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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA MULTICÊNTRICO EM BIOQUÍMICA E BIOLOGIA
MOLECULAR (PMBqBM)
LUCIANA COSTA RAMOS
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO ISOLAMENTO ALGAL NA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE, BACTERICIDA E TOXICIDADE FRENTE À ARTÊMIA
SALINA DAS MICROALGAS ISOCHRYSIS GALBANA E
PHAEODACTYLUM TRICORNUTUM.
SALVADOR
2018
Orientadora: Profa. Drª Suzana T. Cunha Lima
LUCIANA COSTA RAMOS
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO ISOLAMENTO ALGAL NA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE, BACTERICIDA E TOXICIDADE FRENTE À ARTÊMIA
SALINA DAS MICROALGAS ISOCHRYSIS GALBANA E
PHAEODACTYLUM TRICORNUTUM.
SALVADOR
2018
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação Multicêntrico em
Bioquímica e Biologia Molecular, do
Instituto de Ciências da Saúde, da
Universidade Federal da Bahiacomo
requisito para obtenção do título de
Mestre em Bioquímica e Biologia
Molecular.
Orientadora: Drª Suzana Telles da Cunha
Lima
Co-orientador: Drª Russolina Zingali
“... ainda que eu conhecesse todos os mistérios e
toda a ciência, e ainda que tivesse toda fé, de
maneira tal que transportasse os montes, e não
tivesse amor, nada seria.”
1coríntios 13:2b
AGRADECIMENTOS
AGRADEÇO A DEUS PELO QUE ELEFEZ E AINDA VAI FAZER.
À ORIENTADORA E AMIGA, PROFª DRª SUZANA TELLES DA CUNHA LIMA,
PELA COMPETÊNCIA E RESPEITO COM QUE CONDUZIU ESTE PROCESSO,
DO ALVORECER DA IDEIA ATÉ A SUA SÍNTESE.
AO PROFESSOR DRª. RONAN BATISTA PELASVALIOSAS CONTRIBUIÇÕES
NESTE TRABALHO;
À PROFESSORA LUZIMAR PELA AMIZADE E CONTRIBUIÇÕES.
À MINHAFAMÍLIA, QUE SEMPRE APOIOU A MINHA TRAJETÓRIA: RAILDA,
MARCELA, BENJAMIN, JORGE E TERCI.
ÀS MINHAS AMIGAS, QUERIDAS, QUE ACOMPANHARAM A MINHA
TRAJETÓRIA DESDE MUITO: VALÉRIA, ARIELLE E MARIANE.
À FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DABAHIA PELA
CONCESSÃO DA BOLSA DE MESTRADO.
À UFBA, AO IBIO E AO PMBQBM PELO ACOLHIMENTO E ESPAÇO PARA
PRODUÇÃO DESTE TRABALHO.
A TODOS QUЕ DIRETA ОU INDIRETAMENTE FIZERAM PARTE DESSE
MOMENTO, О MЕU MUITO OBRIGADA.
RESUMO
As microalgas têm sido estudadas empesquisas biotecnológicas devido a sua
importância nutricional, econômica e ecológica. Elas são micro-organismos
fotossintetizantes, possuem uma composição química riquíssima por isso
apresentam alto potencial de gerar compostos capazes de exercer atividades
biológicas de interesse.Além disso, as microalgas podem ser produzidas em
condições controladas com um baixo custo, devido a sua capacidade emcrescer
numa grande variedade de ambientes, favorecendo uma produção bioquímica
excepcional. O objetivo do presente trabalho foi avaliaro efeito do isolamento algal
na atividade antioxidante, bactericida e toxicidade frente à Artêmia salina das
microalgasIsochrysisgalbana ePhaeodactylum tricornutum. Adeterminação da
capacidade antioxidante dos extratos e de suas frações foirealizada com base na
capacidade sequestradora de radicais livres do 2,2-Difenil-1–picril-
hidrazila(DPPH).Para os ensaios de toxicidade foram utilizadas larvas de Artemia
salina como modelo experimental ea avaliação da atividade antibacteriana dos
extratos foi determinada pelo método de difusão em disco. O extrato etanólicofoi
ensaiado contra as bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Micrococcusluteus e Pseudomonasaeruginosa. A cromatografia em camada fina
revelou duas frações do extrato de P. tricornutum com atividade antioxidante, para
as duas metodologias de isolamento de algas usadas (centrifugação e
eletrofloculação). Posteriormente, o EC50 foi calculado, o que mostrou ser menor
(maior atividade) pelo método de centrifugação; Também foi demonstrada a cinética
da atividade antioxidante de acordo com o tempo, que aumentou progressivamente,
começando a estabilizar apenas 150 min. Para I. galbana, apenas uma banda muito
discreta foi revelada em cromatografia em camada fina para esta atividade. No teste
de toxicidade com ambas as espécies e para ambas as metodologias, o extrato
etanólico provou ser atóxico. Para a atividade bactericida, apenas o extrato etanólico
de P. tricornutum, pelo método de centrifugação, mostrou uma atividade significativa
contra a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus; para I. galbana não houve
atividade bactericida para nenhum dos tratamentos. A metodologia de separação de
biomassa por eletrofloculação mostrou-se promissora na quantidade total de
biomassa obtida, em comparação com a centrifugação. Mas é provável que algumas
moléculas responsáveis pela atividade bactericida sejam degradadas neste
procedimento. No entanto, a atividade antioxidante foi mantida, mesmo em índices
mais baixos, indicando que as moléculas responsáveis por essa atividade
permanecem parcialmente ativas. Os extratos das espécies estudadas foram
promissores para a prospecção de produtos farmacológicos.
Palavras chave: Biomassa, micoalga e eletrofloculação
ABSTRACT
Microalgae have been studied in biotechnological researchdue to their nutritional,
economic and ecological importance.They are photosynthetic micro-organisms, have
a very rich chemical composition and,according to that, they present high potential to
generate compounds capable of exerting biological activities as antioxidants. In
addition to these facts, microalgae can be produced under controlled conditions at a
low cost due to their ability to grow in a wide variety of environments, favoring
exceptional biochemical production.The objective of the present study was to
evaluate the antioxidant and bactericidal activity, toxicity and to trace the beta-
carotene profile of the marine microalgae Isochrysisgalbana and Phaeodactylum
tricornutum. The method used to determine the antioxidant capacity of the extracts
and their fractions was based on the free radical scavenging capacity of 2,2-
Diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH), thin layer chromatography associated with DPPH,
also evaluating the IC50 of the extracts. For the toxicity tests, larvae of Artemiasalina
were used as experimental model and the evaluation of the antibacterial activity of
the extracts was determined by disc diffusion method. The bacteria Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Micrococcusluteus and Pseudomonasaeruginosa were
tested.Thin layer chromatography revealed two fractions of the P. tricornutum extract
with antioxidant activity, for the two algal isolation methodologies used (centrifugation
and electroflocculation). Subsequently, the EC50 was calculated, which was shown to
be smaller (greater activity) by the centrifugation method; it was also demonstrated
the kinetics of antioxidant activity according to time, which increased progressively,
beginning to stabilize only 150 min. For I. Galbana only a very discrete band was
revealed in thin layer chromatography for this activity. In the toxicity test with both
species and for both methodologies the ethanolic extract proved to be non-toxic. For
the bactericidal activity only the ethanolic extract of P. tricornutum, by the
centrifugation method, showed a significant activity against Gram-positive bacteria
Staphylococcus aureus, whereas for I. galbana there was no bactericidal activity for
either treatment. The methodology of separation of biomass by electroflocculation
showed to be promising in the total amount of biomass obtained, compared to the
centrifugation. But it is likely that some molecules responsible for the bactericidal
activity are degraded in this procedure. However, the antioxidant activity was able to
maintain, even at lower indexes, indicating that the molecules responsible for this
activity remain partially active. The extracts of the species studied were promising for
the prospection of pharmacological products.
Key word: eletroflocculation, biomass, microalgae
Sumário 1- Introdução ..................................................................................................................... 8
2- Justificativa ................................................................................................................. 11
3- Objetivos ........................................................................................................................ 12
3.1 Objetivo geral .....................................................................................................................12
3.2 Objetivos específicos........................................................................................................12
4- Revisão bibliográfica ..................................................................................................... 13
4.1 O meio marinho como fonte de compostos com atividade biológica .....................13
4.2 Microalgas e importância biotecnológica .....................................................................13
4.3 Espécies estudadas ..........................................................................................................14
4.3.1 Isochrysis galbana ........................................................................................................14
4.3.2. Phaeodactylum tricornutum ........................................................................................15
4.4 Métodos de separação da biomassa algal .............................................................17
4.4.1 Centrifugação ...........................................................................................................18
4.4.2 Eletrofloculação .......................................................................................................18
4.5 Atividades biológicas........................................................................................................19
4.5.1 Atividade Antibiótica .....................................................................................................19
4.5.2 Atividade Antioxidante ..................................................................................................20
4.5.3 Teste de toxicidade Frente à Artemia salina ..............................................................22
5- Metodologia: .................................................................................................................. 25
5.1 Organismos-teste estudados ..........................................................................................25
5.2 Cultivo e manutenção das espécies ..............................................................................25
5.3 Processos de extração .....................................................................................................26
5.4 Atividade antibiótica .........................................................................................................26
5.5 Atividade sequestradora de radicais DPPH ..................................................................27
5.5.1 Cromatografias em camada delgada ..........................................................................27
5.5.2 Determinação do EC50 dos extratos. ...........................................................................28
5.6 Testes de toxicidade frente Artemia salina ..................................................................29
6- Resultados e discussão ................................................................................................ 31
6.1 Colheita da biomassa utilizando os métodos de centrifugação e eletrofloculação.
.....................................................................................................................................................31
6.2 Atividade antibiótica .........................................................................................................32
6.3 Atividade Antioxidante .....................................................................................................36
6.3.1 Cromatografias em camada delgada ......................................................................36
6.3.2 Determinaçãodo EC50 dos extratos. ........................................................................37
6.4 Testes de toxicidade frente Artemia salina ..................................................................42
7- Conclusões .................................................................................................................... 45
8- Referências Bibliográficas ............................................................................................ 47
9- Anexos ........................................................................................................................... 58
9.1- Dados da Centrifugação. .............................................................................................58
9.2- Dados da Eletrofloculação. .........................................................................................59
9.3- Artigo publicado na revista Engineering and Technology International Vol:11,
2017. 60
8
1- Introdução
As microalgas pertencem a um grupo bastante heterogêneo de organismos,
sendo os primeiros a crescerem e se proliferarem nos oceanos há mais de 3 bilhões
de anos atrás, quando o ambiente da Terra foi formado (OLAIZOLA, 2003). Estima-
se que existam mais de 50.000 espécies de microalgas, contudo só cerca de 30.000
é que se encontram descritas e estudadas (MOSTAFA, 2012). Estes
microorganismos, pertencentes ao fitoplancton, podem ser encontrados nos mais
variados ecossistemas, como ambientes marinhos e de água doce (GUSCHINNA &
HARWOOD, 2006; MOSTAFA, 2012).
O crescente interesse no estudo de microrganismos como microalgas, alguns
fungos (leveduras, por exemplo) e bactérias, deve-se à essencial importância destes
nas diversas cadeias tróficas e, por serem fonte de um amplo espectro de
compostos, tendo o potencial de serem utilizados nas aplicações comerciais em
distintas áreas (KUPPUSAMY, 2017; CERTIK & SHIMIZU, 1999).
As aplicações mais simples de microalgas compreendem seu uso na
alimentação de animais e do homem. Os relatos da utilização de microalgas na
alimentação humana datam de 2000 anos atrás, com a utilização de Nostoc,
Spirulinaee Aphanizomenonpor chineses e indígenas(LOURENÇO 2006). A partir de
1950 o conhecimento de sua rica composição química abriu outros campos para
utilização da biomassa e de seus extratos, entre eles, a aquicultura, a indústria de
cosméticos e alimentos e a produção de suplementos alimentares (SPOLAORE et
al., 2006). No Brasil os primeiros estudos sobre o cultivo de microalgas foram
realizados no início da década de 1970 na USP sobre o cultivo da diatomácea
Phaeodactylum tricornutum.Atualmente, o interesse na biomassa microalgal e nos
extratos obtidos de biomassa como fonte de novos compostos têm ganhado
destaque devido à diversidade de metabolitos produzidos, em especial os
polissacarídeos, pigmentos, proteínas, enzimas, toxinas e lipídios com vista à
obtenção de tais produtos paraindústrias nas áreas da alimentação humana e
animal, cosmética, farmacêutica e dosbiocombustíveis (KUPPUSAMY, 2017,
COHEN, 1997, NASCIMENTO, 2015).
