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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE BIOSSISTEMAS
THAIS REIS VICTORINO
OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BIODIESEL DE ÓLEO DE FRITURA E
APROVEITAMENTO DA GLICERINA RESIDUAL
NITERÓI - RJ
2014
II
THAIS REIS VICTORINO
OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BIODIESEL DE ÓLEO DE FRITURA E
APROVEITAMENTO DA GLICERINA RESIDUAL
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Engenharia de Biossistemas da
Universidade Federal Fluminense como
parte dos requisitos para a obtenção do
título de Mestre em Engenharia de
Biossistemas.
Orientador: Roberto Guimarães Pereira, Doutor em Engenharia Mecânica
Co-orientadora: Sorele Batista Fiaux, Doutora em Tecnologia de Processos Químicos
e Bioquímicos.
NITERÓI - RJ
2014
III
IV
NITERÓI – RJ
2014
V
DEDICATÓRIA
Dedico este meu trabalho a Deus Pai, Filho (Jesus) e Espírito Santo.
VI
AGRADECIMENTOS
A todos que participaram deste trabalho de alguma forma. Da minha parte suplico a Deus
que pela intercessão de Maria Santíssima junto ao seu amado Filho Jesus possa cumular
estes com toda sorte de alegrias.
Agradeço à FAPERJ pelo apoio financeiro no mestrado.
VII
“ Jesus lhe respondeu: Eu sou o caminho, a verdade e a vida; ninguém vem ao Pai senão
por mim.” (Evangelho de São João capítulo 14 versículo 6, cf. Jo14,6)
VIII
RESUMO
Com o crescimento da demanda de biodiesel no mundo aumenta o interesse de
reutilizar seus subprodutos, evitando descarte no meio ambiente. Desta forma, pretende-se
diminuir os custos da produção do biodiesel bem como reduzir os impactos ambientais do
descarte destes resíduos, dando-lhes uma boa utilidade. Para isso foi proposto neste estudo
a utilização do óleo de cozinha residual (OCR) na produção de biodiesel e analisar o
comportamento do microrganismo Aspergillus niger atuando na glicerina residual da
produção desse biodiesel. Neste trabalho, foi obtido o biodiesel a partir do OCR tendo sido
feito ensaios de viscosidade dinâmica e cinemática. Para realizar estes ensaios foi utilizado
um reômetro e um viscosímetro do tipo Cannon-Fenske acoplado em um banho
termostático, mantendo a temperatura da amostra a 40ºC. Com a glicerina obtida da
produção de biodiesel foi feito ensaio de viscosidade e um experimento preliminar para
verificar o comportamento do fungo A. niger em meio contendo glicerina do biodiesel e
outras duas fontes de carbono. A viscosidade cinemática do biodiesel foi de 4,904 cSt que
está dentro da faixa especificada pela ANP (2014c). O experimento preliminar demonstrou
que o A. niger cresce bem no meio contendo glicerina do biodiesel. Este fungo já possui
aplicações industriais bem estabelecidas como na indústria de alimentos. Nos ensaios
usando meios de diferentes composições foi observado que há variações de crescimento do
microrganismo e que quando se utiliza maior quantidade de glicerina o microrganismo
cresce mais. Além disso, este meio com maior quantidade de glicerina apresentou maior
acidez acompanhando a diminuição do pH indicando a presença de formação de ácido.
PALAVRAS – CHAVE: Biodiesel, Biocombustíveis, Glicerina e Aspergillus niger.
IX
ABSTRACT
The growing demand of biodiesel on the world increases the interest of reuse subproducts
avoiding discharges in the environment. In this way, costs of production is intended to
decrease as well as to reduce the environment impacts of discharging residues to give a
good utility to this wastes. It was proposed in this study to use residual cooking oil (RCO)
in the biodiesel production and to analyze microorganism Aspergillus Niger behavior in
residual glycerin use of biodiesel production. In this work, biodiesel was obtained from
RCO, which was did dynamic and cinematic viscosity experiments. To realize these
experiments was used Rheometer and Viscometer Cannon-Fenske linked to thermostatic
bath, 40 º centigrade temperature was kept. In glycerin obtained of biodiesel production
was did viscosity experiment and a previous experiment to evaluate the behavior in a
medium containing glycerin of biodiesel production e two other carbon fonts. The
cinematic viscosity of biodiesel was 4,904 cSt, which is inside ANP (2014c) specified
grade. The preliminary experiments present that A. Niger has grown well in a medium
containing biodiesel glycerin. This fungus has industrials applications well established as
in food industries. In the experiments with different mediums from biodiesel glycerin was
noticed there are different growing of microorganism according the composition of
medium and when it used more quantity of glycerin the microorganism grow more.
Besides that, this medium with more glycerin quantity has shown more acidity following
decreasing pH, which appointing the acid production.
KEY WORDS: Biodiesel, Biofuels, Glycerin e Aspergillus niger.
X
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – As Matérias-Primas mais utilizadas no Brasil em Julho/2014 na produção de
biodiesel, p.3.
Figura 2 – Reação de transesterificação etílica via rota catalítica homogênea, p.4.
Figura 3 – Produção de biodiesel a partir de (a) Óleo de Soja (b) OCR por região em
Julho/2014, p.6.
Figura 4 – Evolução da Produção (●) e do Consumo (▲) de óleo de soja no Brasil, p.7.
Figura 5 – Perfil de produção ( ) e consumo ( ) de óleos vegetais dos três maiores
produtores mundiais, p.8.
Figura 6 – Principais Aplicações da Glicerina Farmacêutica, p.10.
Figura 7 – Efeitos de transferência de massa para micélios do tipo (1) pellets bem definidos
em fermentação em submerso (2) camada fina quase plana em fermentação em superfície
(3) camada oval em superfície inferior em fermentação em superfície, p.14.
Figura 8 – Curva Padrão da Absorbância versus Concentração de Glicerol Total para o Kit
Analisa, p. 19.
Figura 9 – Curva Padrão da Absorbância versus Concentração de Glicerol Total para o Kit
Kovalent, p. 19.
Figura 10 – Etapa de decantação na produção do biodiesel de óleo de cozinha. Fase leve
(de cima): biodiesel; fase pesada (de baixo): glicerina, p.20.
Figura 11 – Viscosidade dinâmica (η) em função da Temperatura ( T ) do OCR de 25 a 85
ºC, p.21.
Figura 12 – Viscosidade dinâmica (η) em função da Temperatura ( T ) do biodiesel do
óleo de fritura de 25 a 85 ºC, p.22.
Figura 13 – Viscosidade dinâmica (η) em função da Taxa de Cisalhamento do OCR a
40ºC, p.22.
Figura 14 – Viscosidade dinâmica (η) em função da Taxa de Cisalhamento do biodiesel do
óleo de cozinha a 40ºC, p.22.
Figura 15 – Concentração celular e pH do meio em função do tempo de cultivo em
presença de glicerol P.A. ■, sacarose ♦ e glicerina de biodiesel ▲ , p.23.
Figura 16 – Morfologia do pellet de Aspergillus niger em meio de cultivo com sacarose, p.
24.
XI
Figura 17 – Morfologia de Aspergillus niger em meio de cultivo com glicerol P.A, p.24.
Figura 18 – Morfologia de Aspergillus niger em meio de cultivo com glicerina do
biodiesel, p.25.
Figura 19 – Crescimento de A. niger no 2º dia para o meio de cultivo 4, p.25.
Figura 20 – Análise do OCR por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de
massas, p.26.
Figura 21– Cultivo de A. niger para obtenção dos esporos, p.28.
Figura 22 – Concentração celular em função do tempo para Meio de cultivo ♦ 2, ■ 3, ▲4 e
● 5, p.29.
Figura 23 – Concentração celular em função do tempo para os meios de cultivo ♦ 2, ■ 3 e
▲4, p.29.
Figura 24 – Variação de pH em função do tempo para Meio de cultivo ♦ 2, ■ 3, ▲4 e ● 5,
p.30.
Figura 25 – Variação da Acidez em função do tempo para Meio de cultivo ♦ 2, ■ 3, ▲4 e
● 5, p.30.
Figura 26 – Observações durante o experimento o papel de filtro após filtração do meio de
cultivo 5, p.38.
Figura 27 – Preparo do meio de cultivo com maior concentração de glicerina do biodiesel,
p.39.
XII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Percentual de Produção de Biodiesel de Óleo de fritura e outros minoritários, p.
5.
