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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DA
RELAÇÃO PARASITO-HOSPEDEIRO
GABRIELA RODRIGUES BARBOSA
Astrovírus humanos clássicos em amostras fecais de crianças
atendidas em um hospital de Goiânia, Goiás
Goiânia
2019
GABRIELA RODRIGUES BARBOSA
Astrovírus humanos clássicos em amostras fecais de crianças
atendidas em um hospital de Goiânia, Goiás
Dissertação de Mestrado apresentado ao
Programa de Pós-Graduação em Biologia
da Relação Parasito-Hospedeiro da
Universidade Federal de Goiás para
obtenção do Título de Mestre.
Orientadora: Dra Menira Borges Lima
Dias e Souza
Goiânia
2019
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através doPrograma de Geração Automática do Sistema de Bibliotecas da UFG.
CDU 578
Barbosa, Gabriela Rodrigues Astrovírus humanos clássicos em amostras fecais de criançasatendidas em um hospital de Goiânia, Goiás [manuscrito] / GabrielaRodrigues Barbosa. - 2019. 56 f.: il.
Orientador: Profa. Dra. Menira Borges Lima Dias e Souza. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Institutode Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP), Programa de PósGraduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro, Goiânia, 2019. Bibliografia. Anexos.
1. Astrovírus humanos clássicos. 2. PCR em tempo real. 3.Ggastroenterite. 4. Assintomáticos. 5. Crianças. I. Souza, MeniraBorges Lima Dias e, orient. II. Título.
Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro da
Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno (a): Gabriela Rodrigues Barbosa
Orientador (a): Menira Borges Lima Dias e Souza
Membros:
1. Profª. Drª. Menira Borges Lima Dias e Souza
2. Profª. Drª. Fabíola Souza Fiaccadori
3. Profª. Drª. Carmen Baur
Data: 23/04/2019
AGRADECIMENTOS
Eu busco ser uma pessoa grata em todos os momentos da minha vida. Acredito
que nada acontece em vão e as pessoas não entram na vida das outras por acaso. Tudo
faz parte de um plano maior, com o objetivo de nos ensinar e transformar a cada etapa.
O arquiteto deste plano maior é Deus, a quem eu amo e agradeço pelo meu
respirar, todos os dias. Sem Ele, eu nada sou. Como Ele me ama demais, me deu um pai
e uma mãe que me apoiam incondicionalmente, mesmo que as minhas ideias não sejam
as melhores. Eles confiam em mim bem mais do que eu mesma. Deus me deu também
duas irmãs e um sobrinho, o Davi, que arranca de mim os melhores sorrisos. À essa
família incrível, meu muito obrigada!!
Eu não estaria defendendo minha dissertação se não fosse um conjunto de
pessoas, que foram responsáveis por me ensinar, incentivar, insistir e confiar em mim.
A principal delas, a minha professora e orientadora Dra Menira Souza. Eu apareci do
“nada” no laboratório e fui adotada. Eu quero dizer que você me inspira! Obrigada pela
oportunidade e pelo carinho. A sua dedicação ao que faz se reflete em mim.
Precisaria de muitas páginas para agradecer a Nathânia, que além de me ensinar
a “colocar a mão na massa”, tornou-se uma amiga. Muito obrigada por cada mania que
você colocou em mim, por me fazer pensar fora da caixa e por “cortar o nosso cordão
umbilical” de maneira muito oportuna.
Agradeço a Dra Fernanda Franco, por me socorrer sempre que precisei, mesmo
quando eu nem sabia muito bem o que eu estava perguntando. Quanta paciência! Muito
obrigada mesmo!! Aprendi muito com você!!
Às professoras Fabiola Fiaccadori e Marcelle Figueira por serem tão humanas e
tão atenciosas, sempre solícitas a sanar minhas dúvidas. Obrigada por contribuírem para
este trabalho.
Aos meus colegas e amigos que conheci no laboratório LABVICC e convivi ao
longo destes dois anos: Deborah, Pedro, Amanda, Brunno, Izabela, Juliana, Lucélia,
Thaís, Paulo, João Paulo, e Géssika. Muito obrigada por me aguentarem, pelas risadas e
por compartilharem momentos tão bons comigo.
Aos meus amigos pessoais Isaú Noronha por me fazer sentir a melhor pessoa do
mundo quando eu estou mal; Jônatas por se preocupar tanto comigo; Timothy Wagoner,
que mesmo de longe se faz presente; Verônica Zulian; por compartilhar insanidades,
Carlos Henrique por toda atenção e carinho e Henrique Ramos, por me trazer à
realidade e me ouvir incansavelmente. Muito obrigada a cada um de vocês.
Ao professor André Kipnis, do Laboratório de Bacteriologia Molecular, pela ajuda
no desenvolvimento deste trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro
(PPGBRPH) pela oportunidade.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
bolsa concedida.
À todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho: meu muito obrigada!
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ vi
LISTA DE QUADROS .............................................................................................. vi
LISTA DE TABELAS................................................................................................ vi
LISTA DE ANEXOS ................................................................................................. vi
LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ......................................... vii
RESUMO ................................................................................................................... ix
ABSTRACT ................................................................................................................ x
1. INTRODUÇÃO – REVISÃO DA LITERATURA ............................................. 1
1.1. BREVE HISTÓRICO .......................................................................................... 1
1.2. PROPRIEDADES GERAIS ................................................................................ 2
1.2.1. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS, GENÔMICAS E
PROTEICAS ........................................................................................................... 2
1.2.2. CLASSIFICAÇÃO .................................................................................... 4
1.3. ASPECTOS DO CICLO REPLICATIVO DOS ASTROVÍRUS ...................... 6
1.4. PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS ............................................. 8
1.5. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL ................................................................ 10
1.6. EPIDEMIOLOGIA............................................................................................ 11
1.7. TRATAMENTO, PREVENÇÃO E CONTROLE ........................................... 15
2. JUSTIFICATIVA .............................................................................................. 17
3. OBJETIVOS GERAIS....................................................................................... 18
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 18
4. METODOLOGIA .............................................................................................. 19
4.1. LOCAL DE ESTUDO ....................................................................................... 19
4.2. DELINEAMENTO E POPULAÇÃO DE ESTUDO ........................................ 19
4.3. COLETA E PREPARO DAS AMOSTRAS FECAIS ...................................... 20
4.4. DETECÇÃO E DETERMINAÇÃO DA CARGA VIRAL DE HASTV .......... 21
4.4.1. PLASMÍDEO PARA REALIZAÇÃO DO ENSAIO DE RT-qPCR
TAQMAN ............................................................................................................... 21
4.5. CURVA PADRÃO PARA O ENSAIO DE RT-qPCR PARA HASTV ............ 22
4.6. DETERMINAÇÃO DA CARGA VIRAL DE HASTV NAS AMOSTRAS
CLÍNICAS POR RT-qPCR ...................................................................................... 24
4.7. SEQUENCIAMENTO GENÔMICO E ANÁLISE FILOGENÉTICA DAS
AMOSTRAS POSITIVAS PARA HASTV .............................................................. 24
4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................ 25
5. RESULTADOS .................................................................................................. 26
6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 31
7. CONCLUSÃO .................................................................................................... 36
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 37
9. ANEXOS ............................................................................................................ 50
Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética ................................................................. 50
Anexo 2 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) ...................... 54
Anexo 3 – Ficha de Investigação Clínica .............................................................. 58
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: (A) Micrografia eletrônica da partícula de astrovírus (AstV). (B)
Representação esquemática da partícula viral ..................................................................3
Figura 2: Representação do genoma de HAstV.................................................................4
Figura 3 : Classificação proposta pelo Astrovírus Study Group. ..................................... 5
Figura 4 : Ciclo replicativo dos HAstV esquematizado. ................................................. 8
Figura 5 : Delineamento do estudo. .................................................................................20
Figura 6: Padronização da curva padrão para Taqman RT-qPCR ........................................23
Figura 7: Análise filogenética da sequência parcial do capsídeo de HAstV.........................28
Figura 8: Análise filogenética das linhagens de HAstV-1.....................................................29
Figura 9: Análise filogenética das linhagens de HAstV-4.....................................................30
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Estudos sobre a pesquisa de astrovírus humanos em diferentes países do
mundo............................................................................................................................. .14
Quadro 2: Iniciadores utilizados para a amplificação do inserto do plasmídeo tendo
como região alvo a RLA2....................................................................................................21
Quadro 3: Iniciadores utilizados para o protocolo de RT-qPCR.....................................23
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Características da população de estudo...........................................................26
Tabela 2: Análise univariada das características gerais das crianças em relação a
positividade global para astrovírus humanos...................................................................27
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1: Parecer do Comitê de Ética..............................................................................49
Anexo 2: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)...................................53
Anexo 3: Ficha de investigação clínica...........................................................................57
vii
LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
μL Microlitro
μM Micromolar
χ2 Qui-quadrado
AsT astrovírus
Ct Cycle Threshold
CaCo2 células de adenocarcinoma humano
CDC Centers for Disease Control and Prevention
cDNA complementary DNA
CG cópias genômicas
dNTP Desoxirribonucleotídeo Trifosfato
DO Densidade óptica
dTTP Desoxirribonucleotídeo Timina Trifosfato
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EIA Ensaio Imunoenzimático
FAM corante reporter 6-carboxifluoresceína
GEA gastroenterite aguda
HAstV astrovírus humanos clássicos
HEK Human Embryonic Kidney 293 cells
HIV vírus da imunodeficência humana
HMI Hospital Materno Infantil
HMO Human-mink-ovine
ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses
IEM imunomicroscopia eletrônica
IPTG Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosideo
IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
Kb Quilobases
KCl cloreto de potássio
kD Quilodaltons
LB Meio de cultura Luria Bertani
MLB Melbourne
ME Microscopia eletrônica
mg Miligramas
MgCl2 cloreto de magnésio
mL Mililitro
mM Milimolar
ng nanograma
nm Nanômetro
NoV norovírus
NS non-structural
Nt nucleotídeo
pb Pares de bases
PBS Tampão Fosfato Salino
PCR Polymerase chain reaction
R coeficiente de correlação
RdRp RNA-dependent RNA polymerase
RE Retículo endoplasmático
RLA região de leitura aberta
viii
RT-PCR reação em cadeia pela polimerase pós-transcrição reversa
RT-qPCR reação em cadeia pela polimerase pós-transcrição reversa em tempo real
sgRNA RNA subgenômico
TBE Tampão Tris/Borato/EDTA
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
UFG Universidade Federal de Goiás
UV Luz Ultravioleta
UTR Untranslated Region
VA Virginia
VLP virus - like particle
VPg viral protein genome-linked
ix
RESUMO
Os astrovírus humanos clássicos são classificados na família Astroviridae, gênero
Mamastrovirus, sendo ainda classificados em oito genótipos (HAstV 1-8). Estes vírus
são considerados importantes agentes da gastroenterite aguda (GEA) não bacteriana,
podendo infectar indivíduos de todas as faixas etárias, sendo predominante em crianças
de até cinco anos de idade. Os objetivos deste estudo foram avaliar a ocorrência e
estimar a carga viral de astrovírus humanos clássicos e realizar a caracterização
molecular das amostras positivas à partir de amostras de fezes, obtidas de crianças de
até seis anos com sintomas de gastrenterite aguda (vômito e/ou diarreia, com ou sem
dores abdominais, com ou sem febre). Para tal foi utilizada reação em cadeia pela
polimerase pós-transcrição reversa em tempo real (RT-qPCR), com curva padrão de
plasmídeo recombinante e sondas e iniciadores específicos para a região RLA2 do
genoma de HAstV, seguida de sequenciamento genômico e análise filogenética das
amostras positivas. Foram obtidas amostras fecais de 250 crianças atendidas em um
hospital de referência ao atendimento pediátrico em Goiânia, no período de maio de
2014 a abril de 2015. Foi observado um índice de positividade global de 3,2% (8/250)
para HAstV nas fezes, sendo que destas crianças positivas, 50% (4/8) apresentavam
sintomas de GEA. A carga viral variou de 2,8x 105 CG/mL a 1,6x1011 CG/mL, com
média de 2,39x1010. Foi realizada a caracterização molecular das amostras positivas, das
quais quatro foram sequenciadas, sendo classificadas duas HAstV-1, linhagem 1-a e
duas HAstV-4, linhagem 4-c. A maior detecção ocorreu no mês de maio (5/8), não
sendo observado padrão de circulação definido em relação às estações seca e chuvosa.