Várias espécies são cultivadas comercialmente em alguns países e a biomassa
produzida tem sido utilizada como fonte de produto para aplicação na indústria de
9
alimentos. Segundo Pulz& Gross (2004), o mercado de alimentos funcionais,
utilizando microalgas em massas, pães, iogurtes e bebidas, apresenta rápido
desenvolvimento em países como França, Estados Unidos, China e Tailândia. As
principais microalgas cultivadas comercialmente são espécies dos gêneros
Chlorellabeyerinck, (Chlorophyceae) e Arthrospirastizenberger (Cyanophyceae) para
a adição em alimentos naturais (“healthfood”), Dunaliella salina, (Chlorophyceae)
para a obtenção de betacaroteno e Haematococcuspluvialisflotow (Chlorophyceae)
para a obtenção de astaxantina (BECKER, 2004).
Muitas propriedades biológicas de microalgas, como imunoestimulante, antiviral e
anti-hiperlipidêmica, podem ser derivadas dos polissacarídeos presentes na
biomassa (DVIR et al., 2009). Sabe-se que as propriedades biológicas estão
diretamente relacionadas à estrutura química destas moléculas - composição
monossacarídica, padrões de ligações glicosídicas, presença de grupos
substituintes, tamanho molecular e a conformação. Todos estes são fatores
quevariam em função da família, gênero e até mesmo da espécie a que pertence à
microalga, por este motivo elas podem ser ricas em moléculas com propriedades
biológicas diferenciadas (TALYSHINSKY et al., 2002; BAO et al., 2001).
Nas últimas décadas, a resistência aos antibióticos tem sido observada em todo
o mundo em vários microrganismos patogênicos, esta resistência é favorecida pelo
uso indiscriminado de antimicrobianos que aumentam o desenvolvimento de
linhagens resistentes (TORTORA et al., 2005). Isto ocorre por meio da pressão
seletiva resultante de seu emprego clínico (humano e veterinário), industrial
(conservação de alimentos), comercial (engorda de animais) e experimental
(CAIERÃO et al., 2004). Devido a isso, a busca de novos compostos com atividade
antimicrobiana contra cepas patogênicas para humanos tornou-se cada vez mais
importante. Os microorganismos marinhos, em particular, cianobactérias e
microalgas, produzem vários tipos de novos metabolitos secundários com atividade
antiviral e anticancerígena, bem como compostos com atividade antibacteriana e
antifúngica. Assim sendo, pesquisas com microalgasdevem ser realizadas a fim de
que novos compostos sejam descobertos e possam ser usados no combate futuro a
esses microrganismos.
10
Atualmente na área da saúde há um grande apelo para a utilização de
antioxidantes, na forma de suplementos, para combate à peroxidação lipídica que
está fortemente associada a doenças degenerativas como câncer, diabetes e
doenças cardiovasculares (GARCIA E GUERRERO, 2008). Na tecnologia de
alimentos os antioxidantes diminuem a deterioração e aumentam a vida de prateleira
dos produtos. Além disso, a indústria de alimentos emprega algas na constituição de
seus produtos pelo seu relevante conteúdo de fibras, vitaminas e minerais
(CARDOZO et al. 2007).
Segundo Chisti (2004), o cultivo de microalgas apresenta vantagens, tais como:
são facilmente cultivadas; são capazes de sobreviver e se proliferar em uma ampla
gama de condições ambientais, quando comparadas com outras espécies vegetais,
o que resulta em enorme produtividade; ocupam pequenas áreas de produção e
permitem a manipulação das condições de cultivo.
O cultivo em fotobiorreatores pode ser utilizado para proporcionar controle sobre
as condições de cultura e parâmetros de crescimento, incluindo a temperatura, pH e
níveis de CO2 e O2. Isso evita a contaminação da cultura de algas e invasão de
microorganismos concorrentes, aumentando a produção de biomassa (MATA,
MARTINS, & CAETANO, 2010). Esses fatores também podem ser manipulados para
criar melhores condições para a produção de biomoléculas específicas (CHISTI
2007).
Visto que as microalgas possuem uma diversa e rica composição química, estas
apresentam alto potencial de gerarem compostos capazes de exercer atividade
biológica, sendo fortes alvos de bioprospecção. O objetivo do presente trabalho foi
avaliar o efeito do isolamento algal na atividade antioxidante, bactericida e toxicidade
frente à Artêmia salina das microalgas Isochrysisgalbana e Phaeodactylum
tricornutum.
11
2- Justificativa
A presente proposta contribuirá para a obtenção de informações não somente
acerca do potencial bioativo das espéciesIsochrysisgalbanaePhaeodactylum
tricornutum,mas também acerca da melhor metodologia para extração algal, sendo
estas poreletrofloculação e centrifugação, sendo que a última se mostrou de 4 a 10
vezes mais eficiente do que a primeria (Ramos, 2017, Anexo 9.3 e dados não
publicados obtidos posteriormente com a sp Isochrysis galbana).Estes dados são
extremamente relevantespois todas as aplicações biotecnológicas das microalgas
partem da biomassa algal, quanto maior o rendimento, maior obtenção de
bioprodutos, uma vez que estudos recentes demonstraram que muitas espécies de
microalgas apresentam grande potencial bioativo incluindo não somente estudos de
citotoxidade, atividade antimicrobiana e atioxidante, mas também atividade
antiinflamatória, antiviral (ALMEIDA et al., 20011) dentre outros. Desta forma, os
resultados do presente estudo apontarão fontes de produtos naturais para a
indústria farmacêutica e uma provável metodologia mais eficiente de obtenção de
biomassa para esse fim.
12
3- Objetivos
3.1 Objetivo geral
Avaliação das atividades antioxidante, bactericida e toxicidade frente à Artêmia
salina das microalgasIsochrysisgalbana e Phaeodactylum tricornutume o efeito do
isolamento algal através dos métodos de centrifugação e eletrofloculação nessas
atividades.
3.2 Objetivos específicos
Comparação dos métodos de centrifugação e eletrofloculação para a
obtenção da biomassa e extrato dasmicroalgas e paratodas
asatividadestestadas.
Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos das duas espécies de
microalgas frente a bactérias Gram positivas e Gram negativas;
Avaliar atividade antioxidante com base na capacidade sequestradora de
radicais livres do 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH), dos extratos das duas
espécies de microalgas;
Determinar a toxicidade frente àArtemia salinados extratos das duas espécies
de microalgas;
Depositar patente no INPI na obtenção resultados inovadores;
Divulgar os resultados obtidos viacongressos e publicação de artigos na área.
13
4- Revisão bibliográfica
4.1 O meio marinho como fonte de compostos com atividade biológica
Os pesquisadores, no início da década de 1960, começaram a ver os
oceanos como um recurso intacto e novo de compostos potencialmente úteis, o que
não é surpresa, considerando que o ambiente marinho cobre cerca de 70% da
superfície do planeta (BURJAet al., 2001). O meio marinho tem uma grande
diversidade biológica devido aos mecanismos de adaptação e sobrevivência de
organismos quegeralmente é associada a uma grande variedade de substâncias
químicas. Esta diversidade tem sido a fonte de novos compostos químicos com uso
potencial para o desenvolvimento industrial de produtos farmacêuticos, cosméticos,
suplementos nutricionais, sondas moleculares, enzimas, produtos químicos finos e
agroquímicos. Durante as últimas quatro décadas, inúmeros compostos novos foram
isolados de organismos marinhos e demonstrou-se que muitos destes compostos
possuem atividade biológica, tais como: atividade anticancerígena e citotóxica,
antibacteriana, antifúngica, imunossupressores, algicidas,antiinflamatório e
antioxidante, entre outras (EL GAMAL, 2010). Cada uma dessasclasses de
bioprodutos marinhos tem um potencial valor de mercado de milhares de dólares
(POMPONI, 1999). No entanto, apenas entre 1 e 10%de todos os microorganismos
marinhos (incluindo microalgas e cianobactérias) são cultivados por técnicas comuns
aplicadas a obtenção de subprodutos de interesse industrial (BURJA et al., 2001).
4.2Microalgas e importância biotecnológica
Microalgas são algas microscópicas, autotróficas e, assim como plantas,
produzem uma variedade de compostos, alguns desses são coletivamente referidos
como metabólitos secundários, quesão sintetizados pelo organismo no final da
primeira fase de crescimento e na fase estacionária. Assim, as células desses
microorganismos possuem uma composição bioquímica diversificada e essa
composição está relacionada à natureza de cada espécie, bem como aos fatores
ambientais relacionados à região onde o cultivo está sendo realizado e ao meio de
cultura utilizado (MIAO; WU, 2006; ZAMALLOA et al., 2011).
Nos últimos anos, muito interesse tem sido focado no potencial biotecnológico
das microalgas, principalmente devido à identificação das substâncias sintetizadas
14
por estes organismos. A imensa biodiversidade e consequente variabilidade na
composição bioquímica da biomassa obtida das culturas microalgais, aliadas
aoemprego de melhoramento genético e ao estabelecimento de tecnologia de cultivo
em grande escala, vêm permitindo que determinadas espéciessejam
comercialmente utilizadas. Nesse sentido, cultivos demicroalgas têm sido realizados
visando à produção de biomassatanto para uso na elaboração de alimentos quanto
para aobtenção de compostos naturais com alto valor no mercadomundial
(LOURENÇO, 2006).Dentre os inúmeros compostos extraídos, ou compotencial de
exploração comercial, podem ser relacionadosácidos graxos poliinsaturados,
carotenoides, ficobilinas,polissacarídeos, vitaminas, esteróides e diversos
compostosbioativos naturais (antioxidantes, redutores do colesterol etc.),os quais
podem ser empregados especialmente nodesenvolvimento de alimentos funcionais,
por suaspropriedades nutricionais e farmacêuticas.
4.3 Espécies estudadas
4.3.1 Isochrysisgalbana
Isochysisgalbanapertence à ordem Isochrysidaes, incluída na
divisãoPrymnesiophyta (LOURENÇO, 2006). Tal divisão tem espécies unicelulares
(isoladas ou em colônias), apresentam flagelos e possuem uma estrutura conhecida
como haptonema entre eles. A maioria das espécies conhecidas são fotossintéticas
de ambientes marinhos e reproduzem-se por divisão binária (LOURENÇO, 2006).
Contém cloroplastos rodeados por quatro membranas (ISHIDA e GREEN, 2001). Os
pigmentos fotossintéticos caracterizados nesta divisão são clorofilas (a, c1 e c2) e
carotenoides (β-carotenos, fucoxantina, diatoxantina e diadinoxantina) (TAKAICHI,
2011; OBATA e TAGUCHI, 2012). AI. galbanaencontra-se isolada, com forma
esférica ou piriforme (forma de pêra) e mede 5μm de diâmetro aproximadamente
(LOURENÇO, 2006).
Essa espécie tem potenciais aplicações para a produção de PUFA(ácidos
graxos poliinsaturados)(ADARME-VEGA et al., 2012; MARCHETTIet al., 2012;
ALONSOet al., 1992), para a produção de energia (PICARDOet al., 2013b;
SANCHEZet al., 2013), para a co- produção de fucoxantina (molécula com alto valor
nutricional) e lipídios (KIMet al., 2012). Nuñoet al. (2012) indicam I.galbanacomo
aditivo alimentar já que observaram melhorias na saúde de ratos diabéticos
15
alimentados com a microalga (como menos acúmulo de
TAG(Triacilglicerol),colesterol e glicose no sangue). Fradique et al. (2012)
reportaram que a adição de pastas de I. galbanaem alimentos cozidos melhora as
características nutricionais dos mesmos (por aumento direto de ômega-3). Devoset
al. (2006) destacou que I. galbanae a dinoflagelado heterotrófico
Crypthecodiniumcohniisão as únicas espécies de microalgas conhecidas capazes de
produzir DHA (ácido docosahexaenoico) como único ômega-3-PUFA - entre 2 e 25%
do total de ácidos graxos. (DEVOSet al., 2006; MOLINA GRIMAet al., 1994;
ALONSOet al., 1992; ZHUet al., 1997).
