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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DA
RELAÇÃO PARASITO-HOSPEDEIRO
VANESSA NEIVA GUIMARÃES
Identificação e caracterização molecular do vírus dengue em
indivíduos sintomáticos atendidos na rede pública de saúde de
Goiânia – Goiás, durante o período epidêmico 2012-2013
Goiânia
2014
ii
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES
E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás
(UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação [ ] Tese
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a): Vanessa Neiva Guimarães
E-mail: [email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ ]Sim [ X ] Não
Vínculo empregatício do autor Secretaria de Saúde do Estado de Goiás
Agência de fomento: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás Sigla: FAPEG
País: Brasil UF: Goiás CNPJ:
Título: Identificação e caracterização molecular do vírus dengue em indivíduos sintomáticos atendidos na
Rede pública de saúde de Goiânia – Goiás, durante o período epidêmico 2012-2013.
Palavras-chave: Dengue, caracterização molecular, Goiás
Título em outra língua: Identification and molecular characterization of dengue vírus in symptomatic
individuals seen in public basic health care of Goiânia – Goiás during the epidemic period 2012-2013.
Palavras-chave em outra língua: Dengue, molecular characterization, Goiás
Área de concentração: Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro
Data defesa: (dd/mm/aaaa) 18/07/2014
Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro
Orientador (a): Fabiola Souza Fiaccadori
E-mail: [email protected]
Co-orientador (a):* ------
E-mail: -----
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento:
Concorda com a liberação total do documento [ X ] SIM [ ] NÃO1
Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação.
O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de
conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.
_______________________________________ Data: ____ / ____ / ______
Assinatura do (a) autor (a)
1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste
prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão
disponibilizados durante o período de embargo.
iii
VANESSA NEIVA GUIMARÃES
Identificação e caracterização molecular do vírus dengue em
indivíduos sintomáticos atendidos na rede pública de saúde de
Goiânia – Goiás, durante o período epidêmico 2012-2013
Dissertação de Mestrado apresentado ao
Programa de Pós-Graduação em Biologia das
Relações Parasito-Hospedeiro da
Universidade Federal de Goiás para
obtenção do Título de Mestre
Orientador: Profa Dra Fabíola Souza
Fiaccadori
Goiânia
2014
iv
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação na (CIP)
GPT/BC/UFG
G963i
Guimarães, Vanessa Neiva.
Identificação e caracterização molecular do vírus dengue
em indivíduos sintomáticos atendidos na rede pública de
saúde de Goiânia – Goiás, durante o período epidêmico 2012-
2013 [manuscrito] / Vanessa Neiva Guimarães. - 2014.
92 f. : il.
Orientadora: Profª. Drª. Fabiola Souza Fiaccadori;
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2014.
Bibliografia.
Inclui lista de figuras, tabelas, quadros, gráficos e
símbolos, siglas e abreviaturas. Apêndices.
1. Dengue – Saúde pública – Goiás 2. Dengue –
Epidemiologia – Goiás 3. Dengue – Vigilância
epidemiológica – Goiás I. Título.
CDU: 578.42(817.3)
v
I
Programa de Pós-Graduação em Biologia das Relações Parasito-Hospedeiro da
Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno (a): Vanessa Neiva Guimarães
Orientador (a): Profa Dra Fabíola Souza Fiaccadori
Membros:
1. Profa Dra Menira Borges de Lima Dias e Souza
2. Profa Dra Divina das Dores de Paula Cardoso
3. Profa Dra Fabíola Souza Fiaccadori
Data: 18/07/2014
vi
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra. Fabiola Souza Fiaccadori, pela oportunidade
de aprendizado, pelo carinho e tempo dedicados a mim.
À minha mãe, por todo o amor incondicional e apoio, em todos os momentos
que precisei.
À minha tia, por acreditar no meu potencial e me apoiar sempre.
Ao meu noivo, pela doação constante de amor, dedicação e cumplicidade, e
por toda a paciência dedicada a mim.
Aos companheiros do Laboratório de Virologia Humana, pela ótima
convivência, pelos ensinamentos e trocas de experiências. Agradecimento especial ao
Marielton e à Keili, por toda a ajuda recebida, vocês foram essenciais para a conclusão
do projeto.
Aos funcionários dos Laboratórios de Análises Clínicas do CAIS Campinas,
CAIS Chácara do Governados, CAIS Cândida de Moraes, de fundamental importância
para a realização desse trabalho.
À minha banca de qualificação, Profa Dra Menira Borges de Lima Dias e
Souza, Profa Dra Márcia Alves Dias de Matos e Profa Dra Heloisa Helena Garcia da Silva,
por todas as contribuições para o benefício do trabalho.
À Profa Dra Megmar Aparecida dos Santos Carneiro, por sua disponilidade
em ajudar sempre que foi necessário.
A Deus, por me presentear com pessoas maravilhosas durante todo meu
trajeto e por me permitir a oportunidade da vida.
i
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1
1.1. Histórico ............................................................................................................. 1
1.2. Características gerais do vírus dengue ............................................................... 3
1.2.1. Classificação e estrutura ............................................................................. 3
1.2.2. Organização proteica .................................................................................. 5
1.2.3. Variabilidade genômica e antigênica .......................................................... 7
1.3. Vetor, Ciclo Biológico e Transmissão ............................................................... 9
1.4. Replicação viral ............................................................................................... 10
1.5. Patogênese da infecção .................................................................................... 11
1.6. Sintomatologia e conduta clínica ..................................................................... 14
1.7. Diagnóstico laboratorial ................................................................................... 17
1.8. Epidemiologia .................................................................................................. 20
1.9. Prevenção e controle ........................................................................................ 22
2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 26
3. OBJETIVOS............................................................................................................ 27
3.1. Objetivo Geral .................................................................................................. 27
3.2. Objetivos Específicos ...................................................................................... 27
4. METODOLOGIA ................................................................................................... 28
4.1. Delineamento do Estudo e População ............................................................. 28
4.2. Aspectos Éticos ................................................................................................ 28
4.2.1. Critérios de Inclusão ................................................................................. 28
4.2.2. Critérios de Exclusão ................................................................................ 29
4.3. Coleta de Dados e Amostras ............................................................................ 29
4.4. Metodologia ..................................................................................................... 30
4.4.1. Diagnóstico sorológico ............................................................................. 30
4.4.2. Detecção viral e Sorotipagem Molecular ................................................. 30
4.4.3. Genotipagem viral .................................................................................... 32
4.4.3.1. Sequenciamento genômico ................................................................ 33
4.4.4. Análise dos Dados .................................................................................... 34
5. RESULTADOS ....................................................................................................... 36
5.1. Características da população em estudo .......................................................... 36
ii
5.2. Infecção pelo DENV ........................................................................................ 38
5.3. Sorotipagem e genotipagem ............................................................................. 42
6. DISCUSSÃO ........................................................................................................... 46
7. CONCLUSÕES ....................................................................................................... 53
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 54
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática da partícula viral do DENV ................................. 4
Figura 2. Estrutura genômica do vírus dengue ................................................................. 5
Figura 3. Esquema ilustrativo da metodologia utilizada ................................................ 35
Figura 4. Análise filogenética Maximun Likelihood das sequências correspondentes à
junção E/NS1 isoladas de DENV1 em Goiânia de 2012-2013 pelo método de Jukes-
Cantor. ............................................................................................................................ 44
Figura 5. Análise filogenética Maximun Likelihood das sequências correspondentes à
junção E/NS1 isoladas de DENV4 em Goiânia de 2012-2013 pelo método de Jukes-
Cantor. ............................................................................................................................ 45
iv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características sociodemográficas da população estudada (N=278) .............. 37
Tabela 2. Características clínicas da população (N=278) .............................................. 38
Tabela 3. Distribuição dos marcadores para infecção por DENV em relação aos dias de
sintomas. ......................................................................................................................... 39
Tabela 4. Infecção por DENV em relação às características da população (N=278). .... 40
Tabela 5. Positividade para os marcadores de infecção em relação aos dias de sintomas
(N=278). ......................................................................................................................... 42
v
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Novos critérios utilizados pelo Brasil para classificação dos casos de dengue
........................................................................................................................................ 15
Quadro 2. Iniciadores utilizados para amplificação e tipagem dos vírus dengue (Lanciotti
et al. 1992). ..................................................................................................................... 31
Quadro 3. Iniciadores usados para amplificação da região E/NS1 (Domingo et al. 2011).
........................................................................................................................................ 32
vi
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Distribuição dos casos de infecção pelo DENV em relação ao período de coleta
(N=278) .......................................................................................................................... 41
Gráfico 2. Distribuição dos casos de infecção pelo DENV em relação à informação das
fichas epidemiológicas do SINAN (N=278). ................................................................. 41
vii
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
ADE – antibody dependent enhancement
Ae. - Aedes
CAIS – Centro de Atendimento Integral à Saúde
CEP – Comitê de Ética em Pesquisa
DC – dengue clássicas
DCC – dengue com complicações
DENV – vírus dengue
DENV1 – vírus dengue sorotipo 1
DENV2 – vírus dengue sorotipo 2
DENV3 – vírus dengue sorotipo 3
DENV4 – vírus dengue sorotipo 4
DENV5 – vírus dengue sorotipo 5
DEPC - dietilpirocarbonato
dsRNA – RNA fita dupla
DTT - ditiotreitol
EIE – ensaio imuno enzimático
ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EUA – Estados Unidos da América
Fc - porção efetora do anticorpo
FHD – febre hemorrágica do dengue
HP - haplótipo
IFN – intérferon
IgG – imunoglobulina G
IgM – imunoglobulina M
IL – interleucina
IPTSP – Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
Kb – quilobase
viii
kDa – quilo Dalton
MAC-ELISA - IgM antibody capture ELISA
µg - micrograma
µL - microlitro
nm – nanômetro
OMS – Organização Mundial de Saúde
ON – óxido nítrico
ORF – open reading frame
PAF – fator de ativaçào plaquetária
pb – pares de base
PAHO – Pan American Health Organization
PCR – reação em cadeia pela polimerase
pH – potencial de hidrogênio
RE – retículo endoplasmático
RER – retículo endoplasmático rugoso
RIDL® - (Release of Insects Carrying a Dominant Letal
RNA – ácido ribonucleico
RpRd – RNA polimerase RNA dependente
RT – transcriptase reversa
RT-PCR – reação em cadeia pela polimerase pós-transcrição reversa
SCD – síndrome do choque do dengue
SIM – Sistema de Informação sobre Mortalidade
SINAN - Sistema de Informação de Agravos de Notificações no Ministério da Saúde
ssRNA – single-stranded RNA
SUVISA - Superintendência de Vigilância em Saúde do Estado de Goiás
T.A. – temperatura ambiente
TBE – Tris/Borato/EDTA
TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TIE - Técnica do Inseto Estéril RIDL® (Release of Insects Carrying a Dominant Letal
ix
TNF – fator de necrose tumoral
UFG – Universidade Federal de Goiás
UTR – untranslated region
x
RESUMO
A dengue é um dos maiores desafios para a saúde pública no Brasil e no
mundo. O vírus dengue (DENV) é um arbovírus da família Flaviviridae, gênero
Flavivírus, classificado em quatro sorotipos antigenicamente distintos DENV1-4. Desde
a introdução do DENV1 em Goiás, o cenário da dengue consistiu de epidemias sucessivas
de dengue com alternância da predominância entre os sorotipos. Um dos fatores que têm
sido associados à patogênese desta infecção, é a ocorrência de uma resposta imune
sorotipo cruzada em infecções secundárias. Assim, a identificação dos sorotipos
circulantes, bem como a caracterização das variantes genômicas, têm sido consideradas
importantes na vigilância da doença, uma vez que a introdução de novas variantes pode
constituir um fator de risco para a gravidade da doença. Nesse contexto, o presente estudo
objetivou investigar a ocorrência de infecção pelo DENV em indivíduos atendidos em
unidades de saúde no município de Goiânia, Goiás no período epidêmico de 2012-2013,
utilizando métodos sorológicos e moleculares, para determinação do índice de
positividade e identificação dos sorotipos/genótipos do vírus circulantes. Para isso, foram
coletadas 278 amostras de indivíduos suspeitos de infecção pelo DENV, as quais foram
submetidas à pesquisa dos marcadores sorológicos NS1, IgM e IgG utilizando kit
comercial, bem como a detecção do RNA viral e identificação do sorotipo através de RT-
PCR para a região C-prM. A positividade para a infecção foi de 43,9%, com índices de
30,5%, 13,6% e 20,5%, para os marcadores NS1, IgM e RNA, respectivamente. Das 57
amostras RNA positivas, 31,5% eram DENV-1 e 68,5% DENV-4, as quais foram
submetidas ao seqüenciamento de nucleotídeos da região da junção E/NS1 para a
caracterização do genótipo viral. As análises filogenéticas classificaram as amostras
DENV1 como genótipo V, sendo observada a diferenciação em dois clados, podendo
refletir a ocorrência de variantes genéticas com diferenças na história evolutiva. Para as
amostras DENV4, classificadas como genótipo II, foi observada uma proximidade
filogenética entre os isolados deste estudo e outros isolados do país e América Latina.
Estes resultados demonstram a eficácia da combinação de metodologias no diagnóstico
desta infecção. Ainda, a avaliação molecular mostra-se fundamental para estabelecer uma
base de dados completa a ser utilizada para estudos de vigilância, colaborando com
investigações da dinâmica do vírus e o padrão esperado para as epidemias futuras.
i
ABSTRACT
Dengue is a major challenge to public health in Brazil and worldwide. Dengue
virus (DENV) is an arbovirus of the family Flaviviridae, genus Flavivirus, classified into
four antigenically distinct serotypes DENV1-4. Since the introduction of DENV1 in
Goiás, the current situation consisted of successive epidemics of dengue fever with
change among prevalence serotypes. One of the factors that have been associated with
the pathogenesis of this infection is the occurrence of a cross-serotype immune response
in secondary infections. Thus, the identification of circulating serotypes and also the
characterization of the genomic variants have been considered important on disease
surveillance, since the introduction of new variants can be a risk factor for severe dengue.
In this context, the present study aimed to investigate the occurrence of DENV infection
in individuals treated at health centers in Goiânia, Goiás in the epidemic period 2012-
2013, using serological and molecular methods for determining the rate of positivity and
identification of serotypes/genotypes in the circulating virus. For this, 278 samples from
suspected individuals of DENV infection, which were submitted to the research of
serological markers NS1, IgM and IgG using a commercial kit, as well as viral RNA
detection and serotype identification by RT-PCR for region C-prM. The positivity for
infection was 43.9%, with rates of 30.5%, 13.6% and 20.5% for NS1, IgM and RNA,
respectively. Considering the RNA-positive samples, 31.5% were DENV1 and 68,5%
were DENV4, which were subjected to nucleotide sequencing of the E/NS1 junction to
characterize the viral genotype. Phylogenetic analysis classified the DENV1 samples as
genotype V, that differentiated into two clades, which may reflect the occurrence of
genetic variants with differences in evolutionary history. For DENV4 samples, classified
as genotype II, was observed a phylogenetic proximity between the strains analyzed and
others strains of the country and Latin America. These results demonstrate the
effectiveness of the combination methods in the diagnosis of DENV infection. Still, the
molecular evaluation has proven crucial to establish a complete data base to be used for
surveillance studies, collaborating with investigations of the dynamics of the virus and
the expected profile for future epidemics.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Histórico
Registros antigos datados de 265 d.C., na China, relatam eventos compatíveis
com quadros clínicos de infecção pelo vírus dengue (DENV). A doença foi chamada de
“veneno da água”, pois sua transmissão foi associada à presença de insetos voadores
relacionados à água (Nobuchi 1979 apud Gubler 1998).
Surtos compatíveis com infecção pelo vírus dengue ocorreram nas Antilhas
Francesas e no Panamá, no século XVII. O mesmo sucedeu no século seguinte, com
relatos de epidemias de dengue em algumas regiões da Ásia, África e da América do
Norte, entre 1779 e 1780. Esses acontecimentos, quase simultâneos nos três continentes,
já se apresentariam como um indicativo de que o vírus e seu vetor teriam uma ampla
distribuição nos trópicos há mais de 200 anos (Gubler 1998, Petersen & Marfin 2005).
Em 1907, dois oficiais médicos das Forças Armadas Americanas foram
enviados às Filipinas para pesquisarem as causas dessa patologia. Suas conclusões foram
que a doença – infecciosa, porém não contagiosa - era causada por um elemento não
filtrável, ficando assim indicado pela primeira vez que o agente etiológico da dengue era
um vírus (Ashburn & Craig 1907). Em 1931, Simmons et al. descreveram a relação entre
a transmissão do vírus dengue e a presença do mosquito Aedes albopictus (Skuse 1894),
encontrando similaridade com o ciclo do vírus amarílico (Simmons et al. 1931 apud
Henchal & Putnak 1990).