Os dados obtidos neste estudo vêm a contribuir para o melhor entendimento da
epidemiologia molecular destes agentes na população infantil da região.
Palavras-chave: Astrovírus humanos clássicos; RT-PCR em tempo real; gastroenterite;
crianças assintomáticas
x
ABSTRACT
Classical human astroviruses are classified into the family Astroviridae, genus
Mamastrovirus, and are further classified into eight serotypes / genotypes (HAstV 1-8).
These viruses are considered important agents of non-bacterial acute gastroenteritis
(GEA), and can infect individuals of all age groups, being predominant in children up to
five years of age. The objectives of this study were to evaluate the occurrence and
estimate the viral load of classical human astrovirus, and to perform molecular
characterization of positive samples from faecal samples obtained from children up to
six years of age with symptoms of acute gastroenteritis (vomiting and / or diarrhea, with
or without abdominal pain, with or without fever). For this real-time reverse
transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR)with standard recombinant plasmid
curve and specific probes and primers specific for RLA2 genomic region were used,
followed by genomic sequencing and phylogenetic analysis of the positive samples.
Fecal samples were obtained from 250 children attended at a referral hospital in Goiânia
from May 2014 to April 2015. A global positivity index of 3.2% (8/250) was observed
for HAstV in the feces, and of these positive children, 50% (4/8) presented symptoms of
GEA. The viral load ranged from 2.8x105 CG / mL to 1.6x1011 CG / mL, with an
average of 2.39x1010. The molecular characterization of the positive samples was
performed, of which four were sequenced, two as HAstV-1, 1-a lineage and two as
HAstV-4, 4-c lineage. The highest detection occurred in the month of May (5/8), and no
defined circulation pattern was observed in relation to dry and rainy seasons. The data
obtained in this study contributes to a better understanding of the molecular
epidemiology of these agents in the children of the region.
Keywords: Classical human astroviruses; Real time PCR; gastroenteritis; asymptomatic
children
1
1. INTRODUÇÃO – REVISÃO DA LITERATURA
1.1. BREVE HISTÓRICO
Em 1975, Appleton e Higgins reportaram a presença de partículas virais, pequenas e
esféricas de 28 a 30 nm de diâmetro, visualizadas por microscopia eletrônica (ME) a partir de
amostras fecais de crianças acometidas por um surto de gastroenterite aguda (GEA) em uma
maternidade no sul da Inglaterra (Appleton & Higgins 1975). Madeley e Cosgrove, no mesmo
ano, analisaram, por ME amostras de fezes de crianças com quadro de GEA admitidas em um
hospital em Glaslow, na Escócia, e visualizaram partículas virais semelhantes às descritas por
Appleton e Higgins. As partículas, que tinham cinco ou seis projeções em suas extremidades,
semelhantes a uma estrela, foram então denominadas de Astrovírus (astron, estrela em Grego)
(Madeley & Cosgrove 1975).
Lee e Kurtz, em 1981, realizaram o cultivo e isolamento de astrovírus (AstV) em
células de rim de embrião humano (HEK) na presença de tripsina, a partir de amostras fecais
obtidas de um voluntário previamente infectado (Lee & Kurtz 1981). Em 1984, utilizando
técnicas de imunofluorescência direta e microscopia eletrônica, foram identificados cinco
sorotipos de astrovírus humanos (HAstV1-5) (Lee & Kurtz 1984). Estes estudos contribuíram
também para o desenvolvimento de um ensaio imunoenzimático para detecção de antígeno
viral, permitindo o diagnóstico laboratorial de HAstV e confirmando sua importância médica
(Herrmann et al. 1990).
Outros dois sorotipos de astrovírus (HAstV 6 e 7) foram identificados na região de
Oxford, na Inglaterra, em fezes de crianças que apresentavam diarreia, nos anos de 1989 e
1991, respectivamente (Lee & Kurtz 1994). A partir do desenvolvimento das técnicas
moleculares, algumas amostras de astrovírus conhecidamente positivas foram cultivadas em
células CaCO2 (células de adenocarcinoma humano), submetidas à reação em cadeia da
polimerase pós transcrição reversa (RT-PCR) e posteriormente à análise filogenética, o que
resultou na identificação de um novo sorotipo (HAstV-8) (Belliot et al. 1997).
Até o ano de 2008, acreditava-se que as infecções por astrovírus humanos (HAstV)
eram decorrentes de infecções por apenas oito sorotipos/genótipos já identificados, os quais
são conhecidos como astrovírus humanos clássicos (Finkbeiner et al. 2008a). Por meio de
análise metagenômica, foram identificados dois novos grupos de astrovírus capazes de
infectar várias espécies de animais, inclusive humanos, sendo estes denominados astrovírus
não clássicos. O primeiro astrovírus não clássico foi isolado a partir de uma amostra de fezes
2
de uma criança que apresentava diarreia, em Melbourne, na Austrália, sendo denominado
HAstV-MLB 1. Outras duas estirpes de MLB (HAstV-MLB-2 e MLB-3) foram identificadas
em fezes de crianças na Índia (Finkbeiner et al. 2008b).
Em 2009, um segundo grupo de astrovírus não clássicos foi descrito em amostras de
crianças com diarreia em Virginia (VA), sendo assim denominados HAstV-VA (Finkbeiner et
al. 2009c). Outras estirpes de HAstV-VA ou HMO como também são chamados (HMO do
inglês, human mink ovine-like ) foram identificadas e compreendem VA-1/HMO-C, VA-
2/HMO-A VA-3/HMO-B descritas na Nigéria, Paquistão, Índia, Estados Unidos, China e
Egito (Kapoor et al. 2009). Em 2013, o AstV-V4 foi descrito no Nepal a partir de duas
amostras de fezes de crianças com diarreia (Jiang et al. 2013) e em 2015, na Gambia, o AstV-
V5 foi estabelecido como variante de astrovírus não clássicos (Meyer et al. 2015).
1.2. PROPRIEDADES GERAIS
1.2.1. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS, GENÔMICAS E
PROTEICAS
Os AstV são vírus esféricos, não envelopados e diâmetro de 28 a 30 nm. A partícula
viral é constituída por um capsídeo icosaédrico que apresenta de cinco a seis pontas que se
assemelham a uma estrela (Figura 1) (Madeley & Cosgrove 1975), composto por proteínas
estruturais que variam de 70 a 90 kd (Arias & Dubois 2017).
O genoma viral é composto por uma fita simples de RNA (fsRNA) de polaridade
positiva, com extensão de aproximadamente 7000 nucleotídeos, excluindo a cauda
poliadenilada na extremidade 3’. O genoma viral é constituído por duas regiões não
traduzidas (UTR, do inglês Untranslated Region), nas extremidades 5’ e 3’, flanqueando três
regiões de leitura aberta (RLA) que apresentam comprimentos diferentes, dependendo da
variante de AstV isolada ( Figura 2) (Willcocks 1993).
3
As RLAs1a e 1b estão localizadas na extremidade 5’ e codificam proteínas não
estruturais (nsPs, do inglês Nonstructural Proteins). A RLA1a codifica nsP1a, que é
processada a serina protease e proteína ligada ao genoma (VPg), enquanto RLA1b, codifica
nsP1ab uma RNA-polimerase RNA-dependente (RdRp), as quais estão relacionadas com a
transcrição e a replicação viral (Lewis et al. 1994; Guix et al. 2005).
Comparando o genoma dos astrovírus com outros vírus RNA de polaridade positiva,
por meio de análise filogenética, identificou-se a presença de uma região codificante para a
proteína ligada ao genoma (VPg, do inglês Virus-protein genome linked). Apesar da síntese de
VPgs em AstV não serem totalmente elucidadas, a remoção da VPg por tratamento
proteolítico do RNA viral inibe a infecciosidade do vírus, sugerindo que a VPg atue no
recrutamento de fatores iniciadores de tradução, como nos calicivírus (Fuentes et al. 2012).
A maior variabilidade do genoma dos astrovírus é encontrada na RLA2, a qual
codifica poliproteínas estruturais, que são expressas a partir de um RNA subgenômico
(RNAsg). A RLA2 está localizada na extremidade 3’ e codifica a proteína precursora do
capsídeo VP90, que possui um domínio N-terminal altamente conservado e um domínio C-
terminal hipervariável (Toh et al. 2016).
A VP90 sofre clivagem por caspases, gerando a proteína VP70, essencial para a
liberação das partículas virais das células. Na presença de tripsina, VP70 produz três produtos
finais: VP34, que forma o core do capsídeo e contém o domínio conservado; VP25 e VP27,
que contêm o domínio variável, os quais formam a partícula viral infecciosa, mediam a
A
B
Figura 1 (A) Micrografia eletrônica da partícula de astrovírus (AstV) (Guimarães
2007). (B) Representação esquemática da partícula viral (Dryden et al. 2012), com
adaptações.
4
ligação do vírus com os receptores da superfície celular e possuem epítopos que são
reconhecidos por anticorpos neutralizantes (Bass & Qiu 2000; Wang et al. 2001). Estudos
realizados com anticorpos monoclonais concluíram que anticorpos reconhecem as proteínas
VP25 e VP27, neutralizando a infectividade das partículas virais, provavelmente bloqueando
a ligação destas com as células do hospedeiro (Bass & Upadhyayula 1997; Arias & Dubois
2017).
1.2.2. CLASSIFICAÇÃO
A família Astroviridae, que hoje pertence ao recém-criado reino Riboviria, foi
estabelecida pelo ICTV (do inglês, International Committee for Taxonomy of Viruses ),
composta apenas pelo gênero Astrovirus, com base na morfologia do vírus e na espécie do
hospedeiro infectado (ICTV 2018; Murphy et al. 1995). Sendo assim, dois gêneros
Mamastrovirus (MAstV) e Avastrovirus (AAstV) foram estabelecidos, de acordo com a
espécie do hospedeiro infectado, sendo estas mamíferos e aves, respectivamente (Griffin et al.
2004). A classificação atual do ICTV reconhece 19 espécies de MastV e 3 espécies de AastV.
Os astrovírus clássicos (1-8) pertencem a Mamastrovirus 1 e compartilham de 63% a 84% de
similaridade na sequência de aminoácidos de RLA 2 (Vu et al. 2017).
Figura 2 Representação do genoma de HAstV (Mendez & Arias 2013), com
modificações.
5
Apesar de terem sido isolados primeiramente em amostras fecais de humanos, os AstV
têm sido identificados em fezes de uma grande variedade de outros mamíferos como gatos
(feline astrovírus - FeAstV) (Hoshino et al. 1981), cães ( canine astrovírus - CaAstV) (Castro
et al. 2013), porcos (porcine astrovírus - PAstV) (Bridjer 1980), ovelhas ( ovine astrovírus -
OAstV) (Jonassen et al. 2003), morcegos (bat astrovírus - BAstV) (Chu et al. 2008), animais
aquáticos, (Chu et al. 2012) e aves (Donato & Vijaykrishna 2017).
Com a caracterização molecular de sequências de nucleotídeos, notou-se que alguns
AstV que infectavam diferentes espécies de animais apresentavam maior semelhança genética
entre si do que isolados de uma mesma espécie. Os astrovírus não-clássicos (MLB e VA), por
exemplo, são geneticamente muito divergentes dos astrovírus clássicos e suas estirpes são
mais próximas às de outros animais como ovelhas e visons do que de humanos (Kapoor et al.
2009).
Sendo assim, os AstV foram ainda classificados em genogrupo I e o genogrupo II.
Cada genogrupo inclui os astrovírus que infectam diferentes espécies hospedeiras, e pode ser
subdividido de acordo com a sequência genômica e análise filogenética da região completa do
capsídeo (ICTV 2018). Os HAstV clássicos (genótipo 1-8), por exemplo, pertencem ao
genogrupo I, enquanto os não-clássicos pertecem ao genogrupo II (Figura 3) (Schultz-Cherry
2013).