Cultivos com alta concentração de CO2 na aeração aumentaram a taxa de
crescimento e a produtividade de biomassa, e também estimularam a síntese de
proteínas e lipídios (com pequeno aumento) (PICARDOet al., 2013a; BHATTIet al.,
2008). A composição química de I. galbanadependerá da cepa, do clone isolado
dentro da cepa e condições de cultivo empregadas (ALONSOet al., 1992; SUKENIK
e WAHON, 1990).
4.3.2. Phaeodactylum tricornutum
As diatomáceas são algas unicelulares abundantes em habitats aquáticos,
elas podem produzir enormes quantidades de biomassa e são responsáveis por
cerca de 20% da fixação global de carbono, aproximadamente 1.000 bilhões de
toneladas do carbono orgânico produzido por fitoplânctons marinhos por ano, cerca
de um terço do total produzido no oceano. Esse carbono produzido permanecefixado
na microalga impedindo a re-entradadessa molécula na atmosfera durante séculos
(FALKOWSKI, 1998). Avaliações recentes sugerem que a produção e exportação
mediada por diatomados pode influenciar as mudanças climáticas através da
captação e sequestro desse CO2 atmosférico (BRZEZINSKI, 2002). O papel que as
diatomaceas desempenham na mitigação das concentrações atmosféricas de CO2
são importantes atualmente por causa do aumento crescente dos níveis de"gás de
efeito estufa" e conseqüente aquecimento global (GRANUM, 2005).
Os plastidios de diatomáceas contêm xantofilas como fucoxantina como
principais pigmentos acessórios para a fotossíntese, que dão a esses organismos
sua cor acastanhada e sua denominação como cromófitas (BHAYA E GROSSMAN,
1991). Filogenéticamente, diatomaceas parecem ter vindo do engolfamento de uma
16
célula eucariótica fotoautotrófica, a maioria são provavelmente um antepassado das
algas vermelhas modernas (MCFADDEN, 2001). Devido a esta endossimbiose
secundária, os plastidioscromofíticos de diatome são cercados por quatro
membranas e referidos como "plastidios complexos".
Além disso, elas desempenham um papel fundamental no ciclo
biogeoquimico da sílica porque a maioria deles está cercada por uma parede
estrutural de sílica (TRÉGUER et al., 1995). A eventual destruição destes
organismos não altera a carapaça, que vem a constituir em material acumulado por
sedimentação eformação de diatomito, conhecido ainda por “terra de diatomáceas”.
Este material depositado é amplamente aplicado nas indústrias como material
abrasivo, refratário a calor, filtro especial para líquidos corrosivos e ainda como
materiais de dispersão da nitroglicerina (dinamite). São conhecidos depósitos com
algumas centenas de metros de espessura e vários quilômetros de extensão em
várias partes do mundo (JOLY, 2005).
Phaeodactylum tricornutum, foco deste estudo, pertence à classe
Bacillariophyceae, sendo comumente conhecidas como diatomácea, nesta classe
predominam organismos unicelulares de vida livre, é uma das mais amplamente
utilizados como modelo para estudar ecologia, fisiologia, bioquímica e biologia
molecular de diatomáceas. É a única espécie no gênero Phaeodactylum. Essa
espécie pode existir em diferentes morfotipos (fusiformes, triradiados e oval), e as
mudanças na forma celular podem ser estimuladas por condições ambientais (DE
MARTINO, 2007). Este recurso pode ser usado para explorar as bases moleculares
do controle da forma da célula e da morfogênese. Ao contrário da maioria das
diatomáceas, essa espécie pode crescer na ausência de silício e pode sobreviver
sem fazer paredes de sílica.
Outra peculiaridade é que, durante a reprodução assexuada, as frusturas
(parede celular) não parecem tornar-se menores. Isso permite uma cultura contínua
sem necessidade de reprodução sexual. Não se sabe se essa espécie pode se
reproduzir sexualmente. Até o momento, nenhuma evidência substancial foi
encontrada para apoiar a reprodução sexual em um laboratório ou outro cenário.
Embora P. tricornutum possa ser considerado um diatomáceo atípico, é uma das
principais espécies modelo de diatomáceas( APT, 1996 e DE RISO 2009) .
17
P. tricornutum é uma das duas diatomáceas cujo genoma foi sequenciado (o
outro sendo Thalassiosirapseudonana. O genoma contém aproximadamente 10% de
genes semelhantes aos procariotas, uma proporção incomum. Mais de 30.000 tags
de seqüência expressa (ESTs) foram organizadas no banco de dados EST de
Diatom (MAHESWARI, 2005).
Phaeodactylum tricornutum emergiu como uma potencial fonte de
biomoléculas ativas de microalgas. Cresce rapidamente e representa uma
alternativa interessante para a produção industrial da PUFA (ácidos graxos
poliinsaturados ). PUFA de cadeia muito longa como EPA(ácido eicosapentaenóico),
DHA (ácido docosahexaenoico) e ácido araquidônico (ARA) receberam grande
interesse, pois são necessários na dieta humana para a saúde e desenvolvimento
normais, particularmente no caso de recém-nascidos e infantes (CRAWFORD,
2000).
4.4 Métodos de separação da biomassa algal
A etapa de separação representa um dos principais obstáculos à produção de
biocompostos em larga escala (CHRISTENSON; SIMS, 2011; RAWAT et al., 2011),
devido ao pequeno tamanho das células, que podem variar de 3-30 μm em
organismos eucarióticos unicelulares (MOLINA GRIMA, 2003) e de 0,2-2 μm em
algumas cianofíceas (LOURENÇO, 2006). Adicionalmente, os meios são
relativamente diluídos, o que acarreta a necessidade de grandes volumes de água
coletados para oprocessamento (UDUMAN et al., 2010). Dessa forma, a
recuperação da biomassa pode representar entre 20-30% do custo total da produção
(MOLINA GRIMA, 2003; BRENNAN, 2010), além de influenciar diretamente os
processos posteriores na obtenção do produto final (CHRISTENSON; SIMS, 2011).
As técnicas atualmente estudadas na separação da biomassa algal incluem métodos
químicos, mecânicos, elétricos e biológicos (DANQUAH et al., 2009).
18
4.4.1 Centrifugação
A centrifugação é, talvez, o método mais rápido para remoção da biomassa
algal. Forças centrífugas promovem a separação com base nas diferenças entre as
densidades; porém, a eficiência depende das características das células das
microalgas, do tempo de aplicação da força e da profundidade do tubo da centrífuga.
Heasmanet al. (2000) analisaram a centrifugação de nove cepas de microalgas
quanto à recuperação e à viabilidade celular e observou que embora a eficiência de
remoção a altas rotações seja elevada, a viabilidade celular dos microorganismos
torna-se comprometida, impossibilitando o destino final da cultura.
Apesar de a centrifugação ser um método eficaz na recuperação da biomassa
algal, sua principal desvantagem é o elevado custo de implantação e operacional,
além da possibilidadede danificação da célula, o que inviabiliza algumas formas de
uso da biomassa (HEASMAN et al., 2000; UDUMAN et al., 2010).
4.4.2 Eletrofloculação
Devido à carga negativa da superfície celular das algas, os métodos de
separação baseados em eletrofloculaçãopodem, por meio do movimento no campo
elétrico, promover a separação das células. As principais vantagens dos processos
eletroquímicos aplicados ao tratamento de efluentes são a operação e a automação
facilitadas e a utilização do elétron como reagente, fornecendo uma alternativa
promissora aos métodos tradicionalmente utilizados (FORNAZARI et al., 2009).
Os ensaios de eletrofloculação têm sido reportados como de elevada
eficiência na remoção de microalgas do meio. Azarianet al. (2007) investigaram o
efeito da eletrocoagulação em fluxo contínuo na remoção de microalgas de águas
residuais, usando eletrodos de alumínio. Os resultados obtidos neste estudo
mostraram uma maior eficiência de remoção em um curto período de tempo com
uma maior entrada energética.
Em outro estudo, Udumanet al. (2010) analisaram a eficiência do método de
eletrofloculação na separação de microalgas marinhas das espécies
Chlorococcumsp. eTetraselmis sp. e obtiveram percentuais de remoção superiores a
98%. Foi reportado que a energia requerida no processo de eletrocoagulação
depende da espécie que se deseja remover, bem como da temperatura e da
19
salinidade do líquido envolvido. Por fim, os pesquisadores sugeriram que o processo
de eletrofloculação em fluxo contínuo pode ser mais favorável energeticamente, uma
vez que o hidrogênio produzido durante o período de indução não seria
desperdiçado.
Adicionalmente, Gao et al. (2010) investigaram a eficiência da
eletrocoagulação/flotação na remoção de microalgas de uma suspensão laboratorial,
comparando reatores operados com eletrodos de sacrifício à base de alumínio e
ferro. Os eletrodos de ferro foram apontados como menos eficientes no processo,
alcançando uma eficiência de remoção de 78,9% contra 100% obtida com os
eletrodos de alumínio, resultado atribuído à maior eficiência da corrente elétrica
gerada pelos eletrodos de alumínio.
4.5Atividades biológicas
4.5.1 Atividade Antibiótica
Em 1928, Alexander Fleming, observando o fenômeno da inibição do
crescimento de culturas bacterianas pelo fungo Penicilliumnotatum, foi capaz de
isolar uma substância de ação anti-séptica seletiva produzida por este fungo, a qual
foi chamada penicilina. No entanto, foi durante a Segunda Guerra Mundial que
Florey e colaboradores em 1942 conseguiram aplicar esta terapia para doenças
infecciosas e produzir este composto industrialmente. Em 1944, Waksman e
colaboradoresconseguiram extrair outro antibiótico de grande importância, a
estreptomicina do actinomicetoStreptomycesgriseus. Desde então, a estreptomicina
foi sintetizada artificialmente. Os antibióticos agem de duas formas: inibindo o
crescimento de bactérias (ação bacteriostática) ou destruindo-os (ação bactericida).
Em alguns casos, inibem as enzimas que causam a formação da membrana celular
das bactérias; em outros casos interferem com as reações enzimáticas do
metabolismo intermediário. As aplicações farmacológicas dos antibióticos devem
responder a dois fatores: inibir in vivo a proliferação desses microorganismose não
ser nocivo para o corpo. (Madiganet al., 1995).
No decorrer das últimas décadas, o desenvolvimento de fármacos eficientes
no combate a infecções bacterianasrevolucionou o tratamento médico, ocasionando
a redução drástica da mortalidade causada por doenças microbianas(RANG 2001).
20
Por outro lado, a disseminação do uso de antibióticos lamentavelmente fez com que
as bactérias também desenvolvessem defesas relativas aos agentes
antibacterianos, com o conseqüente aparecimento de resistência. O fenômeno da
resistência bacteriana(VARALDO 2002) a diversos antibióticos e agentes
quimioterápicos impõe sérias limitaçõesàs opções para o tratamento de infecções
bacterianas, representando uma ameaça para a saúde pública (WISE 2003). Esta
resistência prolifera-se rapidamenteatravés de transferência genética, atingindo
algumas das principais bactérias Gram-positivas, como enterococos, estafilococos e
estreptococos (WALSH 2000, NICOLAOU 1999).Devido ao aumento de agentes
patogénicos resistentese a toxicidade observada de alguns dos medicamentos, a
identificação e produção de novos antibióticos são continuamente necessárias
(GUIMARÃES, 2010;DEMAIN, 2000).
A atividade bactericida dos extratos obtidos de microalgas ainda é pouco relatada
na literatura e seus estudos podem trazer benefícios na área da saúde, já que esses
microorganismos são potenciais fontes de agentes antibióticos. Estudos prévios
demonstraram potencial biotecnológico dos metabólitos secundários extraídos das
microalgas no que diz respeito à inibição de micro-organismos patogênicos, tendo
dados promissores (VAZ, 2012).
