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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Faculdade de Nutrição
Programa de Pós Graduação em Nutrição e Alimentos
Dissertação
A influência da exposição e retirada de uma dieta de cafeteria sobre os
parâmetros comportamentais, metabólicos e neuroquímicos de ratos Wistar
Gabriela Kurz da Cunha
Pelotas, 2016
Gabriela Kurz da Cunha
A influência da exposição e retirada de uma dieta de cafeteria sobre os
parâmetros comportamentais, metabólicos e neuroquímicos de ratos Wistar
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Nutrição e Alimentos da
Faculdade de Nutrição da Universidade Federal
de Pelotas, como requisito parcial à obtenção
do título de Mestre em Nutrição e Alimentos
(área do conhecimento: Nutrição Clínica).
Orientador: Giovana Duzzo Gamaro
Co-orientador: Rachel Krolow Santos Silva Bast
Pelotas, 2016
Banca Examinadora:
1 Prof. Dra. Giovana Duzzo Gamaro (Universidade Federal de Pelotas – UFPel)
(Presidente – Orientadora)
2 Prof. Dra. Rachel Santos Silva Krolow Bast (Universidade Católica de Pelotas –
UFPel) (Coorientadora)
3 Prof. Dra. Renata Abib (Universidade Federal de Pelotas – UFPel) (Titular)
4 Prof. Dra. Rejane Tavares (Universidade Federal de Pelotas – UFPel) (Titular)
5 Prof. Dra. Márcia Rúbia Duarte Buchweitz (Universidade Federal de Pelotas-
UFPel) (Suplente)
Dedico este trabalho aos meus pais, por todo o apoio e incentivo de sempre.
Agradecimentos
Agradeço a Deus.
A minha orientadora, Giovana Gamaro, pela possibilidade da realização deste
trabalho e por todos os ensinamentos ao longo do mestrado.
A minha Co-Orientadora, minha amiga Rachel Krolow, por todo apoio,
dedicação, tranquilidade e ensinamentos passados, não só pelo estudo, mas para a
minha vida. És minha inspiração profissional, é um prazer enorme te ter do meu
lado, sou eternamente grata a ti por tudo. Meu muito obrigada, de coração.
Aos meus pais, Adriana e Humberto, sem eles eu nada seria. Obrigada por
me possibilitarem sonhar, e principalmente por sempre me apoiarem e auxiliarem na
realização desses sonhos. Muito obrigada, é tudo por vocês.
Meu namorado, Leonardo, pelo companheirismo, amizade, amor e dedicação
de todos os dias, és muito importante na realização desse sonho.
Aos funcionários do Biotério Central, pela auxilio e dedicação durante a
realização do experimento, em especial a Fabi, por ser sempre tão carinhosa, me
auxiliando e sendo de extrema importância para a realização desse trabalho.
Grupo NeuroCell e NeuroCan, em especial aos alunos Pathise, Mayrara,
Clara e Priscila, por me auxiliarem durante o processo e possibilitarem esse
trabalho. Além da Francine, inicialmente apenas uma colega, mas que se tornou
uma grande amiga durante esses 2 anos. Meu sincero obrigada.
Universidade Federal de Pelotas e Programa de Pós Graduação em Nutrição
e Alimentos por me possibilitarem na realização desse trabalho/sonho.
“Eu não sou quem eu gostaria de ser;
Eu não sou quem eu poderia ser, ainda;
Eu não sou quem eu deveria ser.
Mas graças a Deus,
Eu não sou mais quem eu era”.
Martin Luther King
Resumo
CUNHA, Gabriela. A influência da exposição e retirada de uma dieta de cafeteria sobre os parâmetros comportamentais, metabólicos e neuroquímicos de ratos Wistar. 2016. 80F. Dissertação (Mestrado em Nutrição e Alimentos) – Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Alimentos, Faculdade de Nutrição, Universidade Federal de Pelotas, 2016. Nas últimas décadas o Brasil vem passando por um processo de transição nutricional, caracterizado pelo rápido declínio da prevalência de desnutrição e elevado aumento das taxas de sobrepeso/obesidade. E sabe-se que hábitos alimentares desregrados, como por exemplo, o consumo frequente de fast food, elevado consumo de alimentos com alto teor calórico e de gordura, alimentos com baixo teor de fibra e ingestão excessiva de bebidas adoçadas são fatores de risco para obesidade. Sendo assim, utilizamos a dieta de cafeteria, com o objetivo de avaliar as alterações comportamentais e neuroendócrinas do consumo crônico e retirada permanente desta dieta palatável durante as fases do desenvolvimento. A dieta de cafeteria foi composta por alimentos palatáveis: salgadinho, wafer, biscoito recheado, salsicha e leite condensado. Os grupos que recebiam essa dieta possuíam a livre escolha para consumo contínuo de água e ração padrão. Os animais receberam as dietas a partir do 21° dia de vida e o experimento durou 7 semanas. Foram utilizados 36 ratos Wistar machos, divididos em 3 grupos, controle (C), que recebeu dieta padrão, dieta de cafeteria (DC) que recebeu dieta de cafeteria do 21º dia de vida até o 70º dia de vida, e retirada (R) que recebeu dieta de cafeteria até o 35º dia de vida, sendo ela depois substituída por ração padrão até 70º dia de vida. Como era esperado, o consumo de dieta de cafeteria em alguma fase da vida, aumentou o peso corporal dos animais quando comparado ao controle. Os animais do grupo DC apresentaram um indicativo de comportamento ansioso, na tarefa do campo aberto, pois apresentaram uma maior latência para sair do primeiro quadrado e explorar o aparato. O consumo crônico desta dieta levou a alterações metabólicas periféricas como aumento da glicemia, aumento da leptina plasmática, assim como, aumento da gordura abdominal, inguinal e aumento do peso das adrenais. No entanto quando a DC foi retirada na adolescência esses parâmetros metabólicos retornaram aos mesmos níveis dos animais que receberam apenas ração padrão. No hipocampo, foram observadas alterações como, diminuição na expressão de receptores de glicocorticoides (GR), da proteína oxido nítrico sintase neuronal (nNos) e no receptor tropomiosina Cinase B (TRKB), e uma resposta oxidativa celular equilibrada. Contudo, esses achados indicam que a dieta de cafeteria ao longo da vida induziu um comportamento ansioso que, em parte, pode ser justificado pela as alterações neuroendócrinas encontradas tanto no metabolismo periférico como no hipocampo destes animais. Além disso, interessante é que a retirada abrupta no período da adolescência foi capaz de reverter, pelo menos em parte, algumas destas alterações.