Figura 3: Classificação proposta pelo Astrovírus Study Group, 9th Report ICTV,
2012. Fonte: https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_9th_report, com adaptações.
6
Dentro da classificação em genótipo, a caraterização molecular permite ainda a divisão
em diferentes linhagens, a partir de 93% a 95% de identidade nucleotídica da RLA2. Sendo
assim, HAstV-1, possui seis linhagens (1a a 1f), HAstV-2 (2a a 2d), HAstV-3 (3a e 3b),
HAstV-4 (4a a 4c), HAstV-5 (5a a 5c), e HAstV-6 (6a e 6b) (Donato & Vijaykrishna 2017;
Vu et al. 2017).
1.3. ASPECTOS DO CICLO REPLICATIVO DOS ASTROVÍRUS
As interações iniciais do HAstV e o seu receptor putativo nas células do hospedeiro
não são totalmente estabelecidas (Arias & Dubois 2017). Acredita-se que pela suscetibilidade
a diferentes linhagens celulares dependendo do genótipo, os HAstV tenham mais de um
receptor, podendo estes serem comuns a todos os HAstV (Schultz-Cherry 2013).
Pouco se sabe sobre o mecanismo utilizado pelos HAstV para entrar na célula do
hospedeiro. Estudos realizados com linhagem celular permissiva aos HAstV, de células de
adenocarcinoma de cólon humano (CaCo-2), confirmaram observações feitas anteriormente
com células HEK, que indicavam que HAstV utilizam de uma cascata de sinalização que
desencadeia a endocitose mediada pela clatrina como mecanismo de entrada nas células. O
mesmo estudo concluiu que drogas que inibem a endocitose mediada pela clatrina podem
diminuir a infectividade do HAstV. Além disso, a liberação do vírus no interior da célula
depende da acidificação dos endossomos, para que assim, ocorra a permeabilização da
membrana e o conseguinte desnudamento, o qual se estima que ocorra em aproximadamente
130 minutos após a adsorção das partículas virais às células alvo (Mendez et al. 2014).
Foi demonstrado um aumento da permeabilidade da membrana de células CaCo-2 em
culturas monocamada quando tratadas com partículas virais infectantes e também com o vírus
inativado ou partículas virus-like purificadas (VLPs), indicando que a indução da
permeabilidade por AstVs depende apenas da ligação de partículas virais às células (Moser et
al. 2007).
A interação dos astrovírus com as células do hospedeiro resulta na ativação da cascata
de sinalização de ERK1/2 (do inglês, extracellular signal-regulated kinase), que é necessária
para que a infecção seja estabelecida. Apesar de o mecanismo de ativação da sinalização não
ser elucidado, a inibição de ERK1/2 bloqueia a síntese de proteínas virais e do RNA viral
(Moser & Schultz-Cherry 2008).
A proteína VPg tem papel importante na infectividade dos AstV após o desnudamento.
A remoção da VPg após tratamento proteolítico do RNA viral interrompe o ciclo replicativo
7
do vírus, indicando que esta proteína atua no recrutamento celular de fatores iniciais na
tradução, semelhante ao que acontece com os calicivírus (Fuentes et al. 2012). Duas proteínas
não estruturais são traduzidas a partir do RNA genômico ligado à VPg: nsP1a e nsP1ab,
posteriormente clivadas por serinas proteases virais e celulares, produzindo assim, proteínas
não estruturais individuais, dentre elas proteases e a RNA polimerase viral. A tradução da
RdRp ocorre por meio de um mecanismo de frameshifting ribossomal na região de
sobreposição das RLAs1a e 1b (Bosch et al. 2014).
A síntese do RNA dos astrovírus não é amplamente esclarecida. A partir da estrutura e
da organização do genoma, pode-se inferir que estes utilizam estratégias similares às dos
alphavirus para replicar e transcrever o seu genoma (Fuentes et al. 2011). Sendo assim,
acredita-se que um RNAg seja utilizado como molde para a produção de um RNA de
comprimento completo (full-lenght) de polaridade negativa e que este sirva de molde para a
síntese de ambos RNA genômico e outro subgenômico de polaridade positiva (Kiang &
Matsui 2002; Murillo et al. 2015).
As proteínas estruturais dos HAstV, codificadas pela RLA2, são sintetizadas a partir
do RNA subgenômico como um precursor da poliproteína VP90, por um mecanismo que
provavelmente envolve a extremidade 5’ de VPg (Arias & Dubois 2017). O modelo aceito
atualmente para explicar a morfogênese dos HAstV sugere que a VP90 atue na montagem de
vírions imaturos associados a membranas intracelulares e que várias caspases clivem a VP90
assim que elas são dissociadas das membranas, resultando no capsídeo viral, composto pela
VP70 (Dryden et al. 2012; Bosch et al. 2014). Várias caspases são ativadas em células
infectadas por HAstV, mas ainda não é totalmente elucidado quais delas participam da
clivagem de VP90. Um estudo com células CaCo2 infectadas por HAstV demonstrou que as
Casp 3, Casp 4 e Casp 9 estão envolvidas na clivagem de VP90 em células infectadas
(Banos-Lara & Méndez 2010; Schultz-Cherry 2013). O processamento de VP90 em VP70 é
necessário para que o vírus saia da célula e a liberação de partículas de VP70 ocorre sem que
haja lise celular (Banos-Lara & Méndez 2010; Bosch et al. 2014).
As partículas virais contendo VP70 sofrem então ação da tripsina, presente no lúmen
intestinal (Méndez et al. 2004; Schultz-Cherry 2013). A infectividade por HAstV é aumentada
pela tripsina durante a infecção in vitro. Na presença de tripsina, ocorre a clivagem da
proteína VP70 do capsídeo em três produtos finais VP34, VP 25, VP27, bem como mudanças
conformacionais na estrutura da partícula viral (Figura 4). Apesar de estabelecidos os
produtos desta clivagem, o mecanismo pelo qual ela aumenta a infectividade dos HAstV
ainda é desconhecido (Bass & Qiu 2000; Arias & Dubois 2017).
8
1.4. PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
Os astrovírus clássicos são importantes agentes etiológicos de GEA não bacteriana em
crianças em todo o mundo, sendo mais frequente em crianças de até dois anos de idade, com
casos reportados também entre idosos, imunocomprometidos e adultos saudáveis (Bosch et al.
2014).
Os HAstV são transmitidos principalmente pela via fecal-oral pelo consumo de água
ou alimentos contaminados, contato com fômites e ainda por contato pessoa-pessoa, muitas
vezes relacionadas a surtos de HAstV em locais semi fechados e com aglomeração de pessoas
como creches, hospitais, enfermarias, escolas, dependências militares, navios (Vu et al. 2017).
Figura 4: Ciclo replicativo dos HAstV esquematizado. Após ligação com os receptores
celulares, forma-se endossoma dependente da via da clatrina. Duas proteínas não
estruturais (nsP1a e nsP1ab) são traduzidas a partir de VPg. RNA subgenômicos são
produzidos e usados para a expressão da proteína do capsídeo (VP90), que sofre ação das
caspases e resulta em VP70, ainda uma partícula imatura. A liberação de VP70 ocorre
sem lise celular, (Mendez & Arias 2013) com adaptações.
9
Nos casos sintomáticos, o principal sintoma é diarreia aquosa, normalmente com
duração de dois a três dias, seguida de vômito, que podem ser acompanhadas ou não de febre,
anorexia e dor abdominal (Mendez & Arias 2013). No entanto, muitos casos de infecção por
HAstV em crianças e adultos saudáveis tendem a ser assintomáticos. A excreção de HAstV
por indivíduos assintomáticos, amplia a sua transmissibilidade (Maldonado et al. 1998; Vu et
al. 2017).
Estudos realizados com adultos voluntários e surtos de GEA em hospitais infantis
estimam que o período de incubação seja de três a quatro dias, em média, e que o maior
número de partículas virais seja excretado no sexto dia após a infecção, sendo proporcional à
duração da doença. Um período menor de incubação, de 24 a 36 horas, foi relatado durante
um surto de GEA em uma escola infantil no Japão (Konno et al. 1982; Lee et al. 2013).
Dados sobre a associação entre genótipos de HAstV e carga viral, bem como a
severidade da doença, são escassos. Em um estudo onde a carga viral dos genótipos 1, 2, 3 e 4
e 8 foi avaliada, a excreção variou de 3,4 x 108 a 1,0 x 1013 por grama de fezes, sendo que o
genótipo 3 apresentou os maiores títulos virais, bem como levou à diarreia crônica (Caballero
et al. 2003).
Os casos de coinfecção de HAstV com rotavírus e calicivírus dificultam a avaliação
dos sintomas clínicos. De modo geral, a diarreia causada por HAstV é mais branda do que a
causada por norovírus, e, normalmente, evolui para cura espontânea (Lee et al. 2013). Os
vômitos também se mostram menos frequentes em infecções por astrovírus do que as que os
rotavírus e calicivírus estão envolvidos (Vu et al. 2017).
Apesar dos HAstV serem conhecidos como um dos principais agentes causadores de
GEA em crianças, o conhecimento sobre a patogênese é limitado, principalmente pela
ausência de um modelo animal para estudo ideal (Bosch et al. 2014).Existe apenas um caso
reportado na literatura descrevendo aspectos histopatológicos do intestino delgado a partir de
biópsias obtidas de uma criança que apresentava diarreia persistente por HAstV após
transplante de medula óssea. Este caso demonstrou que a infecção por astrovírus se manteve
limitada ao intestino delgado. Os principais achados desse caso foram mudança
conformacional das vilosidades, superfície irregular das células epiteliais e aumento na
densidade celular por inflamação da lâmina própria (Sebire et al. 2004; Schultz-Cherry 2013).
O mecanismo pelo qual os HAstV causam a diarreia não é totalmente elucidado.
Acredita-se que o aumento na permeabilidade da barreira intestinal resulte no aumento da
secreção de fluidos no lúmen intestinal, provavelmente pela interação de proteínas do
capsídeo e a superfície das células do hospedeiro. Aparentemente, este processo ocorre
10
independente da replicação, sugerindo que as proteínas do capsídeo atuem como enterotoxina
(Moser et al. 2007). A perda de fluidos e eletrólitos que acompanha as infecções ocorre
provavelmente como resultado da inibição da função usual de absorção do intestino e ativação
de processos secretórios (Bosch et al. 2014).
1.5. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
O diagnóstico laboratorial da infecção por astrovírus pode ser feito a partir da detecção
de partículas ou do genoma viral em amostras clínicas, como fezes e swabs retais (Bosch et al.
2014). Os primeiros estudos envolvendo astrovírus utilizavam como método de detecção a
microscopia eletrônica (Apleton & Higgins 1975) e a imunoeletromicroscopia eletrônica
(IEM) que utiliza soros hiperimunes ou anticorpos específicos, facilitando a identificação do
vírus em casos de baixa carga viral, pois aumenta a sensibilidade do teste (Noel & Cubitt
1994; Murillo et al. 2015).
Os ensaios imunoenzimáticos (EIA) foram posteriormente desenvolvidos para a
detecção e também tipagem dos HAstV. Em 1990, foi desenvolvido um EIA com anticorpos
monoclonais, específicos para o domínio conservado da proteína do capsídeo dos HAstV 1-8
(resíduos de aminoácidos de 71 a 260) que capturam o antígeno viral e antissoro policlonal
para detecção do anticorpo. Essa metodologia, comparada às anteriores (EM e IEM)
apresentou maior sensibillidade e especificidade (Herrmann et al. 1990; Mendez & Arias
2013)
O desenvolvimento de técnicas de diagnóstico molecular possibilitou a prática de
ensaios com sensibilidade e especificidade muito superior para amostras de fezes. Ao passo
que informações sobre as sequências genômicas do HAstV tornavam-se disponíveis, mais
técnicas de detecção molecular utilizando iniciadores e sondas foram desenvolvidas (Pérot et
al. 2017).
A escolha da RT-PCR confere uma maior especificidade na detecção dos AstV pois
utiliza pares de iniciadores específicos para determinadas regiões alvo do genoma viral e
permite adequação nas condições enzimáticas e de temperatura dos ensaios (Schultz-Cherry
2013). Um estudo foi realizado com amostras testadas em paralelo comparando a
sensibilidade das técnicas de EIA e RT-PCR, reportando maior positividade dos testes
realizados por RT-PCR (Mitchell et al. 1995).