Tabela 2 – Produção de biodiesel em m3 por região brasileira em Julho/2014, p. 5.
Tabela 3 – Consumo de óleo de soja no Brasil de Janeiro a Julho 2014, p. 7.
Tabela 4– Composição qualitativa em ácidos graxos de alguns óleos vegetais, p. 9.
Tabela 5: Composição dos meios de cultivo de 2 a 5, p. 16.
Tabela 6 - Caracterização de ácidos graxos do OCR, p. 27.
XIII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A Absorbância
ABIOVE Associação Brasileira das Indústrias de Óleos Vegetais
AG Ácidos Graxos
ANP Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis
ATCC American Type Culture Collection
BDA Agar Batata Dextrose
MRVS Coleção de Microrganismos de Referência em Vigilância Sanitária
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
EBB European Biodiesel Board
EIA U.S. Energy Information and Administration
EUA Estados Unidos da América
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
L Litros
MME Ministério das Minas e Energia
OECD Organization for Economic Co-operation and Development
OCR Óleo de Cozinha Residual
PA Para Análise
pH Potencial Hidrogeniônico
R2 Coeficiente de regressão
RCO Residual Cooking Oil
T Temperatura
UP Ultrasonic Processor
XIV
LISTA DE SÍMBOLOS
@ Arroba
η Viscosidade dinâmica
XV
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1
1.1. JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 2
1.2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 2
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................ 3
2.1. BIODIESEL..................................................................................................................... 3
2.2. ÓLEO DE FRITURA OU DECOZINHA RESIDUAL (OCR) .................................. 6
2.3. GLICERINA DO BIODIESEL ..................................................................................... 8
2.4. PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIAS DE INTERESSE INDUSTRIAL POR
MICRORGANISMOS A PARTIR DA GLICERINA DO BIODIESEL ........................... 11
2.5. ASPERGILLUS NIGER ................................................................................................ 12
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 14
3.1. PRODUÇÃO DO BIODIESEL E DA GLICERINA ................................................ 14
3.2. LAVAGEM DO BIODIESEL ...................................................................................... 15
3.3. EXPERIMENTOS DE APROVEITAMENTO DA GLICERINA
UTILIZANDO ASPERGILLUS NIGER ................................................................................ 15
3.4. MÉTODOS DE ENSAIOS ........................................................................................... 17
4. RESULTADOS .................................................................................................................. 20
4.1. PRODUÇÃO DO BIODIESEL ................................................................................... 20
4.2. VISCOSIDADE DINÂMICA DO OCR E DO BIODIESEL .................................... 21
4.3. VISCOSIDADE CINEMÁTICA DO OCR E DO BIODIESEL............................... 23
4.4. CRESCIMENTO DE ASPERGILLUS NIGER EM MEIO CONTENDO
GLICERINA DE BIODIESEL............................................................................................... 23
4.5. MORFOLOGIA DO ASPERGILLUS NIGER ........................................................... 24
4.6. COMPOSIÇÃO QUALITATIVA DO ÓLEO DE FRITURA EM TERMOS
ÁCIDOS GRAXOS.................................................................................................................. 25
4.7. INFLUÊNCIA DO pH E DA ACIDEZ DO MEIO DE CULTIVO NO
CRESCIMENTO DE ASPERGILLUS NIGER ..................................................................... 28
5. CONCLUSÃO .................................................................................................................... 31
6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................................ 32
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 32
APÊNDICE A - DIFICULDADES ENCONTRADAS ................................................... 38
1
1. INTRODUÇÃO
Desde que se iniciou a produção de alimentos e recursos materiais em larga escala
começaram os impactos na natureza. O uso de petróleo, seus derivados e carvão para gerar
energia para carros, casas e indústrias causaram o aumento da liberação de gases de efeito
estufa que contribuem para o aquecimento global (Mendonça, 2003; IPCC, 2007). Além de
um problema ambiental, isto é um grande problema social, pois pessoas à margem da
sociedade são os primeiros a sofrerem as consequências de temperaturas extremas e os riscos
de catástrofes. Segundo Mendonça (2003) as ondas de calor e de frio dentre outros aspectos
do aquecimento global podem intensificar a ocorrência de algumas doenças, dentre elas as
respiratórias. As emissões de material particulado liberados no ar podem causar alergias e
consequentemente o aumento na ocorrência de rinites e asmas na população.
Tendo isso em vista, muitos pesquisadores tem se dedicado ao estudo de fontes
alternativas de energia como a eólica, solar, hidroelétrica, etc. que sejam renováveis. Dentre
os combustíveis alternativos, tem crescido a participação do uso de etanol e mais
recentemente do biodiesel. (Rutz, D.; Janssen, R., 2008 ; ANP, 2014). A utilização de
biodiesel tem se mostrado bastante promissora tendo em vista suas muitas vantagens, por
exemplo, os motores a diesel atuais não precisam ser modificados para o uso com o biodiesel
(Oner e Altun, 2009). No Brasil o biodiesel é um combustível promissor devido à grande
variedade de matérias-primas existentes no país que são o óleo de soja, de dendê, de canola,
de girassol, residual de fritura, de sebo bovino, etc. (Rutz, D.; Janssen, R., 2008; Knothe et al,
2006). Os maiores componentes de óleos vegetais são os triacilgliceróis ou triglicerídeos.
Estes são ésteres de ácidos graxos (AG) com glicerol. O biodiesel é importante, pois tem a
compensação da assimilação de dióxido de carbono pelas plantas antes de ser extraído o óleo
que será utilizado. O biodiesel é, portanto uma fonte de energia renovável, pois não necessita
de milhões de anos para ser produzido novamente o que não ocorre, com os combustíveis
fósseis. Tem a vantagem, ainda, de não emitir compostos derivados de enxofre. No entanto, a
presença de compostos nitrogenados na composição dos óleos vegetais e consequentemente,
no biodiesel deles derivado, leva à emissão de parte destes compostos após combustão nos
motores automotivos, dependendo do grau de mistura com o diesel (Pereira et al., 2012).
Embora o biodiesel seja um combustível promissor, durante o processo de produção há
formação de um produto, a glicerina, que pela grande produção de biodiesel, está em excesso
no mundo. Por este motivo e levando-se em consideração os danos econômicos e ambientais
deste rejeito, torna-se uma necessidade estudar formas de seu reaproveitamento em outros
processos. Neste trabalho, o caminho escolhido para este reaproveitamento é através de
2
processos fermentativos já bastante consolidado em outros setores como de alimentos, de
bebidas e de medicamentos (Mota et al., 2009), embora a matéria prima mais usualmente
empregada seja diferente da glicerina do biodiesel. Em países em que o biodiesel vem sendo
cada vez mais agregado ao mercado dos biocombustíveis, pesquisas nesta área tornam-se
essenciais.
1.1. JUSTIFICATIVA
Com o descarte do óleo de fritura nas redes de esgoto ocorre a poluição das águas. O
destino da glicerina proveniente da produção de biodiesel implica em consequências
econômicas e ambientais. Tendo isto em vista, o presente trabalho estudou formas de
reaproveitamento destes dois passivos ambientais de forma a colaborar com estudos na área
do desenvolvimento sustentável do país. A indústria do biodiesel vem se difundindo por todo
o mundo bem como no Brasil então, este trabalho vem oferecer duas possíveis soluções para
estes problemas que são relevantes neste mercado buscando sempre contribuir para o
desenvolvimento sustentável.
1.2 OBJETIVOS
1.2.1 Geral
O presente trabalho tem o intuito de reaproveitar alguns passivos ambientais. O estudo
busca a utilização de óleo de cozinha residual (de fritura) para produção de biodiesel como
forma de dar uma boa utilidade a este rejeito normalmente descartado por restaurantes, casas,
hotéis etc. Além disso, busca o estudo do reaproveitamento da glicerina residual pelo fungo
Aspergillus niger.
1.2.2 Específicos
Produzir e caracterizar o biodiesel proveniente do óleo de cozinha residual;
Estudar o possível reaproveitamento da glicerina do biodiesel por processos
fermentativos;
Verificar as características de crescimento do fungo Aspergillus niger em diferentes
condições de meio de cultivo.