Palavras Chave: dieta de cafeteria; retirada; ansiedade; alterações neuroendócrinas; obesidade
Abstract
In recent decades, Brazil has been undergoing a process of nutritional transition, characterized by the rapid decline in the prevalence of malnutrition and high increase rates of overweight / obesity. And it is known that unruly eating habits, such as regular consumption of fast food, high intake of foods with high calorie and fat foods with low fiber content and excessive intake of sweetened drinks are risk factors for obesity. Therefore, we use the cafeteria diet, in order to assess the behavioral and neuroendocrine changes of chronic consumption and permanent withdrawal of this palatable diet during the stages of development. The cafeteria diet consisted of palatable food: snack, wafer, biscuit stuffed sausage and condensed milk. The groups that received this diet had free choice for continuous consumption of water and standard chow. Animals fed diets from day 21 of life and the experiment lasted 7 weeks. 36 Wistar rats were divided into 3 groups, control (C), which received standard diet, cafeteria diet (DC) received cafeteria diet of the 21st day of life until the 70th day of life, and withdrawal (R) which received cafeteria diet until the 35th day of life, it is then replaced by standard feed to 70th day of life. As expected, the cafeteria diet consumption at some stage of life, increased body weight of the animals compared to the control. The animals of the DC group showed an indication of anxious behavior, the task of the open field, for had a higher latency to exit the first square and explore the apparatus. Chronic consumption of this diet led to peripheral metabolic changes such as increased blood glucose, increased plasma leptin, as well as increased abdominal fat, inguinal and increased adrenal weight. However when the DC was removed in adolescence these metabolic parameters returned to the same levels of animals fed standard chow only. In the hippocampus, changes were observed as a decrease in the expression of glucocorticoid receptor (GR) protein of the neuronal nitric oxide synthase (nNos) and the tropomyosin receptor kinase B (TrkB) receptor, and balanced cellular oxidative response. However, these findings indicate that the cafeteria diet throughout life induced an anxious behavior which in part can be explained by the neuroendocrine alterations found in the peripheral metabolism as in the hippocampus of these animals. Also, interesting is that abrupt withdrawal during adolescence was able to reverse, at least in part, some of these changes. Keywords: cafeteria diet; withdrawal; anxiety; neuroendocrine changes; obesity
Lista de abreviaturas
AKT = Proteina quinase
BDNF = Fator neurotrófico derivado do cérebro
CAF = Dieta de de cafeteria
CAT= Catalase
DC = Grupo dieta de cafeteria
GPx = Glutationa peroxidase
GR = Glutationa redutase
HPA = Hipotalâmico-pituitário-adrenal
LDL = lipoproteína de baixa densidade
NADH = Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADPH = Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido
NNOS = Óxido nítrico sinstase neuronal
SH = Sulfidrila
SNC = Sistema nervoso central
SOD = Superóxido dismutase
TBARS = Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
TRKB = Recpetor de tropomiosina relacionada a quinase B
Sumário
1. Introdução ............................................................................................................. 9
2. Revisão de literatura ........................................................................................... 11
2.1. Impactos da obesidade nos estágios precoces do desenvolvimento e suas
consequências na vida adulta ................................................................................ 11
2.2. Dieta de cafeteria como indutora de obesidade ........................................... 12
2.2.1.1. Dieta de cafeteria: foco nas alterações comportamentais, metabólicas e
neuroquímicas. ...................................................................................................... 13
2.3. Efeito retirada da Dieta de Cafeteria sobre parâmetros metabólicos,
neuroquímicos e comportamentais ........................................................................ 15
3. Projeto de Pesquisa ............................................................................................ 16
4. Relatório de Trabalho de Campo ........................................................................ 40
5. Artigo .................................................................................................................. 43
Considerações Finais ................................................................................................ 74
Referências Bibliográficas ......................................................................................... 75
9
1. Introdução
De acordo com a Organização Mundial da Saúde, a obesidade em todo
o mundo quase dobrou desde 1980. Isto se deve a profundas mudanças na
disponibilidade, qualidade, quantidade e origem dos alimentos consumidos em
muitos países. Sabe-se também, que o consumo de alimentos industrializados,
ricos em gordura e sacarose, conhecidos como comfort food tem aumentado
drasticamente nos últimos anos (MONTEIRO et al., 2013; SOUTH et al., 2012).
Esse excessivo consumo contribui para aumento das taxas de
sobrepeso e obesidade (SOUSA et al., 2011). Além disso, o aumento da
ingestão de alimentos de alto teor calórico pode aumentar os fatores de risco
para problemas de saúde, incluindo doença cardiovascular, diabetes, câncer e
desordens metabólicas (SAGAE et al., 2012). Da mesma maneira, esse
consumo exacerbado é capaz de gerar distúrbios metabólicos e
comprometimento da função cerebral (SOUZA et al., 2007).
Dados da literatura demonstram que a influência da exposição precoce
desses alimentos altamente calóricos pode levar a alterações persistentes no
sistema nervoso central (SNC) e no sistema endócrino-metabólico
(MCQUILLEN e FERRIERO, 2004; SCHIMIDT et al., 2009). Isso se justifica,
pois durante o desenvolvimento, o encéfalo está passando por diversos
processos fundamentais, como organização funcional das redes neurais,
proliferação neural, migração, diferenciação, além de glicogênese e
mielinização (RICE e BARONE, 2000). Nesse contexto, o hipocampo,
importante estrutura do SNC, está envolvido com a cognição, memória e
emoção. Essa estrutura apresenta um aumento na neurogênese e densidade
dos espinhos dendríticos antes da puberdade e diminui na idade adulta (HE e
CREWS, 2007; ROMEO e MCEWEN, 2006; YILDIRIM et al., 2008). Além
disso, também tem sido demonstrada a vulnerabilidade do hipocampo induzida
pelo consumo de alimentos calóricos (ARCEGO et al., 2014; KROLOW et al.,
2013; MOLTENI et al., 2004; PISTELL et al., 2010; SOUZA et al., 2007).
Sendo assim, entender como a oferta dos alimentos ricos em açúcar e gordura
pode influenciar na maturação e plasticidade neural dessa importante estrutura
encefálica torna-se uma questão digna de estudo, visto que, tem sido atribuído
10
que a exposição precoce e crônica de alimentos calóricos esteja fortemente
implicada na epidemia da obesidade assim como, nos transtornos psiquiátricos.
Sabe-se então, que uma exposição a alimentos altamente palatáveis pode
levar a alterações metabólicas que podem refletir ao aumento do peso corporal
assim como, alterações no SNC. No entanto, a remoção abrupta dessa dieta
também tem demonstrado prejuízos no sistema endócrino-metabólico. Um
estudo mostrou que a remoção de uma dieta de cafeteria diretamente ativa a
resposta ao estresse por ativar o eixo Hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA).
Interessantemente, esse mesmo estudo mostrou que a reposição da dieta após
um período de retirada, fez o animal consumir mais alimento calórico na
tentativa de reduzir os efeitos do estresse. (MARTIRE et al., 2014).
Dessa forma, faz-se interessante além do consumo crônico, estudar
como a retirada de dieta de cafeteria durante as fases do desenvolvimento
podem programar o comportamento e o metabolismo do animal na idade
adulta. Assim, com a compreensão de estudos em modelos animais pode-se
entender de que maneira esses alimentos interferem no metabolismo periférico
e central e como essas possíveis alterações podem estar associadas com o
sobrepeso/obesidade e a ansiedade.
