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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DA RELAÇÃO
PARASITO-HOSPEDEIRO
Danielle Silva Araújo
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS PROTEÍNAS DA PAREDE
CELULAR EM Paracoccidioides sp.
Goiânia
2014
i
Danielle Silva Araújo
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS PROTEÍNAS DA PAREDE
CELULAR EM Paracoccidioides sp.
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Biologia
da Relação Parasito-Hospedeiro da
Universidade Federal de Goiás para
obtenção do Título de Mestre.
Orientadora: Célia Maria de Almeida
Soares
Co-orientadora: Ana Flávia Alves
Parente
Goiânia
2014
Ficha catalográfica elaborada automaticamente com os dados fornecidos pelo(a) autor(a), sob orientação do Sibi/UFG.
Silva Araujo, Danielle IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS PROTEÍNAS DAPAREDE CELULAR EM Paracoccidioides sp. [manuscrito] / DanielleSilva Araujo. - 2014. xii, 95 f.
Orientador: Profa. Dra. Célia Maria de Almeida Soares; coorientador Ana Flávia Alves Parente.Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Instituto dePatologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) , Programa de PósGraduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro, Goiânia, 2014. Bibliografia. Inclui siglas, abreviaturas, gráfico, tabelas, lista de figuras, lista detabelas.
1. Cell Wall. 2. Paracoccidioides. 3. Proteoma . 4. Micélio. 5.Levedura. I. Maria de Almeida Soares, Célia , orient. II. Alves Parente,Ana Flávia , co-orient. III. Título.
ii
Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro da
Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno (a): Danielle Silva Araújo
Orientador (a): Célia Maria de Almeida Soares
Co-orientador (a): Ana Flávia Alves Parente
Membros:
1. Célia Maria de Almeida Soares
2. Alexandre Melo Bailão
3. Lilian Cristiane Baeza
Data: 24/02/2014
iii
À Deus, ofereço.
Aos meus pais e irmã, dedico.
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,
mas lutei para que o melhor fosse feito.
Não sou o que deveria ser,
mas graças a Deus, não sou o que era antes”.
Martin Luther King
iv
AGRADECIMENTOS
À Deus, porque tem sido tudo em minha vida. Por todas as bênçãos concedidas, por
todos os milagres realizados. Por iluminar o meu caminho. Por sempre estar comigo, me
ajudando a subir cada degrau da vida. Por ser minha inspiração ao prosseguir.
Aos meus pais, Ivani e Joaquim, a vocês que me fizeram acreditar na realização dos
meus sonhos e trabalharam muito para que eu pudesse realizá-los.
A minha irmã, Helen, pelo apoio, amizade e companheirismo. Por sempre me ajudar
quando eu mais preciso.
À minha Vó Ana e Margarida, pois sei que se estivessem aqui estariam muito felizes
por essa minha conquista.
Reconheço que sem o apoio e investimento afetivo da família que tanto amo, em
especial da tia Nilda e tio Oswaldo e das amigas Lucy e Luiza não teria chegado até
aqui.
À Profa. Dra. Célia Maria de Almeida Soares, pela orientação, paciência e confiança.
Admiro sua competência e profissionalismo.
À Dra. Ana Flávia Alves Parente, pela co-orientação e ajuda durante esse trabalho
realizado.
Aos professores, Alexandre, Clayton, Juliana, Maristela e Silvia, por todos os auxílios e
preciosos ensinamentos, que foram muito valiosos.
Aos professores Milton, Alexandre e Clayton pela contribuição no exame de
qualificação. Por expandirem meu conhecimento, importante ferramenta para a minha
formação acadêmica e científica.
v
Aos Professores, Alexandre e Lilian por aceitarem participar da banca de defesa da
dissertação de mestrado.
Ao programa de Pós-graduação em Biologia da Relação-Parasito Hospedeiro,
coordenação, secretaria e corpo docente.
Ao auxílio financeiro, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela concessão da bolsa de estudo.
Ao Paulo Herinque, pela sua amizade, por sempre ter me entendido e me aceitado. Por
sempre estar ao meu lado.
Às amigas, Sara, Roberta, Késsia e Mirella, por fazerem presentes na minha vida
mesmo eu sendo tão ausente.
Aos meus amigos, Alessandro, Edilania, Vanessa, Amanda, Igor, Dienny, Fabiana,
Lucas Nojosa, Hanna, Lele, Laura, pela infinita ajuda, amizade, companheirismo e
incentivo em todos os momentos.
Agradeço à Cristina, Laura, Lilian, Patrícia, Mirelle, Sheyla pela disponibilidade e
atenção em me ajudar.
Aos colegas do laboratório, pelo convívio, experiências compartilhadas, por
participarem direta ou indiretamente para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos funcionários da limpeza, pela dedicação de todos os dias.
À todos que fizeram desses dois anos, anos mais alegres.
vi
SUMÁRIO
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS .................................................................. ix RESUMO ........................................................................................................................ xi
ABSTRACT ................................................................................................................... xii 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
1.1. Aspectos Gerais .................................................................................................... 1
1.2. Parede Celular em Fungos .................................................................................. 4
1.3. Parede Celular de Paracoccidioides spp. ........................................................... 6
1.4. Proteínas da Parede Celular de Fungos ............................................................ 8
2. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................... 13 3. OBJETIVO GERAL E OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................... 14
3.1. Geral ................................................................................................................... 14
3.2. Específicos .......................................................................................................... 14
4. MÉTODOS ................................................................................................................. 15
4.1. Manutenção do fungo ........................................................................................ 15
4.2. Isolamento e purificação das proteínas da parede celular de
Paracoccidioides sp. .................................................................................................. 15
4.2.1 Extração de proteínas por tratamento com SDS/DTT: Obtenção da fração
F1 ................................................................................................................................ 16
4.2.2. Extração de proteínas por tratamento com NaOH: Obtenção da Fração F2
.................................................................................................................................... 16
4.3. Deglicosilação das proteínas da fração F2 ....................................................... 17
4.4. Digestão tríptica e preparação de amostras para análises por LC-MS ........ 17
4.5. Aquisição de dados por nanoUPLC-MSE ........................................................ 18
4.6. Análises in silico ................................................................................................. 19
5. RESULTADOS .......................................................................................................... 22
5.1. Enriquecimento das proteínas da parede celular/ validação dos extratos ... 22
5.2. Perfil qualitativo das frações de proteínas da parede celular ....................... 22
5.3. Análise das proteínas da parede celular nas formas miceliana e
leveduriforme ............................................................................................................ 23
5.3.1. Proteínas localizadas na fração F1 da fase leveduriforme de
Paracoccidioides sp. .................................................................................................. 24
5.3.2. Proteínas localizadas na fração F2 da fase leveduriforme de
Paracoccidioides sp. .................................................................................................. 25
vii
5.3.3. Proteínas expressas nas frações F1 a F2 na fase miceliana de
Paracoccidioides sp. .................................................................................................. 25
5.4 Análises in silico das proteínas da parede de Paracoccidioides sp. ................ 26
6. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 29
6.1. Considerações gerais ......................................................................................... 29
6.2. Identificação de proteínas covalentemente ligadas à parede ......................... 30
6.3. Proteínas que utilizam vias de secreção não clássicas para alcançar a
superfície celular ....................................................................................................... 30
6.4. Identificação de proteínas com funções intracelulares estabelecidas ........... 32
6.5. Proteínas identificadas nas frações de proteínas da parede celular na fase
miceliana .................................................................................................................... 36
7. CONCLUSÃO ............................................................................................................ 75 8. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 76
viii
TABELAS E FIGURAS
Figura 1. Parede celular de Paracoccidioides sp............................................................. 7
Figura 2. Fluxograma das estratégias experimentais realizadas no presente estudo ..... 21
Figura 3. Analise da qualidade da fração da parede celular. ......................................... 22
Figura 4. Perfil qualitativo das proteínas da parede celular nas fases miceliana e
leveduriforme de Paracoccidioides sp. .......................................................................... 23 Figura 5. Proteínas identificadas nas fases leveduriforme e miceliana ......................... 24 Figura 6. Número de proteínas da parede celular identificadas secretadas por vias
clássicas e não clássicas. ................................................................................................. 27
Figura 7. Número de proteínas identificadas que apresentam sítios de N e O-
glicosilação nas frações 1 e 2 das fases de levedura e micélio. ...................................... 28
Tabela 1. Proteínas identificadas na fração de proteínas associadas à parede tratadas com
SDS/DTT de Paracoccidioides sp. expressas na fase de levedura ...............................37
Tabela 2. Proteínas identificadas na fração álcali sensível tratada com NaOH 30mM de
Paracoccidioides sp. expressas na fase de levedura....................................................... 48
Tabela 3. Proteínas identificadas na fração álcali sensível tratadas com NaOH 30mM e
N-glicosidase F de Paracoccidioides sp. expressas na fase de levedura........................ 65
Tabela 4. Proteínas identificadas na fração de proteínas associadas à parede tratadas
com SDS/DTT de Paracoccidioides sp. expressas na fase de micélio .......................... 69
Tabela 5. Proteínas identificadas na fração álcali sensível tratadas com NaOH 30mM e
N-glicosidase F de Paracoccidioides sp. expressas na fase de micélio ......................... 71
ix
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
ACN: acetonitrila
ASL-PPCs: proteínas da parede celular sensíveis a álcali
Cacl2: cloreto de cálcio
DTT: ditiotreitol
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético
EtNP: fosfoetanolamina
F1: proteínas associadas à parede, extraídas por SDS e agentes redutores
F2: proteínas covalentemente ligadas à parede, extraídas em meio álcali
FMD: formamidase
GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
GAS: glicofosfolipídeo ancorado à superfície
GEL: beta-1,3-glicanosiltransferase
GPI: glicosilfofatidilinositol
GPI-PPCs: proteína da parede celular GPI ancorada
HF-piridina: fluoreto hidrogenado de piridina
IFNγ: interferon gama
MEC: matriz extracelular
NaCl : cloreto de sódio
nanoUPLC-MSE: nano cromatografia líquida de ultra desempenho- espectrômetro de
massas
NaOH: hidróxido de sódio
NO: óxido nítrico
PAMP: padrões moleculares associados ao patógeno
PbDfg5p: proteína Dfg5 de Paracoccidioides sp.
PbGel3p: proteína Gel3 de Paracoccidioides sp.
PCM: paracoccidioidomicose
PPC: proteínas da parede celular
Pir: proteínas com repetições internas
Pir-PPCs: proteínas da parede celular com repetições internas
PMSF: fluoreto de fenil-metil-sulfonil
x
RE: retículo endoplasmático
SDS: dodecil sulfato de sódio
SOD: superóxido dismutase
TFA: ácido trifluoroacético
TNF-α: fator de necrose tumoral alfa
xi
RESUMO
Paracoccidioidomicose é uma importante micose sistêmica na América latina, com alta
incidência no Brasil, Argentina, Colômbia e Venezuela. A doença é atribuída ao fungo
termodimórfico Paracoccidioides spp.. Durante o processo infecioso podemos destacar
o papel desempenhado pela parede celular, estrutura esta, vital para o crescimento,
sobrevivência, e morfogênese do fungo, a qual está em constante mudança em resposta
a sinais do ambiente. O interesse no estudo da parede celular de fungos ocorre
principalmente pela ausência dessa estrutura nas células de mamíferos; por esse motivo
os componentes da parede são alvos promissores para o desenvolvimento de novas
drogas. Para descrever o perfil das proteínas constituintes da parede celular (PPCs) de
Paracoccidioides sp. nas formas leveduriforme e miceliana, foi utilizada uma
abordagem proteômica combinando cromatografia líquida em nanoescala com
espectrometria de massas multiplexada (nanoUPLC-MSE). Entre as proteínas
identificadas foi encontrada uma transglicosidase, homologa a Crh1p, correspondendo a
uma proteína GPI ancorada, conhecida por estar envolvida em ligar quitina à β-glucana.
Adesinas anteriormente descritas em Paracoccidioides sp. como enolase, gliceraldeído-
3-fosfato desidrogenase, álcool desidrogenase, frutose-1,6-bifosfato aldolase e algumas
chaperonas também foram identificadas. Além disso, nós identificamos a formamidase
que tem sido descrita como localizada na parede celular e pode estar envolvida no
metabolismo de nitrogênio, além de contribuir com propriedades antigênicas.
xii
ABSTRACT
Paracoccidioidomycosis (PCM) is the important systemic mycosis in Latin America,
with high incidence in Brazil, Argentina, Colombia and Venezuela. The disease has
been attributed to the thermodimorphic fungus Paracoccidioides sp.. During the
infective process, we can highlight the role of the cell wall, which is a dynamic
structure, vital for growth, survival and morphogenesis of the fungus. In addition, this
structure is constantly changing in response to environmental signals and different
stages of the cycle of the fungus. The interest in the fungal cell wall occurs primarily by
lack of this structure in mammalian cells; for this reason cell wall components are
promising targets for antifungal drug design. In order to describe the profile of cell
wall proteins (CWPs) of Paracoccidioides sp., it was used a proteomic approach
coupling nanoscale liquid chromatography to multiplexed mass spectrometry
(nanoUPLC-MSE) to identify the CWPs isolated from Paracoccidioides sp. yeast cells
and mycelia. Among the identified proteins, it was found a transglycosylase orthologue
to the Crh1p, which is a GPI anchored protein, known to be involved in attaching chitin
to β-glucan. Adhesins previously described in Paracoccidioides sp. such as enolase,
glyceraldehyde-3-phosphate, alcohol dehydrogenase, fructose-1,6-biphosphate aldose
and some chaperones were also identified. Moreover, we identified formamidase that
was previously described as localized in the fungus cell wall and may be involved in
nitrogen metabolism besides contributing with antigenic properties.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Aspectos Gerais
Paracoccidioides spp. é um fungo termodimórfico, agente etiológico da
paracoccidioidomicose (PCM), doença granulomatosa crônica, endêmica na América
Latina, com alta incidência no Brasil, Argentina, Colômbia e Venezuela (Franco et al.
1993; Lacaz, 1994; McEwen et al., 1995; Restrepo et al. 2000 a; Bellisimo et al., 2011).
Paracoccidioides spp. pertence ao filo Ascomycota, ordem Onygenales e família
Ajellomycetaceae (Leclerc et al., 1994; James et al., 1996; Bialek et al., 2000;
Untereiner et al., 2004; Sturme et al., 2011) grupo no qual se incluem também,
Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum, Emmosia parva e E. crescens. Em
estudos recentes o fungo patogênico Lacazia loboi foi incluído também neste grupo,
como uma espécie próxima ao Paracoccidioides spp. (Theodoro et al., 2012). Em sua
maioria os membros dessa família compartilham características comuns como,
apresentarem uma fase saprobiótica e uma patogênica e apresentarem um envolvimento
com o hospedeiro vertebrado (Untereiner et al., 2004).
Inicialmente o complexo Paracoccidioides brasiliensis era considerado
espécie única de seu gênero. Nesse sentido em abordagens moleculares realizadas por
Matute e colaboradores (2006), foram descritas três espécies filogenéticas pertencentes
ao complexo Paracoccidioides: S1 (espécie 1), compreendendo 38 isolados,
encontrados no Brasil, Argentina, Peru, Paraguai e Venezuela; PS2 (espécie filogenética
2) contendo 6 isolados, presentes no Brasil e Venezuela, PS3 (espécie filogenética 3)
incluindo 21 isolados da Colômbia. Estudos posteriores propuseram a existência de uma
nova espécie do complexo Paracoccidioides sp. compreendida por isolados
pertencentes a um grupo filogenético que apresentava alta divergência com as outras
três espécies filogenéticas identificadas, denominado como Paracoccidioides lutzii, que
representa o isolado Pb01-like (Carrero et al., 2008). Recentemente tem sido proposto
dentro do grupo Paracoccidioides brasiliensis a espécie filogenética 4 (PS4) o qual
inclui isolados recuperados da Venezuela, porém ainda é pouco caracterizada (Salgado-
Salazar et al., 2010; Theodoro et al.,2012; Bocca et al., 2013). Neste contexto o
complexo Paracoccidioides sp. é composto por quatro linhagens filogenéticas distintas
(S1, PS2, PS3 e Pb01-like).
2
Aspectos como a ecologia do Paracoccidioides spp. ainda não são
completamente entendidas, porém várias evidências têm sugerido o solo como principal
habitat da fase saprofítica do fungo, uma vez que ele tem sido isolado esporadicamente
deste local (Terçarioli et al., 2007). O fungo tem sido frequentemente encontrado em
diferentes espécies de tatus, como o Dasypus novemcintus e Cabassus centralis já sendo
isolado em uma frequência entre 75-100% dos animais capturados nas áreas endêmicas
da PCM (Corredor et al. 1999; Bagagli et. al., 2003; Bagagli et. al., 2009; Richini-
Pereira el al. 2009). Esse aspecto pode estar associado ao fato desses animais estarem
frequentemente em contato com o solo. Além disso, uma característica importante que
contribui para a dispersão dos esporos do fungo está ligada ao hábito desses animais em
escavar tuneis e viver sobre tocas (Theodoro et al., 2005; Bagagli et al., 2006; Boca et
al., 2013). O fungo tem sido isolado também em cães, animais domésticos, primatas e
em fezes de morcego e pinguins (Shome & Batista, 1963; Grose & Tamsitt, 1965;
Negroni 1966; Assis et al., 1990; Camargo et al., 1992; Corte et al. 2007; Fontana et al.,
2010; Farias et al. 2011). Estudos têm mostrado que o Paracoccidioides spp. ocorre
preferencialmente em locais de solo com alto índice de chuvas, umidade relativamente
alta, abundância de vegetação e a presença de curso de água (Barrozo et al., 2009;
Barrozo 2010).
Paracoccidioides spp. é um fungo que apresenta dimorfismo térmico,
desenvolvendo-se como micélio na condição saprobiótica ou quando cultivado em
temperaturas entre 18-25oC, com hifas finas e septadas, com clamidosporos terminais
ou intercalares e com vários núcleos (Brummer et al., 1993). A forma leveduriforme se
manifesta quando do cultivo em temperatura a 37oC ou nos tecidos do hospedeiro,
apresentando morfologia oval ou alongada (San-Blas,1993; Brummer et al., 1993), com
múltiplos brotamentos, assemelhando-se a uma “roda-de-leme” (Furtado et al., 1967). A
infecção ocorre pela inalação de propágulos infectantes, produzidos pelo micélio, os
quais ao atingirem os pulmões se diferenciam em células leveduriformes devido ao
aumento da temperatura corporal (36-37oC), e assim estabelecendo a infecção (McEwen
et al. 1987; San-Blas et al., 2002).