A RT-PCR convencional ainda é amplamente utilizada em laboratórios de pesquisa
para detecção e sequenciamento genômico viral (Pérot et al. 2017). Encontram-se descritos
11
diferentes iniciadores utilizados para a detecção dos oito genótipo/genótipos dos HAstV. Os
pares de iniciadores Mon244 / Mon 245 e Mon269 / Mon270 são os mais utilizados e têm
como alvo a região conservada da RLA2 na extremidade 5’ (Noel et al. 1995). Iniciadores
específicos para detectarem HAstV-MLB e HAstV-VA/HMO também já foram descritos
(Finkbeiner et al. 2009a, 2009b) .
O aprimoramento da PCR com técnicas de quantificação em tempo real (RT-qPCR)
permite resultados mais rápidos, com maior sensibilidade, reprodutibilidade e redução do
risco de contaminação no diagnóstico dos HAstV (Le Cann et al. 2004). O uso de RT-qPCR é
uma alternativa que pode ser utilizada na opção multiplex, permitindo a detecção simultânea
dos HAstV e outros vírus como norovírus, sapovírus, rotavírus, adenovírus e/ou bocavírus
(van Maarseveen et al. 2010; Liu et al. 2012). A opção multiplex permite ainda a detecção de
alvos não virais, como bactérias, protozoários e helmintos, uma vez que estes também podem
ser agentes etiológicos de GEA (Liu et al. 2013).
Análises metagenômicas têm revelado a existência de novos astrovírus em amostras de
pacientes com doenças que não haviam sido previamente associadas com estes vírus. Com
isso, é possível identificar astrovírus emergentes, bem como outros patógenos (Quan et al.
2010).
Ainda que os HAstV sejam fastidiosos para replicação in vitro e que os HAstV não
clássicos nunca tenham sido propagados em linhagem celulares, a combinação de técnicas
moleculares com ensaios de infectividade podem contribuir em termos de saúde pública
tratando-se de amostras do meio ambiente e alimentos. O uso de células CaCo-2 com pré
tratamento do inóculo viral com tripsina ainda é o padrão ouro para a identificação dos
HAstV, seja em amostras clínicas ou ambientais (Willcocks et al. 1994; Brinker et al. 2000).
1.6. EPIDEMIOLOGIA
Desde que foram reportados pela primeira vez em 1975 em amostras fecais de
crianças, os astrovírus humanos têm sido reconhecidos como um dos principais agentes
etiológicos de gastroenterite viral pediátrica com distribuição mundial (Jeong & Jeong 2012;
Vu et al. 2017). Os HAstV acometem principalmente a população pediátrica, apesar de casos
em idosos, imunocomprometidos e adultos saudáveis também serem reportados (Bosch et al.
2014). As crianças com até cinco anos, mais frequentemente as com até dois anos, são as mais
atingidas (Medina et al. 2000; Guix et al. 2002; Siqueira et al. 2017a).
12
Diversos surtos de GEA por HAstV, afetando principalmente crianças, têm sido
relatados em diferentes partes do mundo e com menor frequência, surtos afetando adultos e
idosos também são descritos. A decorrência dos surtos está relacionada principalmente a
aglomerações e locais fechados, visto que tais fatores podem contribuir para disseminação do
vírus (Vu et al. 2017). Os HAstV estão associados como a causa de 2% a 9% dos casos de
diarreia não-bacteriana em crianças em todo o mundo (De Benedictis et al. 2011), podendo
apresentar índices mais altos, dependendo da região, sendo 61% o maior índice de detecção
reportado na literatura (Maldonado et al. 1998). Os HAstV são distribuídos por todo o mundo,
com a maior incidência observada nos países em desenvolvimento (Bosch et al. 2014).
No Brasil, os índice de positividade para HAstV variam em média de 3% a 5% em
crianças com ou sem sintomas gastroentéricos (Xavier et al. 2015). Índice de positividade
mais elevado (28,2%) já foi reportado Brasil (Resque et al. 2007). Em um estudo
observacional realizado com amostras fecais de crianças menores de cinco anos de diferentes
regiões brasileiras, no período, foi observado índices de positividade média de 7,1%, com
variações entre as regiões: 3,9% no Nordeste, 7,9% na região Sul e 9,2% no Sudeste (Xavier
et al. 2015). Em um estudo epidemiológico realizado utilizando amostras fecais de crianças
apresentando diarreia em cidades da região norte do Brasil, obteve positividade média para
HAstV de 3,9%, sendo o maior índice de positividade (5,7%) detectado entre crianças de 6 a
12 meses de idade (Siqueira et al. 2017a).
Com relação à epidemiologia molecular dos HAstV, todos os oito genótipos (HAstV
1-8) foram descritos em diferentes estudos realizados em diversas partes do mundo (Palombo
& Bishop 1996; Naficy et al. 2000; Guix et al. 2002; Xavier et al. 2015). De modo geral,
HAstV-1 é o genótipo mais detectado mundialmente (Jeong & Jeong 2012; Vu et al. 2017),
mas há exceções, como em um estudo realizado no México, onde o HAstV-2 foi reportado
como o mais frequente (Guerrero et al. 1998).
A frequência dos genótipos varia bastante na população, principalmente pela
existência de oscilação temporal de circulação e variações geográficas. Acredita-se que o
espaço geográfico e fatores climáticos sejam fatores contribuintes para que as infecções por
HAstV ocorram. No entanto, o padrão de sazonalidade das infecções por HAstV ainda não
está totalmente elucidado (Jeong & Jeong 2012). Estudos relatam que as infecções ocorram
principalmente durante o inverno em regiões que apresentam clima temperado e em períodos
chuvosos em climas tropicais (Walter & Mitchell 2003).
Outro fator importante seria a ausência de uma imunidade heteróloga de longa
duração, uma vez que crianças de um mesmo local podem sofrer infecções subsequentes por
13
outros genótipos. Em um estudo foi observado que as infecções por HAstV-1 e 3 eram mais
frequentes em crianças com menos de dois anos, enquanto as infecções por HAstV-4 foram
observadas em crianças maiores de quatro anos, reforçando a ausência de proteção cruzada
entre os genótipos (Guix et al. 2002). Estudos realizados no Brasil, demonstraram um padrão
similar de circulação em relação ao restante do mundo, sendo o HAstV-1 o genótipo
predominante e em, menor frequência, HAstV-2 a HAstV-5 e HAstV-8 (Xavier et al. 2015).
Estudo realizado com amostras fecais de crianças selecionadas de três localidades
diferentes da região Centro-Oeste do Brasil (Goiânia, Distrito Federal e Campo Grande),
foram testadas para HAstV por RT-PCR. As amostras positivas foram genotipadas, sendo
então detectados todos os oito genótipos de HAstV. Este estudo demonstrou HAstV-1 como o
mais prevalente na região, presente em 42.8% de todas as amostras positivas (Silva et al.
2009). Em Goiânia, estudo realizado com crianças apresentando sintomas gastroentéricos
também reportou o genótipo HAstV-1 como o mais frequente (Cardoso et al, 2002).
No quadro 1, estão apresentadas algumas características de estudos realizados em
população pediátrica apresentando sintomas de GEA, em diversas partes do mundo. Nota-se
uma variabilidade na escolha dos iniciadores utilizados, número amostral, frequência e
genótipos encontrados, possivelmente decorrente do tipo de delineamento do estudo,
localização geográfica e período de tempo, ressaltando que tais variáveis podem interferir
com os índices de positividade encontrados.
14
Quadro 1: Estudos sobre a pesquisa de astrovírus humanos em diferentes países do mundo
Autor, ano País N°
amostral
Faixa
etária
Amostra
clínica
Metodologia Iniciadores
Utilizados
Índice
Global de
detecção
Genótipos
encontrados
(Dai et al.
2010)
China 526 15 dias
a 72
anos
Fezes RT-qPCR e
Nested PCR
MON244/245 e
MON269/270
8,75% HAstV-1 e HAstV-
3
(Malasao et
al, 2012)
Tailândia 1022 até 5
anos
Fezes RT-PCR PreCAP1/82b 1,4% HAstV-1 ; HAstV-2
; HAstV-3 e
HAstV-5;
(Wang et al.
2013)
China 723 até 5
anos
Fezes RT-PCR MON269/270 e
SF0073/SF0076
4,4% HAstV-1; HAstV
MLB1 e 2;
HMOAstV-A
(Yoneda et al.
2017)
Japão 948 até 15
anos
Fezes RT-PCR AC230/AC1 4,2% HAstV-1, HAstV-4,
HAstV-6 e HAstV-
8
(Ouédraogo et
al. 2016)
Burkina
Faso
263 até 5
anos
Fezes RT-qPCR AV1TRa/
AV2TRa
4,9% HAstV-1, HAstV-2,
HAstV-5 e HAstV-
8
(Guix et al.
2002)
Espanha 2347 até 15
anos
Fezes RT-PCR A1/A2 4,9% HAstV-1, HAstV-2,
HAstV-3 , HAstV-4
e HAstV-8
(Espul et al.
2004)
Argentina 1070 até 3
anos
Fezes RT-PCR e EIA MON269/270 3,7% HAstV1-5
(Palombo &
Bishop 1996)
Austrália 378 até 5
anos
Fezes RT-PCR MON269.270 4,2% HAstV-1 e HAstV-
4
(Schulz et al.
2000)
Alemanha 235 até 6
anos
Fezes RT-PCR MON340/248 1,5% HAstV-1 e HAstV-
5
15
1.7. TRATAMENTO, PREVENÇÃO E CONTROLE
A gastroenterite associada aos HAstV é geralmente branda e autolimitada. Alguns
casos podem resultar em desidratação, tanto em crianças quanto em adultos, e a administração
oral ou intravenosa de fluidos pode ser necessária (Mendez & Arias 2013).
A prevenção da infecção de HAstV depende principalmente do controle da
transmissão do vírus por meio de ações de saneamento básico, higiene pessoal,
principalmente em locais onde há aglomeração de pessoas como hospitais, creches, escolas,
asilos, além do monitoramento de indivíduos que manipulam alimentos, uma vez que os
HAstV podem ser excretados pelas fezes antes do surgimento de sintomas (Matsui et al.
2001; Walter & Mitchell 2003).
A desinfecção de fômites potencialmente contaminados também é altamente
recomendada. A utilização de álcool provou ser útil para desinfecção de fômites e das mãos
Ações efetivas de isolamento de crianças que apresentem quadros diarreicos, assim como de
pacientes imunocomprometidos, também são de extrema importância para a prevenção de
infecções nosocomiais (Vu et al. 2017).
Embora existam vários métodos para a detecção e quantificação de HAstV, não existe
uma rotina de rastreamento de HAstV em água e alimentos. Os HAstV clássicos parecem ter
uma sobrevida prolongada em água potável e acredita-se que a desinfecção com 1 mg / mL de
cloro por média de duas horas seja necessária para uma inativação bem sucedida (Abad et al.
1997). A persistência ambiental difere entre as variantes, os genótipos 6 e 7, por exemplo, têm
maior resistência à desinfecção com cloro do que os genótipos 1 a 5 e 8 (Vu et al. 2017).
Alguns casos podem resultar em desidratação, tanto em crianças quanto em adultos, e
a administração oral ou intravenosa de fluidos pode tornar-se necessária (Mendez & Arias
2013). O tratamento intravenoso com imunoglobulina para pacientes imunocomprometidos
com diarreia persistente foi proposto, mas a eficácia deste ainda não foi estabelecida (Bosch et
al. 2014).
O uso de flavonoides e sua atividade antiviral in vitro foi descrita, porém o mecanismo
pelo qual esses compostos atuam para impedir a replicação dos AstV ainda não foi totalmente
elucidado (Superti et al. 1990; Vu et al. 2017). Alguns autores relatam que o uso de
probióticos pode interferir no ciclo replicativo de vírus gastroentéricos, podendo ser usados
como medida de prevenção e/ou tratamento das infecções intestinais (Mendez & Arias 2013;
Bosch et al. 2014). Até o momento, nenhuma vacina foi desenvolvida para a prevenção da
16
infecção por HAstV, seja pela falta de interesse comercial ou pela dificuldade de produção de
uma vacina que seja eficiente para todos os genótipos de HAstV (Bogdanoff et al. 2018).