Na década de 1940, o vírus dengue foi isolado de pacientes infectados, a partir
das descobertas iniciais feitas por Kimura (1943) e Hotta (1944), seguidos por estudos de
Sabin e Schlesinger (1952). A primeira cepa foi denominada Havaí, e com a descoberta
da segunda cepa (Nova Guiné) pôde-se observar que as mesmas possuíam algumas
características antigênicas diferentes, passando a ser consideradas sorotipos de um
mesmo vírus. Em 1956 novos sorotipos foram isolados durante uma epidemia de dengue
no Sudeste Asiático, passando o complexo dengue a ser formado por quatro sorotipos
virais, denominados DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4 (Henchal & Putnak 1990).
2
Embora a transmissão do vírus dengue tenha sido inicialmente relacionada ao
Ae. albopictus, foi com o Aedes aegypti (Linnaeus 1762), atualmente o principal vetor do
DENV, que o mesmo se propagou com eficiência. A expansão territorial do Ae. aegypti
iniciou-se com o tráfico de escravos originários da África, entre os séculos XV e XIX,
expansão essa limitada às regiões tropicais (Soper 1967). Antes da II Guerra Mundial, as
regiões afetadas apresentavam epidemias esporádicas, entretanto, a guerra proporcionou
uma situação favorável para o aumento das regiões afetadas pelo vetor, bem como pelo
agente. Durante esse período bélico, a dengue afetava todos os grupos envolvidos na
guerra e assim, centenas de soldados foram infectados (Gubler 1997 apud Gubler 2011).
A epidemiologia global e a dinâmica da transmissão da doença se
modificaram drasticamente no Sudeste da Ásia. A alteração na ecologia, causada pela
guerra, favoreceu a expansão geográfica do mosquito, aumentou a densidade vetorial, e
o movimento acelerado das tropas espalhou o vírus entre as populações. Ao final da
guerra, vários países asiáticos se tornaram hiperendêmicos, ou seja, apresentavam em seu
território a cocirculação de diferentes sorotipos virais (Sabin 1952 apud Gubler 2011,
Gubler 1997 apud Gubler 2011).
Na década de 1950, os surtos da doença se tornaram mais graves e frequentes,
sendo suas versões hemorrágicas e suas complicações reconhecidas pela primeira vez nos
países do Sudeste Asiático (Cohen & Halstead 1966). Esses países começaram a expandir
sua economia e a ter um crescimento urbano considerável, embora não planejado, o que
propiciou condições ideais para que o vírus dengue e seu vetor Ae. aegypti se instalassem
com sucesso nas áreas urbanas (Gubler 2012). Assim, a forma hemorrágica foi
identificada durante as epidemias de dengue ocorridas nas Filipinas (1953-1954),
Tailândia e Bangkok (1958), seguidas, na década de 1960, por epidemias em Singapura,
Malásia e Vietnam e, em 1970, na Indonésia e Myanmar (Cohen & Halstead 1966,
Hammon 1973 apud Gubler 2011).
Nas Américas, as epidemias de dengue foram raras entre os anos de 1950 e
1970. Nesse período houve controle efetivo do vetor pelo programa de erradicação da
Febre Amarela, financiado pela Pan American Health Organization (PAHO) (Gubler
1998, Guzman & Kouri 2003). A partir de 1970 as epidemias de dengue se expandiram
regionalmente e globalmente, aumentando suas frequências e magnitudes. O vírus dengue
se tornou hiperendêmico na maioria das grandes cidades dos trópicos (Gubler 2012). O
3
programa do controle do vetor no continente americano encerrou-se em 1970, permitindo
a reintrodução do mosquito nos países tropicais do continente juntamente com a
reintrodução dos quatro sorotipos virais do DENV (Petersen & Marfin 2005).
A partir de então, a distribuição territorial do vetor aumentou
consideravelmente e, desta forma, o vírus se tornou endêmico em vários países ocidentais,
levando-os a epidemias por múltiplos sorotipos virais (Ross 2010). Os principais fatores
que contribuíram para esse aumento exacerbado foram: o crescimento da população
mundial, a urbanização não planejada e não controlada, a ausência de um programa de
controle do vetor em regiões endêmicas, o crescimento de viagens aéreas proporcionando
um intercâmbio de patógenos entre os diversos centros populacionais no mundo,
alterações climáticas, mudanças no comportamento do vetor e a ausência políticas de
saúde pública organizadas (Gubler 1998, Guzman & Kouri 2003, Gubler 2011).
1.2. Características gerais do vírus dengue
1.2.1. Classificação e estrutura
A família Flaviviridae é formada por uma diversidade de vírus capazes de
infectar humanos e outras espécies animais. Esta família compreende os gêneros
Flavivirus, Pegivirus, Pestivirus e Hepacivirus, sendo o gênero Flavivirus o que
apresenta maior número de espécies (ICTV 2013). O vírus dengue pertence ao gênero
Flavivirus, o qual é composto por mais de 53 espécies, que podem ser transmitidas aos
humanos através de vetores artrópodes, e apresentam ampla distribuição global
(Lindenbach et al. 2007, Domingo et al. 2011, ICTV 2013). Os vírus deste gênero estão
associados a uma diversidade de doenças, como quadros febris brandos, febres
hemorrágicas e encefalites. Seus principais representantes são os vírus dengue, vírus da
febre amarela, vírus do Nilo Ocidental e o vírus da encefalite japonesa (Lindenbach et al.
2007). Dentre estes, o DENV é o representante que mais se destaca em número de casos
de doenças e de mortalidade (Mukhopadhyay et al. 2005).
O DENV está classificado em quatro sorotipos geneticamente relacionados,
mas antigenicamente distintos, denominados DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4. Esses
sorotipos são bem caracterizados e possuem cerca de 65% de homologia de seu genoma,
sendo cada um considerado uma espécie distinta (Murphy et al. 1995 apud Kuno et al.
4
1998, Guzman et al. 2010a). Através análises moleculares, grupos distintos, que se
diferenciavam em até 6% de seu genoma, foram identificados dentro de cada sorotipo, e
um novo nível de classificação foi proposto, agora definidos como genótipos (Rico-Hesse
1990).
Há ainda a proposição de um novo sorotipo viral proveniente de um surto
ocorrido na Tailândia em 2007. Após sequenciamento genômico completo de uma
amostra isolada de um paciente com quadro grave de dengue, inicialmente suspeito de
infecção pelo DENV4, verificou-se a existência de diferenças significativas, levando à
proposição de um novo sorotipo denominado DENV5. Pouco ainda é conhecido sobre o
novo sorotipo, entretanto, análises preliminares demonstraram maior proximidade ao
sorotipo DENV4 (Normile 2013, Mamani 2014).
A partícula do vírus dengue possui cerca de 40-60 nanômetros (nm) de
diâmetro e morfologia esférica. O vírus é envelopado, apresentando uma bicamada
lipídica à qual estão incorporadas a glicoproteína E, a proteína M e pequenos resíduos da
proteína prM. O envelope circunda o nucleocapsídeo, por sua vez constituído pelo
capsídeo proteico de simetria icosaédrica, formado por múltiplas cópias da proteína C e
uma única molécula linear de RNA (ssRNA) com polaridade positiva (Figura 1) (Russell
et al. 1980 apud Lindenbach & Rice 2003, Chambers et al. 1990).
Figura 1. Representação esquemática da partícula viral do DENV
Fonte: ViralZone 2011 - Modificado
5
O genoma viral, com cerca de 11 kilobases (Kb), apresenta uma única região
de leitura aberta (ORF – Open Reading Frame), que é flanqueada pelas regiões 5’e 3’ não
codificantes (5´UTR/3´UTR – Untranslated Region) participantes na regulação da
tradução e replicação do genoma. A ORF codifica uma poliproteína de 3386 a 3434
aminoácidos, a qual sofre clivagens sucessivas e origina as proteínas estruturais e não
estruturais (Chambers et al. 1990, Lindenbach & Rice 2003). Partindo da extremidade
amino-terminal do RNA inicia-se a codificação das proteínas estruturais: proteína do
capsídeo (C), proteína premembrana e membrana (prM/M) e a proteína do envelope (E);
e em seguida, as não estruturais (NS1/NS2A/NS2B/NS3/NS4A/NS4B/NS5), que atuam
em diversas etapas do processo de replicação viral (Figura 2) (Mackow et al. 1987, Mandl
et al. 1988, Mukhopadhyay et al. 2005, Lindenbach et al. 2007, Domingo et al. 2011).
1.2.2. Organização proteica
Constituinte do capsídeo viral, a proteína C possui aproximadamente 11kDa.
Suas extremidades possuem resíduos carregados (hidrofílica) enquanto a parte interna é
hidrofóbica. O domínio hidrofóbico é clivado na proteína C madura, que se compacta em
dímeros. Estes dímeros se associam para a formação final do nucleocapsídeo, sendo
proposto que esta ocorra a partir de uma interação entre os dímeros e o RNA viral, com
possível envolvimento da proteína prM (Ma et al. 2004, Kiermayir et al. 2004,
Lindenbach et al. 2007).
A proteína M (glicoproteína de membrana) possui como precursora a prM, de
tamanho aproximado de 26kDa. Esta é translocada para o retículo endoplasmático por
associação ao domínio hidrofóbico da proteína C. Sua principal função é de proteção à
proteína E durante a via secretora da patícula viral. É nesta via que a prM é clivada em pr
Figura 2. Estrutura genômica do vírus dengue
Fonte: Guzman et al. 2010
6
e M através de enzimas residentes no Complexo de Golgi. Assim, a fração pr é secretada
enquanto a fração M participará do vírus maduro (Murray et al. 1993, Stocks & Logibs
1998, Lindenbach & Rice 2003).
A glicoproteína do envelope viral, proteína E, constitui a maior proteína do
DENV possuindo 53kDa. Apresenta-se na forma de espículas projetadas da camada
lipídica do envelope viral, com cerca de 180 cópias, sendo responsável por mediar a
ligação da partícula viral aos receptores da célula hospedeira, pela fusão do envelope viral
à membrana da vesícula endocítica e também participa da montagem do vírus. É o
principal determinante antigênico da partícula viral e sua secreção é dependente da
coexpressão do complexo prM (Zhao et al. 1986, Konishi & Mason 1993, Heinz &
Allison 2001).
As proteínas não estruturais desenvolvem importante papel nas etapas do
ciclo de replicação viral. Neste contexto, a glicoproteína NS1 (46kDa) se concentra nas
regiões de replicação do RNA viral junto ao dsRNA ou aos complexos de replicação.
Aparenta ter um papel importante, embora não completamente elucidado, como cofator
na replicação do material genético. Também pode estar presente na superfície celular e
ser secretada pela célula infectada (Mackow et al. 1987, Lindenbach & Rice 1999,
Lindenbach et al. 2007).
Durante a fase inicial da infecção, tanto a forma solúvel da NS1 quanto a sua
forma anexada à membrana celular geram uma resposta imune humoral significativa no
hospedeiro e assim, os anticorpos produzidos podem levar à lise da célula infectada
mediada por ação do sistema complemento e participar na patogênese da infecção
(Schlesinger et al. 1993, Chang et al. 2002, Lindenbach & Rice 2003). Além do caráter
imunogênico, a porção secretada da NS1 constitui um importante marcador da infecção
pelo DENV, tanto em infecções primárias quanto em infecções secundárias, tendo seus
picos nos primeiros dias após o início dos sintomas da doença, podendo chegar até os
níveis de 50g/mL de soro (Young et al. 2000, Lindenbach & Rice 2003, Vazques et al.
2010).
A proteína NS2A (22kDa) é hidrofóbica e possui mais de um função: se
associa ao complexo de replicação do material genético; é importante para a montagem
da partícula viral e atua como antagonista do interferons e através da inibição da
7
sinalização gerada pelos mesmos (Mackenzie et al. 1998, Kümmere & Rice 2002, Leung
et al. 2008). A proteína NS2B, com 14kDa, é uma proteína associada à membrana,
formando um dímero com a NS3 e agindo como um cofator para a serina protease NS2B-
NS3 (Falgout et al. 1991).
Caracterizada como uma proteína multifuncional, a proteína NS3 (70kDa)
desenvolve funções no processamento da poliproteína, clivando-a, bem como na
replicação do RNA viral (função de RNA nucleosídeo trifosfatase, helicase e RNA
trifosfatase). Esta proteína parece estar associada à atividade apoptótica gerada em células
de mamíferos, aparentemente pela ativação da caspase 8 (Mackow et al. 1987, Wengler
& Wengler 1993, Lindenbach et al. 2007).
As proteínas NS4A (16kDa) e NS4B (27kDa) são hidrofóbicas e capazes de
bloquear a sinalização gerada pelo interferon tipo I. Ademais, NS4A se associa à proteína
NS1 e parece estar intimamente relacionada à replicação do genoma viral e NS4B
aparenta ser uma proteína de membrana politópica (Mackenzie et al. 1998, Lindenbach
& Rice 1999, Muñoz-Jordan et al. 2003).
Definida como a maior das proteínas não estruturais, a proteína NS5
(103kDa) é altamente conservada e com função de metiltransferase e RNA polimerase
RNA dependente (RpRd). Sua atividade como polimerase justifica a presença desta
proteína em sítios de replicação do RNA viral. É capaz de induzir a transcrição e secreção
de IL-8, auxiliando na propagação viral no hospedeiro através do recrutamento de células
inflamatórias para o sítio de infecção (Ackermann & Padmanabhan 2001, Medin et al.
2005).
1.2.3. Variabilidade genômica e antigênica
Como já mencionado, o vírus dengue possui quatro sorotipos bem
caracterizados que possuem cerca de 65% de homologia de seu genoma e se diferem
antigenicamente, sendo cada um considerado uma espécie distinta (Murphy et al. 1995
apud Kuno et al. 1998, Guzman et al. 2010a).
Estudos genéticos possibilitaram verificar a homologia entre os quatro
sorotipos virais, assim como demonstraram haver diferenças entre isolados de um mesmo
sorotipo. Análises evolutivas permitiram a caracterização mais precisa desses isolados,
8
que passaram então a ser classificados como genótipos (Rico-Hesse 1990, Holmes &
Twiddy 2003).
De acordo com Rico-Hesse (1990), os genótipos são grupos do DENV que
diferem em até 6% na sequência genômica na região da junção E/NS1, e que podem ser
agrupados de acordo com áreas epidemiológicas. Essa região demonstra uma taxa de
mutação uniforme, sem que a região hipervariável consiga alterar os epítopos
imunogênicos, sendo considerada uma região que apresenta elementos suficientes para a
caracterização dos genótipos (Rico-Hesse 1990).
Alguns autores utilizam o sequenciamento do gene E completo para realizar
estudos relacionados com a filogenia do vírus, como datação de amostras e evolução
molecular, podendo também ser utilizado para genotipagem dos sorotipos. A
genotipagem realizada através do gene E é compatível com a genotipagem encontrada
utilizando-se a junção E/NS1 (Klunhthong et al. 2004, Souza et al. 2011, Costa et al.
2012).
DENV1 possui cinco genótipos relatados: I (Sudeste Asiático, China e Leste
da África), II (Tailândia), III (Malásia), IV (Pacífico Sul) e V (América e África) (Rico-
Hesse 1990, Weaver & Vasilakis 2009, Mendez et al. 2010).
DENV2 possui seis genótipos relatados: I (subdivido entre genótipo 1 da Ásia
e genótipo 2 da Ásia), II (Cosmopolita), III (América), IV (Sudeste da Ásia e América) e
V (Silvestre) (Rico-Hesse et al. 1997, Twiddy et al. 2002, Weaver & Vasilakis 2009).
DENV3 possui quatro genótipos relatados: I (Indonésia, Malásia e Filipinas),
II (Tailândia, Vietnã e Bangladesh), III (Sri Lanka. India, África e Samoa), IV (Porto
Rico, América Central, América Latina) (Weaver & Vasilakis 2009).
DENV4 possui quatro genótipos relatados: I (Tailândia, Filipinas, Sri Lanka
e Japão), II (Indonésia, Malásia, Taiti, Caribe e América), III (Amostras da Tailândia que
diferem de outros isolados), e silvestre (Malásia) (Lanciotti et al. 1997, Klungthong et al.
2004, Weaver & Vasilakis 2009).
9
1.3. Vetor, Ciclo Biológico e Transmissão
O DENV é o princial patógeno humano transmitido por vetores artrópodes,
transmissão essa associada à picada de fêmeas dos mosquitos pertencentes ao gênero
Aedes, subgênero Stegomya, tais como o Ae. aegypti, Ae. albopictus, Ae. polynesiensis ou
Ae. scutellaris, cada uma destas com ecologia, comportamento e distribuição geográfica
particulares (Gubler 1998, Bente & Rico-Hesse 2006).