11
2. Revisão de literatura
2.1. Impactos da obesidade nos estágios precoces do desenvolvimento
e suas consequências na vida adulta
Nas últimas décadas o Brasil vem passando por um processo de
transição nutricional, caracterizado pelo rápido declínio da prevalência de
desnutrição e elevado aumento das taxas de sobrepeso/obesidade (FILHO e
RISSIN, 2003). A obesidade é caracterizada pelo acumulo excessivo de
gordura corporal, que ocorre quando a quantidade de energia ingerida é
superior à energia dispensada (MARTINS et al., 2012). Atualmente, representa
um problema de saúde pública de dimensões mundiais e apresenta forte
associação com diversas doenças crônicas não transmissíveis (SOUSA et al.,
2011).
Globalmente, em 2010, o número de crianças com excesso de peso com
idade inferior a cinco foi estimado em mais de 42 milhões, sendo que
aproximadamente 35 milhões delas vivem em países em desenvolvimento.
(SAHOO et al., 2015). De acordo com a Pesquisa de Orçamentos Familiares
2008-2009 (POF), a taxa de sobrepeso em meninos na faixa etária de 19 anos
aumentou de 3,7% em 1974-1975 para 21,7% em 2008-2009, para as
meninas, a proporção aumentou de 7,6% para 19,4% no mesmo período de
tempo. Segundo Davison et al (2001), a preferência por alimentos altamente
energéticos pode servir como um fator de risco no desenvolvimento de excesso
de peso. Niehoff (2004) também observou a relação entre o aumento do
consumo de fast food com os níveis elevados de obesidade nos últimos anos.
Além disso, Anderson e Butcher (2006) concluíram que o consumo de grandes
porções contribui para uma ingestão calórica excessiva, o que vem sendo um
dos fatores de risco para a obesidade.
Com relação à influência de fatores ambientais e possíveis alterações
persistentes no sistema endócrino-metabólico, é conhecido que a prevalência
de sobrepeso na pré-puberdade e puberdade está aumentando, e tem sido
sugerido que fatores ambientais, como exposição o consumo de alimentos
ricos em gordura e carboidratos, estejam fortemente implicados nessa
12
epidemia. O consumo crônico e precoce de alimentos ricos em gordura pode
modificar as respostas homeostáticas dos circuitos neuroendócrinos e
promover alterações na idade adulta, como redução de receptores para leptina
no hipotálamo e de receptores para glicocorticoides no hipocampo
(BOUKOUVALAS et al., 2010). Interessante que a exposição de uma dieta de
cafeteria após o desmame até a idade adulta levou alterações metabólicas
como aumento do peso corporal, dos níveis plasmáticos da glicose, insulina,
triglicerídeos, resistência a insulina indicando síndrome metabólica nos animais
(LALANZA et al., 2014).
2.2. Dieta de cafeteria como indutora de obesidade
Um dos estilos de vida das sociedades atuais está relacionado com a
alteração no comportamento alimentar. Hábitos alimentares desregrados, como
por exemplo, o consumo frequente de fast food, elevado consumo de alimentos
com alto teor de gordura e ingestão excessiva de bebidas adoçadas (MACEDO
et al., 2012) são fatores de risco para obesidade. Para que seja possível
estudar a obesidade, vários modelos animais têm sido utilizados, incluindo
modelos genéticos e com obesidade induzida por tipos de dietas altamente
calóricas (AUVIT et al., 2012). Um determinado tipo de dieta capaz de induzir a
obesidade é conhecida como dieta de cafeteria (CAF), que representa um
modelo útil para estudos de obesidade em seres humanos. CAF refere-se à
oferta de uma escolha de gêneros alimentícios do tipo cafeteria, ricos em
gordura, energia e açúcar, onde os animais escolhem quais eles desejam
comer (ZENNI et al., 2013). Estudos em modelos animais vêm demonstrando
que a CAF faz com que os animais substituam gradativamente a ingestão da
dieta padrão, composta de água e ração, por substâncias altamente calóricas,
como bacon, leite condensado, refrigerantes, chocolate, salame, queijo, e
gordura animal (ROTHWELL et al., 1988). As grandes quantidades de gorduras
presentes nesses alimentos ocasionam um aumento de peso significativo
acompanhado de uma modulação da adipogênese (AUVIT et al., 2012). Além
disso, CAF provou ser um modelo mais fidedigno a indução de obesidade
assemelhando a obesidade encontrada nos seres humanos (SAMPEY et al.,
2011).
13
2.2.1.1. Dieta de cafeteria: foco nas alterações
comportamentais, metabólicas e neuroquímicas.
Uma dieta de cafeteria administrada durante as fases iniciais de
desenvolvimento, não só promove obesidade e distúrbios metabólicos, mas
também tem impacto sobre o comportamento emocional e cognitivo na vida
adulta (WARNEKE et al., 2014). Foi demonstrado que esse tipo de dieta
altamente calórica alterou o comportamento cognitivo através da diminuição
direta da plasticidade neuronal e reduziu o impacto negativo do estresse em
termos de ansiedade, depressão e atividade do eixo HPA (SOUZA et al, 2007;
ZEENI et al., 2013). No entanto, quando se trata desse eixo é importante
considerar que o mesmo não está apenas envolvido com os estímulos
estressantes da vida diária, mas também sua atividade é altamente
influenciada pelo tipo de alimento palatável ingerido. Uma dieta hipercalórica,
rica em carboidrato e gordura, pode levar a uma redução da resposta do eixo
ao estresse (PECORARO et al., 2004), sugerindo um efeito metabólico
periférico da dieta sobre o encéfalo (DALLMAN et al., 2003). Uma dieta
contendo alto teor de gordura, no entanto, realça os níveis de glicocorticoides
basais e induzidos por estresse, possivelmente agindo como um fator estressor
(KAMARA et al., 1998).
Do mesmo modo, as emoções estão intimamente relacionadas com o
comportamento alimentar (LALANZA et al., 2014). Estudos vêm demonstrando
que a obesidade induzida pela ingestão de alimentos altamente calóricos pode
ter efeitos contraditórios sobre o comportamento emocional. Um estudo
mostrou que ratos obesos induzidos pelo consumo crônico de dieta altamente
calórica foram mais ansiosos e agressivos do que ratos não obesos
(BUCHENAUER et al., 2009). Por outro lado, recentes estudos mostraram que
ratos que receberam CAF desde o desmame até a idade adulta mostraram
uma redução no comportamento ansioso em diferentes tarefas
comportamentais (CANETTI et al., 2002; LALANZA et al., 2014).
