UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE QUIMICA ... · instituto de quimica programa de pÓs-graduaÇÃo em quÍmica ricardo leal cunha desenvolvimento de mÉtodo analÍtico para

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE QUIMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

RICARDO LEAL CUNHA

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA

DETERMINAÇÃO DE ESTIMULANTES ANFETAMÍNICOS

INALTERADOS DE INTERESSE FORENSE EM URINA

EMPREGANDO DLLME E GC-MS

Salvador 2013

2

RICARDO LEAL CUNHA

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA

DETERMINAÇÃO DE ESTIMULANTES ANFETAMÍNICOS

INALTERADOS DE INTERESSE FORENSE EM URINA

EMPREGANDO DLLME E GC-MS

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química, Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Química Analítica. Orientador: Prof. Dr. Pedro Afonso de Paula Pereira

Co-orientador: Prof. Dr. Wilson Araújo Lopes

Salvador 2013

3

4

Cunha, Ricardo Leal.

Desenvolvimento de método analítico para determinação de estimulantes anfetamínicos inalterados de interesse forense em urina empregando DLLME e GC-MS / Ricardo Leal Cunha. - 2013.

100 f.:il. Orientador: Prof. Dr. Pedro Afonso de Paula Pereira. Co-orientador: Prof.Dr. Wilson Araújo Lopes

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Instituto de Química, Salvador, 2013.

1. Estimulantes - Anfetamínicos. 2. Anfetaminas - Abuso. 3. Drogas - Abuso. 4. Analise cromatográfica. 5. Microextração. I. Pereira, Pedro Afonso de Paula. II. Lopes, Wilson Araújo. III. Universidade Federal da Bahia. Instituto de Química. III. Título.

CDD – 615.19 CDU – 543.544:615..074

Sistema de Bibliotecas – IQ/UFBA

5

Dedico este trabalho

Aos meus pais, pelos ensinamentos, pela educação e por tudo que proporcionaram

ao longo da minha vida. A minha mãe Glória, pelas orações, pelo amor e dedicação,

por me incentivar sempre a continuar estudando e perseverando em busca dos

objetivos. Agradeço a Deus por ter uma mãe como você...

Aos meus irmãos, por fazerem parte da minha vida, fontes de constante incentivo e

companheirismo.

6

AGRADECIMENTOS Terei sempre que agradecer em primeiro lugar a Deus, por todas as bênçãos

dispensadas durante esses anos e por me fortalecer nos momentos de dificuldade na

realização desse trabalho.

Ao Prof. Pedro Afonso, pela orientação, pelos ensinamentos, pela paciência e

compreensão durante todo o trabalho e pela receptividade ao aceitar ser meu

orientador. Ao Prof. Wilson Lopes pela amizade e co-orientação.

Aos colegas da Coordenação de Toxicologia Forense e da Coordenação de

Análise Instrumental do Laboratório Central de Polícia Técnica (LCPT). Agradeço de

maneira especial a Ana Cecília e Celinalva pelos ensinamentos, pelo aprendizado

durante esses anos na Polícia Técnica e por confiarem em nosso trabalho.

Ao amigo e diretor do Laboratório Central de Polícia Técnica, Dr. Alexsandro

Fiscina por apoiar e incentivar a realização desse trabalho nas dependências do

LCPT. Ao amigo e Coordenador Técnico Paulo Portela por suas palavras de incentivo

e motivação.

Ao Dr. Bruno Gil de Carvalho Lima, Perito Médico-Legal do Instituto Médico-

Legal Nina Rodrigues (IMLNR), por sua ajuda e cooperação através do Comitê de

Ética em Pesquisa desse instituto.

Ao Perito Criminal Joaci da Coordenação de Hematologia Forense por sua

inestimável ajuda num momento determinante desse trabalho.

Aos colegas do Laboratório de Pesquisa em Química – LPQ (UFBA), pela

amizade e momentos agradáveis de conversas descontraídas. Ao amigo Fábio, pelas

estimulantes conversas sobre instrumentação analítica e espectrometria de massas.

A todas as pessoas que direta ou indiretamente colaboraram para a realização

desse trabalho. Muito obrigado!

7

“Pensava que nós seguíamos caminhos já feitos,

mas parece que não os há. O nosso ir faz o caminho."

C.S.Lewis (1898 – 1963)

8

CUNHA, Ricardo Leal. Desenvolvimento de método analítico para determinaç ão

de estimulantes anfetamínicos inalterados de intere sse forense em urina

empregando DLLME e GC-MS. 98 f. il. 2013. Dissertação (Mestrado) – Instituto de

Química, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2013.

RESUMO

O consumo de drogas de abuso é uma prática crescente no mundo moderno.

Dessa forma, as drogas sintéticas e mais particularmente os derivados da anfetamina,

ocupam um lugar de destaque. O consumo de estimulantes anfetamínicos tais como

fenproporex (FEN), dietilpropiona (DIE) e sibutramina (SIB) se tornou uma prática

comum entre motoristas profissionais nas estradas brasileiras nos últimos anos e

entre pessoas que desejam perder peso, mas fazem o uso dessas substâncias de

forma indiscriminada. O presente trabalho constitui o desenvolvimento de um método

analítico, empregando microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME), capaz de

detectar e quantificar esses medicamentos em baixas concentrações em amostras de

urina. As análises foram realizadas utilizando cromatografia à gás acoplada a

espectrometria de massas (GC-MS). O método apresentou boa performance analítica,

com excelente linearidade na faixa dinâmica de 1 a 1000 ng/mL para DIE, FEN e SIB,

com valores de R2 iguais a 0,9926 , 0,9994 e 0,9951, respectivamente. Os limites de

detecção (LD), foram de 0,1 ng/mL para DIE e FEN e de 0,05 ng/mL para SIB. O

coeficiente de variação intradia variou de 6,63% a 7,95% enquanto o interdia variou

de 3,89% a 5,47%. A recuperação relativa encontrada foi superior a 82,88% para DIE,

88,58% para FEN e 95,60% para SIB. O método desenvolvido mostrou-se bastante

útil na análise dos compostos estudados em amostras de urina postmortem ou in vivo.

Palavras-chave: estimulantes anfetamínicos; DLLME; GC-MS.

9

CUNHA, Ricardo Leal. Development of analytical method for determination of

unchanged amphetamines-type stimulants of forensic interest in urine using

DLLME and GC-MS. 98 f. il.(2013). Master Dissertation – Institute of Chemistry,

Federal University of Bahia, Salvador, 2013.

ABSTRACT

The drug abuse consumption is a growing practice in the modern world. Thus,

synthetic drugs and more particularly amphetamine derivatives, occupy a prominent

place. The consumption of stimulants-type amphetamines such as fenproporex (FEN),

diethylpropion (DIE) and sibutramine (SIB) has become a common practice among

professional drivers on Brazilian roads in recent years and among people who wish to

lose weight, but make use of these substances indiscriminately. The present work is

the development of an analytical method using dispersive liquid-liquid microextraction

(DLLME) capable of detecting and quantifying these drugs at low concentrations in

urine samples. Analyses were performed using gas chromatography coupled to mass

spectrometry (GC-MS). The method showed good analytical performance with

excellent linearity in a dynamic range from 1 to 1000 ng/mL for DIE, FEN and SIB,

with R2 values equal to 0.9926, 0.9994 and 0.9951, respectively. The limits of detection

(LOD) were 0.1 ng/ml for DIE and FEN and 0.05 ng/mL to SIB. The intraday variation

coefficient ranging from 6.63% to 7.95% while the interday ranged from 3.89% to

5.47%. The relative recovery founded was 82.88% for DIE, 88.58% for FEN and

95.60% for SIB. The method proved to be very useful in the analysis of these

compounds in postmortem or in vivo urine samples.

Keywords: amphetamine-type stimulants; DLLME, GC-MS.

10

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURA 1 – Estrutura química da anfetamina............................................................27

FIGURA 2 – Estrutura química da efedrina.................................................................27

FIGURA 3 – Tipos de anfetaminas consumidas por motoristas de caminhão no estado

de São Paulo em 2009................................................................................................29

FIGURA 4 – Posição dos grupos substituintes na estrutura da β-fenetilamina............29

FIGURA 5 – Estrutura química da dietilpropiona.........................................................31

FIGURA 6 – Esquema para a biotransformação da dietilpropiona..............................32

FIGURA 7 – Estrutura química do fenproporex...........................................................32

FIGURA 8 – Esquema da biotransformação do fenproporex......................................34

FIGURA 9 – Estrutura química da sibutramina............................................................35

FIGURA 10 – Esquema da biotransformação da sibutramina.....................................36

FIGURA 11 – Etapas envolvidas na microextração líquido-líquido dispersiva............45

FIGURA 12 – Espectro de massas do fenproporex empregando ionização por impacto

de elétrons (EI-MS).....................................................................................................49

FIGURA 13 – Esquema do procedimento de preparação das soluções padrão dos

analitos.......................................................................................................................54

FIGURA 14 - Procedimento da microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) em

urina............................................................................................................................57

11

FIGURA 15 – Cromatograma de íons selecionados (SIM) de uma amostra de urina

contendo 100 ng/mL de DIE, FEN e SIB.....................................................................65

FIGURA 16 – Espectros de massas por impacto de elétrons (EI-MS) no modo full scan

para (a) DIE, (b) FEN e (c) SIB....................................................................................66

FIGURA 17 – Cromatograma de íons selecionados (SIM) para adicionado de 1 ng/mL

de DIE, FEN e SIB em urina........................................................................................68

FIGURA 18 – Medidas relacionadas ao cálculo do fator de assimetria........................69

FIGURA 19 – Área dos picos cromatográficos para DIE, FEN e SIB extraídos da urina

em concentração inicial de 100 ng/mL, utilizando-se CHCl3, CH2Cl2 e CS2 como

solventes extratores....................................................................................................71

FIGURA 20 – Área dos picos cromatográficos para DIE, FEN e SIB com

concentrações de 100 ng/mL, utilizando-se metanol, acetonitrila e acetona como

solventes dispersores.................................................................................................72

FIGURA 21 – Área dos picos cromatográficos em função do pH para DIE nas

concentrações de 1, 10 e 20 ng/mL.............................................................................73

FIGURA 22 – Área dos picos cromatográficos em função do pH para FEN nas


FIGURA 23 – Área dos picos cromatográficos em função do pH para SIB nas


FIGURA 24 – Avaliação do efeito salting out: áreas dos picos em função da adição de

NaCl na amostra nas quantidades percentuais de 0,0% m/v, 0,5% m/v e 5,0% m/v....75

FIGURA 25 – Variação na área dos picos cromatográficos para os analitos no teste

de estabilidade (1 ng/mL)............................................................................................77

12


de estabilidade (100 ng/mL)........................................................................................77


de estabilidade (1000 ng/mL)......................................................................................78

FIGURA 28 – Curva de calibração e coeficiente de correlação para DIE na faixa de 1

a 1000 ng/mL..............................................................................................................80

FIGURA 29 – Curva de calibração e coeficiente de correlação para FEN na faixa de 1

a 1000 ng/mL..............................................................................................................81

FIGURA 30 – Curva de calibração e coeficiente de correlação para SIB na faixa de 1

a 1000 ng/mL..............................................................................................................81

FIGURA 31 - Valores de recuperação relativa para DIE, FEN e SIB em urina............82

13

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Grupos substituintes na estrutura da β-fenetilamina para anfetamina (ANF),

fenproporex (FEN), dietilpropiona (DIE) e sibutramina (SIB)...................................................30

TABELA 2 - Métodos analíticos utilizados na determinação de DIE em urina........................41

TABELA 3 - Métodos analíticos utilizados na determinação de FEN em urina.........................42

TABELA 4 - Métodos analíticos utilizados na determinação de SIB em urina..........................43

TABELA 5 – Propriedades físicas da água e de diferentes solventes orgânicos empregados

como extratores na otimização de microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME)............55

TABELA 6 - Íons selecionados para identificação e quantificação dos compostos

estudados...................................................................................................................67

TABELA 7 - Valores de fator de assimetria (As) a partir dos picos cromatográficos obtidos

em extrato de urina com adicionado de 100 ng/mL para DIE, FEN e SIB.................................70

TABELA 8 - Valores de fator de alargamento (TF) a partir dos picos cromatográficos obtidos

em extrato de urina com adicionado de 100 ng/mL para DIE, FEN e SIB.................................70

TABELA 9 - Valores de pKa para AMP, DIE, FEN e SIB.........................................................73

TABELA 10 - Valores de limites de detcção (LD) e limites de quantificação (LQ) para o

método....................................................................................................................................79

TABELA 11 - Valores determinados (%) para precisão do injetor do GC-MS, nas

concentrações de 1, 100 e 1000 ng/mL...................................................................................83

TABELA 12 - Valores adquiridos (%) para precisão intra-dia, nas concentrações de 1, 100 e

1000 ng/mL.............................................................................................................................83

14

TABELA 13 - Valores determinados (%) para precisão inter-dia, nas concentrações de 1, 100

e 1000 ng/mL..........................................................................................................................84

TABELA 14 - Parâmetros de performance analítica otimizados para DLLME..........................84

TABELA 15 – Valores de concentração, erro relativo, recuperação e fator de enriquecimento

(FE) para DIE, FEN e SIB em amostra de urina com adicionado de 1 ng/mL...........................86


(FE) para DIE, FEN e SIB em amostra de urina com adicionado de 10 ng/mL.........................87


(FE) para DIE, FEN e SIB em amostra de urina com adicionado de 1000 ng/mL.....................87

15

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANF Anfetamina

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

As Fator de assimetria

ATR-FTIR Reflectância total atenuada acoplada a espectroscopia no infravermelho

por transformada de Fourier

CV Coeficiente de variância

D Debye

DAD Detector de arranjo de diodos

DIE Dietilpropiona

DI-SPME Imersão direta – microextração em fase sólida

DLLME Microextração líquido-líquido dispersiva

DPRF Departamento de Polícia Rodoviária Federal

DPT Departamento de Polícia Técnica

EI Impacto de elétrons

EI-MS Espectrometria de massas por impacto de elétrons

EUA Estados Unidos da América

eV elétron-volt

FE Fator de Enriquecimento

FEN Fenproporex

GC Cromatografia à gás

GC-FID Cromatografia à gás acoplada ao detector de ionização em chama

GC-MS Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

GGLAS Gerência Geral de Laboratórios de Saúde Pública

HPLC-DAD Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo

de diodos

HR-MS Espectrometria de massas de alta resolução

ICH Conferência Internacional para Harmonização

IMLNR Instituto Médico-Legal Nina Rodrigues

IUPAC União Internacional de Química Pura e Aplicada

IV Infravermelho

16

LC Cromatografia líquida

LC-MS Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas

LCPT Laboratório Central de Polícia Técnica

LLE Extração líquido-líquido

LD Limite de detecção

LQ Limite de quantificação

LPME Microextração em fase líquida

LPQ Laboratório de Pesquisa em Química

m/z Relação massa/carga

MDA 3,4-metilenodioxiamfetamina

MDEA Metildietanolamina

MDMA 3,4 –metilenodioximetamfetamina

MDPA 3,4-metilenodioxi-N-propilanfetamina

MEPS Microextração em adsorvente empacotado

MS Espectrometria de massas

MS/MS Espectrometria de massas em sequência

NIST Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia

NPD Detector de nitrogênio e fósforo

PA Para análise

PE Ponto de ebulição

pH Potencial hidrogeniônico

pKa Logaritmo negativo da constante de dissociação ácida

R2 Coeficiente de determinação

RDC Resolução da Diretoria Colegiada

RE Recuperação da extração

RPM Rotações por minuto

S/N Razão sinal-ruído

SIB Sibutramina

SIM Monitoramento de íon selecionado

SNC Sistema nervoso central

SPE Extração em fase sólida

SPME Microextração em fase sólida

TF Fator de alargamento

TOF-MS Espectrometria de massas por tempo-de-vôo

17

TR Tempo de retenção

UHPLC Cromatografia líquida de ultra eficiência

UNODC Escritório das Nações Unidas para Drogas e Crime

WCOT Tubo aberto com parede recoberta

18

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO......................................................................................................19