A incidência da PCM em zonas endêmicas varia de 1 a 3 novos casos por
100 mil habitantes ao ano. Estudos apontam, a PCM como a oitava causa de
mortalidade por doença infecciosa crônica entre as doenças infecciosas e parasitárias.
Dados isolados mostraram que a paracoccidioidomicose é a principal doença
3
responsável em causar mortes entre as micoses sistêmicas, seguido pela criptococose,
candidíase e histoplasmose (Prado et al. 2009). No Brasil, a doença tem distribuição
mais frequente nos estados de São Paulo, Paraná, Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro e
Goiás (Shikanai-Yasuda et al., 2006). Contudo, nas últimas décadas a doença tem
atingido a região Norte do país, sendo relatados casos da doença na Amazônia
(Marques-da Silva et al., 2012).
A doença afeta principalmente indivíduos que exercem atividades
relacionadas com a agricultura, onde através da manipulação do solo, os esporos do
fungo são inalados (Franco et al. 2000). A PCM acomete preferencialmente homens de
idade entre 30 e 50 anos (Londero & Ramos, 1990; Valle et al., 1992). A incidência da
doença até a puberdade é a mesma em ambos os sexos, porém na fase adulta, mais de
80% dos pacientes são do sexo masculino (Martinez, 1997; Colombo et al., 2011).
Acredita-se que a menor incidência no sexo feminino seja devido à ação protetora do
hormônio 17-β-estradiol, visto que este hormônio possui a capacidade de inibir a
transição de micélio ou conídio para a fase leveduriforme (Loose et al., 1983; Salazar et
al., 1988). Dados de transmissão da micose de uma pessoa para outra não tem sido
reportado. Por outro lado, o uso de tabaco, ingestão de álcool aumentam o risco para o
desenvolvimento da PCM (dos Santos et al., 2003).
A PCM apresenta duas formas clínicas principais: forma aguda ou subaguda
e a forma crônica. O espectro da doença vária de um curso assintomático, para uma
doença severa ou até mesmo a uma doença fatal (Franco et al., 1987). Essas
manifestações dependem de diversos fatores como, por exemplo, idade, resposta
imunológica do hospedeiro, carga fúngica inalada. A forma juvenil, aguda (subaguda)
inclui de 3 a 5% dos casos, apresentando um curso rápido, acometendo o sistema
reticuloendotelial, sendo predominante em crianças e adolescentes. A forma crônica da
doença ocorre em 90% dos pacientes, sendo de curso lento, no qual os sintomas podem
ser manifestados anos após a infecção, apresentando em 80% dos casos manifestações
pulmonares (Brummer et al.,1993; Morejón et al., 2009).
4
1.2. Parede Celular em Fungos
A parede celular é uma estrutura dinâmica e complexa, que está em contínua
mudança em resposta às alterações na condição de cultivo e estresse ambiental (Latgé,
2007). Por estar localizada na interface entre o micro-organismo e o meio ambiente, a
parede celular participa diretamente da interação parasito-hospedeiro, sendo um
componente essencial para a sobrevivência do patógeno, uma vez que seus componentes
favorecem a instalação do fungo e o ajudam a resistir às agressões vindas do hospedeiro
(San-Blas & San-Blas, 1977; Gow & Hube, 2012). Suas funções estão relacionadas à
proteção contra uma ampla variedade de condições ambientais como estresse osmótico
e mecânico. Outro fator importante está relacionado ao requerimento da parede celular
para o estabelecimento e manutenção da forma da célula fúngica, além de fornecer
rigidez à célula.
Em fungos patogênicos a parede celular é crítica para virulência e
patogenicidade, além de fornecer propriedades adesivas importantes para a invasão ao
tecido do hospedeiro bem como proteção contra os mecanismos de defesa (De Groot et
al., 2005; Levin, 2011; Goodwin et al., 2013). Sendo assim, seu papel biológico
essencial, bioquímica única, organização estrutural e sua ausência nas células dos
mamíferos, tem tornado à parede celular um alvo promissor para o desenvolvimento de
drogas antifúngicas (Groll et al., 1998; Latgé, 2007). Corroborando com essa
propriedade da parede celular dos fungos, dados tem mostrado que drogas fungicidas e
fungistáticas cujo alvo é interferir na biogênese da parede celular estão entre os agentes
mais efetivos para o tratamento de infecções fúngicas (Goodwin et al., 2013).
Em fungos dimórficos, mudanças extensivas na composição e organização
da parede celular podem ocorrer durante o crescimento e desenvolvimento das células
fúngicas. A composição da parede celular pode variar entre diferentes espécies de
fungos, porém, ela é composta basicamente de proteínas, manoproteínas,
polissacarídeos e lipídeos, que são ligados por diferentes maneiras, a fim de formar esta
estrutura vital aos fungos patogênicos. (De Groot et al., 2005; Xie & Lipke, 2010;
Orlean, 2012).
Dentre os componentes da parede celular estão os polissacarídeos, os quais
são formados por glucanas e quitinas. As glucanas são sintetizadas por glucanas sintases
associadas à membrana celular, um complexo de proteínas que utiliza UDP-glicose
5
intracelular como substrato e catalisa a síntese do polímero linear de glucana. Uma vez
formados, os polímeros lineares de glucanas são então deslocados para o meio externo
(Lesage & Bussey, 2006). De uma maneira semelhante, a quitina é sintetizada por
quitina sintases, enzimas que possuem múltiplos domínios transmembrana, os quais
formam canais onde os polímeros de quitina passam para alcançar o meio externo. É
reconhecido que proteínas que se ligam covalentemente aos componentes da parede,
como as glicoproteínas, apresentam um peptídeo sinal que as direcionam a síntese nos
ribossomos ligados ao reticulo endoplasmático. Neste compartimento, essas proteínas
sofrem modificações pós-traducionais podendo ser ligadas à sua estrutura oligossarídeos
N-ligados e uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Posteriormente algumas
proteínas são O-glicosiladas no complexo de Golgi. Assim as proteínas agora
modificadas podem então ser transportadas para a parede celular. Uma vez que as
glucanas, quitina e glicoproteínas são liberadas na parede celular, enzimas
especializadas as reconhecem e ligam covalentemente esses componentes da parede
celular uns aos outros, gerando uma estrutura tridimensional de glucanas, quitina e
glicoproteínas. Essas enzimas possuem funções de glicosil hidrolase cortando os
polímeros da parede celular, assim como uma função de glicosil transferase criando
uma nova ligação que une um polímero a outro (Goodwin et al., 2013).
Componentes da parede celular têm sido caracterizados como importantes
fatores de virulência e patogenicidade. Os polissacarídeos de parede desempenham
importantes funções como padrões moleculares associados ao patógeno (PAMP) sendo
importantes imunomoduladores, além de desempenharem funções relacionadas à
virulência e evasão do sistema imune do hospedeiro (San-Blas & San-Blas, 1977;
Hallak et al.,1982; Restrepo-Moreno, 1993; Silva et al., 1997). A β-glucana é um
importante imunomodulador na resposta contra infecções fúngicas, induzindo a
secreção de TNF-α que potencializa a resposta inflamatória e eliminação do patógeno
(Brow et al., 2002; Steele et al., 2003; Brown et al., 2003; Steele et al., 2005; Rubin-
Bejerano et al., 2007). Já a α-1,3-glucana está associada com a virulência em diversos
fungos entre eles Paracoccidioides spp., contribuindo para latência do fungo,
protegendo a β-glucana do reconhecimento das células do sistema imune inato,
consequentemente reduzindo a produção de TNF-α pelas células infectadas (San-Blas
&San-Blas, 1977; Rappelye et al., 2006; Lemus et al., 2013).
6
1.3. Parede Celular de Paracoccidioides spp.
A parede celular do fungo patogênico Paracoccidioides spp. contém
polissacarídeos, proteínas e lipídios, sendo que sua composição e organização estrutural
estão em constantes mudanças em resposta a condições ambientais e estresse, bem
como durante o ciclo celular (San-Blas & San-Blas, 1977; San-Blas & Niño-Veja,
2008). Em Paracoccidioides spp. foi demonstrado diferenças estruturais nos
carboidratos das formas miceliana e leveduriforme. Em micélio além de glicose e
glicosamina, também são encontradas pequenas quantidades de galactose e manose
(Kanetsuna et al., 1969; San-Blas & San-Blas, 1977). O complexo de polissacarídeos
inclui α-1,3-glucana, presente nas células leveduriformes, que decresce drasticamente
quando o fungo assume a morfologia miceliana, a qual apresenta predominantemente β-
glucana (Kanetsuna et al., 1972; San-Blas, 1982). Análises transcricionais revelaram
que vários genes relacionados com a síntese de carboidratos da parede são induzidos
durante a transição. Entre eles a indução de genes codificantes das enzimas
fosfoglicomutase, UDP-glicose pirofosforilase e α-1,3-glucana sintetase, permitindo o
aumento da síntese de α-1,3-glucana na forma leveduriforme (San-Blas, 1982; Bastos et
al., 2007; San-Blas & Ninõ-Vega, 2008).
A quitina é um componente que está presente nas formas miceliana e
leveduriforme de Paracoccidioides spp., sendo, entretanto encontrada em proporções
distintas dependendo da morfologia. A fase patogênica da levedura possui uma
quantidade maior de quitina comparada com a miceliana. Não foram observadas
diferenças significativas na quantidade de lipídeos e hexoses em ambas as formas, mas
comparando o teor proteico, a forma miceliana apresenta um maior conteúdo, além
disso, as proteínas são mais rígidas, por possuírem maiores quantidades de pontes
dissulfeto (Kanetsuna et al.,1969; San-Blas & San-Blas, 1977).
7
Estruturalmente, os componentes da parede celular de Paracoccidioides
spp. são dispostos em camadas (Figura 1). Estudos mostraram, através de microscopia
eletrônica, que a parede celular da fase miceliana possui uma única camada com 80 a
150 nm de espessura, o qual compreende uma rede microfibrilar de β-1,3-glucana e em
menor quantidade β-1,6-glucana que se interconectam com a quitina (polímeros de N-
acetilglicosamina unidas por ligações β-1,4), localizada na parte interna da parede
(Carbonell & Rodriguez, 1968; San-Blas & San-Blas, 1977; San-Blas,1982). Na forma
de levedura a parede possui três camadas, com 200 a 600 nm de espessura, sendo que a
camada interna é formada por quitina e β-glucana e a camada externa por α-glucana
(Carbonell, 1972; San-Blas, 1982).
Figura 1. Parede celular de Paracoccidioides sp. (A) Parede celular de levedura x 40.000 mostrando três camadas
distintas, duas eletrodensas alternadas por uma camada translúcida. A camada externa é formada por α-1,3-glucana,
enquanto a interna por uma rede de filamento de quitina e β-glucana. (B) Parede celular da forma miceliana x 38.000
mostrando uma única camada, onde quitina, proteínas e β-glucanas se interconectam. Adaptado de San-Blas & San-Blas
(1977).
8
1.4. Proteínas da Parede Celular de Fungos
Na complexa estrutura da parede celular, conjuntos de diferentes proteínas
se ligam por diferentes maneiras à rede microfibrilar de polissacarídeos que cerca a
membrana plasmática (Klis et al., 2001). Acredita-se que as proteínas de parede
possuem funções estruturais e atividades catalíticas relacionadas à: montagem de
macromoléculas, remodelamento da parede durante o crescimento celular e
morfogênese. Além disso, as proteínas da parede celular têm função na absorção de
nutrientes, na adaptação da célula a diferentes condições de estresse, patogênese,
detoxificação de radicais de oxigênio, bem como na relação patógeno-hospedeiro
(Hoyer et al., 1998; Staab el al. 1999; Schaller et al, 2005; Almeida et al., 2008;
Castilho et al., 2008; Fronhner et al., 2009; Goodwin et al., 2013).
Essas proteínas são frequentemente decoradas com cadeias de carboidratos
consistindo de resíduos de manose em sua maioria, denominadas manoproteínas. As
proteínas da parede celular são usualmente encontradas na camada externa, mascarando
o esqueleto interno formado por polissacarídeos. A localização das proteínas na camada
externa contribui para porosidade limitada da parede celular, sendo que esta função é
conferida pelas cadeias de carboidratos que são ligadas a essas proteínas. A porosidade
limitada fornece proteção contra enzimas do hospedeiro que degradam a parede, bem
como proteção contra o sistema imune do hospedeiro (de Groot et al., 2005; Klis et al.,
2011; Teparic & Mrsa 2013).
O modelo molecular proposto para a parede celular de Saccharomyces
cerevisiae e Candida albicans descreve diferentes tipos de ligações nas quais as
proteínas podem ser retidas na parede celular, com ligações covalentes e não covalentes,
levando assim a uma alta complexidade estrutural (de Groot et al., 2004; Pitarch et al.,
2008). Um modelo molecular semelhante é também aplicável para outros fungos
ascomicetos, incluindo Paraoccidioides spp.. Através do tipo de ligação que é
estabelecido com os componentes da parede estas proteínas podem ser agrupadas em
três classes:
1) as proteínas associadas à parede por ligações não covalentes ou pontes de
dissulfeto (fração F1): incluem proteínas relacionadas com a biossíntese e modulação
dos constituintes da parede, proteínas exportadas por vias de secreção clássicas e
proteínas que usam uma rota alternativa para alcançar a superfície celular. Essas
9
proteínas estão localizadas principalmente na superfície celular, mas podem ser
encontradas em menor proporção nas camadas internas da parede celular, sendo
solubilizadas pelo uso de detergentes e agentes redutores (de Groot et al., 2004; Chaffin,
2008; Pitarch et al. 2008).
2) Proteínas ligadas à parede por ligações álcali sensíveis ASL-PPCs (fração
F2): Inicialmente acreditava-se que esta classe era composta apenas por Pir-PPCs
(proteínas da parede celular com repetições internas); posteriormente estudos
demostraram que havia outras proteínas que não apresentavam homologia com as Pir,
mas eram ligadas covalentemente à β-1,3-glucana sem serem conectadas a uma β-1,6-
glucana e sem possuírem uma âncora de GPI. Assim esta classe inclui as proteínas da
família Pir e proteínas sensíveis ao tratamento álcali, ligadas diretamente a β-1,3-
glucana. (de Groot et al., 2004; Yin et al., 2005). As ASL-PPCs estão localizadas na
camada mais interna da parede celular de C. albicans. Esse grupo de proteínas pode ser
solubilizado com tratamento com álcali ou com tratamento enzimático com β-1,3-
glucanase (Mrsa et al., 1997; Kapteny et al., 1999a; Kapteny et al., 2000).
Na classe da ASL-PPCs, é bem caracterizada a família de proteínas com
repetições internas conservadas (Pir-PPCs). Essas proteínas compartilham
características comuns: um peptídeo sinal N-terminal; um sítio de clivagem Kex2p; um
domínio central com repetições características, consistindo de uma sequência consenso
rica em resíduos de glutamina (Q-I/V-X-D-G-Q-I/V-/P-Q); uma região C-terminal
compreendida por quatro resíduos de cisteínas (Toh-e et al., 1993; Mrsa et al., 1997;
Yin et al., 2005). Foi proposto que as Pir desempenham uma importante função no
fortalecimento da rede de β-1,3-glucana, uma vez que se encontram ligadas a esse
polissacarídeo.
Corroborando com esta função, foi demonstrado que essas proteínas são
induzidas durante enfraquecimento da parede causado pelos níveis reduzidos de β-1,6-
glucana, desencadeando importante mecanismo compensatório utilizado para fortalecer
essa organela extracelular (Kapteyn et al. 1999). Tem sido abordado que as Pir podem
ser incorporadas na parede celular por diferentes e complexas maneiras (de Groot et al.,
2004). Estudos mostraram que uma proteína designada ScPir4p/Cis3p necessita de uma
sequência repetitiva rica em glutamina para ser covalentemente ligada aos
polissacarídeos da parede (Castilho et al., 2003; de Groot et al,. 2004). Além disso, por
serem altamente O-glicosiladas acredita-se que sua interação com a β-1,3-glucana
ocorra através de uma ligação O-glicosídica que as mantém na parede. Especula-se
10
também que as Pir são ligadas à parede celular por pontes dissulfeto uma vez que estas
podem ser liberadas por agentes redutores tais como β-mercaptoetanol ou ditiotretiol
(Moukadiri et al., 2001; Jaafar et al.2003; de Groot et al. 2005, Orlean et al., 2006).
Contudo o mecanismo exato de como as ASL-PPCs são ligadas a parede celular ainda
não é completamente entendido.
3) Proteínas ligadas indiretamente a β-1,3-glucana através de uma β-1,6-
glucana (fração F3): Este grupo inclui proteínas que sofreram a adição de uma âncora de
GPI como modificação pós-traducional, que permite o ancoramento dessas proteínas à
parede (Pitarch et al., 2008).
Essa modificação ocorre no retículo endoplasmático (RE), onde uma âncora
de GPI, por ação de uma GPI transamidase é ligada a extremidade C-terminal de uma
proteína (Mayor & Riezman, 2004). As proteínas que serão ancoradas à GPI possuem
características comuns: um peptídeo sinal na extremidade N- terminal que as direciona
para o RE; um segundo domínio hidrofóbico na extremidade C-terminal para ligação
transitória na membrana do RE; e o sítio ômega (∞) composto por aminoácidos
pequenos (∞+1 e ∞+2) que se ajustam ao sítio catalítico da GPI transamidase
(Eisenbaher et al., 2004); esse sítio ∞ se encontra próximo à porção C-terminal da
proteína e será clivado por uma GPI transamidase e substituído por uma âncora de GPI
que se ligará a proteína (Orlean, 1997; Hamada et al., 1988b; Mayor & Riezman, 2004;
Mathias & Plaine, 2007). O grupo GPI consiste de um grupo lipídico, que serve como
âncora para ligação à membrana, um grupo inositol, um grupo N-acetilglicosamina, três
grupos de manose e fosfoetanolamina; este último conectará a âncora de GPI à região
C-terminal de uma proteína através de uma ligação amida (Tiede et al., 1999).
Posteriormente as proteínas contendo o grupo GPI serão transportadas para
o complexo de Golgi, seguindo destinos possíveis: ou são incorporadas
permanentemente à membrana plasmática ou são direcionadas à parede (Lu et al.,
1994). Em alguns fungos as GPI-PPCs são ligadas na parede celular após serem
clivadas entre o grupo glicosamina e o primeiro grupo de manose da âncora. A proteína
com o remanescente da âncora será então covalentemente ligada a β-1,6-glucana que,
por sua vez será ligada a β-1,3-glucana ou quitina (Kapteyn et al., 1996,1997; Kollár et
al., 1997; de Groot et at., 2004).