4.5.2 Atividade Antioxidante
Antioxidantes são definidos como “qualquer composto que em concentrações
mínimas em relação ao substrato oxidável, seja capaz de inibir ou prevenir
significativamente a oxidação do substrato” (FRANKEL E MEYER, 2000). O aumento
da formação de Espécies Reativas de Oxigênio (ERO's) está frequentemente
associado ao aumento de danos aos tecidos, por oxidar moléculas como lipídios,
proteínas, carboidratos e o DNA. Por isso, nas últimas décadas houve um crescente
interesse pelos suplementos nutricionais antioxidantes (ESTRADA et al., 2001).
Os antioxidantes devem apresentar um efeito protetor, prevenindo ou diminuindo a
severidade de doenças cardiovasculares, câncer e outras doenças relacionadas ao
processo de envelhecimento precoce, as quais são em geral mediadas pelas ERO‟s
geradas durante o burstrespiratório (Estímulo do neutrófilo sendo este capaz de
produzir um metabolismo oxidativo, não mitocondrial, oxidativo ou respiratório
21
caracterizado pela produção de espécies reativas de oxigênio) (PLAZA et al., 2008;
GARCIA E GUERRERO, 2008; ESTRADA et al., 2001).
Antioxidantes podem exercer suas propriedades protetoras em diferentes
estágios do processo de oxidação e por diferentes mecanismos. Existem dois tipos
principais de antioxidantes os “primários” (captadores de radicais livres) e os
“secundários” ou preventivos. O mecanismo antioxidante dos secundários pode
incluir a desativação de metais, a inibição da lipoperoxidação de ácidos graxos e a
regeneração dos antioxidantes "primários", extinguindo o oxigênio singleto(KOLEVA
et al., 2002).
Vegetais superiores em geral e microalgas são boas fontes de antioxidantes
naturais. Durante o processo de fotossíntese estes organismos absorvem luz solar
que é convertida em energia química, mais tarde usada na conversão de CO2 em
carboidratos, e ao mesmo tempo, gerando oxigênio molecular que pode atingir
localmente níveis de concentração elevados. Como o oxigênio é facilmente ativado a
espécies reativas de oxigênio, pela radiação ultravioleta (UV) ou simplesmente pelo
calor da luz solar, tanto plantas quanto microalgasdesenvolveram um mecanismo
protetor o qual consiste na síntese de compostos antioxidantes capazes de
minimizar a concentração destes ERO’s e evitar lesões de oxidação ao seu próprio
tecido (PLAZA et al., 2008; GARCIA E GUERRERO, 2008).
Os antioxidantes protegem nosso organismo contra os radicais livres
formados naturalmente pelas reações do metabolismo ou induzidos por fatores
externos como poluição, estresse, radiação UV, etc (PLAZA et al., 2008). Garcia e
Guerrero(2008) testaram a atividade antioxidante de Porphyridiumcruentum e
Chlorellavulgarise, devido ao seu alto conteúdo de compostos fenólicos (ácido
fenolcarboxilico e seus derivados, catecois e flavonóides) e carotenoides. Neste
trabalho estas espécies apresentaram alto potencial antioxidante, sendo que C.
vulgarisapresentou atividade antioxidante maior que o controle BHA
(ButilHidroxianisol) e BHT (ButilHidroxitolueno). Além desta, a Spirulinaplatensisé,
outra espécie já muito utilizada na preservação de alimentos e prevenção da saúde,
devido aos seus efeitos antioxidantes (HERRERO et al., 2006).
Antioxidantes sintéticos como o hidroxianisolbutilado (BHA), o
hidroxitoluenobutilado (BHT), o Propilgalato (PG) e a hidroxiquinonabutilada (TBHQ)
são comercialmente utilizados (VADLAPUDI, 2012). No entanto, o uso desses
22
compostos ainda é restrito devido à toxicidade e segurança, que podem levar a
problemas sérios de saúde humana (ROCHA et al., 2007; VADLAPUD, 2012).
Em microalgas as substâncias antioxidantes podem ser das mais diversas
naturezas, desde carotenoides, os mais abundantes e solúveis na fração mais
apolar, até vitamina E e C, ficobiliproteínas e polifenóis (PLAZA et al., 2008).
4.5.3 Teste de toxicidade Frente àArtemia salina
A toxicologia estuda o efeito de determinadas substâncias em organismos
vivos. Muitas pessoas utilizam diversas substâncias sem ao menos ter conhecimento
sobre as suas propriedades. Segundo Machado (2008), o conceito de substâncias
tóxicas é bastante relativo, pois depende da dosagem e do indivíduo. Os testes de
toxicidade são elaborados com o objetivo de avaliar ou prever os efeitos de
substâncias tóxicas nos sistemas biológicos e averiguar a toxicidade relativa das
substâncias que são preponderantes na avaliação do ambiente (BAROSA, 2003).
Dentre as várias técnicas existentes, sempre compreendem uma série de dados que
podem ser obtidos por meio de microrganismos e animais de laboratório ou seres
humanos, visando classificar a toxicidade de uma ou mais substâncias químicas. Em
outras palavras trata-se de um bioensaio preliminar que pode ser utilizado no estudo
de substâncias com atividade biológica a fim de avaliar suas possíveis interações
com o organismo (FREITAS DE OLIVEIRA, 2008).
O uso de bioensaios para monitorar a bioatividade de extratos, frações e
compostos isolados de plantas tem sido freqüentemente incorporado na pesquisa
fitoquímica. Entre estes ensaios biológicos,o teste de toxicidade com Artemia salina
(BST-BrineShrimp Test), foi desenvolvido para detectar compostos bioativos em
extratos de plantas (MEYER et al., 1982; NOLDIN et al., 2003). Este teste é um
método simples na pesquisa de produtos naturais, que tem uma boa correlação com
os testes de toxicidade oral aguda in vivo (Parra et al., 2001).
A Artêmia salina (Figura. 1) é um microcrustáceo encontrado em lagos
salgados, salinas e ambientes marinhos, utilizado em diversos estudos de fisiologia
e ganharam popularidade, pois possuem algumas características que o torna alvo
como organismo teste na utilização de bioensaios preliminares em detrimento
daqueles mais caros. São sensíveis frente a diversos compostos, os cistos eclodem
23
facilmente, entre 24 e 48 horase, ainda que estocados por anos a temperatura
ambiente, permanecem viáveis. O teste não requer métodos assépticos e tão pouco
equipamentos especiais na realização, é um teste rápido, de baixo custo, eficiente e
que requer uma pequena quantidade de amostra (2- 20mg) (McLAUGHLIN et al.,
1998; SIQUEIRA et al., 1998).
A literatura apresentou correlações entre a toxicidade geral com o
microcrustáceoArtemia salina e a citotoxicidade em cepas de células humanas de
tumores sólidos (Mclaughlin, 1991; Mclaughlinet al., 1998) e atividade anti-
Trypanosomacruzi (Zani et al., 1995). ). Demonstrou-se que há uma correlação
muito boa entre as concentrações letais medianas (CL50) de extratos de plantas
para larvas de A. salina e as doses medianas letais (DL50) dos mesmos extratos,
administrados por via oral em camundongos (Parra et al., 2001 ).
Existem também outros trabalhos que utilizam o teste de letalidade com A. salina
para testes de toxicidade. Rajabi (2015)comparou o teste de Artemiasalinacom o
teste MTT( brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium]), que é
um teste colorimétrico usado para avaliar a atividade metabólica que está
relacionada com a viabilidade celular, na avaliação da citotoxicidade das
nanoestruturas. Os resultados obtidos de ambos os testes (teste de A. salina e teste
MTT) não apresentaram diferenças estatisticamente significativas (P> 0,05). Esses
achados sugerem que o teste de A. salina pode agilizar experimentos de toxicidade
e diminuir os custos e, portanto, pode ser considerada uma alternativa ao ensaio de
cultura celular in vitro.
De acordo com Ngutaet al. (2011), extratos vegetais que apresentam CL50<
100 µg/mL são considerados altamente tóxicos; extratos que expressam CL50 entre
100 e 500 µg/mL são moderadamente tóxicos; extratos que exprimem CL50 entre
500 e 1000 µg/mL apresentam baixa toxicidade e extratos que expressam
CL50>1000 µg/mL são determinados atóxicos. Resultados que apontam alta ou
moderada toxicidade em Artemia salina têm demonstrado correlação com várias
atividades biológicas (antitumoral, antimicrobiana, antiparasitária, entre outras).
24
Figura 1 – Artêmia salina
Artêmiasalina macho (esquerda) e fêmea (direita). Fonte: http://biologiaacontecendo.blogspot.com.br/2012/04/artemia-salina.html
25
5- Metodologia:
5.1 Organismos-teste estudados
As microalgas utilizadas foram duas espécies marinhas, aPhaeodactylum
tricornutum e aIsochrysisgalbana (Figuras2 e 3).
5.2 Cultivo e manutenção das espécies
O cultivo e manutenção foram realizados de acordo o Manual de Cultivo de
Microalgas (NASCIMENTO et al., 2015), no Laboratório de Bioprospecção e
Biotecnologia (LaBBiotec)- do Instituto de Biologia, da Universidade Federal da
Bahia. A microalga Isochrysisgalbana foi cultivada em meio de cultura Conway
(WALNE, 1966), assim como a diatomácea Phaeodactylum tricornutum, porém para
esta últimafoi adicionada solução de silicato a 0,32M, e mantidas no Banco de
Microalgas Iracema Nascimento- (BMIN). As algasforam cultivadas em reator
tubular, em triplicata, com fotoperíodo de 12h (claro/escuro), fornecendo
luminosidade de cerca 35 μmol de fótons m-2s-1, e temperatura em torno de 22ºC,
com aeração constante e um acréscimo de 2,5% de gás carbono, adicionado
durante a fase clara do fotoperíodo(Nascimento et al, 2015), até que se atingisse o
final da fase de crescimento estacionário.
O acompanhamento do crescimento da biomassa foi realizado diariamente, por
meio de contagem celular em câmara de Neubauer, com auxílio de microscópio
Figura 2 -Phaeodactylum tricornutum Figura 3-Isochrysis galbana
(Ramos, L., 2017) https://jbsmarines.co.uk/isochrysis-galbana-
culture-live-food
26
(ZeissAxiostarplus). O número de células por ml foi determinado de acordo com a
equação a seguir:
A colheita da biomassa foi realizada no final da fase estacionária de crescimento
utilizando dois métodos de separação diferentes: Centrifugação a 5000 rpm por 5
minutos e eletrocoagulação / floculação a 19V 95W. Após a precipitação, as células
foram congeladas a -20°C e, subsequentemente, liofilizadas (Enterprise II, Terroni) e
utilizadas nos ensaios de extração de carotenoides e nos demais ensaios.
5.3 Processos de extração
Para a avaliação da atividade antioxidante, foram pesados 2g de biomassa de
cada um dos procedimentos de isolamento (centrifugação e eletrofloculação), que
foram macerados e diluídos em 100 mL de uma mistura de acetona e éter de
petróleo (4:1). A mistura foi mantida sob agitaçãopor 24 horas e, posteriormente, foi
centrifugada a 5000 RPM por 5 minutos. Reservou-se o sobrenadante e repetiu-se o
procedimento até a coloração da biomassa ser removida. O extrato passou por
rotaevaporação para a remoção do solvente.
Para avaliação da toxicidade e avaliação da atividade antibacteriana, também foi
utilizado 2g de biomassa de cada um dos procedimentos de isolamento
(centrifugação e eletrocoagulação), que foram macerados e diluídos em 100 mL de
Etanol PA. A mistura foi mantida sob agitação por 24 horas e, posteriormente, foi
centrifugada a 5000 RPM por 5 minutos. Reservou-se o sobrenadante e repetiu-se o
procedimento até a coloração da biomassa ser removida. O extrato também passou
por rotaevaporação para a remoção do solvente.