2. OBJETIVOS....................................... ...................................................................24

2.1. OBJETIVOS GERAIS.....................................................................................25

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...........................................................................25

3. REVISÃO DA LITERATURA........................... .....................................................26

3.1. ANFETAMINA E DERIVADOS ANFETAMÍNICOS........................................27

3.1.1. Dietilpropiona........................................................................................30

3.1.2. Fenproporex..........................................................................................32

3.1.3. Sibutramina...........................................................................................34

4. ASPECTOS ANALITICOS............................. .......................................................37

4.1. ASPECTOS GERAIS.....................................................................................38

4.2. URINA COMO MATRIZ BIOLÓGICA..............................................................39

4.3. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS ASSOCIADOS A TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO EMPREGADOS NA DETERMINAÇÃO DE DIE, FEN E SIB EM URINA.............................................................................................................40

4.4. PREPARO DE AMOSTRAS...........................................................................44

4.4.1. Microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME)................................45

4.5. CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASSAS (GC-MS)..........................................................................................48

5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL....................... .............................................51

5.1. MATERIAIS...................................................................................................52

5.2. EQUIPAMENTOS E ACESSÓRIOS...............................................................52

5.3. PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES PADRÃO DE CALIBRAÇÃO....................52

5.3.1. Dietilpropiona........................................................................................53

5.3.2. Fenproporex..........................................................................................53

5.3.3. Sibutramina...........................................................................................53

19

5.4. PROCEDIMENTO DE OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO POR DLLME.............55

5.4.1. Seleção do solvente extrator.................................................................55

5.4.2. Seleção do solvente dispersor...............................................................55

5.4.3. Efeito do pH na amostra........................................................................56

5.4.4. Influência do efeito salting-out...............................................................56

5.4.5. Volume do solvente extrator..................................................................56

5.5. PROCEDIMENTO EMPREGADO NA EXTRAÇÃO.......................................56

5.6. MÉTODO ANALÍTICO POR GC-MS..............................................................58

5.6.1. Condições de separação no cromatógrafo a gás...................................58

5.6.2. Condições do espectrômetro de massas...............................................58

5.6.3. Condições do amostrador CTC-COMBIPAL..........................................58

5.7. FIGURAS DE MÉRITO CONSIDERADAS NA VALIDAÇÃO DO MÉTODO

ANALÍTICO.....................................................................................................59

5.7.1. Seletividade...........................................................................................59

5.7.2. Linearidade...........................................................................................60

5.7.3. Precisão................................................................................................60

5.7.4. Limite de detecção (LOD)......................................................................61

5.7.5. Limite de quantificação (LOQ)...............................................................61

5.7.6. Fator de recuperação............................................................................62

5.7.7. Estabilidade...........................................................................................62

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................... ..................................................64

6.1. DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALITICO........................................65

6.1.1. Separação cromatográfica e identificação por GC-MS..........................65

6.1.2. Otimização da microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME).........71

6.1.2.1. Seleção do solvente extrator.......................................................71

6.1.2.2. Seleção do solvente dispersor....................................................71

6.1.2.3. Efeito do pH da amostra..............................................................72

6.1.2.4. Influência do efeito salting-out.....................................................75

6.1.2.5. Estabilidade................................................................................76

20

6.2. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALITICO........................................................79

6.2.1. Limites de detecção e quantificação (LD e LQ)......................................79

6.2.2. Linearidade...........................................................................................80

6.2.3. Fator de recuperação............................................................................82

6.2.4. Precisão do instrumento e do método....................................................83

7. APLICAÇÃO DO MÉTODO................................ ..................................................85

7.1. APLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO NA ANÁLISE DE AMOSTRAS DE URINA.......................................................................................................86

8. CONCLUSÕES.....................................................................................................88

9. REFERÊNCIAS ....................................................................................................90

10. ANEXO................................................................................................................96

21

CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO

___________________________________________________________________

22

As drogas são um fator onipresente na sociedade moderna, com reflexos em

vários campos da atividade humana como, por exemplo, economia, saúde, segurança

e criminalidade. Diversos campos científicos se dedicam à análise e controle de

drogas e fármacos e, dentre esses, destaca-se a Química Analítica (Ojanperä, 2009).

Embora representem um problema marcante no atual contexto social, as drogas de

abuso são tão antigas quanto a humanidade e têm sido usadas para vários propósitos

no curso da história recente (Clarke, 2004).

Uma definição generalista para o termo “droga de abuso” é a que considera

qualquer substância que é usada para algum outro propósito diferente daquele para o

qual foi planejada (Clarke, 2004). Dessa forma, o uso intencional de uma determinada

substância pode ocorrer para fins terapêuticos, como os benzodiazepínicos, ou em

um uso laboratorial ou industrial como no caso dos solventes orgânicos voláteis.

Entretanto, esses compostos podem ser utilizados como entorpecentes (Clarke, 2004;

Levine, 2010).

Muitas drogas atualmente consumidas de forma abusiva foram, no passado,

não só comercializadas livremente, mas também promovidas como substâncias

benéficas pela indústria farmacêutica. Um padrão de consumo desordenado de

produtos farmacêuticos, tais como as anfetaminas usadas como moderadores do

apetite, levou ao aumento das restrições legais e à consequente escalada do comércio

ilícito dessas substâncias (Cody, 2000; UNODC, 2012).

De acordo com o relatório anual World Drug Report 2012, do Escritório das

Nações Unidas para Drogas e Crime (UNODC), o consumo de estimulantes

anfetamínicos (excluindo "ecstasy") teve uma prevalência estimada de 0,3% a 1,2%

da população mundial em 2010, ou entre 14 milhões e 52,5 milhões de usuários,

estimados globalmente. Esse grupo de drogas continua a ser o segundo mais utilizado

no mundo, perdendo apenas para a Cannabis (UNODC, 2012).

Na classe química dos estimulantes, estão incluídos estimulantes

psicomotores, aminas simpatomiméticas, anfetamina e os derivados anfetamínicos

(Ouyang, 2010). No âmbito forense, os derivados anfetamínicos utilizados como

estimulantes do sistema nervoso central, ocupam um lugar de destaque como, por

exemplo, em casos de suicídio (Bell, 2001) ou como droga de abuso (Cody, 2000).

23

No Brasil, o consumo de derivados anfetamínicos tornou-se um problema de

saúde pública nos últimos anos. O uso de substâncias como fenproporex (FEN) e

dietilpropiona (DIE) por motoristas profissionais nas estradas brasileiras, se tornou

uma prática comum (Nascimento, 2007).

Entre os caminhoneiros, a ingestão dessas substâncias ocorre com o intuito de

manter a vigília em percursos de longa distância. As propriedades estimulantes

dessas substâncias, no sistema nervoso central, são capazes de reduzir o cansaço e

aumentar o estado de alerta e a atenção (Yonamine, 2012). No entanto, ao passar

esses efeitos, os sintomas mais imediatos são sonolência profunda, agressividade e

depressão, fatores que podem provocar a ocorrência de graves acidentes (Fakhouri,

2010).

Essa constatação está de acordo com dados do Departamento de Polícia

Rodoviária Federal, DPRF (BRASIL, 2009), em que o Brasil figura como o líder

mundial em acidentes de trânsito em rodovias. Por outro lado, na última década,

apesar das medidas de prevenção tomadas em nível nacional, não houve redução no

número de acidentes (Pechansky et al. 2010).

De acordo com Nascimento et al. (2007), em um estudo realizado com

motoristas profissionais em uma rodovia do estado de Minas Gerais, ficou constatado

que as anfetaminas eram adquiridas em postos de combustíveis, drogarias e nas

próprias empresas de transportes. Em outro estudo realizado por Yonamine et al.

(2012), em rodovias no estado de São Paulo, o FEN e a DIE foram relatados como os

derivados anfetamínicos mais consumidos nas estradas. Dessa forma, é possível

estabelecer uma relação entre a aquisição dessas substâncias e o consumo por esses

profissionais em sua atividade laboral.

De acordo com o Art. 1º da Resolução RDC 52/2011 da Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA), é vedada, entre outras ações, a fabricação, importação,

distribuição, transporte, comércio e uso de medicamentos ou fórmulas

medicamentosas que contenham as substâncias dietilpropiona, fenproporex e

mazindol, seus sais e isômeros, bem como intermediários. A comercialização de

sibutramina (SIB), apesar de restrita, ainda pode ser realizada sob rigoroso controle

24

do profissional de saúde que a prescrever para fins terapêuticos, como adjunto no

tratamento da obesidade (ANVISA, 2011).

Apesar dessa proibição, apreensões desses medicamentos pela polícia ainda

têm ocorrido. De acordo com dados do Laboratório Central de Polícia Técnica do

Departamento de Polícia Técnica da Bahia (LCPT/DPT), desde 06 de dezembro de

2011, data em que a resolução entrou em vigor, houve apreensões no estado da

Bahia, em regiões com grande fluxo de caminhões, como nas cidades de Vitória da

Conquista e Feira de Santana.

Desde o início de 2012, novas apreensões de Desobesi®-M, contendo

cloridrato de sibutramina em suas cápsulas, têm sido realizadas na Bahia. Análises

preliminares empregando GC-MS e HPLC-DAD indicaram a presença desse princípio

ativo, demonstrando a prática de falsificação, considerando que esse medicamento

originalmente continha fenproporex. Em recente trabalho realizado por Mariotti et al.

(2013), cápsulas de Desobesi®-M apreendidas pela Polícia Federal no estado do Rio

Grande do Sul, foram analisadas por ATR-FTIR. Os resultados comprovaram a

presença de sibutramina numa quantidade até 2 vezes superior àquela presente nas

formulações farmacêuticas originais, numa clara tentativa de burlar a legislação e

manter o comércio ilegal de estimulantes anfetamínicos.

Diante desses fatos, torna-se necessário avaliar o consumo dessa classe de

droga de abuso, a partir da análise toxicológica de fluidos biológicos (p.e. saliva e

urina), sendo esta uma abordagem promissora (Souza et al., 2011). Ao considerar os

resultados obtidos com essa abordagem, é possível estabelecer a prevalência no uso

de determinadas substâncias em rodovias brasileiras (Yonamine, 2012; Zancanaro,

2012) ou em outro contexto de interesse forense como, por exemplo, o consumo ilegal

para fins terapêuticos.

O método analítico desenvolvido nesse trabalho, com o objetivo de determinar

estimulantes anfetamínicos inalterados em urina, justifica-se por haver uma grande

dificuldade de aquisição dos padrões de metabólitos das substâncias estudadas.

Embora as concentrações desses compostos em urina representem menos de 5% da

quantidade absorvida após a ingestão, ao empregar uma técnica de pré-concentração

25

(p.e. DLLME, SPME) e um método sensível de análise como GC-MS, é possível

determinar medicamentos e drogas de abuso inalterados em urina (Strano-Rossi et

al. 2009).

26

CAPITULO 2 – OBJETIVOS

_______________________________________________________________

27

2.1 Objetivos gerais

Desenvolver e aplicar um método analítico capaz de detectar, identificar e

quantificar, em níveis traço, fenproporex (FEN), dietilpropiona (DIE) e sibutramina

(SIB) inalterados em urina, empregando microextração líquido-líquido dispersiva

(DLLME) e cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-

MS).

2.2 Objetivos específicos

� Desenvolver e otimizar a técnica de microextração líquido-líquido dispersiva

(DLLME) para extração e pré-concentração dos analitos em urina;

� Desenvolver e otimizar método analítico para identificar e quantificar os analitos

em estudo, utilizando cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria

de massas (GC-MS);

� Validar a metodologia analítica considerando os parâmetros de validação já

estabelecidos na literatura;

� Aplicar a metodologia desenvolvida em amostras de urina provenientes do

Laboratório de Toxicologia Forense do Departamento de Polícia Técnica da

Bahia;

28

CAPITULO 3 – REVISÃO DA LITERATURA

29

3.1 Anfetamina e derivados anfetamínicos

Anfetamina e alguns derivados estruturalmente semelhantes são utilizados

como droga de abuso e causam sérios problemas sociais e de saúde pública em

muitos países (Balíková, 2007). O termo “anfetamínicos” refere-se ao grupo de

substâncias que contêm a anfetamina e/ou seus derivados, tais como metanfetamina,

dietilpropiona, fenproporex, dentre outros (Oga et al, 2008).

O composto denominado “anfetamina” representa, a partir da sua estrutura

química (FIGURA 1), a classe das β-fenetilaminas, substâncias que apresentam

atividades simpatomiméticas. Drogas simpatomiméticas "imitam" a ação de

neurotransmissores endógenos que funcionam como estimulantes do sistema

nervoso simpático (Moore, 2010).

FIGURA 1. Estrutura química da anfetamina.

A anfetamina foi sintetizada pela primeira vez pelo químico romeno Lazăr

Edeleanu em 1877, na Universidade de Berlin (atualmente, Universidade Humboldt

de Berlin), sendo chamada inicialmente de fenilisopropilamina. Este foi o primeiro de

uma série de compostos sintéticos relacionados à estrutura da efedrina (FIGURA 2),

isolada da planta Ephedra sinica, no mesmo ano (Shulgin, 1992).

FIGURA 2. Estrutura química da efedrina.

30

Na década de 1930, compostos da classe das anfetaminas foram utilizados

clinicamente como estimulantes do sistema nervoso central (SNC) no tratamento da

depressão, período em que se tornou evidente o seu potencial como droga de abuso.

Dessa forma, desde aquela época, a capacidade das anfetaminas em aliviar a fadiga,

melhorar o desempenho em atividades físicas e intelectuais, aumentar a confiança e

produzir euforia, tem levado ao seu uso abusivo (Ouyang, 2010; Moore, 2010; Chasin,

2008).

O consumo de anfetaminas (incluindo metanfetamina, fenmetrazina e

dietilpropiona), ganhou proporções epidêmicas entre os anos de 1940 e 1970.

Naquele período, soldados, trabalhadores de indústrias e prisioneiros de guerra

utilizaram essas substâncias, durante a Segunda Guerra Mundial e a Guerra do

Vietnam (Moore, 2010; Oga, 2008). Dessa forma, buscavam-se os principais efeitos

farmacológicos imediatos dos compostos anfetamínicos, tais como estimulação

locomotora, euforia, excitação e supressão do apetite (Rang, 2008).

Em anos recentes, o uso clínico de derivados anfetamínicos como fenproporex

e dietilpropiona, era justificado pelos efeitos anorexígenos percebidos durante o

consumo regular (Medley, 2010). Drogas anorexígenas, que são estruturalmente

relacionadas com a anfetamina, agem principalmente no centro da saciedade no

hipotálamo, sendo capazes de inibir a fome, tornando-se uma importante ferramenta

terapêutica no tratamento da obesidade (Oga, 2008; Rang, 2008; Craddock, 1976).

Por outro lado, a busca por efeitos relacionados às propriedades estimulantes desses

medicamentos, como o aumento do estado de alerta e atenção, levou ao consumo

irregular dos chamados “rebites” por motoristas de caminhões nas estradas brasileiras

(Nascimento, 2007; Yonamine, 2012; Zancanaro, 2012).