O Ae. aegypti, originário da África, é a principal espécie vetor do vírus nas
Américas, mantendo o ciclo urbano da transmissão homem-vetor-homem. Esta espécie
se estabeleceu nas regiões tropicais e subtropicais e é a única altamente adaptada ao
ambiente doméstico, apresentando acentuada antropofilia (Cristophers 1960, Scott et al.
2000, San Martín et al. 2010).
Os espécimes de Aedes aegypti são pequenos, de cor escura, rajado de branco
nas patas e corpo, muito bem adaptado ao ambiente doméstico e faz sua ovoposição
preferencialmente em depósitos artificiais que acumulem água, localizados ao redor de
casas como vasos de plantas, reservatórios de água, materiais plásticos descartados
incorretamente, pneus, entre outros (Cristophers 1960, Bentley & Day 1989, Gubler &
Meltzer 1999 apud Chua 2005). Os ovos são depositados próximo à superfície da água e,
após embrionados, podem permanecer viáveis por vários meses em baixa umidade (Trpis
1972, Silva & Silva 1999, Russell et al. 2001). Os mosquitos adultos preferem permanecer
no interior das casas, agem de forma discreta e as fêmeas se alimentam de sangue durante
o período diurno (Gubler 1998).
A fêmea do mosquito possui um comportamento melindroso durante a
alimentação, podendo interromper o repasto sanguíneo facilmente, gerando dessa forma
uma necessidade de picar várias pessoas até que tenha se alimentado o suficiente. Este
comportamento, caso a fêmea esteja infectada pelo DENV, aumenta o número de
humanos sob o risco de infecção pelo vírus e faz dessa espécie um vetor eficiente (Platt
et al. 1997, Scott et al. 1997 apud Gubler 1998).
Assim, a transmissão do DENV se faz pela picada de mosquitos fêmeas do
gênero Aedes, compreendendo duas fases: uma extrínseca, no hospedeiro invertebrado, e
outra intrínseca, no hospedeiro vertebrado. Quando um indivíduo é picado por um
mosquito infectado, após um período de incubação intrínseca que dura de três a 14 dias,
10
inicia-se uma fase febril com sintomas inespecíficos. Durante a fase febril, o hospedeiro
apresenta viremia periférica podendo, ao ser picado por outro mosquito do gênero Aedes,
transmitir o vírus para o mesmo (Gubler et al. 1981). As partículas virais infectam as
células do trato intestinal do inseto e, após o período de incubação extrínseca, que varia
de oito a 12 dias, se acumulam nas glândulas salivares do mesmo, tornando-o apto a
transmitir o vírus a outros hospedeiros susceptíveis (Watts et al. 1987, Gubler 1998).
O Ae. Albopictus é considerado o vetor secundário da doença e está em atual
expansão territorial nas regiões de clima temperado (Morens & Fauci 2008).
Originalmente demonstra hábitos silvestres, dificilmente entrando nas casas e não
apresentando uma antropofilia tão acentuada quanto o Ae. aegypti, e, embora esteja
presente nas Américas, ainda não foi associado à transmissão de dengue no Brasil
(Teixeira et al. 1999, Tauil 2001). Entretanto, estudos vêm demonstrando o poder de
adaptação do Ae. albopictus ao ambiente urbano e sua possível potencialidade como vetor
de arboviroses no Brasil (Martins et al. 2006, Silva et al. 2006, Martins et al. 2010).
1.4. Replicação viral
Após a entrada do vírus em um hospedeiro humano, ocorre a interação deste
com a célula alvo, monócitos, macrófagos ou células dendríticas (hospedeira), por meio
da adsorção da glicorproteína E aos receptores da superfície celular, induzindo a
endocitose da partícula viral. Dentro do endossomo, o baixo pH endossomal induz uma
trimerização irreversível da proteína E, levando à fusão das membranas viral e celular,
resultando na liberação do nucleocapsídeo viral no citoplasma, onde ocorre o
desnudamento do genoma viral (Mukhopadhyay et al. 2005; Ross 2010).
No retículo endoplasmático rugoso (RER) o RNA viral é traduzido
codificando a poliproteína viral a qual é processada por proteases virais e celulares
originando as proteínas estruturais e não estruturais maduras. Para a replicação do genoma
viral, um complexo protéico constituído pela proteína NS5 (RpRd), as proteínas NS
acessórias e ainda fatores celulares, associam-se ao RNA viral. O primeiro passo envolve
a síntese de uma molécula de polaridade negativa de RNA que servirá então como molde
para a síntese de cópias do RNA viral polaridade positiva que constituirão a progênie
viral, processo descrito como semiconservado e assimétrico (Lindenbach et al. 2007).
11
A montagem das novas partículas do vírus ocorre na superfície do retículo
endoplasmático (RE), desta forma as proteínas estruturais e as cópias do RNA serão
sintetizadas no lúmen do RE. As partículas imaturas do vírus são transportadas pela via
de secreção do complexo de Golgi e, durante este transporte, as partículas imaturas sofrem
clivagens do complexo prM por proteases da células hospedeira, resultando em partículas
virais maturas e infecciosas, que serão liberadas através do processo de exocitose.
Durante esse processo o núcleo capsídeo viral irá adquirir uma parte da membrana celular
do hospedeiro, formando assim o envelope viral (Lindenbach & Rice 2003,
Mukhopadhyay et al. 2005, Lindenbach et al. 2007, Ross 2010).
1.5. Patogênese da infecção
Após a picada de um mosquito infectado por DENV, os vírus presentes na
saliva do inseto são inoculados no hospedeiro e então podem ser isolados de monócitos
circulantes ou células dendríticas imaturas presentes no tecido epitelial, considerados os
principais alvos para a replicação viral (Marovich et al. 2001). Estas células migram para
os linfonodos locais ou regionais, onde apresentarão os antígenos virais para as células T,
dando início às respostas imunes celular e humoral. Há evidências ainda de vasta
replicação viral em células do parênquima hepático e em macrófagos presentes em
linfonodos, fígado e baço, assim como em monócitos circulantes do sangue periférico
(Hall et al. 1991, Taweechaisupspong et al. 1996, Marovich et al. 2001, Jessie et al. 2004).
A ativação de células alvo pelo vírus induz à liberação de citocinas e
mediadores químicos, entretanto o perfil destes componentes durante infecções por
DENV ainda não está claro e permanece como objeto de estudo. De uma forma geral, a
resposta inicial do sistema imune às infecções virais é mediada pelos interferons (INF):
os INF tipo 1, INF e INFque atuam no controle da replicação viral, enquanto o INF
modula a produção de mediadores inflamatórios e partículas antivirais. Estudos vêm
demonstrando que os IFN tipo I possuem uma pequena ação protetora estabilizando a
barreira endotelial, enquanto o IFN apresenta um efeito contrário sendo responsável por
aumentar a permeabilidade do endotélio causando, assim, extravasamento plasmático,
que por sua vez é fundamental para a gravidade da doença (Kurane & Ennis 1994, Dewi
et al. 2004, Espada-Murao & Morita 2011). Células dendríticas infectadas pelo DENV
produzem IFN e TNF(fator de necrose tumoral), sendo que a produção de TNF é
12
maior em indivíduos que desenvolvem dengue com perfil hemorragico (Ho et al. 2001).
O TNF estimula as células do endotélio vascular e monócitos a libertar fator de ativação
plaquetária (PAF) e óxido nítrico (ON), o que contribui para o aumento da permeabilidade
vascular e extravasamento do plasma. Este feito é em parte reprimido pela produção de
IFN, entretanto a queda dos níveis de INFdurante o curso da infecção permite que as
células endoteliais se tornem sensíveis aos efeitos do TNF (Liu et al. 2009). Outras
citocinas, como IL-4 (interleucina), IL-6 e IL-8 parecem estar aumentadas nos casos de
dengue com quadros hemorrágicos se comparadas aos níveis encontrados em pacientes
com dengue sem complicações. A IL-4 ainda parece se associar ao TFNcriando um
efeito sinérgico no sentido de aumentar a permeabilidade do tecido endotelial (Beynon et
al. 1993).
A suscetibilidade ao DENV é universal e a infecção natural por qualquer um
dos quatro sorotipos do vírus produz imunidade duradoura contra um mesmo sorotipo
específico (homóloga) e uma imunidade cruzada (heterotípica) protetora por um curto
período, aproximadamente de três a seis meses (Sabin 1952). A imunidade heterotípica
de curta duração ocorre devido a anticorpos contra a proteína E, que declinam com o
tempo e permitem que o indivíduo se torne suscetível aos sorotipos DENV pelos quais
não foi infectado (Whitehorn & Simmons 2011). Assim, a resposta imunológica à
infecção por dengue pode ser primária ou secundária. Na resposta primária a produção de
anticorpos IgM anti-DENV inicia-se entre o segundo e quarto dia após o início dos
sintomas e atinge seu pico plasmático em média com 15 dias, enquanto os anticorpos da
classe IgG começam a ser detectados no soro do paciente com cerca de 15 dias do início
da doença. Em infecções secundárias os níveis de IgM permanecem presentes por um
período de menor duração e os níveis de IgG podem aumentar precocemente atingindo
níveis mais elevado que na primo-infecção (Koraka et al. 2001).
Ao longo dos anos, esforços no sentido de elucidar os fatores que teriam papel
no desenvolvimento de casos graves de infecções por dengue têm sido conduzidos. Neste
cenário algumas teorias foram descritas visando definir a patogenia dos casos graves das
infecções pelo DENV. A primeira refere-se à infecção sequencial por outro sorotipo, na
qual a infecção por um sorotipo do DENV gera uma memória imunológica heterotípica e
temporária contra os outros sorotipos virais, essa memória imunológica é não
neutralizante e pode permitir que a entrada do vírus nos macrófagos e monócitos seja
13
facilitada. Essa hipótese, inicialmente postulada por Halstead (1970), é chamada de
fenômeno da facilitação da penetração viral em macrófagos mediada por anticorpos
(antibody dependent enhancement - ADE) e sugere que a gravidade da doença esteja
relacionada à presença de anticorpos heterotípicos contra o DENV, já que o risco de
desenvolver o quadro hemorrágico da dengue aumenta em infecção secundária pelo
DENV e em crianças de até um ano de idade que possuem anticorpos contra o vírus
dengue adquiridos verticalmente de suas mães (Halstead 1970, Kliks et al. 1988. Ng et
al. 2014). Estudo de Gibbons et al. (2007) demonstra, entretanto, que o risco de
desenvolver formas hemorrágicas da doença não permanece em infecções terciárias, ou
até mesmo quaternárias, por DENV.
Segundo a teoria ADE, a partícula viral se associa aos anticorpos
preexistentes e heterotípicos gerando uma sinalização, através dos receptores Fc (porção
efetora do anticorpo), para a sua fagocitose por células mononucleares e, paradoxalmente,
amplificam a infecção. Esse mecanismo aumenta o número de antígenos presentes nas
células infectadas, podendo levar à ativação de linfócitos T de memória específicos para
o sorotipo DENV da infecção anterior, capazes de gerar uma resposta imune cruzada
(Kurane et al. 1991). O mecanismo ainda cria uma cascata de autoamplificação que pode
levar à liberação acentuada de citocinas e mediadores químicos aptos a causar o
extravasamento de plasma, como IFN TNFe IL-2 (Kliks et al. 1989, Green et al. 1999,
Voughn 2000). Estudo de Burke-Gaffney & Keenan (1993) demonstrou in vitro que o
IFN e o TNF podem aumentar a permeabilidade de células endoteliais, sendo o mesmo
efeito observado com altos níveis de IL-2, esses mediadores químicos podem ser um dos
fatores responsáveis pelos episódios hemorrágicos nos casos de dengue grave (Halstead
1989, Kurane et al.1991, Burke-Gaffney & Keenan 1993).
A teoria ADE isolada não é capaz de esclarecer todos os fatores associados à
manifestação das formas hemorrágicas e severas, visto que indivíduos com infecção
primária também podem evoluir para quadros clínicos graves e apenas uma parte da
população infectada pelo vírus dengue uma segunda vez desenvolvem quadros graves da
doença (Scott et al. 1976, Watts et al. 1999). Assim, outro fator fortemente associado aos
casos graves é a virulência do isolado em questão. Epidemias em que ocorrem grande
número de casos graves da doença costumam estar associadas a variantes específicas do
DENV, como, por exemplo, o genótipo Ásia/América do DENV2, que apresenta uma
14
adaptação melhor ao vetor que o genótipo americano do DENV2, e que foi responsável
por uma grande epidemia de casos hemorrágicos de dengue em Cuba (Rico-Hesse et al.
1997). As características virais possíveis de estarem associadas com a virulência da cepa
são: habilidade de infectar um número maior de células, capacidade de gerar uma
progênie maior, capacidade de causar reações inflamatórias mais graves e evasão da
resposta imune do hospedeiro. Essas características são variáveis entre os diversos
genótipos existentes de DENV (McBride & Bielefeldt-Ohmann 2000, Vasilakis &
Weaver 2008).
Fatores intrínsecos do hospedeiro (idade, gênero, estado nutricional, doenças
crônicas) também são variáveis que devem ser consideradas no complexo mecanismo de
evolução para quadros graves de infecções por dengue. A idade aparece como um fator
preocupante, quanto mais jovem o paciente maior a possibilidade de desenvolver quadro
clínico hemorrágico e agravos, sendo as crianças entre um a quatro anos de idade um
grupo de alto risco (Gamble et al. 2000). O gênero feminino também demonstra ser mais
passível a desenvolver casos graves de dengue, hipoteticamente devido a fatores
fisiológicos (endotélio mais suscetível à permeabilidade vascular) ou imunológicos
(resposta imune aparentemente mais forte que a apresentada por homens) (Halsted 1997,
Anders et al. 2011). Entretanto mais estudos são necessários para compreensão da
verdadeira correlação destes fatores. A presença de comorbidades nos indivíduos
infectados também se mostra como um fator de risco, embora ainda não completamente
estabelecida a sua real associação (Whitehorn & Simmons 2011).
1.6. Sintomatologia e conduta clínica
Até o ano 2013, o Brasil seguiu uma classificação proposta em 1997 pela
Organização Mundial de Saúde (OMS), na qual os quadros sintomáticos de infecções pelo
DENV eram classificados como dengue clássica (DC) e febre hemorrágica do dengue
(FDH), sendo esta última possível de se agravar e evoluir para a síndrome do choque do
dengue (SCD). Adicionalmente, o Ministério da Saúde inclui uma quarta classificação,
dengue com complicações (DCC), para os casos que não se enquadravam nos critérios da
OMS para FHD e para os quais a classificação para DC era insatisfatória (WHO 1997,
Brasil 2009).
15
Entretanto, em 2009 a OMS propôs um novo esquema de classificação, com
o objetivo de torná-la mais simples e prática, tornando-se mais favorável no que se refere
à gestão dos casos e para a vigilância da doença. A nova proposta classifica os casos de
dengue em: dengue, dengue com sinais de alarme e dengue grave. A partir de 2014 o
Brasil adotou esta nova classificação para os casos de dengue, seguindo os critérios
apresentados no Quadro 1 (WHO 2009, Brasil 2014).
Quadro 1. Novos critérios utilizados pelo Brasil para classificação dos casos de dengue
Dengue
Indivíduos que vivam ou tenham viajados nos últimos 14 dias
para áreas com transmissão ou presença do Ae. aegypti,
apresentando febre entre 2 e 7 dias e que possuam dois ou mais
dos seguintes sintomas: náusea, vômito, enxantema, mialgia,
artralgia, cefaleia, dor retroorbital, petéquias ou prova do laço
positiva e leucopenia
Dengue com sinais
de alarme
Casos de dengue que, no período de defervescência da febre,
apresentem um ou mais dos sinais de alarme: dor abdominal
intensa e contínua ou dor a palpação de abdome, vômitos
persistentes, acumulação de líquidos (ascites, derrame pleural ou
pericárdico), sangramento de mucosas, letargia ou irritabilidade,
hipotensão postural, hepatomegalia maior do que 2cm, aumento
progressivo do hematócrito.
Dengue grave
Casos de dengue que apresentem uma ou mais das seguintes
condições: choque, devido ao extravasamento grave de plasmo
evidenciado por taquicardia, extremidades frias e tempo de
enchimento capilar igual ou maior a três segundos, pulso débil
ou indetectável, pressão diferencial convergente < 20mm Hg,
hipotensão arterial em fase tardia, acumulação de líquidos com
insuficiência respiratória; sangramento grave, segundo a
avaliação médica (exemplos: hematêmese, melena, metrorragia
volumosa); comprometimento grave de órgãos, exemplo: dano
hepático importante (enzimas transaminases hepáticas > 1000),
alteração de consciência, miocardite.