5.4 Atividade antibiótica
A atividade antibacteriana dos extratos foi deteminada pelo métódo de difusão
em disco, de acordo com a norma M2-A8 da NCCLS (NationalCommitte e
Laboratory Standards Institute) / Agencia nacional de Vigilância Sanitária e proposto
por Rabanal et al., (2002) e Karamam et al., (2003). Para a execução do teste de
suscetibilidade aos extratos etanólicos, a solução estoque foi preparada na
27
concentração de 100 mg/mL em DMSO (dimetilsulfóxido). Os extratos foram
testados contra as cepas padrão (American TypeColectionCulture - ATCC) das
bactérias Gram-positivas Staphyloccoccus aureus (ATCC 6538), Micrococcusluteus
(ATCC 10240), das Gram negativas Escherichia coli (ATCC 94863) e de
Pseudomonasaeruginosa (ATCC 15442)que foram cultivadas em placas de Petri
contendo meio Ágar Müeller Hinton por um período de 24 horas a 37°C.
Após o período de incubação, foi realizada a suspensão dos microrganismos em
2ml solução salina estéril homogeneizada até atingir a turbidez da solução padrão
de McFarland 0,5 que corresponde a aproximadamente 1,5 x108 bactérias/mL. A
supensão, bacteriana foi transferida para placas de Petri utilizando swab de algodão
previamente mergulhado na mesma e apertado contra a parede do tubo para a
eliminação do excesso do inóculo, em seguida esfregados suavemente sobre a
superfície do meio de cultura. Discos de papel filtro (com aproximadamente 6,0mm
de diâmetro) contendo 10 μL de cada extrato etanólico (centrifugado
oueletrofloculado), a uma concentração de 100 mg/mL, o mesmo volume de DMSO
e de antibiótico (cloranfenicol a 1,0 mg/mL) foram adicionados às placas, que em
seguida foram incubadas, em posição invertida, a 37°C por 24 horas. O DMSO
(diluente dos extratos) é o controle negativo e o antibiótico é o controle positivo.
Os testes foram realizados em triplicata e em condições estéreis. Para a
avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada a leitura das placas contendo os
discos de papel filtro, após o período de incubação, onde o diâmetro dos halos
formados foi observado e medido com o auxílio de um paquímetro.
5.5 Atividade sequestradora de radicais DPPH
5.5.1 Cromatografias em camada delgada
Para confirmar a composição nos extratos dos pigmentos oriundos das
microalgas e para análise qualitativada atividade antioxidante dos extratos, foram
utilizadas amostras da biomassa refrigerada, repetindo-se o processo de extração
para realizar a análise de cromatografia em camada delgada.
Foram preparadas em placas de alumínio as fases estacionárias, contendo
uma fina camada de sílica gel. A fase móvel ou a solução eluente foi composta por
éter de petróleo e acetona na proporção de 8:2. A análise constitui-se em usar um
28
pequeno volume do padrão (β-caroteno sintético). Com o uso de um capilar, foi
aplicada a solução do padrão (β-caroteno sintético), Ácido ascórbico e dos
extratos(2mg/100µl), todosdiluídos em acetona, a uma pequenadistância da base. A
placa foi incubada em recipiente contendo a solução eluente, onde o deslocamento
do solvente foi observado, e a corrida foi interrompida quando o mesmo atingiu a
extremidade oposta da placa. Após secagem por aproximadamente 5 minutos, as
placas foram borrifadas com solução de DPPH a 0,2% em metanol e deixadas em
temperatura ambiente por 30minutos para posterior análise qualitativa de sua
atividade antioxidante.
Após o período de 30minutos, os extratos com possível atividade antioxidante
geraram manchas amarelas sob o fundo de coloração púrpura, ao passo que os
extratos sem atividade antioxidante expressiva mantiveram a coloração arroxeada
da soluçãode DPPH (TEPE et al. 2005),a imagem da revelação foi registrada
fotograficamente.
5.5.2Determinação do EC50 dos extratos.
Determinação do EC50 do ácido ascórbico
O DPPH foi diluído em metanol, e utilizado a 169µM. O ácido ascórbico na
concentração de 576µM foi adotado como padrão. Para a construção da curva de
calibração foi realizada uma diluição seriada do ácido ascórbico em Metanol, nas
concentrações extremasde2,25µM a 576µM. A curva de calibração do DPPH foi
estabelecida utilizando as concentrações extremasde 2,64µM a 338µM. A reação foi
monitorada pelo decréscimo da absorbância (DUAN et al., 2006)em
espectrofotômetro a 517nm.
Curva padrão para o DPPH
Preparou-se uma solução metanólica de DPPH a 338µM. Em seguida foram
preparadas diluições dessa solução para obtenção das seguintes concentrações:
169 - 84,5 - 42,25 - 21,125 - 10,562 - 5,281 - 2,64µM. Foram feitas leituras das
absorbâncias dessas soluções, em triplicata, utilizando-se metanol como branco. Foi
construída a curva padrão de DPPH plotando-se os três valores das absorbâncias
29
obtidas para cadaconcentração da solução, calculando-se média e desvio padrão
posteriormente.
Determinação do EC50 dos extratos
Para cada método de tratamento (centrifugação e eletrofloculação), as mesmas
concentrações foram testadas. Solução do extrato em metanol nas concentrações
3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25 µg/ml, o metanol foi usado como branco,
como controle negativo foi usado metanol e DPPH na concentração 169µM e para
retirar qualquer interferência de outros metabolitos do próprio exrato, também foi
obtido a absorbância do extrato mais metanol nas concentrações 3200, 1600, 800,
400, 200, 100, 50 e 25 µg/ml (esse valor foi descontado nas leituras de absorção do
extrato com DPPH). A absorbância das amostras foi determinada a 517 nm a 30min
inicialmente e a cada 30min, até 240min (4h), a fim de que a absorbância observada
atingisse um valor constanteao longo do tempo (platô). Este experimento foi
realizado em triplicatas, e os dados foram plotados em gráficos utilizando o
programa GraphPad Prism 5. A partir de então, os valores de EC50 foram
determinados.
5.6 Testes de toxicidade frente Artemia salina
O ensaio de toxicidade dos extratos da espécie em estudo foi realizado
utilizando náuplios do microcrustáceoArtemia salina, de acordo com a metodologia
proposta por Meyer et al. (1982).Os cistos de Artêmia salina foram incubados em
água do mar filtrada e autoclavada com salinidade ajustada a 35% em um recipiente
com dois compartimentos, um protegido da iluminação artificial (lâmpada
fluorescente), onde foram colocados os cistos do microcrustaceo, e outro que
recebeu luminosidade, para que após a eclosão, os náuplios migrassem em direção
ao compartimento iluminado, devido ao fototropismo positivo, após um período de
incubação de 24 a 48 horas.
Após o período de incubação, 10 náuplios foram transferidos para os poços
das placas esterilizadas e contendo os extratos nas concentrações de 10 µg/mL, 100
µg/mL e 1000 µg/mL, em um volume final de 3,0 mL para cada poço. Para controle
30
do teste foram utilizados etanol (1000 µg/mL) e água do mar, e nesses, foram
adicionados 10 náuplios de A. salina. Todos os poços foram expostos à
luminosidade artificial e a contagem dos organismos foi realizada com 24 e 48 horas
de exposição aos extratos, com o auxílio do estereomicroscópio. Foram
considerados inviáveis (mortos) os indivíduos que não apresentaram nenhuma
mobilidade. Os dados obtidos após a contagem dos náuplios foram submetidos à
análise estatística (média, desvio padrão), para cálculo da CL50 (concentração letal
média).
31
6- Resultados e discussão
6.1Colheita da biomassa utilizando os métodos de centrifugação e
eletrofloculação.
Baseado na contagem de células e no tempo de cultivo é possível se estimar
a taxa de crescimento da população de microalgas durante a fase de crescimento
logarítmico (Levasseur& Thompson, 1993). O cálculo é feito baseado na equação
μ = ln (Ny/Nx)/(ty − tx), onde Ny e Nx são os números de células por mL no final (ty) e
no início (tx) da fase de crescimento logarítmico, respectivamente.
Obteve-se μ = 1,80 ± 0,50 cel/mL por diapara a Isochrysisgalbanae 0,25 ± 0,06
cel/mL por diapara a Phaeodactilum tricornutum( Gráfico 1 e 2 ).
O rendimento médio da biomassa foi de 28,34g para eletrofloculação da P.
tricornutum enquanto para o método convencional de centrifugação foi de 7,76g para
a mesma espécie. Para a I. galbana o rendimento médio da biomassa foi de 19,05g
para o método de eletrofloculação e 2,23g para a centrifugação.A etapa de colheita
da biomassa é um dos principais fatores que encarecem a produção de biomassa de
microalgas para os mais diversos fins (Chisti, 2007). O uso de métodos baseados
em eletrofloculação mostra avanços nesse quesito, uma vez que a eficiência na
separação é relativamente alta. Este método rendeu, de 4 a 10 vezes mais
biomassa do que o método tradicional de centrifugação (Ramos, 2017 Anexo 9.3),de
Gráfico 1- Curva de crescimento da I. galbana Gráfico 2- Curva de crescimento da P.tricornutum
32
acordo com a espécie avaliada, o que comprova a sua eficácia. Apesar deste
procedimento ser bastante eficiente em termos de rendimento,foipreciso avaliar se o
extrato tem a mesma eficácia que o outro (obtido por centrifugação). Silva (2013)
mostrou que a eletrofloculaçãonão-convencionalfoi uma metodologia promissora
para separação e ruptura das células de microalgas de efluentes de lagoas de
estabilização, mostrando que os potenciais lipídicos assemelharam-se aos obtidos a
partir de biomassa microalgal cultivada em processos convencionaispara geração de
biodísel.No entanto, não encontrados relatos na literatura a respeito do uso de
biomassa microalgal obtida pelo método de eletrofloculação para preparação de
extratos, visando avaliação de atividades biológicas.
6.2 Atividade antibacteriana
No teste feito para a espéciePhaeodactylum tricornutuma maioria dos extratos
etanólicosobtidos a partir da eletrofloculação não apresentaram inibição do
crescimento dos microorganismos testados, para as duas concentraçõesdo extrato
(50 e 100mg/ml), exceto contra a bactéria E. coli(Gram negativa). Neste caso, para
as duas concentraçõesforam observados halos discretos com a média de
aproximadmente 8mm de diâmetro (Tabela 1), o que representou aproximadamente
44% de atividade inibitória em relação ao controle com o antibiótico(100% ).
Os extratos etanólicos obtidos através de centrifugação apresentaram
atividade antibacteriana frente às bactérias Gram positivas Staphyloccoccus aureus
e Micrococcusluteus, paraas duas concentrações testadas. Para a bactéria S.
aureus nas duas concentrações (50 e 100mg/ml), obteve-se um melhor resultado de
inibição de crescimento, apresentando halo de 10mm para concentração de
50mg/ml e 12mm para concentração de 100mg/ml(Figura 4), o que representou 71%
de sensibilidade para concentração de 50mg/ml e 84,4% de sensibilidade para
concentração de 100mg/ml em relação ao controle com antibióticocloranfenicol
(~15mm)(Tabela 1). No entanto é importante lembrar que o teste de difusão em
disco é um teste qualitativo, indicando apenas se existe ou não atividade
antibacteriana.
33
Assim sendo, foi observado atividade bactericida com extrato etanólico da
microalga P. tricornutum, pelo método de centrifugação,contra a bactéria
Staphylococcus aureus, a qual já havia sido citada em literatura contra ambos os
grupos de bactérias Gram positivas e Gram negativas, e também contra bactérias
resistentes a múltiplas drogas tais como Staphylococcus aureus (MRSA), que não
Gram positivas Gram negativas
Extratos
Staphyloccoccus aureus
(ATCC 6538)
Micrococcusluteus
(ATCC 10240)
Escherichia coli
(ATCC94863)
Pseudomonas Aeruginosa(ATCC
15442)
P. tricornutum (centrifugação) 0,5mg 10,6mm 5mm - -
P. tricornutum(centrifugação)
1mg 12,6mm 6,6mm - -
P. tricornutum (Eletrofloculação) 0,5mg - - 8mm 4mm
P. Tricornutum(eletrofloculação) 1mg - - 8mm 4mm
DMSO 0,01mg - - - -
Antibiótico cloranfenicol 0,01mg 15 mm + 2,2 20 mm +1,6 18mm+0,3 18 mm+1,6
Tabela 1- Atividade dos extratos etanólicos de P. tricornutum frente a 2 bactérias Gram- positivas e 2 Gram -
negativas.