O estudo realizado por Yonamine et al. (2011), com motoristas profissionais

nas estradas do estado de São Paulo, comprova o uso abusivo de substâncias ilícitas:

de um total de 452 voluntários que cederam amostras de urina, 9,3% (n=42)

apresentaram resultado positivo para alguma das substâncias analisadas

(anfetaminas, canabinóides e cocaína). Entre os entrevistados, 7,5% (n=34) admitiram

consumir regularmente medicamentos derivados de anfetamina, como mostrado na

FIGURA 3.

31

FIGURA 3. Tipos de anfetaminas consumidas por motoristas de caminhão no estado de São Paulo em 2009 (adaptado de Yonamine et al., 2011).

Em geral, os efeitos semelhantes produzidos no SNC pela anfetamina e seus

derivados, são devidos à similaridade estrutural existente entre essas substâncias. A

estrutura química das anfetaminas possui o esqueleto básico da β-fenetilamina

(FIGURA 4).

FIGURA 4. Posição dos grupos substituintes na estrutura da β-fenetilamina

Os diferentes substituintes nas posições meta e para do anel aromático e no

carbono secundário da cadeia lateral (TABELA 1), determinam os efeitos periféricos

2%

50%

22%

35%

0

10

20

30

40

50

60

dietilpropiona fenproporex outras desconhecido

32

no sistema nervoso central, podendo acentuar alguns desses efeitos e abolir outros

(Oga, 2008; Rang, 2008; Balíková, 2007; Cody, 2000).

TABELA 1. Grupos substituintes na estrutura da β-fenetilamina para anfetamina (ANF), fenproporex (FEN), dietilpropiona (DIE) e sibutramina (SIB).

Substância R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7

ANF

DIE

FEN

SIB

H

CH2CH3

CH2CH2CN

CH3

H

CH2CH3

H

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3CH2(CH2)CH3

H

O

H

CH2CH2CH2

H

H

H

H

H

H

H

Cl

H

H

H

H

Efeitos tóxicos, causados por substâncias classificadas como derivados

anfetamínicos, ocorrem principalmente nos sistemas cardiovascular e neuropsíquico.

Os sintomas da intoxicação aguda produzida pelos derivados anfetamínicos tais como

hipertermia, edema cerebral e colapso cardiovascular são semelhantes àqueles

causados pelo uso da cocaína. Podem provocar também, além dos efeitos

estimulantes clássicos, sensações psicodélicas (Oga, 2008; Rang, 2010; Balíková,

2007).

3.1.1 Dietilpropiona (DIE)

A dietilpropiona, [2-(dietilamino)-1-fenil-1-propanona], foi sintetizada pela

primeira vez em 1928, por Hyde e colaboradores (Korolkovas, 1982). Também

conhecida como anfepramona, é um estimulante anfetamínico originalmente

empregado como inibidor do apetite. Foi amplamente utilizado no Brasil e em outros

países americanos e europeus, para controle de peso e tratamento médico da

obesidade (Garcia-Mijares, 2009; Douglas, 1982). A sua produção e comercialização

foi proibida pela ANVISA através da Resolução RDC Nº 52, de 06 de outubro de 2011

(ANVISA, 2011).

33

O sal cloridrato apresenta-se na forma de um pó branco finamente dividido,

com aspecto cristalino, contendo aproximadamente 84,9% de base livre. Possui

fórmula química C13H19NO e massa molecular 205.29 Da. Considerando as suas

propriedades físico-químicas, possui ponto de fusão em torno de 181ºC e elevada

solubilidade em água, metanol, acetonitrila e clorofórmio. (ChemSpider, 2012;

Balíkóva, 2007).

A estrutura molecular da DIE apresenta uma amina terciária e um carbono

quiral (FIGURA 5), sendo ambos isômeros farmacologicamente ativos (Beckett, 1973).

No passado, até o ano de 2011, era comercializado na forma racêmica nos

medicamentos Dualid S® e Inibex S® (Mey, 1999; Medley, 2009; Aché, 2011).

FIGURA 5. Estrutura química da dietilpropiona (DIE).

Considerando a sua atividade farmacológica, a dietilpropiona é uma amina

simpatomimética que produz efeitos adversos como o aumento da transpiração,

palpitações, boca seca e estimulação do sistema nervoso central, refletido pelo

aumento da irritabilidade, nervosismo ou insônia e psicose. Muitos desses sintomas

têm sido relatados de forma semelhante à de outras drogas da classe das anfetaminas

(Medley, 2009; Douglas, 1982).

De acordo com Beckett et al. (1987), o metabolismo da dietilpropiona produz

cinco metabólitos que, ao todo, correspondem a 85% da droga excretada. Somente

em torno de 3-4% da dose é eliminada na forma inalterada exclusivamente pela via

renal (Rice et al., 2000). A via metabólica da dietilpropiona é mostrada na FIGURA 6.

34

FIGURA 6. Esquema para a biotransformação da dietilpropiona, proposto por Beckett et al. (1973)

3.1.2 Fenproporex (FEN)

O fenproporex, 3-[(1-fenil-2-propanil)-amino]-propanonitrila, é uma droga

anorexígena que foi banida em muitos países do mundo, inclusive no Brasil (Cody,

1996; ANVISA, 2011). Inicialmente classificada como uma substância não

estimulante, em um estudo realizado por Tognoni et al. (1972) ficou demonstrado que

a sua ingestão leva à formação de quantidades consideráveis de anfetamina no

organismo, pela clivagem enzimática da ligação entre o nitrogênio e o grupo cianoetil

(FIGURA 7).

FIGURA 7. Estrutura química do fenproporex (FEN).

35

Originalmente, foi sintetizado e ensaiado em laboratórios franceses, em 1965

(Korolkovas,1988). Apresenta-se normalmente como o sal cloridrato, na forma de um

pó branco de aspecto cristalino, possuindo fórmula química C12H16N2 e massa

molecular 188.26 Da. É solúvel em água, acetonitrila, metanol e etanol e apresenta

ponto de fusão em torno de 155ºC (ChemSpider, 2011; Budavari, 2001).

O FEN foi empregado com um propósito terapêutico, como inibidor do apetite,

por apresentar propriedades anorexígenas no tratamento de pacientes obesos com

concomitante comprometimento cardiovascular (Aché, 2009; Bell, 2001; Oga, 2008).

Entretanto, por causa dos efeitos estimulantes quando do seu uso, possui um grande

potencial de abuso (Cody, 1999). No Brasil, o consumo dessa substância em

particular por motoristas de caminhão, foi observado em alguns estados da federação

(Nascimento, 2007; Yonamine, 2004).

Apesar de o uso irregular de medicamentos derivados de anfetaminas ser

conhecido há alguns anos, a proibição de produzir e consumir o FEN no Brasil, surgiu

somente com a publicação da Resolução RDC Nº 52 de 6 de outubro de 2011 pela

ANVISA, sendo o mesmo regulamento que proibiu a comercialização da DIE

(ANVISA, 2011).

A ingestão de FEN origina 14 diferentes metabólitos, como mostrado na

FIGURA 8 (Kraemer, 1998; Maurer, 2000). Entretanto, o composto original pode ser

determinado na sua forma livre em urina, apesar de 25% a 30% da dose sofrer

biotransformação através do chamado efeito de primeira passagem, promovido por

enzimas presentes no fígado, por degradação enzimática na flora intestinal ou uma

combinação das duas causas (Bell, 2001).

De acordo com Cody (1993), entre 5,4% e 8,7% da droga é excretada na forma

inalterada na urina em pH ácido. Entretanto, sem controle do pH da urina, menos de

3% da dose é excretada na forma intacta.

36

FIGURA 8. Esquema da biotransformação do fenproporex proposto por Kraemer et al. (2000).

3.1.3 Sibutramina (SIB)

A sibutramina (SIB) foi desenvolvida e comercializada inicialmente, como um

potencial antidepressivo, na década de 1980 pelo laboratório Knoll Pharmaceuticals

(atualmente, Abbott Laboratories), na Alemanha (Luque et al., 2002). De acordo com

as normas da IUPAC, o seu nome sistemático é 1-[1-(4-clorofenil)-ciclobutil]-N,N,3-

trimetil-1-butanamina. Possui fórmula molecular C17H26ClN e massa molecular 279.84

Da.

Quando na forma de cloridrato, apresenta-se como um pó branco cristalino,

com ponto de fusão 191,5 ºC e solubilidade moderada em água e solventes orgânicos

polares como metanol e acetonitrila (ChemSpider, 2012). Sua estrutura molecular

apresenta um carbono quiral, na mesma posição que a anfetamina, o que confere

atividade farmacológica para ambos isômeros (FIGURA 9).

37

FIGURA 9. Estrutura química da sibutramina (SIB)

Assim como outros fármacos anorexígenos, a SIB é empregada para fins

terapêuticos, no tratamento da obesidade, ou quando a perda de peso é clinicamente

indicada (Heal et al., 1998). No Brasil, pode ser encontrada nas dosagens 10 mg

(equivalente a 8,37 mg de sibutramina) e 15 mg (equivalente a 12,55 mg de

sibutramina), sendo vendida mediante prescrição médica e retenção de receita. Seu

medicamento de referência é o cloridrato de sibutramina, sendo comercializado sob a

marca Reductil® (Abbott, 2012).

A comercialização da SIB no Brasil foi recentemente regulamentada, pela

resolução RDC Nº 52 da ANVISA, mesmo instrumento jurídico utilizado para proibir a

venda de FEN e DIE (ANVISA, 2011). Nesse sentido, no Art. 2º, parágrafo único,

existe a determinação de que a prescrição e a venda de medicamentos ou fórmulas

que contenham a SIB deverão ser realizadas por meio da Notificação de Receita "B2",

mediante receituário azul, numerado e identificado com os dados do médico. De

acordo com o Art. 4º, as prescrições deverão ser também acompanhadas de um termo

de responsabilidade entre o médico e o paciente em três vias, sendo uma para ser

arquivada no prontuário do paciente, outra na farmácia que dispensar o medicamento

e outra com o paciente (ANVISA, 2011).

As restrições quanto à prescrição e uso do medicamento devem-se aos seus

importantes efeitos adversos. Além de apresentar potencial de abuso (Arfken et al.,

2003), os principais distúrbios provocados pelo uso de SIB, são aqueles relacionados

com problemas cardiovasculares, tais como aumento da frequência cardíaca e da

pressão arterial (Luque, 2002; Abbott, 2011).

38

O mecanismo de ação da SIB envolve a inibição da recaptação da serotonina

(5-hidroxitriptamina) e norepinefrina. Porém, esse efeito é provocado por um ou mais

de seus metabólitos, sendo esses, assim, os princípios ativos, indicando que o

composto inalterado atua apenas como um pró-fármaco (Botrè et al., 2007).

Após a ingestão de SIB, ocorre a eliminação urinária de seis metabólitos

principais, além da SIB na forma livre, porém em níveis traço (Strano-Rossi et al.,

2007). A biotransformação da SIB ocorre de acordo com a FIGURA 10.

FIGURA 10. Esquema da biotransformação da sibutramina proposto por Sardela et al.(2009).

39

CAPÍTULO 4 – ASPECTOS ANALÍTICOS

___________________________________________________________________

40

4.1 Aspectos gerais

Em toxicologia forense, para que compostos de interesse possam ser

quantificados em diferentes matrizes biológicas é necessário, inicialmente, identificá-

los através de uma triagem, utilizando-se testes de imunoensaio, que identificam

classes de compostos de interesse toxicológico (Flanagan et al. 2007). Atualmente,

técnicas cromatográficas hifenadas, tais como cromatografia gasosa acoplada à

espectrometria de massas (GC-MS) ou cromatografia líquida acoplada à

espectrometria de massas (LC-MS), são consideradas "padrão-ouro" em análise

toxicológica, pois oferecem altas sensibilidade, especificidade e capacidade de

identificação nesse tipo de análise (Maurer, 2012; Kraemer, 1998; Cody, 2000;

Chasin, 2008).

Essas técnicas são de particular importância para a análise de diferentes

substâncias de interesse toxicológico em matrizes biológicas complexas, tais como

sangue, urina, conteúdo estomacal, tecidos ou matrizes alternativas como cabelo,

saliva, mecônio ou unhas (Maurer, 2012; Alves, 2010). A necessidade de separação

dos diferentes compostos presentes nessas matrizes, para que possam ser

posteriormente identificados e quantificados, torna essencial o uso de técnicas

cromatográficas. Por outro lado, a espectrometria de massas (MS) oferece

capacidade de identificação inequívoca, quando aliada a outros critérios de

confirmação como, por exemplo, tempo de retenção cromatográfico obtido com um

padrão de referência (Chasin, 2008).

A cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS), oferece

importantes vantagens quando utilizada em análises toxicológicas no âmbito forense.

Dentre essas, destaca-se a capacidade de identificação e quantificação de drogas de

abuso, medicamentos, venenos e seus metabólitos polares, sem necessidade de

derivatização e à temperatura ambiente, preservando substâncias termolábeis

(Peters, 2011; Flanagan, 2007). Entretanto, pouquíssimos laboratórios de toxicologia

forense no Brasil dispõem dessa técnica, pelo fato de demandar um alto custo de

aquisição, operação e pessoal especializado (Guttman, 2004; Thurman et al., 2009).

41

Nesse sentido, o relatório intitulado “Levantamento de laboratórios analíticos

de toxicologia forense”, produzido pela Gerência Geral de Laboratórios de Saúde

Pública (GGLAS) da ANVISA, demonstra que a cromatografia gasosa acoplada à

espectrometria de massas (GC-MS), atualmente, é a técnica analítica mais

amplamente empregada nesses laboratórios (Guttmann et al., 2004).

4.2 Urina como matriz biológica

Muitas amostras biológicas como fluidos corporais (p.e. sangue, urina, humor

vítreo), tecidos, cabelo e outras partes do corpo humano, podem ser coletadas durante

a autopsia ou exame ‘in vivo’. Quando uma ou mais amostras dessas matrizes são

corretamente processadas em laboratório, é possível adquirir dados analíticos que

podem auxiliar na resolução de crimes (Levine, 2009).

Nesse sentido, a urina é bastante útil na determinação de substâncias de

interesse toxicológico. Importantes vantagens na sua utilização envolvem a

disponibilidade frequente e em grande volume (em torno de 1000 mL a 2000 mL por

dia) e a presença de venenos, drogas de abuso, fármacos inalterados e metabólitos

em concentrações relativamente altas (Flanagan, 2007; Miller, 1999).

A urina humana é composta por, aproximadamente, 98% de água, possuindo

poucos interferentes endógenos na sua constituição (Raikos et al., 2003). Esse

aspecto a torna uma matriz relativamente limpa, somente apresentando níveis

significativos de proteínas e lipídeos (que podem interferir no processo de extração),

durante estados patológicos (Costa, 2004).

Apesar de as concentrações de fármacos/drogas obtidas em urina,

estabelecerem somente um vínculo relativo com os efeitos farmacológicos, é possível

obter importantes informações toxicológicas quando essa matriz é analisada.

A exemplo dessa afirmação, de acordo com Bell et al. (2001), em um caso de

suicídio com o uso de anfetaminas, foi encontrado um teor de 1,2 µg/mL de FEN na

urina, indicando uma ingestão em grande quantidade dessa substância pela vítima.

42

4.3 Métodos cromatográficos associados a técnicas d e extração empregados na

determinação de DIE, FEN e SIB em urina

Nas TABELAS 2, 3 e 4 a seguir são relacionados alguns trabalhos envolvendo

a determinação, respectivamente, de DIE, FEN e SIB em urina, usando diferentes

técnicas de extração e análise.

De acordo com Ouyang et al. (2005), DIE e SIB podem ser analisadas

empregando-se extração líquido-líquido (LLE) e posterior injeção em GC-MS, sem

derivatização. Os íons qualificadores utilizados na identificação de DIE foram m/z 72,

77 e 100.