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 BIODIESEL
Segundo a Lei Federal nº 11.097 (13 de janeiro de 2005), o biodiesel pode ser classificado
como qualquer combustível alternativo de natureza renovável que possa oferecer vantagens
socioambientais ao ser empregado na substituição total ou parcial do diesel de petróleo, em
motores de ignição por compressão interna (motores do ciclo diesel). Esta definição, bastante
abrangente, inclui diversas opções tecnológicas. No entanto, o único tipo de biodiesel já
regulamentado no Brasil corresponde aos ésteres de óleos vegetais ou gordura animal, que são
obtidos através de uma reação denominada transesterificação (Knothe et al, 2006).
As matérias-primas utilizadas são óleo de coco, de palma, de girassol, de amendoim,
canola, soja, microalgas, óleo de fritura, gordura animal, etc (Rutz, D.; Janssen, R., 2008). As
mais utilizadas no Brasil estão na Figura 1.
Figura 1 – As Matérias-Primas mais utilizadas no Brasil em Julho/2014 na produção de
biodiesel.
Fonte: ANP, 2014.
Uma das maneiras mais utilizadas, para a obtenção do biodiesel é o processo de
transesterificação. Este processo consiste no deslocamento do glicerol por um álcool de cadeia
curta, transformando os triglicerídeos em uma mistura de ésteres de ácidos graxos, o
biodiesel. Os principais catalisadores empregados na reação são hidróxido de sódio (NaOH) e
4
o hidróxido de potássio (KOH) (Garcia, 2006; Nunes et al, 2009). Segue na Figura 2 a reação
de transesterificação.
Em função da importância do biodiesel o estabelecimento de padrões de qualidade para o
biodiesel se constitui um fator primordial para sua adoção ser bem sucedida. A especificação
do biodiesel destina-se a garantir a sua qualidade e é pressuposto para se ter um produto
adequado ao uso. Por este motivo se faz necessário à determinação da viscosidade, pois
combustíveis muito viscosos podem causar danos ao motor (Moura, 2010).
Figura 2– Reação de transesterificação etílica via rota catalítica homogênea.
Fonte: Garcia, 2006; Nunes et al., 2009; Battisti et al., 2009
Os alcoóis mais utilizados são o metanol e o etanol. No Brasil, com estímulo do programa
Pró-álcool o uso de etanol tornou-se bastante popularizado. A oferta de álcool etílico pelas
indústrias sucroalcooleiras favoreceu o uso deste no país (Carvalho, 2007). Além disso, este
álcool tem a vantagem em relação ao metanol de não ser tóxico.
A viscosidade regulamentada pela ANP (2014c) normatiza que a faixa de especificação
para a Viscosidade Cinemática a 40 ºC é de 3-6 mm2/s. Os demais parâmetros podem ser
observados na Resolução 14 em anexo.
As misturas de Diesel 95%/Biodiesel 5% conhecidas como B5 passaram a ser
comercializados desde 2010. Em 2014, segundo uma Medida Provisória (MP) passou de 5
para 6% (B6) a partir de julho e ainda pretende-se ampliar o percentual para 7%, ou seja, B7 a
partir de novembro deste ano (ANP, 2014).
O perfil de produção nacional de biodiesel por óleo fritura é muito reduzido ainda como
mostrado na Tabela 1 em conformidade com a Figura 1.
5
Tabela 1 - Percentual de Produção de Biodiesel de Óleo de fritura e outros minoritários.
Fonte: ANP, 2014.
Segundo dados de julho ANP (2014), dentre os 0,44% de biodiesel produzido por óleo de
fritura (Tabela 1), a maior parte da produção de biodiesel proveniente do óleo de fritura veio
do Sul, seguido do Centro-Oeste e Nordeste (Tabela 2 e Figura 3) apesar de, a maior produção
de biodiesel ter sido no Centro-Oeste (Tabela 2).
Tabela 2 – Produção de biodiesel em m3 por região brasileira em Julho/2014.
Região Produção Mensal de Biodiesel (m3)
Centro-Oeste 139.019
Sul 122.986
Sudeste 17.540
Nordeste 15.223
Norte 7.358
Fonte: ANP, 2014
A produção de biodiesel de óleo de fritura no Sul corresponde a apenas 762 m3 desta forma, o
país torna-se um grande potencial de exploração deste resíduo à medida que se cresce a
conscientização ambiental.
Segundo dados do MME (2014), a Alemanha lidera o mercado mundial de biodiesel
seguido por Estados Unidos e Brasil, respectivamente. Outro grande produtor de oleaginosas,
a Argentina, também exerce papel importante no mercado de biodiesel.
Em 2011, só a Alemanha produziu 2,8 milhões de toneladas de biodiesel (EBB, 2014). No
mesmo ano, EUA produziu cerca de 3,7 milhões de m3 (EIA, 2013) e o Brasil produziu em
torno de 2,4 milhões de m3 de biodiesel (ANP, 2012). O Brasil produziu no último ano em
torno de 2,6 milhões de m3 de biodiesel (ANP, 2014b). Já os EUA produziram 5,1 milhões de
m3de biodiesel no mesmo ano (EIA, 2014). O Brasil
Matérias-Primas Minoritárias
Percentual de Produção
Óleo de Fritura
Óleo de Algodão
1,00%
Outros
1,76%
Total 3,2%
0,44%
6
Figura 3 – Produção de biodiesel a partir de (a) Óleo de Soja (b) OCR por região em
Julho/2014.
Fonte: ANP, 2014
aumentou apenas 8,3% a produção de biodiesel comparando-se a produção de 2011 com a
2013. Mas ainda assim, se mantém um dos maiores produtores mundiais.
2.2 ÓLEO DE FRITURA OU DECOZINHA RESIDUAL (OCR)
Estima-se que serão produzidos no Brasil cerca de 7 milhões de toneladas de óleo de soja
no Brasil e que cerca de 6 milhões serão consumidos em 2014 (ABIOVE, 2014). Este
consumo estimado é de uso doméstico. Portanto, uma enorme quantidade de óleo de fritura
residual só de óleo de soja será gerado no Brasil em 2014, sem contar as demais matérias-
primas. Na Figura 4 pode-se observar a evolução da produção e do consumo residencial de
óleo de soja desde 2003 no Brasil. Partiu-se de uma produção de aproximadamente 5 milhões
de toneladas para chegar a 7 milhões. Um consumo residencial quase sempre crescente de 3
milhões de toneladas em 2003 para aproximadamente 6 milhões de toneladas em 2014. Com
uma queda ocorrendo somente em 2012. Observa-se que o consumo residencial cresceu
7
bastante em relação ao crescimento da produção o que nos leva a pensar na importância de se
ter uma logística no descarte deste óleo utilizado.
Na Tabela 3 observa-se um consumo de 414.000 toneladas de óleo de soja nas residências
só em julho de 2014, no Brasil.
Figura 4 – Evolução da Produção (●) e do Consumo (▲) de óleo de soja no Brasil.
*Previsão Fonte: ABIOVE, 2014
Tabela 3 – Consumo de óleo de soja no Brasil de Janeiro a Julho 2014.
Mês
Consumo Residencial ( x 1000 t)
Janeiro 335
Fevereiro 319
Março 371
Abril 411
Maio 432
Junho 404
Julho 414
Agosto a Dezembro *
Total 2.686
* Ausência de dados Fonte: ABIOVE, 2014
O perfil de produção e consumo de três importantes mercados mundiais encontra-se na
Figura 5. Neste perfil observa-se que somente o Brasil produziu mais do que consumiu de
óleos vegetais nos anos de 2005 e 2007. Enquanto que, a União Europeia e EUA produziram
8
igual ou menos o que consumiram. O Brasil manteve seu consumo em 3 milhões de toneladas
nos dois anos.
Figura 5 – Perfil de produção ( ) e consumo ( ) de óleos vegetais de três importantes
produtores mundiais.
*Previsão Fonte: OECD-FAO, 2008
Dentre as caracterizações dos óleos vegetais a composição em ácidos graxos é de grande
importância, pois a presença de determinados ácidos graxos irá influenciar em outras
propriedades tais como densidade e viscosidade. A composição qualitativa em ácidos graxos
em alguns óleos estão na Tabela 4.
2.3 GLICERINA DE BIODIESEL
Um aspecto negativo na produção de biodiesel é a formação de grandes quantidades de
glicerina residual. Dada à importância do assunto, é crescente o número de trabalhos sobre o
reaproveitamento deste resíduo formando uma área específica de estudo chamada
gliceroquímica (Mota et al., 2009).
O termo glicerina é normalmente aplicado aquela cuja concentração de glicerol é de 95%.