Entre as consequências do acesso a esses alimentos, estão um padrão
alimentar hiperfágico e hipercalórico pelo maior consumo de gorduras e
carboidratos (SHAFAT et al., 2009), ganho de peso corporal, aumento
14
significativo na quantidade de gordura visceral, e resistência à insulina
(WOFFORD e HALL, 2004). Um estudo em modelos animais mostrou que a
CAF mesmo sendo administrada somente por 15 dias, foi capaz de aumentar a
adiposidade (RIBOT et al., 2008). Em outro estudo, com ratas fêmeas, CAF
oferecida a partir do desmame até a idade adulta, induziu obesidade pelo
aumento da gordura corporal, resultando em níveis aumentados de
triglicerídeos, colesterol total e colesterol LDL e resistência à insulina (SAGAE
et al., 2012). Da mesma maneira, o uso desse tipo de alimento foi capaz de
induzir síndrome metabólica, por alterar parâmetros característicos desta
condição como, hipertrigliceridemia, hiperglicemia e resistência à insulina
(LALANZA et al., 2014). Sabe-se também que uma CAF é capaz de induzir
hiperfagia, aumento da ingestão de alimentos ricos em energia, gordura e
ingestão de carboidratos levando a um consumo excessivo de alimentos de
alta densidade de energia contida na dieta (SHAFAT et al., 2009). Além desses
fatores, outro estudo demonstrou que seu consumo levou a um aumento da
concentração sanguínea de hormônios chaves envolvidos no controle
homeostático da alimentação como, leptina e insulina em ratos (CHAVES et al.,
2006).
O consumo da CAF também afeta diretamente o sistema nervoso
central. Foi observada em ratos expostos a essa dieta por seis semanas, uma
redução na expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) no
hipocampo (MARTIRE et al., 2014). Cabe ressaltar que essa neurotrofina é
importante para sobrevivência e diferenciação neuronal, sendo diretamente
envolvida no controle da atividade neuronal e plasticidade sináptica
(MATTSON, 2008). Além disso, outros marcadores importantes para
maturação e plasticidade neural têm apresentado alterações induzidas pelo
consumo excessivo de alimentos calóricos. No encéfalo o consumo de
alimentos calóricos levou desequilíbrio oxidativo por alterar sistemas
antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos assim como, dano ao ADN celular
e aumento na geração de espécies reativas em diferentes estruturas
encefálicas (ARCEGO et al., 2014; KROLOW et al., 2013).
15
2.3. Efeito retirada da Dieta de Cafeteria sobre parâmetros
metabólicos, neuroquímicos e comportamentais
No século XXI, alimentos altamente palatáveis tornaram-se baratos e
abundantes, contribuindo para o aumento da obesidade. Apesar das
complicações de saúde e estigma social da obesidade, indivíduos com esse
distúrbio metabólico parecem incapazes de travar o seu consumo excessivo
como evidenciado pela elevada taxa de insucesso de dietas de restrição
energética (SOUTH et al., 2012). Uma razão pela qual esses tratamentos de
perda de peso são raramente bem sucedidos em longo prazo se deve ao fato
de que interromper o consumo de alimentos ricos em energia resulta em humor
negativo e ativação de sistemas de estresse (ADAM E EPEL, 2007; VOLKOW,
2013). Esse acesso intermitente a alimentos palatáveis em roedores está
associado ao aumento da ansiedade e ativação de circuitos do estresse,
incluindo o eixo HPA (PARYLAK, 2011; SHARMA, 2012). Um estudo mostrou
que a retirada após duas semanas de uma CAF foi capaz de induzir um
aumento do comportamento ansioso quando analisado no aparato no campo
aberto em ratos obesos (PICKERING et al., 2009).
Com relação às alterações metabólicas periféricas, a retirada abrupta do
alimento altamente calórico após dois meses de exposição, mostrou uma
restauração nos níveis séricos de triglicerídeos, glicose e a sensibilidade à
insulina, assim como, melhoraram parâmetros envolvidos com a síndrome
metabólica em ratos (LALANZA et al., 2014). Por outro lado, no que tange
alterações no SNC foi verificado que a retirada abrupta levou a hiperativação
do eixo HPA, indicando que os animais estariam mais estressados após a
retirada de um alimento altamente calórico (MARTIRE, 2014). Contudo, esses
estudos mostraram muitas lacunas a ser compreendidas principalmente no que
se refere aos efeitos da retirada abrupta de um alimento calórico da dieta dos
animais.
16
3. Projeto de Pesquisa
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Faculdade de Nutrição
Programa de Pós Graduação em Nutrição e Alimentos
Projeto de Dissertação
A influência da exposição e retirada de uma dieta de cafeteria sobre os
parâmetros comportamentais, metabólicos e neuroquímicos de ratos
Wistar
Gabriela Kurz da Cunha
Pelotas, 2015
17
Gabriela Kurz da Cunha
A influência da exposição e retirada de uma dieta de cafeteria sobre os
parâmetros comportamentais, metabólicos e neuroquímicos
de ratos Wistar
Projeto de Dissertação apresentado ao
Programa de Pós-Graduação em Nutrição
e Alimentos da Faculdade de Nutrição da
Universidade Federal de Pelotas, como
requisito parcial à obtenção do título de
Mestre.
Orientador: Giovana Duzzo Gamaro
Co-orientador: Rachel Krolow Santos Silva Bast
Pelotas, 2015
18
Resumo
As alterações de estilo de vida e o cotidiano da sociedade moderna causaram mudanças nos hábitos alimentares dos seres humanos. O aumento da obesidade associado ao desenvolvimento de transtornos psicológicos é capaz de gerar consequências ao longo da vida, entre estas a obesidade intergeracional e alterações no sistema nervoso central. O objetivo desse estudo é avaliar os parâmetros bioquímicos e possíveis transtornos comportamentais relacionados à depressão e agressividade nas ratas progenitoras e na prole. Serão utilizados ratos da linhagem Wistar divididos em dois grupos: Grupo Controle (DP) – Ração padrão; Grupo Dieta de Cafeteria (DC). Os animais receberão a dieta durante 8 semanas e posteriormente acasalados. A prole, após o desmame, será também submetida a 8 semanas de dieta de cafeteria . Os testes comportamentais que avaliarão possíveis sintomas depressivos e de agressividade. Ao longo do tratamento serão monitorados o consumo de alimentos palatáveis bem como a ingestão hídrica. Após a eutanásia as dosagens bioquímicas avaliarão os níveis séricos de glicose, triacilgliceróis, colesterol total, HDL, LDL e VLDL. Além disso, o peso do fígado, glândulas adrenais, gordura mesentérica e visceral será avaliado. O projeto de pesquisa foi submetido ao Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da UFPel e aprovado sob o parecer n° 1610. Palavras Chave: depressão, agressividade, dieta hiperlipídica, ratos neonatos
19
Sumário
1 Introdução.......................................................................................................20
2 Revisão de literatura......................................................................................22
3 Justificativa.....................................................................................................27
4 Objetivos.........................................................................................................28
4.1 Objetivo geral....................................................................................28
4.2 Objetivo específicos..........................................................................28
5 Hipóteses........................................................................................................29
6 Metodologia....................................................................................................30
6.1 Animais e Desenho Experimental.....................................................30
6.2 Dietas Experimentais - Dieta padrão e Dieta de cafeteria................30
6.3 Eficiência Alimentar...........................................................................31
6.4 Consumo de Ração Padrão..............................................................31
6.5 Peso Corporal...................................................................................32
6.6 Campo Aberto (‘Open Field’)............................................................32
6.7 Labirinto em Cruz elevado (‘Plus Maze’)..........................................32
6.8 Dosagens Bioquímicas......................................................................32
7 Aspectos éticos..............................................................................................34
8 Cronograma....................................................................................................35
9 Orçamento......................................................................................................36
Referências Bibliográficas.................................................................................37
20
1 Introdução
Dados da literatura demonstram que a influência de fatores ambientais
em períodos precoces do desenvolvimento pode levar a alterações persistentes
no sistema nervoso central e no sistema endócrino-metabólico (MCQUILLEN e
FERRIERO, 2004, SCHIMIDT et al., 2009). Tais exposições a fatores
ambientais, como o estresse e o consumo elevado de alimentos palatáveis
pode influenciar a susceptibilidade a doenças ou a resiliência na idade adulta
(PAUS et al., 2008). Isso se justifica, pois durante o desenvolvimento, o
encéfalo está passando por diversos processos fundamentais como
organização funcional das redes neurais, proliferação neural, migração,
diferenciação, além de glicogênese e mielinização (RICE e BARONE, 2000).