O quadro clínico apresentado na infecção pelos diferentes sorotipos do
DENV é de amplo espectro e evolução variável, podendo cursar desde formas
assintomáticas, febre indiferenciada e autolimitada, até formas graves com apresentação
de quadros hemorrágicos com possibilidade de evolução para choque e óbito, sendo difícil
delimitar a transição de um quadro clássico para um quadro grave (WHO 2009).
A dengue, em sua forma sem complicações, constitui uma doença
autolimitada e geralmente com evolução espontânea para a cura. A fase aguda da doença
16
varia de três a sete dias, porém a fase convalescente pode ser acompanhada de grande
debilidade física e se prolongar por semanas (Gubler 1998). Pode se apresentar com início
abrupto, sendo a febre alta (acima de 38,5o C) a manifestação mais frequentemente
descrita, acompanhada de cefaleia, prostração, mialgia, artralgia, dor retrorbital, fotofobia
e linfadenopatia, com erupções cutâneas pruriginosas afetando cerca de 50% dos
pacientes (Hayes & Gubler 1992, Gould & Solomon 2008). Outros sintomas relatados
são dores ósseas, vômitos e náuseas, podendo haver anorexia, alteração de paladar e leve
dor de garganta. Frequentemente há uma fraqueza e apatia prolongada (Gubler 1998) e
pode haver prurido intenso seguido de descamação da palma das mãos e sola dos pés.
Achados laboratoriais compatíveis com dengue clássica são neutropenia e linfocitose com
presença de linfócitos atípicos, dosagem de enzimas do fígado aumentadas e frequente
trombocitopenia (Dietz et al. 1996, Simmons et al. 2012).
Alguns pacientes com dengue podem desenvolver sintomas mais graves que
devem ser avaliados cuidadosamente pelo clínico para que as providências de manejo do
paciente sejam feitas em tempo hábil. Após o período febril é necessário observar se o
paciente apresenta sinais de insuficiência circulatória ou manifestações hemorrágicas.
Nestes casos o hemograma frequentemente apresenta trombocitopenia (contagem de
plaquetas menor que 100.000/mm³) e hemoconcentração (Kalaynarooj 1999). A
fragilidade capilar é evidenciada pela prova do laço positiva e outras manifestações
hemorrágicas podem estar presentes, tais como petéquias, equimose, púrpura,
sangramento de mucosa ou do trato gastrointestinal e outros (Gubler 1998). O
extravasamento de plasma causa aumento do hematócrito, efusão e edema,
principalmente no tórax e abdome. O tempo da doença varia de sete a 10 dias, havendo a
necessidade de se fazer a reidratação do paciente a fim de obter um bom prognóstico
(Gould & Solomon 2008, Ross 2010, Simmons et al. 2012).
Casos graves de dengue ocorrem principalmente devido ao extravasamento
de fluidos intravascular, podendo levar ao choque hipovolêmico e possível óbito. O
paciente apresenta, junto aos sintomas de alarme, sintomas de falência circulatória:
pulsação rápida e fraca, hipotensão, extremidades frias, pele úmida e pegajosa e redução
do nível de consciência (Kalayanarooj 1999). É de rápida evolução e pode levar ao óbito
em oito a 24 horas ou à recuperação rápida, após terapia apropriada. Para evitar o choque
é necessária completa atenção à reposição do fluído intravenoso e a mudanças abruptas
na clínica apresentada pelo paciente (WHO 1997, Morens & Fauci 2008). Outras
17
manifestações graves e menos comuns vêm sendo descritas em vários países endêmicos
para o vírus, como insuficiência hepática, disfunção cardiorrespiratória, hemorragia
digestiva volumosa, miocardites, alterações neurológicas, convulsões e perda de
consciência (Solomon et al. 2000, Jackson et al. 2008, Guzman et al. 2009, Brasil 2009,
Araujo et al. 2012).
1.7. Diagnóstico laboratorial
Infecções pelo DENV se apresentam com sintomatologia variada, e muitas
vezes não específicas, sendo o diagnóstico clínico impreciso, levando assim à necessidade
de métodos laboratoriais específicos para o diagnóstico de dengue (WHO 2009). O
diagnóstico laboratorial envolve métodos de detecção diretos e indiretos, com
sensibilidade variável e associada ao período da infecção. Assim, o isolamento viral ou a
detecção do genoma ou de antígenos do vírus são métodos aplicados logo no início dos
sintomas, sendo posteriormente substituídos por testes que identificam a presença de
anticorpos específicos no soro (Guzman & Kouri 1996, WHO 2009, Peeling et al. 2010).
De acordo com a literatura, na maioria dos casos entre quatro a cinco dias
após o início dos sintomas é possível a detecção do vírus na corrente sanguínea ou em
tecidos do indivíduo infectado. Nessa fase aguda da infecção, é possível utilizar técnicas
que permitam a identificação do vírus, material genético ou antígenos virais. Assim, o
isolamento viral e a reação em cadeia pela polimerase pós-transcrição reversa (RT-PCR
– reverse transcriptase – polimerase chain reaction) são métodos indicados (WHO
2009).
O isolamento viral é realizado a partir de amostras de soro ou de autópsia.
Diferentes técnicas são descritas como: inoculação em cérebros de ratos recém-nascidos,
cultura em células de mamíferos, inoculação intratorácica em mosquito adulto e
inoculação em células de mosquito (Henchal & Putnak 1990), esta última é a mais
utilizada. A principal linhagem celular é a C6/36 do Ae. albopictus, por possibilitar maior
sensibilidade, rapidez em relação às outras linhagens (Igarashi 1978, Gubler et al. 1984,
Yamada 2002, Shu & Huang 2004). Após o cultivo celular, a identificação do sorotipo
viral é realizada pela técnica de imunofluorescência indireta, aplicando-se anticorpos
monoclonais específicos para cada sorotipo (Gubler et al. 1984). O isolamento viral pode
levar até 15 dias para seu resultado final e há a necessidade de pessoal técnico
18
especializado para realização do exame, esses são fatores limitantes para seu uso na rotina
de laboratórios menores (Lanciotti et al. 1992). Estudos de vigilância, entretanto, são
baseados em cultivo viral, permitindo a identificação dos sorotipos circulantes em
diferentes regiões (Brasil 2009).
Os testes moleculares se apresentam como ferramenta importante no
diagnóstico das infecções virais, contribuindo também em estudos de epidemiologia
molecular, patogenia e vacinas (WHO 2009). Para o DENV, a RT-PCR é uma alternativa
que permite a detecção rápida do vírus, com maior sensibilidade que a cultura viral,
possibilitando ainda a identificação do sorotipo e o diagnóstico de coinfecções por
sorotipos distintos (Lanciotti et al. 1992). Ademais, a técnica de PCR em tempo real se
apresenta como uma alternativa com maior sensibilidade de detecção além de permitir a
determinação da carga viral, dado este que tem sido avaliado em uma possível associação
entre elevada carga viral com maior risco de formas graves (Vaughn et al. 2000, Kong et
al. 2006, Dos Santos et al. 2008, Waggoner et al. 2013).
Para a investigação de infecção pelo DENV, o protocolo proposto por
Lanciotti et al. (1992), baseado na região da junção C-prM, permite a detecção do DENV
simultaneamente com a diferenciação e identificação do sorotipo infectante , desde então,
vem sendo amplamente utilizado. Adicionalmente, técnicas de sequenciamento genômico
permitem investigar variantes genéticas do vírus, assim como inferir sobre datação de
amostras, distribuição filogeográfica e filonegia evolutiva. Neste contexto, outras regiões
do genoma viral ganharam importância, como a junção E/NS1 e o gene codificante da
proteína E (Zhang et al. 2005, Souza et al. 2011, Shin et al. 2013)
A detecção da proteína NS1 durante os três primeiros dias de sintomas
também se mostra como uma opção para o diagnóstico precoce do agente viral¸ sendo
importante que a coleta da amostra ocorra no período correto da infecção. Essa detecção
pode ser realizada por ensaios imunoenzimáticos (EIE) ou imunocromatografia (na forma
de teste rápido), ambos demonstrando boa especificidade e sensibilidade (Hang et al.
2009, Guzman et al. 2010b, Bisordi et al. 2011). Entretanto, esses testes, assim como os
outros, possuem limitações. Baixa viremia pode resultar em baixos níveis de NS1 na
corrente sanguínea, gerando a possibilidade de um resultado falso negativo. O mesmo
pode acontecer em pacientes com infecções secundárias, nos quais os baixos níveis
plasmáticos da NS1 estariam associados ao aumento rápido da produção de anticorpos
19
anti-DENV IgG, que sequestram as proteínas NS1 através de imunocomplexos formados
(Hang et al. 2009, Tricou et al. 2009). Atualmente existem no mercado testes rápidos
combinados, baseados em imunocromatografia, que possibilitam a detecção simultânea
do antígeno NS1 e dos anticorpos IgM e IgG. Esses testes vêm apresentando sensibilidade
acima de 80%, além de permitirem a detecção simultânea dos três marcadores, o que
aumenta a precisão do diagnóstico (Blacksell et al. 2011, Andries et al. 2012).
Após o quinto dia do início dos sintomas a possibilidade de detectar o vírus
no sangue diminui em função do surgimento de resposta imune efetiva (Koraka et al.
2003, De La Cruz Hernandez et al. 2013). Neste momento, os testes sorológicos para
identificação de anticorpos específicos tornam-se mais indicados. Têm sido os mais
utilizados, principalmente em períodos de epidemia, uma vez que são de fácil
reprodutibilidade, são de custo mais acessível, o tempo de realização é curto e possuem
especificidade e sensibilidade razoáveis. A limitação destes ensaios inclui a
especificidade dos antígenos e a reatividade cruzada entre flavivírus circulantes (Rigau-
Pérez et al. 1998, Guzman et al. 2010a).
Dentre os testes sorológicos mais utilizados, estão o ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) para IgM e IgG e o MAC-ELISA (IgM antibody capture ELISA)
para detecção dos anticorpos IgM. Estes testes possuem uma especificidade menor,
portanto é necessário avaliar seu uso em regiões possíveis de ocorrer reações cruzadas
com outros vírus (WHO 2009). A técnica de MAC-ELISA apresenta boa sensibilidade na
detecção de anticorpos IgM contra dengue em amostras de pacientes cinco dias após o
início dos sintomas. Há diversos kits comerciais disponíveis no mercado e vários grupos
de estudos desenvolveram sua própria técnica em laboratório (in house) (PAHO 1994,
Guzman et al. 2010a). Os testes de ELISA para anti-dengue IgM e IgG também se
apresentam amplamente disponíveis. A fração de IgM pode ser detectada a partir do
quinto dia após os sintomas, entretanto seus níveis séricos são menores em infecções
secundárias pelo dengue (Blacksell et al. 2006, Hunsperger et al. 2009). Altos níveis de
IgG no soro são observados após duas semanas do início dos sintomas, assim sua dosagem
em soros pareados é usada como teste confirmatório para infecção recente pelo vírus
dengue (Guzman & Kouri 2004, Guzman et al. 2010a).
Em infecções secundárias por outro sorotipo DENV o título de IgG aumenta,
mesmo na fase aguda de infecção, podendo permanecer por até 10 meses (WHO 2009),
20
sendo este fato importante e utilizado em métodos de dosagem de anticorpos para inferir
se a infecção é primária ou secundária. O teste de avidez de IgG para dengue também
permite avaliar se a infecção é primária ou secundária, obtendo-se uma baixa avidez de
IgG durante infecções primárias (Souza et al. 2004).
Uma limitação considerável dos testes baseados na detecção de anticorpos é
a não diferenciação entre os sorotipos virais do dengue, bem como a possibilidade de
haver reações cruzadas com outros flavivírus (Blacksell et al. 2006). Assim, uma forma
de aumentar a sensibilidade do diagnóstico de dengue aguda utilizando testes sorológicos
é o uso combinado das técnicas de detecção de NS1 e de detecção de anticorpos anti-
DENV IgM/IgG (Fry et al. 2011).
Exames hematológicos não compõem os testes diagnósticos específicos para
dengue, mas são usados de forma complementar durante o acompanhamento da doença.
Pacientes com dengue clássica podem apresentar contagens plaquetárias abaixo de
100.000/L, entretanto esta é uma característica constante em pacientes com FHD
(Kalayanarooj 1999). A prova do laço é utilizada para avaliar a fragilidade capilar, o que
pode ser indício da propensão ao desenvolvimento de manifestações hemorrágicas
(Gubler 1998). A hemoconcentração, avaliada a partir do aumento de 20% ou mais no
valor do hematócrito, é um sinal de perda do volume intravascular devido ao aumento da
permeabilidade vascular e extravasamento plasmático. A alteração destes parâmetros
auxilia na avaliação pelo clínico da necessidade de reposição de fluídos ao paciente,
contribuindo para um bom prognóstico e tratamento (WHO 2009).
1.8. Epidemiologia
A dengue está presente em mais de cem países distribuídos pela Ásia,
Américas, Oriente Médio e África, com o número de casos aumentando em todo o mundo
(WHO 2009). Estima-se que 4 bilhões de pessoas vivam em áreas endêmicas para o vírus
dengue (Beatty et al. 2010, Bhatt et al. 2013), e que tenham ocorrido, em 2010, 390
milhões de infecções das quais 96 milhões de indivíduos desenvolveram a doença.
Atualmente, dentre as doenças que afetam humanos e que são transmitidas por vetores,
dengue é a de maior relevância e sua prevalência está aumentando nas regiões tropicais e
subtropicais (San Martín et al. 2010, Gubler 2011, Bhatt et al. 2013).
21
Dentre a população mundial sob o risco de contrair o DENV, cerca de 1,3
bilhões de pessoas vivem em dez países do sudeste asiático que são considerados
endêmicos. Nessa região o número de casos graves vem aumentando nos últimos anos,
principalmente na Tailândia, Myanmar e Indonésia (SEARO 2011), enquanto que no
Pacífico Ocidental os países mais afetados são Camboja, Malásia, Vietnam, Filipinas e
Polinésia Francesa (Ooi & Gubler 2009, WHO 2009).
Na África 34 países são considerados endêmicos para o DENV, com a
cocirculação dos quatro sorotipos virais, sendo DENV2 o sorotipo relatado com maior
frequência (Amarasinghe et al. 2011). Na América, o aumento do número de casos de
dengue vem crescendo desde 1970, com casos relatados na maioria dos países do
continente, sendo o Brasil o responsável por mais de 70% dos casos totais e a Venezuela,
35% dos casos de dengue grave com complicações hemorrágicas (San Martín et al. 2010).
Estudo realizado por San Martín et al. (2010) mostrou que, na América, o
número de casos de dengue aumentou mais de 300% (1980-2007), aumentando também
o percentual de casos de dengue grave. Uma periodicidade de surtos foi observada de três
a cinco anos, havendo a circulação de todos os quatro sorotipos virais no continente
americano, mas sem a presença do DENV4 no Cone Sul. Ao longo do período do estudo
(1980 a 2007) a predominância dos sorotipos virais sofreu alteração, de DENV1 e
DENV2 durante a década de 1990 para DENV2 e DENV3 no período de 2000-2007
(Bennett et al. 2010, San Martín et al. 2010).
A entrada do DENV1 no continente americano se deu pelas Ilhas do Caribe,
sendo o primeiro relato de 1977 na Jamaica (Mendez et al. 2010). A Bolívia apresentou
seu primeiro caso de reemergência de dengue em 1987, seguida pelo Paraguai e Equador
em 1988 e Peru em 1990, todos associados ao DENV1. Posteriormente, novos sorotipos
foram introduzidos, sendo descrita a circulação dos quatro sorotipos virais (Halsey et al.
2012).
No Brasil, as primeiras descrições de quadros clínicos compatíveis com
infecção por dengue datam de 1916 em São Paulo e 1923 no Rio de Janeiro (Meira 1916
apud Rocco 2012, Pedro 1923). O vírus reemergiu no norte do país em 1981 com uma
epidemia em Boa Vista – RO causada pelo DENV1 e DENV4 (Osanai et al. 1983). Em
1986 o sorotipo 1 foi isolado em Nova Iguaçu – RJ e logo se espalhou por várias cidades
22
do estado (Schatzmayr et al. 1986). Em 1990 o DENV2 foi isolado no mesmo estado e
uma nova epidemia da doença se instalou na região, gerando vários episódios de dengue
grave associados à cocirculação de dois sorotipos virais (Nogueira et al. 1993). O DENV3
foi reintroduzido no continente americano em 1994 e chegou ao Brasil em 2000, sendo o
sorotipo responsável pela epidemia de 2001 e 2002 no Rio de Janeiro. Na ocasião, um
grande número de casos graves da doença foi notificado, com um saldo final de 91 mortes
(Nogueira et al. 2001, Nogueira et al. 2005).