As proteínas ancoradas à GPI exercem diversas funções, como antígenos de
superfície, moléculas de adesão, receptores de superfície, biossíntese e remodelamento
da parede celular (Hartland et al., 1996; Mouyna et al., 2000; Chatterjee & Mayor,
11
2001; Hoyer et. al., 2001; Sundstrom, 2002; Hung et al., 2002; McGwire et al., 2002;
Castro et al., 2005). Essas proteínas podem ser extraídas pela adição de HF-piridina
(Fluoreto hidrogenado de piridina), o qual cliva a ligação fosfodiéster entre a âncora
remanescente de GPI e a β-1,6-glucana. Outra forma de extração consiste no tratamento
enzimático: GPI ligadas a β-1,3-glucana (utilizando β-1,3 ou β-1,6-glucanase) ou GPI
ligadas à quitina utilizando (quitinase ou β-1,6- glucanase) (de Groot et al., 2004;
Pitarch et al., 2008; Castilho et al. 2008).
Diversas proteínas têm sido caracterizadas na parede celular de
Paracoccidiodes spp. desempenhando papel importante na virulência e biogênese da
parede celular, sendo algumas caracterizadas como antígenos de superfície e moléculas
de adesão (Barbosa et al., 2006; Pereira et al., 2007; Castro et al., 2009; Nogueira el al.,
2010; Lima et al., 2012; Bailão et al., 2012). Castro e colaboradores (2005), utilizando
um banco de cDNAs que codificam para proteínas associadas à parede celular de
Paracoccidiodes sp., identificaram a sequência deduzida de aminoácidos para PbGel3p,
enzima esta responsável pelo alongamento das cadeias de β-1,3-glucana (Mouyna et al.,
2000). A PbGel3p apresentou níveis de expressão mais abundantes na fase miceliana,
concordando com altos níveis de β-1,3-glucana encontrada na fase infectiva do fungo
(San-Blas & San Blas, 1994). Evidências têm mostrado que o provável papel ativo
dessa enzima esteja relacionado na biossíntese e morfologia da parede celular em
Paracoccidioides sp., especialmente em micélio (Castro et al., 2009; Lima et al., 2012).
Além disso, dois outros membros da família das glicanosiltransferases têm sido
caracterizados em Paracoccidioides sp., Gel1p e Gel2p, encontradas
predominantemente associadas com a superfície celular do fungo. Estudos de
complementação genética têm mostrado que a Gel2p participa da manutenção da
integridade da parede celular, uma vez que ela foi capaz de restaurar a atividade da
Gas1p em mutantes de S. cerevisiae (Lima et al., 2012).
Paracoccidiodes spp. tem múltiplos mecanismos de patogenicidade,
incluindo aderência, colonização, disseminação, sobrevivência em ambientes hostis e
evasão do sistema imune, o que permite o estabelecimento da doença (Franco, 1987;
Kurokawa et al., 1998; Van De et al., 2011). A aderência de micro-organismos
patogênicos a tecidos do hospedeiro é um evento indispensável para o inicio da
colonização e disseminação (Sohn et al., 2006; Bhavsar et al., 2010). O processo de
adesão, mediada por proteínas denominadas adesinas, implica no reconhecimento do
patógeno a carboidratos, proteínas ligantes na superfície do hospedeiro ou proteínas da
12
matriz extracelular (ECM) (Patti et al. 1994; Latgé 2010; Frases et al., 2011). O fungo
utiliza uma variedade de moléculas de superfície para ligar à matriz extracelular do
hospedeiro (Lengeler et al., 2000). Entre elas inclui-se uma glicoproteína
imunodominante de 43 kDa (gp43) identificada como ligante para a laminina (Vicentini
et al., 1994). Estudos mostraram que em ensaios de afinidade, a gp43 foi capaz de se
ligar a fibronectina e a laminina (Mendes-Giannini et al., 2006). Outra molécula
encontrada na parede celular que tem capacidade de aderir às proteínas da ECM, como
laminina, fibronectina, colágeno tipo I e tipo IV, é a PbDfg5p (proteína deficiente para
o crescimento filamentoso 5). Esta proteína pertence à família das glicosil hidrolases,
desempenhando função relacionada à formação e manutenção da parede celular de
Paracoccidioides sp. (Castro et al., 2008).
Em Paracoccidioides spp. outras adesinas que desempenham função na
patogênese tem sido descritas; gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, (Barbosa et al.,
2006); triose-fosfato isomerase (TPI), o qual se liga a componentes da matriz como a
laminina e fibronectina (Pereira et al., 2007). Além disso, a enolase localizada na parede
celular contribui para a virulência de Paracoccidioides sp. (Donofrio et al., 2009;
Nogueira et al., 2010; Bailão et al., 2012). Adicionalmente uma proteína 14-3-3 de 30
kDa, foi caracterizada em Paracoccidioides sp.. Esta é uma adesina ligante de laminina,
localiza-se na parede celular das leveduras, podendo desempenhar papel na relação
fungo-hospedeiro (Silva et al., 2013). Paracoccidioides sp. apresenta também na sua
superfície duas proteínas de 32 e 19 kDa, envolvidas na interação com várias proteínas
da ECM, tais como laminina, fibronectina e fibrinogênio (Gonzalez et al., 2005;
Hernández et al., 2010).
Estudos in silico tem permitido a predição de proteínas de superfície. Castro
et al. (2005) descreveram 20 proteínas com possíveis âncoras de GPI. Dentre as
proteínas, destaca-se a sod3, uma superóxido dismutase Cu, Zn, envolvida na proteção
contra os radicais livres de oxigênio. Devido a sua localização pode-se atribuir sua
atividade a uma melhor acessibilidade aos ânions superóxido do hospedeiro (Castro et
al. 2005).
Como elucidado nas considerações acima, a análise proteômica das
proteínas da parede celular de Paracoccidioides sp. irá ampliar o entendimento da
relação patógeno-hospedeiro, além de fornecer bases moleculares de conhecimento para
o desenvolvimento de novas estratégias no tratamento desta micose sistêmica.
13
2. JUSTIFICATIVA
A parede celular é uma estrutura complexa e dinâmica, vital para o
crescimento, sobrevivência e morfogênese do fungo. Por estar localizada na interface
entra a célula fúngica e o hospedeiro participa diretamente da relação parasito-
hospedeiro, favorecendo assim, a instalação do patógeno e o ajudando a resistir às
agressões vindas do hospedeiro (Heilmann et al., 2011; Goodwin et al., 2013). Os
fungos patogênicos compartilham uma biologia comum com o seu hospedeiro, porém a
parede celular é uma estrutura única para o patógeno, uma vez que esta se encontra
ausente nas células dos mamíferos. Portanto, a parede celular tem se tornado um alvo
promissor para o desenvolvimento de novas drogas.
As proteínas que compõem a parede celular são o primeiro ponto de contato
com as células do hospedeiro sendo importantes em mediarem à resposta imune,
processo de adesão, aquisição de nutrientes, virulência, danos ao tecido do hospedeiro,
bem como na morfogênese da célula fúngica. Nesse sentido essas proteínas permitem
que os fungos avaliem e respondam a mudanças impostas pelo ambiente (Chaffin, 2008;
Pitarch et al., 2008; Goodwin et al., 2013).
Apesar da sua importância, até o momento não tem sido descrito estudos
proteômicos com a parede celular de Paracoccidioides sp., limitando assim a
compreensão da patogênese da doença. Em função de seu papel biológico, bioquímica
única, organização estrutural e a ausência da maioria de seus constituintes em células de
mamífero (Latgé et al., 2007), entendimento da estrutura e composição da parede
celular visa compreender a patogênese de Paracoccidioides sp..
14
3. OBJETIVO GERAL E OBJETIVOS ESPECÍFICOS
3.1. Geral
O objetivo geral desse estudo é a identificação e caracterização de proteínas de
parede celular de Paracoccidioides sp. nas fases miceliana e leveduriforme.
3.2. Específicos
Obter proteínas de parede celular em Paracoccidioides sp. nas formas miceliana
e leveduriforme;
Realizar analise em bancos de dados, visando identificar proteínas ligadas a
parede celular;
15
4. MÉTODOS
4.1. Manutenção do fungo
O isolado Pb01 (ATCC-MYA-826) de Paracoccidioides sp., foi utilizado
em todos os experimentos deste estudo. As fases miceliana e leveduriforme foram
mantidas in vitro em meio Fava-Netto sólido contendo: [1% (p/v) peptona, 0,3% (p/v)
protease peptona, 0,5% (p/v) extrato de levedura, 0,5% (p/v) extrato de carne, 4% (p/v)
glicose, 0,5% (p/v) NaCl, 1,0% (p/v) ágar, pH 7,2] a 22ºC e 36ºC, durante 15 e 7 dias,
respectivamente (Fava-Netto 1955). As formas miceliana e leveduriforme foram a
seguir inoculadas em meio Fava-Netto líquido e cultivadas a 22ºC e 36ºC,
respectivamente por 72 h sob agitação (150 rpm).
4.2. Isolamento e purificação das proteínas da parede celular de Paracoccidioides
sp.
A metodologia padronizada para extração PPCs foi baseada nos dados da
literatura para os modelos S. cerevisiae e C. albicans métodos os quais são aplicáveis
para outros fungos como Paracoccidioides sp.. Foi utilizado o protocolo estabelecido
por Pitarch e colaboradores (2008), com algumas modificações.
Após 72 h de inoculação as células foram coletadas por centrifugação a
1200g por 10 min a 4oC. O sedimento foi lavado 5 vezes com Tris HCl 10mM , CaCl2
2mM , pH 8,5 PMSF 1mM (fenil-metil-sulfonil-fluoreto) a 1200g por 10min a 4oC. As
células foram ressuspendidas em Tris HCl 10mM pH 8,0, contendo PMSF 1 mM. Em
seguida as células foram rompidas por maceração com gral e pistilo na presença de
nitrogênio líquido até a completa pulverização. O material foi ressuspendido em solução
de Tris HCl 10mM , Cacl2 2mM, pH 8,5, PMSF 1mM na presença de pérolas de vidro;
a mistura foi agitada por 1h a 4oC e a seguir centrifugada a 1200g por 10min a 4oC.
Este procedimento foi realizado até a completa ruptura da célula fúngica. O
sobrenadante obtido contém proteínas citoplasmáticas que foram descartadas. Após
retirada das pérolas de vidro foi acrescentado ao sedimento Tris HCl 10mM, Cacl2 2mM
pH 8,5 e o material foi transferido para um novo tubo de 50 mL. Com o intuito de
reduzir contaminantes citoplasmáticos que poderiam aderir à parede celular através de
interações iônicas não especificas, procederam-se as lavagens do sedimento da seguinte
16
maneira: 5 lavagens com água gelada; 5 vezes com NaCl 5% (p/v); 5 vezes com NaCl
2% (p/v); 5 vezes com NaCl 1% (p/v). As dosagens das concentrações proteicas de
todos os extratos foram determinadas pelo método de Bradford (Bradford 1976). Após a
extração de cada fração as proteínas foram precipitadas pelo uso de 2D-Clean-up Kit
(GE Healthcare).
4.2.1 Extração de proteínas por tratamento com SDS/DTT: Obtenção da fração F1
Para otimizar a identificação das PPCs foram adotadas estratégias de
extração de acordo com o tipo de ligação que a proteína é retida na parede celular. Para
obter proteínas que são retidas na parede por ligações não covalentes ou pontes de
dissulfeto (fração 1), o sedimento obtido na etapa de purificação das PPCs foi
submetido a uma etapa de extração por fervura por 10 min com Tris HCl 50mM, pH7,8,
SDS (p/v) 2%, EDTA 100mM , DTT 10mM, sendo o material centrifugado a 1200g por
10 min; essa etapa foi realizada duas vezes. O sobrenadante da centrifugação constitui a
primeira fração denominada Fração 1 (F1). O extrato obtido na F1 foi lavado na
seguinte sequência: 3 vezes com água ultrapura; 3 vezes com solução de bicarbonato de
amônio NH4HCO3 50 mM , pH 8,5. Subsequentemente o material foi concentrado
utilizando-se filtros de 10 kDa (Amicon Ultra centrifugal filter, Millipore).
4.2.2. Extração de proteínas por tratamento com NaOH: Obtenção da Fração F2
O sedimento obtido na etapa anterior, descrito no item 4.2.1, foi submetido
a tratamento em condições alcalinas, a fim de se obter as proteínas de parede álcali
sensíveis (fração 2- F2). O sedimento foi submetido a etapas de lavagens
discriminadas: 5 vezes com água gelada e 10 vezes com acetato de sódio 0,1M, pH 5,5,
contendo PMSF 1 mM. O sedimento foi tratado com NaOH 30mM, sob agitação leve
por 17 h a 4oC. A reação foi interrompida pela adição de ácido acético. Posteriormente o
extrato tratado com NaOH foi centrifugado a 1200g por 10min a 4oC e o sobrenadante
foi então coletado e submetido à diálise por 16 h em água ultrapura gelada. A fração F2,
a qual resultou desse tratamento, foi lavada na seguinte sequência: 3 vezes com solução
de bicarbonato de amônio NH4HCO3 50mM, pH 8,5, subsequentemente sendo
concentrada utilizando filtros de 10 kDa (Amicon Ultra centrifugal filter, Millipore).
17
4.3. Deglicosilação das proteínas da fração F2
Uma vez que as proteínas de parede são altamente glicosiladas, estratégias
foram adotadas no intuito de remover carboidratos ligados à estrutura dessas proteínas.
As amostras da fração F2 foram deglicosiladas para posteriormente serem submetidas à
digestão com tripsina. A deglicosilação foi realizada com a enzima N-glicosidase F
recombinante (Roche Applied Science), a qual cliva as ligações N-glicosídicas dos
resíduos de asparagina. O total de 3 unidades da enzima foi adicionado a 300µg do
extrato das frações F2, juntamente com solução de incubação (fosfato de sódio 125mM,
EDTA 25mM, nonidet P40 1% (p/v), β-mercaptoetanol 1% (v/v), SDS 1% (p/v)). A
mistura foi incubada a 37oC por 16 h e a reação foi interrompida por fervura da mistura
durante 5 min. À amostra foi lavada na seguinte sequência: 3 vezes com água ultrapura;
2 vezes com solução de bicarbonato de amônio NH4HCO3 50 mM, pH 8,5.
Subsequentemente sendo concentrada utilizando filtros de 10 kDa (Amicon Ultra
centrifugal filter, Millipore).
4.4. Digestão tríptica e preparação de amostras para análises por LC-MS
De cada extrato obtido pelos diferentes procedimentos descritos acima, 300
µg foram concentrados até volume final de 50µL e submetidos à digestão com tripsina
de acordo com Murad e colaboradores (2011) com algumas modificações. Em 300 µg
do extrato solúvel foi adicionado surfactante Rapigest SF 0,2% (v/v) (Waters, USA),
sendo a mistura incubada a 80oC por 15 min. Posteriormente foi realizada uma etapa de
redução pela adição de DTT 100 mM e o material foi incubado por 30 min à 60oC.
Após o termino da incubação adicionou-se iodoacetamida 300 mM e o material foi
mantido a temperatura ambiente por 30 min ao abrigo da luz. A seguir procedeu-se a
digestão pela adição de tripsina na proporção de 1:100 (Promega) e incubação 37oC por
16 h. A precipitação do surfactante foi realizada pela adição de ácido trifluoroacético
5% (v/v), sendo o material incubado por 90 min à 37oC. Após, a amostra foi
centrifugada a 10.000g por 30 min a 6oC e o sobrenadante contendo peptídeos trípticos
foi então secado a vácuo.
18
4.5. Aquisição de dados por nanoUPLC-MSE
A fim de permitir a quantificação dos peptídeos a fosforilase B (Waters) foi
adicionada em uma concentração final de 200 fmol.µL-1 . Os peptídeos trípticos foram
separados por cromatografia líquida em nano escala utilizando o cromatógrafo
nanoAcquity UPLC com tecnologia 2D (Waters) de acordo com protocolo descrito por
Schenauer e colaboradores (2012), com modificações. A primeira dimensão da
cromatografia foi realizada em uma coluna XBridge BEH 130 C 18 Nanoease (5µm,
300 µm x 50 mm; Waters, USA) que permitiu o fracionamento dos peptídeos. O sistema
foi mantido em fluxo de 2 µL/min-1 com uma condição inicial de acetonitrila (ACN) de
3%. Os peptídeos foram fracionados-5 vezes (F1-F5) utilizando diferentes gradientes
lineares de concentrações de ACN (-F1-10,8%; F2-14%; F3-16,7%; F4-20,4% e F5-
65%). A segunda dimensão foi realizada pela eluição de cada fração a partir da coluna
de aprisionamento de peptídeos e separadas em uma coluna NanoAcquity UPLC BEH
130 C18 (1,7 µM, 100 µM x 100 mm; Waters, USA). A coluna foi operada em fluxo de
0,9 µL/min-1 à 35o C. O sistema de cromatografia 2D é acoplado a um espectrômetro de
massas Q-TOF-MS Synapt (Waters, Manchester, UK) onde ocorrerá a aquisição dos
dados de espectrometria de massas, o que permitirá a identificação e quantificação dos
peptídeos. Os espectros foram processados e examinados utilizando o ProteinLynx
Global Server (PLGS) versão 2.4. A largura do pico cromatográfico e a resolução MS
TOF foram configuradas em um modo automático. Os parâmetros de busca foram:
taxonomia [Fungi (Paracoccidioides sp. lutzii Pb01) ] com no máximo uma clivagem
perdida. Foram adicionadas à busca modificações de carbamidometilação das cisteínas,
acetilação N-terminal e oxidação de metioninas. A busca foi realizada usando banco de
dados do genoma de Paracoccidioides brasiliensis
(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiH
ome.html).
19
4.6. Análises in silico
Devido às características das proteínas da parede celular como:
apresentarem um peptídeo sinal, ou utilizarem uma rota não clássica para alcançarem a
parede; serem altamente glicosiladas; apresentarem uma âncora de GPI; foram
utilizadas ferramentas de bioinformática que permitem analisarem essas características.
