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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Graduação em Biotecnologia
Trabalho de Conclusão de Curso
Fitorreguladores e anti-oxidantes na composição de semente sintética de batata seleção F630106.
Vinícius da Rosa da Silva Tavares
Pelotas, 2013
Vinícius da Rosa da Silva Tavares
Fitorreguladores e anti-oxidantes na composição de semente sintética de batata seleção F630106.
Trabalho acadêmico apresentado ao Curso de
Bacharelado em Biotecnologia da Universidade
Federal de Pelotas, como requisito parcial à
obtenção do título de Bacharel em
Biotecnologia.
Orientador do Estágio: Dr. Leonardo Ferreira Dutra
Orientador Acadêmico: Prof. Dr. Luciano da Silva Pinto
Pelotas, 2013
Dados de catalogação na fonte: Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901
Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
T231f Tavares, Vinícius da Rosa da Silva
Fitorreguladores e anti-oxidantes na composição de semente sintética de batata seleção F630106 / Vinícius da Rosa da Silva Tavares. – 45f. : il. – Trabalho de conclusão de curso (Graduação em Biotecnologia). Universidade Federal de Pelotas. Centro de Desenvolvimento Tecnológico. Pelotas, 2014. – Orientador Luciano Pinto ; co-orientador Leonardo Ferreira Dutra.
BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Luciano da Silva Pinto, Universidade Federal de Pelotas Dr. Leonardo Ferreira Dutra, Embrapa Clima Temperado Dra. Daiane Vargas, Embrapa Clima Temperado
Agradecimentos
Agradeço àqueles que me ajudaram nas coisas pequenas, àqueles que me
deram carona, àqueles que compartilharam materiais, àqueles que compartilharam
dores, àqueles que compartilharam companhia, àqueles que riram comigo, àqueles
que se desesperaram comigo, àqueles que foram honestos, àqueles que foram
simpáticos.
Agradeço àqueles que não mantiveram contato direto comigo por barreiras
físicas, mas que sempre estiveram juntos pelos meios virtuais. Agradeço àqueles
cujo contato foi perdido ao longo desses quatro anos, porém continuam presentes
na memória.
Agradeço àqueles que tiveram algo para ensinar, mesmo que fosse uma dura
lição. Agradeço até àqueles que não ajudaram, porém não atrapalharam.
Agradeço quem foi ruim, agradeço quem foi bom. Tudo é uma construção,
tudo é aprendizado, nada é jogado fora.
Resumo
TAVARES, Vinícius da Rosa da Silva Tavares. Fitorreguladores e anti-oxidantes na composição de semente sintética de batata seleção F630106. 2013. Trabalho de Conclusão de Curso — Curso de Bacharelado em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas.
Explantes de batata foram extraídos de uma seleção in vitro para o desenvolvimento de um protocolo de semente sintética. O endosperma artificial das sementes foi composto por meio MS com a matriz de Alginato de Sódio, sem a solução de cloreto de cálcio, com adição de diferentes reguladores de crescimento e anti-oxidantes como adjuvantes. No total foram preparados 16 meios diferentes com combinações da presença ou ausência dos fitorreguladores: 0,1 mgL-1 AIB e 0,2 mgL-1 BAP, e dos adjuvantes: 0,6% (p/v) carvão ativado e 1% (p/v) ácido cítrico. As sementes foram gelificadas gotejando meio com os explantes em solução de cloreto de cálcio para complexação e nitrato de potássio para descomplexação. As sementes foram mantidas em vermiculita, embaladas para manter a esterilidade, em estufas, por 30 dias, quando foram avaliadas pela germinação, sobrevivência, enraizamento e oxidação. Os valores de enraizamento e oxidação foram nulos, com 0% para todos os tratamentos. Os tratamentos com pelo menos um fitorregulador junto com pelo menos um adjuvante demonstraram maiores índices de germinação e sobrevivência. Os resultados apontaram que o ácido cítrico não pode ser utilizado em conjunto de muitos compostos por diminuir a germinação.
Palavras-chave: batata; semente sintética; cultura de tecidos.
Abstract
TAVARES, Vinícius da Rosa da Silva Tavares. Phytoregulators and antioxidants in the potato synthetic seed composition, selection F630106. 2013. Trabalho de Conclusão de Curso — Curso de Bacharelado em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas. Segments containing axilary buds from potato were extracted from an in vitro selection aiming to develop a synthetic seed protocol. The seed’s artificial endosperm was composed by MS medium without the calcium chloride solution, with sodium alginate, adding different plant hormones, BAP and IBA, and also two different antioxidants: activated carbon and citric acid. The segments were encapsulated in the alginate-MS matrix and put on vermiculite, where they stayed during 30 days, when they were evaluated for germination, oxidation, rooting and survival. Both oxidation and rooting values were null, achieving an index of 0% in every seed. The results shown that acid citric can not be used along both hormones, and using only one hormone without antioxidants or either using only one antioxidant without any hormones is ineffective on germination and survival rates. Key words: potato; synthetic seeds; plant tissue culture.
Lista de Figuras
Figura 1 Foto de uma semente sintética de batata com explante axilar
encapsulado, mostrando os componentes da
semente........................................................................................
