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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DA
RELAÇÃO PARASITO-HOSPEDEIRO
BRUNNO CÂMARA LOPES COSTA
Pesquisa de bocavírus humano em pacientes submetidos a
transplante alogênico de células progenitoras hematopoiéticas
Goiânia
2018
i
BRUNNO CÂMARA LOPES COSTA
Pesquisa de bocavírus humano em pacientes submetidos a
transplante alogênico de células progenitoras hematopoiéticas
Dissertação de Mestrado apresentado ao
Programa de Pós-Graduação em Biologia da
Relação Parasito-Hospedeiro da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do Título de
Mestre.
Orientadora: Menira Borges de Lima Dias e
Souza
Goiânia
2018
ii
iii
iv
“Aquele que não luta para ter o futuro
que quer, deve aceitar o futuro que vier.”
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por me possibilitar a conclusão de mais esta
etapa da minha vida, por me dar saúde e sabedoria em todos os momentos difíceis.
Aos meus pais, Leane Câmara e Lucinei Lopes, por todo o amor, carinho e apoio
em tudo que faço, e também aos meus irmãos, Tiago, Isabella e João Augusto.
À minha esposa, Me. Carolina Nobre, por todo amor e pelos momentos
maravilhosos que vivemos juntos, e todo apoio e compreensão durante toda a realização
desse trabalho.
À minha orientadora, Profª. Drª Menira Souza, por ter me acolhido como seu
orientando e me conduzido para que eu pudesse me tornar ainda melhor. Sem sua ajuda,
conhecimento, amizade e compreensão a realização deste trabalho não seria possível.
À minha banca de qualificação, Profª. Drª. Fabíola Souza Fiaccadori, Profª. Drª.
Keila Correia de Alcântara e Dr. Hugo Delleon da Silva, por todas as contribuições e
sugestões para o aprimoramento do trabalho.
Aos meus companheiros que fazem ou fizeram parte do Laboratório de
Virologia Humana, Nathânia, Thaís, Raíssa, Thairiny, Terezinha, Tâmera, Amanda,
Déborah, Gabriela, Izabela, João Paulo Gomes, João Paulo, Lucélia, Paulo Henrique e
Pedro, pela amizade, companheirismo e experiências compartilhadas.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro
(PPGBRPH), pela oportunidade.
vi
SUMÁRIO
TABELAS, FIGURAS, QUADROS, APÊNDICES E ANEXOS ............................. vii
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS............................................................. viii
RESUMO ......................................................................................................................... x
ABSTRACT ................................................................................................................... xi
1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA ................................................ 12
1.1. Histórico ................................................................................................................ 12
1.2. Propriedades Gerais dos HBoVs ........................................................................... 14
1.2.1. Taxonomia e classificação .................................................................................. 14
1.2.2. Estrutura, organização genômica e proteínas ..................................................... 14
1.2.3. Replicação ........................................................................................................... 17
1.2.4. Patogenia dos HBoVs e manifestações clínicas ................................................. 19
1.3. Diagnóstico Laboratorial ....................................................................................... 21
1.4. Epidemiologia ....................................................................................................... 23
1.5. HBoVs em Pacientes Imunocomprometidos ........................................................ 24
2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 27
3. OBJETIVOS ............................................................................................................. 28
3.1. Objetivo Geral ....................................................................................................... 28
3.2. Objetivos Específicos ............................................................................................ 28
4. MÉTODOS ............................................................................................................... 29
4.1. Local e População de Estudo ................................................................................ 29
4.2. Delineamento do Estudo ....................................................................................... 30
4.3. Preparo das Amostras Clínicas e Extração do DNA Viral .................................... 31
4.4. Pesquisa de HBoV por qPCR e Determinação da Carga Viral ............................. 32
4.4.1. PCR para obtenção do fragmento utilizado para a construção do plasmídeo
recombinante ............................................................................................................................ 32
4.4.2. Reação de ligação ....................................................................................................... 33
4.4.3. Preparação de células bacterianas competentes para transformação..................... 33
4.4.4. Transformação de E. coli por eletroporação ............................................................ 34
4.4.5. Extração de DNA plasmidial em pequena escala (mini-prep) ............................... 34
4.4.6. Digestão do plasmídeo com endonuclease EcoRI para verificação da presença do
inserto ...................................................................................................................................... 35
4.4.7. Padronização da curva padrão da qPCR TaqMan® para HBoV ........................... 35
4.4.8. Determinação da carga viral por qPCR TaqMan® para HBoV ............................ 37
4.5. Sequenciamento Genômico e Análise Filogenética das Amostras Positivas para
HBoV .............................................................................................................................. 37
4.6. Análises Estatística dos Dados Obtidos ................................................................ 39
5. RESULTADOS ........................................................................................................ 40
6. DISCUSSÃO ............................................................................................................. 46
7. CONCLUSÕES ........................................................................................................ 50
REFERÊNCIAS............................................................................................................ 51
APÊNDICES ................................................................................................................. 62
ANEXOS........................................................................................................................ 65
vii
TABELAS, FIGURAS, QUADROS, APÊNDICES E ANEXOS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Pico de carga viral nas amostras dos pacientes positivos para HBoV ........... 42
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura dos HBoVs ..................................................................................... 15
Figura 2. Representação esquemática do genoma do gênero Bocaparvovirus. ............ 15
Figura 3. Representação esquemática do modelo de replicação rolling hairpin utilizado
pelos parvovírus. ............................................................................................................. 17
Figura 4. Representação esquemática do modelo de replicação rolling circle proposto
para os HBoVs ................................................................................................................ 18
Figura 5. Representação esquemática da Unidade de Transplante de Medula Óssea do
HAJ/ACCGO .................................................................................................................. 29
Figura 6. Gel de agarose do produto de PCR da amostra positiva para HBoV utilizada
na clonagem dos plasmídeos .......................................................................................... 33
Figura 7. Gel de agarose do produto da digestão do plasmídeo com a enzima EcoRI
para verificar a presença de plasmídeos com inserto ..................................................... 35
Figura 8. Curva padrão da qPCR TaqMan® para HBoV .............................................. 36
Figura 9. Frequência das desordens hematológicas apresentadas pelos pacientes ........ 40
Figura 10. Distribuição das cargas de HBoV nas amostras de fezes e soro .................. 41
Figura 11. Comparação das cargas virais antes e após o TACPH................................. 42
Figura 12. Dinâmica da detecção de HBoV em relação ao tempo após o TACPH e à
carga viral nas amostras fecais e séricas ......................................................................... 44
Figura 13. Análise filogenética da sequência parcial da região genômica VP1/VP2 de
HBoV em amostras fecais de pacientes submetidos ao TACPH .................................... 45
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Protocolos terapêuticos de condicionamento utilizados nos pacientes ........ 30
Quadro 2. Iniciadores e sondas utilizados na qPCR TaqMan® para HBoV. ................ 37
Quadro 3. Iniciadores utilizados no sequenciamento genômico. .................................. 38
LISTA DE APÊNDICES E ANEXOS
Apêndice 1. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. ......................................... 62
Apêndice 2. Ficha de investigação clínica de doença diarreica. .................................... 64
Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFG...........................................65
Anexo 2. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do HAJ/ACCGO. .......................... 69
viii
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
ACCGO Associação de Combate ao Câncer em Goiás
AM Aplasia medular
BPV Parvovírus bovino
CAAE Certificado de Apresentação para Apreciação Ética
CnMV Vírus minuto canino
Ct Threshold cycle
DECH Doença do enxerto contra o hospedeiro
DPT Dias após o transplante
EBV Vírus Epstein-Barr
FAM 6-carboxifluoresceína
HAJ Hospital Araújo Jorge
HBoV Bocavírus humano
HIV Vírus da imunodeficiência humana
HPN Hemoglobinúria paroxística noturna
HSV Vírus herpes simplex
Ig Imunoglobulina
IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
LabVICC Laboratório de Virologia e Cultivo Celular
LLA Leucemia linfoide aguda
LMA Leucemia mieloide aguda
LMC Leucemia mieloide crônica
LNH Linfoma Não-Hodgkin
MFP Mielofibrose primária
mRNA Ácido ribonucleico mensageiro
NCBID National Center for Biotechnology Information Database
NP Nuclear phosphoprotein (fosfoproteína nuclear)
NS Non-structural protein (proteína não estrutural)
nt Nucleotídeos
ORF Open reading frame (região de leitura aberta)
Ori Origem de replicação
pb Pares de bases
PBS Phosphate buffered saline (tampão salina fosfato)
PCR Polymerase chain reaction (Reação em cadeia pela polimerase)
qPCR PCR em tempo real quantitativa
RT-qPCR PCR em tempo real quantitativa após transcrição reversa
SDS Sodium dodecyl sulfate (Dodecil sulfato de sódio)
SIDA Síndrome da imunodeficiência adquirida
SMD Síndrome mielodisplásica
ix
SOB Super Optimal Broth
SOC Super Optimal Broth with Catabolite repression
ssDNA Ácido desoxirribonucleico de fita simples linear
TACPH Transplante alogênico de células progenitoras hematopoiéticas
TAMRA Tetrametilrodamina
TBE TRIS/Borato/EDTA
TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido
TCPH Transplante de células progenitoras hematopoiéticas
TRIS Hidroxi-Metil-Aminocetano
VLP Virus like particle (partícula semelhante a vírus)
VP Viral protein (proteína do capsídeo viral)
VZV Vírus da varicela zoster
x
RESUMO
Os Bocavírus humanos (HBoVs) pertencem à família Parvoviridae e têm sido
associados a sintomas respiratórios e gastroentéricos. As infecções virais são uma
importante causa de morbimortalidade em pacientes imunocomprometidos, como os
pacientes submetidos a transplante alogênico de células progenitoras hematopoiéticas
(TACPH). Dados sobre a ocorrência de HBoV nesses pacientes ainda são escassos. Os
objetivos deste estudo foram avaliar a frequência e a carga de HBoVs em amostras
clínicas (fezes e soro) de pacientes submetidos a TACPH e avaliar as características
gerais e sintomas apresentados, e caracterizar as amostras positivas. Foram incluídos no
estudo 21 pacientes consecutivos, dos quais foram coletadas 105 amostras fecais e 145
amostras de soro, em um centro de transplante de medula óssea em Goiânia, Goiás,
durante o período de outubro de 2012 a outubro de 2014. As amostras foram testadas
por qPCR TaqMan®, com sonda e iniciadores específicos para todos os genótipos de
HBoVs (HBoV-1 a -4), e a carga viral nas amostras foi determinada pela construção de
uma curva padrão de diluições seriadas de um plasmídeo recombinante, contendo como
inserto a região NP1. Os resultados mostraram que 53,4% (11/21) dos pacientes eram
do sexo masculino, com idade entre quatro e 61 anos de idade (mediana 35 anos). A
neoplasia hematológica mais observada foi a leucemia mieloide (aguda e crônica),
totalizando 57,1% (12/21) dos casos. Os HBoVs foram detectados em 42,9% (9/21) dos
pacientes, sendo que em 77,7% (7/9) desses houve positividade em ambas amostras de
soro e fezes. A carga de HBoV nas amostras fecais foi significativamente maior do que
nas amostras séricas, sendo observado dois padrões principais de excreção nas fezes, um
intermitente e outro contínuo. Dos nove pacientes, seis (66,6%) tiveram a primeira
amostra positiva antes de serem submetidos ao transplante, sendo observado aumento
nas cargas de HBoV pós-TACPH em comparação às cargas pré-TACPH e, na maioria
dos casos, os picos da carga viral foram detectados durante os 100 primeiros dias após o
TACPH. Considerando os sintomas apresentados pelos pacientes, 66,6% (6/9) desses
apresentavam diarreia no mesmo período da detecção de HBoV nas amostras fecais,
porém não houve significância estatística entre a positividade e os sintomas
gastroentéricos. Três amostras fecais foram caracterizadas como sendo o genótipo
HBoV-1, com mais de 99% de identidade nucleotídica entre elas. Os dados
apresentados mostram uma alta ocorrência e elevada carga de HBoVs nos pacientes
submetidos ao TACPH, além de detecção inicial nas fezes com posterior positividade
no soro. Esses resultados sugerem que as fezes poderiam ser a amostra clínica de
escolha para o monitoramento desses pacientes, tanto antes quanto após o transplante.