Com o objetivo de quantificar o analito, foi escolhido o íon m/z 100 considerando

o critério da singularidade, de modo que íons com maior razão massa/carga permitem

uma maior discriminação (Sparkman, 2007). Por sua vez, a SIB apresentou os íons

qualificadores m/z 58, 72 e 114, sendo este último utilizado para quantificação.

43

T

AB

ELA

2. M

étod

os a

nalít

icos

util

izad

os n

a de

term

inaç

ão d

e D

IE e

m u

rina.

Ext

raçã

o

Sep

araç

ão

Fas

e es

taci

onár

ia

Fas

e m

óvel

D

etec

ção

R

efer

ênci

a

S

PM

E

G

C

D

B-5

(5%

feni

lmet

ilsili

cone

)

H

élio

MS

Str

ano-

Ros

si e

t al.,

200

5

S

PE

LC

C

-18

octa

deci

l

5

mM

ace

tato

de

amôn

io

em 0

,1%

áci

do fó

rmic

o /

acet

onitr

ila

T

OF

-MS

Kol

mon

en e

t al.,

200

7

LL

E

G

C

D

B-5

(5%

feni

lmet

ilsili

cone

)

H

élio

MS

Bot

rè, e

t al.,

200

8

S

PE

LC

C

-18

oc

tade

cil

10

mM

form

iato

de

amôn

io/á

cido

fórm

ico

(0,5

%)

/ ace

toni

trila

(9

0:10

, v/v

)

M

S/M

S

O

uyan

g e

t al.,

201

0

LL

E

G

C

H

P-5

(5

% fe

nilm

etils

ilico

ne)

H

élio

MS

Ouy

ang

et a

l., 2

010

-

UH

PLC

C-8

oc

til

1

mM

ace

tato

de

amôm

io/0

,001

% á

cido

ac

étic

o / m

etan

ol

H

R-M

S

G

irón

et a

l., 2

012

44

T

AB

ELA

3. M

étod

os a

nalít

icos

util

izad

os n

a de

term

inaç

ão d

e F

EN

em

urin

a

Ext

raçã

o

Sep

araç

ão

Fas

e es

taci

onár

ia

Fas

e m

óvel

D

etec

ção

R

efer

ênci

a

LLE

GC

HP

-1 1

% fe

nil-

dim

etilp

olis

iloxa

no

Hél

io

MS

Cod

y et

al.1

996,

199

9.

LLE

GC

HP

-5 5

% fe

nil-

met

ilsili

cone

Hél

io

MS

Mau

rer

et a

l., 2

000

LLE

GC

DB

-17

50%

feni

l-

met

ilpol

isilo

xane

Hél

io; H

2;

MS

NP

D

Bel

l et a

l., 2

001

SP

ME

GC

DB

-5 5

% fe

nil-

met

ilsili

cone

Hél

io

MS

Str

ano-

Ros

si e

t al.,

200

5

SP

E

LC

C-1

8 o

ctad

ecil

5

mM

ace

tato

de

amôn

io e

m 0

,1%

ác

ido

fórm

ico

/ ac

eton

itrila

TO

F-M

S

Kol

mon

en

et a

l., 2

007

LLE

GC

DB

-5

5% fe

nil-m

etils

ilico

ne

H

élio

MS

Bot

ré e

t al.,

200

8

-

UH

PLC

C8

Oct

il

1 m

M a

ceta

to d

e am

ômio

/0,0

01%

ác

ido

acét

ico

/ m

etan

ol

HR

MS

Giró

n et

al.,

201

2

45

TA

BE

LA 4

. Mét

odos

ana

lític

os u

tiliz

ados

na

dete

rmin

ação

de

SIB

em

urin

a.

Ext

raçã

o

Sep

araç

ão

Fas

e es

taci

onár

ia

Fas

e m

óvel

D

etec

ção

R

efer

ênci

a

LL

E

G

C

D

B-5

(

5% fe

nilm

etils

ilico

ne)

H

élio

MS

Bot

rè, e

t al.,

200

8

S

PE

LC

C

-18

oc

tade

cil

10

mM

form

iato

de

amôn

io/á

cido

fó

rmic

o (0

,5%

) /

acet

onitr

ila

(90:

10, v

/v)

M

S/M

S

O

uyan

g et

al.,

201

0

LL

E

G

C

H

P-5

(5

% fe

nilm

etils

ilico

ne)

H

élio

MS

Ouy

ang

et a

l., 2

010

S

PE

LC

C

18

octa

deci

l

ác

ido

fórm

ico

0,2%

(e

m á

gua)

/

ácid

o fó

rmic

o 0,

2%

(em

met

anol

) gr

adie

nte

0-95

%

M

S/M

S

H

su e

t al.,

201

1

46

Na determinação de FEN inalterado em urina, foram empregados diferentes

métodos analíticos, de acordo com a descrição na TABELA 3. A identificação foi

realizada, monitorando-se os íons qualificadores m/z 56, 91 e 97. O íon m/z 97 foi

selecionado como íon quantificador. Strano-Rossi et al. (2005), determinou FEN

utilizando microextração em fase sólida por imersão direta (DI-SPME) e sem

derivatização, com posterior injeção em GC-MS.

4.4 Preparo de amostras

A complexidade do procedimento aplicado na preparação de amostras

dependerá de importantes fatores, tais como a natureza da amostra, a natureza da

droga a ser analisada, o método cromatográfico a ser utilizado e o seu respectivo

sistema de detecção. De uma forma geral, todos esses fatores são interdependentes

(Flanagan, 2007).

Atualmente, muitos sistemas de extração miniaturizados têm sido empregados

em toxicologia analítica. Dentre esses, a microextração em fase sólida (SPME), a

microextração em sorvente empacotado (MEPS) e a microextração em fase líquida

(LPME) têm sido alternativas importantes (Kokosa, 2012; Abdel-Rehim, 2010; Pragst,

2007). No entanto, essas técnicas apresentam limitações em termos de custo de

operação (p.e. SPME e MEPS) ou baixa seletividade para analitos muito polares (p.e.

LPME).

As tendências mais recentes apontam no sentido da utilização de técnicas que

utilizam uma menor quantidade de amostra e quantidade mínima de solventes

orgânicos, até mesmo para análise de traços. Os principais objetivos são obter maior

sensibilidade e especificidade na extração (Bonato et al., 2008), aliado à mínima

geração de resíduos, indo ao encontro de um dos princípios da Química Verde.

Nesse contexto, a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME), tem se

destacado como uma técnica simples e de baixo custo, apresentando excelentes

resultados em diferentes aplicações analíticas, inclusive em análises forenses

(Mudian, 2012; Yamini, 2010; Jofré, 2010).

47

4.4.1 Microextração líquido-líquido dispersiva (DLL ME)

A microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) foi introduzida por Rezaee

et al. em 2006, como uma técnica de microextração baseada em um sistema ternário

de solventes. É um método simples e rápido, onde são utilizados alguns microlitros de

um solvente extrator apropriado, ou seja, um solvente orgânico, pouco miscível em

água e que deve possuir densidade maior que a da água, como diclorometano,

clorofórmio ou dissulfeto de carbono e um solvente dispersor como metanol, acetona

ou acetonitrila, que deve ser solúvel na amostra e no solvente extrator (Yamini, 2010;

Mashayekhi, 2012).

A técnica consiste na injeção de uma mistura dos solventes, extrator e

dispersor, em uma amostra aquosa com os analitos de interesse, acondicionada em

um tubo tipo Falcon (Zanella, 2011). Após a rápida injeção da mistura, uma grande

turbulência é produzida resultando na dispersão do solvente extrator em uma nuvem

de gotículas finamente divididas. A solução turva formada guarda uma grande área

superficial na interface entre o solvente extrator presente nas gotículas e o meio

aquoso da amostra (FIGURA 11).

FIGURA 11. Etapas envolvidas na microextração líquido-líquido dispersiva (adaptado de Zanella, 2011).

48

O estado de equilíbrio entre as duas fases é alcançado rapidamente. Logo, o

tempo de extração é muito curto, sendo esta uma das principais vantagens da técnica

(Rudaz, 2013; Yamini, 2010). A segunda etapa do procedimento de extração é a

centrifugação da solução contendo a dispersão, o que levará à formação de uma gota

sedimentada no fundo cônico do tubo. Uma seringa de pequeno volume é utilizada

para transferir a gota sedimentada (20 a 150 uL) para um pequeno frasco contendo

um microtubo onde é colocada a amostra, que será levado ao GC-MS para análise.

As recentes aplicações da DLLME demonstram importantes vantagens do seu

uso em relação às técnicas convencionais de extração (Yamini, 2010; Rudaz, 2013),

tais como redução da quantidade usada de solventes orgânicos, simplicidade e baixo

custo do procedimento e o considerável fator de enriquecimento do analito.

Por fator de enriquecimento, compreende-se o aumento expressivo da

concentração dos analitos no extrato final, em relação às concentrações destes na

amostra, de modo que quantidades traço dos analitos de interesse podem ser

determinadas mesmo com um pequeno volume de amostra. Nesse sentido, torna-se

viável o emprego de diferentes métodos de análise, até mesmo aqueles com menor

sensibilidade que a técnica de GC-MS, graças à capacidade de pré-concentrar que a

DLLME apresenta (Rezaee, 2006).

As principais variáveis que influenciam de maneira crítica a eficiência do

procedimento de extração em DLLME são a natureza do solvente extrator e do

solvente dispersor, o pH da amostra e o volume dos solventes extrator e dispersor

utilizados (Mashayekhi, 2012; Rudaz, 2013; Jofré, 2010; Yamini, 2010; Rezaee, 2006).

Por causa das propriedades dos solventes extratores, a cromatografia gasosa

(GC) foi a primeira técnica analítica empregada para analisar os extratos obtidos com

DLLME, na determinação de pesticidas e contaminantes não-polares em amostras

de água (Yamini, 2010; Rezaee, 2006). Dessa forma, um fator importante que

influencia a recuperação da extração é a escolha de um solvente orgânico apropriado.

No estudo realizado por Mashayekhi et al. (2012), diferentes solventes orgânicos

apresentaram valores de recuperação muito distintos na determinação de anfetaminas

em urina.

49

Ainda considerando a eficiência da extração, o solvente dispersor exerce um

papel importante na formação das pequenas gotículas do solvente extrator na solução

contendo a amostra. Torna-se necessário que este apresente miscibilidade

intermediária entre o meio aquoso polar, considerando a diluição da amostra de urina

em água, e o caráter apolar ou fracamente polar do solvente extrator. Dessa forma, a

interface formada serve como meio de transferência de massa da fase aquosa para a

fase orgânica, sendo que a grande superfície de contato entre as gotículas de solvente

extrator e a fase aquosa contribui para a ocorrência desse fenômeno.

Para que a transferência de massa entre as duas fases ocorra de maneira

efetiva, é necessário que os analitos estejam na forma não ionizada. O principal fator

que favorece essa condição é o pH da amostra. Os experimentos realizados por Jofré

et al. (2010), demonstraram que diferentes valores de pH influenciam o fator de

enriquecimento dos analitos na fase orgânica. Logo, o pH da amostra de urina é

particularmente importante para a extração de compostos ionizáveis, como as

substâncias de interesse toxicológico (p.e. anfetaminas) que possuem caráter

predominantemente básico, com valores de pKa entre 6 e 10.5 (Rudaz, 2013).

Além desses importantes parâmetros, os volumes dos solventes extrator e

dispersor são críticos para a formação da gota no fundo do tubo de extração. Uma

pequena quantidade do solvente extrator dificulta a formação da gota, em um volume

tal que possa ser transferida para um microtubo, além de, possivelmente, não fornecer

gotículas capazes de extrair quantitativamente os analitos que serão levados

posteriormente ao GC-MS. Por outro lado, o volume do solvente dispersor afeta

diretamente a formação do sistema trifásico (água/solvente dispersor/solvente

extrator), e o grau de dispersão do solvente extrator na fase aquosa e,

consequentemente, o fator de enriquecimento, que também é diminuído ao ser

utilizado grande volume do solvente extrator (Rezaee, 2010).

Em DLLME, o fator de enriquecimento (FE), é definido como a razão da

concentração do analito na fase sedimentada (Csed) e a concentração inicial do analito

na amostra (Co), de acordo com a EQUAÇÃO 1:

50

FE = �� (1)

O valor de Csed é obtido a partir de uma curva de calibração adequada. A

recuperação da extração (RE) é definida como a porcentagem da quantidade total do

analito (ŋo), extraído da fase orgânica sedimentada (ŋsed), de acordo com as

EQUAÇÕES 2 e 3:

RE = ŋ��ŋ x100 = �� x100 (2)

RE =�� FEx100 (3)

onde Vsed e Vaq são os volumes de fase sedimentada e da solução da amostra,

respectivamente (Mashayekhi, 2012; Rezaee, 2010).

4.5 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS)

A cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-

MS) é uma combinação de duas técnicas microanalíticas: cromatografia a gás (GC),

uma técnica de separação e, espectrometria de massas (MS), uma técnica de

identificação e quantificação (Kitson et al., 1996; Sparkman, 2007).

Essa combinação apresenta importantes vantagens (Abian, 1999). A mais

relevante é a capacidade de fornecer a identidade das substâncias analisadas. O

espectro de massas é muito mais específico que aqueles fornecidos por detectores

de absorção molecular, tais como DAD (detector de arranjo de diodos) ou IV

(infravermelho), principalmente ao serem utilizadas diferentes técnicas de ionização

(Sparkman, 2007; Pavia, 2010).

51

Quando empregada em análises forenses, a ionização por impacto de elétrons

(EI) é de grande utilidade, pois o espectro obtido por essa técnica (FIGURA 12) pode

ser comparado com bancos de dados específicos, que contêm milhares de espectros

de massas de substâncias de interesse toxicológico. (Maurer et al., 2011; NIST, 2011;

Sparkman, 2007; Levine, et al., 2010; Pavia, 2010).

A aquisição de dados em espectrometria de massas por impacto de elétrons

(EI-MS), começa com a fragmentação das moléculas que eluem da coluna

cromatográfica capilar e se chocam com um feixe de elétrons com energia média de

70 eV. Os fragmentos ionizados formados com diferentes razões massa/carga (m/z)

são separados ao passar por um analisador de massas (p.e. quadrupolo de

transmissão), que gera um campo eletromagnético por onde são conduzidos os íons

ressonantes até o detector.

FIGURA 12. Espectro de massas por impacto de elétrons (EI-MS) do fenproporex (FEN)

Outro importante aspecto da técnica é a eficiente separação proporcionada

pela cromatografia em fase gasosa (GC) com colunas capilares. Mesmo analisando

amostras de natureza complexa, como matrizes biológicas, é possível conseguir uma

separação com excelente resolução, pois esse tipo de coluna fornece bandas muito

estreitas, proporcionando picos cromatográficos finos e simétricos, que são utilizados

para distinguir diferentes substâncias com tempos de retenção muito próximos

(Collins, 2007; Skoog, 2009).

(replib) Fenproporex

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 2000

50

100

51

56

6877

91

97

115 132 144 173 187

NH

N

52

Frequentemente, para que as substâncias de interesse toxicológico possam ser

determinadas por essa técnica, torna-se necessária a transformação do analito em

um produto derivatizado (Maurer, 2011). Reações de derivatização são empregadas,

principalmente, quando se deseja obter um composto de maior volatilidade ou um

aumento de resposta a um dado tipo de detector, favorecendo a sua análise por

cromatografia gasosa. Outro aspecto importante é aquele relacionado à degradação

do analito frente as altas temperaturas do sistema de injeção (Collins et al., 2007;

Lanças, 1993; McNair, 2009).