São normalmente glicerinas que passaram por diversos processos de purificação. O termo
9
Tabela 4– Composição qualitativa em ácidos graxos de alguns óleos vegetais.
Óleo Composição (% m/m) em ácidos graxos
Referências 8:0 10:0 12:0 14:0 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 22:1
Soja
9-14,5 2,5-5 18-34 45-60 3,5-8 Christoff,2007
2,3-13,3 2,4-6 17,7-30,8 49-57,1 2-10,5 0-0,3 Knothe et al,2006
0.1 0.1 10.2 3.7 22.8 53.7 8.6 Fangrui et al., 1999
Algodão 0.1 0.7 20.1 2.6 19.2 55.2 0.6 Fangrui et al., 1999
Coco 46.5 19.2 9.8 3.0 6.9 2.2 Fangrui et al., 1999
4,6-9,5 4,5-9,7 44-51 13-20,6 7,5-10,5 1-3,5 5-8,2 1-2,6 0-0,2 Knothe et al.,2006
Sebo bovino 0.1 2.8 23.3 19.4 42.4 2.9 0.9 Fangrui et al., 1999
2,1-6,9 25-37 9,5-34,2 14-50 26-50 Knothe et al,2006
Óleo de Fritura 8.5 3.1 21.2 55.2 5.9 Zhenzhong et al., 2010
Sendo os ácidos: 8:0 – Caprílico; 10:0 – Cáprico; 12:0 – Láurico; 14:0 – Mirístico; 16:0 – Palmítico; 18:0 – Esteárico; 18:1 – Oléico; 18:2 – Linoléico;
18:3 – Linolênico; 22:1 – Erúcico
10
glicerol é aplicado a produtos com concentração de glicerol aproximadamente 100%, ou seja,
completamente puro contendo apenas o componente 1,2,3-propanotriol.
Na sua forma purificada grau farmacêutico tem aplicação em diversos setores sendo os
principais nas indústrias de cosméticos, de produção de sabões e medicamentos. É também
utilizada nas indústrias de alimentos e bebidas. Como pode ser observado na Figura 6.
Figura 6 – Principais Aplicações da Glicerina Farmacêutica.
Fonte: Mota et al. (2009)
Em torno de 10 m3 de glicerina são formados para cada 90 m3 de biodiesel (Silva et al,
2007). Segundo dados da ANP de 2014 estima-se que são gerados 300 milhões de litros de
glicerina por ano no Brasil. Ocorre que nos EUA e na Europa há uma demanda de glicerina
refinada na ordem de 40.000 toneladas (Singhabhandhu, A; Tezuka, T., 2010). Pode tornar-se
um mercado se a glicerina do biodiesel passar por processos de purificação. Este não é o
objetivo deste trabalho, que busca o aproveitamento da glicerina do biodiesel com o mínimo
de pré-tratamento. Desta forma, busca-se diminuir os custos do reaproveitamento. A glicerina
proveniente da produção de biodiesel é denominada glicerina bruta, com teores de glicerol
que dependem na matéria-prima usada na produção do biodiesel, porém, também, pode passar
por processos de purificação como a neutralização pela adição de ácido e a remoção de ácidos
graxos livres formados no processo. Neste caso, possuirá aproximadamente 80% de glicerol
(Mota et al., 2009).
O excesso dessa substância no mundo, com a crescente demanda por biodiesel, pode
acarretar sérios problemas econômicos e ambientais. Estudos têm sido realizados para a
utilização da glicerina. Por exemplo, por via química é possível obter 2,2-dimetil-1,3-
dioxolano-4 metanol, um candidato potencial a aditivo para a gasolina, em substituição ao
metil-t-butil-éter (MTBE), que vem sendo abandonado por questões ambientais (Silva et al.,
11
2007). Outra possibilidade é a obtenção de cetais e acetais derivados do glicerol, que possuem
aplicações diversas, destacando-se o uso como aditivo para combustíveis,surfactantes,
flavorizantes e solventes para uso em medicina (Mota et al, 2009). A hidrogenólise da
glicerina tem como principais produtos o 1,2 propanodiol, também chamado de
propilenoglico. O propilenoglicol tem propriedades anti-congelante e também pode ser
matéria-prima para a produção de produtos farmacêuticos, alimentícios, cosméticos,
detergentes e tintas, entre outros (Mota e Pestana, 2011).
Uma das áreas de estudo de grande potencial para o aproveitamento da glicerina é a de
processos fermentativos. As pesquisas nessa área visam a utilização da glicerina residual do
biodiesel para produzir substâncias de maior valor agregado pela ação de microrganismos.
2.4 PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIAS DE INTERESSE INDUSTRIAL POR
MICRORGANISMOS A PARTIR DA GLICERINA DO BIODIESEL
É conhecida a capacidade de vários microrganismos de sintetizar substâncias a partir do
glicerol (Dobson et al., 2012). Podem ser citadas a produção de ácido cítrico por Yarrowia
lipolytica (Silva et al., 2010), de dihidroxiacetona por Gluconobacter oxydans (Pontes, 2012),
etanol por Klebsiella pneumoniae (Oh et al, 2011), hidrogênio por Rhodopseudomonas
palustres (Sabourin-Provost e Hallenbeck, 2009) e biosurfactantes por Yarrowia lipolytica
(Fontes et al, 2012). Apesar dos exemplos descritos na literatura para o glicerol, a
fermentação de glicerina de biodiesel para a produção de químicos só tem sido estudada em
pequena escala e poucas linhagens microbianas têm sido avaliadas (Almeida, 2011).
Não basta apenas que o microrganismo seja capaz de utilizar o glicerol para a obtenção de
produtos de interesse. É necessário levar em consideração impasses como a presença de
impurezas que podem inibir o microrganismo produtor (Rumbold et al., 2009). Nesse caso, é
imprescindível encontrar microrganismos capazes de utilizar o glicerol na forma em que é
obtido na produção de biodiesel, ou seja, microrganismos resistentes às impurezas presentes.
Alguns problemas relacionados às impurezas foram encontrados no cultivo da microalga
Schizochytrium limacinum para a obtenção de ácido docosahexaenóico e ácido
eicosapentaenóico (Pyle et al., 2008) e do fungo Pythium irregulare para a produção de ácido
eicosapentaenóico (Athalye et al., 2009). Em ambos os casos o metanol e o sabão presentes
na glicerina do biodiesel influenciaram negativamente a produção. A solução encontrada foi
simples, o metanol foi eliminado por evaporação durante a esterilização do meio de cultivo
em autoclave e o sabão foi precipitado através do ajuste do pH.
12
O microrganismo selecionado deve ser capaz de formar o produto em quantidades viáveis
economicamente e isso envolve a realização de uma busca pelo melhor produtor. Para ilustrar
a dificuldade envolvida, cita-se o trabalho de Kamzolova et al (2011), que testou 66 cepas de
leveduras para a produção de ácido cítrico a partir de glicerol. Dessas, 41 apresentaram
alguma produção, sendo a maioria da espécie Yarrowia lipolytica. Apenas cinco produziram
em quantidades satisfatórias, sendo a melhor selecionada e utilizada para a produção a partir
de glicerina de biodiesel com bons resultados.
As condições de cultivo também são importantes no desenvolvimento de um processo
microbiano. No trabalho de Silva et al. (2010) utilizando uma linhagem de Yarrowia
lipolytica, obteve-se 4,15 g/L de ácido cítrico em meio de cultivo tamponado, enquanto que
no meio não tamponado a produção foi de 3,65 g/L. Da mesma forma, nos experimentos com
glicerol PA obteve-se resultado bem melhor quando o meio de cultivo estava tamponado -
10,65 g/L de ácido cítrico. Sem o meio tamponado a concentração foi menor que os já citados
e foi de 2,51 g/L.
2.5 ASPERGILLUS NIGER
Propõe-se verificar a adequação da glicerina como fonte de carbono para o cultivo do
microrganismo Aspergillus niger. Este é um dos mais importantes microrganismos usados na
biotecnologia sendo bastante utilizado nas indústrias, embora a matéria-prima usada
normalmente seja diferente do glicerol. Este microrganismo é, há várias décadas, utilizado
para produzir enzimas e ácido cítrico (Liguori et al., 2013; André et al., 2010; Desgranges et
al., 1990; Legisa et al., 1986; Venegas et al., 2013)
Além disso, é usado em biotransformações e no tratamento de resíduos (Schuster et al.,
2002). Segundo Shuster et al. (2002) este microrganismo é considerado não patogênico
embora no Brasil seja classificado como de risco 2 pelo CMRVS. De acordo com a coleção
americana ATCC e a alemã DSMZ o classificam como de risco 1 podendo portanto, ser
considerado um microrganismo seguro de se trabalhar oferecendo pouco risco a saúde
humana tomando-se o devido cuidado em sua manipulação como evitar a exposição intensa
aos esporos do microrganismo.