Palavras-chave: Bocavírus humano; Transplante alogênico de células progenitoras
hematopoiéticas; Pacientes imunocomprometidos.
xi
ABSTRACT
Human Bocavirus (HBoVs) are classified in the Parvoviridae family and are associated
with respiratory and gastrointestinal symptoms. Viral infections are an important cause
of morbimortality in immunocompromised patients such as allogeneic hematopoietic
stem cell transplantation (allo-HSCT) recipients. The aim of the present study was to
evaluate the positivity rate and loads of HBoVs in clinical samples (feces and sera) of
patients who were subjected to allo-HSCT at a reference center for bone marrow
transplantation in Goiânia, Goiás. A total of 105 fecal samples and 145 sera samples
were collected from 21 consecutive patients, during October 2012 to October 2014.
Samples were screened by qPCR TaqMan assay, with specific probe and primers
targeting all HBoVs genotypes (HBoV-1 to -4), and viral loads were determined using
serial dilutions of a recombinant plasmid, targeting the NP1 gene. The results showed
that 53.4% (11/21) of the patients were male, aged between four and 61 years-old (mean
35 years). The most observed hematologic malignancy was myeloid leukemia (acute or
chronic), accounting for 57.1% (12/21) of the cases. The HBoVs were detected in
42.9% (9/21) of the patients and 77.7% (7/9) were positive in both fecal and serum
samples. The viral load in fecal samples were higher than in the sera samples and a
prolonged fecal shedding were observed, with two patterns: one intermittent and
another continuous. Of all HBoV positive patients, six (66.6%) had the first positive
sample before the transplantation, and a rise of the viral loads after the allo-HSCT
occurred when comparing to the loads before the allo-HSCT. Furthermore, on most
cases the highest viral loads were detected during the first 100 days after the allo-HSCT.
Considering the symptoms presented by the patients, 66.6% (6/9) had diarrhea at the
same period of the viral genome detection in feces, but no statistical significance was
observed. Three fecal samples were characterized as being HBoV-1, with more than
99% of nucleotide identity among them. The present data shows a high occurrence and
loads of HBoVs in allo-HSCT recipients, with first positivity in fecal samples and later
viral detection in sera. These results suggest that fecal samples could be the sample of
choice in HBoV monitoring of these patients both before and after the transplant.
Keywords: Human bocavirus; Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation;
Immunocompromised patients.
12
1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA
1.1. Histórico
As infecções virais do trato respiratório e do trato gastrointestinal (TGI)
destacam-se dentre as doenças humanas mais comuns com importância clínica e
epidemiológica, acometendo principalmente crianças. Essas infecções são ainda
associadas a elevados índices de morbimortalidade em grupos de risco como menores
de cinco anos de idade, pacientes imunocomprometidos e idosos (Dennehy 2011, Berry
et al. 2015). Dentre os agentes associados às infecções gastroentéricas, destacam-se os
vírus, tais como os rotavírus, calicivírus, adenovírus humanos (HAdV), astrovírus e
bocavírus humanos (HBoV), dentre outros (Sidoti et al. 2015). As infecções do trato
respiratório são causadas principalmente por bactérias e vírus. Dentre os agentes virais
estão os rinovírus, enterovírus, HAdV, vírus parainfluenza, vírus influenza, coronavírus,
vírus respiratório sincicial e bocavírus humanos (Berry et al. 2015).
Em 2005, Allander e colaboradores utilizaram a metagenômica para pesquisar a
presença de novos vírus humanos em amostras de aspirados nasofaríngeos provenientes
de pacientes com infecção do trato respiratório inferior. Após análises de
bioinformática, sequências de nucleotídeos inéditas, similares a de parvovírus, foram
encontradas. Tais sequências apresentaram semelhanças com os genomas dos vírus
minuto canino (CnMV) e parvovírus bovino (BPV), dois membros da família
Parvoviridae, subfamília Parvovirinae e gênero Bocaparvovirus. Sendo assim, o vírus
recém descoberto foi denominado bocavírus humano (Allander et al. 2005).
Em 2009, um outro bocavírus humano foi descoberto por dois grupos
independentes de pesquisadores utilizando sequenciamento pelo método de Sanger para
triagem de amostras fecais de pacientes com gastroenterite aguda e paralisia flácida
aguda (Arthur et al. 2009, Kapoor et al. 2009).
O estudo de Kapoor et al. (2009) revelou que o genoma dessa nova variante
possuía organização genômica análoga à do HBoV-1. As proteínas não estruturais (NS1
e NP1) e estruturais (VP1/VP2), codificadas pelo novo genótipo, denominado bocavírus
humano 2 (HBoV-2), apresentaram 78% de similaridade com a proteína NS1, 67% com
a NP1 e 80% com as proteínas VP1/VP2 do HBoV-1, respectivamente. Arthur et al.
(2009) também reportaram a descoberta desse mesmo genótipo de bocavírus humano, e
13
o alinhamento das sequências nucleotídicas do genoma dos HBoV-1 e HBoV-2 revelou
similaridade maior que 99,7%.
Adicionalmente, enquanto analisavam a frequência de HBoV-2 em crianças com
gastroenterite aguda, Arthur e colaboradores descobriram um terceiro genótipo de
bocavírus humano, sendo esse designado bocavírus humano 3 (HBoV-3). A análise
genômica evidenciou homologia de 91% e 83% com o HBoV-1 nas regiões codificantes
para as proteínas NS1 e NP1, respectivamente. No entanto, o HBoV-3 possuiu maior
similaridade (90%) com o HBoV-2 na região codificante para as proteínas VP1/VP2.
Foi ainda observada uma divergência de 18% entre o genoma de HBoV-3 e o genoma
dos genótipos HBoV-1 e HBoV-2 (Arthur et al. 2009).
Kapoor et al. (2010) utilizaram pares de iniciadores específicos para a região
parcial VP1/VP2 do genoma dos bocavírus humanos descritos até aquele momento
(panbocavírus) e analisaram amostras fecais provenientes da Nigéria, Tunísia, Estados
Unidos e Nepal. Foi detectada a presença dos três genótipos, além de mais um novo
genótipo, denominado bocavírus humano 4 (HBoV-4), que apresentou em média 22,3%
de divergência do HBoV-1 na região codificante para a proteína VP1, 12,3% do HBoV-
2 e 11,9% do HBoV-3.
No Brasil, o HBoV foi detectado pela primeira vez em 2007 por PCR
convencional, tendo como alvo o gene NS1, a partir de amostras fecais de crianças que
apresentavam quadro de diarreia aguda. Foram analisadas 705 amostras e o DNA viral
foi detectado em 2,0% dessas (Albuquerque et al. 2007).
Inicialmente, os HBoVs foram associados a infecções do trato respiratório. A
detecção de HBoVs em amostras fecais (Vicente et al. 2007), evidenciou-se a excreção
viral nas fezes, o que sugeria que os HBoVs poderiam ser também patógenos entéricos.
Atualmente, o HBoV-1 tem sido considerado a principal variante relacionada com
doenças respiratórias, e os genótipos HBoV-2, HBoV-3 e HBoV-4 têm sido associados
à presença nas fezes de pessoas com ou sem sintomas gastroentéricos (Qiu et al. 2017).
Porém, mais estudos são necessários para confirmar essa associação dos HBoVs com as
manifestações clínicas em diferentes grupos populacionais, como crianças, idosos e
imunocomprometidos.
14
1.2. Propriedades Gerais dos HBoVs
1.2.1. Taxonomia e classificação
Os bocavírus humanos são classificados na família Parvoviridae, que é
subdividida em duas subfamílias. A subfamília Densovirinae, que inclui vírus que
infectam artrópodes, é composta pelos gêneros Ambidensovirus, Brevidensovirus,
Hepandensovirus, Iteradensovirus e Penstyldensovirus. A subfamília Parvovirinae,
definida pela habilidade de seus membros infectarem hospedeiros vertebrados, é
composta pelos gêneros Amdoparvovirus, Aveparvovirus, Bocaparvovirus,
Copiparvovirus, Dependoparvovirus, Eritroparvovirus, Protoparvovirus e
Tetraparvovirus. O gênero Bocaparvovirus, anteriormente denominado Bocavirus,
atualmente é formado por 12 espécies, sendo que os genótipos HBoV-1 e HBoV-3
pertencem à espécie Bocaparvovirus primata 1, e os genótipos HBoV-2 e HBoV-4
estão incluídos na espécie Bocaparvovirus primata 2 (King et al. 2012, Babkin et al.
2015, Wang et al. 2016, ICTV 2017).
1.2.2. Estrutura, organização genômica e proteínas
Assim como outros membros da subfamília Parvovirinae, as partículas de HBoV
não apresentam envelope e têm diâmetro de aproximadamente 25 nanômetros (Figura
1). O capsídeo tem simetria icosaédrica e é composto por 12 capsômeros pentaméricos,
resultante da combinação de 60 cópias de cada uma das proteínas do capsídeo viral
(viral protein – VPs) (Chow & Esper 2009, Gurda et al. 2010).
O genoma do HBoV consiste de uma molécula de ácido desoxirribonucleico de
fita simples linear (ssDNA), sendo que a maioria (95%) das moléculas encapsidadas
apresenta polaridade negativa. Possui aproximadamente 5300 pares de bases (pb) e
contém três regiões de leitura aberta (open reading frames, ORFs) (Allander et al.
2005). O genoma dos parvovírus é flanqueado por pequenas sequências palindrômicas,
não codificantes, que formam estruturas secundárias semelhantes a “grampos” (do
inglês, hairpin) (Cotmore & Tattersall 2014).
15
Figura 1. Estrutura dos HBoVs. (A) Micrografia eletrônica das partículas de HBoV. A barra representa
100 nm. Adaptado de Santos et al. (2010). (B) Representação esquemática da partícula de HBoV.
Adaptado de Zou et al. (2016).
Os HBoVs são vírus heteroteloméricos, significando que as suas sequências
terminais, direita e esquerda, são diferentes. Na extremidade esquerda do genoma de
polaridade negativa, os HBoVs possuem uma sequência palindrômica imperfeita,
composta por 140 nucleotídeos (nt); na direita, uma sequência palindrômica perfeita de
200 nt (Figura 2) (Huang et al. 2012).
A expressão gênica dos membros do gênero Bocaparvovirus apresenta algumas
características que os distinguem de outros parvovírus. Eles utilizam um único
promotor, P5 nos HBoVs, para a transcrição de um pré-RNA mensageiro (pré-mRNA),
que, após poliadenilação e splicing alternativo, dá origem a vários mRNA maduros que
irão ser codificados em proteínas estruturais e não estruturais (NS). Além disso,
possuem em seu genoma uma ORF adicional localizada entre as regiões que codificam
para proteínas estruturais e não estruturais (Chen et al. 2010).
Figura 2. Representação esquemática do genoma (polaridade negativa) do gênero Bocaparvovirus. NS1,
proteína não estrutural 1. NP1, fosfoproteína nuclear 1. VP, proteína do capsídeo viral. Adaptado de
Cotmore & Tattersall (2014) e Qiu et al. (2017).