17
2. JUSTIFICATIVA
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, a gastroenterite aguda (GEA) é a
segunda causa mais comum de morte entre crianças menores de cinco anos de idade,
resultando em aproximadamente 520.000 mortes anuais. Estima-se que anualmente ocorra 1,7
bilhão de casos relacionados com GEA em crianças com até cinco anos, sendo que a maioria
destes casos ocorre em países em desenvolvimento (WHO 2018).
Dentre os principais agentes etiológicos virais da GEA destacam-se os calicivírus,
rotavírus, astrovírus e adenovírus (Ouyang et al. 2012). As infecções por HAstV acometem
pessoas em todas as idades, mas estão predominantemente relacionadas a surtos de GEA em
crianças de até cinco anos e, principalmente, menores de dois anos (Vu et al. 2017).
A positividade para HAstV em amostras de fezes em indivíduos assintomáticos já foi
reportada (Meyer et al. 2015; Ouédraogo et al. 2016). No entanto, a maioria dos estudos que
detectam HAstV utilizam amostras provenientes de pacientes apresentando diarreia
(Maldonado et al. 1998; Zhang et al. 2006; Osborne et al. 2015). Sendo assim, poucos estudos
avaliam os índices de positividade para HAstV entre grupos com e sem sintomas de GEA em
uma mesma população de estudo, mais raros ainda são os estudos que têm utilizado técnicas
mais sensíveis como RT-PCR em tempo real, tanto para a pesquisa quanto determinação da
carga viral nas amostras fecais.
O Laboratório de Virologia Humana e Cultura Celular (LABIVICC) do IPTSP realiza
o monitoramento de vírus entéricos desde a década de 1980. A avaliação mais recente sobre a
ocorrência de HAstV realizados em amostras coletadas de crianças em Goiânia ocorreu em
2009 (Silva et al. 2009). Deste modo, é importante se avaliar possíveis mudanças no perfil de
circulação desses agentes. Deve-se ressaltar que alguns estudos têm relatado um aumento na
frequência de outros vírus gastroentéricos após a implementação da vacina contra rotavírus no
ano de 2006 (Sandra et al. 2015; Hassan et al. 2018). No entanto, ainda não existem dados
suficientes que afirmem que a frequência de HAstV tenha aumentado após a vacina, o que
ressalta, mais uma vez, a necessidade da continuidade do monitoramento deste vírus em nossa
região.
Dessa forma, estudos que sejam conduzidos a fim de se entender o perfil da
epidemiologia molecular dos HAstV, que relacionem a carga viral com características virais
(genótipo) e sintomatologia, são importantes, uma vez que estes fatores variam de acordo com
as características específicas da população estudada (Bosch et al, 2017).
18
3. OBJETIVOS GERAIS
Avaliar a ocorrência e caracterizar molecularmente astrovírus humanos clássicos
(HAstV) em crianças, de até seis anos, apresentando ou não sintomatologia de GEA aguda
atendidas no hospital Materno Infantil em Goiânia, no período de maio de 2014 a abril de
2015.
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
o Determinar a positividade de HAstV e quantificar a carga viral (CG/mL) das amostras
fecais positivas por PCR em tempo real;
o Determinar os genótipos e linhagens de HAstV nas amostras positivas para HAstV;
o Correlacionar a positividade, carga viral e genótipo dos HAstV com a idade e a
presença ou não de sintomas nas amostras das crianças participantes do estudo.
19
4. METODOLOGIA
4.1. LOCAL DE ESTUDO
O Hospital Estadual Materno Infantil Dr. Jurandir do Nascimento (HMI) é um hospital
de referência em casos de média e alta complexidade nas áreas de saúde, situado na cidade de
Goiânia, no estado de Goiás. O HMI oferece atendimento de urgência, emergência e
ambulatorial aos usuários do Sistema Único de Saúde (SUS), destacando-se em
especialidades como pediatria, ginecologia e obstetrícia. É um hospital que prioriza a política
de humanização com enfoque na saúde da mulher e da criança.
4.2. DELINEAMENTO E POPULAÇÃO DE ESTUDO
Este é um estudo observacional, de corte transversal para a pesquisa de HAstV em
amostras de fezes proveniente de crianças de até seis anos de idade, no período de maio de
2014 a abril de 2015. O projeto foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa do Hospital das
Clínicas da Universidade Federal de Goiás (CAAE19948113.6.0000.5078) (Anexo 1).
A população de estudo foi constituída por dois grupos, considerando a presença ou não
de sintomas de GEA, como indicado na Figura 5. Para a composição dos grupos de
investigação, foi realizada uma avaliação dos prontuários/fichas das crianças atendidas por
membros da equipe de pesquisa. Foram considerados como critérios de inclusão no grupo
sintomáticos crianças que apresentavam os sintomas gastroentéricos (diarreia e/ou vômito,
acompanhados ou não de dores abdominais e/ou febre). O grupo assintomático foi composto
por crianças foram atendidos na unidade de saúde e não apresentavam nenhum dos sintomas
gastroentéricos citados.
Após a seleção dos casos elegíveis, procedeu-se com o esclarecimento a respeito dos
objetivos da pesquisa e metodologia de coleta de amostra aos responsáveis. A partir do
consentimento destes, foi obtida a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TCLE, Anexo 2), sendo assim realizada uma entrevista para preenchimento do questionário
contendo dados clínicos e epidemiológicos (Anexo 3) e a coleta de amostras de fezes.
20
Figura 5: Delineamento do estudo.
4.3. COLETA E PREPARO DAS AMOSTRAS FECAIS
As amostras de fezes foram coletadas em frascos coletores estéreis e armazenadas a
4°C até serem transportadas para o LABVICC do Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública (IPTSP) da Universidade Federal de Goiás (UFG), onde foram imediatamente
processadas em cabines com fluxo laminar e luz ultravioleta (UV) para a obtenção de uma
suspensão fecal a 20% em tampão fosfato salina, pH 7,4 (PBS - cloreto de sódio, cloreto de
potássio, fosfato de sódio dibásico, fosfato monobásico de potássio). As suspensões foram
clarificadas por centrifugação a 2.000 x g por sete minutos, e o sobrenadante recolhido e
estocado em alíquotas a -20 °C e -80°C, até a realização dos ensaios laboratoriais.
21
4.4. PADRONIZAÇÃO DA REAÇÃO DE RT- qPCR HASTV
4.4.1. PLASMÍDEO PARA REALIZAÇÃO DO ENSAIO DE RT-qPCR
TAQMAN
Para a obtenção do inserto a ser clonado em plasmídeo para a construção da curva
padrão da reação em cadeia pela polimerase pós-transcrição reversa em tempo real (RT-
qPCR), uma amostra conhecida e caracterizada como HAstV-1 foi amplificada por PCR
convencional (Noel et al. 1995) utilizando iniciadores desenhados utilizando o software
CodonCode Alignment, descritos na quadro 2.
Para a reação de ligação foi utilizado o kit pGEM – T Easy Vector System I (Promega
corporation, Madison, Wisconsin, USA). Foi realizada a transformação com o utilizando uma
colônia isolada de Escherichia coli (linhagem XL1-Blue), cedida gentilmente pelo laboratório
de bacteriologia molecular do IPTSP/UFG.
Após a clonagem, as bactérias foram propagadas em meio Luria-Bertani (LB) sólido
contendo ampicilina na concentração final de 100 μg/mL. As colônias isoladas foram
posteriormente cultivadas em meio (LB) líquido, ao qual foi adicionado ampicilina na
concentração final de 100 μg/mL. Um volume de 2 mL de bactérias em meio LB foi utilizado
para a extração do DNA plasmidial pelo protocolo de lise alcalina, com posterior
armazenamento a – 20 °C.
Nome
Sequência dos iniciadores (5’-3’)
Posição
genômica
AV_insert1
(senso) CTH RTH AAY CAR GG 6482 - 6496
AV_insert3
(Antisenso) GCW YCT GAT TAA ATC A 6762 - 6777
Quadro 2: Iniciadores utilizados para a amplificação do inserto do plasmídeo tendo
como região alvo a RLA2.
22
4.5. CURVA PADRÃO PARA O ENSAIO DE RT-qPCR PARA HASTV
A curva padrão da RT-qPCR foi construída a partir do plasmídeo extraído e
purificado. O DNA plasmidial purificado foi quantificado por espectofotometria utilizando o
aparelho NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). Após quantificação, foi realizado o
cálculo para a equivalência de concentração em gramas para número estimado de moléculas
de DNA. Para o cálculo do número de moléculas de DNA foi utilizada a seguinte fórmula:
Após o cálculo, foram realizadas diluições seriadas na base 10 (1010 a 100) e testadas
no aparelho Rotor-Gene® Q 5plex HRM System (Qiagen®), juntamente com amostras
controles. A RT-qPCR foi realizada utilizando iniciadores e sonda específicos, descritos por
Le Cann, ( 2004) com modificações (Quadro 3 ) e submetidos à RT-qPCR juntamente com
os controles positivos e negativos.
As diluições foram expressas em cópias genômicas por mililitro (CG/mL). A
validação da curva foi obtida pelo coeficiente de correlação (R > 0.99), slope −3,270; Ct=
0,0357, R2 = 0,998 e o limite de detecção considerado foi ≤ 37 ciclos (Figura 6). Foram feitas
alíquotas de cada diluição em microtubos de 200 μL e congeladas a – 80 °C.
Nome Sequência dos iniciadores e sonda (5’-3’)
utilizados no RT-qPCR
Localização
AV1
(senso)
GAG TAG GAH CGA GGG TAC 6692 - 6709
AV2
(antisenso)
GCW TCT GAT TAA ATC AAT TTT AA 6755 - 6777
Sonda AVS aFam-CTT TTC TGT CTC TGT TTA GAT KAT
TTT AAT CAM C-Tamrab
6719 - 6752
Quadro 3: Iniciadores e sonda utilizados para o protocolo de RT-qPCR (Le Cann et
al. 2004), com modificações. a – FAM - corante repórter 6-carboxifluoresceína. b –
Tamra -fluorecent quencher.
23
Figura 6: Padronização da curva padrão para Taqman RT-qPCR para
detecção de HAstV. Os pontos em azul representam as diferentes diluições
do plasmídeo contendo o inserto de HAstV e o ponto em vermelho
representa a amostra controle positiva para HAstV.
24
4.6. DETERMINAÇÃO DA CARGA VIRAL DE HASTV NAS AMOSTRAS
CLÍNICAS POR RT-qPCR
Para a detecção e determinação da carga de HAstV, as amostras do estudo foram
extraídas pelo kit comercial QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen - Hilden, Alemanha),
seguindo instruções do fabricante. Foi utilizado o kit AgPath-ID™ One-Step RT-PCR
(Thermo Fisher Scientific) para a reação de RT-qPCR.
A reação foi feita a partir de mix contendo Tampão Path-ID™ One-Step RT-PCR (2X)
(Applied Biosystems – Carlsbad, CA, USA), Multiplex Enzyme Mix (10X) e 0,3 μM de cada
iniciador (Quadro 3) e 0,15 μM de sonda. O aparelho utilizado foi o Rotor-Gene® Q 5plex
HRM System (Qiagen®). A reação foi padronizada seguindo o seguinte protocolo de
ciclagem:
Foram consideradas amostras positivas aquelas que apresentaram Cycle Threshold
(Ct) ≤37 ciclos.
4.7. SEQUENCIAMENTO GENÔMICO E ANÁLISE FILOGENÉTICA DAS
AMOSTRAS POSITIVAS PARA HASTV
A reação de sequenciamento do fragmento parcial (RLA2 do capsídeo) do genoma
dos HAstV foi realizada utilizando-se BigDye Terminator versão 3.01 Cycle Sequencing Kit
(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), com os iniciadores Mon244/Mon245 e
Mon269/Mon270 (Noel et al. 1995).