O programa Signal P 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) foi utilizado para
predição de peptídeo sinal, onde para discriminar se a proteína apresentava peptídeo
sinal predito foi avaliado o valor de significância (score) correspondente ao D-score. O
D-score (score de discriminação) é usado parar discriminar peptídeo sinal nas proteínas;
foram consideradas possuírem peptídeo sinal predito aquelas proteínas que
apresentaram um D-score ≥ 0,34. Para predição de proteínas secretadas por vias não
clássicas foi utilizado o programa Secretome P 2.0
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/). Para a entrada da proteína quatro scores
são gerados, o score determinante é o SecP-score. Foram consideradas secretadas por
vias não clássicas aquelas proteínas que apresentavam um SecP-score ≥0,5.
Para avaliar modificações pós traducionais do tipo glicosilação, dois
programas foram utilizados (NetNGlyc 1.0, NetOGlyc 3.1). O programa NetNGlyc 1.0
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) foi utilizado para predizer sítios de N-
glicosilação, sendo consideradas preditas aquelas que apresentaram um valor de score
≥0,5 e com no mínimo dois ++. Para sítios O-glicosilação o programa NetOglyc 3.1
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/) foi utilizado e as proteínas com um G-
score (score discriminante) ≥ 0,5, foram preditas com O-glicosilação. Para identificar
proteínas putativas com âncoras de GPI o programa big-PI fungal
(http://mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html) foi utilizado para reconhecer motivos C-
terminal capazes de ancorar a GPI.
As proteínas identificadas foram agrupadas em categorias funcionais de
acordo MIPS Functional Catalogue Database (FunCatDB), disponível no banco de
dados do Pedant
(http://pedant.gsf.de/pedant3htmlview/pedant3view?Method=analysis&Db=p3_r48325_
Par_brasi_Pb01).
20
A figura 2 apresenta o fluxograma das etapas experimentais desenvolvidas
no presente trabalho.
Sobrenadante
Proteínas com ligações não
covalentes/pontes de dissulfeto
(Fração 1)
Sedimento
Proteínas resistentes ao
tratamento com SDS/DTT
(Fração F2)
Extração com NaOH 30mM ( 17 horas,
4oC)
Deglicosilação com N-glicosidase F
(16 horas, 37oC)
Sobrenadante
Proteínas ligadas à parede por
ligações álcali sensíveis
(Fração 2)
Componentes da parede celular ligados entre si. Representando a fração
a fração 1 e fração 2, e o tratamento químico utilizados para liberar as
PPCs. Adaptado de Orlean (2012).
21
Figura 2. Fluxograma das estratégias experimentais realizadas no presente estudo. O isolamento das proteínas de
parede foi realizado segundo o tipo de ligação que essas moléculas estabelecem com os componentes da parede.
22
5. RESULTADOS
5.1. Enriquecimento das proteínas da parede celular/ validação dos extratos
Com objetivo de verificar se a extração das amostras obtidas continha preferencialmente
proteínas da superfície celular e que as medidas tomadas para reduzir a presença de
contaminantes citoplasmáticos foram efetivas, o sobrenadante da última lavagem com
NaCl 1% foi coletado e submetido à eletroforese unidimensional (SDS-PAGE).
Conforme mostra na Figura 3, a última lavagem não continha proteínas solúveis em
NaCl 1%, sugerindo que o sedimento continha preferencialmente proteínas da fração da
parede celular.
5.2. Perfil qualitativo das frações de proteínas da parede celular
Para avaliar a qualidade dos extratos, as amostras das frações de proteínas
das fases de micélio e levedura foram submetidas à eletroforese unidimensional (SDS-
PAGE). Na Figura 4 é apresentado o gel unidimensional realizado para os extratos de
micélio e levedura fração 1 (A) e fração 2 (B). Foi possível observar um padrão de
Figura 3. Analise da qualidade da fração da parede celular. SDS-PAGE do sobrenadante
da última lavagem com NaCl 1% corado com prata. O marcador do peso molecular é mostrado à esquerda.
Linha 1 micélio; Linha 2 levedura.
23
“arraste” nas amostras apresentadas, possivelmente porque essas proteínas são
altamente glicosiladas. Em adição a presença de arraste pode também estar relacionada
ao uso de agentes desnaturantes como o SDS, para solubilizar as proteínas associadas à
parede por ligações não covalentes ou pontes de dissulfeto.
Figura 4. Perfil qualitativo das proteínas da parede celular nas fases miceliana e leveduriforme de
Paracoccidioides sp. SDS-PAGE das frações: a) F1- proteínas extraídas com SDS/DTT em micélio (linha
1) e levedura (linha 2); b) F2- proteínas extraídas com NaOH 30mM em micélio (linha 3) e levedura
(linha 4). O marcador do peso molecular é mostrado à esquerda.
5.3. Análise das proteínas da parede celular nas formas miceliana e leveduriforme
Os extratos das diferentes frações foram digeridos com tripsina, onde o
sistema de cromatografia 2D acoplado a um espectrômetro de massa Q-TOF-MS,
permitiu a identificação e quantificação dos peptídeos. As tabelas-1-5 mostram a relação
de todas as proteínas identificadas nas fases miceliana e leveduriforme nas diferentes
frações analisadas. São apresentados o valor de significância (score) da proteína, o
número de peptídeos encontrados, a cobertura da sequência. Também são evidenciados
a predição para secreção de acordo com os programas Signal P 4.0 e Secretome P 2.0,
possíveis sítios de glicosilação, podendo ser N-glicosilação ou O-glicosilação utilizando
os respectivos programas: NetNGlyc 1.0, NetOGlyc 3.1 e proteínas preditas com âncora
de GPI onde o preditor Big-PI foi utilizado.
Na fase leveduriforme foram identificadas 110 proteínas na fração F1
(Tabela 1), 194 proteínas na fração F2 (Tabela 2). O total de 30 proteínas foram
24
identificadas nos extratos da fração F2 submetida a tratamento com a enzima N-
glicosidase F (Tabela 3). Na fase miceliana foram identificadas 11 proteínas na fração
F1 (Tabela 4), 33 proteínas foram identificadas na F2 (Tabela 5). Pode-se observar um
menor número de proteínas identificadas na fase miceliana sugerindo que a extração
dessas proteínas foi menos eficiente quando comparada à levedura; por esse motivo têm
sido buscadas novas técnicas para otimizar a extração. A Figura 5 apresenta o total das
proteínas identificadas nas fases leveduriforme e miceliana nas diferentes frações.
Figura 5. Proteínas identificadas nas fases leveduriforme (diagramas em cinza escuro) e miceliana
(diagramas em cinza claro) nas frações F1-F2.
5.3.1. Proteínas localizadas na fração F1 da fase leveduriforme de Paracoccidioides
sp.
As proteínas identificadas na fração F1 da fase leveduriforme compreendem
em grande número (38,2% do total) em proteínas relacionadas com a síntese proteica,
na qual se incluem proteínas ribossomais, fatores de elongação ou proteínas
relacionadas com o processo de tradução. Proteínas de resposta ao estresse (8,2%),
proteínas de resgate celular, defesa e virulência (2,7%), proteínas/enzimas relacionadas
ao metabolismo e energia (27,3%), proteínas de transporte (4,5%), histonas (5,4%),
proteínas relacionadas com o ciclo celular e processamento de DNA (3,6%), proteínas
envolvidas no dobramento, modificações e destinação (3,6%), proteínas relacionadas
com a biogênese de compostos celulares (1,8%), proteínas envolvidas na comunicação
celular (1,8%), proteínas de transcrição (2,7%) e proteínas não classificadas (0,90%) são
25
representadas na fração F1 da fase leveduriforme de Paracoccidioides sp. como
demostrado na (Tabela 1).
5.3.2. Proteínas localizadas na fração F2 da fase leveduriforme de Paracoccidioides
sp.
As proteínas identificadas na fração 2 da fase leveduriforme incluem
proteínas de resposta ao estresse (4,6%), proteínas de resgate celular, defesa e virulência
(1,5%), proteínas/enzimas relacionadas ao metabolismo e energia (35,6%), proteínas
relacionadas com a síntese proteica que incluem proteínas ribossomais e fatores de
elongação (23,2%). Proteínas de transporte (5,1%), histonas (2,1%), proteínas
relacionadas à comunicação celular (2,1%), proteínas relacionas com a biogênese de
componentes celulares (2,6%), proteínas envolvidas com o ciclo celular e
processamento de DNA (5,7%). Proteínas relacionadas com o dobramento,
modificações e destinação (8%), proteínas envolvidas na transcrição (3,6%,) e proteínas
não classificadas (6,2%) foram identificadas na fração F2 da fase leveduriforme de
Paracoccidioides sp. (Tabela 2).
Na fração 2 tratada com N-glicosidase F, foram identificadas proteínas de
resposta ao estresse (16,6%), proteínas/enzimas envolvidas no metabolismo e energia
(40%), proteínas relacionadas na com a síntese proteica (13,3%). Proteínas envolvidas
no dobramento, modificações e destinação (13,3%), proteínas relacionadas com a
biogênese de componentes celulares (10%), proteínas de transporte (3,3%), e proteínas
não classificadas (3,3%) foram representadas na fração F2 tratada com NaOH e N-
glicosidase F (Tabela 3).
5.3.3. Proteínas expressas nas frações F1 a F2 na fase miceliana de Paracoccidioides
sp.
As proteínas identificadas na fração F1 da fase miceliana compreendem em
grande número (45,4% do total) aquelas relacionadas com a síntese proteica, na qual se
incluem proteínas ribossomais, fatores de elongação ou proteínas relacionadas com o
processo de tradução. Proteínas de resposta ao estresse (9,1%), proteínas/enzimas
relacionadas com o metabolismo e energia (27,2%), proteínas relacionadas com a
biogênese de compostos celulares (9,1%) e (9,1%) proteínas não classificadas são
representadas na fração F1 da fase miceliana de Paracoccidioides sp., como mostra a
(Tabela 4).
26
As proteínas identificadas na fração 2 incluem proteínas de resposta ao
estresse (15,1%), proteínas/enzimas relacionadas com metabolismo e energia (15,1%),
proteínas envolvidas na síntese proteica compreendendo proteínas ribossomais e fatores
de elongação (42,4%). Proteínas de transporte (9,1%), histonas (9,1%), proteínas
envolvidas no ciclo celular e processamento de DNA (3%), proteínas relacionadas com
transcrição (3%) e proteínas envolvidas na comunicação celular (3%) são demonstradas
na fração F2 da fase miceliana de Paracoccidiodes sp. como mostrado na (Tabela 5).
5.4 Análises in silico das proteínas da parede de Paracoccidioides sp.
Várias proteínas são transportadas para a superfície celular dos organismos
para serem integradas na parede celular ou serem exportadas para o meio extracelular
(Nombela el al., 2006). Com o intuito de identificar proteínas secretadas foram
utilizados os programas signal P 4.0 para predizer peptídeo sinal e o Secretome P 2.0
para secreção por vias não clássicas.
Foi possível observar que das proteínas identificadas na fração 1 da parede
celular da forma leveduriforme de Paracoccidioides sp., (44,7%) apresentaram secreção
predita de acordo com os programas signal P 4.0 e secretome P 2.0 Figura 6 (A). O
total de (2,7%) das proteínas encontradas em F1 apresentavam sequência compatível
com peptídeo sinal e (42%) são secretadas por vias alternativas. Em relação às proteínas
extraídas na fração 2 (53,6%) apresentaram secreção predita: o total de (3,1%)
apresentavam peptídeo sinal e (50,5%) foram preditas serem secretadas por vias não
clássicas. Para a fração 2 tratada com N-glicosidase F, o percentual de secreção predita
foi de (56,6%), sendo que desse total (10%) apresentaram sequência compatível com
peptídeo sinal e (46,6%) foram proteínas preditas para secreção por vias não clássicas.
As análises da predição de secreção em proteínas extraídas da parede
celular de micélio mostraram que apenas a F2 apresenta proteínas com secreção predita
por vias clássicas correspondendo a um percentual de (3%) Figura 6 (B). Em
contrapartida todas as frações analisadas contêm proteínas com secreção predita por
vias não clássicas, correspondendo à (45,4%) das proteínas identificadas em F1, (36,3%
do total) na F2.
27
A B
Figura 6. Número de proteínas da parede celular identificadas secretadas por vias clássicas e não
Também foram realizadas análises in silico com o intuito de se identificar
possíveis sítios de glicosilação nas proteínas identificadas nas formas leveduriforme e
miceliana. Essas análises foram realizadas utilizando os programas NetNglyc 1.0 e
NetOglyc 3.1. As análises revelaram que na fração 1 da fase de levedura o total de
(32,7%) das proteínas identificadas apresentam sítios de N-glicosilação. Esta mesma
fração mostrou um percentual (85,4%) de proteínas com possíveis sítios de O-
glicosilação. Na fração 2 obteve-se o total de (42%) das proteínas com sítios preditos de
N-glicosilação e (91,2%) para sítios de O-glicosilação. Na fração F2 tratada com N-
glicosidase F um percentual de (46,6%) das proteínas identificadas apresentaram sítios
de N-glicosilação e um total de (86,6%) para sítios de O-glicosilação Figura 7 (A).
Em micélio pode-se observar que (63,6%) das proteínas identificadas na
fração 1 apresentam sítio de N-glicosilação, além disso um percentual de (100%) foram
preditas apresentarem sítios de O-glicosilação. Na fração 2 o total de proteínas com
possíveis sítios de N-glicosilação foi de (39,4%), já o total para sítios de O-glicosilação
foi de (87,8%) na fase miceliana de Paracoccidioides sp. Figura 7 (B). Estes resultados
corroboram com estudos anteriores que mostram que as proteínas da parede celular de
fungos são altamente glicosiladas.
Figura 6. Número de proteínas da parede celular identificadas secretadas por vias clássicas e não clássicas. (A), (B), em
levedura e micélio, respectivamente. O número de proteínas preditas com peptídeo sinal (em cinza escuro) utilizando o programa
Signal P 4.0 e aquelas que apresentavam secreção por uma via não clássica utilizando o programa Secretome P 2.0 (em cinza claro)
em cada fração de levedura e micélio respectivamente.
28
A B
Figura 7. Número de proteínas identificadas que apresentam sítios de N e O-glicosilação nas frações
1 e 2 das fases de levedura e micélio. (A),(B), fases leveduriforme e miceliana, respectivamente. O
número de proteínas preditas com sítios de N-glicosilação (em cinza escuro) utilizando o programa
NetNglyc 1.0, e aquelas que apresentavam sítios de O-glicosilação utilizando o programa NetOglyc 3.1
(em cinza claro) em cada fração de levedura e micélio respectivamente.
Com o intuito de se identificar proteínas associadas a uma âncora de GPI o
programa big-PI foi utilizado. Observou-se que na fração 2 tratada com N-glicosidase F
(tabela 3) na fase de levedura, uma proteína denominada glucanase da parede celular
apresentou uma região C-terminal predita, com características de proteínas GPI
ancoradas.
29
6. DISCUSSÃO
6.1. Considerações gerais
A identificação das proteínas da parede celular é um procedimento difícil
devido à sua baixa abundância. Além disso, as proteínas que constituem a parede celular
apresentam baixa solubilidade, natureza hidrofóbica, são altamente glicosiladas como
também ligam-se covalentemente a polissacarídeos da parede (Pitarch et al., 2008).
Todos esses fatores em conjunto tornam a identificação dessas proteínas complicada.
Outro fator importante é que diferentes proteínas da parede celular são sintetizadas sob
diferentes condições de crescimento, condições ambientais e estágio de
desenvolvimento, sendo assim incorporadas preferencialmente na parede durante
condições específicas, demonstrando que o proteoma das proteínas da parede fúngica é
rigorosamente controlado e continuamente ajustado para condições ambientais e
estresses encontrados pela célula fúngica (Ruiz-Herrera et al., 2002; de Groot et al.,
2005; Castilho et al., 2008; de Groot et al., 2008; Butler et al., 2009; Backhaus et al.,
2010; Klis et al., 2011; Moran et al., 2011; Klis et al., 2013).
Sabe-se que proteínas que se ligam covalentemente à parede celular, como
as Pirs e GPIs, são caracterizadas por possuírem um peptídeo sinal e sítios de O e N-
glicosilação. Dessa forma a identificação de proteínas covalentemente ligadas à parede
torna-se complicada principalmente pela presença de interferentes que podem dificultar
a identificação por espectrometria de massas como: o alto número de resíduos N ou O-
glicosilados faz com que os peptídeos trípticos apresentem massa diferencial,
interferindo assim na sua correta análise.
Outro fator relevante é o fato que alguns peptídeos são mais difíceis de
serem ionizados do que outros devido ao fato de que os carboidratos são responsáveis
por conferirem cargas negativas a proteínas da superfície celular dificultando a sua
ionização (Deshpande et al., 2008; Frandin et al., 2008; Castilho et al., 2008). Neste
sentido a deglicosilação enzimática pode ajudar a solucionar em partes este problema.
Com esse intuito foi realizado um tratamento adicional utilizando uma enzima que
promove a deglicosilação dos resíduos de asparagina N-ligados a carboidratos,
denominada N-glicosidase F. Esse tratamento permitiu a identificação de proteínas
ligadas à parede celular por ligação álcali sensível, principalmente em micélio. Ressalte-
se que inicialmente, antes do tratamento com a enzima, nenhuma proteína havia sido
identificada na fração 2 de micélio e que após o tratamento enzimático um total de 33
30
proteínas foram identificadas (Tabela 5). Além disso, esse tratamento enzimático
permitiu a identificação de uma proteína GPI ancorada (Tabela 3).
6.2. Identificação de proteínas covalentemente ligadas à parede
No presente estudo foi possível identificar na fração 2, após o tratamento
com N-glicosidase F, uma glucanase da parede celular de Paracoccidioides sp. (tabela
3) da família glicosil hidrolases 16, a qual desempenha uma função na organização da
parede celular, onde possui atividade de transglicosidase (Rodriguez-Pena et al., 2002;
Martinez-Lopez et al.,2004; Cabib et al., 2007). Sua função está relacionada à
transferência de quitina sintetizada para a β-glucana (Cabib et al., 2007, 2009; Mazáñ et
al., 2013). A glucanase identificada no presente estudo apresenta alta identidade com a
proteína Crh1 de S. cerevisiae, a qual é uma proteína ancorada por GPI (Hamada et al.,
1998; Yin et al., 2005). Além disso, tem sido proposto que GPI-PPCs como a Cwp1p de
S. cerevisiae, podem ser alternativamente ligadas à parede celular por uma ligação álcali
sensível (Kapteny, 2001; de Groot et al., 2004). Sabe-se que a Crh1 é ligada a quitina
por uma β-1,6-glucana, porém sua detecção na fração 2 sugere que talvez Crh1 possa
também ser ligada diretamente a quitina por ligação álcali sensível.