No entanto, o emprego de uma reação de derivatização requer minucioso

estudo da cinética de formação do produto e da determinação do rendimento dessa

reação, para que seja possível o desenvolvimento de um método quantitativo. Diante

das dificuldades impostas por essa estratégia analítica e considerando os

procedimentos anteriormente empregados por Strano-Rossi et al.(2010) e Ouyang

(2010) na análise de FEN, DIE e SIB inalterados em urina, considera-se mais fácil a

determinação desses analitos sem a utilização de reações de derivatização.

53

CAPÍTULO 5 – PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ___________________________________________________________________

54

5.1 Materiais

As substâncias químicas de referência (SQR) utilizadas como padrões

secundários foram obtidas a partir de produtos comerciais. A dietilpropiona (cloridrato

de anfepramona) foi obtida do medicamento Inibex® S (Medley), em cápsulas de 50

mg. A sibutramina (cloridrato de sibutramina) foi obtida do medicamento Plenty®

(Medley), em cápsulas de 15 mg. O fenproporex (cloridrato de fenproporex) foi obtido

do medicamento Desobesi-M® (Aché), em cápsulas de 25 mg. Os solventes orgânicos

utilizados foram metanol, diclorometano, acetonitrila, clorofórmio e dissulfeto de

carbono grau P.A. da Merck (Darmstadt, Alemanha). O hidróxido de sódio P.A. foi

adquirido da Synth (Brasil).

5.2 Equipamentos e acessórios

No procedimento de análise das amostras de urina foi utilizado cromatógrafo a

gás Agilent (EUA) modelo 7890A acoplado a espectrômetro de massas (quadrupolo

simples) Agilent (EUA) modelo 5975C, com amostrador automático CombiPAL da

CTC Analytics (Suiça). A coluna instalada no cromatógrafo durante a realização das

análises foi uma coluna capilar de sílica fundida do tipo WCOT (Wall Coated Open

Tubular), fase estacionária HP-5ms (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), marca Agilent J&W

Scientific (EUA). O gás de arraste utilizado foi hélio 6.0 (99,9999%) da White Martins

(Brasil). No procedimento de extração foi utilizada centrífuga universal para tubos

falcon da Cientec (Brasil). A água ultrapura foi obtida do purificador Milli-Q modelo

RiOS da Merck Millipore (Alemanha). Na preparação das soluções padrão utilizou-se

balança analítica modelo AUW-220 da marca Shimadzu (Japão). As membranas de

nylon 0,45 µm Millex®, utilizadas para filtração, foram da marca Merck Millipore

(Alemanha).

5.3 Preparação das soluções padrão de calibração

A preparação das soluções padrão para a calibração foi feita a partir de

diluições do conteúdo das cápsulas contendo dietilpropiona, fenproporex e

sibutramina em acetonitrila. As diluições dos padrões procederam-se como a seguir:

55

5.3.1 Dietilpropiona (DIE)

Para preparar a solução padrão de DIE, o conteúdo de uma cápsula foi pesado

em balança analítica, obtendo-se a massa de 0,4842 g. Considerando o teor de 75

mg do princípio ativo em cada cápsula, pesou-se 0,3228 g para a obtenção de uma

solução estoque de concentração 500 µg/mL. Dessa forma, o conteúdo pesado

equivalente a 50 mg de DIE foi solubilizado em acetonitrila, levado ao ultrassom por

20 minutos, filtrado em membrana de nylon 0,45 µm e adicionado em balão

volumétrico aferido em 100 mL.

5.3.2 Fenproporex (FEN)

A solução padrão de FEN foi preparada, inicialmente, pesando-se o conteúdo

de uma cápsula em balança analítica, obtendo-se a massa de 0,4137g. Considerando

o teor de 25 mg do princípio ativo em cada cápsula, tomou-se 0,8275g do pó para a

obtenção de solução estoque de concentração 500 µg/mL. A massa equivalente a 50

mg do princípio ativo foi solubilizada em acetonitrila e levado ao ultrassom por 20

minutos. A solução foi filtrada em membrana de nylon 0,45µm e transferida para um

balão volumétrico de 100 mL, sendo posteriormente aferido.

5.3.3 Sibutramina (SIB)

A solução estoque de SIB foi preparada a partir de 0,8166 g do pó contido na

cápsula do medicamento. O conteúdo de cada cápsula, pesando 0,2450 g, continha

15mg do princípio ativo. Dessa forma, tomou-se o equivalente a 50mg de SIB, que foi

solubilizado em acetonitrila, levado ao ultrassom por 20 min, filtrado em membrana de

nylon 0,45 µm e transferido para balão volumétrico aferido em 100 mL.

Todas as soluções estoque preparadas foram armazenadas em balões

volumétricos previamente condicionados com acetonitrila e posteriormente vedados

com tampa de vidro e fita teflon. Os balões foram mantidos em geladeira à temperatura

média de 5ºC. O fluxograma a seguir (FIGURA 13) demonstra o esquema utilizado na

preparação das soluções:

56

FIGURA 13. Esquema do procedimento de preparação das soluções padrão dos analitos.

O ideal para qualquer análise é ter a garantia de um padrão primário, ou seja,

um padrão analítico certificado. Entretanto, ao utilizar como padrão um produto

comercial de procedência conhecida, como por exemplo, formulações farmacêuticas

adquiridas dentro do prazo de validade, é possível considerá-lo como um padrão

secundário de boa qualidade (Leite, 2008).

Dessa forma, é preciso levar em consideração o grau de pureza oferecido por

esse material e a forma correta de armazenamento, de modo a manter a confiabilidade

dos resultados adquiridos no método analítico desenvolvido.

Conteúdo pesado da cápsula

Béquer com acetonitrila

Filtração em membrana 0.45µm

ultrassom por 20 minutos

Balão volumétrico 100 mL

Solução estoque

aferição do balão

57

5.4 Procedimento de otimização da extração por DLLME

5.4.1 Seleção do solvente extrator

Diferentes solventes orgânicos foram testados, considerando as propriedades

físicas mais importantes para DLLME como densidade, polaridade e solubilidade, de

acordo com a TABELA 5.

TABELA 5. Propriedades físicas da água e de diferentes solventes orgânicos empregados como extratores na otimização de microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME).

Solvente Densidade (g/mL) Momento dipolar (D) Solubilidade em H2O P.E. (ºC)

H2O 1,000 1,85 - 100,0

CHCl3 1,498 1,04 0,8 g/100 mL 61,2

CH2Cl2 1,326 1,60 1,3 g/100 mL 40,0

CS2 1,260 0,00 0,3 g/100 mL 46,0

Foram preparadas soluções com 1 mL de metanol (MeOH), contendo diferentes

volumes de solventes extratores (CS2, CHCl3 e CH2Cl2) de modo a obter uma gota de

50 µL no fundo do tubo de extração e a maior área para os picos cromatográficos de

cada analito. Para cada solvente foi realizada a extração em urina de acordo com o

procedimento de DLLME descrito na seção 5.5.

5.4.2 Seleção do solvente dispersor

Ao contrário do solvente orgânico utilizado como extrator em DLLME, o

solvente dispersor deve ser miscível com a água e com o solvente extrator, de modo

a atuar na interface existente entre esses dois líquidos. Dessa forma, foram realizados

três experimentos de acordo com o procedimento de extração por DLLME,

adicionando-se 1 mL de metanol, acetonitrila e acetona, em cada tubo falcon, com o

objetivo de otimizar a formação de pequenas gotículas do solvente extrator na

dispersão.

58

5.4.3 Efeito do pH da amostra

Foram realizados experimentos com o objetivo de testar o efeito da variação do

pH da amostra nas áreas dos picos cromatográficos dos analitos. O procedimento de

extração por DLLME já descrito, foi realizado após adição de gotas de NaOH 1 mol/L,

de modo a ajustar o pH das amostras para 9, 10 e 11, em três experimentos distintos.

5.4.4 Influência do efeito salting-out

Considerando o mesmo procedimento de extração, foram realizados

experimentos com a adição de NaCl. Adicionou-se em três tubos falcon diferentes

quantidades de sal, nas proporções de 0,0% m/v, 0,5% m/v e 5,0% m/v, ou seja, 0,0g,

0,02580g e 0,25218g, respectivamente, em 5 mL de urina. Posteriormente, foram

realizadas extrações por DLLME.

5.4.5 Volume do solvente extrator

O ajuste do volume de solvente extrator foi realizado acrescentando-se

pequenas quantidades de CS2(100µL), CHCl3(180 µL) e CH2Cl2 (300 µL), com o

objetivo de obter, após o procedimento de extração e centrifugação, uma gota

sedimentada com o volume de 50 uL.

5.5 Procedimento empregado na extração

O procedimento empregado na extração de DIE, FEN e SIB em urina foi

desenvolvido a partir dos trabalhos de Rezaee et al. (2006) e Mashayekhi (2012).

Entretanto, o procedimento foi otimizado considerando os diferentes parâmetros que

influenciam a recuperação dos analitos na microextração líquido-líquido dispersiva

(Jofré, 2010). As etapas gerais do procedimento foram realizadas de acordo com o

esquema proposto na FIGURA 14:

59

FIGURA 14. Procedimento da microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) em urina.

Em um tubo falcon de 15 mL, foram adicionados 5 mL da amostra de um pool

de urina (mistura de amostras negativas), previamente filtrada em membrana de nylon

Millex 0,45 µm. O pH foi ajustado para 2 unidades acima do valor de pKa do analito

mais básico estudado, de modo a garantir o estado não ionizado dos mesmos.

Separadamente, foi preparada uma solução contendo 1 mL de metanol e 300 µL de

diclorometano. A solução formada pelos solventes dispersor e extrator foi injetada

rapidamente no tubo falcon contendo a amostra de urina, utilizando-se uma seringa

hipodérmica de 5 mL, de modo a formar uma dispersão das gotículas finamente

divididas de diclorometano.

Após a injeção dos solventes e a formação da dispersão, o tubo falcon foi

centrifugado a 3000 rpm por 5 minutos. Dessa forma, uma gota com 50 µL do solvente

amostra de urina (5 mL) filtrada em membrana Millex 0,45 µm

tubo falcon (15mL)

ajuste para pH 11

injeção rápida de dispersor (1 mL de MeOH) + extrator (300 µL de DCM)

centrifugação (3000 rpm / 5 min)

retirada da gota do fundo do tubo (50 µL)

injeção no GC-MS (1 µL)

transferência para frasco pequeno

60

extrator foi decantada no fundo cônico do tubo. Com uma microseringa de vidro de

250 µL, a gota foi retirada e transferida para um pequeno frasco de 1,5 mL contendo

um microtubo, que foi levado ao GC-MS para análise.

5.6 Método analítico por GC-MS

A otimização das condições analíticas foi realizada visando a obtenção de um

método capaz de separar, detectar, identificar e quantificar os analitos em estudo.

Dessa forma, os parâmetros utilizados foram os seguintes:

5.6.1 Condições de separação no cromatógrafo a gás (GC):

• Rampa de aquecimento do forno da coluna:

o Temperatura inicial: 60ºC por 2 min.

o Rampa 1: 10ºC/min até 200ºC

o Rampa 2: 6ºC/min até 220ºC

• Temperatura do injetor e modo de injeção: 250ºC (splitless)

• Fluxo do gás de arraste: 0,8 mL/min

• Tempo de corrida: 20 min

5.6.2 Condições do espectrômetro de massas (MS):

• Temperatura da fonte de íons: 230ºC

• Temperatura da linha de transferência: 280ºC

• Temperatura do quadrupolo: 150ºC

• Faixa de aquisição em full scan (m/z): 45 – 550

• Tempo de aquisição por scan: 1 scan/500 ms

• Voltagem do detector: 1188 V

• Energia de ionização: 70 eV

5.6.3 Condições do amostrador CTC-CombiPAL:

61

• Volume da microseringa: 10 µL

• Volume de injeção: 1 µL

• Número de lavagens pré-injeção: 1x em MeOH

• Número de lavagens pós-injeção: 2x em hexano, 2x em MeOH

5.7 Figuras de mérito consideradas na validação do método analítico

A validação de um método analítico é um conjunto de verificações que devem

ser realizadas, de modo a garantir que as características de desempenho sejam

satisfatórias para o fim desejado e que o método seja cientificamente coerente

(ANVISA, 2005). Dessa forma, o método validado deve produzir resultados que

atendam às necessidades do problema analítico em questão.

De acordo com o ICH (The International Conference on Harmonisation), os

parâmetros empregados na validação dependerão da natureza da análise. Logo, o

objetivo do procedimento analítico deve ser claramente entendido, pois este irá

direcionar as características de desempenho que precisarão ser avaliadas (ICH,

2005). Os principais parâmetros de desempenho que devem ser considerados na

validação são os seguintes:

5.7.1 Seletividade

A seletividade de um método irá demonstrar a extensão na qual um analito

poderá ser determinado numa amostra complexa, sem sofrer interferências dos

componentes da matriz. Considerando a urina como a matriz biológica de eleição

nesse estudo, tornou-se necessária a avaliação do efeito matriz diante dos compostos

estudados.

Dessa forma, foi realizada extração em urina com adicionado de 1 ng/mL de

DIE, FEN e SIB. O objetivo desse experimento foi observar uma possível

sobreposição entre picos cromatográficos provenientes da matriz e aqueles referentes

aos analitos extraídos da urina.

62

5.7.2 Linearidade

A quantificação de compostos de interesse requer a medição de respostas

analíticas para uma série de padrões, abrangendo a faixa dinâmica ajustada para o

método. Os valores resultantes são utilizados na obtenção de uma reta que deverá

expressar a correlação linear entre as concentrações dos padrões e a resposta do

detector, empregando-se o método dos mínimos quadrados. Dessa forma, um método

será linear ao longo da faixa dinâmica considerada, quando o fator de correlação linear

for próximo a 1.

A verificação da linearidade do método desenvolvido para os três analitos, foi

realizada numa faixa dinâmica compreendida entre 1 – 1000 ng/mL. As curvas de

calibração foram feitas a partir de adicionado dos analitos em alíquotas de 5 mL de

urina, filtrada em membrana Millex, nas concentrações de 1, 20, 50, 100, 500 e 1000

ng/mL. Após a adição dos analitos e ajuste para o pH 11, foram realizadas extrações

utilizando a técnica de DLLME já descrita.

5.7.3 Precisão

Demonstra a reprodutibilidade e a repetibilidade dos resultados, ou seja, a

concordância entre os valores obtidos para duas ou mais replicatas das medidas ou

entre medidas que foram realizadas da mesma forma. Considerando um mesmo

método analítico, a precisão poderá ser determinada pela simples repetição da

medida. Dessa forma, será denominada repetibilidade, pois está relacionada com as

medições que podem ser repetidas. Nesse caso emprega-se em todas as análises, o

mesmo método, o mesmo material, o mesmo analista e o mesmo laboratório em um

curto espaço de tempo entre as análises. Por outro lado, a reprodutibilidade é uma

modalidade de precisão que está relacionada com as medições feitas em condições

que podem ser reproduzidas.

A avaliação da precisão do método foi realizada através de experimentos de

precisão intradia, precisão interdia e precisão do instrumento. A precisão intradia foi

avaliada realizando-se cinco extrações consecutivas em urina com DLLME. As

63

análises dos extratos foram feitas em um mesmo dia, considerando as concentrações

de 1, 100 e 1000 ng/mL, a partir do procedimento descrito na FIGURA 14.

A precisão interdia foi realizada por um período de cinco dias consecutivos

onde, em cada dia, foram realizadas cinco extrações simultâneas para cada uma das

concentrações baixa, média e alta (1, 100 e 1000 ng/mL), utilizando o mesmo

procedimento de DLLME já descrito. A precisão do instrumento foi realizada, de modo

a avaliar a performance do injetor CTC do GC-MS. Logo, de um mesmo extrato nas

concentrações baixa, média e alta, foram feitas cinco injeções consecutivas, com o

objetivo de verificar a repetibilidade da injeção.