Figura 4 –Ilustração do ensaio de difusão em disco da P. tricornutum
Ilustração do ensaio de difusão em disco para testar o extrato de P. tricornutum em
S. aureus. As áreas transparentes são as zonas de inibição, em A o disco central é o
controle (Antibiótico cloranfenicol 1mg/ml), em B- 3- (centrifugação, concentração
50mg/ml), B- 4 (centrifugação, conc. 100mg/ml).
O sinal– indica que não houve formação de halo para a concentração do extrato correspondente.
34
são suscetíveis a maioria dos antibióticos convencionais, mesmo em níveis de
µM(DESBOIS, 2009). Esta atividade foi atribuída ao ácido eicosapentaenóico, um
composto sintetizado por diatomáceas (WARD 2005, DESBOIS, 2009); este ácido é
encontrado principalmente como um lipídeo polar em componentes estruturais
celulares (por exemplo, membranas) e desempenha um papel na defesa de
microalgas (JÜTTNER2001). Da mesma forma, o ácido hexadecatrienoico isolado de
P. tricornutum exibe atividade contra S. aureus(patógeno Gram positivos). Níveis
elevados de ácido palmitoleico e outros ácidos graxos bioativos também foram
encontrados em P. tricornutum e são ativos contra vários tipos de patógenos
humanos Gram positivos em concentrações muito baixas (µM) e seus efeitos letais
começam imediatamente após a exposição (SMITH 2010).
Prestegard (2015) também analisou os metabólitos na biomassa da P.
tricornutume observou que continha níveis elevados de ácido eicosapentaenóico
(EPA) (25,73% e 28,31%), e ácido palmitoleico (46,36% e 43,66%), que são os
metabólitos responsáveis pela atividade antibacteriana da biomassa.Ométodo de
eletrofloculação, não apresentou halosigificativo para nenhuma bactéria testada por
essa razãonovos estudos devem ser feitos nesse sentido para maiores
esclarecimentos.
O teste com a espécie Isochrysisgalbanafeito comos extratos
etanólicosobtidos a partir da eletrofloculação e centrifugação não apresentaram
inibição do crescimento dos microorganismos testados para as duas diferentes
concentrações (50 e 100mg/ml).
Bruce (1967) mostrou em seu trabalho que a atividade bactericida em I.
galbana está associada a dois componentes pigmentados, clorofila A e B, em extrato
de acetona. A atividade antibacteriana de derivados de clorofila de algas já tinha
sido relatada anteriormente (Sieburth, I965). Nesse trabalho de Bruce (1967) a
cultura de dessa microalga foi colhida no inicio da fase estacionária. As culturas de I.
galbana colhidas nessa fase revelou ter em sua biomassa maior teor de lipídios do
que a cultura de fase exponencial (ZHU 1997).Fabregas( 1986) também mostrou
que a fase estacionária é o melhor momento da colheita de biomassa para a
Isochrysisgalbana, nessa fase a clorofila a atingiu valores entre 0,15 e 0,33 pg /
célula e também observou que o crescimento nas culturas está relacionado às
35
mudanças nas concentrações de nutrientes e as variações queocorrem nos teores
de proteína, clorofila a e carboidratos, na fase estacionária. No presente trabalho a
biomassa da Isochrysisgalbana foi colhida na fase estacionária, que a literatura
sugere que seja o melhor momento para a colheita para essa espécie (BRUCE
1967, ZHU 1997).
O etanol têm sido utilizado para extração de metabólitos com atividade
antibiótica de diversas espécies de microalgas como a Chlorella(PRATT et al., 1944;
KATIRCIOGLU et al., 2005; UMA et al., 2011; NAJDENSKI et al., 2013; VISHNU;
SUMATHI, 2014), a Haematococcuspluvialis, onde a atividade bactericida de seus
extratos etanólicos, têm sido relacionada à presença de ácidos graxos de cadeia
curta, os ácidos propanoico e butanoico (SANTOYO et al., 2009; 2012;
RODRIGUEZ-MEIZOSO et al., 2010). De algum modo o extrato etanólico da I.
galbanano presente estudo não se mostrou eficiente para extração dos metabólitos
responsáveis por tal atividade (clorofila a e b). Aparentemente a acetona se mostrou
mais eficiente para tal fim ( BRUCE 1967), sendo que são necessários novos testes
com outros solventes afim de esclarecer se o método de eletrofloculação para a
separação da biomassa dessa microalga é eficiente não só para a quantidade de
biomassa final, mas também na preservação dos metabólitos de interesse para a
atividade bactericida desta espécie.
36
6.3Atividade Antioxidante
6.3.1 Cromatografias em camada delgada
A intensidade da descoloração indicativa de atividade antioxidante foi
diferente para as espécies de microalgas. As bandas que apresentaram
descoloração mais intensa apareceram alguns minutos após borrifar DPPH, ao
passo que as que apresentaram descoloração fraca apareceram lentamente durante
o intervalo de tempo proposto pela metodologia. As frações dos extratos com
atividade antioxidante destacada produziram manchas amareladas, resultantes da
redução do radical DPPH que foi borrifado, enquanto as frações do extrato sem
atividade antioxidante expressiva mantiveram a coloração púrpura, sem
descoramento, pois não houve redução do radical DPPH, conforme resultados
apresentados nas figuras 5 e 6. Os extratos da P. tricornutum foram os que
apresentaram os melhores resultados, tanto para o método de eletrofloculação
quanto para o método de centrifugação, já a I. galbananão apresentou bandas para
o nenhum método.
Figura 5 –Cromatografia de camada delgada de extratos da P. tricornutum
Na imagem A, cromatografia simples, a fase móvel com Éter de petróleo e Acetona na proporção
8:2, na imagem Ba mesma cromatografia após borrifamento com DPPH 0,2% mostrando as
frações do extrato que possuem atividade antioxidante, em 1 e 2 são os extratos da
eletrofloculação, em 3 e 4 extratos da centrifugação, 5 padrão de Betacaroteno e 6 ácido
ascórbico.
37
6.3.2Determinaçãodo EC50 dos extratos.
O sistema de DPPH é considerado do ponto de vista metodológico, um dos
mais fáceis, precisos e reprodutivos na avaliação da atividade antioxidante de sucos
de frutas, extratos vegetais e substâncias puras. É um ensaio colorimérico, onde se
observa o decaimento da absorbância do radical DPPH, em um determinado
comprimento de onda entre 515 a 528nm, na presença de um composto com ação
antioxidante à solução de DPPH (ALVES et al., 2010; CHEN et al., 2000).O DPPH,
que inicialmente apresenta uma coloração violeta, torna-se amarela à medida que o
radical é reduzido, ocorrendo a formação do DPPH-H (forma reduzida e estável) e
os picos de absorbância da solução tendem a decair. A mudança pode ser medida
por um espectrofotômetro e plotada contra a concentração (REZENDE, 2010).
É essa característica de mudança de coloração do DPPH que permite o
acompanhamento visual da reação. Uma revisão de literatura detalhada revelou que
a maioria dos estudos para determinação da atividade antioxidante usando DPPHé
baseada em tempo de reação fixo variando de 20 a 30 min em vez de reação total
de tempo necessário para atingir o estado estacionário para completar esta reação
redox (MOLYNEUX, 2004). O ensaio DPPH parece de natureza simples, mas devido
ao seu radical de nitrogênio estável, muitos antioxidantes podem reagir com
Figura 6 –Cromatografia de camada delgada de extratos da I. galbana
Em C, cromatografia simples, a fase móvel com Éter de petróleo e Acetona na proporção 8:2,
Em D,a mesma cromatografia após borrifamento com DPPH 0,2% não apresentando bandas.
Em 1 e 2 são os extratos da eletrofloculação, em 3 e 4 extratos da centrifugação, 5 padrão de
Betacaroteno.
38
diferentes cinéticas ou podem não reagir de forma alguma,por esse motivoneste
trabalho também foi avaliado o tempo em que a atividade antioxidante do extrato da
microalga P. tricornutumcomeça a atingir o platô, sabendo-se que o tempo para
alcançar o estado estacionário depende da natureza do antioxidante (MISHRA
2012).
Devido aos resultados obtidos por cromatografia de camada delgada, onde foi
mostrada atividade antioxidante para o extrato da P. tricornutum, foi avaliada a
quantidadede extrato, apenas dessa espécie, necessário para diminuir a
concentração inicial de DPPH em 50%. (EC50).Inicialmente foi construída uma curva
de calibração.
Os gráficos a seguir referem-se à curva padrão realizada em laboratório
empregada para o experimento de DPPH (gráfico 2) e a curva do EC50 do ácido
ascórbico (gráfico 3).
A curva padrão de DPPH foi costruida plotando-se todos os valores das
absorbâncias obtidas x concentração das soluções, esse gráfico (gráfico 2) refere-se
à curva de calibração empregada para o experimento de DPPH.
y = 0,008x + 0,047R² = 0,996
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00
Ab
sorb
ânci
a (5
17n
mm
)
Concentração (µM)
Curva Padrão DPPH
Média Linear (Média)
Gráfico 2: Curva de calibração do DPPH
39
Para uma solução metanólica de DPPH a 169 µM, o valor EC50do ácido
ascórbico determinado no presente trabalho (gráfico 3)foi32µM(5,64 µg/mL), valor
esse que corrobora com a literatura já queKanimozhiePrasad (2009) encontraram o
valor de 33,21µM(5,85 µg/mL) para uma solução de DPPH a 167 µM, eMishra
(2012) obteve o valor de EC50=10,2 µM quando uma solução de DPPH a 50 µM foi
usada.
Para cada um dos extratos deP. tricornutumobtidos da centrifugação e da
eletrofloculação, os valores de EC50 foram determinados em cada tempo de leitura
(Tabela 2), e então plotados noGráfico 4.
Tempo (min)
EC50 (µg/ml)
Extrato deP. tricornutum Ácido Ascórbico
Centrifugação Eletrofloculação
2 - - 5,64
30 1018 3008 -
60 719 1925 -
90 543 1467 -
120 451 1224 -
150 399 1092 -
180 358 984 -
210 339 892 -
Tabela 2: Valores de EC50 determinados para os extratos de P. tricornutumpor centrifugação e eletrofloculação, ao longo de vários tempos de leitura.
Gráfico 3- Curva de atividade antioxidante do Ácido Ascórbico
40
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 30 60 90 120 150 180 210 240
EC 5
0(µ
g/m
L)
Tempo (min)
Centrifugação
Eletrofloculação
240 318 856 -
A Tabela 2 e o Gráfico 4 mostram que os valores de EC50 determinados ao
longo do tempo foram diferentes para os diferentes tratamentos (centrifugação e
eletrofloculação), ainda que sejam extratosprovenientes da mesma espéciee obtidos
com um mesmo solvente (éter de petróleo-acetona 8:2). Nota-se que os valores de
EC50determinados para o extrato da eletrofloculação foram maiores, revelando um
menor potencial antioxidante deste extrato quando comparado com os valores
observados para o extrato da centrifugação. Estes resultadossugerem que os
componentes antioxidantes deP. tricornutum podem estar sendo parcialmente
inativados ou degradados pelo processo da eletrofloculação, o que justificaria o
menor potencial antioxidante observado para esse extrato, mesmo tendo-se um
rendimento de biomassa(28,34 g) aproximadamente 4 vezes superior ao método da
centrifugação (7,76 g).
No entanto parece que o platô se inicia no mesmo momento para os dois
tratamentos que é no tempo 150min (2h30min), tempo esse que Brand-Williams
(1994) define em seu trabalho como os compostos que reagem mais lentamente
Gráfico 4: Curva de cinética de atividade antioxidante de extratos de P. tricornutum obtidos
por centrifugação e eletrofloculação, ao longo de vários tempos de leitura.