Neste contexto, distintas estruturas encefálicas tais como: o hipocampo e o
córtex pré-frontal, importantes estruturas do sistema nervoso central, as quais
estão envolvidas com a cognição, memória e emoção caracterizam-se por
maturar diferentemente. O córtex pré-frontal, por exemplo, possui uma
maturação tardia no início da idade adulta (GOGTAY et al., 2004), enquanto o
hipocampo apresenta um aumento na neurogênese e densidade dos espinhos
dendríticos antes da puberdade, que diminui na idade adulta (HE e CREWS,
2007; YILDIRIM et al., 2008). Sendo assim, entender como a oferta dos
alimentos ricos em açúcar e gordura pode influenciar na maturação destas
importantes estruturas encefálicas torna-se um tema importante de estudo,
visto que tem sido atribuído à exposição precoce e crônica a alimentos
calóricos esteja fortemente implicada na epidemia da obesidade assim como,
nos transtornos psiquiátricos.
Um estudo em ratos mostrou que o consumo crônico e precoce de
alimentos ricos em gordura e ou açúcar apresentam alterações
comportamentais na idade adulta, como ansiedade e depressão (WRIGHT et
al., 2011). Além disso, o consumo crônico destes alimentos calóricos pode
modificar as respostas homeostáticas dos circuitos neuroendócrinos e
promover alterações neuroquímicas na idade adulta, como redução de
receptores para leptina no hipotálamo e de receptores para glicocorticoides no
hipocampo (BOUKOUVALAS et al., 2010).
21
De acordo com os relatos citados acima, uma exposição a alimentos
altamente palatáveis pode levar a alterações metabólicas que podem refletir no
aumento do peso corporal assim como, alterações no sistema nervoso central.
No entanto, a remoção abrupta desta dieta também tem demonstrado prejuízos
no sistema endócrino-metabólico. Um estudo mostrou que a remoção de uma
dieta de cafeteria (rica em açúcar e gordura), estimula a resposta ao estresse
por ativar o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA). Interessantemente, esse
mesmo estudo mostrou que a reposição da dieta após um período de retirada,
fez o animal consumir uma maior quantidade de alimentos calóricos na
tentativa de reduzir os efeitos do estresse (MARTIRE et al., 2014).
Sendo assim, entender como o uso e a retirada de dieta rica em açúcar
e gordura durante as fases do desenvolvimento podem programar o
comportamento e o metabolismo do animal na idade adulta é fundamental para
compreender porque é tão difícil controlar o consumo alimentar. Assim, com a
compreensão de estudos em modelos animais pode-se elucidar de que
maneira estes alimentos interferem na neuroquímica do hipocampo e do córtex
pré-frontal e como essas alterações nas diferentes estruturas encefálicas
podem estar associadas com patologias como obesidade e a ansiedade.
22
2 Revisão de literatura
2.1 Impactos da obesidade nos estágios precoces do desenvolvimento
e suas consequências na vida adulta
Nas últimas décadas o Brasil vem passando por um processo de
transição nutricional, caracterizado pelo rápido declínio da prevalência de
desnutrição e elevado aumento das taxas de sobrepeso/obesidade (FILHO e
RISSIN, 2003). A obesidade é caracterizada pelo acumulo excessivo de
gordura corporal, que ocorre quando a quantidade de energia ingerida é
superior à energia dispensada (MARTINS et al., 2012). Atualmente, representa
um problema de saúde pública de dimensões mundiais e apresenta forte
associação com diversas doenças crônicas não transmissíveis (SOUSA et al.,
2011).
Globalmente, em 2010, o número de crianças com excesso de peso com
idade inferior a cinco foi estimado em mais de 42 milhões, sendo que
aproximadamente 35 milhões delas vivem em países em desenvolvimento.
(SAHOO et al., 2015). De acordo com a Pesquisa de Orçamentos Familiares
2008-2009 (POF), a taxa de sobrepeso em meninos na faixa etária de 19 anos
aumentou de 3,7% em 1974-1975 para 21,7% em 2008-2009, para as
meninas, a proporção aumentou de 7,6% para 19,4% no mesmo período de
tempo. Segundo Davison et al (2001), a preferência por alimentos altamente
energéticos pode servir como um fator de risco no desenvolvimento de excesso
de peso. Em um estudo de Birch e Fisher (1998), crianças com maior
espessura das dobras cutâneas tricipital exibiram uma preferência maior por
alimentos ricos em gordura. Niehoff (2004) observou que aumento do consumo
de fast food tem sido associado com a obesidade nos últimos anos. Além
disso, Anderson e Butcher (2006) concluíram que o consumo de grandes
porções contribui para uma ingestão calórica excessiva, o que vem sendo um
dos fatores de risco para a obesidade.
Com relação à influência de fatores ambientais e possíveis alterações
persistentes no sistema endócrino-metabólico, é conhecido que a prevalência
de sobrepeso na pré-puberdade e puberdade está aumentando, e tem sido
23
sugerido que fatores ambientais, como exposição ao estresse e/ou consumo de
alimentos ricos em gordura e carboidratos, estejam fortemente implicados
nessa epidemia. Um estudo em ratos mostrou que a exposição a um estressor
durante as fases iniciais do desenvolvimento leva a uma alteração na
distribuição de gordura, aumentando a razão de gordura visceral/subcutânea
quando os animais tornaram-se adultos, levando a um maior risco para o
desenvolvimento de doenças metabólicas na idade adulta (SCHMIDT et al.,
2009). O consumo crônico e precoce de alimentos ricos em gordura também
pode modificar as respostas homeostáticas dos circuitos neuroendócrinos e
promover alterações na idade adulta, como redução de receptores para leptina
no hipotálamo e de receptores para glicocorticoides no hipocampo
(BOUKOUVALAS et al., 2010).