5.7.4 Limite de detecção (LD)

Em termos gerais, o limite de detecção (LD) é a menor quantidade ou

concentração do analito na amostra de teste, que pode ser distinguida do zero, com

segurança (IUPAC, 2002). Normalmente, ao serem utilizadas técnicas analíticas

instrumentais, o limite de detecção é dado como 3 vezes a razão sinal-ruído do

instrumento (S/N) para o analito em estudo. Dessa forma, os valores foram

determinados em amostras de urina com adicionado dos analitos em baixas

concentrações, após o procedimento de extração com DLLME, de modo a alcançar o

valor mínimo de concentração capaz de atender a esse critério (S/N ≥ 3:1).

5.7.5 Limite de quantificação (LQ)

Esse parâmetro é útil para indicar a concentração abaixo da qual o método

analítico não pode operar com uma precisão aceitável. Com frequência essa precisão

é arbitrariamente definida como 10% do desvio padrão relativo (DPR) ou o limite é

tomado arbitrariamente como sendo igual a um múltiplo do limite de detecção (IUPAC,

2002). Em métodos instrumentais, o limite de quantificação é considerado como sendo

10 vezes a razão sinal-ruído (S/N). Normalmente é o ponto inferior na curva de

calibração, excluindo-se o branco. Considerando a faixa dinâmica linear para o

método (1 - 1000 ng/mL), o LQ foi fixado como sendo a menor concentração da curva

de calibração que foi feita em urina, após o procedimento de DLLME.

64

5.7.6 Fator de recuperação

Quando uma amostra recebe tratamento para análise indireta (extração,

diluição, derivatização, etc) ou é determinada de forma direta (quando há, por

exemplo, baixa solubilidade) torna-se necessário calcular experimentalmente as

perdas das espécies analisadas. Dessa forma, a recuperação é o número que

expressa a quantidade de massa do analito que foi extraída de uma amostra que

contém outros componentes (Leite, 2008).

O objetivo de determinar o fator de recuperação é estimar a eficiência do

método, de modo a garantir que o composto seja analisado na totalidade de sua

massa presente na amostra. O principal método de obtenção desse parâmetro, é

aquele em que se utiliza uma alíquota da matriz isenta da espécie a analisar, faz-se

um adicionado do analito de interesse nessa matriz e, após todo o processo de

extração, calcula-se o fator de recuperação.

Os valores de recuperação relativa foram obtidos considerando as curvas

analíticas para DIE, FEN e SIB feitas em matriz, ou seja, a partir de extratos em pool

de urina utilizando o procedimento de DLLME. Após a obtenção das curvas, foram

realizadas extrações, empregando uma amostra distinta de urina, com adicionado dos

analitos de 1, 100 e 1000 ng/mL em triplicata.

5.7.7 Estabilidade

É o parâmetro que visa determinar se um analito mantém-se quimicamente

inalterado numa dada matriz sob condições específicas, em determinados intervalos

de tempo (ANVISA, 2005). A estabilidade da amostra é fundamental para garantir a

confiabilidade na quantificação. É um parâmetro que permite avaliar a capacidade do

analito em suportar as condições laboratoriais durante uma análise.

De acordo com a Resolução 899 da ANVISA, para a realização do estudo de

estabilidade, devem ser observados parâmetros previamente validados para o método

analítico, tais como exatidão, precisão, linearidade, limite de detecção, limite de

65

quantificação e especificidade. A estabilidade do fármaco em fluidos biológicos

depende de suas propriedades químicas, da matriz biológica e das condições de

acondicionamento. Os ensaios de estabilidade devem reproduzir as reais condições

de manuseio e análise das amostras em laboratório.

A partir dessa consideração inicial, as amostras de urina, após adicionar os

analitos em concentrações baixa, média e alta (1, 100 e 1000 ng/mL), foram

congeladas à uma temperatura de -18ºC por um período de um mês. No primeiro dia

de realização do experimento e a cada 7 dias até o 28º dia, as amostras de urina foram

descongeladas e analisadas seguindo o procedimento de extração por DLLME.

66

CAPITULO 6 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

___________________________________________________________________

67

6.1 Desenvolvimento do método analítico

6.1.1 Separação cromatográfica e identificação por GC-MS

Durante o desenvolvimento da metodologia analítica para determinação de

DIE, FEN e SIB em urina, foram testados diferentes métodos de separação como

cromatografia líquida de alta eficiência e cromatografia gasosa. Entretanto, esta

demonstrou maiores vantagens na separação dos compostos estudados.

O desenvolvimento do método de análise empregando GC-MS levou em

consideração, em princípio, a capacidade de os analitos serem volatilizados no injetor

aquecido do cromatógrafo à gás, sem que houvesse degradação térmica. Outros

importantes fatores foram a excelente separação dos analitos, a simetria dos picos

cromatográficos proporcionada pela coluna capilar (FIGURA 15) e a detecção por

espectrometria de massas, que demonstra grande capacidade de discriminação e

identificação dos compostos em extratos de urina (FIGURA 16).

FIGURA 15. Cromatograma de íons selecionados (SIM) de uma amostra de urina adicionada com 100 ng/mL de DIE, FEN e SIB.

68

(a)

(b)

(c)

FIGURA 16. Espectros de massas por impacto de elétrons (EI-MS) no modo full scan para (a) DIE, (b) FEN e (c) SIB.

69

A seleção dos íons para identificação e quantificação dos analitos, levou em

consideração a relação percentual existente entre aqueles de maior intensidade no

espectro normalizado. A quantificação de um determinado analito por espectrometria

de massas, geralmente é realizada selecionando-se o pico base, ou seja, o íon de

intensidade 100% por ser aquele que resulta em maior relação sinal-ruído (S/N) para

o pico cromatográfico correspondente.

Por outro lado, a identificação é feita considerando-se ao menos três íons

qualificadores, preferencialmente aqueles que apresentam maior razão massa/carga

(m/z), como mostrado na TABELA 6.

TABELA 6. Íons selecionados para identificação e quantificação dos compostos estudados

Analito Quantificação (m/z) Identificação (m/z) T.R. (min)

Dietilpropiona( DIE) 100 72(5,3%), 77(8,5%), 100(100%) 14,009

Fenproporex (FEN) 97 56(31,4%), 91(18,2%), 97(100%) 15,276

Sibutramina (SIB) 114 58(4,6%), 72(13%), 114(100%) 18,231

Apesar de a urina se apresentar como uma matriz limpa em relação a outras

matrizes biológicas como sangue ou tecidos, o seu extrato resultou em um

cromatograma com evidência de impurezas, quando foram feitas extrações com

adicionado dos analitos com concentração de 1 ng/mL.

O cromatograma de íons selecionados (SIM), mostrado na FIGURA 17, sugere

que há uma contribuição dos interferentes da matriz na aquisição dos íons

selecionados para a quantificação. Porém, não foram observadas sobreposições de

picos cromatográficos dos analitos com aqueles de interferentes presentes na urina.

A janela de aquisição para o íon m/z 97 (o pico base do FEN utilizado para

quantificação), compreendida entre 14,50 e 17,00 minutos, apresenta, em baixas

concentrações, maior deslocamento da linha de base e um ruído acentuado. Isso se

deve principalmente ao sangramento da coluna cromatográfica, considerando o

aumento da temperatura nesse tempo de eluição e a contribuição do íon m/z 97

proveniente da fase estacionária.

70

FIGURA 17. Cromatograma de íons selecionados (SIM) para adicionado de 1 ng/mL de DIE, FEN e SIB em urina.

De outra forma, mesmo em baixas concentrações como em 1 ng/mL, os picos

cromatográficos de DIE em 14,008 minutos e SIB em 18,230 minutos, apresentaram-

se de forma simétrica, com boa resolução e linha de base menos ruidosa que aquela

do FEN (FIGURA 17). Mesmo eluindo em uma região de programação de maior

temperatura que o FEN, a SIB não apresentou deslocamento da linha de base,

provavelmente pelo fato de haver pouca contribuição do íon m/z 114 durante o

sangramento da fase estacionária da coluna.

Os parâmetros cromatográficos mais relevantes para a cromatografia gasosa

foram considerados durante a avaliação da separação dos compostos estudados.

Dessa forma, os fatores de assimetria (As) e alargamento dos picos (TF) foram

71

avaliados no cromatograma obtido a partir da amostra de urina enriquecida com os

analitos na concentração de 100ng/mL (FIGURA 14). Os analitos foram extraídos com

o procedimento de microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME), descrito no item

5.4.

O fator de assimetria (As) é o parâmetro que considera a simetria do pico

cromatográfico, sendo este calculado a 10% da altura do pico, através da EQUAÇÃO

9,

�� = �� (9)

onde, A e B correspondem às distâncias entre o centro do pico cromatográfico (tp) e

as bordas laterais a 10% da altura, de acordo com a FIGURA 18.

FIGURA 18. Medidas relacionadas ao cálculo do fator de assimetria (adaptado de Caramão et al. 2010). Dessa forma, se A/B > 1, considera-se a formação de cauda no pico

cromatográfico, o que influencia de forma negativa a simetria. Logo, quanto mais

simétrico e resolvido for um pico, menor será a possibilidade de coeluição, pois bandas

largas e pouco separadas tendem a sobrepor-se.

A partir dessas considerações iniciais, foram obtidos os seguintes valores de

fator de assimetria (As) para os compostos estudados, de acordo com a TABELA 7:

72

TABELA 7. Valores de fator de assimetria (As) a partir dos picos cromatográficos obtidos em extrato de urina com adicionado na concentração de 100 ng/mL para DIE, FEN e SIB.

Analito A(min) B(min) Fator de assimetria (As)

Dietilpropiona (DIE) 0,025 0,025 1,00

Fenproporex (FEN) 0,027 0,028 0,96

Sibutramina (SIB) 0,028 0,028 1,00

Considerando que, para valores de As ≤ 1 os picos são simétricos, é possível

observar a partir dos valores da tabela que DIE, FEN e SIB, apresentaram boa simetria

no cromatograma considerado na FIGURA 14.

O fator de alargamento (TF) é outro parâmetro empregado para avaliar a

simetria dos picos cromatográficos e pode ser obtido a partir da EQUAÇÃO 10:

�� = (��)�� (10)

onde, A e B correspondem às mesmas medidas obtidas para o fator de assimetria

(As), encontrados na TABELA 6. Dessa forma, os valores obtidos para os fatores de

alargamento dos analitos estudados, são mostrados na TABELA 8.

TABELA 8. Valores de fator de alargamento (TF) a partir dos picos cromatográficos obtidos em extrato de urina com adicionado na concentração de 100 ng/mL para DIE, FEN e SIB.

Analito A(min) B(min) Fator de alargamento (TF)

Dietilpropiona (DIE) 0,025 0,025 1,00

Fenproporex (FEN) 0,027 0,028 1,02

Sibutramina (SIB) 0,028 0,028 1,00

Valores ótimos para esse parâmetro são aqueles em que TF ≤ 2, de acordo

com Ribani et al. (2004). Logo, para os três compostos analisados, os valores para o

fator de alargamento estão dentro da faixa aceitável.

73

6.1.2 Otimização da microextração líquido-líquido d ispersiva (DLLME)

6.1.2.1 Seleção do solvente extrator

O primeiro parâmetro otimizado no procedimento de extração foi a escolha do

solvente extrator. De acordo com Mashayekhi et al. (2012), o solvente extrator deve

ser pouco miscível com a água, deve apresentar maior densidade que esta e

capacidade de extrair os analitos em questão. De acordo com a FIGURA 19, o CH2Cl2

proporcionou maiores áreas dos picos cromatográficos para os três analitos,

simultaneamente, após a extração em concentrações de 100 ng/mL em 5,0 mL de

urina.

FIGURA 19. Áreas dos picos cromatográficos para DIE, FEN e SIB extraídos da urina em concentração inicial de 100 ng/mL, utilizando-se CHCl3, CH2Cl2 e CS2 como solventes extratores. 6.1.2.2 Seleção do solvente dispersor

Foram avaliados diferentes solventes dispersores que possuem solubilidade

adequada em água, considerando o caráter aquoso da matriz e boa miscibilidade com

o extrator. Metanol, acetonitrila e acetona foram testados como dispersores, obtendo-

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

2000000

CHCl3 CH2Cl2 CS2

Áre

a

DIE FEN SIB

74

se diferentes valores de área dos picos cromatográficos para DIE, FEN e SIB, de

acordo com a FIGURA 20. No procedimento de extração, utilizou-se 1mL do solvente

dispersor e 300 µL de diclorometano em 5,0 mL de urina.

FIGURA 20. Áreas dos picos cromatográficos para DIE, FEN e SIB extraídos de urina com concentração inicial de 100 ng/mL, utilizando-se metanol, acetonitrila e acetona como solventes dispersores.

Os resultados ilustrados na FIGURA 20 demonstram a variação nos valores de

área para os picos com diferentes dispersores. O metanol proporcionou maior área

dos picos em relação aos outros solventes, sendo esse empregado na metodologia.

Como já discutido anteriormente, o solvente dispersor afeta diretamente o grau de

dispersão do extrator na fase aquosa e, por consequência, a eficiência da extração

(Rezaee et al. 2010).

6.1.2.3 Efeito do pH da amostra

O pH é um dos parâmetros que afetam a eficiência da extração e a seletividade

em DLLME. A amostra deve ter o seu pH ajustado para um valor em que os analitos

sejam mantidos na forma molecular, ou seja, não ionizada, com o objetivo de tornar a

partição destes, da solução para as pequenas gotas de CH2Cl2, mais eficiente.

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

METANOL ACETONITRILA ACETONA

Áre

a

DIE FEN SIB

75

Diferentes valores de pH foram testados, no sentido de avaliar a influência dessa

variável na recuperação dos analitos durante o procedimento de extração. Dessa

forma, foram considerados os valores de pKa de DIE, FEN e SIB, que são próximos

do pKa da anfetamina (AMP) e são mostrados na TABELA 9. Os derivados

anfetamínicos possuem, em sua maioria, valores de pKa < 10.

TABELA 9. Valores de pKa para AMP, DIE, FEN e SIB (Kolmonen et al. 2007; PubChem, 2013).

Analito pKa

AMP 10,2

DIE 8,5

FEN 7,9

SIB 8,5

Considerando os valores de pKa para os compostos estudados foram

realizados experimentos de DLLME, de acordo com o procedimento descrito na seção

5.5, empregando-se pH 9, 10 e 11. As áreas dos picos cromatográficos foram

avaliadas em função da variação de pH da amostra, para os analitos em

concentrações de 1, 10 e 20 ng/mL em urina. Os resultados são mostrados nos

gráficos contidos nas FIGURAS 21, 22 e 23, para DIE, FEN e SIB, respectivamente.

FIGURA 21. Área dos picos cromatográficos em função do pH para DIE nas concentrações de 1, 10 e 20 ng/mL.

0,0E+00

1,0E+05

2,0E+05

3,0E+05

4,0E+05

5,0E+05

6,0E+05

7,0E+05

pH 9 pH 10 pH 11

Áre

a

DIETILPROPIONA

1 ng/mL 10 ng/mL 20 ng/mL

76

FIGURA 22. Área dos picos cromatográficos em função do pH para FEN nas concentrações de 1, 10 e 20 ng/mL

FIGURA 23. Áreas dos picos cromatográficos em função do pH para SIB nas concentrações de 1, 10 e 20 ng/mL

0,0E+00

1,0E+05

2,0E+05

3,0E+05

4,0E+05

5,0E+05

6,0E+05

7,0E+05

pH 9 pH 10 pH 11

Áre

aFENPROPOREX


0,0E+00

1,0E+05

2,0E+05

3,0E+05

4,0E+05

5,0E+05

6,0E+05

pH 9 pH 10 pH 11

Áre

a

SIBUTRAMINA


77

A partir dos resultados experimentais contidos nos gráficos anteriores, é

possível observar a influência do pH na recuperação dos analitos. Considerando que

os valores de pKa dos compostos (TABELA 9) são próximos de 9, sendo este o

primeiro valor de pH testado, é possível inferir que uma fração das moléculas estará

no estado ionizado. Logo, a transferência de massa para a fase orgânica será

dificultada pelo fato da espécie ionizada ser mais solúvel na fase aquosa.