28
Figura 2 Esquema de formação de cápsula de semente
sintética........................................................................................
29
Figura 3 Semente sintética de batata germinada....................................... 30
Lista de Tabelas
Tabela 1 16 Tratamentos utilizados no experimento.................................. 30
Tabela 2 Médias de sobrevivência e germinação de semente sintética de
batata após 30 dias......................................................................
31
Lista de Abreviaturas e Siglas
Fig. – Figura
BAP – 6-benzilaminopurina
AIB – Ácido indolbutírico
PVP - polivinilpirrolidone
SUMÁRIO
Introdução...................................................................................................................1
Objetivo.......................................................................................................................3
Revisão.......................................................................................................................4
Materiais e Métodos.................................................................................................13
Resultados e discussão...........................................................................................15
Conclusão e perspectivas.......................................................................................17
Anexos.......................................................................................................................18
Referências Bibliográficas......................................................................................22
1
1. INTRODUÇÃO
A batata (Solanum tuberosum L.) é uma importante fonte de alimento e
emprego rural, sendo a quarta cultura mais importante no mundo, depois do trigo,
arroz e milho. Na região sul colhe-se cerca de 1,2 milhão de toneladas por ano.
A espécie se originou nos Andes (Peru e Bolívia) de onde foi levada para a
Europa, lá, foi selecionada para a tuberização em dias longos e a partir daí foi
disseminada para países do mundo todo.
Vegetativamente, a batata é propagada através de tubérculos, porém isso
facilita a transmissão de doenças causadas por vírus. Para contornar tal problema,
atualmente é comumente aplicada a cultura in vitro de meristemas de batata. A
cultura de meristemas se baseia no fato de que a concentração de partículas virais é
diferente ao longo da planta, com uma menor concentração no ápice e uma maior
concentração na base. A produção de mudas a partir de meristemas já é
amplamente aplicada e comercialmente comum.
A tecnologia de semente sintética vem se tornando uma alternativa viável
para multiplicação de plantas devido as suas inúmeras vantagens, que unem a
tecnologia de cultivo in vitro (como a produção de plantas livres de vírus) com as
técnicas tradicionais de propagação por semente.
O uso dessa tecnologia para batatas aumentará a produtividade e facilitará o
armazenamento e transporte do produto, diminuindo custos e permitindo uma maior
produção de plantas livres de vírus.
O armazenamento de batata pode ser feito in vitro, através de repicagens
contínuas, porém esse o armazenamento em curto prazo implica em alterações na
estabilidade genética da planta. Uma alternativa de armazenamento se encontra no
congelamento em nitrogênio líquido de semente sintética de batata. As cápsulas
protegem o embrião de danos, ajudando a reduzir os problemas causados pela
técnica. O armazenamento em longo prazo é capaz de auxiliar nos programas de
melhoramento devido à possibilidade de utilizar plantas um longo período de tempo
após o cultivo.
2
Esse trabalho de conclusão de curso trata sobre o desenvolvimento de um
protocolo para elaboração do endosperma artificial das sementes sintéticas de
batata utilizando antioxidantes e reguladores de crescimento.
3
2. OBJETIVO
O trabalho tem como objetivo o determinar a constituição de endosperma
artificial para sementes sintéticas de batata, utilizando diferentes combinações de
AIB, BAP, ácido cítrico e carvão ativado para plantas de batata da seleção F630106.
4
3. REVISÃO
3.1. A batata (Solanum tuberosum L.)
A batata é uma dicotiledônea da família Solanaceae, de importância
econômica mundial por sua versatilidade gastronômica e industrial, podendo ser
servida de diversas formas, sendo um dos alimentos mais consumidos do mundo
(MÜLLER et al. 2008). A produção mundial supera 300 milhões de toneladas
anualmente em uma área de 19 milhões de hectares, sendo o Brasil responsável por
cerca de 3,9 milhões de toneladas por ano, as regiões Sul e Sudeste do Brasil são
as maiores produtoras, dentre as quais o estado de Minas Gerais se destaca como o
principal produtor brasileiro (IBGE, 2010; SILVA & PEREIRA, 2011).
Ela pertence ao gênero Solanum e possui mais de 2000 espécies, das quais
cerca de 160 produzem tubérculos. Apesar disso, apenas cerca de 20 espécies são
cultivadas, sendo que a mais popular é a Solanum tuberosum ssp. tuberosum
(HAWKES, 1993; SILVA & PEREIRA, 2011).
A espécie se originou nos Andes (Peru e Bolívia) de onde foi levada para a
Europa, lá, foi selecionada para a tuberização em dias longos e a partir daí foi
disseminada para países do mundo todo (SILVA & PEREIRA, 2011). As espécies
silvestres dos Andes ainda são de grande importância aos programas de
melhoramento (FORTES & PEREIRA, 2003).
5
A batata é propagada vegetativamente por meio de tubérculos (clones),
embora algumas cultivares floresçam e produzam sementes. A propagação clonal
possibilita que o vigor híbrido obtido a partir de cruzamentos seja mantido nas
gerações (SILVA & PEREIRA, 2011).