As poucas pesquisas que vem sendo feitas para o cultivo de A. niger utilizando glicerina
de biodiesel como fonte de carbono mostram seu grande potencial para obtenção de
substâncias de interesse. É conhecido que A. niger pelo seu desenvolvimento em meio
apropriado leva à formação de vários ácidos orgânicos, dependendo das condições de cultivo
13
(Liguori et al, 2013; Steiger et al,2013). Os ácidos orgânicos cítrico e oxálico são muito
utilizados, principalmente nas indústrias de alimentos (Yokoya, 1992) e em laboratórios.
A formação de ácido oxálico já foi observada em meio contendo glicerina de biodiesel
obtida a partir de óleos comerciais. André et al. (2010) utilizaram duas linhagens de
Apergillus niger para obtenção de ácido oxálico a partir de glicerina do biodiesel. Em 262
horas de experimento obteve-se as concentrações máximas de 21,5 e 20,5 g/L de ácido
oxálico quando o meio de cultivo tinha a maior concentração de glicerina do biodiesel, que
era de 60 g/L. Também utilizando A. niger em glicerina de biodiesel, Musial et al (2011)
obtiveram o ácido oxálico e utilizaram o meio de cultivo enriquecido com esse ácido para o
branqueamento de kaolin.
A obtenção de lipídeos por A. niger foi possível em meio contendo 30 a 60 g/L de
glicerina de biodiesel, obtendo-se 2,0 e 2,5 g/L de lipídeos (André et al., 2010). Os lipídeos
microbianos, também chamados de single cell oil podem servir de fonte de ácidos graxos
importantes para a indústria farmacêutica, mas recentemente ganhou espaço como potencial
matéria prima para a produção de biodiesel (Papanikolaou et al, 2008).
Ainda podem ser citados como produtos potenciais do cultivo de A. niger mas que ainda
não foram verificados em glicerina de biodiesel a vanilina (Liguori et al, 2013) e as lípases
(Salihu et al, 2012; Papanikolaou et al, 2011).
Quando uma fermentação ocorre em submerso o A. niger pode crescer sob diversas
formas como filamentos livres e/ou dispersos, pellets, etc. (Couri et al., 2003) Este tipo de
fermentação se dá devido a parâmetros de controle utilizados no meio como, principalmente
controle agitação (aumenta a aeração) e temperatura (Soccol et al., 2006). Desta forma, o
microrganismo se desenvolve quase que completamente no interior do meio. Isto não ocorre
em fermentações em superfície, onde não se tem controle de agitação e apenas de
temperatura, o microrganismo tende a se desenvolver na superfície do meio onde se tem
maior aeração (Dhillon et al., 2011). No presente trabalho, utilizaram-se os dois tipos de
fermentação, pois foram feitos estudos preliminares em submerso e o posterior em superfície
devido a resultados qualitativos parecerem melhores em fermentação em superfície que em
submerso.
A formação de produtos depende, também, da morfologia dos micélios que podem
contribuir na interação dos microrganismos com o meio de cultivo. Existem diferentes
problemas de transferência de massa do nutriente do meio de cultivo até o centro do micélio
que depende da sua forma (Figura 7) (Walisko et al., 2012; Pamboukian, 1997).
14
Figura 7 – Efeitos de transferência de massa para micélios do tipo (1) pellets bem definidos
em fermentação em submerso (2) camada fina quase plana em fermentação em superfície (3)
camada oval em superfície inferior em fermentação em superfície.
A resistência à transferência de massa depende da geometria da superfície que para ser
estudada é aproximada para formas geométricas mais conhecidas como a esférica, plana,
cilíndrica, etc. As geometrias apresentadas na Figura 7 assemelham-se a superfícies esféricas,
planas e semiplana e semiesférica em (1), (2) e (3), respectivamente. Estas geometrias foram
próximas às que se encontram no presente trabalho.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1. PRODUÇÃO DO BIODIESEL E DA GLICERINA
3.1.1. Óleo de Fritura
O óleo de fritura utilizado nos experimentos foi cedido pelo Auto Posto Ingá localizado
em Niterói, RJ, que faz parte do Projeto Posto Cidadão, monitorado pela Secretaria Municipal
de Meio Ambiente de Niterói. É um óleo de cozinha residual proveniente das casas dos
moradores da região e restaurantes que o utilizaram na fritura de alimentos. Foi utilizado
também um óleo de fritura de soja transgênico que anteriormente foi usado na fritura de
pastéis por diversas vezes.
O óleo de fritura foi filtrado em papel de filtro e seco em estufa a 110 ºC por uma hora. O
óleo foi caracterizado determinando-se as suas viscosidades cinemática e dinâmica e sua
composição qualitativa em termos de ácidos graxos.
3.1.2. Reação de Transesterificação
A produção de biodiesel e da glicerina foi realizada com auxílio de ultrassom em
Erlenmeyer ou Bécher tampados para evitar a entrada de umidade. Foi utilizado 1 g de KOH
PA ou NaOH dissolvido em 40 mL de álcool etílico PA Absoluto 99,5% em placa de
15
agitação. Após a dissolução total, 100 mL de óleo de fritura (filtrado e seco a 110 ºC por uma
hora) foram adicionados lentamente e a mistura foi colocada no ultrassom modelo Hielscher
UP 200S Ultrasonic Processor Ultrasound Tecnology com amplitude de 60% por 15 minutos
ou com amplitude de 30% pelo mesmo tempo no ultrasom modelo Ultrasonic Processor Cole
Parmer. A mistura foi vertida para funil de separação e deixada em descanso por um dia. Foi
observada a formação de duas fases sendo, a fase leve (de cima) o biodiesel e a fase pesada
(de baixo) a glicerina. Após separação da glicerina, o biodiesel foi lavado, seco e filtrado.
3.2. LAVAGEM DO BIODIESEL
Foram feitas 3 lavagens para eliminar resíduos de glicerina, catalisador e alcoóis. Na
primeira lavagem, foi adicionado água destilada acidificada com ácido clorídrico aquecida a
70ºC por meia hora. Deixou-se decantar por meia hora e foi descartada a fase aquosa. Na
segunda lavagem, foi adicionado ao biodiesel apenas água destilada aquecida a 70 ºC por
meia hora. Deixou-se decantar por meia hora e foi descartada a fase aquosa também. A
terceira lavagem foi feita da mesma forma que a segunda.
A secagem foi feita colocando-se o biodiesel lavado na estufa a 105 ºC por uma hora
(Braz, 2011). O biodiesel foi caracterizado determinando-se as suas viscosidades cinemática e
dinâmica.
3.3. EXPERIMENTOS DE APROVEITAMENTO DA GLICERINA UTILIZANDO
ASPERGILLUS NIGER
3.3.1. Microrganismo:
Foi utilizado o fungo filamentoso Aspergillus niger INCQS 40065 (ATCC 6275), cedido
pelo INCQS / Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), mantido em solo estéril à temperatura
ambiente.
3.3.2. Obtenção dos esporos:
Os esporos foram obtidos crescendo o microrganismo a 30 ºC por cinco dias em Agar
Batata Dextrose (BDA - HiMedia Laboratories) em garrafa de Roux.
3.3.3. Meios de cultivo:
Meio 1 (em g/L): (NH4)2SO4, 5.0; KH2PO4, 1.0; MgSO4.7H2O,0.25 e em (mg/L): Fe+2 (como
FeSO4.7H2O), 0.3; Zn+2 (como ZnSO4.7H2O), 0.4; Mn+2 (como MnSO4.H2O),0.15; Cu+2
(como CuSO4.5H2O), 0.4; pH 5,0, acrescido da fonte de carbono de acordo com o
experimento (esterilizado a 121ºC/ 15 min). Baseado no trabalho de Kurbanoglu et al. (2002).
A composição dos demais meios (2, 3, 4 e 5) utilizados está apresentada na Tabela 5.
16
Tabela 5: Composição dos meios de cultivo de 2 a 5 (Yokoya, F., 1992; Kurbanoglu et al.;
2002).