41
com o DPPH. Brand-Williams (1994) e Mishra (2012)classificaram os componentes
antioxidantes nas categorias de rápidos(<30 min), médios (de30 min a 1 h) e
lentos(> 1 h), com base na cinética de consumo do DPPH.Brand-Williams
(1994)testou 20 compostos, destes apenas três, incluindo ácido ascórbico, ácido
isoascórbico e isoeugenol reagiram rapidamente com o DPPH, atingindo o platô em
menos de 1 min. O segundo tipo de comportamento foi Intermediário apenas com
ácido rosmarínico e tocoferol. Para estas reações, o estado estacionário foi atingido
após aproximadamente 30 min para ambos os reagentes. Os 15 compostos
restantes reagiram mais devagar com o DPPH, que levaram de 1 a 6 h para atingir o
estado estacionário. Em contraste com outros pesquisadores (LAMAISON, 1988,
SHIMADA, 1992 e JUMÉNEZ, 1993) que determinaram o EC50 após 30 minutos de
tempo de reação, onde as atividades antiradical foram analisadas no estado
estacionário.
O uso de DPPH fornece uma maneira fácil e rápida de avaliar as atividades
anti-radicais dos antioxidantes, mas deve-se ter cuidado ao usar o método e a
interpretação os dados, foi mostrado nesse trabalho que o melhor momento para
avaliar a atividade antioxidante atráves do método de DPPH com extratos de P.
tricornutum é pelo menos depois de 3h.Nossos resultados confirmaram que a
fixação dotempo de 30 minutos para a leitura da absorbância do DPPH no
espectrofotômetro, muito frequentemente encontrado em vários trabalhos publicados
que descrevem a avaliação do potencial antioxidante de extratos vegetais, pode
subestimar atividades de eliminação deste radical por reações mais lentas de
algumas moléculas antioxidantes destes extratos.
42
6.4Testes de toxicidade frente Artemia salina
Neste trabalho foram avaliados extratos etanólicos da microalga
Phaeodactylum tricornutum e Isochrysis galbana utilizando o materialprovenientedos
diferentes métodosde separação da biomassaalgal já citados acima.
No intervalo de 24h e 48h o potencial citotóxico dos extratos das duas
microalgas pelos métodos de eletrofloculação e centrifugação não foi suficiente para
afetar, nas três concentrações testadas( 1000, 100 e 10 mg/ml), cinquenta por cento
da população de Artêmia salina(Tabela 2). De acordo com Nguta et al. (2011),
extratos vegetais que apresentamCL50>1000 µg/mL são determinados
atóxicos,assim sendo, as substâncias presentes nos extratos obtidos com
etanoldestas espécies testadas no presente trabalho não apresentamatividade
tóxica. Porém, outros ensaios confirmatórios podem vir a ser necessários, caso
estas microalgas venham a ser utilizadas como fitofármaco posteriormente.
Segundo Meyer (1982) o ensaio de letalidade frente à Artemia salina, é uma
técnica amplamente utilizada para avaliação prévia da atividade tóxica de extratos
de plantas e/ou substâncias com atividades farmacológicas, devido a sua
simplicidade, rapidez e baixo custo. Avaliações toxicológicas possibilitam a seleção
de uma grande variedade de substâncias com atividade biológica, que podem ter
aplicação terapêutica, produzindo novos fármacos de acordo com a toxicidade
apresentada (CARBALLO et al., 2002).
Para determinação preliminar de atividade antitumoral este bioensaioé tido
como uma ferramenta útil (MEYER et al., 1982).De acordo com estudo realizado por
McLaughlin et al. (1998) o teste apresentou boa correlação com a citotoxicidade
sobre alguns tumores humanos sólidos e conduziu para a descoberta de novas
classes de agentes antitumorais ativos. Guillén(2012) mostrou o efeito tóxico
dosextratos da cultura devinte e oito espécies de microalgas e
cianobactériasmarinhas, asextrações foram realizadas com água, clorofórmio e
diclorometano; foi testada a atividade antimicrobiana e toxicidade de 168 os extratos.
A toxicidade foi avaliada usando náuplios de Artemia franciscana como organismo
modelo.O único extrato tóxico contra nauplios de Artemia foi obtido a partir do
sobrenadante
43
Tabela 2. Tabela de bioensaio de letalidade para extratos etanólico das espéciesPhaeodactylum tricornutume Isochrysisgalbanafrente à Artemiasalina
P. tricornutum
11mg/ml
µg/ml Nº % +
µg/
ml I. Galbana
11mg/ml
µg/ml Nº % + µg/ml
Concentração do extrato
(mg/ml)
A. salina
expostas
Média de mortalidad
e 48h Desvio Padrão CL50
Concentração do extrato
(mg/ml)
A. salina
expostas
Média de mortalidade
48h Desvio Padrão CL50
Eletrofloculação
1000 10 0 0 _
Eletrofloculação
1000 10 0 0 _
100 10 0,1 0,33 _ 100 10 0,1 0,33 _
10 10 0 0,33 _ 10 10 0 0 _
Centrifugação
1000 10 0,1 0,33 _
Centrifugação
1000 10 0 0 _
100 10 0,1 0,33 _ 100 10 0 0 _
10 10 0,2 0,44 _ 10 10 0 0 _
Controle Etanol 1000 10 0 0 _ Controle Etanol 1000 10 0 0 _
Controle água
do mar _ 10 0 0 _
Controle água do
mar _ 10 0 0 _
44
da microalgaNitzschiathermalis usando clorofórmiocomo solvente que apresentou
um LC50-24 h de 773,4 mg l-1.
Rajabi (2015) comparou o teste de Artemia salinacom o teste MTT ( brometo de
[3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium]), um teste colorimétrico usado para
avaliar a viabilidade celular na avaliação da citotoxicidade das nanoestruturas. Os
resultados obtidos de ambos os testes (teste de A. salina e teste MTT) não
apresentaram diferenças estatisticamente significativas (P> 0,05). Esses achados
sugerem que o teste de A. salina pode agilizar experimentos de toxicidade e diminuir
os custos e, portanto, pode ser considerada uma alternativa ao ensaio de cultura
celular in vitro.
45
7- Conclusões
No atual estudo, as análises do efeito do isolamento algal por eletrofloculação
em comparação com a centrifugação para o potencial antibiótico, antioxidante e
toxicidade frente àArtemia salina, com extratos da biomassa de Isochrysisgalbana e
Phaeodactylum tricornutumexibiram respostas promissores.
Com relação ao rendimento de biomassa, o método de eletrofloculação
rendeude 4 a 10 vezes mais biomassa do que o método tradicional de centrifugação
(Ramos, 2017; Anexo), apesar deste método de separação algal ser bastante
eficiente, este trabalho trouxe uma questão importante na avaliação da eficácia em
comparaçãocom a centrifugação na preservação das moléculas com princípios
bioativos.
Na análise da atividade antibacteriana, no teste feito para a espécie
Phaeodactylum tricornutum a maioria dos extratos etanólicos obtidos a partir da
eletrofloculação não apresentou inibição significativa do crescimento dos
microorganismos testados, já os extratos etanólicos obtidos através de centrifugação
apresentaram atividade bactericida frente às bactérias Gram positivas
Staphyloccoccus aureus e Micrococcusluteus, para as duas concentrações testadas,
tendo a primeira um melhor resultado de inibição de crescimento. Para os extratos
da eletrofloculação é possível que essa metodologia tenhade algum modo,
degradado as moléculas responsáveis por essa atividade.
O teste com a espécie Isochrysisgalbanafeito com os extratos etanólicos obtidos
a partir da eletrofloculação e centrifugação não apresentaram inibição do
crescimento dos microorganismos testados. É possível que o extrato não possua
atividade antibacteriana.
Este estudo demonstrou potencial biotecnológico das moléculas extraídas da
microalga P. tricornutumno que diz respeito à inibição de micro-organismos
patogênicos.
Com relação à atividade antioxidante, a cromatografia de camada delgada
revelou essa atividade para o extrato da P. tricornutumobtido pelos dois métodos,
sendo queo aparecimento das bandasmais intensas após borrifar
DPPHfoiobservado para o método de centrifugação, mesmo sendoformadas bandas
46
para o métódo de eletrofloculação; Para a I. galbana, não houve a formação de
bandas, por esse motivo apenas os extratos da P. tricornutum foram utilizados para
o cálculo do EC50 e avaliação da cinética de DPPH, chegando-se àconclusão que a
atividade antioxidante foi menor para a eletrofloculaçãoem relação à centrifugação,
indicando que possívelmente algum componente antioxidante foi parcialmente
inativado ou degradado pelo método de eletrofloculação. Os resultdos também
sugerem que o tempo para se alcançar o platô (estabilização da reação com DPPH)
para esses extratos é a partir de 3h, e tais extratos devem, portanto, ser
classificados como lentos em relação à cinética de consumo do DPPH.
O teste de toxicidade dos extratos frente àArtemia salina demonstrou que as
amostras foram atóxicas para as concentrações testadas, o que é um resultado
positivo, levando em consideração as possíveis aplicações dos extratos para fins
farmacológicos ou na área de cosméticos.
Portanto, o atual estudo constitui-se como investigação inédita referente
aopotencial antibacteriano, antioxidante e toxicidade da biomassa de
Isochrysisgalbana e Phaeodactylum tricornutumobtida por duas metodologias
diferentes: centrifugação e eletrofloculação.Essa avaliação preliminar demonstrou
que apesar do método de eletrofloculação produzir um rendimento excepcional de
biomassa, cerca de quatro a dez vezes mais que a centrifugação, essa metodologia
parece estar contribuindo para a degradação ou inativação das moléculas
responsáveis pelas atividades biológicas, no entanto são necessários novos estudos
para maiores esclarecimentos. A respeito das espécies analisadas, a P. tricornutum
demonstrou ser uma microalga promissora, uma vez que apresentou potencial
antioxidante, antibacteriano e nenhuma toxicidade, o que a torna possível alvo na
indústria farmacológica, de cosméticos e nutracêutica.
47
8- Referências Bibliográficas
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58
9- Anexos
9.1- Dados da Centrifugação.
Dados da absorbância das soluções contendo diferentes concentrações dos extratoscom DPPH169 µM, em triplicata,a 517 nm, em tempos de 30 em 30 minaté 240min (4h). Concentração
(µg/ml) Replicatas Tempo
30' 60' 90' 120' 150' 180' 210' 240'
3200
1 1,315 1,475 1,571 1,663 1,729 1,806 1,874 1,943
2 1,356 1,486 1,586 1,647 1,710 1,785 1,849 1,914
3 1,360 1,494 1,589 1,683 1,748 1,832 1,885 1,951
1600
1 0,995 1,208 1,365 1,499 1,598 1,695 1,757 1,827
2 1,027 1,206 1,367 1,500 1,580 1,695 1,755 1,821
3 1,050 1,234 1,378 1,511 1,606 1,720 1,783 1,849
800
1 0,676 0,874 1,038 1,185 1,300 1,431 1,502 1,587
2 0,714 0,881 1,044 1,192 1,305 1,433 1,503 1,584
3 0,744 0,916 1,077 1,225 1,339 1,475 1,550 1,631
400
1 0,481 0,631 0,759 0,881 0,978 1,089 1,153 1,229
2 0,510 0,645 0,780 0,903 0,998 1,109 1,172 1,246
3 0,512 0,649 0,778 0,902 0,999 1,105 1,162 1,239
200
1 0,316 0,418 0,502 0,563 0,616 0,672 0,709 0,751
2 0,330 0,416 0,500 0,573 0,632 0,698 0,736 0,783
3 0,353 0,449 0,533 0,616 0,683 0,758 0,805 0,857
100
1 0,196 0,245 0,286 0,327 0,363 0,399 0,427 0,457
2 0,179 0,248 0,302 0,348 0,380 0,408 0,433 0,456
3 0,215 0,283 0,316 0,361 0,398 0,425 0,445 0,471
50
1 0,085 0,108 0,125 0,151 0,161 0,184 0,190 0,205
2 0,114 0,147 0,166 0,191 0,207 0,226 0,225 0,239
3 0,139 0,183 0,204 0,232 0,251 0,277 0,291 0,312
25
1 0,007 0,019 0,016 0,027 0,033 0,042 0,045 0,045
2 -0,016 0,007 0,011 0,027 0,036 0,051 0,053 0,052
3 0,048 0,081 0,095 0,116 0,129 0,143 0,155 0,166
59
9.2- Dados da Eletrofloculação.