O cultivo in vitro de batata para micropropagação se encontra bem
estabelecido, com possibilidade de uso de meristemas, ápices caulinares,
segmentos nodais e gemas laterais. Pode-se modificar o meio de cultura
dependendo do resultado que se deseja obter (multiplicação rápida, manutenção de
germoplasma, obtenção de microtubérculos, entre outros) (PEREIRA & FORTES,
2003).
3.2. A Cultura de Tecidos
A cultura de tecidos vegetais é uma técnica biotecnológica utilizada para a
produção de clones, ou seja, produção de plantas geneticamente idênticas. Entre os
objetivos de se produzir clones, se podem citar o armazenamento de germoplasma,
multiplicação de plantas geneticamente idênticas, e produção de mudas livres de
patógenos (ANDRADE, 2002).
A partir de um explante vegetal (qualquer segmento de uma planta), que pode
ser um fragmento de caule, raiz, folha ou qualquer tecido com capacidade de
diferenciação (de preferência tecidos jovens e meristemáticos), há a possibilidade de
6
se induzir a brotação de uma nova planta em cultivo in vitro (ANDRADE, 2002). Isso
é possível devido à capacidade das células vegetais se proliferarem, se organizarem
em tecidos e posteriormente em plantas completas (KERBAUY, 1997).
A partir da cultura de tecidos, é possível gerar calos, que são massas
celulares disformes e indiferenciadas, usados em cultura de suspensão celular;
brotos, que podem ser enraizados e gerar uma nova planta, e, por fim, embriões
somáticos que possuem a capacidade de gerar um novo indivíduo completo
(ANDRADE, 2002).
A embriogênese somática é o processo de formação de embriões sem a
fusão de gametas. Desse modo, pode-se criar uma nova planta sem que ocorra
mistura de material genético, produzindo, portanto, um clone. Um embrião somático
pode ser produzido a partir de uma célula haploide, diploide ou até somática
(MONDO & CICERO, 2008).
Embriogênese somática pode ser feita por dois mecanismos: através de
calos, chamada de embriogênese indireta; ou diretamente através de explantes das
plantas, a embriogênese direta (RAVI & ANAND, 2012). A embriogênese direta se
baseia no princípio da totipotencialidade das células vegetais, que permite que uma
célula vegetal se desdiferencie e se diferencie em outra célula (MONDO & CICERO,
2008).
7
A embriogênese somática é utilizada, além para a produção de sementes
sintéticas, para a obtenção de plantas transgênicas (PRAKASH & VARADARAJAN,
1992; GAMA, 1993). Em alguns casos para sementes sintéticas se utiliza ramos
laterais invés de embrião somático (BAPAT et. al, 1988).
3.3. Micropropagação de batata
A batata é propagada vegetativamente por tubérculos, o que acaba facilitando
a transmissão de doenças causadas por vírus. Essas doenças são responsáveis por
uma perda de até 90% da produtividade das plantações de batata, por provocarem
degenerescência. Uma das formas mais utilizadas para obter material propagativo
isento de vírus é através do cultivo de ápices caulinares (meristemas) sob condições
in vitro, ou seja, através da micropropagação (DUTRA et al., 2010).
O método de cultura de meristema se baseia no fato que as partículas virais
não se encontram distribuídas igualmente ao longo da planta, mas sim a sua
concentração decresce da base em direção ao ápice (DUTRA et al. 2010).
A cultura de tecidos de batata começou a ser estudada na década de 1950
(BAJAJ & SOPORY, 1988), e desde então muitos trabalhos foram realizados
visando o aperfeiçoamento dos protocolos (CHAPMAN, 1955; MOREL & MARTIN,
1955; KASSANIS, 1957). Atualmente a micropropagação in vitro de batata é
8
utilizada rotineiramente para a produção de plantas com alta qualidade fitossanitária
(DUTRA et al., 2010).
A batata pode ser propagada com meio de cultura semissólido (normalmente
utilizando o ágar), ou meio líquido, ou por técnicas sofisticadas de biorreatores
(DUTRA et al., 2010).
3.4. Semente Sintética
O surgimento de sementes no reino vegetal proveu a capacidade de propagar
os embriões vegetais de maneira segura e eficiente. As sementes são o método
mais apropriado para proteção, armazenamento e dispersão de material genético
vegetal (RAVI & ANAND, 2012). A semente sintética mimetiza a semente zigótica (a
semente natural), tendo uma cobertura artificial, um endosperma artificial, composto
por meio nutritivo, e o propágulo (Figura 1). Esse propágulo pode ser um embrião
somático, ou um broto, ou um tecido que possa ser usado para cultura in vitro e ex
vitro (MONDO & CICERO, 2008).