16
Nos HBoVs, a primeira ORF, localizada na extremidade 3’ (esquerda), codifica
para as proteínas NS1, NS1-70, NS2, NS3 e NS4. A segunda ORF codifica para uma
pequena fosfoproteína nuclear, NP1. A terceira ORF, na extremidade 5’ (direita),
codifica as proteínas estruturais do capsídeo viral, VP1 e VP2, produzidas a partir do
mesmo transcrito (Shen et al. 2015).
Com relação às proteína virais, assim como nos demais parvovírus, a NS1 do
HBoV possui aproximadamente 100 quilodaltons (kDa), sendo esta uma proteína com
múltiplos domínios que dá início à replicação do genoma por meio do reconhecimento e
ligação à origem de replicação (Ori) do DNA viral e que também possui atividade de
endonuclease. A proteína NS1-70, isoforma da NS1, tem 70 kDa (Chen et al. 2010,
Tewary et al. 2013). Tanto a NS1 quando a NS1-70 são antagonistas de Fator Nuclear
kappa B (NF-kB), um fator de transcrição importante para a defesa antiviral por meio da
ativação de diversos processos fisiológicos. Essas proteínas bloqueiam a ativação de
NF-kB em resposta ao Fator de Necrose Tumoral α (TNF-α) produzido durante a
infecção viral, tendo um potencial papel na evasão do HBoV da resposta imune inata
(Liu et al. 2016).
Adicionalmente, o HBoV expressa pequenas proteínas NS auxiliares, NS2, NS3
e NS4, com peso molecular de 66, 69 e 34 kDa, respectivamente. Mas, apesar de
possuírem domínios funcionais homólogos aos da proteína NS1, em culturas de células
embrionárias renais humanas não são essenciais à replicação viral. Contudo, a NS2 foi
considerada importante para a replicação viral durante a infecção de células polarizadas
do epitélio respiratório humano, possuindo domínios funcionais para ligação à Ori, de
endonuclease e de transativação (Shen et al. 2015).
A proteína NP1, exclusiva do gênero Bocaparvovírus, com 25 kDa, bloqueia a
produção de interferon, induz a parada do ciclo celular e a apoptose celular em células
HeLa (Broccolo et al. 2015). Após sua produção, a NP1 é importada para o núcleo
celular por meio de importinas α/β1 celulares, sendo importante na expressão das
proteínas do capsídeo do HBoV, tendo ainda função essencial para uma eficiente
replicação do DNA viral (Li et al. 2013, Zou et al. 2016).
As proteínas VP1 e VP2, de aproximadamente 74 e 64 kDa, respectivamente,
formam o capsídeo icosaédrico do HBoV. Elas ligam-se aos receptores celulares e, após
a entrada na célula hospedeira, se deslocam para o núcleo juntamente com o genoma
viral. As proteínas VP1 e VP2 possuem a mesma sequência de aminoácidos na região
C-terminal, porém a região N-terminal da VP1 possui um peptídeo adicional com
17
atividade enzimática de fosfolipase A2 (PLA2), localizado na região única da VP1
(VP1u), cuja função é a hidrólise de fosfolipídeos, evento crítico para a saída do vírus
do endossomo e transferência para o núcleo celular para iniciar a replicação do genoma
viral. Ao contrário de outros parvovírus, a proteína VP2 dos HBoVs desencadeia uma
resposta imune humoral superior àquela induzida por VP1u, sendo importante para a
produção de anticorpos neutralizantes (Qu et al. 2008, Deng et al. 2014).
1.2.3. Modelos de replicação propostos para os parvovírus
A replicação dos HBoVs ainda não está totalmente elucidada, existindo dois
modelos propostos: o mecanismo de rolling hairpin (Huang et al. 2012) e o de rolling
circle (Lusebrink et al. 2011). Na replicação pelo mecanismo de rolling hairpin, há
formação de uma dupla fita do genoma viral que serve como molde para a expressão de
NS1, importante em todas as etapas seguintes da replicação. Após, há formação de uma
longa cadeia de DNA contendo múltiplas cópias do DNA genômico ligadas em
sequência (concatâmeros intermediários). Esses concatâmeros são ligados por junções
cabeça-cabeça ou cauda-cauda, uma característica importante deste tipo de replicação.
Posteriormente, os concatâmeros são clivados na etapa de empacotamento do genoma
viral (Figura 3) (Cotmore & Tattersall 2014).
Figura 3. Representação esquemática do modelo de replicação rolling hairpin utilizado pelos parvovírus.
Em cinza escuro está representado o genoma viral original, em cinza claro os novos genomas e em preto o
DNA recém sintetizado. A esfera cinza representa a proteína viral NS1. A extremidade 3’ está
representada pela seta. As letras E e D representam as sequências terminais palindrômicas esquerda e
direita, respectivamente. As letras em minúsculo indicam as sequências complementares invertidas do
genoma original. Adaptado de Martin et al. (2011) e Cotmore & Tattersall (2014).
18
Estudos que tentaram detectar as junções cabeça-cabeça e cauda-cauda nos
HBoVs, que confirmaria o modelo de rolling hairpin, não obtiveram sucesso, e a
presença de concatâmeros intermediários ainda não foi evidenciada para esses vírus
(Babkin et al. 2015).
Além disso, novos dados apontam que durante a infecção os HBoVs persistem
nas células do hospedeiro por meio da formação de um genoma circular fechado
extracromossômico (epissoma). Esses epissomas já foram detectados em células
infectadas pelos quatro genótipos de HBoVs (Kapoor et al. 2011, Lusebrink et al. 2011,
Zhao et al. 2012, Babkin et al. 2015).
Em conjunto, essas evidências levaram à hipótese de que os HBoVs possam
replicar seu genoma pelo mecanismo de rolling circle. Nesse tipo de replicação, as
novas fitas de DNA polaridade negativa são originadas a partir de uma fita polaridade
positiva, circularizada por um mecanismo ainda não totalmente elucidado, gerando
longos concatâmeros lineares ligados por sequências de junção cabeça-cauda (Figura 4).
Fortalecendo tal hipótese, foram detectadas em todos os genótipos de HBoVs
sequências de junção cabeça-cauda, formas replicativas intermediárias encontradas
quando o DNA viral está na forma circular (Guido et al. 2016).
Figura 4. Representação esquemática do modelo de replicação rolling circle proposto para os HBoVs. As
novas fitas de DNA polaridade negativa são originadas a partir de uma fita polaridade positiva,
circularizada por um mecanismo ainda não elucidado, gerando longos concatâmeros lineares ligados por
sequências de junção cabeça-cauda; nt: nucleotídeos. Adaptado de Schildgen et al. (2012).
Como o modelo de replicação citado não está ainda estabelecido para os
parvovírus, tem-se questionado se os HBoVs possuem um mecanismo que difere dos
19
outros parvovírus, e se estes epissomas são produtos formados durante a replicação pelo
mecanismo de rolling hairpin ou se são formas de persistência para a manutenção do
genoma viral nos tecidos (Schildgen et al. 2012, Babkin et al. 2015).
Até o momento, sabe-se que a sequência terminal direita do genoma do HBoV é
importante para a sua replicação. Nessa região, encontra-se a Ori, formada por uma
sequência de 46 nt, que contém elementos de ligação para a NS1 (NS1 binding elements
- NSBEs), compostos por repetições de quatro nt, sendo reconhecidos pelo domínio de
ligação à Ori da proteína NS1. Além disso, está localizado na Ori um sítio de clivagem,
cerca de sete a 17 nt a frente dos NSBEs, que é clivado pela atividade de endonuclease
da NS1 (Shen et al. 2016).
Diferentemente dos demais parvovírus, a replicação do DNA do HBoV-1 não
depende da célula estar na fase S do ciclo celular, uma vez que o vírus infecta e replica-
se em células diferenciadas do epitélio respiratório humano que não estão em divisão.
Sendo assim, acredita-se que os HBoVs utilizem o maquinário de dano e reparo do
DNA da célula infectada, recrutando enzima DNA polimerase para os centros de
replicação do genoma viral (Deng et al. 2017).
1.2.4. Patogenia dos bocavírus humanos e manifestações clínicas
Até o momento, o conhecimento sobre a patogenia dos HBoVs é limitado. Um
possível modelo de patogenia seria análogo ao do CnMV. Esse vírus penetra no
hospedeiro pelas vias respiratórias, atinge a circulação sanguínea e após entra no trato
gastrointestinal, ou pode alcançá-lo diretamente pela ingestão de água e alimentos
contaminados com o mesmo. O vírus pode ser excretado pelo trato respiratório ou pelas
fezes (Schildgen 2013). Os HBoVs já foram detectados em amostras respiratórias, fezes,
soro, saliva, líquido cefalorraquidiano, urina, tonsila e intestino, o que sugere
disseminação viral pelo organismo (Lin et al. 2007, Kantola et al. 2008, Lu et al. 2008,
Martin et al. 2009, Kapoor et al. 2011, Mitui et al. 2012, Mori et al. 2013).
Para tentar elucidar a patogenia dos HBoVs, estudos com culturas de células têm
sido utilizados. Após a inoculação de HBoV-1 em células de adenocarcinoma coloretal
humano (Caco-2), detectou-se o genoma viral na monocamada de células, porém sem
alterações na morfologia e sobrevida das células infectadas. O HBoV-1 também foi
detectado no sobrenadante dos meios de cultura, sendo observado um aumento nas
20
concentrações do DNA viral nas primeiras 48 horas, mostrando um ciclo de
desenvolvimento rápido com excreção de viral (Ghietto et al. 2017).
Em cultura de células de epitélio respiratório humano, a infecção pelo HBoV-1
parece romper a barreira epitelial, causando perda dos cílios no lado apical, hipertrofia
celular e danificando as junções de oclusão. A espessura do epitélio das culturas
infectadas diminuiu gradativamente, indicando que a infecção pelo HBoV-1 possa
destruir as células do epitélio respiratório humano (Dijkman et al. 2009, Huang et al.
2012, Deng et al. 2013).
Em lavados broncoalveolares de pacientes infectados com HBoV-1, foi
demonstrado que há aumento da expressão de citocinas como a quimiocina CC 17
(CCL-17), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento do endotélio
vascular (VEGF), TNF-α e TNF-β, sugerindo que o dano causado na via respiratória
pela infecção possa ser proveniente da indução da expressão de citocinas pelo HBoV-1
(Khalfaoui et al. 2016). Em células epiteliais brônquicas humanas, o HBoV-1 é capaz de
induzir a autofagia e a apoptose, e também inibir a proliferação celular, regulando a
expressão de proteínas como caspase 3, Bcl-2 (linfoma de células B), p53 e Akt
(proteína quinase B) (Deng et al. 2017).
Estudos mostram que o DNA dos HBoVs pode ser detectado no sangue
(viremia) concomitantemente com sua detecção em amostras do trato respiratório na
presença de sintomas respiratórios, indicando uma possível infecção ativa ou recente
(Don et al. 2011). Do mesmo modo, o genoma dos HBoVs já foi detectado
simultaneamente em amostras fecais e séricas de pacientes com sintomas
gastroentéricos e/ou respiratórios (Paloniemi et al. 2014). Sendo assim, a viremia tem
sido considerada um marcador de infecção recente para HBoV (Soderlund-Venermo et
al. 2009). Além disso, o genoma de HBoV foi detectado em níveis baixos (mediana de
7,68 × 10² cópias/mL) em amostras séricas de indivíduos adultos saudáveis, o que pode
indicar uma possível viremia prolongada após uma infecção assintomática (Bonvicini et
al. 2011).