Desde então os três sorotipos circularam pelo país aumentando anualmente
sua expansão. A partir de 2001 todos os estados brasileiros reportaram casos de dengue,
sendo que as regiões sudeste e nordeste foram as mais afetadas, enquanto a região sul é a
que possui menos casos relatados (Brasil 2012, Brasil 2013).
O sorotipo 4 permaneceu ausente no país desde seu isolamento em 1981 até
2008, quando três casos de infecção por DENV4 foram isolados em Manaus – Amazônia
(Figueiredo et al. 2008). Em 2010 novos casos de infecção por este sorotipo foram
identificados no norte do Brasil (Temporão et al. 2011) e no 1º trimestre de 2012 o
DENV4 já era o responsável por mais de 50% dos casos de dengue no Brasil (Brasil
2012).
Na cidade de Goiânia um estudo baseado nos casos de dengue entre 1993 e
2003 mostrou que até 1999 apenas o sorotipo 1 circulava na região, sendo os sorotipos 2
e 3 isolados em 2002. Em 1998, mesmo havendo apenas um sorotipo presente na cidade,
houve o primeiro relado de dengue grave apresentando complicações hemorrágicas (Feres
et al. 2006). Não existem estudos recentes em Goiás que avaliem o perfil das amostras
virais circulantes e seu efeito na população, apenas relatos da Vigilância Epidemiológica
Estadual e Municipal, o qual demonstram, de 2012 para 2013, o aumento do número de
casos de dengue em 401% e de óbitos em 25% (Goiás 2013)
1.9. Prevenção e controle
Em 1940 iniciou-se uma grande campanha no continente americano para
erradicação do Ae. aegypti, a fim de controlar a transmissão da febre amarela. Entretanto
essa campanha perdeu força a partir de 1970, o que resultou na reinfestação do mosquito
nas áreas erradicadas e possibilitou a expansão do mesmo para outras áreas não afetadas
23
anteriormente, facilitando assim a disseminação do DENV (Guzman & Kouri 2003,
WHO 2010).
A atual estratégia de controle da doença, adotada pela PAHO, consiste no
controle do Ae. aegypti pelo uso de compostos químicos (organofosforados,
gradativamente sendo substituídos por piretróides) e a remoção de possíveis locais usados
pelo mosquito como habitat. O controle da dengue se mostra como um desafio, sendo
necessário o comprometimento da população e das autoridades em saúde pública para
erradicar o vetor e melhorar a condição sanitária da população (FUNASA 2002, Brasil
2009, PAHO 2009, Tapia-Conyer et al. 2012).
No Brasil, o manejo do controle da dengue é realizado através de ações
sinérgicas entre os setores de vigilância epidemiológica e entomológica e os setores de
atenção básica à saúde. Agentes Comunitários de Saúde e Agentes de Controle de
Endemias são os responsáveis por realizar visitas rotineiras aos domicílios a fim de
conscientizar a população sobre a eliminação de possíveis criadouros do mosquito e, caso
necessário, utilizar compostos para o controle químico ou biológico de recipientes
propícios ao desenvolvimento larval. Adicionalmente, o Ministério da Saúde lança
campanhas nacionais de conscientização da população sobre os riscos e o controle da
dengue (Brasil 2009).
Entretanto, o uso de compostos químicos nas regiões infestadas pelos
mosquitos Aedes não demonstra eficácia suficiente, uma vez que o alvo (mosquito adulto)
tem preferência pelo ambiente interno das casas, local não atingido pelos inseticidas
(Gubler 2011). Ademais, a resistência adquirida a esses compostos leva à falha desses
programas de controle do vetor e prediz a ocorrência de epidemias pelo vírus dengue (Luz
et al. 2011). Diante disto, ressalta-se a importância da utilização de novos métodos para
o controle da doença, como por exemplo o controle biológico do vetor, juntamente com
a manutenção do controle dos possíveis criadouros peridomiciliares para o mosquito
(Jansen & Beebe 2010).
Algumas medidas de proteção individual, com diferentes níveis de eficácia,
podem auxiliar evitando o contato do vetor com humanos. O uso de telas nas portas e
janelas das casas tende a evitar que o mosquito entre nos domicílios, podendo seu uso ser
associado à aplicação de substâncias repelentes de insetos no material de confecção das
24
telas. O uso de repelentes corporais contra insetos, à base de compostos naturais ou
sintéticos, se mostra como mais uma opção para evitar a picada das fêmeas do Aedes
(Stefani et al. 2009, Eisein et al. 2009, Andrade & Cabrini 2010, PPAV 2011, Shapiro
2012).
O uso de técnicas para a supressão e substituição da população de Ae. aegypti
pode constituir uma forma específica de combate ao mosquito, como a Técnica do Inseto
Estéril (TIE) e a tecnologia RIDL® (Release of Insects Carrying a Dominant Letal)
(Jansen & Beebe 2010).
A TIE, que consiste na liberação no ambiente de uma grande população de
insetos machos estéreis pelo uso de radiação, apresentou bons resultados no controle de
pragas agrícolas. A eficiência desta tecnologia está intimamente relacionada à adequada
separação dos mosquitos de acordo com o gênero. Um estudo realizado na Índia
conseguiu que apenas 0,2% de fêmeas fossem liberadas junto aos machos estéreis.
Embora o baixo percentual, este refletia um número significativo no total de insetos
liberados no ambiente, o que inviabilizou o uso da TIE. Dessa forma, para que o uso da
TIE se torne viável no controle do Ae. aegypti, é necessário um aperfeiçoamento do
método para evitar a soltura de fêmeas no ambiente (Ansari et al. 1977, Robinson 2002,
Alphey et al. 2010).
A tecnologia RIDL® utiliza mosquitos machos homozigotos geneticamente
modificados para um gene letal ligado ao sexo feminino. Assim, ao serem liberados no
meio ambiente, o contato com as fêmeas favorecerá a produção de apenas mosquitos
machos, o que acarretará em uma diminuição progressiva do potencial reprodutivo da
espécie em controle. O controle da produção de apenas mosquitos machos é realizado
diferentemente da TIE, de uma forma mais segura evitando, assim, a liberação de fêmeas
indesejáveis no meio ambiente (Thomas et al. 2000, Alphey et al. 2013). Essa técnica
sofreu adaptações para seu uso em mosquitos, e se mostra como uma opção viável para
testes em campo (Phuc et al. 2007).
Outra opção em desenvolvimento é o uso de cepas da bactéria Wolbachia
como inibidoras da infecção pelo DENV nos mosquitos Ae. aegypti. Esta bactéria
constitui uma relação endossimbiótica com mais de 60% da população mundial de insetos
e sua presença parece encurtar a vida adulta do Ae. aegypti. Estudos demonstram que em
25
mosquitos infectados por Wolbachia (cepa wMelPop-CLA) o vírus dengue não consegue
estabelecer uma infecção produtiva, havendo diminuição da replicação e do
desenvolvimento do vírus no vetor, demonstrando ter potencial para o controle biológico
da transmissão do DENV (Moreira et al. 2009, Turley et al. 2009).
Em relação à imunidade dos indivíduos contra a dengue, esforços vêm sendo
desenvolvidos na tentativa de criar uma vacina contra os quatro sorotipos virais. É
necessária uma pesquisa bem delineada e cuidadosa para evitar que a vacina seja restrita
às características de apenas uma população (Tapia-Conyer et al. 2012). O princípio
utilizado é a criação de anticorpos neutralizantes contra os quatro sorotipos virais
simultaneamente, entretanto um dos principais problemas encontrados é a resposta
imunológica desigual gerada pelos quatro sorotipos virais (Thomas & Endy 2011).
Atualmente a vacina em estágio mais avançado é da empresa Sanofi Pasteur.
Sua vacina (CYD-TDV) é tetravalente, recombinante, possui o vírus atenuado e usa como
base a cepa viral 17D da vacina contra febre amarela. Atualmente o ensaio clínico se
encontra na fase III, conduzido em países da América Latina e Ásia. Os resultados do
ensaio clínico fase IIb demonstraram eficácia vacinal contra 3 dos 4 sorotipos virais do
DENV, demonstrando que são necessários mais estudos para uma vacina que induza a
uma resposta imune eficaz contra todos os sorotipos do DENV, evitando assim um
reposta vacinal que possa induzir a ADE (Sabchareon et al. 2012, Barnighousen et al.
2013).
É importante ressaltar que um controle eficaz do vetor em uma população,
pode refletir na diminuição da transmissão da infecção, levando também à diminuição da
imunidade rebanho na mesma. Na ausência de uma vacina eficaz, a ocorrência de
epidemias futuras estará então relacionada à perda da imunidade na população, e não à
falha no controle do vetor (Jansen & Beebe 2010). Devido a isso, a melhor forma de
combate à dengue é a junção do controle do vetor com a produção de uma vacina
eficiente, evitando assim, de uma forma geral, que o vírus encontre alguma forma de se
propagar.
26
2. JUSTIFICATIVA
Conforme referido, a patogênese da infecção pelo DENV não é bem
compreendida, entretanto, a gravidade da doença tem sido associada à resposta imune
sorotipo cruzada bem como à virulência do isolado viral. Assim, a identificação dos
sorotipos do vírus circulantes é importante na vigilância da doença, uma vez que a
introdução de uma nova variante em áreas afetadas por sorotipos preexistentes pode
constituir um fator de risco para a dengue grave.
A caracterização das variantes genômicas dos sorotipos do dengue através da
utilização de técnicas moleculares abriu novas perspectivas aos estudos epidemiológicos,
por determinar a evolução molecular e a origem geográfica dos vírus, e ainda poder inferir
a respeito da virulência viral em relação à gravidade da doença e seu impacto sobre a
população (Deubel et al. 1993, Lanciotti et al. 1997, Messer et al. 2003, Nogueira et al.
2000, Rico-Hesse 1990, 1997). Assim, estudos filogenéticos têm indicado a associação
entre o genótipo específico e a gravidade da doença (Aquino et al. 2006, Messer et al.
2003). Não obstante, a análise genética é uma importante ferramenta para o
monitoramento da transmissão e eventual introdução de novos genótipos em uma área
endêmica. A definição de variações genéticas das amostras virais, e sua distribuição
global, podem levar a um mapeamento e acompanhamento da circulação viral (Lanciotti
et al. 1994, Leitmeyer et al. 1999)
Em Goiás, desde a introdução do vírus dengue, em 1994, houve a circulação
viral de todos os sorotipos do DENV (Maciel et al. 2008). Entretanto, estudos moleculares
na região datam do período epidêmico de 2003 (Feres et al. 2006), quando o sorotipo
predominante era o DENV3 e não havia sido ainda introduzido do DENV4 na região.
Identifica-se, dessa forma, a inexistência de estudos moleculares direcionados para a
avaliação de variantes genéticas circulantes na região. Neste cenário, este tipo de
investigação adiciona mais um parâmetro a ser avaliado na vigilância laboratorial da
dengue, assumindo papel de relevância, visto que a entrada de novos genótipos na região
poderia acarretar mudança nos perfis epidêmicos apresentados até o momento, em
consequência, contribuindo para o entendimento da epidemiologia da infecção e para o
seu controle.
27
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Investigar a ocorrência da infecção pelo vírus dengue em indivíduos
atendidos em unidades de saúde no município de Goiânia, Goiás no
período epidêmico de Outubro/2012 a Maio/2013.
3.2. Objetivos Específicos
Determinar o índice de positividade da infecção pelo DENV na
população em estudo;
Avaliar a associação entre infecção pelo DENV e as características da
população estudada;
Relacionar a positividade dos marcadores investigados ao período da
infecção;
Identificar os sorotipos e genótipos de DENV circulantes em Goiânia,
no período do estudo.
28
4. METODOLOGIA
4.1. Delineamento do Estudo e População
Este é um estudo observacional, analítico, de corte transversal, realizado em
três unidades de atendimento básico à saúde da rede pública de saúde da cidade de
Goiânia, sendo todas Centro de Atendimento Integral à Saúde (CAIS) no período
epidêmico 2012-2013. A escolha das unidades foi feita com base no levantamento da
distribuição dos casos da epidemia de dengue do período 2011/2012 realizado pela
Superintendência de Vigilância em Saúde do Estado de Goiás (SUVISA). Para escolha,
foram selecionadas as unidades com maior número de notificações de casos suspeitos de
dengue, sendo elas: CAIS Campinas, CAIS Cândida de Morais e CAIS Chácara do
Governador.
A população do estudo consistiu de indivíduos que procuraram atendimento
nas unidades de saúde, por apresentarem suspeita clínica de infecção pelo vírus dengue.
Foram inclusos nesta pesquisa indivíduos com relato de sintomas por um período máximo
de sete dias e que, após esclarecimento de sua participação no estudo, procederam
autorização mediante a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TCLE - Anexo 1) pelo próprio paciente ou seu responsável direto. Os dados referentes
às características sóciodemográficas, aspectos clínicos e fatores de risco foram coletados
mediante entrevista (questionário padrão – Anexo 2), face a face, realizada pelo
pesquisador.
4.2. Aspectos Éticos
O presente estudo foi submetido à avaliação e aprovado pelo Comitê de Ética
em Pesquisa (CEP) do Hospital Materno Infantil, com o número de protocolo
No.17/2012, bem como pelo Setor de Ensino e Pesquisa da Secretaria Municipal de Saúde
de Goiânia, a qual autorizou a realização do estudo nas referidas unidades de saúde.
4.2.1. Critérios de Inclusão
Indivíduos de ambos os sexos, em todas as faixas etárias, apresentando
suspeita clínica de dengue entre o primeiro e sétimo dia de sintomas, dos quais tenha sido
29
obtida a assinatura do TCLE, o preenchimento do questionário, bem como a coleta da
amostra sanguínea.
4.2.2. Critérios de Exclusão
Indivíduos apresentando suspeita clínica de dengue com mais de sete dias de
início dos sintomas ou aqueles que não tenham assinado o TCLE autorizando o estudo ou
mesmo a coleta do espécime clínico, por quaisquer motivos.
4.3. Coleta de Dados e Amostras
No período de outubro de 2012 a maio de 2013, foram realizadas visitas
periódicas às três unidades de saúde selecionadas. Cada unidade recebeu, em média, uma
visita semanal, sempre realizada no período matutino, o qual foi escolhido por apresentar
maior quantidade de atendimento laboratorial aos pacientes. Durante este período, todos
os pacientes com suspeita de dengue e que fossem encaminhados para exame laboratorial
eram abordados pela pesquisadora, recebiam informações a respeito do estudo, sendo
então convidados a participar do mesmo. Após aceite e assinatura do TCLE, procedia-se
a entrevista para preenchimento do questionário padrão, relativo a informações
sóciodemográficas, aspectos clínicos e fatores de risco. Em seguida, profissionais da
própria equipe da unidade realizavam a coleta da amostra sanguínea, sendo coletados 10
mL de sangue por de punção venosa, utilizando-se seringa e agulha descartáveis.
As amostras coletadas eram conservadas em tubos de ensaio identificados,
acondicionados em caixa de isopor e transportados ao Laboratório de Virologia Humana
do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás
(IPTSP/UFG), em um período máximo de duas horas, onde eram imediatamente
processadas. Após centrifugação e separação dos soros, estes eram aliquotados e
armazenados a –70ºC, até a realização dos ensaios laboratoriais.
Adicionalmente, eram avaliadas as fichas de investigação de dengue, quando
disponíveis, do Sistema de Informação de Agravos de Notificações no Ministério da
Saúde (SINAN), para obter dados relativos à evolução e à classificação dos casos
incluídos no estudo.
30
4.4. Metodologia
4.4.1. Diagnóstico sorológico
Todas as amostras de soro coletadas foram submetidas a um imunoensaio
qualitativo para a detecção simultânea do antígeno NS1 e dos anticorpos específicos para
DENV IgM e IgG. Para isso utilizou-se o ensaio imunocromatográfico Dengue Duo Test
(Bioeasy), seguindo as instruções do fabricante.
4.4.2. Detecção viral e Sorotipagem Molecular
Todas as amostras de soro coletadas foram submetidas à investigação da
presença de RNA-DENV, e identificação do sorotipo viral, utilizando-se iniciadores
descritos por Lanciotti et al. (1992) (Quadro 2) e protocolo adaptado.