Ao surgimento do conceito de semente sintética, dado por Murashige em
1977, foi-se dito que a técnica era apenas viável com aquelas plantas nas quais era
possível induzir embriogênese somática. Porém, posteriormente, Bapat e
colaboradores (1987) propuseram o uso de outros propágulos derivados de cultivo in
vitro nas sementes sintéticas, utilizando gemas axilares de Morus indica, como o
9
primeiro exemplo dessa nova aplicação. O trabalho ampliou o conceito de semente
sintética, inovando o uso da tecnologia e ampliando suas aplicações: o que antes
era limitado a embriões somáticos, a partir de então poderia ser feito com gemas
axilares, hipocótilos, segmentos nodais, calos, entre outros, a partir de então muitos
trabalhos começaram a surgir utilizando outros materiais além de embriões
somáticos (LAMBARDI et al., 2006)
Os explantes são normalmente encapsulados em materiais crioprotetores,
como gel de alginato, etilenoglicol, Dimetilsulfóxido (DMSO), entre outros. O
encapsulamento protege o explante de danos físicos e permite que a germinação
ocorra sem induzir variações indesejáveis, agindo como verdadeiras sementes e
permitindo a germinação sob condições adequadas (RAVI & ANAND, 2012), além
de ter como outras vantagens, o fácil armazenamento, transporte e conversão em
plantas. É graças a esse encapsulamento que se torna possível a utilização das
sementes sintéticas nas casas de vegetação ou no campo (MONDO & CICERO,
2008).
A tecnologia de sementes sintéticas pode ser automatizada para produção em
massa de material encapsulado com alginato. Uma máquina de encapsulamento
aleatório já foi desenvolvida, com uma eficácia de 8000 cápsulas por minuto, esse
número, porém, considera as cápsulas vazias. Porém, há outra máquina
10
desenvolvida que é capaz de separar as cápsulas vazias das carregadas utilizando
a visualização através de um scanner (ONISH et al., 1994).
Às vantagens da semente sintética unem-se às vantagens da propagação
clonal com as da propagação de sementes, entre elas pode-se citar a produção de
grande quantidade de propágulos em curto espaço de tempo, manutenção da
identidade clonal, semeadura direta em campo, facilitar programas de melhoramento
com plantas cujo cruzamento é muito demorado, facilidade de armazenamento,
diminuição dos “anos de baixa produção”, eliminação de estruturas caras de
aclimatação, possibilidade de semear, entre outras (LAMBARDI et al., 2006,
MONDO & CICERO, 2008; RAVI & ANAND, 2012).
Infelizmente, são os baixos índices de germinação no solo de propágulos de
alta qualidade, de acordo com RAVI & ANAND (2012), o maior bloqueio para o uso
de sementes sintéticas como uma tecnologia viável, além da falta de entendimento
completo em relação à embriogênese somática.
Várias espécies já foram encapsuladas, tais como Morus nigra, Morus alba
(obtendo 95% de germinação) (PATTNAIK & CHAIND, 2000), Citrus reticulata
“Avana” (26% de germinação) (GERMANÀ et al. 1999), Cleopatra tangerine (93% de
germinação) (NIEVES et al. 1998), entre muitas outras.
3.5. Preparação de Sementes Sintéticas
11
Como dito previamente, as sementes são formadas por um material de
revestimento e um endosperma artificial para a nutrição do explante. Para a
composição da cápsula de revestimento foram testados diversos materiais
diferentes, tais como ágar, agarose, alginato, carboximetilcelulose, carrageninas,
gelrite, nitrocelulose, poliacrilamida, polyox, entre outros (DATTA et al. 2001;
SAIPRASAD 2001; LAMBARDI et al. 2006).
Esses materiais podem ser utilizados de acordo com a necessidade ou
situação, e de acordo com a espécie utilizada. Por exemplo, Kitto e Janick (1985)
testaram oito compostos químicos para as cápsulas das sementes sintéticas, e
demonstraram que o polímero polietileno óxido homopolímero (“polyox”) foi o melhor
para encapsular sementes sintéticas de explantes embriogênicos (calos, agregados,
células e embriões) de cenoura (LAMBARDI et al. 2006).
Redenbaugh et al. (1988) propôs pela primeira vez o uso de uma solução de
Na-Alginato que poderia se transformar em uma solução endurecida de Ca-Alginato
através de uma reação de troca de íons. A germinação de sementes de alfafa
encapsuladas em alginato foi superior a 85%, desde então, alginato tem sido o
agente de gelificação mais usado na preparação de sementes sintéticas (LAMBARDI
et al. 2006).
O hidrogel de alginato possui características adequadas para a função de
revestimento, tais como viscosidade moderada, baixa toxicidade e rápida gelificação.