Com relação à excreção de HBoV, foi demonstrado um padrão intermitente e
prolongado, tanto no trato respiratório quando no TGI (Blessing et al. 2009, Schenk et
al. 2011). Em todos, o HBoV-1 foi o genótipo encontrado. Além disso, a detecção viral
recorrente foi documentada, com várias amostras positivas intercaladas com pelo menos
uma amostra negativa. Sugere-se ainda que a detecção viral prolongada possa ser
21
consequência de infecções repetidas ao invés de um único período de excreção
prolongado (Martin et al. 2010, Kapusinszky et al. 2012, Wagner et al. 2016).
As principais síndromes clínicas associadas à infecção por HBoV-1 em crianças
são pneumonia, bronquiolite, resfriado, asma e otite média, cujos sintomas mais
presentes são febre, tosse, rinite, rinorreia e diarreia (Broccolo et al. 2015, Lee et al.
2016, Qiu et al. 2017). Existe ainda, associação entre infecções respiratórias agudas e a
detecção de HBoV-1 como único patógeno presente, juntamente com altas cargas virais
(104 - 108 cópias/mL) em amostras respiratórias e a detecção de imunoglobulina M
(IgM) anti-HBoV. Alguns estudos mostraram uma relação desses achados com maior
gravidade ou duração dos sintomas, enquanto outros não observaram essas diferenças
(Wang et al. 2010, Deng et al. 2012, Nascimento-Carvalho et al. 2012, Zhou et al. 2014,
Ghietto et al. 2015).
Os genótipos HBoV-2, -3 e -4 têm sido associados a quadros de gastroenterite
(Kantola et al. 2010, Santos et al. 2010, Paloniemi et al. 2014). A gastroenterite é
definida como um processo inflamatório no trato gastrointestinal, cujo sintomas incluem
náuseas, vômitos, dor abdominal e diarreia (Graves 2013). Porém, além desses
genótipos, o HBoV-1 também tem sido detectado nas fezes, sugerindo excreção viral
após a replicação inicial no trato respiratório (Zhao et al. 2016).
1.3. Diagnóstico Laboratorial
Atualmente, o diagnóstico dos HBoVs é baseado na pesquisa de regiões parciais
do seu genoma, por métodos moleculares como a PCR, principalmente em amostras de
soro, fezes, nasofaringe e urina, e também na detecção de anticorpos específicos IgM e
IgG por imunoensaios (imunocromatografia e ensaios imunoenzimáticos) (Zaghloul
2011, Jartti et al. 2013, Broccolo et al. 2015).
As técnicas moleculares utilizam iniciadores específicos que têm como alvo
diferentes genes dos HBoVs como NP1, NS1, VP1 e VP2. Dentre esses, NS1 e NP1 são,
preferencialmente, utilizados na detecção dos HBoVs, pois possuem uma sequência
mais conservada entre os genótipos de HBoV. Já o gene que codifica para as proteínas
VP1 e VP2 é o gene de escolha para a caracterização molecular, devido à sua maior
variabilidade dentre os HBoVs (Chieochansin et al. 2007, Lee et al. 2016, Moreno et al.
2016).
22
Mais recentemente, ensaios utilizando a metodologia de PCR em tempo real
quantitativa (qPCR) foram desenvolvidos a fim de detectar os quatro genótipos de
HBoV (Lu et al. 2006, Neske et al. 2007, Kantola et al. 2010, Xu et al. 2011). Esses
testes são sensíveis, específicos e confiáveis para a amplificação do DNA dos HBoVs,
possibilitando também a determinação da carga viral, quando utilizada curva padrão
específica (Neske et al. 2007).
Além disso, foi desenvolvida uma PCR em tempo real pós-transcrição reversa
(RT-qPCR) para a conversão de um RNA mensageiro (mRNA) funcional, específico do
HBoV-1, em DNA complementar e posterior amplificação (Christensen et al. 2013).
Sugere-se que a detecção do mRNA do HBoV-1 seria mais precisa para o diagnóstico
de infecção aguda do trato respiratório do que a detecção do genoma viral, visto que o
DNA do HBoV-1 pode persistir por meses após a resolução da infecção (Martin et al.
2010, Schlaberg et al. 2017).
Ensaios de PCR para detecção de regiões parciais de genomas de mais de um
tipo de vírus, ou mesmo visando a genotipagem de um vírus (Multiplex PCR)
representam a abordagem diagnóstica laboratorial mais atual e complementa a evolução
do diagnóstico das viroses respiratórias (Mahony 2008). Nesse aspecto, alguns sistemas
de multiplex PCR para viroses respiratórias disponíveis comercialmente já incluem a
pesquisa de regiões do genoma que codificam para as proteínas NP1 ou NS1 do HBoV-
1 (Balada-Llasat et al. 2011, Babady et al. 2012, Broccolo et al. 2015, Barratt et al.
2017).
Além da detecção do DNA e mRNA por PCR, é possível identificar anticorpos
específicos IgM e IgG anti-HBoV, por métodos in house, em amostras séricas usando
metodologias como western blot, imunofluorescência e ensaio imunoenzimático,
utilizando virus like particles (VLPs) das proteínas do capsídeo VP1 e VP2, produzidos
em sistemas de expressão de leveduras ou bactérias como antígenos (Endo et al. 2007,
Tamosiunas et al. 2016). Sendo assim, além da viremia detectada por métodos
moleculares, os marcadores sorológicos utilizados para o diagnóstico da infecção aguda
dos HBoVs são a presença de IgM e/ou IgG anti-HBoV, o aumento de pelo menos
quatro vezes nos títulos de IgG anti-HBoV em amostras de soro pareadas e também a
baixa avidez de IgG anti-HBoV no soro de pacientes imunocompetentes (Hedman et al.
2010, Qiu et al. 2017).
23
1.4. Epidemiologia
Em amostras respiratórias, os HBoVs apresentam uma frequência de detecção
que varia entre 0,8 e 24,5%. O HBoV-1 tem sido o genótipo predominantemente
encontrado, sobretudo em amostras clínicas de crianças (Silva et al. 2010, Wang et al.
2010). Apesar disso, todos os quatro genótipos de HBoV já foram detectados em
amostras respiratórias de pacientes com infecção do trato respiratório (Koseki et al.
2012), sendo o HBoV-2 mais frequentemente detectado (Han et al. 2009, Song et al.
2010).
No Brasil, a frequência global de detecção molecular de HBoV varia entre 0,76 e
23% em amostras respiratórias, sendo a região Sudeste a que apresenta o maior número
de estudos com HBoV nesse tipo de amostra. Porém, o vírus já foi detectado em todas
as regiões brasileiras (Silva et al. 2010, Pilger et al. 2011, Sousa 2016, Nascimento-
Carvalho et al. 2018, Silva et al. 2018).
Na região Centro-Oeste do Brasil, poucos estudos avaliaram a presença de
HBoV em amostras respiratórias, cuja positividade variou entre 5,3 e 12,3%. Nesses
estudos, o HBoV foi detectado em amostras do trato respiratório de crianças menores de
seis anos de idade com a presença de sintomas respiratórios e/ou gastroentéricos. Os
genótipos detectados até o momento foram o HBoV-1 e HBoV-3 (Oliveira 2016, Sousa
2016).
Em amostras fecais, a frequência de positividade para HBoV varia entre 0,3 e
42%, por métodos moleculares (Campos et al. 2016, Tymentsev et al. 2016). A
prevalência de HBoV foi de 6,9% em crianças menores de cinco anos com
gastroenterite aguda (De et al. 2017).
Em fezes de pacientes com gastroenterite, o HBoV-2 é o mais frequentemente
detectado (Jin et al. 2011, Zhao et al. 2016). Em seguida, o HBoV-1 é a variante mais
encontrada nas amostras fecais (La Rosa et al. 2016, Zhao et al. 2016). O terceiro
genótipo mais detectado nesse espécime clínico é o HBoV-3 (Paloniemi et al. 2014,
Zhao et al. 2016), sendo que o genótipo HBoV-4 é raramente detectado (Ong et al.
2016, Qiu et al. 2017). Ademais, observa-se uma elevada frequência de co-detecção de
HBoV com outros vírus gastroentéricos, variando de 20 a 81% em amostras fecais,
sendo que o agente viral mais frequentemente detectado em conjunto com o HBoV é o
rotavírus, seguido de norovírus (NoV) (Ong et al. 2016).
24
No Brasil, a frequência global de detecção molecular de HBoV varia entre 2,0 e
42% em amostras fecais (Albuquerque et al. 2007, Sampaio 2014, Campos et al. 2016).
Até o momento, a positividade para HBoV foi descrita nas regiões Sudeste, Centro-
Oeste e Nordeste, sendo que todos os genótipos virais já foram detectados nesse tipo de
amostra (Santos et al. 2010, Campos et al. 2016, Sousa 2016).
No Centro-Oeste brasileiro, a detecção de HBoV nas amostras fecais de crianças
hospitalizadas, assintomáticas ou com sintomas gastroentéricos e/ou respiratórios,
variou entre 5,8 e 9,0% (Sousa et al. 2012, Sousa 2016). Recentemente, o genótipo
HBoV-4 foi identificado pela primeira vez no Brasil, em nosso laboratório, em amostra
fecal de uma criança hospitalizada, proveniente da região Centro-Oeste, com tumor na
região submandibular, sem sintomas de gastroenterite aguda ou infecção do trato
respiratório (Sousa et al. 2017).
1.5. Bocavírus Humanos em Pacientes Imunocomprometidos
Em indivíduos imunocomprometidos, há uma deficiência em componentes da
imunidade, seja ela inata ou adaptativa. Essa situação pode ser desencadeada por
imunodeficiências primárias e secundárias, sendo que essa última pode ocorrer devido a
uma doença específica ou ser relacionada ao tratamento de neoplasias, doenças
autoimunes, transplante de órgãos sólidos ou de células progenitoras hematopoiéticas
(Dropulic & Lederman 2016). O transplante de células progenitoras hematopoéticas
(TCPH) é uma terapia utilizada para o tratamento de doenças hematológicas e
autoimunes, sendo que o TCPH autólogo é utilizado para melhorar o prognóstico de
neoplasias e doenças autoimunes e o transplante alogênico de células progenitoras
hematopoéticas (TACPH) pode ser indicado para curar ou melhorar o prognóstico de
doenças como linfomas, leucemias, hemoglobinopatias, aplasia de medula óssea,
neoplasias mieloproliferativas dentre outras (Tomblyn et al. 2009).
Após o TACPH, durante o período de reconstituição dos sistemas hematológico
e imune, o paciente passa por um período de pancitopenia intensa, podendo durar de
dias a semanas, o que aumenta o risco de infecções oportunistas que podem resultar em
complicações clínicas e um pior prognóstico (Yen et al. 2004, Tomblyn et al. 2009).
Sendo assim, esses pacientes devem ser monitorados para o aparecimento de
manifestações clínicas de uma doença infecciosa durante todo o período de
imunocomprometimento (Bittencourt 2002). Os candidatos ao TACPH devem ser
25
testados para a presença de agentes infecciosos antes do transplante, dentre esses estão
os vírus como o citomegalovírus humano (HCMV), vírus Epstein-Barr (EBV), vírus
herpes simplex (HSV), vírus da varicela-zoster (VZV), vírus da influenza, dentre outros.
Porém, até o momento não há recomendações para a triagem pré e pós TACPH de
outros vírus, como os HBoVs, nesses pacientes (Tomblyn et al. 2009).