2.2 Dieta de cafeteria como indutora de obesidade
Um dos estilos de vida das sociedades atuais está relacionado com a
alteração no comportamento alimentar. Hábitos alimentares desregrados, como
por exemplo, o consumo frequente de fast food, elevado consumo de alimentos
com alto teor calórico e de gordura, alimentos com baixo teor de fibra e
ingestão excessiva de bebidas adoçadas são fatores de risco para obesidade
(MACEDO et al., 2012). Para que seja possível estudar a obesidade, vários
modelos animais têm sido utilizados, incluindo modelos genéticos e com
obesidade induzida por tipos de dietas altamente calóricas (AUVIT et al., 2012).
Um determinado tipo de dieta capaz de induzir a obesidade é conhecido como
dieta de cafeteria (CF), que representa um modelo útil para estudos de
obesidade em seres humanos. Estudos em modelos animais vêm
demonstrando que a dieta de CF faz com que os animais substituam
gradativamente a ingestão da dieta padrão, composta de água e ração, por
substâncias altamente calóricas, como bacon, leite condensado, refrigerantes,
chocolate, salame, queijo, e gordura animal (ROTHWELL et al., 1988). As
grandes quantidades de gorduras presentes nesses alimentos ocasionam um
aumento de peso significativo acompanhado de uma modulação da
adipogênese (AUVIT et al., 2012). Baseado em vários estudos, a dieta de
cafeteria provou ser um modelo mais fidedigno a indução de obesidade,
24
assemelhando-se com a obesidade encontrada nos seres humanos (SAMPEY
et al., 2011).
2.2.1 Dieta de cafeteria: foco nas alterações comportamentais,
metabólicas e neuroquímicas
Uma CF administrada durante as fases iniciais de desenvolvimento, não só
promove obesidade e distúrbios metabólicos, mas também tem impacto sobre
o comportamento emocional e cognitivo na vida adulta (WARNEKE et al.,
2014). Foi demonstrado que este tipo de dieta altamente calórica alterou o
comportamento cognitivo através da diminuição direta da plasticidade neuronal
e reduziu o impacto negativo do estresse em termos de ansiedade, depressão
e atividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA). (SOUZA ET AL, 2007;
ZENI ET AL, 2013). Além disso, as emoções estão intimamente relacionadas
com o comportamento alimentar (LALANZA ET AL, 2014), e tem sido
demonstrado, que o humor negativo induz o consumo excessivo de alimentos
palatáveis e o ganho de peso, e que esse comportamento alimentar reduziu o
comportamento do tipo ansioso (CANETTI et al., 2002). Assim como, também
foi observado que níveis elevados de corticosterona podem aumentar o
consumo de alimentos altamente calóricos a fim de diminuir as respostas ao
estresse (SINHA e JASTREBOFF, 2013, TANNENBAUM et al., 1997). Alguns
estudos em humanos mostram que indivíduos altamente reativos ao estresse
ingerem mais calorias e este comportamento estaria associados com o
comportamento compulsivo (EPEL ET AL., 2001; FREEMAN e GIL, 2004). Já
estudos em ratos adultos mostram que animais submetidos a um estresse
crônico apresentaram aumento da ingestão de alimentos palatáveis (ELY et al.,
1997; PECORARO et al., 2004; SILVEIRA et al., 2004) mostrando que a
exposição ao estressor é capaz de modificar o comportamento alimentar, que
por sua vez, depende da gravidade e da duração do estressor.
No entanto, quando se trata do eixo HPA é importante considerar que este
não está apenas envolvido com os estímulos estressantes da vida diária, mas
também sua atividade é altamente influenciada pelo tipo de alimento palatável
ingerido. Uma dieta hipercalórica pode levar a uma redução da resposta do
eixo ao estresse, sugerindo um efeito metabólico periférico da dieta sobre o
25
encéfalo (DALLMAN et al., 2003, PECORARO et al., 2004). Porém no estudo
de Kamara et al (1998), a dieta realçou os níveis de glicocorticóides basais e
induzidos por estresse, possivelmente agindo como um fator estressor.
Com relação à influência da dieta de cafeteria sobre os parâmetros
metabólicos e neuroquímicos, um estudo em modelos animais mostrou que a
dieta de CF administrada em ratas fêmeas, a partir do desmame até a idade
adulta, induziu obesidade pelo aumento da gordura corporal, resultando em
níveis aumentados de triglicerídeos, colesterol total e colesterol LDL (SAGAE et
al., 2012). Também, o uso deste tipo de alimento foi capaz de induzir síndrome
metabólica, por alterar parâmetros característicos desta condição como,
hipertrigliceridemia, hiperglicemia e resistência à insulina (LALANZA et al.,
2014). Além desses fatores, outro estudo demonstrou que o consumo de uma
CF levou a um aumento da concentração sanguínea de hormônios chaves
envolvidos no controle homeostático da alimentação como, leptina e insulina
em ratos (CHAVES et al., 2006). O consumo de CF também afeta diretamente
o sistema nervoso central. Foi observada em ratos expostos a uma dieta de
cafeteria por seis semanas, uma redução na expressão do fator neurotrófico
derivado do cérebro (BDNF) no hipocampo (MARTIRE et al., 2014). Cabe
ressaltar que esta neurotrofina é importante para sobrevivência e diferenciação
neuronal, sendo diretamente envolvida no controle da atividade neuronal e
plasticidade sináptica (MATTSON, 2008).
2.4 Efeito da retirada da Dieta de Cafeteria sobre parâmetros
metabólicos, neuroquímicos e comportamentais
Uma razão pela qual os tratamentos de perda de peso são raramente
bem sucedidos em longo prazo, se deve ao fato de que a interrupção do
consumo de alimentos ricos em energia resulta em humor negativo e ativação
de sistemas de estresse (ADAM E EPEL, 2007, VOLKOW, 2013,). Esse acesso
intermitente a alimentos palatáveis em roedores está associado com aumento
da ansiedade e ativação de circuitos do estresse, incluindo o HPA (PARYLAK,
2011, SHARMA, 2012). Um estudo mostrou que a retirada após duas semanas
de uma CF foi capaz de induzir um aumento do comportamento ansioso
26
quando analisado no aparato no campo aberto em ratos obesos (PICKERING,
et al., 2009).
Com relação às alterações metabólicas e neuroquímicas, a retirada
abrupta do alimento altamente calórico após dois meses de exposição, mostrou
uma restauração nos níveis séricos de triglicerídeos, glicose e a sensibilidade à
insulina, assim como, melhoraram parâmetros envolvidos com a síndrome
metabólica em ratos (LALANZA et al., 2014). A retirada da CF
interessantemente mostrou uma alteração na expressão de genes envolvidos
com a resposta ao estresse. Foi observado um aumento na expressão do
hormônio liberador de corticotropina (CRH) mostrando assim, que o eixo HPA
torna-se mais ativado quando um alimento altamente calórico é retirado
abruptamente (MARTIRE, 2014) Este estudo é importante, pois mostra porque
a retirada de uma dieta calórica pode levar a um ciclo vicioso com relação ao
consumo alimentar. Ativa-se o eixo HPA, estimula o consumo alimentar a fim
de se diminuir a ativação do eixo HPA estimulado (MARTIRE, 2014).