12
A rápida gelificação é útil para o método de “endurecimento de gotas”
(REDENBAUGH et al. 1993). Este método consiste em gotejar solução de alginato
(0,5 – 5% m/v) contendo o explante vegetal em uma solução de complexação, que
pode ser um sal di- ou tri-valente de cálcio, como o cloreto de cálcio (30 – 100 mM),
de modo que aconteça reação entre as soluções e a gota endureça, formando a
cápsula da semente sintética. O processo de endurecimento normalmente dura
entre 10 e 60 minutos, seguida por lavagem em água para remover os íons de cálcio
em excesso (ONISHI et al., 1994). Entre outras vantagens, pode-se citar a excelente
solubilidade em água, a fácil obtenção por baixo custo, a facilidade de
armazenamento em longo prazo da solução Na-Alginato, a possibilidade de gerar
sementes com diferente rigidez (a partir da mudança da concentração do alginato ou
do tempo de troca de íons entre alginato e a solução de complexação), e a
possibilidade de misturar o alginato com meio nutritivo para a produção do
endosperma artificial (LAMBARDI et al. 2006)
Porém, foi retratada a falta de elasticidade ideal e a deficiência de oxigênio
dentro do gel, dificultando a germinação das sementes. Além disso, o alginato
produz sementes com superfícies que facilmente aderem a outras substâncias,
tornando difícil a separação. Outra limitação é a rápida desidratação das sementes
após a exposição ao ar. Para isso, foi desenvolvido um método de “quebra de
dormência” da semente sintética, nesse método, as sementes, após a lavagem em
13
água destilada, são mergulhadas em uma solução monovalente de cátions (como o
Nitrato de Potássio, por exemplo), chamada de “solução de descomplexação”,
seguida em outra lavagem por água destilada. Esse método fragiliza as sementes e
contorna os problemas do alginato, enquanto mantém a proteção mecânica das
sementes (LAMBARDI et al. 2006; ONISHI et al. 1994).
Além de prover proteção mecânica para o explante, a semente também deve
ser capaz de prover os nutrientes necessários para que esse explante possa se
desenvolver em uma nova planta ou broto (no caso de embriões ou gemas axilares)
ou de se regenerar (no caso de células ou calos). Ou seja, deve ser capaz de
entregar os nutrientes e reguladores de crescimento de modo que o explante possa
germinar, ao mesmo tempo em que permite armazenamento, transporte e proteção
(LAMBARDI et al., 2006).
O principal método para obter sementes com endosperma artificial e cápsula
suficientemente rígida é o desenvolvimento de meio nutritivo (como o MS, por
exemplo), sem solução de cálcio, com alginato como composto gelificante (o
alginato substituiria o ágar, por exemplo, em meios nutritivos). Para o processo de
endurecimento, uma solução estéril de alginato (normalmente, com o meio nutritivo)
é misturada com o explante em um pequeno recipiente de vidro, em condições
estéreis de uma cabine de fluxo laminar. Deste recipiente, os explantes são sugados
com uma micropipeta (com a ponteira cortada, de modo que se aumente o diâmetro
14
para 2-4 mm) junto com a solução de alginato. O alginato é então gotejado gota-a-
gota (cada gota contendo um explante) na solução estéril do agente de complexação
(cloreto de cálcio ou nitrato de cálcio, por exemplo). A reação de troca de íons ocorre
no qual o cálcio substitui o sódio da cápsula. Após o endurecimento, as sementes
sintéticas são coletadas e lavadas em água destilada (ou deionizada) estéril (Fig.
2A-D) (LAMBARDI et al. 2006). No meio nutritivo, pode-se adicionar fitorreguladores,
antioxidantes e quaisquer aditivos já utilizados em meios de cultura (MONDO &
CICERO, 2008).
Diversos aparatos foram construídos para a produção de sementes sintéticas
que utilizam o método de endurecimento de alginato, de modo que o processo possa
ser automatizado e as sementes possam ser produzidas a uma velocidade rápida
(SAKAMOTO et al., 1992). Além de uma máquina de produção de sementes,
também foi desenvolvido um aparato para a separação das cápsulas vazias das
cápsulas carregadas, na qual as carregadas já são despejadas na solução de
descomplexação (SAKAMOTO et al. 1992). Essas duas máquinas podem ser
acopladas para trabalharem juntas e aumentar a eficiência da produção de
sementes sintéticas (ONISHI et al. 1994).
Porém, uma alta porcentagem de cápsulas demonstrou carregar dois
embriões (38,2%) ou nenhum embrião (33,2%). Apenas 28,6% das cápsulas
15
estavam carregadas com apenas um explante. O aparelho de produção é capaz de
produzir 8320 cápsulas (carregadas ou não) por minuto (ONISHI et al. 1994).
Recentemente, métodos alternativos ao convencional “gota-a-gota” foram
propostos, como a “semente sintética parcialmente encapsulada”, no qual são
produzidas cápsulas vazias de alginato, em que são feitas perfurações e o explante
é inserido, de modo que o explante não fique totalmente em volta da matriz. Apesar
de ter suas vantagens, como o fato do embrião não ser inibido de crescer por
inibição física, ainda é um procedimento mais complexo que o tradicional “gota-a-
gota” e, por isso, não tem sido tão utilizado (MAMIYA & SAKAMOTO, 2001;
LAMBARDI et al. 2006).
3.6. Armazenamento de batata
Armazenamento de batata in vitro consome muito tempo e gera muitas
despesas. A preservação em médio prazo é feita por culturas in vitro devido à baixa
necessidade de usar muitos reguladores, porém, condições de média duração não
garantem uma boa estabilidade genética. Harding, 1991, já descreveu alterações no
RNA ribossomal de Solanum tuberosum cv. Désirée. Portanto, o armazenamento em
longo prazo em nitrogênio líquido é preferido para uma preservação de
germoplasma de batata (BOUAFIA, 1996).