6.3. Proteínas que utilizam vias de secreção não clássicas para alcançar a superfície
celular
Diversos estudos têm demonstrado a presença de proteínas citosólicas e
proteínas secretadas para o meio extracelular associadas com a parede celular. Nesses
estudos tem sido proposta hipóteses para a integração dessas proteínas à parede celular,
assim como funções que essas proteínas desempenham na estrutura da parede celular
(Nombela et al., 2008; Chaffin, 2008). Nesse sentido tem sido inferido, por alguns
autores, que essas proteínas podem simplesmente associar-se à parede celular como
resultado de sua liberação para meio externo devido ao processo de lise celular (Eroles
et al., 1997, Phillips et al., 2003; Madinger et al., 2009).
Outra explicação alternativa se relaciona ao fato de que como a parede
celular é uma estrutura elástica, esta pode se estender e se encolher rapidamente em
resposta a mudanças osmóticas do ambiente e consequentemente proteínas em transito
para o meio extracelular podem tornar-se presas à parede celular (Klis et al., 2011). As
cadeias de carboidratos que se associam às proteínas da parede contêm ligações
31
fosfodiester, que são responsáveis pela carga negativa da superfície celular em pH
fisiológico. Assim essas proteínas podem funcionar como sítio de ligação para que
proteínas carregadas positivamente associem-se à parede (Cutler, 2001; Fradin et al.,
2008; Deshpande et al., 2008; Klis et al., 2011).
Várias proteínas sem peptídeo sinal podem alcançar a superfície celular ou se
associarem à parede como resultado de um processo de secreção alternativa. Estudos
têm utilizado diferentes protocolos para isolar as proteínas da parede, e em quase todos
tem se detectado proteínas intracelulares conhecidas associadas à parede celular
(Castilho et al., 2008). Como exemplo, tem sido observado que enzimas glicolíticas
podem ser extraídas de células intactas pelo uso de agentes redutores, indicando assim
que sua presença na superfície celular não é um processo resultante de lise celular.
Desta forma alguns autores têm sugerido que essas proteínas realizam duplas ou
múltiplas funções dependendo da sua localização.
A multifuncionalidade de algumas proteínas tem sido demonstrada em vários
organismos. Neste contexto várias dessas enzimas glicolíticas tem sido classificadas
como componentes da parede celular de C. albicans (Pardo et al., 2000; Jeffery et al.,
2003), o mesmo ocorrendo com Paracoccidioides sp. (Nogueira et al., 2010; Barbosa et
al. 2006; Pereira et al., 2007). Acredita-se que essas proteínas sem peptídeo sinal
possam estar envolvidas em vários processos, incluindo dinâmica da parede celular e
interação com componentes do hospedeiro, assim como com virulência dos patógenos
(Nombela et al., 2006). A via de secreção que algumas dessas proteínas utilizam para
alcançar a superfície não é completamente elucidada, porém sabe-se que para algumas
enzimas com a enolase, que tem sido identificada na parede celular, essa secreção é
baseada em vias não convencionais, visto que essa enzima não tem um sinal de secreção
conhecido. Além disso, várias vias de secreções não convencionais têm sido descobertas
e sugeridas, podendo explicar como essas proteínas alcançam então a superfície celular
(Nickel, 2010; Miura et al., 2012).
Nesse sentido, no presente estudo das proteínas da parede celular de
Paracoccidioides sp. foi possível observar um alto índice de proteínas que apresentam
sinais de secreção por uma via não convencional (Figura 6) tanto em micélio como em
levedura. Corroborando com esses dados, Weber e colaboradores (2012), observaram
que 52,5% do total das proteínas extracelulares identificadas em micélio e levedura em
Paracoccidioides sp. foram preditas ser secretadas por vias não clássicas, enquanto
12,5% mostraram ser secretadas por uma via clássica. Este resultado também está de
32
acordo com análises do banco de dados do Secretome Fungal (FSD), que descreveu
58% das 9.136 proteínas expressas no genoma do Pb01 são preditas como secretadas
por uma via de secreção não convencional, enquanto que 14% apresentariam secreção
por uma via clássica.
6.4. Identificação de proteínas com funções intracelulares estabelecidas
No presente estudo foi detectado em todas as frações analisadas um número
grande de proteínas que estão localizadas também em outros compartimentos celulares
desempenhando funções conhecidas. Tem sido caracterizada diversas adesinas que se
ligam aos componentes da matriz extracelular. Em Neisseria meningitidis existem
indícios de que a frutose-1,6-bifosfato aldolase possa desempenhar função relacionada à
adesão a células do hospedeiro (Tunio et al., 2010 a). Em C. albicans foram descritas
oito proteínas ligantes de plasminogênio entre elas álcool desidrogenase, fosfoglicerato
quinase e frutose-1,6-bifosfato aldolase (Crowe et al., 2003). Estudos realizados em
Paracoccidiodes sp. tem reconhecido algumas adesinas como gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase (Barbosa et al., 2006), triose-fosfato isomerase (Pereira et al., 2007),
malato sintase (Neto et al., 2009), enolase (Nogueira et al., 2010). Adicionalmente, uma
chaperona DnaJ mitocondrial foi descrita localizada na superfície celular de
Paracoccidioides sp. (Batista et al., 2006) e sua função pode ser inferida ao processo de
adesão (Tabela 2).
A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) é uma proteína presente
na superfície de vários patógenos, facilitando a colonização e invasão nos tecidos do
hospedeiro pela direta interação com as proteínas do hospedeiro (Tunio, 2010 b). Em
Paracoccidioides sp. a GAPDH localiza-se também na parede celular, sendo capaz de
se ligar à laminina, colágeno I e fibronectina, desempenhando um importante papel no
estabelecimento da doença (Barbosa et al., 2006). No presente estudo foi possível
identificar a GAPDH em diversas frações representadas nas (Tabelas 1, 2, 3, 5) nas
formas leveduriforme e miceliana.
A enolase está presente em quase todas as frações analisadas (Tabelas 1, 2,
3, 4). Estudos recentes têm mostrado que a enolase localizada na superfície celular é
capaz de recrutar plasminogênio e ativar o sistema fibrinolítico da plasmina, que por sua
vez degrada a matriz extracelular do hospedeiro, promovendo a disseminação do
patógeno (Nogueira et al., 2010). Além disso, a enolase foi anteriormente caracterizada
33
como uma proteína de ligação a fibronectina (Donofrio et al., 2009). Outro dado
importante foi observado através de ensaios de imunofluorescência, que demonstraram
que a enolase é capaz de aderir à superfície de macrófagos, reforçando o papel da
proteína na interação com células do hospedeiro, promovendo a adesão de
Paracoccidioides sp.. Neste sentido a enolase da parede celular desempenha um papel
crucial na virulência de Paracoccidioides sp. (Bailão et al., 2012). Esta enzima tem sido
encontrada tanto na camada mais externa quanto na camada mais interna da parede
celular, sendo associada com a rede de glucana e quitina (Pitarch et al., 2002). Em
concordância com a sua localização, a enolase tem sido identificada como um
componente associado à glucana da parede celular de C. albicans (Angiolella et al.,
1996, 2002).
Adicionalmente tem sido descrito que enzimas glicolíticas podem ser
fortemente retidas dentro da rede de β-1,3-glucana e quitina, podendo ser liberadas após
tratamento com glucanase e quitinase, sugerindo que estas enzimas possam estar
distribuídas em toda a parede celular (Pitarch et al., 2002). Corroborando com esses
dados estudos anteriores demonstraram através de imunolocalização que proteínas como
a fosfoglicerato quinase (Alloush et al.1997), e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
(Gozalbo et al., 1998), enolase (Edwards et al., 1999), fosfoglicerato mutase
(Motshwene et al., 2003), foram localizadas tanto na superfície celular quanto nas
camadas internas da parede. Nas frações analisadas até o momento no presente estudo
foram identificadas enzimas como: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, frutose-1,6-
bifosfato aldolase, enolase, fosfoglicerato quinase como demonstrado nas (tabelas 1, 2,
3, 4, 5).
Formamidase tem sido localizada tanto no citoplasma quanto na parede
celular de Paracoccidioides sp.. A formamidase promove a conversão de formamida em
formato e amônia. A amônia pode ser usada como fonte de nitrogênio por alguns micro-
organismos, como tem sido descrito em Aspergillus nidulans, demonstrando assim a
importância da formamidase no metabolismo do nitrogênio (Fraser et al., 2001). Porém
sua localização na superfície celular pode estar relacionada à destruição celular e
resistência a ambientes ácidos (Borges et al., 2010). Nesse sentido, em Helicobacter
pylori, onde um dos produtos finais da catálise enzimática da formamidase, é a amônia,
esta desempenha um papel importante na patogênese auxiliando na destruição tecidual
bem como na resistência ao pH ácido encontrado no estômago (Bury-Moné et al.,
2004). Outro aspecto no que tange à formamidase foi demonstrado em estudos
34
realizados por Borges e colaboradores (2005), onde a proteína foi capaz de reagir com
anticorpos presentes no soro de pacientes com PCM, especulando-se então associação
da proteína na patogênese do fungo. A formamidase foi presente na fração 2 da fase de
levedura (Tabela 2).
Adicionalmente, a superóxido dismutase (SOD) foi expressa na fase de
levedura de Paracoccidioides sp. (Tabela 2). A SOD3 tem sido identificada em
Paracoccidioides sp., onde devido a sua localização na superfície celular, poderia
atribuir-se sua atividade à proteção contra aníons superóxidos extracelulares (Castro et.
al, 2005). Dados semelhantes a este tem sido descrito em Histoplasma capsulatum onde
a SOD3 promove a detoxificação de espécies reativas de oxigênio (ROS) derivados do
hospedeiro (Youseff et al., 2012).
Estudos mostraram que o fator de elongação-1α tem sido localizado na
parede celular de C. abicans e S. cerevisiae (Pitarch et al., 2002; Nombela et al., 2006;
Castilho et al., 2008). Além disso, fatores de elongação têm sido descritos em diversos
organismos associados à superfície celular (Maneu et al., 1996; Lim et al., 2001; Singh
et al., 2001; Chivasa et al., 2002). Na tentativa de explicar sua localização na superfície
celular, foi proposto que os fatores de elongação poderiam estar relacionados com o
processo de adesão de patógenos. Foi relatado também que esses fatores de elongação
podem desenvolver funções de chaperona, promover a translocação de proteínas, como
também podem estar envolvidos no processamento dos componentes da parede celular
(Pitach et al., 2002). Adicionalmente tem sido descrito em Leishmania, que o fator de
elongação-1 α é capaz de ativar múltiplas proteínas tirosina fosfatases do hospedeiro, o
que irá regular negativamente a sinalização de interferon-γ (INF-γ), impedindo a efetiva
expressão da atividade microbicida desempenhada pelos macrófagos, incluindo a
produção de TNF-α e óxido nítrico (NO) (Silverman et al., 2010; Silverman et al.,
2012). O fator de elongação-1α tem sido identificado também em proteínas secretadas
em Paracoccidioides sp. (Weber et al., 2012). O fator de elongação-1 α também foi
identificado nas frações de proteínas da parede do presente estudo (Tabelas 1, 2, 3, 4, 5).
Foram identificadas também um grande número de proteínas relacionadas com a síntese
proteica que incluem proteínas ribossomais e fatores de elongação (Tabelas 1, 2, 3, 4,
5).
As proteínas relacionadas com o dobramento, modificação e destinação,
identificadas no presente trabalho, incluem a dissulfito isomerase (Tabelas 1, 2, 3). Sua
função está relacionada com dobramento de proteínas que contém pontes de dissulfeto.
35
Esta proteína tem sido imunolocalizada no envelope celular de Giardia lambia (Reiner
et al., 2001), Trichoderma reesi (Lim et al., 2001) e Arabidopsis thaliana (Chivasa et
al., 2002). Uma vez que ela tem sido imunolocalizada com PPCs na superfície celular,
foi sugerido que esta proteína participa do amadurecimento das proteínas da parede na
superfície celular (Knodler et al., 1999; Reiner et al., 2001).
Foram identificadas também diversas proteínas relacionadas com a resposta
ao estresse e virulência (Tabelas 1, 2, 3, 4, 5). Dentro desse grupo incluem-se as
proteínas de choque térmico (Hsps); essa classe de proteínas pode contribuir com a
proteção ao dano celular bem como reparo celular causado pelo estresse que ocorre
durante a infecção (Bailão et al., 2006). Assim, a resposta ao estresse provavelmente
seja um atributo de grande importância para a virulência em fungos patogênicos. As
proteínas identificadas relacionadas com a resposta ao estresse incluem as proteínas
membro das famílias HSP70 e HSP90 (Tabelas 1, 2, 3, 4, 5). A presença dessas
proteínas na parede foi anteriormente descrita em C. albicans através de técnica de
imunolocalização (Matthews et al., 1988; Lopez-Ribot et al., 1996). As proteínas
membros das famílias HSP70 e HSP90 tem sido demostradas também na superfície
celular de diversos organismos (Ardeshir et al., 1987; Danilition et al., 1990; Gomez et
al., 1992; Macellaro et al, 1998; Pardo et al., 1999). Essas chaperonas estão envolvidas
no dobramento e translocação de proteínas (Georgopouls & Welch 1993; Bukau &
Horwich 1998), podendo desempenhar também funções relacionadas com a:
biossíntese, secreção, montagem de componentes na parede, bem como na estrutura da
parede celular (Lopez-Ribot & Chaffin, 1996). Além disso, devido a sua localização na
superfície celular foi proposto que essas proteínas podem exibir propriedades
antigênicas (Martínez et al., 1998; Pitarch et al., 2002).
As histonas foram identificadas nas frações analisadas (Tabelas 1, 2 e 5).
Apesar das histonas serem comumente associadas com DNA, tem sido descrito a
presença dessas proteínas na superfície celular (Nosanchuk et al., 2003). Em
Mycobacterium leprae, um patógeno intracelular obrigatório, algumas histonas podem
se ligar à laminina nos nervos periféricos, facilitando a invasão nas células de Schwann
(Pessolani et al., 1993; Shimoji et al., 1999; Marques et al., 2000, 2001). Em H.
capsulatum foi demonstrado uma histona H2B, localizada na parede celular. Neste
estudo observou-se que a imunização em camundongos contra essa proteína reduziu a
carga fúngica, diminui a inflamação pulmonar e prolongou a sobrevivência contra a
histoplasmose em modelos murinos infectados (Nosanchuk et al., 2003).
36
As proteínas identificadas relacionadas à sinalização celular incluem a Rho
1 GTPase, identificada na fração 1 da fase leveduriforme de Paracoccidioides sp.
(tabela 1). A proteína Rho 1 GTPase foi descrita em vesículas extracelulares de
leveduras de fungos patogênicos (Vallejo et al., 2012), e sua função está relacionada à
via da integridade da parede celular como regulador de β-1,3-glucana sintase em
Paracoccidioides sp. (Sorais et al., 2010), com também em S. cerevisiae (Hirano et al.,
1996) e Cryptococcus neoformans (Fuchs et al., 2007).
Corroborando com os resultados do presente estudo, tem sido demonstrado
que proteínas intracelulares conhecidas tem sido encontradas na parede (Ebanks et al.
2008) como, endo-β-1,3-glucanase (Hartland et al., 1991), HSP60 (Lopez-Ribot et al.
1996), álcool desidrogenase (Klotz et al. 1994, 2001), fosfoglicerato quinase (Alloush et
al., 1997), fatores de elongação 1e 2, actina, proteína transportadora de ADP/ATP,
porina da membrana externa mitocondrial (Castilho et al. 2008) entre outras. Com
exceção da endo- β-1,3-glucanase e fosfoglicerato mutase, todas foram identificadas no
presente estudo (Tabelas 1, 2, 3, 4, 5).
6.5. Proteínas identificadas nas frações de proteínas da parede celular na fase
miceliana
Um número restrito de proteínas foi identificado em micélio em comparação
com o número de proteínas identificadas na fase leveduriforme. Em estudos realizados
em C. albicans que é possível que as proteínas de parede celular na fase miceliana
possam ser retidas no esqueleto da parede por meio de ligações diferentes daquelas
observadas na fase leveduriforme (Pitarch et al., 2002). Esse mesmo estudo mostrou que
as GPI-PPC de micélio são ligadas em quitina em uma maior proporção daquela
observada em levedura. Acredita-se que a quitina presente na hifa possa estabelecer
mais conexões com outros componentes de parede e reter maiores quantidades de
manoproteínas (Pitarch et al., 2002). Esse dado talvez possa justificar o número
reduzido de proteínas encontradas nas frações da parede celular de micélio. Abordagens
para melhorar as extrações na fase miceliana estão sendo realizadas, na tentativa de
detectar um maior número de proteínas da parede celular de micélio em
Paracoccidioides sp.