Extração do ssRNA viral – O ssRNA viral foi extraído a partir de 150µL de
amostra de soro diluido em 150L de água com inibidor de RNAse dietilpirocarbonato
(DEPC), utilizando-se reagente Trizol (Invitrogen/Life Technologies - EUA), seguindo
as instruções do fabricante com modificações. Brevemente, aos 300L de soro diluído
em água DEPC, foram adicionados 900L de reagente trizol, seguidos por
homogeneização breve em agitador de tubos (vórtex) e incubação a temperatura ambiente
(T.A.) por 5 minutos, seguindo de adição de 240L de clorofórmio gelado. A mistura foi
homogeneizada rapidamente, incubada a T.A. por 10 minutos e centrifugada a 12000g
por 15 minutos a 4oC. Aproximadamente, 600L da fase superior aquosa foram
transferidos para um novo microtubo, ao qual se adicionou 600L de álcool isopropílico
gelado, deixando incubar a T.A. por 10 minutos. Após nova centrifugação (12000g, 10
minutos, 4oC) e descarte do sobrenadante, adicionou-se 1mL de etanol 75% gelado,
seguindo agitação e centrifugação a 7500g por 5 minutos, 4oC. O sobrenadante foi
descartado e o pellet secado a T.A. por 15 minutos. O produto da extração foi ressuspenso
em 20L de água com DEPC e incubado a 56oC por 10 minutos, para então ser estocado
a -20oC.
Reação em cadeia pela polimerase pós transcrição reversa (RT-PCR) – a
reação foi realizada em etapa única em um volume final de 25µL utilizando 3µL do RNA
extraído adicionado à mistura de reação contendo 12,5µL de GoTaq Colorless Master
Mix (Promega/EUA), 8,3µL de água Nuclease Free (Promega/EUA), 2mM de ditiotreitol
31
(DTT), 0,12mM de cada iniciador (D1 e D2) (Quadro 2), 0,16U/µL de inibidor de RNase
(Invitrogen/EUA), 0,8U/µL de enzima transcriptase reversa (RT – Invitrogen/EUA). A
reação foi processada em termociclador (Swiftmaxi Thermal Cycler/ESCO) a 42ºC por
40 minutos, seguido por 5 min a 95 ºC e posterior amplificação em 35 ciclos: 94ºC/35s,
57oC/45s, 72oC/2min e extensão final à 72oC/7min.
Semi-Nested PCR – para sorotipagem do vírus dengue, 2,5µL do produto
obtido na primeira amplificação diluído 1:80 foi submetido à reação de semi-Nested PCR.
A reação foi realizada nas mesmas condições da primeira amplificação, exceto pela não
adição de DTT, do iniciador D2, do inibidor de RNAse assim como da trasncriptase
reversa, sendo utilizados os iniciadores tipo específicos, TS1, TS2, TS3 e TS4, para
DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4, respectivamente (Quadro 1). A reação foi
processada em termociclador (Swiftmaxi Thermal Cycler/ESCO) a 94ºC por 1 minuto e
posterior amplificação em 30 ciclos de: 94ºC/35s, 56oC/45s, 72oC/2min e extensão final
à 72oC/7min.
Quadro 2. Iniciadores utilizados para amplificação e tipagem dos vírus dengue (Lanciotti et al.
1992).
Iniciador Sequência
Posição
genômica
(nt)
Tamanho
esperado do
fragmento*
D1 5’-TCAATATGCTGAAACGCGGAGAAACCG-3’ 134-161
511
D2 5’-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3’ 616-644
TS1 5’-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3’ 568-586 482
TS2 5’-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3’ 232-252 119
TS3 5’-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3’ 400-421 290
TS4 5’-CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA-3’ 506-527 392
*Em pares de base (pb)
Eletroforese em gel de agarose – Os produtos de amplificação (10 μL), bem
como o padrão de peso molecular 100bp DNA ladder (InvitrogenTM/Life Technologies
- EUA) foram misturados a 1μL do tampão de corante da amostra (Azul de bromofenol;
Xilenocianol; Glicerol) e aplicados em gel de agarose (InvitrogenTM/Life Technologies
- EUA) a 1,5% contendo 0,5mg/mL de brometo de etídeo e submetido a eletroforese
durante 60 minutos a 100 volts em tampão TBE 0,5X (Tris/Borato/EDTA).
32
Posteriormente, o gel foi examinado em transluminador (Universal Hood II/BioRad) com
luz ultravioleta para a visualização dos fragmentos de tamanho esperado (Quadro 2).
4.4.3. Genotipagem viral
As amostras positivas obtidas nas reações de detecção e sorotipagem viral
foram submetidas a um novo protocolo de RT-PCR para amplificação da região E/NS1 e
posterior sequenciamento nucleotídico e análise filogenética para caracterização
genotípica da amostra. Para a reação de amplificação da região E/NS1 foi utilizado o
protocolo descrito por Domingo et al. (2011) com modificações. Os pares de iniciadores
foram selecionados após resultados obtidos pela sorotipagem (Quadro 3).
Quadro 3. Iniciadores usados para amplificação da região E/NS1 (Domingo et al. 2011).
Iniciador Sequência Posição
genômica
Tamanho
esperado do
produto
amplificado*
PCR
S1871DEN1 5’-TGGCTGAGACCCARCATGGNAC-3’ 1869-1890 776
RT-PCR
AS2622DEN1 5’-CAATTCATTTGATATTTGYTTCCAC -3’ 2620-2644 RT-PCR
S1871DEN4 5’-TGGCAGAAACACARCAYGGNAC-3’ 1873-1894 776
RT-PCR
AS2622DEN4 5’-TAGCTCGTTGGTTATTTGYTTCCAC-3’ 2624-2648 RT-PCR
DEN1STR 5’-GGAAAATGTTYGAAGCAACYGCCC -3’ 2130-2153 444
Nested
DEN1ASTR 5’-TCCTCCCATGCCTTCCCRATGG-3’ 2553-2574 Nested
DEN4STR 5’-ATYGGCAAGATGTTTGAGTCC -3’ 2130-2150 459
Nested
DEN4ASTR 5’-CACAGACCCCRTCTTTGTGGGC-3’ 2568-2589 Nested
*Em pares de base (pb)
RT-PCR – a reação foi realizada em etapa única em um volume final de 25µL
utilizando 3µL do RNA extraído adicionado a mistura de reação contendo 12,5µL de
GoTaq Colorless (Promega/EUA), 8,0µL de água Nuclease Free (Promega/EUA), 2mM
de DTT, 0,32mM de cada iniciador (cada par de iniciador utilizado especificamente para
seu sorotipo) (Quadro 3), 0,16U/µL de inibidor de RNase (Invitrogen/EUA), 0,8U/µL de
enzima RT (Invitrogen/EUA). A reação foi processada em termociclador (Swiftmaxi
Thermal Cycler/ESCO) a 42ºC por 45 minutos, seguido por 10 minutos a 94ºC e posterior
amplificação em 40 ciclos: 94ºC/30s, 55oC/1min, 72oC/40s e extensão final à
72oC/10min.
33
Nested PCR – 1µL do produto obtido na primeira amplificação foi submetido
à reação de Nested PCR. Esta foi realizada nas mesmas condições da primeira
amplificação, exceto pela não adição de DTT, do inibidor de RNAse e da enzima RT,
sendo também utilizados novo par de iniciadores internos tipo específicos para DENV1
ou DENV4 (Quadro 3). A reação foi processada em termociclador (Swiftmaxi Thermal
Cycler/ESCO) a 94ºC por 2 minutos e posterior amplificação em 40 ciclos: 94ºC/30s,
57oC/2min, 72oC/40s e extensão final à 72oC/10min.
Eletroforese em gel de agarose – Os produtos de amplificação foram
visualizados seguindo o mesmo protocolo utilizado na reação de detecção do genoma
viral.
4.4.3.1. Sequenciamento genômico
Purificação do produto de PCR – Os produtos finais obtidos na reação de
amplificação da região E/NS1 (444pb para DENV1 e 459pb para DENV4) foram
purificados por precipitação com isopropanol 65%, lavados com etanol 70% e
ressuspensos com 20μL de água Milli-Q/DEPC.
O produto de purificação foi visualizado em gel de agarose 1,5%, seguindo-
se quantificação do DNA, realizada por estimativa, comparando-se visualmente com
produtos de concentração de DNA previamente conhecidos, sendo considerado
satisfatório para o procedimento de seqüenciamento, produto com no mínimo 50ng de
DNA/L de reação.
Reação de sequenciamento - A reação de seqüenciamento genômico foi
realizada diretamente, a partir do produto de purificação, em ambas as direções, utilizando
o sequenciador automático ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems/USA), segundo
procedimento descrito por Sanger et al. (1977). A reação foi realizada utilizando o Kit
comercian BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems/USA) e os
iniciadores da reação Nested PCR de Domingo et al. (2011).
Análise das sequências – Os eletroferogramas gerados pelo processo de
sequenciamento automático foram triados para determinação da qualidade, bem como
para a montagem de uma sequência consenso (contig), utilizando o programa PHPH
(http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/) (Togawa et al. 2006). A identidade dos
34
contigs foi confirmada por alinhamento simples local com sequências depositadas no
GenBank utilizando o algoritmo BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al. 1990).
As sequências de nucleotídeos, referentes à região da junção E/NS1 (2013-2589), foram
editadas pelo Jalview (Waterhouse et al. 2009) e, em seguida, alinhadas utilizando o
programa Clustal X v 2.0 (Larkin et al. 2007) para a verificação da identidade entre as
amostras.
Análise filogenética – Para a determinação dos genótipos, foram selecionadas
sequências protótipos bem como isolados, do Brasil e do mundo, a partir do banco de
dados GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) e do Dengue vírus genotyping database
(www.gen-info.osaka-u.ac.jp/~uhmin/genotyping/index.html). As sequências foram
avaliadas pelo programa jModelTest-2.0 (Darriba et al. 012) para selecionar o modelo de
substituição nucleotídica adequado. Os contigs, juntamente com as sequências
provenientes dos bancos de dados, foram alinhados utilizando o programa Clustal X 2.0.
A análise filogenética foi realizada peloo programa MEGA v.6 (Tamura et al. 2013),
utilizando o algoritmo Maximum Likelihood (ML) e baseado na matriz de pares de
distância estimada Jukes-Cantor (1969).
4.4.4. Análise dos Dados
Foi elaborado um arquivo eletrônico contendo os dados provenientes do
questionário padrão, da ficha epidemiológica do SINAN e dos testes sorológicos e
moleculares. Este arquivo foi utilizado para entrada das informações no programa SPSS
15.1, no qual foi realizado a análise de dados para distribuição de frequências, e posterior
análise estatística dos resultados utilizando o teste de qui-quadrado (2), com intervalo de
confiança de 95% e valor de p<0,05 como valor limite para significância estatística.
35
Figura 3. Esquema ilustrativo da metodologia utilizada
36
5. RESULTADOS
5.1. Características da população em estudo
No período de Outubro/2012 a Maio/2013 foram coletadas 278 amostras
sanguíneas de igual número de pacientes, todos apresentando suspeita clínica de infecção
por DENV (Tabela 1). A população de estudo foi constituída por número equivalente de
indivíduos de ambos os sexos, sendo a maioria na faixa etária de 20 a 40 anos (56,5%).
Considerando o estado civil dos participantes, 45,7% eram solteiros. A
maioria dos indivíduos possuía de 10 a 12 de escolaridade (51,1%) e residia no município
de Goiânia (85,6%), sendo a média de renda familiar de 1,7 salários mínimo. Em relação
às unidades de saúde, o maior número de amostras coletadas foi proveniente dos CAIS
Campinas e Chácara do Governador, com 39,2% e 39,5%, respectivamente.
37
Tabela 1. Características sociodemográficas da população estudada (N=278) CARACTERÍSTICAS N (%)
Sexo
Masculino
Feminino
139
139
50
50
Idade (Média ± dp: 33,9 ±14,5) ≤ 19 anos
20 – 40 anos
≥ 41 anos
42
157
79
15,1
56,5
28,4
Estado civil
Solteiro
Casado
Viúvo
Divorciado
127
126
5
20
45,7
45,3
1,8
7,2
Grau de instrução
<5 anos
6-9 anos
10-12 anos
>12 anos
21
60
142
55
7,6
21,6
51,1
19,8
Renda familiar
<1 salário mínimo
1-2 salários mínimo
>2 salários mínimo
Si
21
128
126
1
7,6
46,5
45,7
0,4
Município de Residência
Goiânia
Região Metropolitana
238
40
85,6
14,4
Unidade de Saúde
CAIS Campinas
CAIS Cândida de Moraes
CAIS Chácara do Governador
109
59
110
39,2
21,2
39,6
CAIS – Centro de Assistência Integral à Saúde; Si – Sem informação; dp – desvio padrão.
Em relação aos dados clínicos declarados pelo paciente no momento da
entrevista (Tabela 2), a maior parte dos casos se encontrava entre o 1º e 5º dias do início
de sintomas (78%). Os sintomas associados à febre e dores foram os mais frequentemente
observados, e sinais de sangramento foram relatados em apenas 6,1%, O histórico de
infecção anterior por DENV foi relatado por 33,9% dos indivíduos. Adicionalmente, a
investigação das fichas epidemiológicas do SINAN permitiu identificar que 30,3% dos
casos não foram notificados e, 28,1% dos casos notificados não tiveram a investigação
concluída. Dos 116 (41,6%) casos notificados e investigados, a maioria (36%) foi
classificada, clinico ou laboratorialmente, como dengue clássico.
38
Tabela 2. Características clínicas da população (N=278) CARACTERÍSTICAS N %
Dias de sintomas
1º - 3º
4º - 5º
6º - 7º
105
112
61
37,7
40,3
22,0
Sintoma relatado
Artralgia
Calafrios
Cefaléia
Diarréia
Dor abdominal
Dor retrocular
Dor óssea
Febre
Mialgia
Náuseas
Sangramento
Vômito
224
235
242
90
140
201
178
260
245
160
17
79
80,5
84,5
87
32,4
50,3
72,3
64
93,5
88,1
57,5
6,1
28,4
Relado de infecção anterior por dengue
Sim
Não
Não sabe
94
183
1
33,9
65,8
0,3
Notificação SINAN
Sem notificação
Notificado - não investigado
Notificado
Descartado
Clássica – clínica
Clássica – laboratorial
DCC
84
78
15
72
27
2
30,3
28,1
5,5
26
10
0,1
Sinan – Sistema de Informação de Agravos e Notificações; DCC – Dengue com complicações.
5.2. Infecção pelo DENV
Para definição de diagnóstico laboratorial de infecção por DENV foram
considerados indivíduos com positividade, isolada ou não, dos seguintes marcadores:
NS1, IgM ou RNA viral. Assim, foi observado um índice de infecção pelo DENV na
população estudada de 43,9% (Tabela 3). Considerando individualmente os marcadores
pesquisados, NS1, IgM e RNA-viral, observou-se uma taxa de detecção de 30,5%
(85/278), 13,6% (38/278) e 20,5% (57/278), respectivamente. Adicionalmente, o
marcador IgG foi detectado em 16,2% (45/278) dos pacientes.
39
Tabela 3. Distribuição dos marcadores para infecção por DENV em relação aos dias de
sintomas.
Pos. – Positivos.
Considerando o índice de infecção pelo DENV em relação aos dados da
população, não foi observada diferença estatisticamente significativa em relação ao sexo,
faixa etária, grau de instrução ou renda familiar (p>0,05). A análise para as unidades de
saúde, mostrou as unidades CAIS Campinas e CAIS Cândida de Moraes com o maior
índice de positividade em relação ao CAIS Chácara do Governador (p<0,05). Com
relação aos dias do início dos sintomas relatados, não foi observada diferença
estatisticamente significativa para a identificação da infecção por DENV (p>0,05)
(Tabela 4).
Dias de
sintomas
NS1 NS1/
RNA
NS1/
IgM
NS1/
RNA/IgM
RNA RNA/
IgM
IgM Pos./Total(%)
1-3 Dias 5 21 0 1 12 1 3 43/105 (40,9)
4-5 Dias 20 15 5 1 3 0 7 51/112 (45,5)
6-7 Dias
5 2 10 0 1 0 10 28/61 (45,9)
Total 30 38 15 2 16 1 20 122/278 (43,9)
40
Tabela 4. Infecção por DENV em relação às características da população (N=278).
O Gráfico 1 apresenta a distribuição dos casos de infecção pelo DENV
identificados durante o período do estudo, sendo possível observar um maior índice de
positividade entre os meses de janeiro a abril de 2013.