16
Um novo método de criopreservação de batata começou a ser testado em
1996, por Bouafia, no qual foi feita a criopreservação de gemas apicais desidratadas
em sementes sintéticas de alginato. Bouafia conseguiu taxas entre 50% e 64% de
regeneração pós-congelamento em duas cultivares de S. tuberosum testadas
(KACZMARCZYK et al., 2011). Diversos autores, desde então, realizaram
congelamento de S. tuberosum com o método de encapsulamento e desidratação,
tais como Benson et al., 1996, Harding & Benson, 2001, entre outros.
Atualmente, o Centro Internacional de Batata (International Potato Center),
em Lima no Peru, conserva genótipos de batata congelados em nitrogênio líquido,
além de manter cultivo de batata in vitro (KACZMARCZYK, 2011).
3.7. Anti-oxidantes em sementes sintéticas
No endosperma artificial, assim como em meios de cultura, podem-se
adicionar fitorreguladores e adjuvantes para melhorar o desempenho dos resultados
(MONDO & CICERO, 2008).
Um dos problemas decorrentes do cultivo in vitro se deve a oxidação dos
explantes, ocorrendo o mesmo com as sementes sintéticas. A oxidação pode ocorrer
devido à produção de compostos fenólicos, que são liberados devido ao dano
causado pela excisão dos explantes (ALBINO et al., 2010).
17
Para evitar a produção de compostos fenólicos, é recomendado utilizar anti-
oxidantes no meio, tais como carvão ativado, ácido ascórbico, e PVP. Além disso,
também é possível deixar os explantes inicialmente no escuro, sem o uso de
adjuvantes (ALBINO et al., 2010).
O carvão ativado age na adsorção e liberação dos nutrientes do meio
nutritivo, além de absorver os compostos liberados pelo explante. O ácido cítrico, por
outro lado, não age em relação aos compostos fenólicos, mas sim reagindo com os
metais presentes no meio de cultura, evitando que eles fiquem disponíveis para se
oxidarem (ALBINO et al. 2010; GEORGE, 1996).
Atualmente, o carvão ativado é comumente utilizado em baixas quantidades
(0,8 gL-1) no cultivo in vitro de meristemas (ápice caulinar) de batata (DUTRA, 2010).
18
4. MATERIAIS E MÉTODOS
O material vegetal foi proveniente de uma seleção de batata da
Embrapa Clima Temperado, mantida in vitro no Laboratório de Cultura de Tecidos,
onde o experimento foi realizado.
Para o endosperma artificial das sementes sintéticas foi preparado o
meio nutritivo MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) sem a solução de Cloreto de
Cálcio, com 3% (p/v) de sacarose e adição de 5% (p/v) de Alginato de Sódio.
Também se preparou, separadamente, soluções de 14,7 gL-1 de Cloreto de Cálcio e
10,1 gL-1 de Nitrato de potássio (adaptado de REDENBAUGH et al. 1993). Ambas as
soluções e os meios nutritivos foram regulados para pH 5,8 e autoclavados.
Foram preparados 16 diferentes tratamentos para o endosperma
artificial, constarando da combinação da adição (ou não), no meio MS, dos
fitorreguladores BAP e AIB (nas concentrações de 0,2 mgL-1 e 0,1 mgL-1,
respectivamente) e dos anti-oxidantes carvão ativado e ácido cítrico (0,6% p/v e 1%
p/v, respectivamente). As concentrações permaneceram as mesmas,
independentemente do tratamento, diferindo apenas em relação à presença ou não
do adjuvante/fitorregulador. Os adjuvantes e fitorreguladores foram adicionados ao
meio antes do ajuste do pH e da autoclavagem. A adição do alginato foi após o
ajuste do pH e antes da autoclavagem.
19
Os 16 tratamentos foram numerados da seguinte forma: 1- MS sem
adição de adjuvantes e reguladores; 2- MS com BAP; 3- MS com AIB; 4- MS com
carvão ativado; 5- MS com ácido cítrico; 6- MS com BAP e AIB; 7- MS com BAP e
carvão ativado; 8- MS com BAP e ácido cítrico; 9- MS com AIB e carvão ativado; 10-
MS com AIB e ácido cítrico; 11- MS com AIB, BAP e carvão ativado; 12- MS com
AIB, BAP e ácido cítrico; 13- MS com AIB, BAP, carvão ativado e ácido cítrico; 14-
MS com AIB, carvão ativado e ácido cítrico; 15- MS com BAP, carvão ativado e
ácido cítrico; 16- MS com carvão ativado e ácido cítrico (Tabela 1).
Os explantes utilizados foram segmentos nodais de menos de 1 cm
contendo gema axilar de batata mantida in vitro, os quais foram segmentados com
bisturi em câmara de fluxo laminar.
O meio foi solidificado pelo método de endurecimento de gota, no qual a
solução de meio MS e Alginato de Sódio com um explante é gotejada com uma
micropipeta de ponteira cortada na solução de Cloreto de Cálcio para a
complexação, onde ficaram por 20 minutos. Após, as sementes foram lavadas em
água deionizada estéril, e foram mergulhadas na solução de Nitrato de Potássio
para a descomplexação, em que permaneceram por 15 minutos.