Componentes MEIO 2 MEIO 3 MEIO 4 MEIO 5
Glicerina do biodiesel (33,3
% de glicerol) (g/L) 10 10 10 80
(NH4)2SO4 (g/L) 2,06 2,06 2,06 2,06
MgSO4.7H2O (g/L) 1 1 1 1
KH2PO4 (g/L) 1 1,8 1 1,4
Fe+2 (como FeSO4.7H2O)
(mg/L) 0 0 1,3 0,4
Zn+2 (como ZnSO4.7H2O)
(mg/L) 0 0 0,25 0,2
Cu+2 (como CuSO4.5H2O)
(mg/L) 0 0 0,05 0,2
Mn+2 (como MnSO4.H2O)
(µg/L) 5 135 135 70
pH 5 2 2 3,5
3.3.4. Crescimento de Aspergillus niger em meio contendo glicerina:
Os esporos foram suspensos em solução 0,1% de Tween 80 estéril, contados e utilizados
para inocular 50 mL de meio 1 contidos em Erlenmeyers de 250 mL (105 esporos / mL de
meio). O meio foi complementado com glicerina de biodiesel, sacarose ou glicerol PA, nas
concentrações de 40,5, 51,1 e 47,5 g/L, respectivamente. A sacarose e o glicerol PA foram
utilizados como controles. A glicerina do biodiesel utilizada continha uma concentração de
glicerol de 30% (mglicerol/mglicerina). Os frascos foram incubados sob agitação de 150 rpm e 30
oC em agitador incubador G-25 marca Superohm Equipamentos Científicos LTDA. As
amostragens, constituídas do conteúdo total do frasco, foram feitas em duplicata. A
concentração celular em termos de peso seco de células e o pH foram analisados.
3.3.5. Influência do pH e da acidez do meio de cultivo no crescimento de Aspergillus
niger:
Os esporos foram suspensos em solução 0,1% de Tween 80 estéril e utilizados para
inocular 100 mL de meio contidos em Erlenmeyers do 500 mL (106 esporos / mL de meio).
Foram utilizados os meios de cultivo constantes na Tabela 5. O cultivo foi realizado em
superfície, para isso os frascos foram incubados sem agitação à temperatura constante de 30ºC
17
em estufa Q-316B24 da marca QUIMIS Aparelhos Científicos LTDA. As amostragens foram
constituídas do conteúdo total do frasco. A concentração celular em termos de peso seco de
células, o pH e a acidez foram analisados.
3.4. MÉTODOS DE ENSAIOS
3.4.1. Viscosidade dinâmica do óleo de cozinha residual (OCR) e do biodiesel
Realizou-se análise no reômetro RS 50 RheoStress da Precitech Instrumental LTDA, no
Laboratório de Reologia da UFF, para a determinação da viscosidade dinâmica do OCR e do
Biodiesel de óleo de fritura.
Foram feitos dois tipos de análises: uma feita à temperatura constante de 40ºC e outra
feita variando a temperatura de 25 a 90ºC. Obteve-se a viscosidade variando a taxa de
cisalhamento com o tempo (curva de fluxo).
3.4.2. Viscosidade cinemática do óleo de cozinha residual (OCR) e do biodiesel
A determinação da viscosidade cinemática do OCR foi feita no Laboratório de Reologia
da UFF utilizando-se um viscosímetro cinemático do tipo Cannon-Fenske acoplado em um
banho termostático a 40ºC. O tempo necessário para que óleo escoasse entre duas marcações
do viscosímetro foi medido. Multiplicou-se esse tempo por uma constante do viscosímetro
(0,01512 mm²/s²) obtendo-se a viscosidade cinemática. Foram feitas três repetições do
experimento.
3.4.3. Análise qualitativa dos ácidos graxos componentes do óleo
A amostra de OCR foi preparada para ser injetada no cromatógrafo gasoso segundo o
procedimento descrito no trabalho de Santos (2010). Foram pesados aproximadamente 370
mg do material lipídico em balão de fundo chato de 250 mL, aos quais foram adicionados 5
mL de solução metanólica de hidróxido de sódio 0,5 N, deixando em ebulição com refluxo
entre 3 a 5 minutos com o auxílio de um condensador de refluxo. Na solução quente foram
adicionados 15 mL do reagente de esterificação (cloreto de amônio e ácido sulfúrico
concentrado em metanol), deixando em refluxo por 3 minutos com o auxílio de um
condensador de refluxo. Depois do resfriamento, a mistura foi colocada em funil de
decantação de 250 mL e foram acrescentados 50 mL de água destilada e 25 mL de hexano
para HPLC. Foi feita a lavagem com 25 mL de água destilada na mistura anterior por duas
vezes. Após a separação, a fase hexânica foi filtrada após a adição de sulfato de sódio anidro.
O extrato hexânico foi colocado em Ependorf, lacrado e congelado para análise por
cromatografia gasosa. (Santos, 2010)
18
A amostra foi injetada no cromatógrafo Shimadzu, modelo QP2010 equipado com
detector de espectrometria de massas. A coluna utilizada foi do tipo capilar de sílica fundida
com fase 5% difenil/ 95% dimetil-polisiloxano, modelo RTX-5MS, com 30 m de
comprimento, 0,25 mm de diâmetro e 0,25 μm de espessura. O gás de arraste foi o hélio, com
fluxo de 0,76 mL/minuto. A quantidade de amostra injetada foi de 1 μl diluída em hexano.
Os diferentes ácidos graxos foram identificados por comparação dos seus espectros de
massas com os espectros de padrões pertencentes à biblioteca do equipamento.
3.4.4. Concentração de esporos
A concentração da suspensão de esporos utilizada como inóculo foi determinada por
contagem direta ao microscópio em câmara de Neubauer.
3.4.5. Concentração celular
A concentração celular foi determinada pelo método do peso seco de células. O volume
de cultivo em cada frasco foi medido em proveta. O micélio foi filtrado em papel de filtro
seco e pesado, lavado duas vezes com volume de água igual ao de meio e secado a 80ºC por
24h. A massa seca foi pesada e a concentração calculada utilizando o volume de meio
medido.
3.4.6. Determinação do pH
O pH foi medido no meio, após a filtração, em pHmetro.
3.4.7. Determinação do glicerol na glicerina do biodiesel
Para a determinação da quantidade de glicerol na glicerina do biodiesel foi utilizado o
método enzimático (Kit Enzimático Colorimétrico Analisa Triglicérides PP, adquirido no
comércio, ou Kit Enzimático Triglicerídeos GPO-PAP, cedido gentilmente pela Kovalent).
Este Kit permite medir o glicerol total incluindo aquele ainda associado aos ácidos graxos, na
forma do triglicerídeo residual da reação de transesterificação. Foram preparadas curvas de
calibração para cada kit utilizado, utilizando glicerol PA diluído adequadamente. As soluções
de glicerol para a curva e a amostra de biodiesel previamente diluída foram analisadas
conforme indicado pelo fabricante do kit. O branco foi constituído do reagente de cor. As
leituras das absorbâncias foram feitas em espectrofotômetro BEL modelo SP 2000 UV no
comprimento de onda de 505 nm (Kit Analisa) e 500 nm (Kit Kovalent).
As Figuras 8 e 9 mostram as curvas de calibração para cada análise de determinação de
glicerol na glicerina. É possível observar a faixa de linearidade em cada caso.
19
Figura 8 – Curva Padrão da Absorbância versus Concentração de Glicerol Total para o Kit
Analisa.
Figura 9 – Curva Padrão da Absorbância versus Concentração de Glicerol Total para o Kit
Kovalent.
20
A equação da reta é dada por:
para o kit Analisa e
para o kit Kovalent,
Sendo:
A = Absorbância
CGlicerol Total = Concentração de glicerol em g/L.
3.4.8. Determinação da acidez
Foi feito titulação dos meios de cultivo com solução de NaOH 0,0948 M em 1mL de cada
meio no tempo 0h e 2 mL de cada meio nos demais tempos de cultivo. Utilizou-se o indicador
Fenolftaleína 1%.
4 RESULTADOS
4.1. PRODUÇÃO DO BIODIESEL
Feita a reação de transesterificação e após um dia de decantação (Figura 10) formaram-se
aproximadamente 13 mL de glicerina e após a lavagem e secagem do biodiesel obteve-se 88
mL de biodiesel. De acordo com Mota et al. (2011), essa é uma proporção razoável entre a
produção de biodiesel e glicerina.