37
37
Tabela 1. Proteínas identificadas na fração de proteínas associadas à parede tratadas com SDS/DTT de Paracoccidioides sp. expressas na
fase de levedura
Número de
acessoa
Descrição da
Proteínab
Score
Proteínac
Número de
peptídeos
encontradosd
Cobertura
de sequencia
(%)e
Signal P
Score
≥0,34f
Secretome P
Score ≥0,5g
NetNglyc
Score ≥0,5 h
NetOglyc
Score
≥0,5 i
Big-PI j
RESPOSTA AO ESTRESSE
PAAG_05142 Proteína de choque
térmico mitocondrial
10 kDa
11918,36 6
53,4
-
-
- - -
PAAG_05679
HSP90 8880,164 21 25,18 - - 5 sítios 13 sítios -
PAAG_08003
HSP70 6092,981 17 31,65
- - 1 sítio 3 sítios -
PAAG_08059
HSP60 4316,16 23 45,1
- - 1 sítio 14 sítios -
PAAG_01339
Proteína de choque
térmico SSC1
3470,543 12 18,09
- - 1 sítio 18 sítios -
PAAG_00871 Proteína de choque
térmico 30 kDa
2943,868 9 32,95 - 0,8925 - 25 sítios -
PAAG_01262
HSP70 1803,437 13 24,84 0,864 - - 1 sítio -
PAAG_09083
Proteína da família
TCTP
2669,875 2 14,29 - 0,9067
- - -
PAAG_07775
Proteína de choque
térmico SSB1
1025,759 10
23,16 - 0,8618
- 4 sítios -
METABOLISMO E ENERGIA
38
38
PAAG_00771
Enolase 10973,91 9 27,23
- - - 1 sítio -
PAAG_08468
Gliceraldeído-3-
fosfato
desidrogenase
8475,858 7
30,18 - 0,9120
1 sítio 1 sítio -
PAAG_00053 Malato
desidrogenase
34448,071 9 32,35 - 0,8163 1 sítio 4 sítios -
PAAG_01534
Piruvato
desidrogenase,
componente E1,
subunidade beta
1004,258
5
16,45
-
- - 7 sítios -
PAAG_05249
Aldeído
desidrogenase
817,5178 9 18,35 - - 2 sítios 3 sítios -
PAAG_01995
Frutose-1,6-
bifosfato aldolase
1199,503 3
11,39
- 0,6628
1 sítio - -
PAAG_00850
Glicosamina frutose-
6- fosfato
aminotransferase
800,3458 5 9,84 - - - 1 sítio -
PAAG_02869
Fosfoglicerato
quinase
761,352 7 21,1 - 0,6626
1 sítio 1 sítio -
PAAG_00403
Álcool
desidrogenase
318,5437 4 10,17 - - - - -
PAAG_01463
Succinil-CoaA
ligase, subunidade
beta
591,1973 6 16,89 - - 1 sítio 4 sítios -
PAAG_07729
Isocitrato
desidrogenase,
subunidade beta
368,0217 4 10,56 - - 1 sítio 6 sítios -
PAAG_04166 Transaldolase 362,9621 1 5,58 - - 1 sítio 3 sítios -
39
39
PAAG_02664
3-cetoacil-CoA
tiolase
483,0092 5 14,39 - 0,8279
1 sítio 8 sítios -
PAAG_05048
3-isopropilmalato
desidratase,
subunidade maior
296,034 11
9,9 - 0,6667
1 sítio 8 sítios -
PAAG_01321
2-nitropropano
dioxigenase
2789,323 8 39,44 - - - 3 sítios -
PAAG_04401
Aminotransferase de
aminoácidos de
cadeia ramificada
657,3777 6 17,80
- - 2 sítios 7 sítios -
PAAG_06996
Complexo da
proteína G,
subunidade beta
CpcB
517,3622 7 22,47 - 0,9009
2 sítios - -
PAAG_07114
Argininosuccinato
sintase
694,9622 6 16,46 - - - - -
PAAG_08163
Fumaril acetoacetase 296,6448 5 9,11 - 0,7491
- 4 sítios -
PAAG_07672
Ubiquinol citocromo
c redutase
2797,48 2 21,31 - - - - -
PAAG_04838
ATP sintase,
subunidade 4
411,1718 6 22,13 -
- - 15 sítios -
PAAG_06796
Citocromo c,
subunidade Vb
364,5266 1 5,58 - 0,7597
- 6 sítios -
PAAG_02603
Aspartato
aminotransferase
642,9378
9 24,71
- - 1 sítio 7 sítios -
PAAG_02265
ATP sintase
mitocondrial,
1538,543
4 38,61 - - - 3 sítios -
40
40
subunidade F1F0
PAAG_07786 Acetil-CoA
acetiltransferase
280,1454 1 4,26 - 0,8393 - 2 sítios -
PAAG_05576
ATP sintase, cadeia
gama
411,1624 3 13,13 -
- - 1 sítio -
PAAG_08082
ATPase de
membrana
plasmática
290,8544
5 8,4 - - - 2 sítios -
PAAG_08037
ATP sintase,
subunidade beta
1128,148
7 16,18 - - 1 sítio 10 sítios -
PAAG_08088
Complexo citocromo
bc1, subunidade 2
527,8231
4 9,94 - 0,9180
- 12 sítios -
PAAG_04820
ATPase, subunidade
alfa
4579,176
9 15,48 - - - 6 sítios -
SÍNTESE DE PROTEÍNAS
PAAG_02024 Fator de elongação 1
alfa
8826,426
9
24,57
-
0,6836
2 sítios 2 sítios -
PAAG_03556
Fator de elongação 1
gamma
2529,685
4
10,32 - 0,9067
- 4 sítios -
PAAG_00594
Fator de elongação 2 2425,76
20 25,99 - - - 5 sítios -
PAAG_02921
Fator de elongação 1
alfa
474,6803
7 9,3 - - 1 sítio - -
41
41
PAAG_03028
Fator de elongação 1
beta
420,258
1 7,33 - 0,9342
- 7 sítios -
PAAG_01785
Proteína ribosomal
40S
6092,981
17 31,65 - - - 4 sítios -
PAAG_04998
Proteína ribossomal
L8 B 60S
3339,399
6
20,69 - 0,8718
- 4 sítios -
PAAG_01939
Proteína ribossomal
L2 A 60S
2758,593 2 15,56 - 0,8279
3 sítios -
PAAG_02634
Proteína ribossomal
S6
2268,1
4
16,46
- 0,5410
1 sítio 11 sítios -
PAAG_08888
Proteína ribossomal
L4 60S
2014,625
9
30,38 - 0,9204
- 19 sítios -
PAAG_00724
Proteína ribossomal
11, subunidade
maior
1984,338 2 16 - - 1 sítio 3 sítios -
PAAG_05590
Proteína ribossomal
L12 60S
1959,476
5 35,76 - - - 1 sítio -
PAAG_01433
Proteína ribossomal
S 14 40S
1933,933 4 16,56 - 0,7428
2 sítios 7 sítios -
PAAG_07847
Proteína ribossomal
S26 40S
1917,488 1 12,4 - 0,8297
- - -
PAAG_05017
Proteína ribossomal
S10 A 40S
1894,55
1 7,88 - 0,7241
- 3 sítios -
PAAG_01435
Proteína ribossomal
S16 40S
1725,604 4 30,07 - 0,7623
- - -
PAAG_04965
Proteína ribossomal
L31 60S
1665,748 8 49,59 - 0,5706
1 sítio 5 sítios -
PAAG_08497
Proteína ribossomal
L19
1591,624 4 25,13 - - - 5 sítios -
42
42
PAAG_00264
Proteína ribossomal
S8 B
1452,817 2 10,89 - 0,7054
- 7 sítios -
PAAG_07182
Proteína ribossomal
S7 40S
1448,197
2 9,95 - - - 7 sítios -
PAAG_00765
Proteína ribossomal
L36
1382,323
3 30,1 - 0,5076
1 sítio 8 sítios -
PAAG_06367
Proteína ribossomal
S17P 30S
1276,02 5 31,06 - 0,6969
- 4 sítios -
PAAG_03816
Proteína ribossomal
S4 40S
1212,652 5 20,23 - - 1 sítio 3 sítios -
PAAG_06320 Proteína ribossomal
L13 60S
1177,596
4 23,04 - 0,5188
1 sítio 4 sítios -
PAAG_02111
Proteína ribossomal
S0 40S
1048,887 3 17,29 - - 2 sítios 13 sítios -
PAAG_08955
Proteína ribossomal
S3aE 40S
1043,386
7 18,43 - - 1 sítio 5 sítios -
PAAG_05778
Proteína ribossomal
S19 40S
916,5134
4 29,45 - - - 4 sítios -
PAAG_07955
Proteína ribossomal
L18 60S
802,4984
3 14,29 - 0,5731
- 5 sítios -
PAAG_00548
Proteína ribossomal
L5 60S
784,9415
4 12,04 - - - 5 sítios -
PAAG_00430 Proteína ribossomal
L2 60S
836,5415
4 24,41 - 0,8823
- 7 sítios -
PAAG_04572
Proteína ribossomal
L14
825,0777 2 8,16 - - - 7 sítios -
PAAG_06487 Proteína ribossomal
L7 C 60S
822,2573
5 18,95 - - - 4 sítios -
PAAG_07385
Proteína ribossomal
L23a 60S
724,7755
2 15,03 - 0,9298 - 10 sítios -
43
43
PAAG_00385
Proteína ribossomal
S23 40S
533,4198
3 23,45 - 0,6139
- 2 sítios -
PAAG_03828
Proteína ribossomal
S9 40S
556,4899 5 14,14 - - - 7 sítios -
PAAG_09043
Proteína ribossomal
S2 40S
525,6276 2 6,92 - 0,7268
- 3 sítios -
PAAG_00952
Proteína ribossomal
L20 60S
427,4286
2 10,92 - - - 2 sítios -
PAAG_04690
Proteína ribossomal
S15 40S
427,4286
2 10,92 - - - 1 sítio -
PAAG_06743
Proteína ribossomal
L23
396,0694 3 18,57 - 0,6449
- - -
PAAG_03019
Proteína ribossomal
L6 60S B
350,0803
8 24,02 - 0,9072
- 9 sítios -
PAAG_00801 60S ARP P0 liase 265,7515
3 10,86 - - - 6 sítios -
PAAG_00689
RNA helicase eIF4A
dependente de ATP
1979,469 7 21,36 - - - 2 sítios -
TRANSPORTE
PAAG_08620
Proteína
transportadora de
ADP/ ATP
4976,334 6 19,42 - - - - -
PAAG_07564
Porina mitocondrial
da membrana
externa
1351,719
6 16,55 - 0,9516
- - -
PAAG_02458
Proteína de ligação
GTP ypt7
474,3975 7 9,3 - 0,5310
- - -
PAAG_04651
Proteína nuclear de
ligação ao GTP
2843,585 5 24,19 - - - 1 sítio -
44
44
GSP1 Ran
PAAG_01647 Alfa tubulina cadeia
1
585,1683 6 10,42 - - - 1 sítio -
HISTONAS
PAAG_08917 Histona H2a 4104,597
2
14,07 - 0,5473
- 12 sítios -
PAAG_07098
Histona H4 1 1230,269
4 32,92 - - - 1 sítio -
PAAG_08918
Histona H2B L4 1180,999
5 29,79 - 0,9505
- 4 sítios -
PAAG_00126
Histona H42 828,1799 9 28,16 - - - 1 sítio -
PAAG_07099
Histona H3 3 764,6865
2
9,56 - 0,6000
- 7 sítios -
PAAG_08471
Histona H2A Z 618,3201 3 21,74 - 0,9110
- 4 sítios -
TRANSCRIÇAO
PAAG_06891
Csx1 regulador pós
transcricional de
ligação ao mRNA
535,6835 3 9 - 0,9313
- 15 sítios -
PAAG_04511
RNA Helicase
dependente de ATP
SUB2
335,7571 6 13,06 - - - 11 sítios -
PAAG_07785
Componente de 116
kDa da
ribonucleoproteína
U5
277,602 7 3,94 - - - 11 sítios -
CICLO CELULAR E PROCESSAMENTO DE DNA
45
45
PAAG_01041
Proibitina 2 1029,772
4 13,23
- - 2 sítios 2 sítios -
PAAG_04458
Proibitina 1 755,5968 8 37,86 0,426
- 2 sítios 1 sítio -
PAAG_06751
Proteína de
checagem do dano
ao DNA rad24
1541,15
10 54,72 - - 1 sítio 10 sítios -
PAAG_00773
Proteína de
checagem do dano
ao DNA rad24
758,4174
7
21,58
- - 3 sítios 9 sítios -
DOBRAMENTO, MODIFICAÇÃO, DESTINAÇÃO PROTEICA
PAAG_00986 Disulfito isomerase
Pdi1
481,7226 7 19,33
0,772
-
- 17 sítios -
PAAG_03334
Peptidil-prolil-cis-
trans isomerase D
994,6697
3
8,85
- 0,8640
2 sítios 5 sítios -
PAAG_00797 Proteína
mitocondrial MAS5
221,9973 4 10 - 0,9516
- 6 sítios -
BIOGÊNESE DE COMPONENTES CELULARES
PAAG_03532
Actina 3390,721
9 27,2
- - 1 sítio 3 sítios -
PAAG_08209
Peroxina 11 688,1796 6 25,21 - - - - -
RESGATE CELULAR, DEFESA E VIRULÊNCIA
46
46
PAAG_03292
Citocromo c
peroxidase
2372,334 7 19,52 - - - 24 sítios -
PAAG_06255
Chaperona
mitocondrial GrpE
585,1652 3 14,62 - - - 18 sítios -
PAAG_07750
Proteína de choque
térmico HSP88
879,8005 10 17,47 - - - 4 sítios -
COMUNICAÇÃO CELULAR
PAAG_07634
RhoA GTPase,
subunidade menor
1239,854 5 21,47 - - - 4 sítios -
PAAG_08028
Proteína de ligação ao
GTP ypt1
1355,245
5 28,36 - - - 3 sítios -
OUTROS
PAAG_12011
Citocromo c oxidase
mitocondrial, subunidade
2
478,8431 3 7,91 - - 1 sítio - -
A,b) Número de acesso/descrição da proteína de acordo com o banco de dados do P. brasiliensis;
(http://www,broadinstitute,org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiHome,html) c) Score da Proteína d) Número de peptídeos encontrados (MS/MS)- número de peptídeos correspondente às massas da proteína encontrada; e) Cobertura de sequência- porcentagem de cobertura de sequências do aminoácido em relação à proteína total identificada; f) Predição de secreção de acordo com Signal P 4,0 servidor, o número correspondente para o D-score deve ser igual ou exceder o valor de 0,340 (D-score ≥ 0,340)
(http://www,cbs,dtu,dk/services/SignalP/); g) Predição de secreção de acordo com Secretome P 2,0 servidor, o número correspondente para o SecP- score deve ser igual ou exceder o valor de 0,5 (SecP score≥0,50)
(http://www,cbs,dtu,dk/services/SecretomeP/); g) Predição de secreção de acordo com Secretome P 2,0, o número correspondente para o SecP- score deve ser igual ou exceder o valor de 0,5 (SecP score ≥0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/). h) Predição de secreção de acordo com NetNglyc 1.0, o número correspondente para o score discriminante deve ser igual ou exceder o valor de 0,5 (score ≥ 0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ );
47
47
i) Predição de secreção de acordo com NetOglyc 3.1, o número correspondente para o score discriminante deve ser igual ou exceder o valor 0,5 (score ≥ 0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ ); j) Predição de secreção de acordo com big-PI, sendo consideradas preditas aquelas que apresentarem uma região C-terminal positiva para modificações por âncora de GPI
(http://mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html);
48
48
Tabela 2. Proteínas identificadas na fração álcali sensível tratada com NaOH 30mM de Paracoccidioides sp. expressas na fase de
levedura
Numero de
acessoa
Descrição da Proteínab Score
Proteínac
Número de
peptídeos
encontradosd
Cobertura
da
sequencia
(%)e
Signal P
Score
≥0,34 f
Secretome
P
Score ≥0,5g
NetNglyc
Score ≥0,5 h
NetOglyc
Score
≥0,5 i
Big-
PI j
RESPOSTA AO ESTRESSE
PAAG_05142 Proteína de choque
térmico mitocondrial 10
kDa
21525,24 5
58,52
-
-
- - -
PAAG_05679
HSP90 2509,094 6 30,1 - - 5 sítios 13 sítios -
PAAG_08003
HSP70 9588,844 20 42,2
- - 1 sítio 3 sítios -
PAAG_08059
HSP60 5672,206 12 24,32
- - 1 sítio 14 sítios -
PAAG_01339
Proteína de choque
térmico SSC1
7104,76 12 21,32
- - 1 sítio 18 sítios -
PAAG_01262
HSP70 1730,431 11
17,52 0,864 -
- 1 sítios -
PAAG_03735
Chaperona DNAJ 1641,456 4
5,83 - 0,9375
- 31 sítios -
PAAG_02686
Chaperona Hsp90 AHA1 684,8682 4
15,2 - 0,9412
- 21 sítios -
PAAG_02130
Proteína de choque
térmico HSP98
300,1422 15
14,04 - -
3 sítios 27 sítios -
METABOLISMO E ENERGIA
49
49
PAAG_00771
Enolase 15356,21 8 31,19
- -
- 1 sítio -
PAAG_08468
Gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase
7618,667 8
26,33 - 0,9120
1 sítio 1 sítio -
PAAG_00053
Malato desidrogenase 13268,37
15 52,94 -
0,8163 1 sítio 4 sítios -
PAAG_08449
Malato desidrogenase 3549,875 9 27,49 - - 1 sítio - -
PAAG_01995
Frutose-1,6- bifosfato
aldolase
1932,856 10
34,44
- 0,6628
1 sítio - -
PAAG_02869
Fosfoglicerato quinase 801,2019 9 18,71 - 0,6626 1 sítio 1 sítio -
PAAG_02664
3-cetoacil-CoA tiolase 2109,959 6 19,66 - 0,8279 1 sítio 1 sítio -
PAAG_05048
Aconitase 273,5587 2
19,92 - 0,6667
1 sítio 8 sítios -
PAAG_02630
Glicoproteína synaptic
SC2
4885,785 4 14,38
- - 1 sítio - -
PAAG_04931
Flavoproteína de
transporte de eléctrons,
subunidade beta
3833,899
2 13,57
- - 1 sítio 3 sítios -
PAAG_00173 Flavoproteína de
transporte de elétrons,
subunidade alfa
449,4608
4
15 -
0,9103
- 3 sítios -
PAAG_02554
3-hidroxi-isobutiril CoA
hidrolase
3487,025
3
11,55
- - 2 sítios 20 sítios -
50
50
PAAG_00666
Componente PDX1 do
complexo piruvato
desidrogenase
2138,267
7 27,95
- - 1 sítio 31 sítios -
PAAG_00417
Succinil-CoA ligase,
subunidade alfa
2076,947
8 38,97
- - 1 sítios 4 sítios -
PAAG_00050
Componente X do
complexo piruvato
desidrogenase
1763,07
9
21,06 - 0,5717
- 15 sítios -
PAAG_04851
Proteína de crescimento
osmótico
1508,671
11
20,38
-
0,9046
2 sítios 12 sítios -
PAAG_04550
2-metilcitrato sintase 1293,437
8 18,76
- 0,5337
1 sítio 6 sítios -
PAAG_01974 Metilglutaconil-CoA
hidratase mitocondrial
1285,362
4
21,97
- - - 2 sítios -
PAAG_07786
Acetil-CoA
acetiltransferase
1223,407
4
13,53 - 0,8393
- 2 sítios -
PAAG_06473
Manitol-1-fosfato-5
desidrogenase
1185,34
7 23,45 - - - 1 sítio -
PAAG_00731
Proteína bifuncional da
biossíntese purina
ADE17
1172,607
13 31,13
- - - - -
PAAG_04549
2-metilisocitrato liase
mitocondrial
1056,94
7
11,07 - 0,9005
- 14 sítios -
PAAG_08701
D-3-fosfoglicerato
desidrogenase
981,0499
7 24,89
- - 1 sítio 9 sítios -
51
51
PAAG_02603
Aspartato
aminotransferase