Para cada reação de sequenciamento, empregou-se 3 μL do DNA purificado
(isopropanol a 65%) e uma mistura contendo 3μL de água MilliQ, 2 μL de tampão 5X, 1 μL
de iniciadores (2 pmol) e 1μL de Big Dye (composto por didesoxinucleotídeos trifosfatos
(ddNTPs) com marcadores fluorescentes e Taq DNA polimerase). Posteriormente, as
amostras foram levadas ao termociclador utilizando a ciclagem: 25 ciclos de 95°C por 20
segundos, 58°C por 15 segundos e 60°C por 60 segundos.
RT 48° C 10 minutos
95° C 10 minutos
40
ciclos
95° C 20
segundos
60° C 60
segundos
25
Em seguida, as amostras foram precipitadas utilizando isopropanol a 65% para a
retirada dos ddNTPs não incorporados. Após centrifugação, a placa foi colocada em
termociclador para completa secagem (2 minutos a 95°C).
Adicionou-se 10 μL de formamida Hi Di (Applied Biosystems) às amostras, e a placa
foi colocada em termociclador durante 5 minutos a 95°C para desnaturação da fita de DNA.
Após isso, as amostras foram colocadas em gelo por dois minutos, e a placa foi levada para o
sequenciador automático ABI 3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), sendo
posteriormente realizada a leitura dos eletroferogramas.
Para análise das sequências obtidas montou-se uma sequência consenso das fitas senso
e antisenso utilizando a interface phred/phrap por meio do site
http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/ da EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária). Foi realizado o alinhamento das sequências consenso de cada amostra com a
utilização do programa Clustal X, juntamente com sequências protótipos de cada genótipo de
HAstV-1 disponíveis no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Para edição do
alinhamento utilizou-se o programa BioEdit, que também foi utilizado para análise de matriz
de identidade entre as amostras.
A árvore filogenética foi construída utilizando-se o programa MEGA (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis) versão 7.0. As análises foram realizadas pelo método
Neighbor-Joining, modelo de substituição de nucleotídeos Kimura 2 parâmetros e sendo
consideradas 1500 replicatas e valores boostraps acima de 70%.
4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A partir dos resultados moleculares e dados obtidos das fichas epidemiológicas dos
pacientes foi realizada a análise estatística, utilizando o programa GraphPad Prism versão 8.0,
utilizando o teste de qui-quadrado (χ2) ou teste de Fischer, quando necessário.
26
5. RESULTADOS
Neste estudo, foram incluídas 250 crianças, das quais foi obtida uma amostra de fezes
de cada, no período de maio de 2014 a abril de 2015. Os pacientes eram predominantemente
do sexo masculino, 55,6% (139/250), com idade variando de 0 a 70 meses, com média de 13
meses. Considerando os sintomas de GEA, 56,8% (142/250) das crianças foram incluídas no
grupo sem sintomas e 43,2% (108/250) no grupo com sintomas (Tabela 1).
Tabela 1 – Características da população de estudo (N= 250)
Características N %
Sexo
Feminino 111 44,4%
Masculino 139 55,6%
Idade (meses)
0 - 12 meses 159 63,6%
13 - 24 meses 45 18%
25 - 36 meses 19 7,6%
>36 meses 27 10,8%
Sintomas GEA
Sim 108 43,2%
Não 142 56,8%
Todas as 250 amostras fecais foram testadas por RT-qPCR TaqMan, sendo encontrado
índice de positividade de 3,2% (8/250). A carga viral estimada nas amostras fecais variou de
2,8 x 105 CG/mL a 1,6 x 1011 CG/mL, com média de 2,39 x 1010.
Das crianças que apresentavam sintomas, 3,7% (4/108) foram positivas para HAstV, e
das assintomáticas 2,8% (4/142). Todos os pacientes sintomáticos positivos para HAstV
apresentaram diarreia e destes 75% (3/4) apresentaram diarreia e vômito. Não foi observada
nenhuma significância estatística entre positividade para HAstV e a presença de sintomas.
Quando analisados os sintomas de GEA, diarreia e vômito, diarreia sem vômito e vômito sem
diarreia, também não houve diferença significativa, no entanto, a maioria dos casos positivos
(75%) eram crianças que apresentavam diarreia e vômito.
27
Quando analisada a positividade para HAstV em relação à idade, observou-se uma
maior positividade na faixa etária de 25 a 36 meses (p<0,0001). Para as outras faixas etárias,
não foi observada significância estatística. Todas as amostras positivas foram provenientes de
crianças com até 33 meses de idade, ou seja, menores de três anos.
Características Positivas/Total % p
Sexo
Feminino 3/111 2,7%
Masculino 5/139 3,6% 0,7
Idade (meses)
0 - 12 2/159 1,2%
13-24 2/45 4,4% 0,6
25-36 4/19 21% <0,0001
>36 0/27
Presença de sintomas
Sim 4/108 3,7% 0,7
Não 4/142 2,8%
Sintomas GEA
Diarreia sem vômito 1/37 2,7% >0,9
Diarreia e vômito 3/61 4,9% 0,6
Vômito sem diarreia 0/10
Período
Seco 5/112 4,5% 0,3
Chuvoso 3/138 2,2%
Considerando a circulação de HAstV, durante o período de um ano (maio/2014 a
abril/2015), apesar de não ser observada nenhuma significância estatística entre a positividade
para HAstV e os períodos seco e chuvoso, nota-se maior frequência no período seco,
principalmente no mês de maio, quando foi detectada 62,5% (5/8) de positividade para
HAstV.
Das oito amostras positivas para HAstV por RT-qPCR, foi possível a detecção do
genoma viral em seis amostras por RT-PCR convencional. Primeiramente utilizando os pares
Tabela 2 - Análise univariada das características gerais das crianças em relação à
positividade para astrovírus humanos.
28
de iniciadores Mon269/Mon270, obteve-se apenas duas amostras positivas. Quando utilizados
pares Mon244/Mon245, seis amostras foram positivas. Os iniciadores Mon244/Mon245
mostraram-se mais abrangentes do que Mon269 e Mon270. Porém, após o processo de
purificação, foi possível obter produtos com concentração adequada e de boa qualidade de
quatro amostras. Os produtos das quatro amostras foram submetidos ao sequenciamento
genômico para determinação dos genótipos de HAstV. Quando se realiza a associação entre
carga viral e genótipo observa-se que as quatro maiores cargas detectadas eram das quatro
amostras sequenciadas. A carga viral destas amostras variou de 1,1 x 108 a 1,63 x 1011.
Para a realização da análise filogenética, foram utilizadas sequências protótipos de
cada genótipo de HAstV-1 a 8 obtidas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Após
construção da árvore filogenética, duas amostras foram caracterizadas como HAstV-1 e duas
como HAstV-4. Estas sequências foram depositadas no GenBank (números de acesso:
MK608708-MK608711).
Figura 7 - Análise filogenética da sequência parcial (413 pb) do capsídeo de HAstV
detectados em amostras de fezes provenientes de crianças com ou sem sintomas de
GEA. As amostras protótipo estão representadas pelo número de acesso no GenBank.
As amostras encontradas neste estudo estão representadas por ♦ (MK608708-
MK608711). A amostra NC011400.1 (MLB1) foi utilizada como outgroup.
29
Foi ainda realizada análise para identificação das linhagens em cada um dos genótipos
encontrados (HAstV-1 e HAstV-4).
A análise filogenética das linhagens de HAstV-1 demonstrou que as amostras
identificadas neste estudo pertencem à linhagem 1-a. Quando realizada análise de identidade
de matriz, observou-se 100% de identidade entre as amostras identificadas neste estudo e 98%
entre as sequências selecionadas da mesma linhagem, sendo estas protótipos do Brasil,
também classificadas como HAstV-1-a (Xavier et al. 2015).
Figura 8 - Análise filogenética das linhagens de HAstV-1 da sequência parcial (413 pb)
do capsídeo. As amostras encontradas neste estudo estão representadas por ♦
(MK608710 e MK608711).
30
A análise filogenética das linhagens de HAstV-4 demonstrou que as amostras
identificadas neste trabalho pertencem à linhagem 4-c. Quando realizada análise de identidade
de matriz, observou-se 100% de identidade entre as amostras identificadas neste estudo e 96%
entre as sequências protótipos de referência, também classificadas como linhagem HAstV-4-
c.
Figura 9 - Análise filogenética das linhagens de HAstV-4 da sequência
parcial de RLA2 (413 pb) do capsídeo. As amostras encontradas neste
estudo estão representadas por ♦ (MK608708 e MK608709).
31
6. DISCUSSÃO
Desde que foram descobertos em 1975, os astrovírus humanos são reconhecidos como
importantes agentes etiológicos de gastroenterite aguda com distribuição mundial (Vu et al.
2017). Os HAstV podem acometer indivíduos de todas as idades, mas estão relacionados,
principalmente, a GEA em crianças menores de cinco anos de idade (Guix et al. 2002; Espul
et al. 2004; Xavier et al. 2015). Estima-se que os HAstV sejam responsáveis por 2 a 9% dos
episódios de gastroenterite não bacteriana aguda em crianças em diferentes partes do mundo
(Bosch et al. 2014).
No presente estudo foi realizada a pesquisa de HAstV em amostras provenientes de
crianças de 0 a 70 meses, com média de 13 meses, a maioria do sexo masculino (55,6%), com
e sem sintomas de GEA atendidas em um hospital de referência pediátrica em Goiânia, Goiás,
durante o período de um ano (maio de 2014 a abril de 2015). Foi realizada a pesquisa de
HAstV, estimada a carga viral e a determinação de genótipos nas amostras positivas por RT-
PCR em tempo real.
Neste estudo, o índice de positividade encontrado foi de 3,2% (8/250), por RT-qPCR.
Como referido, os HAstV têm distribuição mundial, sendo mais frequentes em países em
desenvolvimento. Em estudos que utilizam RT-PCR convencional, a média da frequência
mundial de HAstV é 5% em casos esporádicos (Vu et al. 2017). A positividade para HAstV
pode variar dependendo da população analisada e a sensibilidade da metodologia de escolha
para a pesquisa viral. Dados da literatura ressaltam como vantagens da metodologia de
escolha deste estudo (RT-qPCR), a maior sensibilidade e a capacidade de estimar a carga viral
(Pérot et al. 2017).
Nos Estados Unidos, um estudo utilizando RT-qPCR, para a pesquisa de HAstV em
amostras provenientes de crianças com GEA, com até cinco anos de idade observou
positividade de 4,9% (Chhabra et al. 2013), assim como em Burkina Faso, na África, que
também obteve positividade de 4,9% em população semelhante (Ouédraogo et al. 2016).
Outro estudo conduzido na Moldova e Ucrânia em pacientes atendidos em hospitais detectou
HAstV em 1,4% das amostras analisadas por RT-qPCR apresentou (Chhabra et al. 2014). De
modo geral, estes estudos apresentaram positividade próxima à média mundial, bem como ao
índice detectado no presente trabalho.
Apesar de ter sido utilizada metodologia considerada mais sensível, a positividade
para HAstV encontrada neste trabalho foi semelhante a de outros estudos em população
pediátrica, que utilizaram como metodologia a RT-PCR convencional, como na Espanha,
32
China e Estados Unidos, que apresentaram positividade de 4,9%, 4,4% e 3,5%,
respectivamente (Guix et al. 2002; Wang et al. 2013; Osborne et al. 2015).
Um estudo realizado na região norte do Brasil, com amostras de crianças com GEA,
atendidas em hospital, utilizando RT-PCR, encontrou um índice de positividade de 3,9%
(Siqueira et al. 2017b). Outro estudo conduzido no Brasil, com delineamento semelhante, com
amostras dos anos 2005 a 2011, apresentou positividade geral de 7,1% e, quando analisadas
por regiões, os índices encontrados foram de 3.9% no nordeste, 7,9% no sul e 9,2% no
sudeste (Xavier et al. 2015).
Na região Centro-Oeste, um estudo que buscou avaliar a circulação de HAstV nas
cidades de Brasília e Goiânia, utilizando RT-PCR, relatou positividade de 3,7% (Santos et
al. 2007). Ainda na região Centro-Oeste, dados da cidade de Campo Grande, MS, revelam
positividade de 3,1% em amostras testadas por RT-PCR (Andreasi et al. 2008). Em Goiânia,
um estudo com crianças de até dois anos de idade apresentando sintomas de GEA detectou
HAstV em 2,8% das amostras coletadas entre os anos de 1998 e 2000 (Cardoso et al. 2002).