Figura 10 – Etapa de decantação na produção do biodiesel de óleo de cozinha. Fase leve (de
cima): biodiesel; fase pesada (de baixo): glicerina.
A = 1,1893 x CGlicerol Total +
0,002 (Equação 1)
A = 1,2166 x CGlicerol Total -
0,0296 (Equação 2)
21
O biodiesel tem usualmente coloração amarela quando obtido de óleos refinados, já a
coloração do biodiesel de óleo de fritura apresentou-se durante todo o processo de produção
de coloração castanho claro.
A glicerina pura é incolor e sua densidade é em torno de 1,26 g/mL a 20 °C e possui
percentual de aproximadamente 99% (mglicerol/mglicerina). A glicerina do biodiesel de óleos
refinados é amarela escura. Já a glicerina do biodiesel de óleo de fritura obtida no presente
trabalho apresentou uma coloração castanha escura com densidade aproximadamente 0,960
g/mL a 25ºC. Em termos de composição a glicerina obtida no presente trabalho apresentou
aproximadamente 30% em massa de glicerol. Este valor é próximo ao encontrado por Lage
(2009) que obteve um teor de glicerol de 36,2% na glicerina bruta originada de óleos de
mamona, soja, algodão e girassol na produção de biodiesel por rota metílica. Já Zavarize
(2012) obteve 40,3% de glicerol em uma glicerina bruta oriunda da produção de biodiesel
utilizando como matéria-prima óleo de fritura.
4.2. VISCOSIDADE DINÂMICA DO OCR E DO BIODIESEL
A influência da temperatura na viscosidade dinâmica do OCR e do biodiesel do óleo de
fritura é mostrada nas Figuras 11 e 12, respectivamente. Percebe-se que a viscosidade
dinâmica decresce com o aumento da temperatura o que era esperado.
Na temperatura de 40ºC encontrou-se uma viscosidade dinâmica média de 0,0379 Pa.s
para o OCR e de 0,0046 Pa.s para o biodiesel (vide Figuras 13 e 14). Como se pode observar
a viscosidade do biodiesel é bem menor que a do OCR como já era esperado, este é um forte
motivo pelo qual não se usa óleo puro como combustível. A viscosidade alta do óleo pode
causar danos ao motor do ciclo diesel durante o seu funcionamento.
Figura 11 – Viscosidade dinâmica (η) em função da Temperatura ( T ) do OCR de 25 a 85 ºC.
22
Figura 12 – Viscosidade dinâmica (η) em função da Temperatura ( T ) do biodiesel do óleo
de fritura de 25 a 85 ºC.
Figura 13 – Viscosidade dinâmica (η) em função da Taxa de Cisalhamento do OCR a 40ºC.
Figura 14 – Viscosidade dinâmica (η) em função da Taxa de Cisalhamento do biodiesel do
óleo de cozinha a 40ºC.
23
4.3. VISCOSIDADE CINEMÁTICA DO OCR E DO BIODIESEL
A viscosidade cinemática, determinada a 40ºC, do OCR e do biodiesel, foi de 36,87 cSt e
4,90 cSt, respectivamente. A incerteza expandida na medição da viscosidade cinemática foi de
± 0.006 mm2.s-1 (Santo Filho, 2010).
A viscosidade cinemática do OCR ficou próxima da encontrada no trabalho de Moura
(2010) que foi 33,23 cSt e, também, foi próxima de outros trabalhos como o de Arjun et al
(2008) que foi de 35,30 cSt, todas determinadas a 40ºC. O controle da viscosidade é um
parâmetro importante para garantir o bom funcionamento dos sistemas de injeção das bombas
combustíveis (Moura, 2010). A viscosidade do biodiesel atende a norma da ANP (2014 c).
4.4. CRESCIMENTO DE ASPERGILLUS NIGER EM MEIO CONTENDO
GLICERINA DE BIODIESEL
O Aspergillus niger apresentou bom crescimento em presença de todas as fontes de
carbono sendo que, na glicerina do biodiesel foi obtido o maior crescimento médio (22,8 g/L),
conforme mostrado na Figura 15.
Tanto no meio com glicerina quanto no meio com sacarose o pH do meio de cultivo
decresceu até aproximadamente 70 horas de cultivo, embora o fungo tenha continuado a
crescer. No meio com glicerol, o pH decresceu até 1,5 no tempo total de cultivo, de acordo
com a Figura 15, o mesmo valor final do meio contento sacarose. O meio com glicerina
permaneceu em valor 2,0 após as 70 horas de cultivo.
Figura 15 – Concentração celular ( ) e pH ( - - - ) do meio em função do tempo de cultivo
em presença de glicerol P.A. ■, sacarose ♦ e glicerina de biodiesel ▲ (Média de duplicatas).
24
Mesmo não tendo sido feito nenhum pré-tratamento na glicerina do biodiesel, as
impurezas presentes não afetaram o crescimento do fungo ao contrário do que tem sido
relatado para outros microrganismos (Athalye et al, 2009; Pyle et al, 2008). Além disso, o
crescimento de A. niger em glicerina foi um pouco maior do que na sacarose, fonte
comumente utilizada na indústria. Aparentemente, alguns resíduos da reação de produção do
biodiesel, por exemplo os resíduos de triglicerídeos (óleo de fritura utilizado) ou de ácidos
graxos livres, podem ter contribuído para o crescimento do A. niger. Papanikolaou et al.
(2011) em seu trabalho utilizaram óleo de cozinha residual para gerar biomassa de algumas
linhagens de Aspergillus sendo, portanto, um indicativo de que este resíduo na glicerina do
biodiesel pode ter contribuído para o crescimento microbiano.
4.5. MORFOLOGIA DO ASPERGILLUS NIGER
Nos meios de cultivo contendo sacarose a morfologia do A. niger se apresentou como
pellets bem formados (Figura 16), enquanto que no meio contendo glicerol P.A. e glicerina do
biodiesel o crescimento em submerso se deu em forma mais fragmentada (Figuras 17 e 18).
Figura 16 - Morfologia do pellet de Aspergillus niger em meio de cultivo com sacarose.
Figura 17 - Morfologia de Aspergillus niger em meio de cultivo com glicerol P.A.
25
Figura 18 - Morfologia de Aspergillus niger em meio de cultivo com glicerina do biodiesel.
A morfologia do A. niger nos experimentos com glicerina do biodiesel em superfície
mostrou-se fragmentada inicialmente, com posterior formação de uma camada espessa na
superfície do meio devido ao fato dos experimentos serem sem a agitação (Figura 19).
Figura 19 - Crescimento de A. niger no 2º dia para o meio de cultivo 4.
4.6. COMPOSIÇÃO QUALITATIVA DO ÓLEO DE FRITURA EM TERMOS
ÁCIDOS GRAXOS
Uma análise qualitativa da composição dos triglicerídeos presentes no OCR em termos de
ácidos graxos foi realizada por cromatografia gasosa para verificar a qualidade do óleo de
fritura utilizado. Os picos podem ser observados na Figura 20. A Tabela 6 mostra a
identificação das estruturas moleculares dos ácidos graxos do OCR.
A composição de ácidos graxos do OCR mostrou-se bastante parecida com a dos óleos de
soja, algodão, coco e sebo bovino encontrados nos trabalhos de Christoff (2007), Fangrui et
al. (1999) e Zhenzhong et al. (2010). A deterioração do óleo durante a fritura pode trazer
problemas à reação de transesterificação e geração de produtos indesejáveis (Araújo et al,
2013), o que pode acarretar um biodiesel e a respectiva glicerina de baixa qualidade. A
qualidade do resíduo utilizado como matéria prima num processo biotecnológico implica na
qualidade do produto obtido (Habe et al, 2013). Pelas análises de composição o óleo de fritura
utilizado no presente projeto se mostrou comparável a outros óleos e gorduras.
26
Figura 20 – Análise do OCR por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas.
27
Tabela 6 - Caracterização de ácidos graxos do OCR.
Tempo
de
Retenção
(minutos)
Nome dos
Ácidos Graxos
Fórmula
Molecular Estrutura Molecular
33,7 Mirístico C15H30O2
49,4 Palmitoléico C15H30O2
51,6 Palmítico C17H34O2
66,3 Linoléico C19H34O2
66,9 Elaidico C19H36O2
67,2 Oléico C19H36O2
67,4 12-cis-
octadecadienoato C19H34O2
67,9 Linolênico C19H32O2
69,1 Esteárico C19H38O2
83,3 13-cis-
eicosenóico C19H36O2
85,7 Araquídico C21H42O2
101,2 Behênico C23H46O2
28
4.7. INFLUÊNCIA DO pH E DA ACIDEZ DO MEIO DE CULTIVO NO
CRESCIMENTO DE ASPERGILLUS NIGER
Um experimento preliminar foi realizado, cultivando o fungo em processo submerso (sob
agitação) e em superfície (sem agitação) apenas para verificar como o fungo se desenvolvia.