Alguns estudos já reportaram a presença dos HBoVs em pacientes
imunocomprometidos. Num estudo de Arnold et al. (2006), o HBoV-1 foi detectado em
amostras respiratórias de dois pacientes pediátricos, que tinham sido submetidos a
transplante de órgãos sólidos. Kupfer et al. (2006) descreveram o caso de um paciente
adulto com Linfoma Não-Hodgkin (LNH) de células T angioimunoblástico que evoluiu
para aplasia de medula óssea. Na pesquisa do agente etiológico, em uma amostra de
lavado broncoalveolar, detectou-se a presença isolada de HBoV-1.
Schenk et al. (2007) relataram o caso de uma criança com disceratose congênita,
que, após o TACPH, desenvolveu pneumonia. Foram detectadas altas cargas de DNA
de HBoV-1 em aspirados de nasofaringe, amostras de fezes e de sangue da criança. No
estudo de Smuts & Hardie (2006), o HBoV-1 foi detectado em amostras respiratórias de
oito pacientes pediátricos infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Já
no estudo de Rahiala et al. (2013), em que foram analisadas amostras de soro de 53
pacientes pediátricos com diversas doenças hematológicas, coletadas após o TACPH,
não foi encontrada positividade para o genoma dos HBoVs.
Koskenvuo et al. (2008) reportaram três casos de crianças com leucemia linfoide
aguda (LLA), apresentando sintomas gastroentéricos e respiratórios, positivos para
HBoV-1 em swab nasal, com uma positividade de detecção de 5,6%. Em outro estudo,
foi descrito o caso de um paciente idoso, imunocomprometido, acometido com um
estágio avançado de síndrome mielodisplásica, apresentando síndrome respiratória
aguda grave e pneumonia. O mesmo genótipo HBoV-1 foi detectado no lavado
broncoalveolar, na crista ilíaca e num tumor retal (Krakau et al. 2015). Em um estudo
prospectivo, foi pesquisado por um período de até 30 meses a presença de HBoV em
amostras respiratórias de 88 pacientes adultos submetidos ao TACPH que
desenvolveram sintomas respiratórios. Por meio de um ensaio multiplex PCR comercial,
a presença do genoma viral foi detectada em 8,0% dos pacientes, porém somente
amostras do trato respiratório foram testadas e somente quando havia a presença de
sintomas (Pinana et al. 2018).
26
No Brasil, os HBoVs já foram detectados por métodos moleculares em amostras
do trato respiratório de pacientes submetidos a transplante de pulmão, de fígado e de
medula óssea (Costa et al. 2009, Caccia et al. 2012) e em amostras fecais de pacientes
com algum tipo de imunodeficiência apresentando sintomas de gastroenterite aguda
(Santos et al. 2010, Portes et al. 2017).
Diante do exposto, observa-se vários estudos avaliando a ocorrência dos HBoVs
em pacientes imunocomprometidos, porém poucos realizaram a detecção desse agente
viral naqueles submetidos ao TACPH. Além disso, até o momento apenas um estudo
realizou o acompanhamento de pacientes submetidos ao TACPH para a pesquisa de
HBoV, somente em amostras respiratórias.
27
2. JUSTIFICATIVA
Os pacientes que realizam o TACPH são submetidos a regimes intensos de
quimioterapia e, até que haja completa instalação do enxerto, ficam imunossuprimidos,
o que resulta em um risco aumentado de infecções virais, bacterianas e fúngicas
(Tomblyn et al. 2009, Chatzidimitriou et al. 2010).
Em estudos recentes realizados no Laboratório de Virologia e Cultivo Celular do
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás
(LabVICC/IPTSP/UFG), tem sido observado um número elevado de casos de infecção
ativa por HCMV em pacientes submetidos ao TACPH (Borges 2016), de infecção
prolongada por calicivírus (Lemes 2013) e de cargas virais elevadas de HAdV (Santos
2015). A pesquisa de todos esses vírus não faz parte da rotina de triagem de agentes
infecciosos nesses pacientes no Brasil.
Desde a sua descoberta, os HBoVs têm sido associados, em todo o mundo, com
infecções do trato respiratório e também do trato gastrointestinal, principalmente em
crianças (Zhao et al. 2014, Berry et al. 2015). Porém, ainda são poucos os estudos
realizados com esses agentes em pacientes imunocomprometidos, em especial os que
foram submetidos ao TACPH.
Estudos em pacientes imunocomprometidos que relacionam a infecção por
HBoV com carga viral, viremia e também sintomas gastroentéricos são escassos na
literatura. Ademais, em nenhum dos estudos já realizados fez-se o seguimento desses
pacientes, com a pesquisa de HBoV em amostras seriadas do mesmo paciente.
Como a pesquisa, quantificação e monitoramento dos HBoVs não faz parte do
monitoramento rotineiro dos pacientes submetidos ao TACPH, espera-se ainda que os
dados obtidos possam auxiliar no melhor conhecimento da relevância desses agentes
nesse contexto.
28
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Pesquisar a ocorrência de HBoVs em pacientes submetidos ao transplante
alogênico de células progenitoras hematopoiéticas em um centro de referência em
transplantes de medula óssea de Goiás, no período de 2012 a 2014.
3.2. Objetivos Específicos
Investigar a ocorrência de HBoV em amostras clínicas (fezes e soro) de
pacientes submetidos ao TACPH, antes e após o transplante;
Avaliar a carga de HBoV nas amostras clínicas positivas;
Verificar a positividade de HBoV considerando as características clínicas dos
pacientes;
Proceder à caracterização molecular das amostras positivas para HBoV.
29
4. MÉTODOS
4.1. População de Estudo e Local
A população de estudo foi composta por pacientes submetidos ao TACPH na
Unidade de Transplante de Medula Óssea do Hospital Araújo Jorge/Associação de
Combate ao Câncer em Goiás (HAJ/ACCGO), primeiro estabelecimento de saúde,
credenciado pelo Ministério da Saúde, a oferecer o TACPH no Centro-Oeste brasileiro
pelo do Sistema Único de Saúde (SUS). Em média, na instituição, são realizados
anualmente 22 transplantes de medula óssea do tipo alogênico e 35 do tipo autólogo.
Para a assistência aos pacientes submetidos ao TACPH, a unidade possui um
leito em cada um dos quatro quartos (n.º 217-220; Figura 5). Cada um desses é
equipado com filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) e possui um banheiro
individual, medidas que garantem a filtragem do ar e previnem a contaminação do
ambiente e pacientes.
Figura 5. Representação esquemática da Unidade de Transplante de Medula Óssea do
HAJ/ACCGO. Adaptado de Lemes (2013).
Para o contato com os transplantados são necessárias a higienização das mãos
em uma antessala (Figura 5) e a utilização de capote estéril, assim como o uso de
máscara descartável. Os pacientes alimentam-se nos próprios quartos em que estão
internados, bem como consomem água mineral fornecida pelo serviço, sendo proibida a
entrada de alimentos e bebidas obtidos externamente ao hospital.
Os protocolos terapêuticos de condicionamento utilizados nesses pacientes antes
do TACPH estão descritos no Quadro 1. Para a profilaxia da doença do enxerto contra o
30
hospedeiro (DECH), utilizou-se ciclosporina (15 mg/kg/dia), iniciada dois dias pré-
TACPH, e metotrexato (3 mg/kg/dia) nos dias um, três, seis e 11 pós-TACPH.
Ainda, a partir do período de condicionamento e após o TACPH, todos os
pacientes foram submetidos às profilaxias antibacteriana com sulfametoxazol +
trimetopima (400 mg + 80 mg) a cada 12 horas, antifúngica com fluconazol (200 mg) a
cada 12 horas, antiviral com aciclovir (10 mg/kg) a cada oito horas e antiparasitária com
albendazol (400 mg) a cada 24 horas.
Quadro 1. Protocolos terapêuticos de condicionamento utilizados nos pacientes antes do
TACPH.
Neoplasia Protocolo terapêutico
Leucemia mieloide crônica
Leucemia mieloide aguda
Síndrome mielodisplásica
Bussulfano: 16 mg/kg (1 mg/kg a cada 6 h) do dia -7 ao dia -4
Ciclofosfamida: 60 mg/kg (2x por dia)
Mesna (dose integral de ciclofosfamida) no dia -3 e -2
ou
Bussulfano: 16 mg/kg (1 mg/kg a cada 6 h)
Fludarabina: 40 mg/m² (a cada 24 h) do dia -5 ao -2;
Leucemia linfoide aguda
O mesmo para leucemia mieloide crônica
ou
Irradiação corporal total (200 cGy) do dia -6 ao -4
Ciclofosfamida: 60 mg/kg (2x por dia)
Mesna (dose integral de ciclofosfamida) no dia -3 e -2
Aplasia medular
Ciclofosfamida: 60 mg/kg (2x por dia)
Mesna (dose integral de ciclofosfamida) do dia -5 ao -2
ou
Bussulfano: 16 mg/kg (1 mg/kg por via oral a cada 6 h)
Fludarabina: 40 mg/m² (a cada 24 h) no dia -5 ao -2
4.2. Delineamento do Estudo
Trata-se de um estudo observacional longitudinal retrospectivo para a pesquisa
de HBoVs em amostras fecais e séricas de pacientes que seriam submetidos ao TACPH,
devido ao regime imunossupressor utilizado para evitar a DECH e também ao maior
tempo de reconstituição do sistema imunológico após o procedimento, condições que
aumentam o risco de complicações infecciosas. Foram excluídos os pacientes que
seriam submetidos ao transplante autólogo. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética
em Pesquisa da UFG (CAAE: 67782917.3.0000.5083) e do Hospital Araújo Jorge
(CAAE: 04048712.0.0000.0031).
31
Para a pesquisa de HBoVs, foram coletadas amostras de fezes e de sangue dos
pacientes que aceitaram participar da pesquisa, por meio do preenchimento e assinatura
do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE). A coleta teve início em outubro
de 2012 e foi finalizada em outubro de 2014.
O protocolo proposto para a coleta dos pacientes foi o seguinte:
Antes do TACPH: coleta de uma amostra de sangue e uma de fezes;
Até três meses após o TACPH: coleta semanal, ou com maior frequência
dependendo da ocorrência de gastroenterite nos pacientes (além de coleta
de ambas as amostras sempre que houvesse suspeita clínica de infecção
viral ou de DECH);
De três a seis meses após o TACPH: coleta quinzenal;
De seis a doze meses após o TACPH: coleta mensal.
Para se obter as informações sobre os sinais e sintomas dos pacientes durante o
período da pesquisa, foram analisadas as fichas de investigação preenchidas pelos
profissionais de saúde responsáveis da unidade, assim como foi realizada revisão de
prontuário com o objetivo de complementar os dados clínicos e laboratoriais sobre os
pacientes.
4.3. Preparo das Amostras Clínicas e Extração do DNA Viral
As amostras biológicas obtidas foram encaminhadas ao LabVICC/IPTSP/UFG
para serem processadas e armazenadas de maneira adequada. Primeiramente, foi feita
uma suspensão de cada amostra de fezes a 20% em tampão salina fosfato (PBS), pH
7,4. Os sobrenadantes foram aliquotados e armazenados à temperatura de -20°C e de -
80°C até o uso. As amostras de sangue total foram centrifugadas a 1500 xg durante 10
minutos (min) para obtenção do soro, que posteriormente foi aliquotado em três tubos,
sendo dois armazenados a -80°C e um a -20°C, até o momento de uso.
Para a extração do DNA viral foram utilizados kits comerciais, a partir de
aproximadamente 100 µg de fezes in natura (QIAamp Stool Mini Kit, QIAGEN), e de
200 µL de soro (QIAamp MinElute Spin Kit, QIAGEN), de acordo com as instruções
fornecidas pelo fabricante.