Dados da absorbância das soluções contendo diferentes concentrações dos extratoscom DPPH169 µM, em triplicata, a 517 nm, em tempos de 30 em 30 minaté 240min (4h).
Concentração
(µg/ml) Replicatas Tempo
30' 60' 90' 120' 150' 180' 210' 240'
3200
1 1,101 1,331 1,504 1,632 1,749 1,883 1,975 2,055
2 1,096 1,319 1,493 1,624 1,740 1,877 1,959 2,042
3 1,121 1,333 1,506 1,640 1,753 1,887 1,978 2,060
1600
1 0,770 0,961 1,113 1,240 1,350 1,434 1,531 1,624
2 0,787 0,972 1,126 1,257 1,370 1,456 1,552 1,637
3 0,798 0,976 1,129 1,259 1,368 1,448 1,546 1,635
800
1 0,592 0,738 0,848 0,941 1,024 1,083 1,152 1,219
2 0,551 0,691 0,792 0,878 0,954 1,013 1,085 1,150
3 0,573 0,715 0,827 0,922 1,002 1,065 1,144 1,212
400
1 0,410 0,487 0,544 0,598 0,653 0,679 0,724 0,725
2 0,406 0,482 0,535 0,583 0,628 0,641 0,686 0,734
3 0,428 0,507 0,567 0,625 0,681 0,714 0,965 0,807
200
1 0,284 0,318 0,354 0,383 0,420 0,420 0,454 0,483
2 0,293 0,329 0,367 0,396 0,414 0,433 0,456 -0,523
3 0,274 0,312 0,345 0,375 0,398 0,416 0,446 0,465
100
1 0,192 0,211 0,236 0,254 -0,728 0,285 0,308 0,339
2 0,201 0,208 0,222 0,232 0,240 0,241 0,247 0,263
3 0,174 0,194 0,212 0,227 0,241 0,252 0,267 0,277
50
1 0,132 0,130 0,134 0,145 0,162 0,157 0,170 0,187
2 0,114 0,119 0,115 0,128 0,143 0,146 0,155 0,158
3 0,073 0,095 0,100 0,110 0,128 0,139 0,156 0,157
25
1 0,110 0,116 0,128 0,144 0,170 0,172 0,197 0,205
2 0,062 0,062 0,069 0,069 0,081 0,087 0,093 0,100
3 0,082 0,085 0,094 0,093 0,101 0,108 0,109 0,110
60
9.3- Artigo publicado na revista Engineering and Technology International
Vol:11, 2017.
Evaluation of Electro-flocculation for Biomass Production of Marine Microalgae Phaeodactylum tricornutum
Luciana C. Ramos1, Leandro J. Sousa1, Antônio Ferreira da Silva2, Valéria Gomes Oliveira1, Suzana T. Cunha
Lima1
1Institute of Biology, 2Institute of Physics, Federal University of Bahia (UFBA). Salvador – BA, Brazil.
Abstract: The commercial production of biodiesel using microalgae demands a high-energy input for harvesting biomass, making production economically unfeasible. Methods currently used involve mechanical, chemical and biological procedures. In this work, a new flocculation system is presented as a cost and energy effective process to increase biomass production of Phaeodactylum tricornutum. This diatom is the only species of the genus that present fast growth and lipid accumulation ability that are of great interest for biofuel production. The algae, selected from the Bank of Microalgae, Institute of Biology, Federal University of Bahia (Brazil), has been bred in tubular reactor with photoperiod of 12h (clear/dark), providing luminance of about 35 μmol photons m-2s-1, and temperature of 22°C. The medium used for growing cells was the Conway medium, with addition of silica. The seaweed growth curve was accompanied by cell count in Neubauer camera and by optical density in spectrophotometer, at 680nm. The precipitation occurred at the end of the stationary phase of growth, twenty one days after inoculation, using two methods: centrifugation at 5000rpm for 5 min, and electro-flocculation at 19 EPD and 95W. After precipitation, cells were frozen at -20oC and, subsequently, lyophilized. Biomass obtained by electro-flocculation was approximately 4 times greater than the one achieved by centrifugation. The benefits of this method are that no addition of chemical flocculants is necessary and similar cultivation conditions can be used for the biodiesel production and pharmacological purposes. The results may
contribute to improve biodiesel production costs using marine microalgae.
Keywords:Biomass, diatom, flocculation, microalgae.
Introduction:
The growing interest in the study of micro-organisms as microalgae, fungi and bacteria, is due to the essential importance of them as source of a wide range of compounds used in different areas such as nutrition, human and animal health, wastewater treatment, energy production and pharmaceutical industry [1]. In the production of biodiesel and ethanol, microalgae have a higher photosynthetic efficiency (4-7%) and increased productivity (390-700bep), compared to sugarcane (2-3% and 210-250bep ha-1 year-1), this being the only traditional culture with efficiency above 1% [2]. Microalgae present, therefore, great productive potential, compared to other plant sources.
Different methods have been used for harvesting microalgae and producing algal biomass, the most common arecentrifugation, filtration, flotation, chemical and electroflocculation. Despite some physical limitations, these methods are quite capable of separating the biomass from the surrounding media. The difficulty is the high cost of microalgal isolation, estimated to be about 25% of the total production [3]. Therefore, the success of microalgal biofuels depends on finding more efficient methods of biomass production, which varies among species due to cell size and morphology.
61
The aim of this work is to evaluate biomass production of the marine microalgae Phaeodactylum tricornutum using two methods of algal isolation: centrifugation and electroflocculation. Algal growth in a tubular photo-bioreactor was also analyzed by cell count and absorbance, at regular intervals. This diatom is the only species of the genus that presents fast growth and lipid accumulation of great interest for biofuel production [4]. In addition to that, it produces different biomolecules of pharmacological interest under nitrogen starvation [5].
Methods:
The microalgae P. tricornutum (Figure 01) was grown in tubular reactor (patent: Privilege of Innovation, registration No. 0000221105500270), in triplicate, with photoperiod of 12h (clear/dark), providing luminance of about 35 μmol photons m-2 s -1, and temperature around 220 C. This photobioreactor (Figure 02) has total capacity of approximately 70 liters (7 for each cylinder). The species has been bred in Conway medium [6] added to silica (6,5 x 10 -4
mM), with constant aeration and an increase of 2.5% of carbon gas during the light phase of the photoperiod, until the end of the stationary growth phase. To evaluate growth, two methods were used: daily cell count in Neubauer chamber and absorbance reading (680 nm) at the spectrophotometer (Shimatzu). Based on cell count and time of cultivation, it was estimated the growth rate during the logarithmic phase [7]. The calculation was made based on the equation: μ = ln (Ny/Nx)/(ty − tx), where Ny and Nx are the numbers of cells per mL on the final day (ty) and starting day (tx) of the logarithmic growth phase, respectively. Twenty one days after seeding the cells, the microalgae reached the stationary phase, and then, followed algal isolation forobtaining the biomass. The total volume of medium (content of one cylinder or 7 liters) containing the microalgae was homogenized and divided in two aliquots: the first followed centrifugation at 5000rpm for 5 min (Eppendorf Centrifuge 5402), and the second, electro-flocculation at 19 EPD and 95W for 15 min. After isolation, both
pelletsproceeded to lyophilization (Enterprize II Terroni) for 12 hours and the yield of biomass was compared between both isolation methods.
Results:
The P. tricornutum from the Institute of Biology (UFBA) microalgae Bank was well adapted to the cultivation conditions described and presented regular growth and morphology (Figure 01) when bred in a closed photobioreactor.
Figura01.Phaeodactylum tricornutum cultivation
Figure 02. Photo-bioreactor (patent: Privilege of Innovation, registration No. 0000221105500270).
The growth rate (µ) obtained for this species, according to cell counts in Neubauer chamber was 1,8 ± 0,5 cells mL-1 day1, indicating that this algae can efficiently grow in a photobioreactor. The growth curve according to this evaluation method is shown in Figure 03
62
Cell growth was also followed by absorbance readings at 680nm in a spectrophotometer, since algae growth may be better represented by different methods, according to cell morphology and size. Results are shown in Figure 04.
Both methods used for analyzing microalgae growth (cell counts and absorbance at 680nm) demonstrated to be appropriate for the algal species selected, and could be applied for calculating growth rates. After the end of the stationary phase (20th day after inoculation) the harvesting of biomass was performed.
Considering biomass separation, the electroflocculation device (Figure 05) constructed at the Laboratory of Bioprospection and Biotechnology(LABBIOTEC) of Federal University of Bahia, demonstrated to be very effective for P. tricornutum. This is the first time that this isolation method and device was used for this diatom. Figure 05A shows the medium containing the microalgae after stationary growth phase, before electric discharge was applied. The cells are not
separated, as can be seen by the dark brown color cultivation medium. After 15 min. of continuous electric discharge, the cells are completely isolated from the medium (Figure 05B), and biomass is totally separated.
Centrifugation method of algae isolation was also applied. This method is commonly used for obtaining biomass for different purposes. With the species used in this study, many hours and innumerous centrifugation cycles were necessary for isolating cells form the total volume of the cultivation medium. In large scale procedures, it would be necessary an industrial centrifuge, with increased energy demand, which makes the procedure ineffective and expensive. Another negative aspect is the time spent for isolation by this method (3 hours compared to 15 min by electro-flocculation) resulting in a non-satisfactory amount of biomass yield. This time can be even longer depending on the culture volume and size of centrifuge rotors and tubes.
Figure 05. Electro-flocculation device before (A) and after (B) isolation of microalgae.
Between the two techniques compared for efficiency of harvesting, the electro-flocculation yielded significantly higher production of biomass (Figure 06). Following centrifugation it was obtained 1.14 ± 0.24 g/L, whereas the electro-flocculation yielded 4.05 ± 0.33 g/L.
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500
0 5 10 15 20 25 Op
tical d
en
sit
y
Days
A
B
63
Figure 06. Biomass production (g) chart by two algal isolation methods,for 7 liters of P. tricornutum cultivation medium.
Discussion:
Among all algal isolation methods, electro-flocculation is a physical/chemical process that has the advantages of being simpler to operate and provides more predictable results. Contrasting with chemical flocculation, it does not introduce unnecessary anions in the growth medium, which can result in the lowering of pH [3]. The use of electro-flocculation to a species with high potential for biomolecules production (including biodiesel), as Phaeodactylum tricornutum, is of great importance since it may lead to economic advances in biomass harvest stage, one of the main factors for increasing production costs. In the present work, this method yielded approximately 4 times more biomass than the traditional method of centrifugation, proving its effectiveness.
It is well known that during different stages of growth, microalgae may suffer changes in the cell content or even on the morphology [8]. At stationary phase, cells tend to increase their reserves of lipids, proteins and carbohydrates, and reduce the rate of replication. This phase was achieved with P. tricornutum growth curve at the 16th day after algal inoculation. The addition of carbon dioxide to the growth medium, previously shown [9] to increase microalgae biomass and metabolites production was also efficient for the studied species. Although the use electro-flocculation could be fairly effective, it is worth mentioning that the product from this treatment may be limited due to the presence of salts formed during the process. With the
marine microalgae P. tricornutum tested in this study, this effect was not observed, demonstrating that the selected species could be a good choice for obtaining high production of biomass, and consequently increased amounts of bioproducts.
Although, diatoms P. tricornutum may grow in the absence of silica, which is not possible for many microalgae, the additionof silica, which is not possible for many microalgae, the addition of 6,5 x 10-4
mM of this micronutrient demonstrated to contribute for better biomass yield, when grown in the photo-bioreactor under tested conditions.
The results presented in this work greatly contribute for indicating an appropriate species and procedure for algal isolation that may contribute to pharmacological and energy purposes, since no contaminant was generated during algal isolation. Moreover, microalgae appear to be the only source of renewable [10] biodiesel that is capable of meeting the global demand for transport fuels.
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5
10
15
20
25
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