Aparentemente, em superfície foi formada maior quantidade de ácido e, por isso, o processo
em superfície foi o escolhido para esses experimentos.
Para a obtenção de grande número de esporos, A. niger foi crescido em garrafas. A Figura
21 mostra o cultivo.
Figura 21– Cultivo de A. niger para obtenção dos esporos.
Com relação aos meios de cultivo 2, 3, 4 e 5 foi possível observar um maior
crescimento do fungo no meio de cultivo 5, que apresenta maior concentração de glicerina do
biodiesel (80 g/L ). Nesse meio o máximo de concentração celular obtido foi de 41,6 g/L em
aproximadamente 330 horas de cultivo. Os demais meios (2, 3 e 4), que tinham a mesma
concentração de glicerina do biodiesel (10 g/L), levaram a crescimentos muito menores
(Figura 22) porém com alguns perfis de crescimento singulares como pode ser melhor
observado na Figura 23.
Observa-se na Figura 23 que a concentração de células foi maior para o meio de
cultivo 4. Nesse meio foi verificado um crescimento rápido até 86 h, seguido de uma fase
quase que de estabilidade entre 86 e 231 h de cultivo e novamente crescimento rápido após
231 horas, atingindo 7,7 g/L em aproximadamente 330 horas. No meio de cultivo 3 também
houve um crescimento rápido até 86 h de cultivo, em taxa próxima a observada no meio 4
seguido de uma estabilização em torno de 5 g/L até o final do experimento. O meio de cultivo
2 apresentou bastante crescimento em até 136 h e ficou estável até 187 h de cultivo mas
posteriormente houve queda no crescimento.
29
Figura 22 – Concentração celular em função do tempo para Meio de cultivo ♦ 2, ■ 3, ▲4 e
● 5.
Figura 23– Concentração celular em função do tempo para os meios de cultivo ♦ 2, ■ 3 e ▲4.
30
Uma vez que o método de análise da concentração celular foi por medida da massa
celular após secagem, uma queda no crescimento sugere um desaparecimento de biomassa.
Isso só seria possível pela lise celular, o que não parece o caso. Portanto, essa queda pode ter
sido devida a um erro experimental e assumiu-se que o crescimento estacionou em torno de 5
g/L após 187 horas.
A variação de pH e acidez no meio de cultivo estão apresentados nas Figuras 24 e 25.
Figura 24 – Variação de pH em função do tempo para Meio de cultivo ♦ 2, ■ 3, ▲4 e ● 5.
Figura 25 – Variação da Acidez em função do tempo para Meio de cultivo ♦ 2, ■ 3, ▲4 e ● 5.
31
Observa-se que nos meios 3 e 4 não houve variação de pH, mantendo-se em pH
aproximadamente 2. No meio 2, o pH decresceu do valor inicial 5 até 2,2 em torno de 200
horas, aumentando em seguida até 3,0. O pH no meio de cultivo 5 decresceu até 1,92 em 200
horas e prosseguiu até o final mantendo este valor aproximadamente constante.
A acidez no meio de cultivo 2 não acompanhou a variação de pH, pois manteve-se
praticamente constante por todo o tempo de cultivo (em torno de 1,2 g/L). Dessa forma,
verifica-se que a acidez não foi a responsável pelo abaixamento do pH e sim o consumo de
algum nutriente, provavelmente a fonte de nitrogênio ((NH4)2SO4).
No meio de cultivo 3, o pH manteve-se constante, porém a acidez inicial no meio de
cultivo já se mostrava alta, diminuindo em torno de 50 horas e ficando constante até o final do
cultivo. Essa acidez inicial alta observada pode ter sido devida a algum componente do meio.
É fato que esse meio possui a maior concentração de dihidrogeno fosfato de potássio, que
pode ter sido o responsável pela acidez inicial. Não se pode afirmar que houve ou não
formação de ácido nesse meio, pois essa acidez inicial ficou muito alta não permitindo
visualizar se houve aumento da acidez. No meio 4 houve um leve acréscimo no valor da
acidez, apesar do pH ter se mantido constante.
O meio 5 apresentou a produção de ácido máxima, atingindo 2,9 g/L, em
aproximadamente 200 horas. O aumento da acidez foi acompanhado pelo decréscimo do pH.
Nesse meio a concentração de glicerina foi a maior de todas as testadas.
André et al. (2010) obteve acidez em termos de ácido oxálico até 21,5 g/L utilizando duas
linhagens de A. niger a partir de glicerina de biodiesel. Musial et al. (2011) relataram
formação de ácido oxálico também em concentração alta (48,9g/L). No presente trabalho a
baixa formação de ácido pode ter sido devido à linhagem utilizada. Resultado semelhante foi
observado por Papanikolaou et al. (2011) ao cultivar A. niger em óleo de fritura residual.
Apenas uma dentre as cinco linhagens testadas produziu ácido e ainda assim em baixa
quantidade (5 g/L).
Algumas dificuldades encontradas relacionadas com os meios de cultivos são detalhadas
no Apêndice A.
5 CONCLUSÃO
A produção do biodiesel pelo OCR mostra-se bastante promissora levando-se em conta a
quantidade deste passivo ambiental que deve ser descartado em grandes quantidades no
mundo todo. Obteve-se um bom percentual de biodiesel e uma viscosidade que atende a
norma da ANP.
32
Em termos de produção de ácido o meio de cultivo 5 foi o que apresentou melhor
resultado pois a acidez acompanhou o pH dando bom indicativo de formação de algum ácido,
embora não tenha sido feito a análise qualitativa. Além disso, o meio de cultivo 5 apresentou
maior crescimento do microrganismo, desta forma não se verificou a inibição do crescimento
devido as demais substâncias constituintes da glicerina do biodiesel como discutido
anteriormente.
6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Realizar análises por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) nos
meios de cultivo para saber se houve formação de ácidos orgânicos.
Realizar mais experimentos de caracterização do biodiesel para saber se ele
atende os demais parâmetros.
Realizar mais experimentos de caracterização do OCR.
Realizar o experimento com concentração maior de glicerina do biodiesel.
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38
APÊNDICE A – DIFICULDADES ENCONTRADAS
O meio de cultivo apresentou uma camada superficial de um material oleoso em sua
superfície após a esterilização. Provavelmente os ácidos graxos residuais resultantes da reação
de transesterificação, que não são solúveis em água, solvente utilizado em meios de cultivo,
formaram essa camada. Houve dificuldade na remoção desse óleo após filtração do micélio no
meio de cultivo 5, que apresentava alta concentração de glicerina. Na Figura 26 pode-se
observar a presença de óleo após a filtração do micélio. Por isso foi decidido lavar o micélio
com pequena porção de hexano, para a remoção dos resíduos de óleo, e só depois com água,
para a remoção de outros componentes do meio. Esse procedimento foi necessário somente na
primeira amostragem. Nas demais amostragens, provavelmente houve consumo do óleo pelo
fungo.
Figura 26 - Observações durante o experimento o papel de filtro após filtração do meio de
cultivo 5.
Outra dificuldade encontrada foi o preparo do meio de cultivo de concentração maior de
glicerina do biodiesel (Figura 27). A princípio a glicerina e todos os demais nutrientes eram
dissolvidos no meio de só então o pH era ajustado. No entanto, o abaixamento do pH dessa
solução resultava na formação de uma “emulsão amarelada”. A massa era provavelmente
39
composta de ácidos graxos que se tornavam insolúveis com o abaixamento de pH. A partir
daí não se conseguia mais abaixar o valor de pH. Estudando o assunto, foi concluído que
estava havendo formação de tampão entre o hidrogeno fosfato de potássio presente do meio
de cultivo com o sódio residual do catalisador da reação de transesterificação. O problema foi
resolvido com o preparo do meio sendo feito em duas etapas. Na primeira a glicerina era
solubilizada em água, e o pH era ajustado. Só depois era feita a adição dos sais.
Figura 27 - Preparo do meio de cultivo com maior concentração de glicerina do biodiesel.