27
3 Justificativa
Diante de novos hábitos alimentares da população, a obesidade vem se
tornando um problema de saúde publica que se dá principalmente pelo
excesso do consumo de alimentos não saudáveis. Muito se sabe sobre as
consequências metabólicas deste tipo de alimentação, porém os efeitos
neuroquímicos e comportamentais ainda têm evidências restritas. Sabe-se que
a interrupção deste tipo de alimentação, seria capaz de reparar o peso e perfil
metabólico, porém é necessário saber quais são as implicações dessa
interrupção no sistema nervoso central, já que dietas ricas em gordura e açúcar
podem ser vistas como um fator estressor. Portanto é relevante avaliar se a
exposição precoce a um alimento altamente calórico pode causar alterações
em diferentes estruturas encefálicas, e se essas alterações podem estar
associadas com patologias como a obesidade e ansiedade.
Sendo assim, este trabalho além de buscar maiores evidências sobre a
dieta de cafeteria e suas consequências, busca analisar quais as
consequências da retirada tanto em perfis neuroquímicos quanto
comportamentais.
28
4 Objetivos
4.1 Objetivo geral
Avaliar a influência da exposição crônica e retirada permanente de uma
dieta de cafeteria sobre parâmetros comportamentais, metabólicos e
neuroquímicos em ratos Wistar.
4.2 Objetivos específicos
a. Avaliar o consumo de alimento e ganho de peso dos animais (aos 35 e
50 dias de vida pós-natal);
b. Determinar o comportamento ansioso utilizando tarefas
comportamentais como, campo aberto e labirinto em cruz elevado na
idade adulta;
c. Mensurar os níveis séricos de perfil lipídico, leptina e corticosterona ao
longo do desenvolvimento (35 e 70 dias de vida pós-natal);
d. Mensurar os níveis de leptina no hipocampo e córtex pré-frontal ao longo
do desenvolvimento (35 e 70 dias de vida pós-natal);
e. Analisar os níveis de BDNF no hipocampo e córtex pré-frontal ao longo
do desenvolvimento (35 e 70 dias de vida pós-natal);
f. Correlacionar os níveis de leptina e BDNF no hipocampo e córtex pré-
frontal com o comportamento ansioso em animais que foram expostos
e/ou sofreram retirada de uma dieta de cafeteria.
29
5 Hipóteses
Acredita-se em um aumento do consumo alimentar naqueles animais
tratados com dieta de cafeteria, e consequente ganho e peso elevado.
Acredita-se que a dieta de cafeteria é capaz de inibir o comportamento
ansioso dos animais. Porém os animais que sofrerem a retirada da dieta
apresentarão comportamento ansiogênico.
Acredita-se que a dieta de cafeteria irá alterar os níveis séricos de perfil
lipídico, além de aumentar os níveis de leptina e corticosterona nos
animais.
Acredita-se que o BDNF terá sua expressão reduzida naqueles animais
com retirada da dieta.
Acredita-se que os níveis de leptina e BDNF no hipocampo e córtex pré-
frontal estarão correlacionados com o comportamento ansioso em
animais que foram expostos e/ou sofreram retirada de uma CF.
30
6 Material e Métodos
6.1 Animais e Desenho Experimental
Serão utilizados 36 ratos Wistar (todos machos, recém-desmamados,
com 21 dias de vida) provenientes do Biotério Central da Universidade Federal
de Pelotas. Serão randomizados e divididos em três grupos com 12 animais em
cada. O grupo controle, que receberá ração padrão (DP), grupo cafeteria, que
receberá dieta de cafeteria (CAF) e o grupo CAF-DP que receberá dieta de
cafeteria até o 35º dia e após ração padrão até o 50º. Ao final do tratamento o
comportamento ansiogênico será avaliado. Por fim, serão eutanasiados, por
método de decapitação, para obtenção de sangue e tecidos, as dosagens
bioquímicas, de perfil lipídico, BDNF, leptina e corticosterona e então serão
encaminhados ao Biotério Central para o seu descarte adequado.
Durante o experimento os animais permanecerão no Biotério Central da
UFPel, mantidos em caixas (65x25x15cm) com ciclo de 12h claro-escuro e
temperatura controlada (24-26ºC).Todos os procedimentos com animais serão
realizados de acordo com o Nacional Instituteof Health (NIH) “ Guia para
cuidados e Uso de animais de Laboratório” (NIH, 1985). O projeto será
encaminhado para o Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFPel.
6.2 Dietas Experimentais - Dieta padrão e Dieta de cafeteria
A dieta padrão será da marca Nuvilab utilizada pelo Biotério Central de
Pelotas composta de 55% de carboidratos, 22% de proteínas e 4,5% de
lipídios, entre outros constituintes (fibras e vitaminas) perfazendo um total de
2,93 Kcal/g (informações prestadas pelo fabricante). A dieta palatável
caloricamente densa (dieta de cafeteria) é composta aproximadamente de 60%
de carboidratos, 15% de proteínas e 20% de lipídios e 5% de outros
constituintes (sódio, cálcio, vitaminas, conservantes, minerais entre outros)
conforme descrita por Macedo et al (2012). Os componentes estão descritos na
Tabela 1. A composição nutricional é fornecida pelos fabricantes dos alimentos
utilizados, conforme descrito na Tabela 1. Os alimentos serão oferecidos in
31
natura. A dieta padrão estará disponível para que os animais não apresentem
déficit nutricional.
Alimentos Kcal/g/ml
Bolacha recheada 4,76
Leite condensado 3,20
Salgadinho 4,68
Salsicha 2,97
Waffer 5,32
Refrigerante 0,42
Tabela 1 – Descrição dos alimentos constituintes da dieta de cafeteria.
6.3 Eficiência Alimentar
Buscando avaliar a capacidade do animal em converter energia
alimentar consumida em peso corporal, será realizado o cálculo de eficiência
alimentar (EA). A EA será obtida por meio da divisão da média de ganho de
peso semanal (g) pelo total da energia ingerida (Kcal), multiplicado por 100
(Mathiset AL, 1996; Murray AL AL., 1999).
6.4 Consumo de Ração Padrão e Dieta de Cafeteria
O consumo de ração padrão e dieta de cafeteria será avaliado na caixa
de moradia, com os animais acomodados em seus grupos habituais de quatro
ratos, em um período de 24h, colocando-se uma quantidade conhecida de
ração, e medindo-se o restante após decorrido o tempos estabelecido. O
resultado obtido será dividido pelo número de ratos que habitam a caixa, o
resultado final será expresso pela média de consumo por animal.
32
6.5 Peso Corporal
O monitoramento do peso dos animais será realizado semanalmente, a
fim de evitar manipulação excessiva com os animais, em uma balança digital,
os valores serão registrados em planilhas para controle do peso.
6.6 Campo Aberto (“open field”)
O teste Campo Aberto tem por finalidade avaliar a capacidade
exploratória e aferição da ansiedade. Os testes serão realizados no Laboratório
de Neuropsicofarmacologia do Instituto de Biologia da UFPel. Os animais serão
colocados na caixa de observação (50 x 60 x 40 cm), onde será avaliado o
número de cruzamentos entre os diferentes quadrantes e o número de bolos
fecais em um tempo total de 5 minutos (BIANCHIN et al, 1993).