Após a descomplexação, as sementes foram, novamente, lavadas em
água deionizada estéril, e colocadas em vermiculita autoclavada e deixadas em casa
de vegetação por 30 dias, em caixas embaladas de modo a permitir a esterilidade do
20
ambiente. Decorridos os 30 dias, as sementes foram avaliadas em relação a
germinação, número de brotos, enraizamento, sobrevivência e oxidação.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em arranjo
fatorial 2x2 (2 anti-oxidantes x 2 reguladores de crescimento) e a comparação das
médias foi feita com emprego do programa Sisvar, pelo teste Scott-Knot (1974).
21
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As maiores sobrevivências das plantas nas sementes sintéticas, foram
observadas nos meios 6 (BAP e AIB), 7 (Carvão e BAP), 8 (Ácido Cítrico e AIB), 9
(Carvão ativado e AIB), 10 (Ácido cítrico e AIB), 11 (Carvão ativado, AIB e BAP) e 16
(Carvão ativado e ácido cítrico) e diferiram significativamente do restante dos
tratamentos (Tabela 2).
Em relação à germinação, os meios 6, 7, 8, 9, 10 e 11 foram
significativamente superiores aos demais (Tabela 2).
As demais variáveis avaliadas não obtiveram resultado significativo
devido ao valor irrelevante que alcançaram, ou seja, não houve um valor relevante
de enraizamento (11% apenas no tratamento 8, enquanto zero nos demais), a
quantidade de plantas oxidadas foi nula (0% em todos os tratamentos), e o número
de brotos se relaciona diretamente com a germinação, pois não houve brotação
dentro da semente.
Observando, então, ambos os resultados de germinação e
sobrevivência, se conclui que os meios meios 6 (BAP e AIB), 7 (Carvão e BAP), 8
(Ácido Cítrico e AIB), 9 (Carvão ativado e AIB), 10 (Ácido cítrico e AIB), 11 (Carvão
ativado, AIB e BAP) são capazes de garantir tanto a sobrevivência, quanto a
germinação dos explantes de batata em sementes sintéticas, enquanto o meio 16
22
(Carvão ativado e ácido cítrico) apenas permite a sobrevivência, porém não a
germinação.
Analisando os meios indicados, percebe-se que todos, com exceção do
meio 11, possuem apenas dois componentes. No caso do tratamento 6, são ambos
fitorreguladores, os tratamentos 7, 8, 9 e 10, possuem, cada um, um fitorregulador e
um adjuvante, indicando que o tipo de fitorregulador ou o adjuvante não são
importantes para a sobrevivência e germinação da semente, apenas que a interação
entre dois componentes exista. Por outro lado, quando a semente possuía mais de
dois componentes adicionados, a germinação foi inibida e os explantes morreram,
indicando que o uso exagerado de adjuvantes e fitorreguladores pode causar uma
interação tóxica para o explante, sendo o caso dos meios 12 (Ácido cítrico, BAP e
AIB), 13 (Carvão ativado, ácido cítrico, BAP e AIB), 14 (Carvão ativado, ácido cítrico
e AIB) e 15 (Carvão ativado, ácido cítrico e BAP). E, quando a semente possuía
apenas um componente, o estímulo não foi forte o suficiente para induzir a
germinação e garantir a sobrevivência, o que foi o caso dos meios 1 (nenhum
aditivo), 2 (BAP), 3 (AIB), 4 (Carvão ativado) e 5 (Ácido cítrico).
Porém, ao analisar a exceção para o caso, observa-se que as
afirmações sobre a toxicidade não são completamente verdadeiras. O meio 11
possui interação de três componentes, sendo ambos os fitorreguladores e carvão
ativado, e ainda assim não diferiu significativamente em relação à germinação dos
23
meios 6, 7, 8, 9 e 10. É possível que o carvão ativado tenha adsorvido os
componentes os hormônios, e liberado aos poucos, diminuindo a quantidade de
químicos no meio, reduzindo a toxicidade gerada, o que não aconteceu nos meios
12, 13, 14, 15 e 16 pois o carvão ativado não foi capaz de adsorver a quantidade de
ácido cítrico, enquanto foi capaz de adsorver os hormônios, gerando toxicidade aos
explantes (INCI, 2004).
Em trabalhos com bacupari, o carvão ativado se mostrou eficaz em
controlar a oxidação dos explantes, enquanto o ácido cítrico mostrou-se sem
influência (ALBINO et al. 2010)
No caso do meio 16, no qual não há hormônios, porém há os dois
adjuvantes, houve sobrevivência significativa, porém a germinação foi inibida.
Neste sentido, para garantir tanto a sobrevivência quanto a germinação
da semente sintética de batata, é necessária a presença de ou AIB ou BAP,
juntamente com ou carvão ativado ou ácido cítrico. É possível o uso de ambos os
fitorreguladores juntos, desde que não seja junto de ácido cítrico, pois haverá
toxicidade e a germinação será inibida. O ácido cítrico poderá ser usado para obter
germinação desde que com apenas um fitorregulador, ou AIB, ou BAP, nunca
ambos.