32
4.4. Pesquisa de HBoV por qPCR e Determinação da Carga Viral
4.4.1. PCR para obtenção do fragmento utilizado para a construção do plasmídeo
recombinante
Para a amplificação da região parcial do genoma do HBoV a ser utilizado como
inserto para construção do plasmídeo recombinante usado na curva padrão da qPCR, foi
selecionada uma amostra positiva para HBoV-1 previamente sequenciada, proveniente
de um estudo anterior realizado pelo LabVICC/IPTSP/UFG (Andreasi et al. 2008). A
região alvo do genoma selecionada foi a NP1. As sequências dos iniciadores
desenhados para a reação de PCR foram as seguintes: NP1F (5’-
GWGACGAMGATGAGCTCAG-3’) e NP1R (5’-
CCGTTWTCAAGWGGATTAAATG-3’), senso e antisenso respectivamente.
A reação foi realizada nas seguintes condições: 1 μL de DNA em mistura de
reação contendo 12,5 μL GoTaq® Colorless Master Mix 1X (Promega – Madison,
Wisconsin, EUA), 0,5 μL (20 μM) de cada iniciador (NP1F e NP1R) e água ultrapura
(GoTaq®) para completar o volume final de 25 μL de reação. As condições para a
ciclagem foram realizadas de acordo com Kapoor et al. (2010).
Após a amplificação, 10 µL do produto da PCR, juntamente com 3 µL de
tampão de amostra (azul de bromefenol 0,25%, xilenocianol 0,25%, glicerol 30%)
foram aplicados em gel de agarose (Invitrogen – Foster City, EUA) a 1,5%, contendo
brometo de etídio a 0,1% e submetido a eletroforese a 115 volts por aproximadamente
30 min em tampão TBE (TRIS/Borato/EDTA) 0,5X. Em seguida, a visualização do gel
foi realizada em transiluminador com luz ultravioleta para observação do fragmento de
tamanho esperado (738 pb) (Figura 6).
33
Figura 6. Gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídio a 0,1% após corrida
eletroforética do produto de PCR da amostra positiva para HBoV utilizada na clonagem
dos plasmídeos. Poço A: amostra positiva; poço M: marcador de tamanho molecular
(100 pb, Jena Bioscience).
4.4.2. Reação de ligação
Para esta etapa, o produto da PCR foi purificado por isopropanol a 65% e etanol
a 70% de acordo com Green & Sambrook (2012) e depois quantificado. A reação foi
realizada com o Kit PROMEGA pGEM – T Easy Vector System I (Promega corporation,
Madison, Wisconsin, EUA), sendo misturados 1 μL do plasmídeo (50 ng/μL), 5 μL do
produto purificado da PCR, 10 μL da solução tampão e 2 μL da enzima T4 DNA ligase,
completando o volume com água ultrapura estéril para 20 μL. A mistura foi
homogeneizada seguindo incubação por 2 horas em temperatura ambiente e
posteriormente a 4°C por 24 horas.
4.4.3. Preparação de células bacterianas competentes para transformação
Foi feito o pré-inóculo de uma colônia isolada de Escherichia coli (linhagem
XL10-Gold), cedido gentilmente pelo Laboratório de Bacteriologia Molecular do
IPTSP/UFG, em 5 mL de meio SOB (Extrato de levedura, cloreto de sódio, triptona,
cloreto de potássio). As células foram cultivadas por 16 horas sob agitação de 250 rpm a
37°C. Após este período, 1 mL deste pré-inóculo foi transferido para cinco erlenmeyers
34
diferentes contendo 200 mL de meio SOB. O inóculo foi incubado sob agitação de 250
rpm a 37°C até atingir uma densidade óptica a 600 nm de 0,6 a 0,7. As células foram
coletadas por centrifugação a 5000xg por 10 min a 4°C até que todo o sobrenadante
fosse descartado (um tubo de 50 mL para cada erlenmeyer), e ressuspensas em glicerol
(Sigma®, Saint Louis, Missouri, EUA) 10% (v/v) gelado. As células competentes foram
armazenadas em alíquotas de 50 μL em microtubos novos e estéreis e mantidas a -80°C
até o uso (Green & Sambrook 2012).
4.4.4. Transformação de E. coli por eletroporação
As bactérias competentes (50 μL) foram transformadas por eletroporação (5,0
kV, 25 μF, 200 Ω) sendo adicionadas à mistura 4 μL do sistema de ligação (inserto +
plasmídeo) e incubadas no gelo por 10 min. Após o choque em eletroporador
MicroPulser™ (Bio-rad) a cubeta foi retirada do suporte, e foram adicionados 950 μL
de meio SOC (extrato de levedura, triptona, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto
de magnésio, sulfato de magnésio e glicose). Após homogeneização, a solução foi
retirada da cubeta com a pipeta, passando-a para um tubo de ensaio com tampa
rosqueada, o qual foi incubado a 37ºC por 1 hora e 30 min sob agitação de 200 rpm. Em
seguida, as células foram transferidas para placas contendo meio LB (Luria Bertani –
triptona, extrato de levedura e cloreto de sódio) ágar com ampicilina (Inlab, São Paulo,
Brasil) (100 µg/mL), isopropil-tio-β-galactosídeo (IPTG) (Ludwig Biotec, Rio Grande
do Sul, Brasil) (1 nM) e X-gal (Ludwig Biotec, Rio Grande do Sul, Brasil) (20 ng/mL).
4.4.5. Extração de DNA plasmidial em pequena escala (mini-prep)
Da placa semeada, dez colônias brancas foram selecionadas e inoculadas cada
uma em 3 mL de meio LB e ampicilina (100 µg/mL). Esse pré-inóculo foi incubado por
aproximadamente 16 horas a 37ºC sob agitação de 150 rpm. Após, a extração do DNA
plasmidial foi realizada de acordo com Green & Sambrook (2012), com as seguintes
modificações: foram utilizados 210 μL de Solução de lise alcalina I juntamente com 1
µL de RNAse A (10 mg/mL) (Ludwig Biotec, Alvorada, Rio Grande do Sul, Brasil),
280 μL de Solução de lise alcalina II e 280 μL de Solução de lise alcalina III. O
sedimento foi ressuspendido em 30 μL de água ultrapura e permaneceu por 10 min a
4ºC e, após esse período, foi armazenado a -20ºC.
35
4.4.6. Digestão do plasmídeo com endonuclease EcoRI para verificação da
presença do inserto
A digestão de DNA com a enzima de restrição EcoRI (Invitrogen, CA, EUA) foi
realizada de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. O material foi
estocado a -20ºC. Após, 10 µL do produto da digestão, assim como o marcador de
tamanho molecular (100 pb, Jena Bioscience), foram misturados a 3 µL de tampão de
amostra e aplicados em gel de agarose (Invitrogen – Foster City, EUA) a 1,0%,
contendo brometo de etídio a 0,1% e submetido a eletroforese a 115 volts por
aproximadamente 30 min em tampão TBE 0,5X. Em seguida, a visualização do gel foi
realizada em transiluminador com luz ultravioleta para observação do inserto de
tamanho esperado (738 pb) (Figura 7).
Figura 7. Gel de agarose a 1,0% após corrida eletroforética do produto da digestão do
plasmídeo com a enzima EcoRI para verificar a presença de plasmídeos com inserto.
Poço A: digestão positiva mostrando a presença do inserto no plasmídeo. Poço B:
digestão negativa mostrando ausência de ligação do inserto no plasmídeo. M: marcador
de tamanho molecular (100 pb, Jena Bioscience).
4.4.7. Padronização da curva padrão da qPCR TaqMan® para HBoV
A curva padrão da qPCR foi obtida a partir do plasmídeo extraído purificado. O
DNA plasmidial foi quantificado utilizando o aparelho NanoDrop 2000 (Thermo Fisher
Scientific). Após, foi calculada a equivalência de concentração em gramas para número
36
estimado de moléculas de DNA, sendo que o tamanho total do plasmídeo com o inserto
é de 3753 pb. Utilizou-se a seguinte fórmula:
[((Xg / μL DNA) / (tamanho do plasmídeo com inserto x 660))] x 6.022x1023 = Y moléculas/μl
Após o cálculo, foram feitas diluições seriadas (108 a 100) que posteriormente
foram analisadas no aparelho de PCR em tempo real Rotor-Gene Q, modelo 5-Plex
HRM (QIAGEN, Hilden, Alemanha) (Figura 8). A qPCR para HBoV foi realizada de
acordo com Deng et al. (2012). Os resultados foram expressos em cópias genômicas por
mililitro (cópias/mL) para as amostras de soro e cópias genômicas por grama (cópias/g)
para as de fezes.
Figura 8. Curva padrão da qPCR TaqMan® para HBoV. A: Curvas de amplificação das diluições
seriadas em escala linear; a curva na cor preta representa o controle positivo. B: Gráfico da concentração
de DNA pelo Ct; pontos em azul representam as diluições seriadas; ponto em vermelho (seta) representa
o controle positivo.
37
A validação da curva foi obtida por meio do coeficiente de correlação (R > 0,99)
e o limite de detecção foi estabelecido como threshold cycle (Ct) < 40. Depois, 10 µL
de cada diluição foram aliquotados em microtubos de 200 µL e congelados a -80ºC,
sendo armazenadas até o momento de seu uso. Após a padronização da curva padrão,
amostras fecais positivas para os genótipos HBoV-1, HBoV-2, HBoV-3 e HBoV-4,
obtidas e sequenciadas em estudos anteriores (Sousa et al. 2012, Sousa 2016, Sousa et
al. 2017), realizados no LabVICC/IPTSP/UFG, foram testadas a fim de validar a reação.
4.4.8. Determinação da carga viral por qPCR TaqMan® para HBoV
As amostras de fezes e soro foram testadas separadamente por qPCR TaqMan®.
Para verificação da presença de inibidores foi utilizado o kit TaqMan® Exogenous
Internal Positive Control (VIC™ probe) (Applied Biosystems, Massachusetts, EUA). A
reação de qPCR foi conduzida de acordo com o descrito por Deng et al. (2012). As
sequências da sonda e dos iniciadores estão descritas no Quadro 2.
Quadro 2. Iniciadores e sondas utilizados na qPCR TaqMan® para HBoV.
Nome Sequência (5' - 3') Localização*
Iniciadores Boca-forward GGAAGAGACACTGGCAGACAA 2480-2500
Boca-reverse GGGTGTTCCTGATGATATGAGC 2558-2579
Sonda Boca probe FAM-CTGCGGCTCCTGCTCCTGTGAT-TAMRA 2504-2525
*Localização referente ao isolado HBoV-1 307AR09 (ID: KJ634207.1). Fluoróforo: FAM (6-
carboxifluoresceína); Quencher: TAMRA (tetrametilrodamina) (Deng et al. 2012).
4.5. Sequenciamento Genômico e Análise Filogenética das Amostras Positivas
para HBoV
Para a determinação da sequência das amostras positivas para HBoV foi
realizada a reação de PCR, seguida de Nested-PCR tendo como alvo a região genômica
VP1/VP2 (Quadro 3), conforme descrito por Kapoor et al. (2010), com modificações. A
reação de PCR foi realizada nas seguintes condições: 2,5 μL de DNA acrescidos em
mistura contendo 12,5 μL de GoTaq® Colorless Master Mix 1X (Promega – Madison,
Wisconsin, EUA), 0,3 μL (20 μM) de cada iniciador (AK-VP-F1 e AK-VP-R1) (Quadro
3) e água ultrapura (GoTaq®) para completar o volume final de 25 μL de reação. A
38
reação de Nested-PCR foi realizada nas seguintes condições: 1 μL do produto da PCR
acrescido em mistura contendo 12,5 μL de GoTaq® Colorless Master Mix 1X (Promega
– Madison, Wisconsin, EUA), 0,3 μL (20 μM) de cada iniciador (AK-VP-F2 e AK-VP-
R2) e água ultrapura (GoTaq®) para completar o volume final de 25 μL de reação.