CARACTERÍSTICAS Positivos/Total (%) Valor de p
Sexo
Masculino
Feminino
61/139 (50)
61/139 (50)
1,0
Idade <20 anos
20 – 40 anos
> 40 anos
13/42 (30,9)
68/157 (43,3)
41/79 (51,9)
0,085
Grau de instrução
<5 anos
6-9 anos
10-12 anos
>12 anos
9/21 (42,8)
28/60 (46,6)
56/142 (39,4)
29/55 (52,7)
0,378
Renda familiar
<1 salário mínimo
1-2 salários mínimo
>2 salários mínimo
Si
9/21 (42,8)
46/128 (35,9)
66/126 (53,4)
1/3 (33,3)
0,071
Unidade de Saúde
CAIS Campinas
CAIS Cândida de Moraes
CAIS Chácara do Governador
55/109 (50,4)
30/59 (50,8)
37/110 (33,6)
0,020
Dias de sintomas
1-3 Dias
4-5 Dias
6-7 Dias
43/105 (39,4)
51/112 (45,5)
28/61 (45,9)
0,744
41
Gráfico 1. Distribuição dos casos de infecção pelo DENV em relação ao período de coleta
(N=278)
A partir das informações de notificação dos casos de dengue obtidas por meio
das fichas epidemiológicas do SINAN, observou-se que 30,9% dos casos não notificados
e 52,6% dos casos notificados sem investigação posterior, apresentaram-se com infecção
por DENV. Considerando os casos de notificação investigados, 20% dos casos
descartados e 51,5% dos casos classificados como dengue clássica foram identificados
como positivos para infecção. Dos dois casos classificados como dengue com
complicações, um foi positivo (Gráfico 2).
Gráfico 2. Distribuição dos casos de infecção pelo DENV em relação à informação das fichas
epidemiológicas do SINAN (N=278).
SN – Sem notificação; NNI – Notificado, não investigado; ND – Notificado e descartado; NCC
– Notificado, clássico clinico; NCL – Notificado, clássico laboratorial; NDCC – Notificado,
Dengue com complicações.
Análise considerando o índice de detecção dos marcadores NS1, IgM e RNA,
em relação aos dias de sintomas, demonstrou não haver diferença nos índices para o
marcador sorológico NS1 (p>0,05). Entretanto, para IgM e RNA viral, diferenças
0
21,418,2
50 51,2
42
47,6
0
0
10
20
30
40
50
60
out/12 nov/12 dez/12 jan/13 fev/13 mar/13 abr/13 mai/13
Po
rcen
tagem
de
po
siti
vo
s
84
78
15
72
27
2
26
41
3
34
17
1
30
,90
% 52
,60
%
20
%
47
,20
%
62
,90
%
50
%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
S N N N I N D N C C N C L N D C C
NÚ
ME
RO
DE
PA
CIE
NT
ES
Total Positivos
42
estatisticamente significativas foram observadas. Para IgM, maiores índices de
positividade foram identificados em amostras coletadas de indivíduos que se encontravam
entre o sexto e sétimo dia de sintomas e para o RNA, entre o primeiro e terceiro dia
(p<0,05) (Tabela 5).
Tabela 5. Positividade para os marcadores de infecção em relação aos dias de sintomas
(N=278).
Pos. – Positivos; *Valor de p<0.000
5.3. Sorotipagem e genotipagem
Do total de amostras analisadas, o RNA viral foi detectado em 57, das quais,
18 (31,5%) foram identificadas como sorotipo DENV1 e 39 (68,5%) como DENV4.
Das amostras DENV1 positivas, 16 foram submetidas ao sequenciamento de
nucleotídeos por apresentarem produtos de amplificação com quantificação adequada,
sendo obtidos eletroferogramas de qualidade para todas. Após análises e montagem das
sequencias consenso, o alinhamento dos contigs obtidos permitiu a identificação de
sequências haplótipos (100% das bases idênticas), que foram denominadas HP01
(amostras 091, 093, 155 e 180) e HP02 (117, 187 e 268). Para as outras sequências, a
identidade nucleotídica variou de 96,1% a 99,7%. Análises comparativas com outras
amostras depositadas em banco de dados demonstrou identidade variando de 96% a 99%
com sequencias DENV1 provenientes do Brasil e da América Latina.
Análise filogenética permitiu a classificação destas sequências como genótipo
V (Figura 3), sendo observada a diferenciação em dois clados. Dez sequências, incluindo
as duas haplótipos, foram agrupadas em um mesmo clado e mostraram-se altamente
relacionadas entre si e com outras sequências brasileiras isoladas em 2010. Para a amostra
095, observou-se a formação de um clado individual com associação a outras amostras
brasileiras, bem como de outros países da América Latina.
Dias de
sintomas
NS1 IgM RNA
Pos./Total (%) p Pos./Total (%) p Pos./Total (%) P
1-3 Dia
4-5 Dia
6-7 Dia
Total
27/105 (25,7)
41/112 (36,6)
17/61 (27,8)
85/278 (30,5)
0,192
5/105 (4,7)
13/112 (11,6)
20/61 (32,8)
38/278 (13,6)
0,000*
35/105 (33,3)
19/112 (16,9)
3/61 (4,9)
57/278 (20,5)
0,000*
43
Para as amostras de DENV4, a quantificação de DNA mostrou valores
adequados para 37 amostras e, após reação de sequenciamento e análise de qualidade dos
eletroferogramas, foram obtidas 33 sequências consenso. Análises comparativas entre
estas sequências levaram à definição de seis haplótipos, que foram assim denominados:
HP03 (amostras 068 e 069); HP04 (82, 143, 222 e 231); HP05 (233 e 243); HP06 (47 e
49); HP07 (159 e 168) e HP08 (046, 049, 057, 060, 078, 109, 173, 195 e 261). Para o
restante das sequências, a identidade nucleotídica variou de 99,3% a 99,8%. Em relação
às sequências do banco de dados, identidades de 98% a 99% foram observadas, sendo
associadas a amostras brasileiras e da América Latina.
As sequências DENV4 deste estudo, após análise filogenética pelo método de
máxima verossimilhança, utilizando-se amostras representativas de todos os genótipos
deste sorotipo, foram classificadas como genótipo II (Figura 4). As sequências de Goiânia
foram agrupadas em um único clado, confirmando a forte identidade entre elas e com
outras sequências de origem brasileiras e da América Latinas, isoladas entre 2008 e 2013.
Observa-se ainda, que este clado apresenta menor homologia com isolados de DENV4
identificados em 1982.
44
Figura 4. Análise filogenética Maximun Likelihood das sequências correspondentes à junção E/NS1 isoladas de DENV1 em Goiânia de 2012-2013 pelo
método de Jukes-Cantor.
19 amostras representativas dos cinco genótipos disponíveis no GenBank foram utilizadas para genotipar as amostrar em estudo (sinalizadas com círculo
preto), e uma sequência de DENV3 foi incluída como grupo externo para enraizamento da árvore. O valor de boodtrap foi de 1000 replicatas e se encontra
anotado nos nós principais da árvore. Todas os isolados em Goiânia se encontram classificadas como genótipo V.
45
Figura 5. Análise filogenética Maximun Likelihood das sequências correspondentes à junção E/NS1 isoladas de DENV4 em Goiânia de 2012-2013 pelo
método de Jukes-Cantor.
14 amostras representativas dos quatro genótipos disponíveis no GenBank foram utilizadas para genotipar as amostrar em estudo (sinalizadas com círculo
preto), e uma sequência de DENV2 foi incluída como grupo externo para enraizamento da árvore. O valor de boodtrap foi de 1000 replicatas e se encontra
anotado nos nós principais da árvore. Todas os isolados em Goiânia se encontram classificadas como genótipo II.
46
6. DISCUSSÃO
O cenário da dengue em Goiânia desde 2001 consistiu-se de epidemias
sucessivas, sendo observada uma alternância entre os anos, com número expressivo de
casos, seguidas de anos com um decréscimo na quantidade de casos. A partir de 2008
seguiram-se três anos de epidemias consecutivas com um número crescente de casos
associados à cocirculação de três sorotipos. Em 2011, embora com a introdução do
DENV4, o estado relatou uma redução no número de casos notificados de 61,7% em
relação a 2010, e este padrão permaneceu até o ano de 2012, com uma redução de 21,4%.
Entretanto, em 2013, o levantamento epidemiológico realizado pela Secretaria de
Vigilância em Saúde do Estado apresentou dados alarmantes, com um aumento de 401%
do número de casos notificados e de 25% no número de óbitos (Goiás 2013).
Com o objetivo de colaborar na compreensão da circulação do vírus dengue
na cidade de Goiânia, o presente estudo avaliou a ocorrência de infecção pelo DENV no
município, no período epidêmico 2012-2013, em uma população com suspeita clínica de
infecção pelo vírus dengue e, utilizando a combinação de métodos sorológicos e
moleculares, identificou um índice de positividade de 43,9%. No Brasil, índices de
positividade variando de 48,5% a 81% têm sido descritos (Cordeiro et al. 2007, Daumas
et al. 2013, Ferraz et al. 2013), embora existam algumas divergências em relação às
metodologias utilizadas e o contexto das populações avaliadas. Em Goiás, estudo
desenvolvido por Feres et al. (2006), com amostras do período epidêmico de 2003, relatou
índice semelhante (47,1%), utilizando os métodos de isolamento viral, RT-PCR e
detecção de IgM.
A PAHO relata que, de todos os casos notificados na América em 2013, 12%
tiveram confirmação laboratorial (PAHO 2014) e, avaliação dos dados do SinanNet
mostrou que, em 2012, 25% dos casos notificados em todo território nacional foram
confirmados laboratorialmente, enquanto que para o estado de Goiás a confirmação
ocorreu em 22% das notificações. Para 2013, os dados referentes à infecção pelo DENV,
até o presente momento, não foram disponibilizados pelo SINAN. Entretanto, estes
levantamentos epidemiológicos utilizam apenas os dados disponíveis na ficha
epidemiológica do SINAN, que pode apresentar falhas, já que a maior parte das
notificações baseia-se apenas nos critérios de avaliação clínica. Embora esta avaliação
47
seja essencial para os casos de dengue, ela não é o suficiente para distinguir uma infecção
por DENV de outra doença febril, sendo assim necessária a confirmação pelo diagnóstico
laboratorial.
Também, dentro do processo de acompanhamento destes casos, existem
fatores que dificultam a confirmação laboratorial da infecção, como a não solicitação do
teste pelo clínico e até mesmo o não retorno do paciente à unidade de saúde para a
realização da pesquisa de IgM/IgG, o que pode levar a uma subnotificação dos casos que
poderiam ser confirmados laboratorialmente.
Os sintomas mais relatados pelos pacientes do estudo foram dor e febre,
sintomas inespecíficos que podem estar associados a um amplo espectro de doenças
(WHO 2009). Essa inespecificidade de sintomas dificulta um diagnóstico preciso e,
conforme referido, pode levar à subnotificação de casos de DENV. A análise dos dados
registrados pelo SINAN neste estudo demonstra a ocorrência de subnotificação, uma vez
que 30,3% da população, inclusa no presente estudo, por apresentar suspeita clínica de
infecção pelo DENV, não foi notificada no sistema. Também se observa uma deficiência
no processo de acompanhamento dos casos notificados, dos quais 28,1% não tiveram a
investigação concluída. Esses fatos tornam-se mais relevantes, ao associá-los aos índices
de positividade identificados no presente estudo, onde, 30,9% e 52,6% dos casos não
notificados ou notificados e não investigados, respectivamente, apresentavam infecção
pelo DENV.
A falha do sistema de notificação de dengue não se restringe apenas à cidade
de Goiânia. Avaliação do sistema de notificação do SINAN realizada por Duarte e França
(2006), mostrou que em Belo Horizonte (MG), de 1996 a 2002, ocorreu uma
subnotificação de 37% dos casos de dengue, a qual foi associada à má capacitação dos
profissionais de saúde no que se refere à vigilância epidemiológica ativa, fato também
observado durante a coleta das amostras analisadas. Outro estudo, comparando os dados
do Sistema de Informação sobre Mortalidade (SIM) e do SINAN para óbitos por dengue,
encontrou uma concordância entre os dois sistemas de apenas 19,6% (Moraes & Duarte
2009). Esse baixo índice de concordância demonstra a grande perda de informações
relevantes para o sistema de saúde do Brasil.
48
Entretanto, ressalta-se o importante papel destes sistemas de informação em
saúde que, apesar das dificuldades e necessidades de aperfeiçoamento, constituem fontes
de dados que apoiam o cálculo da maioria das estatísticas nacionais oficiais divulgadas
pelo Ministério da Saúde, as quais são fonte e suporte de pesquisas e processos de
investigação, fornecendo subsídios na elaboração de medidas de intervenção e prevenção
de agravos à saúde.
Neste estudo, observou-se uma diferença estatisticamente significativa do
índice de positividade da infecção pelo DENV em relação às unidades de saúde
pesquisadas, o que está de acordo com o padrão de distribuição das notificações de casos
de dengue na cidade de Goiânia no ano epidêmico 2013 (Goiânia 2013). Segundo este, o
CAIS Campinas (distrito sanitário Campinas-Centro) e o CAIS Cândida de Moraes
(distrito sanitário Noroeste) apresentaram maiores índices de positividade em relação ao
CAIS Chácara do Governador (distrito sanitário Leste). O mesmo ocorreu com a
distribuição da positividade de acordo com os meses de coleta das amostras. Observa-se
uma maior concentração de amostras positivas para DENV nos meses de janeiro a abril
de 2013, o que corresponde às semanas epidemiológicas com maior número de
notificação de casos de dengue neste ano (Goiânia 2013).
Análises considerando a infecção pelo DENV em relação às características
da população, como sexo, renda familiar e grau de instrução, não identificou diferenças
estatísticas significativas, o que está de acordo com os estudos de Cordeiro et al. (2007),
Ferraz et al. (2013), Alves et al. (2011) e Mishra et al. (2014). Embora não tenha sido
observada diferença significante entre positividade e idade, a maior parte dos casos
positivos se encontravam entre 20 e 40 anos de idade, que é a população frequentemente
relatada na literatura como a mais afetada pelo DENV (Cordeiro et al. 2007, Siqueira Jr
et al. 2008, Alves et al. 2011, Ferraz et al. 2013).
O marcador sorológico de infecção NS1 foi identificado em 30,5% das
amostras analisadas, sendo que em 24,5% dos casos de infecção por DENV, este foi o
único marcador detectado. Esses dados demonstram o benefício de se utilizar a pesquisa
de NS1 no diagnóstico desta infecção, perspectiva defendida por alguns autores,
principalmente por ser um método aplicável logo aos primeiros dias de sintomas da
doença, favorecendo um diagnóstico precoce (Singh et al. 2010, Bisordi el atl. 2011,
Kassim et al. 2011). A detecção do antígeno NS1 ocorre principalmente nos três primeiros
49
dias de sintomas (Hang et al. 2009), entretanto, no presente estudo, a detecção de NS1 foi
possível do 1º ao 7º dia de sintomas, com maior índice de positividade entre 4º e 5º dias
(36,6%), mas sem haver diferença estatística relevante. No entanto, não foram
encontrados estudos disponíveis com avaliação semelhante que permitam comparação,
visto que a maioria dos estudos epidemiológicos utilizam métodos de eficiência
amplamente reconhecida, como isolamento viral (padrão ouro), RT-PCR e detecção de
IgM (Ferez et al. 2006, Cordeiro at al. 2007, Bastos at al. 2012, Martins et al. 2014).
A pesquisa para presença do marcador IgM demonstou um índice de 13,6%,
que se mostra inferior ao relatado por Cordeiro et al. (2007), com 26,9% de positividade
em Recife (PE), e equivalente ao encontrado por Martinez-Vega at al. (2006), 14,8%
Santander-Colombia. A indicação para detecção de anticorpos contra DENV é a partir do
5º dia de sintomas quando a viremia do DENV tende a diminuir, devido ao aumento dos
anticorpos circulantes no soro (Koraka et al. 2003). As amostras do presente estudo se
encontravam, em sua maioria, entre o 1º e 5º dia de sintomas, o que pode justificar o
menor índice observado. Ademais, análise considerando a positividade para este
marcador, de acordo com o dia de início dos sintomas, encontrou diferença
estatisticamente significativa para o período entre o 6º e 7º dias de sintomas, corroborando
com o encontrado por Peeling et al. (2010). Ressalta-se também a detecção de IgM em
8,3% das amostras de indivíduos com até cinco dias de sintomas, o que demonstra a
possibilidade de detecção de IgM no período inicial da infecção por DENV (SEARO
2011).
A quantificação de anticorpos da classe IgG específicos para o DENV, é uma
ferramenta que pode ser utilizada para auxiliar na identificação de uma infecção
secundária pelo vírus. Neste caso, títulos elevados de IgG poderão estar presentes nos
primeiros dias de sintomas e assim, a partir do teste de avidez pode-se evidenciar a
infecção secundária (Guzman & Kouri 2004, Souza et al. 2004). O presente estudo
identificou este marcador em 16,2% da população. A ocorrência de infecção previa por
DENV foi relatada por 33,9% dos indivíduos entrevistados, dos quais, 5,0% apresentaram
positividade para o marcador IgG. Não obstante, nenhuma inferência a respeito de
infecção secundária nestes indivíduos pôde ser feita, uma vez que o teste realizado foi
apenas de caráter qualitativo.