Com isso, percebe-se que apesar de metodologias de detecção distintas, dos períodos
diferentes e variações no número amostral dos estudos, a positividade para HAstV encontrada
neste trabalho foi semelhante a de outros estudos conduzidos na região.
O principal sintoma associado à infecção por HAstV é a diarreia, seguida de vômito.
Neste estudo, 100% (4/4) das crianças positivas e sintomáticas apresentavam diarreia e 75%
(3/4) apresentavam diarreia e vômito em associação. Diferente das infecções por norovírus e
rotavírus, nas infecções por HAstV a presença de vômito é menos prevalente (Walter &
Mitchell 2003). Em um estudo realizado no Brasil, com RT-PCR convencional como método
de detecção, em população pediátrica com GEA, resultado idêntico foi observado, com 75%
das amostras positivas associadas à presença de vômito (Siqueira et al. 2017b).
As infecções por HAstV são geralmente associadas à presença de sintomas
gastroentéricos, no entanto, existem relatos de positividade para HAstV em amostras fecais de
crianças assintomáticas (Santos et al. 2007; Bosch et al. 2014; Osborne et al. 2015;
Ouédraogo et al. 2016). Neste estudo foi analisada a positividade para HAstV em ambos os
grupos sintomáticos e assintomáticos, os quais, analisados separadamente, representam 3,7%
e 2,8% de positividade respectivamente. Um estudo conduzido no Quênia e em Gambia
encontrou índices de positividade semelhantes entre os dois grupos: 2,7% no grupo
sintomático e 2,4% no assintomático, em amostras de crianças menores de cinco anos (Meyer
et al. 2015). O fato dos HAstV serem detectados em pacientes assintomáticos pode estar
associado a fatores do indivíduo, da excreção viral prolongada ou mesmo de uma persistência
33
do vírus no trato gastrointestinal (Vu et al. 2017). No presente estudo não foi possível avaliar
a excreção prolongada visto que foi obtida somente uma amostra fecal de cada criança
participante.
Após a implementação da vacina contra rotavírus em 2006, alguns estudos sugerem a
possibilidade de um aumento da frequência de outros vírus gastroentéricos (Sandra et al.
2015; Hassan et al. 2018). No entanto, neste trabalho não foi detectada maior positividade
para HAstV do que em estudos que utilizaram amostras de diferentes períodos anteriores ao
ano de 2006 (Cardoso et al. 2002; Gabbay et al. 2005; Santos et al. 2007; Silva et al. 2009). É
importante ressaltar que a presente pesquisa faz parte de um projeto maior que objetivou a
pesquisa de vários vírus gastroentéricos na mesma população, sendo detectados elevados
índices de positividade para norovírus (Dábilla et al. 2016) e sapovírus (Silva et al. 2018),
bem como um declínio na positividade para rotavírus (Almeida et al. 2015).
A carga viral das amostras positivas variou de 2,8 x 105 CG/mL a 1,6 x 1011 CG/mL,
com média de 2,39 x 1010. As amostras provenientes de crianças assintomáticas apresentaram
carga viral significativa, variando de 3,16 x 106 a 1,6 x 1011 CG/mL, com média de 5,4 x 1010
CG/mL, e as sintomáticas variaram de 2,8 x 105 a 1,6 x 1010 CG/mL, com média de 5,5 x 109
CG/mL. Quando analisado se havia relação entre carga viral com sintomas apresentados, não
foi observada significância estatística.
A compreensão da relação da carga viral em pacientes assintomáticos torna-se ainda
mais difícil em razão da ausência destes dados, pois os poucos estudos que relatam carga viral
referem-se a pacientes com quadro de GEA. Um estudo realizado utilizando RT-qPCR,
apenas com amostras de crianças com GEA, obteve carga viral variando de 7,6 x 101 a 3,6 x
1014 CG por 0,1g de fezes (Zhang et al. 2006). Caballero e colaboradores, utilizando RT-PCR,
estimaram a carga viral de HAstV em amostras fecais de crianças que estavam com quadro de
diarreia, a qual variou de 3.4 x 108 a 1 x 1013 cópias genômicas por gramas de fezes
(Caballero et al. 2003). Outro estudo conduzido com crianças de até cinco anos com GEA,
utilizando rRT-LAMP PCR, obteve carga viral variando de 103 a 108 cópias de RNA (Wei et
al. 2013).
Crianças de 25 a 36 meses de idade foram as que mais apresentaram positividade para
HAstV, sendo este dado significativo (p=0,001). A variação da idade das crianças positivas
foi de 2 a 33 meses, ou seja, crianças menores de três anos. Em um estudo conduzido com
indivíduos de 0 a 15 anos de idade, utilizando RT-PCR, o maior número de casos de infecção
por HAstV foi entre crianças de 2 a 3 anos, sendo que do total, 80% dos casos positivos eram
menores de três anos (Guix et al. 2002). Entretanto, em estudo conduzido em amostras de
34
crianças com GEA em Goiânia, observou-se maior positividade para HAstV em crianças
menores de 36 meses (Cardoso et al. 2002).
Dados disponíveis na literatura reportam maior positividade para HAstV em épocas
chuvosas (Cruz et al. 1992; Maldonado et al. 1998; Schultz-Cherry 2013). A cidade de
Goiânia é caracterizada por um clima tropical, com duas estações bem definidas: verão
(chuvoso) que compreende os meses de outubro a abril, e inverno (seco), no período de maio
a setembro (INMET 2015). Apesar de não haver diferença significativa entre a positividade
para HAstV e os períodos seco e chuvoso nos dados do presente estudo, nota-se maior
frequência de casos positivos no período seco, principalmente no mês de maio, onde ocorreu
62,5% (5/8) dos casos positivos.
Dados de trabalhos realizados em Goiânia e Brasília mostram maior positividade
durante os meses de setembro a março, período que coincide com maior humidade relativa do
ar (Santos et al. 2007). Outro estudo conduzido em Goiânia, mostrou maior positividade foi
encontrada no período de outubro a dezembro (Cardoso et al. 2002). Em contrapartida, em um
estudo realizado em São Luiz, no Maranhão, os casos positivos foram detectados durante
vários meses do ano, não sendo observado um padrão entre as estações, assim como em
Campo Grande onde também não houve diferença no padrão de circulação nas diferentes
estações (Gabbay et al. 2005; Andreasi et al. 2008).
As amostras positivas foram submetidas ao sequenciamento genômico, sendo
utilizados dois pares de iniciadores: Mon269/Mon270 onde se obteve apenas duas amostras
positivas e Mon244/Mon245 com o qual seis amostras foram positivas. Sendo assim, os
iniciadores Mon244/Mon245 mostraram-se mais sensíveis do que Mon269/Mon270,
considerados universais, para as amostras deste estudo, discordando de dados da literatura
(Noel et al. 1995), reforçando a maior sensibilidade da metodologia de RT-qPCR e
especificidade dos iniciadores e sondas utilizados.
Por meio de análise filogenética, das quatro amostras sequenciadas, duas foram
caracterizadas como HAstV-1, que é o genótipo mais frequente no Brasil e no mundo
(Gabbay et al. 2005; Silva et al. 2009; Bosch et al. 2014; Siqueira et al. 2017b; Vu et al.
2017). Foi realizada ainda uma análise de linhagens pertencentes à este genótipo, sendo duas
amostras sequenciadas identificadas como pertencentes à linhagem 1-a. Foi observado 98%
de identidade nucleotídica com os outros protótipos 1-a brasileiros do estado do Rio de
Janeiro e Rio Grande do Sul, provenientes de um estudo conduzido em amostras, coletadas
em 2005, de crianças menores de cinco anos com GEA. Foi realizada ainda uma análise de
matriz de identidade entre as amostras sequenciadas deste trabalho com protótipos de estudos
35
anteriores conduzidos em Goiânia e Brasília (número de acesso: DQ139828, DQ139846 e
DQ139832) e observada identidade nucleotídica que variou de 78% a 96% com as amostras
sequenciadas neste estudo. Apesar de pertencerem à mesma região, as amostras de Goiânia e
Brasília foram coletadas entre os anos 1996 e 2001, por isso nota-se maior identidade das
amostras deste estudo com as coletadas em 2005, ainda que pertencente a estados de outras
regiões brasileiras. Alguns estudos brasileiros também caracterizaram amostras HAstV-1
como pertencentes à linhagem 1-a (Gabbay et al. 2007; Morillo et al. 2018).
Ainda que o genótipo HAstV-1 seja o principal em distribuição global, neste estudo o
genótipo HAstV-4 foi encontrado em mesma proporção, semelhante ao estudo anterior
conduzido no Brasil, com amostras provenientes de vários estados, no qual também quatro
amostras foram sequenciadas e caracterizadas como HAstV-1 e HAstV-4. As amostras eram
provenientes dos anos de 2010 a 2012, o que nos permite inferir que estes genótipos circulam
no país já à algum tempo (Morillo et al. 2018). No referido estudo, a análise de linhagens
também caracterizou as amostras como pertencentes à linhagem 4-c.
Os dados obtidos neste estudo contribuem para continuidade da vigilância
epidemiológica de HAstV, juntamente aos estudos anteriores conduzidos em Goiânia com
crianças menores de cinco anos, visto que o último estudo foi realizado há quase uma década
(Silva et al. 2009). Além disso, o trabalho traz dados sobre a epidemiologia molecular dos
HAstV e carga viral das amostras positivas, o que poderá contribuir com outros estudos que
busquem relacionar tais informação com sintomas e/ou características moleculares desses
agentes.
36
7. CONCLUSÃO
o Este foi o primeiro estudo realizado na região Centro-Oeste a utilizar RT-qPCR para a
pesquisa de HAstV. A carga viral média das amostras positivas foi de 2,39 x1010 CG/mL,
sendo observadas cargas consideráveis tanto para as amostras de crianças sintomáticas,
quanto assintomáticas;
o Foi observada frequência para HAstV (3,2%) em amostras de crianças de até seis anos
de idade com ou sem sintomas de GEA atendidas em hospital de Goiânia, GO;
o As amostras positivas foram caracterizadas como genótipo HAstV-1 e HAstV-4,
sendo ainda identificadas as 1-a e 4-c. Sendo a primeira descrição de linhagem 1-a em
amostras de Goiânia.
37
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Nara Prefecture, Japan, during the 2009/2010-2014/2015 seasons. Japanese Journal of
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Zhang, Z., Mitchell, D.K., Afflerbach, C., Jakab, F., Walter, J., Zhang, Y.J., et al.
Quantitation of human astrovirus by real-time reverse-transcription-polymerase chain reaction
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49
2006.
WHO - World Health Organization. Fact Sheets 2018. https://www.who.int/en/news-
room/fact-sheets/detail/diarrhoeal-disease. Acesso em março de 2018.
50
9. ANEXOS
Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética
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52
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54
Anexo 2 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
Termo de consentimento livre e esclarecido
Título do projeto de pesquisa: Detecção de Bocavírus Humano (HBoV) em crianças com
infecção respiratória e/ou gastroenterite: estudo caso-controle.
Pesquisador responsável: Teresinha Teixeira de Sousa
Orientadora: Profa. Divina das Dores de Paula Cardoso.
Nome do sujeito de Pesquisa:...........................................................................................
Você autoriza a criança a participar de uma pesquisa, em que ela, seu filho (a) ou a
criança pela qual você é responsável está sendo convidado (a) como voluntário (a) a fazer
parte deste estudo que tem como título: ¨Detecção de Bocavírus Humano (HBoV) em
crianças com infecção respiratória e/ou gastroenterite: estudo caso-controle¨.
Meu nome é Teresinha Teixeira de Sousa, sou a pesquisadora responsável e minha
área de atuação é de médica pneumologista, aluna de doutorado da UFG/IPTSP. A
participação da criança é importante, mas antes de decidir se você quer que ela faça parte da
pesquisa em que é preciso coletar fezes e secreção do nariz de crianças doentes (com
infecções respiratórias e com gastroenterite-diarreia) e também daquelas sem estas doenças
(que é o grupo controle, estudar a presença do vírus em quem não está doente), é preciso que
o senhor ou a senhora, entenda o motivo da pesquisa: o convite está sendo feito porque os
vírus respiratórios e entéricos são causas comuns de infecções respiratórias e de gastroenterite
em crianças.