Quadro 3. Iniciadores utilizados na PCR e Nested-PCR para o sequenciamento genômico.
Nome Sequência (5' - 3') Sentido
Tamanho
do produto
amplificado
PCR AK-VP-F1 CGCCGTGGCTCCTGCTCT Senso
604 pb AK-VP-R1 TGTTCGCCATCACAAAAGATGTG Anti-senso
Nested-
PCR
AK-VP-F2 GGCTCCTGCTCTAGGAAATAAAGAG Senso 576 pb
AK-VP-R2 CCTGCTGTTAGGTCGTTGTTGTATGT Anti-senso
(Kapoor et al. 2010)
As condições para a ciclagem da PCR foram as seguintes: 10 ciclos a 95ºC por
35 segundos, 58ºC por 1 min e 72ºC por 1 min, com decréscimo de 0,5ºC na
temperatura de hibridização a cada ciclo; 30 ciclos a 95ºC por 30 segundos, 54ºC por 45
segundos e 72ºC por 45 segundos; e uma extensão final a 72ºC por 10 min. Condições
similares foram usadas para a Nested-PCR, exceto que a temperatura inicial de
hibridização foi 60ºC e 58ºC no primeiro e segundo grupo de ciclos da PCR,
respectivamente.
Os produtos resultantes da Nested-PCR foram purificados utilizando-se
isopropanol a 65% e etanol a 70% de acordo com Green & Sambrook (2012). Em
seguida, as amostras foram submetidas ao sequenciamento genômico, utilizando os
mesmos iniciadores da reação, nas seguintes condições: 3 µL ou 5 µL do produto
purificado (dependendo da quantidade do produto), acrescidos em mistura contendo 3
µL de Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA,
EUA), 1 µL (2 μM) dos iniciadores AK-VP-F2 ou AK-VP-R2 em poços separados da
placa e água ultrapura estéril para completar o volume final de 10 μL de reação.
As condições para a ciclagem foram as seguintes: 95ºC por 10 segundos; 25
ciclos a 95ºC por 20 segundos, 58ºC por 15 segundos e 60ºC por 60 segundos.
Posteriormente, o DNA das amostras foram precipitados com isopropanol a 65%,
seguido de lavagem com etanol a 60% e desnaturação das fitas. Para realizar o
39
sequenciamento genômico pelo método de Sanger (Sanger et al. 1977) foi utilizado
sequenciador automático (DNA ABI PRISM 3130, Applied Biosystems).
As sequências obtidas neste estudo foram alinhadas e comparadas com
sequências de referência depositadas no National Center for Biotechnology Information
Database (NCBID) (www.ncbi.nlm.nih.gov/genebank/index.html), utilizando-se o
software Clustal X2. A construção da árvore filogenética será feita utilizando-se o
software Mega 7.0 pelo método de neighbor-joining (Tamura et al. 2011), sendo
consideradas 1000 replicatas e valores de boostraps acima de 80%.
4.6. Análises Estatística dos Dados Obtidos
Para a análise estatística dos dados preliminares, foi utilizado o programa SPSS
versão 23 (IBM®). As diferenças entre as variáveis nominais foram avaliadas por meio
do Teste exato de Fisher. Variáveis ordinais e contínuas independentes foram avaliadas
pelo teste de Mann-Whitney U e as dependentes pelo teste de Wilcoxon. O nível de
significância considerado foi de 5% (p < 0,05).
40
5. RESULTADOS
Entre outubro de 2012 e outubro de 2014, todos os pacientes submetidos ao
TACPH na unidade de Transplante de Medula Óssea do HAJ/ACCGO aceitaram
participar do estudo, totalizando 21 indivíduos consecutivos. Desses, 52,4% (11/21)
eram do sexo masculino com a idade variando entre quatro e 61 anos (mediana de 35
anos), sendo que dois pacientes eram pediátricos (4 e 9 anos de idade).
Em 52,4% (11/21) dos casos, a fonte de células progenitoras hematopoiéticas
(CPH) foi a medula óssea, e em 47,6% (10/21) foi o sangue periférico. A mediana da
contagem de linfócitos foi de 480/µL (992.332/µL) e 280/µL (02.178/µL) antes e
após o TACPH, respectivamente. Dentre as desordens hematológicas apresentadas pelos
pacientes, as leucemias de linhagem mieloide, crônica e aguda, corresponderam a
57,1% (12/21) dos casos (Figura 9).
Figura 9. Frequência das desordens hematológicas apresentadas pelos pacientes (n = 21). AM: aplasia
medular; HPN: hemoglobinúria paroxística noturna; LMC: leucemia mieloide crônica; LMA: leucemia
mieloide aguda; LLA: leucemia linfoide aguda; MFP: mielofibrose primária; SMD: síndrome
mielodisplásica.
Apesar do protocolo de coleta proposto, não foi possível aplicá-lo a todos os
pacientes, principalmente devido aos óbitos ocorridos no decorrer do estudo (n = 10).
Sendo assim, a mediana de acompanhamento dos pacientes para a pesquisa viral foi de
104 dias, variando de quatro a 586 dias.
Foram coletadas 145 amostras de soro e 105 amostras de fezes, totalizando 250
amostras obtidas dos 21 pacientes. Porém, não foi possível a obtenção das amostras de
fezes de dois pacientes. Em média, para cada paciente foram coletadas cinco amostras
de fezes (variando de zero a 12 amostras) e sete amostras de soro (variando de uma a 18
19%
38,1%
14,3%
4,8%
9,5%
9,5%
4,8%
0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45%
LMC
LMA
LLA
MFP
AM
SMD
HPN
41
amostras). Ainda, antes da realização do TACPH foram coletadas amostras de fezes e
soro de 19 participantes.
Em relação à frequência de detecção, 42,9% (9/21) dos pacientes foram
positivos para HBoV por qPCR TaqMan® em pelo menos uma das amostras (fezes ou
soro) coletadas no decorrer do seu acompanhamento no estudo, sendo que em sete
pacientes a detecção de HBoV ocorreu em ambas amostras de fezes e soro. Além disso,
a maioria (6/9) dos pacientes teve a primeira amostra positiva antes da infusão das CPH,
ainda durante o período de condicionamento.
Em relação à carga viral, a mediana nas fezes foi de 3,78 x 107 cópias/g
(variando de 8,16 x 106 a 3,86 x 108 cópias/g) e no soro foi de 3,56 x 105 cópias/mL
(variando de 4,60 x 104 a 1,99 x 106 cópias/mL), sendo que a carga de HBoV nas fezes
foi significativamente maior do que no soro (p = <0,0001) (Figura 10).
Figura 10. Distribuição (mediana e variação) das cargas de HBoV nas amostras de
fezes (n = 15) e soro (n = 13). Cada círculo e triângulo representa uma amostra
positiva nas fezes e no soro, respectivamente.
Em todos os pacientes positivos para HBoV, acompanhados por mais de cem
dias, o pico da carga viral nas fezes ocorreu dentro dos 100 primeiros dias após o
TACPH, com uma mediana de 27 dias (448 dias) entre o transplante e o pico da carga
viral. Já no soro de dois pacientes, o pico ocorreu após os 100 primeiros dias da
realização do procedimento, sendo encontrada uma mediana de 78,5 dias (18459 dias)
(Tabela 1).
42
Tabela 1. Pico de carga viral nas amostras clínicas dos pacientes positivos para HBoV
ID Acompanhamento
(dias)
Pico da carga viral
nas fezes (cópias/g)
Dia do
pico
Pico da carga viral
no soro (cópias/mL)
Dia do
pico
P002 >100 1,94E+08 +37 1,99E+06 +108
P004 >100 8,96E+07 +19 9,47E+05 +459
P005 ≤100 4,82E+07 +8 4,68E+05 +19
P006 >100 3,69E+07 +8 3,10E+05 +43
P007 >100 2,60E+08 +15
P008 >100 4,91E+07 +35 1,89E+05 +58
P010 >100 3,86E+08 +48 1,17E+06 +99
P015 ≤100 5,16E+07 +5 1,64E+05 +11
P017 >100 3,56E+05 +18
Ademais, ao se comparar a carga viral antes da realização do procedimento com
a carga viral da primeira amostra positiva após o TACPH, tanto nas amostras de soro
quanto nas de fezes, foi observado um aumento estatisticamente significativo (p = 0,03)
(Figura 11).
Figura 11. Comparação das cargas virais antes e após o TACPH. Cada linha
representa um paciente cuja positividade para HBoV ocorreu antes e após o
transplante (n = 6).
Nas fezes, houve detecção de HBoV com uma mediana de tempo 26 dias,
variando de cinco a 121 dias. Nessas amostras, foram observados dois padrões
principais de excreção: um intermitente, com pelo menos uma amostra negativa entre
duas positivas; e outro contínuo, com pelo menos duas amostras positivas consecutivas.
43
Desse modo, em 37,5% (3/8) dos pacientes a excreção de HBoV foi intermitente
(P002, P004 e P008) e em 37,5% (3/8) a excreção foi contínua (P005, P007 e P015).
Além disso, o paciente P004 apresentou recorrência de positividade nas fezes, sendo o
HBoV novamente detectado após quatro amostras sucessivamente negativas, passados
cem dias da realização do TACPH. De modo contrário, no paciente P006 não houve
recorrência de excreção de HBoV nas cinco amostras de fezes testadas subsequentes à
amostra positiva após cerca de quatro meses de acompanhamento.
Em relação à viremia, 88,9% (8/9) dos pacientes apresentaram pelo menos uma
amostra sérica positiva no decorrer do estudo. A mediana de tempo para a primeira
detecção de HBoV no soro foi de 50,5 dias, variando de -8 a 206 dias. Ainda, em 25%
(2/8) dos pacientes a viremia ocorreu no período de condicionamento, em 37,5% (3/8)
ocorreu dentro dos cem primeiros dias após o TACPH e em 37,5% (3/8) ocorreu após
esse período. Em 75% (6/8) dos indivíduos, a positividade para HBoV no soro foi
observada somente após a detecção viral nas amostras fecais. A dinâmica da detecção
de HBoV nas amostras fecais e séricas em cada um dos pacientes está representada na
Figura 12.
As manifestações clínicas gastrointestinais mais frequentes apresentadas pelos
pacientes do estudo foram mucosite, vômito, constipação intestinal, dor abdominal e,
principalmente, diarreia. Dentre os pacientes positivos para HBoV, seis apresentavam
diarreia no mesmo período da detecção do genoma viral nas amostras fecais. A
frequência de diarreia foi maior entre os pacientes positivos para HBoV (54,5%),
quando comparada à frequência em pacientes negativos para HBoV, porém não houve
diferença estatística entre a presença ou ausência de diarreia com a positividade para
HBoV (p = 0,38). Além disso, dois pacientes (P004 e P007) apresentaram sintomas
respiratórios durante o período do estudo, como coriza, tosse, sinusite, obstrução nasal e
quadro pneumônico, porém, em nenhum dos casos a detecção de HBoV nas amostras
clínicas foi concomitante com tais manifestações clínicas.
Como complicação pós-TACPH, 52,4% (11/21) dos pacientes apresentaram
DECH durante o período de acompanhamento pelo estudo, sendo que o acometimento
cutâneo e intestinal foram os mais frequentes, variando de grau moderado a grave.
Desse total, 54,5% (6/11) dos pacientes foram positivos para HBoV, sendo que três
pacientes apresentavam DECH grau II (moderado), um apresentava grau III (grave) e
dois apresentavam grau IV (com risco de vida).