Comparando este resultado com aqueles obtidos em pH 10 e pH 11, observa-se uma

variação nas áreas dos picos e o aumento destas. Esse comportamento é justificado

pelo fato de esses valores estarem em torno de 2 unidades acima dos valores de pKa

dos compostos estudados. Assim, a quase totalidade das moléculas estará na forma

não ionizada, favorecendo a transferência para a fase orgânica. Por outro lado, não

foram observadas variações importantes nos valores de recuperação entre o pH 10 e

11, considerando que nessas condições a forma molecular das espécies é

predominante.

6.1.2.4 Influência do efeito salting-out

Foram adicionadas diferentes quantidades de sal para avaliar a influência do

efeito salting-out nas áreas dos picos cromatográficos. Os resultados obtidos para

esse experimento são mostrados na FIGURA 24.

FIGURA 24. Avaliação do efeito salting-out: áreas dos picos em função da adição de NaCl na amostra nas quantidades percentuais de 0,0% m/v, 0,5% m/v e 5,0% m/v.

0,0E+00

1,0E+05

2,0E+05

3,0E+05

4,0E+05

5,0E+05

6,0E+05

7,0E+05

0,0% m/v 0,5% m/v 5,0 % m/v

Áre

a

DIE FEN SIB

78

As condições do procedimento de extração foram idênticas àquelas já descritas

nas etapas anteriores de otimização do método. A força iônica foi avaliada pela adição

de cloreto de sódio (NaCl) nas quantidades percentuais de 0 – 5 % m/v e na

concentração de 100 ng/mL dos analitos em estudo. Logo, é possível observar o

decréscimo nas áreas em função do aumento da quantidade de sal na amostra.

Ao contrário do que ocorre em outras técnicas de microextração como, por

exemplo, na microextração em fase sólida (SPME), o efeito salting-out não favorece

uma maior recuperação dos analitos em DLLME. Isso ocorre porque, com o aumento

da força iônica, haverá diminuição da solubilidade do solvente extrator na amostra,

provocando o aumento do volume da gota depositada no fundo do tubo de extração,

diminuindo o fator de pré-concentração. Diante dessa constatação, os experimentos

foram realizados sem a adição de sal.

Após a otimização dos parâmetros mais importantes da microextração líquido-

líquido dispersiva (DLLME), definiu-se as condições ideais para a realização do

procedimento, como a seguir:

� Volume de amostra: 5 mL

� Volume do solvente extrator (CH2Cl2): 300 µL

� Volume do solvente dispersor (metanol): 1 mL

� Valor de pH: 11

� Concentração de sal (salting out): 0,0% (m/v)

� Centrifugação: 3000 RPM (5 min)

� Volume da gota decantada no tubo: 50 µL

6.1.2.5 Estabilidade

De acordo com os critérios estabelecidos para o teste de estabilidade, o

procedimento ideal é aquele que retrata com maior fidelidade as condições reais de

armazenamento e manuseio da amostra. As variações das concentrações dos

analitos em urina são mostradas nas FIGURAS 25, 26 e 27, para DIE, FEN e SIB,

respectivamente.

79

FIGURA 25. Variação na área dos picos cromatográficos para os analitos no teste de estabilidade (1 ng/mL)

FIGURA 26. Variação na área dos picos cromatográficos para os analitos no teste de estabilidade (100 ng/mL)

0,0E+00

2,0E+05

4,0E+05

6,0E+05

8,0E+05

1,0E+06

1,2E+06

1,4E+06

1,6E+06

1,8E+06

1º 7º 14º 28º

Áre

a

Dia

1 ng/mL

DIE

FEN

SIB

0,0E+00

1,0E+06

2,0E+06

3,0E+06

4,0E+06

5,0E+06

6,0E+06

7,0E+06

8,0E+06

9,0E+06

1,0E+07

1º 7º 14º 28º

Áre

a

Dia

100 ng/mL

DIE

FEN

SIB

80

FIGURA 27. Variação na área dos picos cromatográficos para os analitos no teste de estabilidade (1000 ng/mL).

É possível observar, através das curvas decrescentes indicadas nos gráficos,

que houve diminuição na área dos picos cromatográficos dos analitos durante os

testes. Essa constatação é justificada pelo fato de parte das proteínas e outras

macromoléculas presentes na urina, precipitarem juntamente com os analitos.

Dessa forma, ocorre a diminuição da concentração entre o primeiro e o sétimo

dias e pouca variação é observada entre os dias posteriores. Por outro lado, nas

amostras contendo, inicialmente, 1 ng/mL dos analitos, a diminuição das áreas dos

picos ocorre de forma mais acentuada e de maneira decrescente em todo o período

de testes. Isso se deve, possivelmente, à maior influência da precipitação de

macromoléculas durante o processo de descongelamento e à degradação dos

compostos na matriz.

Entretanto, vale ressaltar que, mesmo após 28 dias e com uma baixa

concentração inicial (1 ng/mL), o método ainda foi capaz de detectar os analitos

presentes na urina.

0,0E+00

1,0E+07

2,0E+07

3,0E+07

4,0E+07

5,0E+07

6,0E+07

7,0E+07

8,0E+07

9,0E+07

1º 7º 14º 28º

Áre

a

Dia

1000 ng/mL

DIE

FEN

SIB

81

6.2 Validação do método analítico

6.2.1 Limites de detecção e quantificação (LD e LQ)

Particularmente, em toxicologia forense, é de suma importância conhecer os

limites de detecção do método para os analitos em questão, de modo que não haja

ocorrência de falsos negativos. A abordagem aplicada com maior frequência é aquela

em que o LD de uma substância corresponde à menor concentração em que a relação

sinal-ruído é maior ou igual a 3, ou seja, S/N ≥ 3:1 (Peters et al. 2007; Rivier, 2003).

O limite de quantificação (LQ) para o método foi definido como a quantidade

mínima do analito que pôde ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis. Os

valores obtidos experimentalmente para DIE, FEN e SIB são mostrados na TABELA

10.

TABELA 10. Valores de limites de detecção (LD) e limites de quantificação (LQ) para o método.

Analito LD (ng/mL) LQ (ng/mL)

DIE 0,1 1,0

FEN 0,1 1,0

SIB 0,05 1,0

De acordo com Botré et al.(2010), os limites de detecção (LD) para DIE e FEN

foram 10 ng/mL e 50 ng/mL, respectivamente. Considerando a técnica de DLLME e o

fator de enriquecimento proporcionado por esta, foi possível atingir limites menores

no presente estudo.

Strano-Rossi et al. (2005) ao empregarem SPME-GC-MS, encontraram para os

mesmos compostos, valores de LD da ordem de 50 ng/mL. Em outro trabalho, Ouyang

et al. (2010) estabeleceram para DIE e SIB os valores de limite de detecção (LD) em

10 ng/mL e 20 ng/mL, respectivamente.

82

6.2.2 Linearidade

O método analítico desenvolvido demonstrou excelente linearidade para os

estimulantes anfetamínicos estudados, na faixa dinâmica de 1 a 1000 ng/mL, quando

realizado procedimento de DLLME em urina. Strano-Rossi et al. (2005) fixaram para

DIE e FEN, a faixa de 50 a 1000 ng/mL, obtendo valores de R2 iguais a 0,985 e 0,980,

respectivamente.

Botré et al.(2010), em um método desenvolvido para análise em GC-MS,

obtiveram para os mesmos analitos em uma faixa linear de 10 a 2000 ng/mL,

excelentes valores de correlação: 0,994 para DIE e 1,0 para FEN. As curvas de

calibração obtidas com o método em extratos de urina, após a realização do

procedimento de DLLME, são mostradas nas FIGURAS 28, 29 e 30 com os

respectivos valores de R2.

Em um método desenvolvido por Thörngren et al. (2008), para determinação

de SIB em urina empregando LC-MS, foi obtido o coeficiente de determinação de

0,980 para uma faixa de concentração de 50 a 1000 ng/mL.

FIGURA 28. Curva de calibração e coeficiente de determinação para DIE na faixa de 1 a 1000 ng/mL.

y = 32587x - 158993R² = 0,9926

-5,0E+06

0,0E+00

5,0E+06

1,0E+07

1,5E+07

2,0E+07

2,5E+07

3,0E+07

3,5E+07

4,0E+07

0 200 400 600 800 1000 1200

Áre

a

ng/mL

83

FIGURA 29. Curva de calibração e coeficiente de determinação para FEN na faixa de 1 a 1000 ng/mL.

FIGURA 30. Curva de calibração e coeficiente de determinação para SIB na faixa de 1 a 1000 ng/mL.

y = 35781x - 215032R² = 0,9994

-5,0E+06

0,0E+00

5,0E+06

1,0E+07

1,5E+07

2,0E+07

2,5E+07

3,0E+07

3,5E+07

4,0E+07

0 200 400 600 800 1000 1200

Áre

a

ng/mL

y = 19726x - 345004R² = 0,9951

-5,0E+06

0,0E+00

5,0E+06

1,0E+07

1,5E+07

2,0E+07

2,5E+07

0 200 400 600 800 1000 1200

Áre

a

ng/mL

84

6.2.3 Fator de recuperação

Em métodos bioanalíticos o fator de recuperação é um parâmetro de grande

importância, considerando o efeito matriz, ao se utilizar a espectrometria de massas

como sistema de detecção (Veuthey et al., 2010). Dessa forma, durante o

desenvolvimento do método, foram avaliadas as recuperações relativas para os

analitos estudados, presentes em urina nas concentrações de 1, 100 e 1000 ng/mL.

Os resultados experimentais demonstraram que a recuperação variou de 82,08% para

SIB (100 ng/mL) até 104,22% para FEN (1000 ng/mL), de acordo com os dados

apresentados na FIGURA 31.

FIGURA 31. Valores de recuperação relativa para DIE, FEN e SIB em urina.

Levando-se em consideração a classe dos compostos anfetamínicos, os

valores de recuperação relativa obtidos, estão de acordo com aqueles encontrados

por Mashayekhi (2010). Ao utilizar DLLME na determinação de MDMA, MDA, MDEA

e MDPA em urina empregando GC-FID, foram encontrados valores da ordem de

90 - 98,5% para todos os analitos. Neste estudo, os valores médios obtidos para DIE,

FEN e SIB foram na faixa de 91,7 a 96,6%.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0


Re

cup

era

ção

(%

)

DIE FEN SIB

85

6.2.4. Precisão do instrumento e do método

Foram avaliados parâmetros de precisão para o método de extração e para o

instrumento utilizado. Dessa forma, os valores obtidos para precisão instrumental,

precisão intradia e precisão interdia são mostrados a seguir. A TABELA 11 apresenta

a precisão após a injeção de cinco alíquotas do mesmo extrato obtido pelo

procedimento de DLLME.

TABELA 11. Valores determinados (%) para precisão instrumental, nas concentrações de 1, 100 e 1000 ng/mL.

Analito 1 ng/mL 100 ng/mL 1000 ng/mL Média

DIE 4,18 4,45 3,63 4,08

FEN 4,96 4,61 4,16 4,50

SIB 4,80 4,26 3,64 3,23

De acordo com Leite (2008), a repetibilidade do instrumento deve ser avaliada

em termos de precisão, sob as mesmas condições de análise, ou seja, utilizando a

mesma amostra, o mesmo instrumento, a mesma calibração e o mesmo analista.

Valores ótimos para esse parâmetro devem ser obtidos com precisão de até 5%. Logo,

considerando os valores experimentais, a precisão instrumental apresentou valores

dentro da faixa aceitável.

Os valores de precisão intradia e precisão interdia, estão em concordância com

aqueles citados por Peters et al.(2007), ao afirmarem que os critérios de aceitação

para a precisão são de CV(%)≤15 para concentrações média e alta e CV(%)≤20 para

o valor próximo ao LQ, os quais têm sido amplamente aceitos em métodos

bioanalíticos. Os resultados são mostrados nas TABELAS 12 e 13.

TABELA 12. Valores determinados (%) para precisão intra-dia, nas concentrações de 1, 100 e 1000 ng/mL.


DIE 10,09 5,14 5,19 6,63

FEN 10,53 7,07 4,67 7,42

SIB 10,93 7,56 5,38 7,95

86

TABELA 13. Valores determinados (%) para precisão inter-dia, nas concentrações de 1, 100 e 1000 ng/mL.


DIE 5,48 5,86 5,07 5,47

FEN 4,12 4,76 4,50 4,46

SIB 3,65 4,55 3,47 3,89

Os parâmetros de performance analítica otimizados para o método de

microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) são mostrados na TABELA 14.

Estão reunidos valores de precisão intradia e interdia, linearidade (R2), faixa dinâmica

linear e limites de detecção para os estimulantes anfetamínicos estudados.

TABELA 14. Parâmetros de performance analítica otimizados para o procedimento de extração por DLLME. Analito Equação de

regressão linear

R2 Faixa linear

(ng/mL)

LD

(ng/mL)

CV(%)

Interdia

CV(%)

Intradia

DIE y = 32587x - 158993 0,9926 1 – 1000 0,1 5,47 6,63

FEN y = 35781x - 215032 0,9994 1 – 1000 0,1 4,46 7,42

SIB y = 19726x - 345004 0,9951 1 - 1000 0,05 3,89 7,95

87

CAPÍTULO 7 – APLICAÇÃO DO MÉTODO

___________________________________________________________________

88

7.1 Aplicação do método desenvolvido na análise de amostras de urina

Foram analisadas 20 amostras de urina provenientes do Laboratório de

Toxicologia Forense com o objetivo de detectar a presença de DIE, FEN e SIB,

utilizando o método analítico desenvolvido nesse trabalho. Entretanto, confirmando os

resultados preliminares da triagem realizada por técnicas de imunoensaio comumente

aplicadas em urina, em nenhuma das amostras analisadas foram detectados os

analitos estudados. De modo a simular condições reais, três amostras de urina que

apresentaram resultados negativos foram utilizadas na aplicação do método.

Após a análise e confirmação da inexistência dos analitos nas três amostras de

urina, para cada uma delas foram feitos adicionados nas concentrações de 1, 100 e

1000 ng/mL, com DIE, FEN e SIB. O passo seguinte foi a extração utilizando DLLME

com o procedimento já descrito na seção 5.5. Para cada amostra, incialmente foi

realizada a identificação com os respectivos íons qualificadores, de acordo com a

TABELA 6.

O método de identificação foi satisfatório, considerando a relação percentual

existente entre íons qualificadores e o pico base para cada espectro. De outra forma,

a quantificação dos analitos nas amostras foi realizada com a seleção do íon

quantificador como sendo o pico base (o íon mais intenso do espectro de massas),

pelo fato de este fornecer melhor relação sinal-ruído (S/N).

As concentrações de cada analito nas amostras, juntamente com o erro relativo

(exatidão), a recuperação e o fator de enriquecimento (FE) para DIE, FEN e SIB, são

mostrados nas TABELAS 15, 16 e 17, para concentrações de 1, 100 e 1000 ng/mL,

respectivamente.

TABELA 15. Valores de concentração, erro relativo, recuperação e fator de enriquecimento (FE) para DIE, FEN e SIB em amostra de urina com adicionado de 1 ng/mL.