833,1692
7 15,15
- - 1 sítio 7 sítios -
PAAG_04444
Transcetolase 836,9566
12 20,58
- - 1 sítio 3 sítios -
PAAG_05392
Betaína aldeído
desidrogenase
809,2419
10 37,45
- - 1 sítio 4 sítios -
PAAG_05005
Componente da
antranilato sintase
770,2108
4 4,68 - - - 7 sítios -
PAAG_02769
Componente X do
complexo piruvato
desidrogenase
766,1917
5 6,46 0,387
- - 29 sítios -
PAAG_02050
Piruvato decarboxilase 693,5775
7 10,8 - - - 6 sítios -
PAAG_03978
3-hidroxi-isobutirato
desidrogenase
670,6199
7 23,26 - - - 8 sítios -
PAAG_05416
Leucotrieno B4 12-
hidroxi desidrogenase
dependente NADP
577,66
8
15,63 - 0,7898
- - -
PAAG_07605
Acetolactato sintase,
subunidade menor
573,3843
4 14,84 - - - 24 sítios -
PAAG_03659
Proteína quinase gsk3 520,5465
7 22,34
- - 1 sítio 9 sítios -
PAAG_06224
Carnitina-O
acetiltransferase
512,402 5
10,98
- 0,8922
1 sítio 7 sítios -
PAAG_01870
3-oxoacil-(proteína-
transportadora de acil)
redutase
498,2003
2
11,19
- 0,8025
1 sítio 5 sítios -
52
52
PAAG_07412
Serina
hidroximetiltransferase
482,0086
4 8,07
- - 3 sítios - -
PAAG_06329
3-hidroxibutiril-CoA
desidrogenase
447,8461
7 22,12
- - 2 sítios 7 sítios -
PAAG_03333
Formamidase 430,5747
7 18,07 - - - 2 sítios -
PAAG_05151
ATP citrato liase 389,5834
9 12,76
- - 1 sítio 10 sítios -
PAAG_07760
Treonina sintase 418,5964
10 21,46
- - 1 sítio 4 sítios -
PAAG_05929
Sulfato adeniltransferase 382,4107
7 18,85 - - - 3 sítios -
PAAG_08915
Dihidrolipoamida
succiniltransferase
379,6206
4
8,19 - 0,7542
- 2 sítios -
PAAG_03116
Acil-CoA oxidase 377,7757
5 6,6
- - 1 sítio 8 sítios -
PAAG_08164
Homogentisato 1,2
dioxigenase
310,4226
5
13,22 - 0,9083
- 11 sítios -
PAAG_00435
R benzilsuccinil CoA
desidrogenase
301,3124
6 15,32 - - - 8 sítios -
PAAG_01002
Glutamato desidrogenase
NAD específica
300,7159
6 3,35
- - 1 sítio 21 sítios -
PAAG_08203
Fosfoenolpiruvato
carboxiquinase
281,3573
3
2,08 - 0,5873
- 6 sítios -
PAAG_02732
2-oxoglutarato
desidrogenase E1
266,885
15 8,3
- - 3 sítios 21 sítios -
53
53
PAAG_01833
2-succinilbenzoato-CoA
ligase
258,9445
3 2,75
- - 1 sítio 8 sítios -
PAAG_04291
Nucleosídeo difosfato
quinase
8847,635
2 17,11 - - - 1 sítio -
PAAG_05091 Ubiquinona
oxidoredutase,
Subunidade 213 kDa
NADH
1510,975
3
16,08 - 0,5137
- 2 sítios -
PAAG_01078
Oxidase 1436,363
5 21,88 - - - 2 sítios -
PAAG_05735
Ubiquinona
oxidoredutase,
subunidade 49 kDa
NADH
293,5617
5
10,23 - - - 3 sítios -
PAAG_06252
Citocromo c oxidase,
polipeptídio VIb
7560,263
3
39,13
- 0,8581
1 sítio 3 sítios -
PAAG_04570
Mitocondrial ATP
sintase, cadeia D
5645,292
8 56,9 - - - 12 sítios -
PAAG_02266
Ubiquinona
oxidoredutase NADH 21
kDa
1010,831
5
32
- 0,9355
1 sítio 18 sítios -
PAAG_02653
Acetil-CoA sintetase 710,3576
6 15,1
- - 1 sítio 5 sítios -
PAAG_03631 Oxofitodienoato redutase 4468,336
6
16,71
- 0,7398
1 sítio 9 sítios -
PAAG_07321
Proteína da biossíntese
piridoxina PDX1
1107,222 2 5,56 - - - 6 sítios -
54
54
PAAG_05107 AAA ATPase
1982,711
5
53,4
- 0,5297 1 sítio 28 sítios -
PAAG_08019
Adenilato quinase
citosolica 2
858,6353
6 25,72 - - - 2 sítios -
PAAG_02265
ATP sintase
mitocondrial, subunidade
F1F0
6296,381
3 35,64 - - - 3 sítio -
PAAG_04820 ATPase, subunidade alfa 6106,426
10 21,94 - - - 6 sítios -
PAAG_08037
ATP sintase, subunidade
beta
4211,933
9 27,1 - - 1
sítio
10 sítios -
PAAG_08088
Complexo citocromo
bc1, subunidade 2
373,6864
7 14,69 - 0,9180 - 12 sítios -
PAAG_08082
ATPase de membrana
plasmática
531,6011
5 8,72 - - - 4 sítios -
PAAG_02019
ATP sintase mitocondrial
F1F0, subunidade Atp14
2398,232
1
15,87 - 0,9112
- 7 sítios -
PAAG_06155
ATP sintase vacuolar,
subunidade E
720,8109
3 11,72 - - - 7 sítios -
PAAG_06206
ATP sintase, subunidade
5
604,9119
6 21,74 - - - 14 sítios -
SÍNTESE PROTEICA
55
55
PAAG_02024 Fator de elongação 1 alfa 13601,02
10
30,43
-
0,6836
2 sítios 2 sítios -
PAAG_03556
Fator de elongação 1
gamma
735,5676
5
12,04 - 0,9067
- 4 sítios -
PAAG_00594
Fator de elongação 2 1020,818
10 11,31 - - - 5 sítios -
PAAG_02921
Fator de elongação 1 alfa 577,6839
10 22,45 - - 1 sítio - -
PAAG_03028
Fator de elongação 1 beta 14675,21
4 43,1 - 0,9342 - 7 sítios -
PAAG_01785
Proteína ribossomal 40S 6192,729
8 38,89 - - - 4 sítios -
PAAG_04998
Proteína ribossomal L8 B
60S
4724,041
7
22,22 - 0,8718
- 4 sítios -
PAAG_02634
Proteína ribossomal S6 1749,818
8
29,11
- 0,5410
1 sítio 11 sítios -
PAAG_08888
Proteína ribossomal L4
60S
7576,587
11
30,65 - 0,9204
- 19 sítios -
PAAG_05590
Proteína ribossomal L12
60S
3383,873
3 22,42 - - - 1 sítio -
PAAG_01433
Proteína ribossomal S14
40S
1479,611
4
33,77
- 0,7428
2 sítios 7 sítios -
PAAG_05017
Proteína ribossomal S10
A 40S
2180,968
2 17,58 - 0,7241 - 3 sítios -
56
56
PAAG_07182
Proteína ribossomal S7
40S
9979,46
3 20,4 - - - 7 sítios -
PAAG_00765
Proteína ribossomal L36
6220,854
6 41,75 - 0,5076 1 sítio 8 sítios -
PAAG_06367
Proteína ribossomal S17P
30S
1207,773 5 33,54 - 0,6969 - 4 sítios -
PAAG_06320 Proteína ribossomal L13
60S
5049,785
7
35,94 - 0,5188
1 sítio 4 sítios -
PAAG_08955
Proteína ribossomal S3aE
40S
2032,168
6 26,27 - - 1 sítio 5 sítios -
PAAG_05778
Proteína ribossomal S19
40S
2557,597
4 17,81 - - - 4 sítios -
PAAG_07955
Proteína ribossomal L18
60S
1948,537
4 17,46 - 0,5731 - 5 sítios -
PAAG_00548
Proteína ribossomal L5
60S
3858,295
7 28,76 - - - 5 sítios -
PAAG_00430
Proteína ribossomal L2
60S
3580,26
5 44,46 - 0,8823 - 7 sítios -
PAAG_06487
Proteína ribossomal 60S 1016,449
5 27,02 - - - 10 sítios -
PAAG_07385
Proteína ribossomal L23a
60S
2917,367
2 21,57 - 0,9298 - 10 sítios -
PAAG_00385
Proteína ribossomal S23
40S
1292,228
2 18,62 - 0,6139 - 2 sítios -
PAAG_00952
Proteína ribossomal L20
60S
1765,818
3 13,22 - - - 2 sítios -
57
57
PAAG_04690
Proteína ribossomal S15
40S
4685,958
1 10,46 - - - 1 sítio -
PAAG_03019
Proteína ribossomal L6
60S B
884,5244
4 21,08 - 0,9072 - 9 sítios -
PAAG_00801 60S ARP P0 liase 361,8257
3 8,63 - - - 6 sítios -
PAAG_04691
60S ARP P2 8857,591
4 53,98 0,386
- - 1 sítio -
PAAG_06627
Proteína ribossomal L32
60S
7636,002
2
18,32
- 0,8123
1 sítio 6 sítios -
PAAG_01413
Proteína ribossomal S17
40S
4403,99
1 11,27 - - - - -
PAAG_05805
Proteína ribossomal S21
40S
3846,095
2 26,14 - - - - -
PAAG_05484
Proteína ribossomal S5
40S
1791,419
2 11,68 - - - 2 sítios -
PAAG_06882
Proteína ribossomal S24
40S
1187,413
5
29,1
- 0,6412
1 sítio 4 sítios -
PAAG_02110
Proteína ribossomal S15 1057,565
4
21,71
- 0,6965
3 sítios 26 sítios -
PAAG_00088
Proteína ribossomal L3
60S
845,5701
4
10,46 - 0,8106
- 10 sítios -
PAAG_08634
Proteína ribossomal S12
40S
776,1919
2 13,25 - - - 8 sítios -
PAAG_08847
Proteína ribossomal L28
60S
768,1138
7
44,3 - 0,9207
- 6 sítios -
PAAG_02789
Proteína ribossomal L2
50S
697,4224
4
9,3 - 0,9190
- 7 sítios -
58
58
PAAG_02394
Proteína ribossomal S5
37S
487,9358
4 11,95 -
- - 16 sítios -
PAAG_00244
Proteína ligação ao
poliadenilato
387,9247
9
9,61
- 0,9502
5 sítios 20 sítios -
PAAG_07028
Histidil tRNA sintetase 347,0626
6 12,81 - - - 15 sítios -
PAAG_00815
Fator de iniciação em
Eucarioto 3
283,1691
11 10,08
- - 2 sítios 4 sítios -
PAAG_05103 Treonil tRNA sintetase 263,5384
9 6,94
- - 2 sítios 15 sítios -
PAAG_06623
Fator iniciação da
tradução 4B
3434,049
11
26,27
- 0,9283
1 sítio 47 sítios -
TRANSPORTE
PAAG_07564
Porina mitocondrial da
membrana externa
5152,032
6 30,28 - 0,9516 - - -
PAAG_07185
Subunidade do complexo
Arp2/3
845,3303
3
28,5 - 0,8877
- 13 sítios -
PAAG_05960
Proteína da família
NIPSNAP
423,6351
3 8,56 -
- - 36 sítios -
PAAG_06228 Proteína de translocação
SEC 62
301,4547
2
3,4
- 0,9412
- 24 sítios -
PAAG_06249 Proteína de translocação
SEC 31
300,5972
13
8,17
-
0,9321
1 sítio 90 sítios -
PAAG_07039
Nexina de
endereçamento 3
358,6393
5
12,11 - 0,9455 - 35 sítios -
PAAG_01647
Alfa tubulina cadeia 1 894,3934 7 13,53
- - - 1 sítio -
59
59
PAAG_08103 Proteína com domínio EF 526,1804
15
17,7
- 0,8985
4 sítios 213 sítios -
PAAG_08697 Miosina 2 1698,131
13 9,21 - - 2 sítios 78 sítios -
PAAG_03054
Proteína de controle da
checagem da fase G2/M
456,587
7
17,86
- 0,7363
2 sítios 60 sítios -
HISTONA
PAAG_08917 Histona H2a 41315,43
6
58,52 - 0,5473
- 12 sítios -
PAAG_07098
Histona H4 1 4333,104
2 19,42 - - - 1 sítio -
PAAG_08918
Histona H2B L4 9653,564
2 13,48 - 0,9505 - 4 sítios -
PAAG_07099
Histona H3 3 372,7343
1
6,62 - 0,6000
- 7 sítios -
COMUNICAÇÃO CELULAR
PAAG_02817 Proteína da família
estomatina
5862,986
5 12,08
- -
PAAG_08028
Proteína de ligação ao
GTP ypt1
3004,69
3 25,37 - - - 3 sítios -
PAAG_04591
Proteína sec16 de
montagem do complexo
de revestimento COPII
279,6222
14
4,53
- 0,8588
3 sítios 299 sítios -
PAAG_01764
Proteína de ligação a
actina
1992,791
12
22,81
- 0,8836
1 sítio 98 sítios -
BIOGÊNESE DE COMPONENTES CELULARES
PAAG_02994
Proteína da biogênese da
parede celular fosfatase
SSD1
910,5494
6
4,77
- 0,9462
3 sítios 93 sítios -
60
60
PAAG_01415
Proteína com dominio
SH3
474,2371
8 6,5 - 0,8448
PAAG_03898
Proteína de síntese do
cofator miolibdopterina
1140,437
6
13,9
- 0,8957
1 sítio 13 sítios -
PAAG_03532
Actina 349,3648
4 9,33
- - 1 sítio 3 sítios -
PAAG_00004
Proteína de ligação a
actina
10384,49
4
13,77
- 0,9281
1 sítio 200 sítios -
RESGATE CELULAR, DEFESA E VIRULÊNCIA
PAAG_07750
Proteína de choque
térmico HSP88
1683,205 11 17,74 - - - 4 sítios -
PAAG_02725
Superóxido dismutase 9525,718 6
48,02 - 0,8823
- 6 sítios -
PAAG_03216
Peroxiredoxina
mitocondrial PRX1
1999,772
5 21,17 - - - 3 sítios -
CICLO CELULAR E PROCESSAMENTO DE DNA
PAAG_02230
Proteína do controle da
divisão celular
1841,691
2
9,9 - 0,5481
- 151 sítios -
PAAG_05518
Proteína de ciclo celular 505,0283
9 14,02
- - 1 sítio 5 sítios -
PAAG_01041
Proibitina 2 4546,234
8 30
- - 2 sítios 2 sítios -
PAAG_07296
Proteína de ligação
ssDNA
3256,021
3
26,63 - 0,5421
- 3 sítios
PAAG_03188
Proteína de movimento
nuclear nudC
2140,304
3
29,29 - 0,7668
- 6 sítios -
61
61
PAAG_02186
Proteína de segregação
nuclear BFR1
430,907
8
13,69 - 0,8541
- 30 sítios -
PAAG_07192 Proteína RP, membro da
família EB, associada
com microtúbulo
8151,502 3 19,84 - - 1 sítio 12 sítios -
PAAG_06143 Proteína Wsp1 associada
a actina
724,0607
6
15,44 - 0,7604
- 81 sítios -
PAAG_01325
Proteína ativadora de
GTPase ARF
668,3336
4
9,84 - 0,9411
- 51 sítios -
PAAG_06751
Proteína de checagem do
dano ao DNA rad24
2707,374
7 31,32 - - 1 sítio 10 sítios -
PAAG_00773
Proteína de checagem do
dano ao DNA rad24
2392,273
6
24,32
- - 3 sítios 9 sítios -
DOBRAMENTO, MODIFICAÇÃO, DESTINAÇÃO PROTEICA
PAAG_07037
Calnexina 1056,599
11
31,39
0,826
-
PAAG_00986
Disulfito isomerase PDI1 2660,437
13
33,09
0,772 - - 17 sítios -
PAAG_00478
Proteína PSI com
domínio DNAJ
989,7959
3
16,08
- 0,9001
PAAG_06255
Chaperona mitocondrial
GrpE
10867,69
4
18,18
- - - 18 sítios -
PAAG_02907 Proteína com repetição
de anquirina
2058,952
2 12,08 - -
PAAG_03334
Peptidil-prolil-cis-trans
isomerase D
1383,248
3
12,6
- 0,8640 2 sítios 5 sítios -
62
62
PAAG_00739
Peptidil-prolil-cis-trans
isomerase B
5598,1
4 24,29 0,641
- - 1 sítio -
PAAG_06738
Translocase subunidade
tim 50 importe
membrana interna
684,5787 10 29,93 - 0,8222
1 sítio 48 sítios -
PAAG_05509
ATPase do complexo
proteassoma 26S,
subunidade 11 não
regulatória
604,8031
9
17,69
- - - 11 sítios -
PAAG_01896
Peroxina 872,4768
5
18,7 -
0,9426
2 sítios 46 sítios -
PAAG_00797 Proteína mitocondrial
MAS5
3856,714 6 16,83 - 0,9516
- 6 sítios -
PAAG_08260
Chaperona Hsp90 Cdc37 600,4196 7
24,26
- 0,6028
2 sítios 17 sítios -
PAAG_03027
Chaperona CLPB 497,7903 9 15,57 - - - 13 sítios -
PAAG_05643
Proteína Npl4 de
membrana nuclear e
reticulo endoplasmático
9119,638 13 25,39 - 0,9361
1 sítio 39 sítios -
PAAG_04282
Proteína com dominio
UBX
670,2841
4
15,31 - 0,9367
- 30 sítios -
TRANSCRIÇÃO
PAAG_08117
Regulador transcricional 494,931 5 7,48 - - - 3 sítios -
PAAG_02840
Helicase prp5 de
processamento de pré-
mRNA ATP dependente
269,8375 4 8,65 - - - 14 sítios -
63
63
PAAG_05711
Subunidade 50 kDa
U2AF fator de splicing
268,0169 5 6,17 - 0,8111
1 sítio 41 sítios -
PAAG_00672
Proteína da família
MRS7
794,9688
4
10 - 0,5347
- 14 sítios -
PAAG_01097 Proteína de ligação Poly
rC
360,6784
4
3,84
- 0,9159
1 sítio 36 sítios -
PAAG_04571
Complexo associado
polipeptídio nascente,
subunidade alfa
14209,44
6
49,76 - 0,5360
- 13 sítios -
PAAG_02379 Fator transcricional
APSES
1447,345
4 23,36 - 0,9143
2 sítios 11 sítios -
OUTROS
PAAG_05230
CCCH finger de ligação
ao DNA
899,5995 4 13,61 - 0,9509
1 sítio 17 sítios -
PAAG_00957 Proteína contendo HMG
box
7641,071
2 26,72 - 0,9395 - - -
PAAG_03489
Proteína de lise celular
CWL1
955,2409
3 14,29 - - - 9 sítios -
PAAG_04913
Proteína com domínio
RNP
7210,115
7 36,34 - 0,9061
- 19 sítios -
PAAG_01280 Proteína serina/ treonina
fosfatase
2601,225
10
27,1 - 0,9307
- 61 sítios -
PAAG_01347
Proteína de citoesqueleto
actina VIP1
2096,143
9 40,23 - 0,9088
- 17 sítios -
PAAG_03701 Proteína com dominio
BAR
1992,791
12
22,81
- 0,5458
- 13 sítios -
64
64
PAAG_00627
Proteína com dominio
GYF
278,6811
16
8,8
- 0,8965
4 sítios 250 sítios -
PAAG_06869
Proteína de ligação ran 740,6178
4
1,25 - 0,8939
2 sítios 138 sítios -
PAAG_09108
Proteína com repetição
de RPEL
4069,938
3
28,99
- 0,8939
- 10 sítios -
PAAG_05720 Proteína com domínio
SAP
2509,094
6
30,1 - 0,9422
- 40 sítios -
PAAG_00367
Proteína com domínio
CUE
1683,791
7
37,28 - 0,8362
- 33 sítios -
A,b) Número de acesso/descrição da proteína de acordo com o banco de dados do P.brasiliensis;