50
A positividade para a detecção do RNA viral foi de 20,5%, valor próximo ao
encontrado na mesma região de estudo por Feres et al. (2006), porém abaixo da faixa de
detecção de 31,4% a 53,4% apresentada por outros estudos realizados no Brasil (Cordeiro
et al. 2007, Bastos et al. 2012, Martins et al. 2014). Esse intervalo de detecção que chega
a 25%, pode ser influenciado por variações de percentuais da população com diferentes
dias de sintomas. Ao se comparar a detecção desse marcador com os dias de sintoma dos
indivíduos, observou-se considerável diferença estatística, sendo o maior índice de
detecção encontrado no período entre 1º-3º dias. Esse achado é compatível com o período
de viremia do DENV (Peeling et al. 2010) e com o resultado encontrado por Costa e
Façanha (2011), no qual 75% das amostras positivas para o RNA viral se encontravam
neste mesmo período.
A associação de três marcadores (NS1, IgM e RNA viral) para o diagnóstico
de infecção por dengue aumentou notadamente a sensibilidade de detecção, considerando
que a positividade total de 43,9% é maior do que as apresentadas isoladamente para cada
marcador. O uso de testes combinados vem sendo descrito por diversos autores como uma
boa alternativa para se aumentar a sensibilidade da detecção de infecção por DENV (Arya
et al. 2011, Bisordi et al. 2011, Andries et al. 2012, Aryati et al. 2013). Os testes rápidos,
em sua maioria utilizando o princípio da imunocromatografia para detecção de
marcadores de infecção por DENV, têm apresentado alta sensibilidade, acima de 80%, e
passam a ser indicados para o diagnóstico rápido, principalmente em locais que dispõem
de poucos recursos técnicos em função da praticidade na sua realização (Osorio et al.
2010, Blacksell et al. 2011, Lima et al. 2012, Valdez Sandoval et al. 2012).
Desde a introdução do vírus dengue em Goiás, com o sorotipo 1 em 1994
(Siqueira Jr. 2001) epidemias sucessivas em decorrência da introdução de novos sorotipos
foram descritas. Após a introdução do DENV3 em 2002, observou-se uma predominância
deste em relação aos sorotipos 1 e 2 e, a partir de 2008, embora a manutenção da
cocirculação dos três sorotipos, o predomínio foi de DENV1 (Goiânia 2013). Em 2010
ocorreu a reintrodução do DENV4 no país e, em novembro de 2011, houve o diagnóstico
do primeiro caso com isolamento viral para DENV4 em Goiânia, período em que o
sorotipo predominante permaneceu sendo o DENV1. Em 2013, foram isolados os
sorotipos DENV1 e DENV4 com predominância do DENV4 (60%) (Goiânia 2013). É de
conhecimento o fato de que um novo sorotipo introduzido substitua gradativamente os
sorotipos preexistentes, por encontrar uma população suscetível do ponto de vista
51
imunológico. Os resultados encontrados no presente estudo corroboram os relatados pela
Vigilância Epidemiológica Municipal, com o DENV4 representando 68,5% das amostras
positivas para o RNA viral.
Análises filogenéticas das amostras DENV1 identificaram a circulação
apenas do genótipo V, sendo este o único genótipo circulante em território americano
descrito na literatura, introduzido em 1977 através da Jamaica (PAHO 1979, Allicock et
al. 2012). Da mesma forma que amostras de outros estudos brasileiros (Santos et al. 2004,
Santos et al. 2011, Carneiro et al. 2012, Martins et al. 2014), os isolados de DENV1 se
diferenciaram em dois clados. O primeiro composto pela maioria dos isolados,
demonstrou uma forte associação com outras amostras brasileira isoladas em 2010. No
outro clado, a amostra DVGO095 mostrou a existência de proximidade filogenética com
amostras brasileiras coletadas em diferentes períodos, bem como com de outros países da
América Latina. A identificação de clados para um mesmo genótipo tem sido discutida
na literatura, podendo refletir variantes genéticas (linhagens) com diferenças na história
evolutiva (Santos et al. 2011). Entretanto, para inferências a este respeito, é necessária a
avaliação de outras regiões do genoma viral, como análises filogenéticas realizadas a
partir da sequência do gene E completo (Wang et al. 2002, Zhang et al. 2005, Chu et al.
2013).
A avaliação das sequências nucleotídicas das amostras de DENV4 mostrou
altos valores de homologia entre estas. A caracterização molecular permitiu a
classificação de todas como genótipo II, o qual foi identificado pela primeira vez em 1981
em Dominica (Henchal et al. 1986). O genótipo II circula na América e no Sudeste
Asiático há quase 30 anos (Villabona-Arenas & Zanotto 2011) e supõem-se ter sido
reintroduzido no Brasil através da Venezuela (Souza et al. 2011). A análise filogenética
confirma a identidade entre as amostras, que constituíram um mesmo clado, em
associação a outros isolados brasileiros e venezuelanos isolados a partir de 2008.
Adicionalmente, a análise filogenética, sugere a existência de uma distância evolutiva
entre estas amostras e isolados datados de 1982. Entretanto, para a datação de amostras,
são necessárias análises filogenéticas mais abrangentes, considerando entre outros
fatores, taxas de substituição por sítio/ano (Foster et al. 2003, Souza et al. 2011).
A combinação de testes utilizada contribuiu para o aumento da detecção da
infecção por DENV, demonstrando seu benefício, principalmente no que se refere ao
52
marcador NS1, ainda pouco utilizado para estudos desse tipo. A avaliação molecular
utilizada preencheu uma lacuna de dados da região, uma vez que o último estudo com
este perfil refere-se a amostras do ano de 2003, antes da reintrodução do DENV4 no
Brasil. A genotipagem das amostras adiciona mais um parâmetro a ser avaliado na
vigilância laboratorial, visto que a entrada de novos genótipos na região poderia gerar a
mudança dos perfis epidêmicos apresentados até o momento.
O acompanhamento das epidemias de dengue por meio da confirmação
laboratorial dos casos, juntamente com um sistema de notificação ativo e eficaz, é de
suma importância para estabelecer uma base de dados completa a ser utilizada para
estudos de vigilância, colaborando para estudos da dinâmica do vírus e o padrão esperado
para as epidemias futuras. Assim, contribuem para o desencadeamento de medidas de
intervenção e prevenção, possibilitando o uso de recursos humanos e logísticos de forma
eficaz para o diagnóstico e tratamento, bem como atividades de educação para a
comunidade, fundamentais para a redução da transmissão da doença.
53
7. CONCLUSÕES
Foi identificada uma positividade de infecção por DENV em 43,9% na
população do estudo
Não foi observada associação entre infecção e as características da população
estudada.
A distribuição da positividade dos marcadores de infecção variou de acordo
com os dias de sintomas. Para o NS1, houve maior detecção entre os dias 4 e
5, enquanto IgM foi entre o 6º e 7º dias, e o RNA viral teve maior detecção
entre o 1º e 3º dias.
Foi identificada a cocirculação dos sorotipos DENV1 e DENV4,
classificados, respectivamente, como genótipo V e genótipo II.
54
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71
ANEXOS
ANEXO 1 - Parecer do Comitê de Ética
72
ANEXO 2 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA, PARASITOLOGIA E PATOLOGIA Setor de Microbiologia - Laboratório de Virologia
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO – V2
Prezado(a) Paciente,
Você está sendo convidado(a) a participar, como voluntário, em uma pesquisa. Este
documento irá lhe fornecer informações importantes sobre o estudo. Por favor, leia as instruções abaixo
atentamente. Após o esclarecimento sobre essas informações, no caso de aceitar fazer parte do estudo,
assine ao final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador
responsável. Em caso de dúvida, esclareça-as junto à equipe, para decidir se participa ou não do estudo. Em
caso de recusa você não será penalizado de forma alguma.
INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA
Título do Projeto: Identificação e caracterização molecular do vírus dengue em Goiânia – Goiás.
Pesquisador Responsável: Fabíola Souza Fiaccadori - Telefone para contato: 62 – 3209-6122
Pesquisadores Participantes: Divina das Dôres de Paula Cardoso; Vanessa Neiva Guimarães -
Telefone para contato: 62 – 3209-6122
Dúvidas e esclarecimentos – Comitê de Ética em Pesquisa (CEP/HMI): 62 – 3201-3374
Descrição da Pesquisa/Justificativa:
Atualmente, a dengue é um dos maiores desafios para a saúde pública no Brasil e no mundo. São
conhecidos quatro sorotipos distintos do vírus dengue (DENV1-4). Análises genéticas
demonstram extensiva variação viral, o que permitiu a identificação de variantes do vírus. A forma
clínica da dengue apresenta variações extremas, desde casos assintomáticos até casos graves como
febre hemorrágica do dengue (FHD) e síndrome do choque por dengue (SCD). Também se tem
demonstrado que determinadas variantes virais seriam mais agressivas estando associadas com
epidemias de FHD. A caracterização dessas variantes através da utilização de técnicas moleculares
abriu novas perspectivas aos estudos epidemiológicos por determinar a evolução e origem dos
vírus, e ainda poder revelar informações a respeito da agressividade viral em relação à gravidade
da doença e seu impacto sobre a população. Neste sentido, o presente estudo objetiva identificar
os sorotipos e suas variantes circulantes na cidade de Goiânia, Goiás no período de um ano, bem
como avaliar possíveis associações destas ao quadro clínico das infecções pelo vírus dengue.
Objetivo Geral:
Identificar aspectos clínicos, laboratoriais e virológicos associados a infecção pelo vírus dengue em
indivíduos atendidos em unidades de saúde no município de Goiânia, Goiás.
73
Objetivos Específicos:
- Determinar a prevalência da infecção pelo vírus dengue na população da cidade de Goiânia no
período do estudo;
- Caracterizar os achados clínicos associados a dengue na população de estudo;
- Identificar as complicações de dengue e determinar a temporalidade do agravamento da dengue;
- Detectar os sorotipos de DENV circulantes em Goiânia, no período do estudo;
- Identificar os genótipos de DENV nas amostras isoladas e proceder a caracterização de variantes
genéticas;
- Relacionar os genótipos detectados no estudo, bem como suas variantes, aos achados clínicos.
Informações Gerais/Esclarecimentos (Resolução CNS 196/96):
a) Participar deste estudo será uma decisão voluntária e você pode se recusar a participar ou retirar o
seu consentimento em qualquer fase da pesquisa, sem que seja necessária qualquer explicação.
Pedimos apenas que seja feito um comunicado da desistência, a qual não acarretará penalidade
alguma, muito menos prejuízos;
b) Antes e durante todo o curso da pesquisa, todos os pesquisadores participantes estarão disponíveis
para esclarecer dúvidas e fornecer as informações que se fizerem necessárias em relação a qualquer
ponto referente à pesquisa;
c) Se o paciente(a) concordar em participar, incialmente ele responderá a um questionário sobre dados
pessoais, clínicos e fatores de risco, conduzido pelo pesquisador responsável na mesma unidade de
saúde na qual você procurou atendimento e logo após serão coletados, por profissionais devidamente
treinados, de 5ml a 10ml de sangue através de punção venosa. As informações clínicas e laboratoriais
relacionadas à sua pessoa serão confidencialmente mantidas em sigilo o tempo todo. Nem seu nome
ou mesmo as iniciais irão constar em qualquer registro desta pesquisa. Sua identidade será, então,
mantida no mais absoluto sigilo;
d) Este estudo oferece baixos riscos para o(a) paciente. Durante a coleta de sangue poderá haver alguma
dor de curta duração devido à punção na pele. O sangue será colhido por técnicos treinados
utilizando seringas e agulhas descartáveis, conferindo segurança e minimizando o desconforto ao(a)
paciente. Complicações de coleta de sangue rotineira são raras e geralmente de pequeno porte. Se
houver pequena perda de sangue no local da punção poderá haver um leve desconforto (equimose)
que desaparecerá em poucos dias;
e) O espécime clínico ficará sob nossa guarda e responsabilidade durante a execução desta pesquisa e
para realização de estudos futuros para a pesquisa de outros vírus, desde que aprovados pelo Comitê
de Ética em Pesquisa;
f) Com os resultados desta pesquisa, os futuros pacientes e até mesmo você poderão se beneficiar,
indiretamente, com as novas informações que possivelmente serão obtidas a respeito do vírus
dengue. Estas informações poderão ser de extrema importância e utilidade para futuros processos de
prevenção (vacinação) e até de tratamento;
74
g) Durante todo o período da pesquisa, toda a equipe de pesquisadores estará disponível, de forma a
acompanhar os participantes da pesquisa, bem como seus responsáveis, e prestar assistência em caso
de necessidades pertinentes à pesquisa em questão;
h) O seu compromisso com o estudo será apenas de preencher o questionário no dia da coleta de sangue,
dessa forma, sua participação não acarretará nenhum gasto ou despesas, não sendo necessário o
ressarcimento de despesas decorrentes da participação na pesquisa;
i) Em caso de eventuais danos decorrentes da pesquisa, estes serão avaliados por equipe responsável,
a qual procederá as medidas de indenização que se fizerem necessárias.
_________________________________
Fabíola Souza Fiaccadori
Pesquisador Responsável
CONSENTIMENTO DA PARTICIPAÇÃO DA PESSOA COMO SUJEITO
Eu, ____________________________________________________, RG/CPF
_________________________, abaixo assinado, responsável por
____________________________________________________, autorizo sua participação no estudo
“Identificação e caracterização molecular do vírus dengue em Goiânia – Goiás.”, como sujeito,
autorizando a realização dos procedimentos e a publicação dos resultados obtidos. Fui devidamente
informado(a) e esclarecido(a) sobre a pesquisa, os procedimentos nela envolvidos, assim como os
possíveis riscos e benefícios decorrentes de minha participação. Foi-me garantido que posso retirar meu
consentimento a qualquer momento, sem que isto leve à qualquer penalidade.
Goiânia-GO, ________ de __________________ de 20___
Assinatura do responsável: ______________________________________________________
Testemunhas (não ligadas à equipe de pesquisadores):
Nome:______________________________________________Assinatura:________________________
Nome:______________________________________________Assinatura:________________________
75
ANEXO 3 - Questionário
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA, PARASITOLOGIA E PATOLOGIA
Setor de Microbiologia - Laboratório de Virologia
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS DENGUE EM GOIÂNIA –
GOIÁS.
QUESTIONÁRIO – IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE
Data Coleta:
Registro Virologia:
Nome Paciente: Nº prontuário:
Naturalidade:
Gênero:
Data de nascimento: Idade:
Unidade: Data do 1º atendimento:
Data dos primeiros sintomas: Data de internação:
Estado Civil:
Solteiro ( ) Casado/Amigado ( ) Viúvo ( ) Separado/Divorciado ( ) Si ( )
Viúvo
Separado
Si
Grau de instrução:
5 anos ( ) 6-9 anos ( ) 10-12 anos ( ) > 12 anos ( ) Si ( )
6-9 anos
10-12 anos
12 anos
Si
Renda Familiar:
1 salário mínimo ( ) 1-2 salários mínimos ( ) > 2 salários mínimos ( ) Si ( )
1-2 salários
2 salários
Si
Profissão:
Endereço:
Cidade/Estado: Telefone:
Origem: ( ) UBS ( ) secundário ( ) terciário ( ) outros:
QUESTIONÁRIO – DADOS CLÍNICOS
Manifestações Clínicas: (1-Sim, 2-Não, 9-Ignorado)
Rash cutâneo Dor de cabeça Fraqueza
Artralgia Dor abdominal Anorexia
Dor de garganta Dor retrocular Dor óssea
Mialgia Calafrios Náuseas
Vômitos Tosse Diarreia
Febre Prova do laço Ascite
76
Derrame pleural Hepatomegalia Mal Estar
Sangramento: (1-Sim, 2-Não, 9-Ignorado)
Metro/menorragia Equimose Hematúria
Epistaxe Hemoptise Petéquia
TGI Conjuntiva
Antecedentes: (1-Sim 2-Não, 9-Ignorado)
Usou AAS Usou Diclofenaco Outro AINH
Hipertenso Diabético DPOC
Colagenose Dengue prévia Tabagismo
Etilismo Outro: Usou Dipirona
Usou Paracetamol
Internação: (1-Sim 2-Não, 9-Ignorado)
Até 12h 12 a 24h 24 a 36h
36 a 48h 48 a 72h >72h
Óbito: (1-Sim 2-Não, 9-Ignorado)
( ) Obs:
Informações adicionais:
Responsável pelo preenchimento das informações:
Nome:_______________________________________________________________
Assinatura: ___________________________________ Data:_____/_____/_____
77
EXAMES:
DATA
Eritrócitos
Hb
Htc
Leucócitos
Bastões
Neutrófilos
Linfócitos
Monócitos
Eosinófilos
Basófilos
Linf.Atípicos
Plaquetas
AST
ALT
BI
BD
FA
γGT
Albumina
Globulina
Outras observações: -
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