44
Figura 12. Dinâmica da detecção de HBoV em relação ao tempo após o TACPH e à carga viral nas amostras fecais e séricas (n = 9).
45
Durante o estudo, 47,6% (10/21) dos pacientes foram a óbito, sendo que em 30%
(3/10) desses houve detecção de HBoV nas amostras clínicas e a última amostra
positiva foi em média seis meses antes do óbito.
Das 28 amostras positivas para HBoV por qPCR, em 12 houve amplificação do
genoma viral por Nested-PCR. Porém, após o processo de purificação, foi possível obter
produtos com concentração adequada e de boa qualidade de três amostras fecais obtidas
de três pacientes (P002, P007 e P015). Os produtos das três amostras foram submetidas
ao sequenciamento genômico para a análise dos genótipos de HBoV. As três sequências
parciais, do gene VP1/VP2, foram alinhadas com nove sequências de referência,
incluindo genótipos representativos das quatro variantes de HBoV. Todas sequências
submetidas foram agrupadas com amostras HBoV-1 (Figura 13). Além disso, houve
elevada identidade nucleotídica (≥ 99%) entre as três sequências detectadas neste
estudo.
Figura 13. Análise filogenética da sequência parcial da região genômica VP1/VP2 de
HBoV em amostras fecais de pacientes submetidos ao TACPH. As amostras de referência
estão representadas pelo número de acesso no GenBank. As amostras utilizadas neste
estudo estão representadas pelo símbolo .
46
6. DISCUSSÃO
Este é o primeiro estudo prospectivo a pesquisar e quantificar o HBoV em
amostras fecais e séricas de pacientes submetidos ao TACPH, tanto antes quanto após o
transplante. Os indivíduos positivos para HBoV neste estudo eram majoritariamente
adultos, com exceção de um paciente pediátrico. As neoplasias hematológicas
apresentadas pelos pacientes do presente estudo acometem principalmente a população
adulta, sendo que o TACPH é uma das terapias utilizadas para a melhora do prognóstico
ou cura da doença (Tomblyn et al. 2009), o que explicaria a idade mediana encontrada
neste estudo.
Alguns estudos têm descrito a detecção de HBoVs em pacientes
imunocomprometidos, principalmente aqueles com sintomas respiratórios, com uma
positividade variando entre 0,9 e 16,7% (Kupfer et al. 2006, Schenk et al. 2007, Costa et
al. 2009, Caccia et al. 2012). Em amostras do trato respiratório de pacientes
transplantados, a presença de HBoV foi detectada por qPCR específica para as regiões
NS1 e NP1, sendo que a positividade para esse vírus nos pacientes submetidos ao
transplante de medula óssea foi maior (16,7%) do que naqueles submetidos ao
transplante de pulmão (3,6%) e de fígado (10%) (Costa et al. 2009).
No presente estudo, foi observada uma elevada positividade (42,9%) para HBoV
nos pacientes submetidos ao TACPH. Em pacientes pediátricos imunocomprometidos,
com gastroenterite, a pesquisa de HBoV foi realizada por Nested-PCR e qPCR com
pares de iniciadores específicos para regiões genômicas VP1/VP2 e NS1,
respectivamente. A frequência de HBoV nas amostras de fezes foi de 14% (Portes et al.
2017).
Alguns fatores poderiam explicar a elevada frequência de HBoV encontrada
neste estudo como o acompanhamento prolongado e a disponibilidade de várias
amostras de fezes e soro de cada paciente, coletadas independentemente da presença de
sintomas, o que aumenta as chances de detecção do genoma viral; a utilização da qPCR,
uma técnica mais sensível quando comparada à PCR convencional, com primers e
sonda específicos para todos os genótipos de HBoV; o imunocomprometimento
provocado pelo tratamento, desde o período de condicionamento, passando pelo período
de pancitopenia, até o tratamento para a prevenção da DECH, o que aumenta ainda mais
a susceptibilidade às infecções por patógenos como bactérias, vírus e fungos (Wingard
et al. 2010).
47
Neste estudo, a carga viral nas fezes foi significativamente maior do que a carga
viral sérica. Dados da literatura revelam que a carga de HBoV nas fezes tem uma
mediana variando de 104 a 1010 cópias genômicas (Xu et al. 2011, Proenca-Modena et
al. 2013), sendo que as cargas mais elevadas foram detectadas em crianças
imunocomprometidas com gastroenterite (Portes et al. 2017). Em amostras séricas, a
carga de HBoV tem sido encontrada em menor concentração, variando entre 100 e 106
cópias genômicas (Endo et al. 2007, Kantola et al. 2010), o que poderia ser explicado
pelo tropismo, pelo menos por determinados genótipos de HBoV, pelo TGI e que
também o comprometimento do sistema imune possa favorecer a viremia e a maior
excreção de HBoV nas fezes, porém mais estudos são necessários para se confirmar
essas hipóteses.
No presente estudo foi observado que, em todos os pacientes, a maior excreção
viral nas fezes ocorreu dentro dos 100 primeiros dias após o transplante e que o pico da
carga viral ocorreu mais precocemente nesse tipo de amostra, quando comparado ao
pico das amostras séricas. Nos 100 primeiros dias após o TACPH, os pacientes possuem
risco aumentado de serem acometidos por infecções oportunistas, principalmente pelos
vírus da família Herpesviridae, por vírus respiratórios e vírus entéricos. Além disso,
nesse período, a profilaxia imunossupressora e o tratamento da DECH são importantes
fatores de risco para o aparecimento dessas infecções virais (Dropulic & Lederman
2016). Ainda, o aumento das cargas virais após o TACPH quando comparadas com as
cargas pré-TACPH, tanto no soro quanto nas fezes, pode sugerir que o organismo fica
mais susceptível à replicação e disseminação viral, devido ao dano mucocutâneo e
diminuição da imunidade causados pelo condicionamento mieloablativo.
A persistência do genoma de HBoV no organismo e a sua detecção em amostras
clínicas por períodos prolongados têm sido descritas em alguns estudos (Martin et al.
2010, Wagner et al. 2016), o que pode ser explicado pela formação de epissomas,
estruturas já encontradas para os quatro genótipos de HBoV, levando à possibilidade de
latência viral com posterior reativação da replicação, como já descrito para a família
Parvoviridae (Kapoor et al. 2011, Lusebrink et al. 2011, Zhao et al. 2012, Babkin et al.
2015). Além disso, há a possibilidade de transmissão nosocomial enquanto o paciente
está internado na unidade de transplante ou de que o mesmo paciente possa ter sido
reinfectado ou infectado por genótipos diferentes no decorrer do estudo.
Os HBoVs podem se disseminar pela via sanguínea, visto que seu genoma é
detectado em amostras séricas (Qiu et al. 2017). Comumente, a viremia por HBoV é
48
mais curta, durando cerca de duas semanas (Meriluoto et al. 2012, Kantola et al. 2015).
Porém, em pacientes imunocomprometidos a viremia pode ser mais prolongada,
podendo durar por pelo menos quatro semanas (Tozer et al. 2009). Na maioria dos
pacientes deste estudo, a viremia foi verificada após a detecção viral nas amostras
fecais, indicando que possivelmente o vírus replica-se primeiramente no TGI para
depois atingir a circulação sanguínea. Porém, não podemos excluir a possibilidade do
envolvimento do trato respiratório na patogenia do vírus.
Além da associação com quadros respiratórios, os HBoVs também são
considerados vírus entéricos (genótipos HBoV-2, -3 e -4) e diversos estudos relatam a
presença do seu genoma em amostras de fezes de pacientes com gastroenterite (Santos
et al. 2010, Kapoor & Dhole 2016, De et al. 2017). Os principais sintomas relacionados
à excreção de HBoV nas fezes são náusea, vômito e diarreia (Kapoor & Dhole 2016,
Lasure & Gopalkrishna 2017). As infecções virais são uma das causas mais comuns de
diarreia na população em geral. Depois do TACPH, os pacientes ficam ainda mais
propensos à diarreia de causa viral devido à imunossupressão, sendo a DECH um fator
de risco para tais infecções (Lin & Liu 2013). Ademais, em estudos anteriores
realizados em amostras clínicas obtidas dos mesmos pacientes do presente estudo foi
observada elevada positividade para norovírus e adenovírus, tanto no soro quanto nas
fezes, sendo o principal sintoma a diarreia (Lemes et al. 2014, Santos et al. 2017). No
presente estudo também foi observada importante frequência de gastroenterite, porém
essa manifestação clínica detectada nesses pacientes pode ter causas múltiplas, como a
quimioterapia utilizada durante o condicionamento, o desenvolvimento da DECH que
acomete o TGI e a presença de outros agentes virais.
Após sequenciamento genômico e análise filogenética foi possível observar que
em três amostras fecais, cada uma oriunda de um paciente distinto, houve detecção do
genótipo HBoV-1. Essas amostras apresentaram elevada identidade nucleotídica com
sequências obtidas de amostras fecais de pacientes pediátricos brasileiros, HIV
soropositivos, sendo que das amostras positivas 50% foram caracterizadas como HBoV-
1 (Portes et al. 2017). Apesar dessa variante viral estar associada a infecções
respiratórias, sua detecção em amostras fecais é comum (Jartti et al. 2012). Porém,
ainda não há estudos comprovando se sua presença nas fezes é decorrente de uma
replicação no TGI ou se corresponde apenas à excreção viral após a infecção
respiratória. Devido a limitações na obtenção das sequências genômicas das amostras
positivas, não foi possível estabelecer uma associação entre os genótipos de HBoV com
49
a detecção nas amostras fecais e séricas e com as manifestações clínicas, nem verificar
se a detecção prolongada foi devido a transmissão nosocomial, reinfecção ou infecção
por genótipos diferentes.
No Brasil, até então, nenhum estudo de acompanhamento em pacientes
submetidos ao TACPH foi realizado para a detecção de HBoV, principalmente em
amostras fecais e séricas. Desse modo, é de extrema importância a avaliação da
frequência e monitoramento dos HBoVs nesses pacientes, para que os dados obtidos
possam auxiliar na profilaxia de possíveis complicações clínicas causadas por esses
agentes virais.
50
7. CONCLUSÕES
A positividade para HBoVs foi elevada em pacientes acompanhados e submetidos ao
transplante alogênico de células progenitoras hematopoiéticas em um centro de
referência em transplantes de medula óssea do Brasil;
A carga de HBoV nas amostras fecais foi significativamente maior do que nas
amostras séricas. Além disso, houve um aumento nas cargas de HBoV pós-TACPH
em comparação às cargas pré-TACPH e as maiores concentrações virais foram
detectadas durante os 100 primeiros dias após o TACPH;
Nas fezes, os HBoVs apresentaram excreção prolongada, com dois padrões
principais: intermitente e contínuo. Ainda, na maioria dos casos, a viremia ocorreu
mais tardiamente do que a excreção de HBoV nas fezes;
Não houve significância estatística entre a presença de sintomas gastroentéricos e a
positividade para HBoV, visto que múltiplos fatores poderiam ter contribuído para a
ocorrência desses sintomas;
Todas as amostras sequenciadas foram caracterizadas como genótipo HBoV-1, sendo
observada elevada identidade nucleotídica entre elas.
51
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62
APÊNDICES
Apêndice 1. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
63
64
Apêndice 2. Ficha de investigação clínica de doença diarreica.
65
ANEXOS
Anexo 1. Parecer consubstanciado do Comitê de Ética em Pesquisa da UFG.
66
67
68
69
Anexo 2. Parecer consubstanciado do Comitê de Ética em Pesquisa do HAJ/ACCGO.
70