Analito C (ng/mL) Erro relativo (%) Recuperação (%) FE

DIE < LQ (0,95)* 4, 40 95,60 95,60

FEN < LQ (0,88)* 11,41 88,58 88,58

SIB < LQ (0,82)* 17,11 82,88 82,88

* Valores estimados a partir dos resultados encontrados nas análises

89



DIE 103,67 3,67 103,67 103,67

FEN 107,12 7,12 107,12 107,12

SIB 91,90 8,10 91,90 91,90



DIE 1018,19 1,82 101,82 101,82

FEN 973,03 2,69 97,30 97,30

SIB 1045,58 4,55 104,56 104,56

A quantificação dos analitos em amostras de urina foi satisfatória, considerando

que os resultados para a concentração e a recuperação mostrados nas tabelas

anteriores se encontram dentro da faixa considerada na otimização do método. Por

outro lado, o fator de enriquecimento (FE) em torno de 100, demonstrou que a DLLME

apresenta uma boa capacidade de pré-concentrar os analitos presentes na urina,

sendo esse um importante parâmetro na determinação de compostos traço.

Acredita-se que a diminuição do consumo ilícito dos medicamentos estudados,

principalmente por causa da proibição de fabricar e comercializar DIE e FEN e o maior

controle na venda de SIB no Brasil, tenham sido as principais dificuldades em detectar

esses analitos em amostras de urina. Por outro lado, é importante ressaltar que,

apesar de tais restrições terem sido impostas no final de 2011, ainda são observadas

apreensões desses medicamentos, principalmente de cloridrato de fenproporex e

cloridrato de sibutramina, sendo este, atualmente, contrabandeado do Paraguai. Esse

fato aponta para a continuidade do consumo dessas substâncias de forma criminosa

e para fins não-terapêuticos.

90

CAPÍTULO 8 - CONCLUSÕES

___________________________________________________________________

91

8. Conclusões

1. O método analítico desenvolvido empregando cromatografia em fase

gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS) é capaz de

identificar e quantificar dietilpropiona (DIE), fenproporex (FEN) e

sibutramina (SIB) inalterados em urina em concentrações a nível de traços.

2. A microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME), mostrou ser uma

técnica de extração bastante útil para a determinação de derivados

anfetamínicos em urina, na forma inalterada, ainda que estes estejam

presentes em baixas concentrações, sendo sua capacidade de pré-

concentração um dos fatores relevantes. A faixa dinâmica linear

determinada permitiu limites de detecção e quantificação para os três

analitos abaixo daqueles encontrados na literatura para métodos

semelhantes. Isso se deve principalmente ao fator de enriquecimento

alcançado no procedimento de extração.

3. O uso da técnica de microextração em análises de rotina é facilitado pelo

fato de serem utilizados somente pequenos volumes de solventes orgânicos

e materiais de uso comum em laboratório, não necessitando de materiais

de alto custo ou adsorventes específicos.

4. O método demonstrou ser relevante para análises forenses, considerando

a sensibilidade e a rapidez de execução proporcionadas pela técnica de

microextração, podendo ser implementado em laboratórios de toxicologia

no âmbito da polícia científica.

5. Como sugestão de trabalhos futuros empregando a microextração líquido-

líquido dispersiva, a investigação de metabólitos de estimulantes

anfetamínicos em urina torna-se relevante pela continuidade na

comercialização e no consumo de forma ilícita.

92

CAPÍTULO 9 – REFERÊNCIAS

___________________________________________________________________

93

ALVES, M.N.R.; Desenvolvimento e validação de metodologia para análise de cocaína, derivados e metabólitos em amostras de mecônio utilizando cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS). (77 f). Dissertação (Mestrado em Toxicologia). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto 2010. ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL). Resolução da Diretoria Colegiada Nº 52, de 6 de outubro de 2011. ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL). Resolução da Diretoria Colegiada Nº 899, de 29 de maio de 2003. BALÍKOVÁ, M.; BERÁNKOVÁ, K.; SZKUTOVÁ, M.; Distribution profile of 2,5-dimetoxy-4-bromoamphetamine (DOB) in rats after oral and subcutaneous doses. Forensic Science International , 170: 94-99, 2007.

BECKETT, A.H.; STANOJCIC, M; Re-evaluation of the metabolism and excretion of diethylpropion in non-sustained and sustained release formulations. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 39(6):409-415, 1987.

BECKETT, A.H.; TESTA, B.; Metabolism and excretion of diethylpropion in man under acidic urine conditions. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 25, 119-124. 1973. BELL, R.R.; CROOKMAN, S.B.; DUNN, W.A.; GRATES, K.M.; REIBER, T.M.; A contemporaneous finding of fenproporex in a polydrug suicide. Journal of Analytical Toxicology , Vol 25, Out 2001. BOTRÈ, F., STRANO-ROSSI, S., DE LA TORRE, X.; A fast gas chromatography-mass spectrometry method for determination of stimulants and narcotics in urine. Rapid Communications in Mass Spectrometry , 24: 1474-1480, 2010. BOTRÈ, F.; STRANO-ROSSI, S.; COLAMONICI, C.; Detection of sibutramine administration: a gas chromatography-mass spectrometry study of the main urinary metabolites. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 21: 79-88, 2007. BOTRÈ, F.; STRANO-ROSSI, S.; COLAMONICI, C.; Parallel analysis of stimulants in saliva and urine by gas chromatography/mass spectrometry: perspectives for “in competition” anti-doping analysis. Analytica Chimica Acta , 606: 217-222, 2008. CHEMSPIDER. The free chemical database. Disponível em www.chemspider.com . Acesso em 03 julho 2013. CODY, J.; Amphetamines. In: Maciej Bogusz. Forensic Science, Handbook of Analytical Separations. Elsevier Science, 2000. Vol 2, Chapter 3, 107-141. CODY, J.; VALTIER, S.; Detection of amphetamine following administration of fenproporex. Journal of Analytical Toxicology , Vol 20, Oct 1996.

94

CODY, J.; VALTIER, S.; STILLMAN, S.; Amphetamine and fenproporex levels following multidose administration of fenproporex. Journal of Analytical Toxicology , Vol 23, May/Jun 1999. CODY, JT.; Metabolic precursors to amphetamine and methamphetamine. Forensic Science Review , 5:109, 1993. COLLINS, C.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S.; Fundamentos de cromatografia . 1ª ed. Campinas, SP. Editora Unicamp. 2009 COSTA, J.L.; CHASIN, A.A.M.; Determination of MDMA, MDEA and MDA in urine by high performance liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Chromatography B , 811: 41-45, 2004. COSTA, J.L.; Determinação de MDMA, MDEA e MDA em fluidos biológicos por cromatografia líquida de alta eficiência: aspecto forense. (142 f). Dissertação (Mestrado em Toxicologia). Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2004. FLANAGAN, R.J.; TAYLOR, A.; WATSON, I.D.; WHELPTON, R.; Fundamentals of Analytical Toxicology . 1st edition, England. John Wiley & Sons, 2008. HSU, M.C.; HSU, K.F.; CHIEN, K.Y.; CHANG-CHIEN, G.P.; LIN, S.F.; HSU, P.H.; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry screening method for the simultaneous detection of stimulants and diuretics in urine. Journal of Analytical Toxicology , Vol 35, Nov/Dec 2011. ICH – International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1), 2005. JOFRÉ, V.P.; ASSOF, M.V.; FANZONE, M.L.; GOICOECHEA, H.C.; MARTINEZ, L.D.; SILVA, M.F.; Optimization of ultrasound assisted-emulsification-dispersive liquid-liquid microextraction by experimental design methodologies for the determination of sulfur compounds in wines by gas chromatography-mass spectrometry. Analytica Chimica Acta , 683: 126-135, 2010. JOHNSON,R.D.; BOTCH, S.R.; The screening of forensic blood, urine and tissue specimens for xenobiotics using ion-trap liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology , Vol. 35, Mar 2011. JUNG, J.; HERMANNS-CLAUSEN, M.; WEINMANN, W.; Anorectic sibutramine detected in a chinese herbal drug for weight loss. Forensic Science International , 161: 221-222, 2006. KOLMONEN, M.; LEINONEN, A.; PELANDER, A.; OJANPERÄ, I.; A general screening method for doping agents in human urine by solid phase extraction and liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry. Analytica Chimica Acta , 585: 94-102, 2007.

95

KOROLKOVAS, A.; BURCKHALTER, J.H. Química farmacêutica. Rio de Janeiro. Guanabara Koogan, 1988. KRAEMER, T.; MAURER, H.H.; Determination of amphetamine, methamphetamine and amphetamine-derived designer drugs or medicaments in blood and urine. Journal of Chromatography B , 713: 163-187, 1998. KRAEMER, T.; THEIS, G.A.; WEBER, A.A.; Studies on the metabolism and toxicological detection of the amphetamine-like anorectic fenproporex in human urine by gas chromatography-mass spectrometry and fluorescence polarization immunoassay. Journal of Chromatography B , 738: 107-118, 2000. LEITE, F.; Validação em análise química . 5ª ed. Campinas, SP. Editora Átomo. 2008. LUQUE, C.; REY, J.; The discovery and status of sibutramine as an anti-obesity drug. European Journal of Pharmacology , 440: 119-128, 2002. MARIOTTI, K.C.; ORTIZ, R.S.; SOUZA, D.Z.; MILESKI, T.C.; FROEHLICHP.E.; LIMBERGER, R.P.; Trends in counterfeits amphetamine-type stimulants after its prohibition in Brazil. Forensic Science International , 229: 23-26, 2013. MASHAYEKHI, H.A.; REZAEE, M.; Determination of ecstasy components in human urine by gas chromatography using a Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Procedure. Journal of the Brazilian Chemical Society , vol 00, Nº 00, 1-6, 2012. MOFFAT, A.C.; OSSELTON, M.D.; WIDDOP, B.; GALICHET, L.Y.; Clarke's Analysis of Drugs and Poisons . 3rd edition, USA. Pharmaceutical Press, 2004. MOORE, K.; Amphetamines/Sympathomimetics Amines. In: LEVINE, B.; Principles of Forensic Toxicology . 3rd edition, USA. AACCPress, 2009. NASCIMENTO, E.C.; NASCIMENTO, E.; SILVA, J.P.; Uso de álcool e anfetaminas entre caminhoneiros de estrada. Revista de Saúde Pública , 41(2): 290-293, 2007. OGA, S.; CAMARGO, M.M.A.; BATISTUZZO, J.A.O.; Fundamentos de Toxicologia . 3ª ed. São Paulo, SP. Atheneu Editora. 2008. OUYANG, G.; LU, J.; WANG, S.; DONG, Y; WANG, X.; YANG, S.; ZHANG, J.; DENG, J.; QIN, Y.; XU, Y.; WU, M.; Simultaneous analysis of fourteen tertiary amine stimulants in human urine for doping control purposes by liquid chromatography –tandem mass spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry. Analytica Chimica Acta , 657: 45-52, 2010. PAVIA, D.L.; LAMPMAN, G.M.; KRIZ, G.S.; VYVYAN, J.R.; Introdução à Espectroscopia . 4ª ed. São Paulo, SP. Cengage Learning, 2010. PECHANSKY, F.; DE BONI, R.; DUARTE, P.; PAULA, F.C.; BENZANO, D.; DIEMEN, L.V.; LEUKEFELD, C.; Consumo de álcool e drogas entre motoristas privados e

96

profissionais do Brasil. In: Uso de bebidas alcoólicas e outras drogas nas rodov ias brasileiras e outros estudos . SENAD, 2010. PETERS, F.; DRUMMER, O.; MUSSHOF, F.; Validation of new methods. Forensic Science International , 165: 216-224, 2007. RANG, H.P.; DALE, M.M.; RITTER, J.M.; FLOWER, R.J.; Farmacologia . 6ª ed. Rio de Janeiro, RJ. Elsevier, 2007. RIBANI, M.; BOTTOLI, C.B.G.; COLLINS, C.H.; JARDIM, I.C.S.F.; Validação de métodos analíticos e eletroforéticos. Química Nova , Vol. 27, Nº 5, 771-780, 2004. RICE, KC.; YU, H.; ROTHMAN, R.B.; DERSCH, C.M.; PARTILLA, J.S.; Uptake and release effects of diethylpropion and its metabolites with biogenic amine transporters. Bioorganic Medicinal Chemistry, 8: 2689-2692, 2000. RIVIER, L.; Criteria for the identification of compounds by liquid chromatography-mass spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry in forensic toxicology and doping analysis. Analytica Chimica Acta , 492: 69-82, 2003. SARDELA, V.F.; MOTTA, M.T.R.; PADILHA, M.C.; PEREIRA, H.M.G.; AQUINO NETO, F.R.; Analysis of sibutramine metabolites as N-trifluoroacetamide and O-trimethysilyl derivatives by gas chromatography-mass spectrometry in urine. Journal of Chromatography B , 877: 3003-3011, 2009. SHULGIN, A.; SHULGIN, A.; Pihkal: A Chemical Love Story . 1st edition, Berkeley, USA. Transform Press, 1991. SOUZA, D.Z.; BOEHL, P.; COMIRAN, E.; MARIOTTI, K.C.; PECHANSKY, F.; DUARTE, P.C.A.V.; BONI, R.D.; FROEHLICH, P.E.; LIMBERGER, R.P.; Determination of amphetamine-type stimulants in oral fluid by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry. Analytica Chimica Acta , 696: 67-76, 2011. SPARKMAN, O.D.; WATSON, J.T.; Introduction to Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications and Strategies for Da ta Interpretation . 4th edition, West Sussex, UK. John Wiley & Sons, 2007. STRANO-ROSSI, S.; MOLAIONI, F.; BOTRÈ, F.; Application of solid-phase microextraction to antidoping analysis: determination of stimulants, narcotic, and other classes of substances excreted free in urine. Journal of Analytical Toxicology , Vol. 29, May/Jun 2005. UNODC – United Nations Office on Drug and Crime. World Drug Report 2012. Viena: United Nations Publication Sales, 2012. VEUTHEY, J.C.; MARCHI, I.; VIETTE, V.; BADOUD, F.; FATHI, M.; SAUGY, M.; RUDAZ, S.; Characterization and classification of matrix effects in biological samples analysis. Journal of Chromatography A , 1217: 4071-4078, 2010.

97

YAMINI, Y.; REZAEE. M.; FARAJI, M.; Evolution of dispersive liquid-liquid microextraction method. Journal of Chromatography A , 1217: 2342-2357, 2010. YONAMINE, M.; LEYTON, V.; SINAGAWA, D.M.; OLIVEIRA, K.C.B.G.; SCHMITZ, W.; ANDREUCCETTI, G.; DE MARTINIS, B.S.; MUNOZ, D.R.; Amphetamine, cocaine and cannabinoids use among truck drivers on the roads in the State of São Paulo, Brazil. Forensic Science International , 215: 25-27, 2012. ZANCANARO, I.; LIMBERGER, R.P.; BOEHL, P.O.; SANTOS, M.K.; DE BONI, R.B.; PECHANSKY, F.; CALDAS, E.D.; Prescription and illicit psychoactive drugs in oral fluid LC-MS/MS method development ana analysis of samples from Brazilian drivers. Forensic Science International , 2012. ZANELLA, R.; MARTINS, M.L.; PRIMEL, E.G.; CALDAS, S.S.; PRESTES, O.D.; ADAIME, M.B.; Microextração líquido-líquido dispersiva: fundamentos e aplicações. Scientia Chromatographica , 4(1): 35-51, 2012.

98

CAPÍTULO 10 – ANEXO

___________________________________________________________________

99

100

Documents

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE QUIMICA ... · instituto de quimica programa de pÓs-graduaÇÃo em quÍmica ricardo leal cunha desenvolvimento de mÉtodo analÍtico para