Apesar disso, os resultados para germinação ainda foram inferiores aos
resultados esperados, com o maior índice de germinação sendo apenas de 33%,
24
apesar desse índice ainda ser maior que o obtido pelo tratamento controle (meio 1),
o qual foi de 0%. Isso pode ser devido à idade da planta-matriz da qual foram
retirados os explantes para o trabalho, a planta exibia sinais de envelhecimento, tais
como formação de tubérculos no meio de cultura.
WAGNER & GREEF, 2002, reportaram 100% de germinação em
sementes sintéticas de meio MS após seis meses de armazenamento a 4 e 10°C, e
61,8% de germinação após nove e 12 meses de armazenamento a 4 e 10°C com
meristemas apicais de cultivares quenianas e germânicas de batata.
25
6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Para obter os maiores índices de sobrevivência e germinação de semente
sintética de batata, pode-se usar, no endosperma artificial da semente, tanto AIB
quanto BAP, junto dos anti-oxidantes carvão ativado ou ácido cítrico. É possível
utilizar ambos os fitorreguladores juntos, desde que não haja a presença de ácido
cítrico no meio de cultura.
Os tratamentos indicados para a formação do endosperma artificial são:
1. 0,2 mg.L-1 BAP e 0,1 mgL-1 AIB;
2. 0,6% Carvão Ativado, 0,2 mgL-1 BAP
3. 1% Ácido Cítrico, 0,2 mgL-1 BAP
4. 0,6% Carvão Ativado, 0,1 mg.L-1 AIB
5. 1% Ácido Cítrico, 0,1 mg.L-1 AIB
6. 0,6% Carvão Ativado, 0,2 mg.L-1 BAP e 0,1 mg.L-1 AIB
Após o desenvolvimento do protocolo ideal para semente sintética de batata,
planeja-se desenvolver um experimento de armazenamento das cápsulas em
nitrogênio líquido.
26
Figura 1 - Foto de sementes sintéticas de batata com explante encapsulado,
mostrando os componentes da semente. Fotos de LAMBARDI et al., 2006.
27
Figura 2 - Esquema de formação de cápsula de semente sintética A- Explantes
vegetais mergulhados em meio com alginato, sendo pescados com micropipeta; B-
Explante com alginato pronto para ser gotejado em solução de Cloreto de Cálcio; C
– Gotas de alginato com explante em solução de Cloreto de Cálcio para
endurecimento; D- Sementes sintéticas depois de lavagem em água destilada pós-
complexação. Fotos de LAMBARDI et al., 2006.
28
Figura 3. Semente sintética de batata germinada. Embrapa Clima Temperado,
Pelotas, 2010.
29
Tabela 1 - 16 Tratamentos utilizados no experimento. O meio nutritivo utilizado foi o
meio Murashige & Skoog sem a solução de Cloreto de Cálcio, com 3% (p/v) de
Sacarose. O meio foi adicionado de 5% (p/v) de Alginato. As porcentagens dos
adjuvantes estão em p/v. Tratamento Adjuvante Regulador
1 Não Não 2 Não 0,2 mg.L-1 BAP 3 Não 0,1 mg.L-1 AIB 4 0,6% Carvão Ativado Não 5 1% Ácido Cítrico Não 6 Não 0,2 mg.L-1 BAP e 0,1 mg.L-1
AIB 7 0,6% Carvão Ativado 0,2 mg.L-1 BAP 8 1% Ácido Cítrico 0,2 mg.L-1 BAP 9 0,6% Carvão Ativado 0,1 mg.L-1 AIB
10 1% Ácido Cítrico 0,1 mg.L-1 AIB 11 0,6% Carvão Ativado 0,2 mg.L-1 BAP e 0,1 mg.L-1
AIB 12 1% Ácido Cítrico 0,2 mg.L-1 BAP e 0,1 mg.L-1
AIB 13 0,6% Carvão Ativado e 1%
Ácido Cítrico 0,2 mg.L-1 BAP e 0,1 mg.L-1
AIB 14 0,6% Carvão Ativado e 1%
Ácido Cítrico 0,1 mg.L-1 AIB
15 0,6% Carvão Ativado e 1% Ácido Cítrico
0,2 mg.L-1 BAP
16 0,6% Carvão Ativado e 1% Ácido Cítrico
Não
30
Tabela 2 - Médias de sobrevivência e germinação de semente sintética de batata
após 30 dias. Médias seguidas da mesma letra minúscula não diferem
estatisticamente entre si quanto à sobrevivência. Médias seguidas da mesma letra
maiúscula não diferem estatisticamente entre si quanto à germinação. Tratamento Sobrevivência Germinação
1 0 B 0 b 2 0 B 0 b 3 0 B 0 b 4 0 B 0 b 5 0 B 0 b 6 88,6 A 22 a 7 83 A 33 a 8 55 A 11 a 9 75 A 16,5 a
10 55,3 A 11 a 11 66 A 33 a 12 16,5 B 0 b 13 16,5 B 0 b 14 0 B 0 b 15 33 B 0 b 16 66,5 A 0 b
31
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