Vários novos vírus estão sendo descobertos e pouco se conhece sobre seu impacto
(importância) em pacientes com essas doenças. Esta pesquisa pretende estudar as infecções
respiratórias e gastroenterite por vírus (bocavírus humano/HBoV) em crianças com idades
abaixo de 5 anos. Durante o período de um ano atendidas no Hospital Materno Infantil de
Goiânia/Goiás. A pesquisa será realizada em crianças com sintomas clínicos (casos) de
infecção respiratória e/ou gastroenterite e comparar o vírus também em pacientes sem estas
doenças (que é o grupo controle, onde estudamos o vírus também em quem está sadio, pois
em alguns casos a criança pode ser portadora do vírus, mas não manifestar a doença). Após o
atendimento do paciente pelos pediatras do hospital, um dos membros da equipe pedirá
autorização para os pais e/ou responsáveis pelas crianças e explicará em detalhes todos os
procedimentos para a pesquisa: haverá o preenchimento de um questionário e uma coleta de
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cada material (secreção nasal e fezes), em todas as crianças tanto as doentes como as sadias
que estão no hospital por outros motivos. Todos estes procedimentos serão feitos pela
pesquisadora responsável (Teresinha, médica) em sala ao lado do ambulatório no térreo e sala
procedimentos no segundo andar / enfermarias do Hospital Materno Infantil, onde será
garantida a privacidade da criança, por ocasião das consultas e/ou hospitalização, sem a
necessidade de comparecimento ou retorno ao Hospital por motivo relacionado à Pesquisa.
Os exames de fezes e secreção nasal não substituirão os exames regularmente colhidos
no Hospital como parte do seguimento médico dos pacientes. A participação de seu filho (a)
ou a criança pela qual você é responsável é importante, mas você e a criança podem recusar
participar da pesquisa a qualquer momento. Os procedimentos apresentam riscos baixos à
integridade física da criança, serão realizados pela pesquisadora (Teresinha) e consistem em:
Coleta de lavado nasal é feita através de uma pequena sonda com soro fisiológico, introduzida
nas narinas e aspirada (¨como uma lavagem do nariz com soro, só que aspirado o líquido de
volta¨), podendo ocorrer desconforto local e muito raramente pequeno sangramento nasal,
sem danos posteriormente para a criança. E a coleta de fezes é espontânea, durante a
evacuação, a qual será recolhida em um frasco específico, sem a utilização de medicação ou
instrumentos para tal. Não acarretando nenhum desconforto direto, podendo ser acompanhado
pelo responsável legal da criança. Além da coleta das amostras de secreções nasais e de fezes,
o responsável pela criança deverá responder um questionário para o registro das informações
pessoais da criança e a pesquisadora poderá, também, anotar dados dos prontuários. O
destino dessas amostras será para o Laboratório de Virologia Humano da UFG/IPTSP, onde
por exames moleculares os vírus respiratórios e entéricos serão detectados através de técnicas
laboratoriais sofisticadas chamadas de PCR em tempo real (material genético dos vírus, DNA
e RNA).
Informo, aos pais ou responsáveis pela criança, que as amostras (material biológico de
fezes e de secreções nasais) ficarão armazenadas (guardadas) no Instituto de Patologia e
Doenças Tropicais da UFG seguindo todas as normas do regulamento aprovado pelo
CEP/IPTSP a respeito de biorrepositório (segundo as normas da resolução do CNS 441 de
2011), e, caso eu tenha seu consentimento por escrito autorizando o uso para esta pesquisa e
no futuro para qualquer outra pesquisa, não será necessário preencher um novo termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE); sobre o bocavírus humano e também para os
outros vírus como o: rotavírus (A), calicivírus, adenovírus, astrovírus, enterovírus, aichivírus,
salivírus/klassevírus, vírus respiratório sincicial, vírus influenza A e B, vírus da parainfluenza,
adenovírus respiratório, rinovírus, metapneumovírus humano, coronavírus e os H1N1. Esta
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pesquisa estará sendo financiada com recurso do próprio laboratório e de convênios
regularmente firmados sem nenhum custo para o SUS, familiares ou planos de saúde. É
importante ressaltar, entretanto que a pesquisa está restrita aos procedimentos listados acima.
A participação no estudo NÃO IMPLICA na realização de outro exame e NÃO
INTERFERE nas decisões sobre os remédios necessários para o tratamento do problema atual
(o médico do hospital que atender seu filho (a) decidirão por procedimentos necessários,
como os medicamentos ou outros exames). Estes dados procedimentos e/ou seus resultados,
entretanto serão registrados para análise futura. Todos os pacientes serão convidados a
participar do estudo, e a qualquer momento podem também deixar de participar, se assim o
desejarem. Somente os pesquisadores e/ou equipe de pesquisa terão conhecimento de suas
identidades e do questionário. Os pesquisadores pretendem publicar os resultados obtidos pela
pesquisa, mas o nome e dados pessoais dos pacientes são TOTALMENTE CONFIDENCIAIS
(não haverá identificação dos participantes) os dados também poderão ser utilizados em
estudos futuros de outros vírus citados acima.
Em caso de recusa, você e seu filho (a) não serão penalizados (as) de forma alguma,
esta recusa em nada implicará na assistência que seu filho (a) receberá. Se aceitar participar e
depois retirar seu consentimento também, em nada será prejudicado. É importante destacar
que, como não há despesas decorrentes da participação na pesquisa por parte do sujeito da
pesquisa, neste caso, o responsável legal e a criança participante não haverá nenhum tipo de
pagamento ou gratificação financeira pela sua participação. Este estudo tem início no ano de
2013 e previsão de encerramento em 2014.
Autorizo o armazenamento e guarda de amostras de secreção nasal e de fezes,
formando um banco de dados/biorrepositório para investigações futuras, e que toda nova
pesquisa a ser feita com o material será submetida à aprovação do CEP da instituição e,
quando for o caso, da CONEP e com a dispensa de novo consentimento a cada pesquisa (Res.
CNS n° 347/2005-1.1, 1.2, 1.3, 1.4).
Após receber os esclarecimentos e as informações, no caso de aceitar fazer parte do
estudo, você deverá rubricar todas as páginas e assinar ao final deste documento e, que está
em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador responsável A qualquer momento,
antes e durante a pesquisa, você poderá solicitar esclarecimentos e em caso de dúvidas sobre a
pesquisa, você poderá entrar em contato com a pesquisadora responsável, Teresinha Teixeira
de Sousa no telefone: (62) 81595675. Em caso de dúvidas sobre os seus direitos como
participante nesta pesquisa, você poderá entrar em contato com o Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital Materno Infantil de Goiânia Telefone (62) 3201-3374.
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Local e Data: Goiânia, ......../......../..............
Nome e Assinatura do pesquisador ___________________________________________
Consentimento da participação da criança como sujeito da pesquisa pelo responsável
legal
Eu,_____________________________________________, RG_____________, CPF
____________________, endereço ________________________________, abaixo assinado
concordo que _____________________________________ cuja responsabilidade legal me é
conferida autorizo que a criança participe do estudo ¨Detecçaõ de Bocavírus Humano
(HBoV) em crianças com infecções respiratótias e/ou gastroenterite: estudo caso-
controle¨, como sujeito de pesquisa.
Fui devidamente informado e esclarecido pelo Pesquisador ________________ sobre
a pesquisa, os procedimentos envolvidos, assim com os possíveis riscos e benefícios
decorrentes da participação da criança pela qual sou responsável legal.
Foi-me garantido que posso retirar meu consentimento a qualquer momento, sem que
isto leve a qualquer penalidade ou interrupção do seu acompanhamento assistência/tratamento
e que todas as informações pessoais obtidas serão mantidas em sigilo. Recebi uma cópia deste
documento com todas as páginas rubricadas e assinadas por mim e pelo pesquisador
participante deste estudo. Autorizo a execução do trabalho de pesquisa e a divulgação dos
dados obtidos neste estudo sobre o bocavírus humano e, ainda, a formação de um banco de
dados e um biorrepositório das amostras (fezes e de secreções nasais) cujo regulamento foi
aprovado pelo CEP/IPTSP/UFG, seguindo as normas da resolução do CNS 441 de 2011. E
que as amostras obtidas poderão ser utilizadas em pesquisas futuras sem a necessidade do
preenchimento de um novo termo de consentimento (TCLE); para o bocavírus humano e para
outros vírus como o: rotavírus (A), calicivírus, adenovírus, astrovírus, enterovírus, aichi vírus,
salivírus/klassevírus, vírus respiratório sincicial, vírus influenza A e B, vírus da parainfluenza,
adenovírus respiratório, rinovírus, metapneumovírus humano, coronavírus e os H1N1.
Local e data: ____________________________________________________________
Nome e assinatura do sujeito ou responsável legal: ______________________________
Presenciamos a solicitação de consentimento, esclarecimentos sobre a pesquisa e aceite do
sujeito em participar.
Testemunhas
Nome e assinatura: _______________________________________________________
Nome e assinatura: _______________________________________________________
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Anexo 3 – Ficha de Investigação Clínica
Ficha de investigação clínica
DATA: ........./........./.......... Registro geral (..................) Nº Amostra (..................)
Controle: 1.1 Fezes assintomático ( ) 1.2 Swab assintomático ( )
Caso: 2.1 Sintomas GEA ( ) 2.2 Sintomas respiratórios ( )
Amostra: 3.1 Fezes ( ) 3.2 Swab ( )
Dados epidemiológicos
NOME: ................................................................................................................................
COLETA: DATA (....../....../.......) HORA (....................)
UNIDADE COLETA: ( ) PS ( ) ENFERMARIA ADMISSÃO: ..............................
SEXO: ( ) MASC. ( ) FEM.
DATA DE NASCIMENTO: ........./......../........ IDADE: ..............................
Natural: ............................................. Procedência: .................................................
Endereço: ............................................................................................................................
Bairro:................................................ Cidade:........................................... UF:............
Telefone: ( )................................. Nome responsável: ....................................................
Profissão: Mãe ................................................ Pai..........................................................
Renda familiar (em salário mínimo): ..................................................................................
Habitação: ( ) própria ( ) alugada
Asfalto: sim( ) não( ) Água: ( )tratada ( )cisterna ( )poço Esgoto: sim( ) não ( )
RAÇA/COR: ( )branca, ( )morena, ( )negra, ( )indígena
ESCOLARIDADE: ( )pública, ( )creche, ( )particular
ASSISTÊNCIA MÉDICA: ( ) SUS, ( ) plano de saúde, ( )particular
ALIMENTAÇÃO: ( ) leite materno, ( ) leite materno e outro, ( ) outro
TIPO PARTO: ( ) normal, ( ) cesariana
Sintomatologia:
A. Respiratório:
Febre: sim( ) não( ), Tosse ( )sim ( )não, Dispnéia/Chiado ( )sim ( )não
SaO2:........................./ Rad TX:............................../ HMG: ...................................
Ausculta: ................................................./ Temperatura: ......................................
B. GASTROENTERITE:
Diarréia: sim( ) não( )/ Frequência: 1 a 2x ( ), >2x ( )
Aspecto: líquida( ), semi-liquida( ), pastosa( ), sangue( ), fétida( )
Febre: sim( ) não( )/ Vômitos: sim( ) não( )/ Dor abdominal: sim( ) não( )
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Antecedentes epidemiológicos:
Contato caso suspeito (Respiratório e/ou GEA): ( )domicílio, ( )creche, ( ) escola
Uso de medicação antes coleta: sim( ) não( ), qual? ........................................................
Vacinação completa: sim( ) não( )
Vacina contra gripe: sim( ) não( ) Última dose:.......................................................
Vacina rotavírus (VORH)( ), Rotarix ( ), Rotatec( ) – 1ªdose( ), 2ªdose ( )
Comprovação: sim( ), não( )
Diagnóstico clínico prontuário:............................................................................................
Outras patologias/cirurgias: ...............................................................................................
![parasito schistosoma[1]](https://img.document.onl/doc/110x75/5571fb6f497959916994e04d/parasito-schistosoma1.jpg)