(http://www,broadinstitute,org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiHome,html) c) Score da Proteína d) Número de peptídeos encontrados (MS/MS)- número de peptídeos correspondente às massas da proteína encontrada; e) Cobertura de sequência- porcentagem de cobertura de sequências do aminoácido em relação à proteína total identificada; f) Predição de secreção de acordo com Signal P 4,0 servidor, o número correspondente para o D-score deve ser igual ou exceder o valor de 0,340 (D-score ≥ 0,340)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/); g) Predição de secreção de acordo com Secretome P 2,0 servidor, o número correspondente para o SecP- score deve ser igual ou exceder o valor de 0,5 (SecP score≥0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/); h) Predição de secreção de acordo com NetNglyc 1.0, o número correspondente para o score discriminante deve ser igual ou exceder o valor de 0,5 (score ≥ 0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ ); i) Predição de secreção de acordo com NetOglyc 3.1, o número correspondente para o score discriminante deve ser igual ou exceder o valor 0,5 (score ≥ 0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ ); j) Predição de secreção de acordo com big-PI, sendo consideradas preditas aquelas que apresentarem uma região C-terminal positiva para modificações por âncora de GPI
(http://mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html);
65
65
Tabela 3. Proteínas identificadas na fração álcali sensível tratadas com NaOH 30mM e N-glicosidase F de Paracoccidioides sp. expressas
na fase de levedura
Número de
acessoa
Descrição b Score
Proteínac
Número de
peptídeos
encontradosd
Cobertura
de
sequencia
(%)e
Signal
P
Score
≥0,34f
Secretome P
Score ≥0,5g
NetNglyc
Score ≥0.5 h
NetOglyc
Score
≥0.5 i
Big-PI j
RESPOSTA AO ESTRESSE
PAAG_05142 Proteína de choque
térmico mitocondrial 10
kDa
8656,394 8 67,96 -
-
- - -
PAAG_05679
Proteína de choque
térmico 90
297,1502 7 11,08 - - 5 sítios 13 sítios -
PAAG_08003
HSP70 2909,914 21 48,17 - - 1 sítio 3 sítios -
PAAG_08059
Proteína de choque
térmico 60
2331,569 19 44,76 - - 1 sítio 14 sítios -
PAAG_01339
Proteína de choque
térmico SSC1
361,5818 13 15,44 - - 1 sítio 18 sítios -
PAAG_01262
HSP70 12,2215 1 1,43 0,864 -
- 1 sítio -
PAAG_06811
Proteína do choque
térmico STI1
218,6675
11 16,61 - - 1 sítio 3 sítios
METABOLISMO E ENERGIA
PAAG_00771
Enolase 810,6396 5 15,1 - -
- 1 sítio -
66
66
PAAG_08468
Gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase
867,1328 7 40,24 - 0,9120
1 sítio 1 sítio -
PAAG_00403
Álcool desidrogenase 591,5544 5 16,38 - - - - -
PAAG_08313
Proteína da família Hmf1
endoribonuclease LPSP
533,0194 3 21,56 - - - - -
PAAG_07246
Citocromo c oxidase,
subunidade Va
2812,154 7 46,2 - - - 14 sítios -
PAAG_03309
Suaprga1 413,4066 5 16,67 - 0,6627
- 23 sítios -
PAAG_01995
Frutose-1,6-bifosfato-
aldolase
271,2023 9 27,5 - 0,6628
1 sítio - -
PAAG_02869
Fosfoglicerato quinase 290,4629 3 7,43 - 0,6626 1 sítio 1 sítio -
PAAG_06329
3-hidroxibutiril-CoA
desidrogenase
234,9206 7 8,72 - - 2 sítios 7 sítios -
PAAG_04820
ATPase, subunidade alfa 528,6951 9 19,35 - - - 6 sítios -
PAAG_08037
ATP sintase, subunidade
beta
324,5255 7 22,42 - - 1 sítio 10 sítios -
PAAG_05367
Álcool desidrogenase
234,6676
5 17,46 - 0,7212 - 5 sítios -
SÍNTESE PROTEICA
PAAG_02024 Fator de elongação 1 alfa 618,2094 6 20,43 -
0,6836
2 sítios 2 sítios -
67
67
PAAG_07841
60S ARP P1
6745,977
2
45,05
- 0,6534 - - -
PAAG_03028
Fator de elongação 1 beta
1424,036
2 10,78 - 0,9342 - 7 sítios -
PAAG_03664
Proteína ribossomal L28e 573,1142 3 26,62 - 0,9541
- 10 sítios -
TRANSPORTE
PAAG_08252
Clatrina cadeia leve 389,5535 4 25 - 0,9112
- 28 sítios -
DOBRAMENTO, MODIFICAÇÃO, DESTINAÇÃO PROTEICA
PAAG_00986
Disulfito isomerase Pdi1 225,9247 5 10,41 0,772 - - 17 sítios -
PAAG_07509
Peptidil-prolil-cis-trans
isomerase ssp1
242,8321 3 18,45 - 0,6854
1 sítio 7 sítios -
PAAG_03334
Peptidil-prolil-cis-trans
isomerase D
358,134 2 3,75 - 0,8640 2 sítios 5 sítios -
PAAG_06536
Ubiquitina 392,8655
3 22,08 - 0,7186 - 3 sítios -
BIOGÊNESE DE COMPONENTES CELULARES
PAAG_01139
Glucanase de parede
celular
195,5835 4 9,51 0,858 - - 51 sítios Positivo
PAAG_03532
Actina 353,859 6 20,53 - - 1 sítio 3 sítios -
PAAG_08973
Tropomiosina
450,0906
5 28,57 - - - - -
68
68
OUTROS
PAAG_01347
Proteína actina VIP1 do
citoesqueleto
295,7978 3 14,29 - 0,9088
- 17 sítios -
A,b) Número de acesso/descrição da proteína de acordo com o banco de dados do P. brasiliensis;
(http://www,broadinstitute,org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiHome,html) c) Score da Proteína d) Número de peptídeos encontrados (MS/MS)- número de peptídeos correspondente às massas da proteína encontrada; e) Cobertura de sequência- porcentagem de cobertura de sequências do aminoácido em relação à proteína total identificada; f) Predição de secreção de acordo com Signal P 4,0 servidor, o número correspondente para o D-score deve ser igual ou exceder o valor de 0,340 (D-score ≥ 0,340)
(http://www,cbs,dtu,dk/services/SignalP/); g) Predição de secreção de acordo com Secretome P 2,0, o número correspondente para o SecP- score deve ser igual ou exceder o valor de 0,5 (SecP score ≥0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/); h) Predição de secreção de acordo com NetNglyc 1.0, o número correspondente para o score discriminante deve ser igual ou exceder o valor de 0,5 (score ≥ 0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ ); i) Predição de secreção de acordo com NetOglyc 3.1, o número correspondente para o score discriminante deve ser igual ou exceder o valor 0,5 (score ≥ 0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ ); j) Predição de secreção de acordo com big-PI, sendo consideradas preditas aquelas que apresentarem uma região C-terminal positiva para modificações por âncora de GPI
(http://mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html);
69
69
Tabela 4. Proteínas identificadas na fração de proteínas associadas à parede tratadas com SDS/DTT de Paracoccidioides sp. expressas na
fase de micélio
Número de
acessoa
Descrição da proteínab Score
Proteínac
Número de
peptídeos
encontradosd
Cobertura de
sequencia
(%)e
Signal P
Score
≥0,34f
Secretome
P
Score ≥0,5g
NetNglyc
Score
≥0.5h
NetOglyc
Score
≥0.5i
Big-PI j
RESPOSTA AO ESTRESSE
PAAG_08003
HSP70 955,6063 12 33,94 - - 1 sítio 3 sítios -
METABOLISMO E ENERGIA
PAAG_05392
Betaína aldeído
desidrogenase
1049,8663 5 15,9 - - 1 sítio 4 sítios -
PAAG_08037
ATP sintase,
subunidade beta
763,5012 8 24,37 - - 1 sítio 10 sítios -
PAAG_00771
Enolase 192,3795
2 7,67 - -
- 1 sítio -
SÍNTESE PROTEICA
PAAG_01785
Proteína ribosomal S3
40S
2983,528 6 31,11 - - - 4 sítios -
PAAG_04965
Proteína ribossomal
L31 60S
4731,078 1 8,13 - 0,9197
1 sítio 5 sítios -
PAAG_03827
Proteína ribossomal
L21 A 60S
4506,85 1 13,13 - - 1 sítio 7 sítios -
PAAG_04425
Proteína ribossomal
L22 60S
3926,994 4 45,08 - 0,5706
- 2 sítios -
PAAG_02024 Fator de elongação 1
alfa
1192,016 9 25,22 -
0,6836 2 sítios 2 sítios -
BIOGÊNESE DE COMPONENTES CELULARES
70
70
PAAG_03532 Actina 1490,045 6 26,67 - 0,5649
1 sítio 3 sítios -
OUTROS
PAAG_06886
Proteína dedo de zinco
GIS2
770,8409 2 24,77 - 0,6514
- 24 sítios -
A,b) Número de acesso/descrição da proteína de acordo com o banco de dados do P.brasiliensis;
(http://www,broadinstitute,org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiHome,html) c) Score da Proteína d) Número de peptídeos encontrados (MS/MS)- número de peptídeos correspondente às massas da proteína encontrada; e) Cobertura de sequência- porcentagem de cobertura de sequências do aminoácido em relação à proteína total identificada; f) Predição de secreção de acordo com Signal P 4,0, o número correspondente para o D-score deve ser igual ou exceder o valor de 0,340 (D-score ≥ 0,340)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) g) Predição de secreção de acordo com Secretome P 2,0, o número correspondente para o SecP- score deve ser igual ou exceder o valor de 0,5 (SecP score ≥0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/). h) Predição de secreção de acordo com NetNglyc 1.0, o número correspondente para o score discriminante deve ser igual ou exceder o valor de 0,5 (score ≥ 0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ ). i) Predição de secreção de acordo com NetOglyc 3.1, o número correspondente para o score discriminante deve ser igual ou exceder o valor 0,5 (score ≥ 0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ ). j) Predição de secreção de acordo com big-PI, sendo consideradas preditas aquelas que apresentarem uma região C-terminal positiva para modificações por âncora de GPI
(http://mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html).
71
71
Tabela 5. Proteínas identificadas na fração álcali sensível tratadas com NaOH 30mM e N-glicosidase F de Paracoccidioides sp. expressas
na fase de micélio
Número de
acessoa
Descrição b Score
Proteínac
Número de
peptídeos
encontradosd
Cobertura
de
sequencia
(%)e
Signal P
Score
≥0,34f
Secretome
P
Score ≥0,5g
NetNglyc
Score
≥0.5h
NetOglyc
Score
≥0.5 i
Big-PI j
RESPOSTA AO ESTRESSE
PAAG_05142 Proteína de choque
térmico mitocondrial 10
kDa
351,6537 3 31,07 -
-
- - -
PAAG_08003
HSP70 249,2091 10 19,27 - - 1 sítio 3 sítios -
PAAG_08059
Proteína de choque
térmico
276,3557 7 16,39 - - 1 sítio 14 sítios -
PAAG_01339
Proteína de choque
térmico SSC1
518,575 12 16,76 - - 1 sítio 18 sítios -
PAAG_07775
Proteína de choque
térmico SSB1
193,2841 11
16,85 - 0,8618
- 4 sítios -
METABOLISMO E ENERGIA
PAAG_08468
Gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase
325,2322 8 27,51 - 0,9120
1 sítio 1 sítio -
PAAG_05249
Aldeído desidrogenase
1258,311
14
35,48
- - 2 sítios 3 sítios -
PAAG_07246
Citocromo-c oxidase,
cadeia VI
350,2753
3
39,18
- - - 15 sítios -
72
72
PAAG_04820
ATPase, subunidade alfa 466,5501 7 17,63 - - - 6 sítios -
PAAG_08037
ATP sintase, subunidade
beta
996,9396 9 27,68 - - 1 sítio 10 sítios -
TRANSPORTE
PAAG_07564
Porina da membrana
externa da mitocôndria
1312,075 6 17,96 - 0,9516 - - -
PAAG_04651
Proteína nuclear de
ligação ao GTP GSP1
Ran
699,5951
3 21,4 - - 1 sítio - -
PAAG_08620
Proteína transportadora
de ADP/ ATP
534,660 6 24,6 - - - - -
SÍNTESE PROTEICA
PAAG_04425
Proteína ribossomal L22
60S
710,4438 3 31,15 - 0,5649
- 2 sítios -
PAAG_03827
Proteína ribossomal L21
A 60S
318,0048
3
13,13
1 sítio 7 sítios -
PAAG_02024
Fator de elongação 1 alfa 375,1037 4 16,96 -
0,6836 2 sítios 2 sítios -
PAAG_04089
Proteína principal dos
corpos de woronin
957,3892
8
43,98
- - - 3 sítios -
PAAG_03828
Proteína ribossomal S9
40S
889,7404
7 37,17
- - - 7 sítios -
PAAG_04965
Proteína ribossomal L31
60S
831,8064
4 33,33
- 0,5706 1 sítio 5 sítios -
73
73
PAAG_05484
Proteína ribossomal S5
40S
747,7584
7 30,84 - - - 2 sítios -
PAAG_08888
Proteína ribossomal L4 A
60 S
708,372
11 35,22 - 0.9204 - 19 sítios -
PAAG_01785
Proteína ribossomal S3
40S
553,8762
8 28,89 - - - 4 sítios -
PAAG_00689
RNA helicase eIF4A
dependente de ATP
502,128 10 22,36 - - - 2 sítios -
PAAG_03816
Proteína ribossomal S4
40S
460,554 8 30,53 - - 1 sítio 3 sítios -
PAAG_00952
Proteína ribossomal L20
60S
361,343 2 12,07 - - - 2 sítios -
PAAG_05379
Proteína ribossomal L17
60S
314,9333
3 22,28 - 0,8477 - 6 sítios -
PAAG_00594
Fator de elongação 2 197,505
11 16,85 - - - 5 sítios -
HISTONA
PAAG_08918
Histona H2B L4 399,7065 2 14,18 - 0,6514
- 4 sítios -
PAAG_08917
Histona H2a
3962,407
2
28,15
- 0,5473 - 12 sítios -
PAAG_07099
Histona H3 3 480,677
2
11,76 - 0,6000
- 7 sítios -
TRANSCRIÇÃO
74
74
PAAG_04814
Proteína de ligação ao
ácido nucleico
395,3721 4 14,65 - 0,9505 1 sítio 21 sítios -
CICLO CELULAR E PROCESSAMENTO DE DNA
PAAG_04458
Proibitina 1 211,9912 8 7,5 0,426
- 2 sítios 1 sítio -
COMUNICAÇÃO CELULAR
PAAG_07634
RhoA GTPase,
subunidade menor
1239,854 5 21,47 - - - 4 sítios -
A,b) Número de acesso/descrição da proteína de acordo com o banco de dados do P.brasiliensis;
(http://www,broadinstitute,org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiHome,html) c) Score da Proteína d) Número de peptídeos encontrados (MS/MS)- número de peptídeos correspondente às massas da proteína encontrada; e) Cobertura de sequência- porcentagem de cobertura de sequências do aminoácido em relação à proteína total identificada; f) Predição de secreção de acordo com Signal P 4,0 servidor, o número correspondente para o D-score deve ser igual ou exceder o valor de 0,340 (D-score ≥ 0,340)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/); g) Predição de secreção de acordo com Secretome P 2,0 servidor, o número correspondente para o SecP- score deve ser igual ou exceder o valor de 0,5 (SecP score≥0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/); h) Predição de secreção de acordo com NetNglyc 1.0, o número correspondente para o score discriminante deve ser igual ou exceder o valor de 0,5 (score ≥ 0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ ); i) Predição de secreção de acordo com NetOglyc 3.1, o número correspondente para o score discriminante deve ser igual ou exceder o valor 0,5 (score ≥ 0,50)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ ); j) Predição de secreção de acordo com big-PI, sendo consideradas preditas aquelas que apresentarem uma região C-terminal positiva para modificações por âncora de GPI
(http://mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html)
75
75
7. CONCLUSÃO
Paracoccidioides sp. apresenta diversas proteínas retidas por diferentes
ligações a parede celular expressas na fase de micélio e levedura. Devido o número
reduzido de proteínas identificadas na fase de micélio, não foi possível ainda realizar
uma análise comparativa entre as duas fases de Paracoccidioides sp. Com esse intuito
técnicas para otimizar a extração de proteínas da parede de micélio têm sido buscadas.
Foi possível detectar-se uma proteína ancorada a GPI na fração 2 sugerindo que essa
possa ser retida por uma ligação álcali sensível entre os polímeros da parede de
levedura. Além disso, várias proteínas com conhecidas funções intracelulares foram
detectadas em todas as frações, estando de acordo com vários estudos que tem
localizado essas proteínas na parede celular. Este é um trabalho inicial que pode vir
contribuir para o conhecimento sobre a relação patógeno-hospedeiro, ampliando o
entendimento do desenvolvimento da PCM.
76
76
8. REFERÊNCIAS
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