6.7 Labirinto em Cruz elevado (“Plus Maze”)
O labirinto utilizado descrito por Lamprea et al (2000) é constituído por 2
braços abertos (50 X 10 cm ) sem qualquer anteparo dispostos em oposição a
outro e de 2 braços fechados (de mesma proporção com paredes de 40 cm de
altura) também opostos, em forma de cruz e possui 50 cm de altura do chão .
Os animais serão colocados no centro do labirinto (no cruzamento entre os
braços), com a cabeça voltada para um dos braços abertos e o comportamento
será avaliado durante 5 minutos. O teste será realizado Laboratório de
Neuropsicofarmacologia do Instituto de Biologia da UFPel.
6.8 Dosagens Bioquímicas
Ao final do tratamento, após 8 horas de jejum, os animais serão
eutanasiados por meio de decapitação. O sangue do tronco será coletado em
tubos de ensaio previamente heparinizados e centrifugados a 1609 x g por 15
minutos. Após a centrifugação, o plasma será separado em alíquotas e
estocado à -80°C até a realização das análises bioquímicas.
33
Os parâmetros bioquímicos serão avaliados por meio de Kits
enzimáticos, por espectofotometria e expressos em mg/dL. Serão aferidas as
concentrações plasmáticas de colesterol total, triacilgliceróis (TAG) e
lipoproteína de alta densidade (HDL). Os valores de lipoproteína de baixa
densidade e muito baixa densidade (LDL e VLDL) serão calculados pela
equação de Friedewald (VLDL= TAG/5, LDL= Colesterol total- (HDL-VLDL)
(FRIEDWALD et al.,1972). As lipoproteínas serão somadas para se obter o
valor total, simulando o que se considera colesterol total em humanos. Os
níveis de leptina e BDNF serão aferidos por meio de utilização de kits de
ELISA.
34
7 Aspectos éticos
O projeto de pesquisa está em conformidade com a lei Arouca nº
11.794/2008, com a resolução normativa nº 12/2013 (Diretriz Brasileira para
cuidado e a utilização de animais para fins científicos e didáticos) do Conselho
Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e Resolução
normativa nº 13/2013 (Prática de eutanásia - CONCEA).
Com base na legislação, todos os procedimentos visam minimizar o
sofrimento dos animais e diminuir fontes externas de dor e desconforto. Além
disso, será solicitado um pedido de adendo, afim de aumentar o número de
animais, ao CEEA da UFPel pois esse projeto faz parte de um projeto maior
que já possui aprovação sob protocolo nº 1610.
35
8 Cronograma
2014 2015
2016
Atividade/Período O N D J F M A M J J A S O N D J F M A
Revisão bibliográfica
Elaboração do desenho
experimental
Elaboração do projeto
Defesa do projeto
Ensaio Biológico
Testes comportamentais
Eutanásia
Dosagens bioquímicas
Análises estatísticas
Elaboração da dissertação
Entrega/Defesa da dissertação
36
9 Orçamento
O projeto possui auxílio financeiro da FAPERGS com um valor total de R$
26.000,00 no edital PQG 01/2013.
Ítem Quantidade Custo Unitário (R$) Custo Total (R$)
Dieta de cafeteria 1.000,00
Luvas 5 caixas 20,00 100,00
Dosagem colesterol total 2 unid. 177,02 354,04
Dosagem Triglicerídeos 2 unid. 175,35 350,70
Kit ELISA BDNF 1 unid. 2.000,00 2.000,00
Kit ELISA Costicosterona 1 unid. 2.000,00 2.000,00
Kit ELISA Leptina 1 unid. 2,000,00 2.000,00
Total: 7.921,30
37
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40
4. Relatório de Trabalho de Campo
4.1 Animais
Foram utilizados 36 ratos Wistar machos, recebidos no 21º dia de vida pós-
natal, recém-desmamados, e tratados até o 70º dia de vida onde foram eutanásiados
por meio de decapitação. Provenientes do Biotério Central da Universidade Federal
de Pelotas e mantidos no mesmo, localizado no Campus Capão do Leão. O
experimento teve duração de 7 semanas.
Após o recebimento em junho de 2015, os animais foram pesados, e
randomizados em 3 grupos, com 12 animais em cada grupo. Foram mantidos em
caixas (65x25x15cm) padronizadas fornecidas pelo biotério, ao total foram nove
caixas com quatro animais em cada. O ambiente era controlado com ciclo de luz de
12horas claro-escuro e temperatura (24-26ºC). As caixas foram escolhidas de
maneira aleatória, para cada grupo.
Caixas 1, 2 e 3 para o grupo controle, animais que não receberam dieta de
cafeteria, apenas ração padrão e água do 21º dia de vida pós-natal até 70º dia.
Caixas 4, 5 e 6 para o grupo cafeteria, animais que receberam dieta de cafeteria,
ração padrão e água do 21º dia de vida pós-natal até 70º dia de vida pós-natal. As
caixas 7,8 e 9 o grupo retirada, grupo esse que recebeu dieta de cafeteria ate o 35º
dia de vida, e após passou a receber ração padrão e água até 70º dia de vida pós-
natal.
Os animais eram pesados semanalmente, e o comida trocada e pesada
diariamente.
4.2 Dietas
Como dieta padrão, foi utilizada a Nuvilab dieta utilizada pelo Biotério,
composta de 55% de carboidratos, 22% de proteínas e 4,5% de lipídios, entre outros
constituintes (fibras e vitaminas). Essa dieta era oferecida diariamente aos animais,
ad libitum, inclusive para os grupos que recebiam dieta de cafeteria, juntamente com
a água.
A dieta palatável (dieta de cafeteria) é composta aproximadamente de 60% de
carboidratos, 15% de proteínas e 20% de lipídios e 5% de outros constituintes
41
(sódio, cálcio, vitaminas, conservantes, minerais entre outros). Como alimentos
foram utilizados, salsicha, bolacha recheada sabor chocolate, waffer sabor
chocolate, salgadinho, leite condensado. Todos in natura, e trocados diariamente.
Os alimentos eram ofertados nas caixas moradia, previamente pesados e após
24horas de cosumo eram novamente pesados e repostos sucessivamente até o
término do tratamento. O cuidado durante o experimento foi muito grande, para que
nunca os animais ficassem sem comida em suas caixas moradia.
4.3 Testes comportamentais
Quando os animais completaram 68 e 69 dias de vida, foram realizados os
testes comportamentais. No primeiro dia ocorreu o open field (Campo Aberto), e no
segundo, foi realizado o teste de Plus Maze (Labirinto em Cruz elevado). Ambos
tiveram inicio às 9 horas da manhã, e término aproximadamente ás 14 horas. Os
testes foram realizados pela mestranda e alunos da graduação previamente
treinados. Cada animal ficou 5 minutos no aparato, que era limpo com álcool 70%
sempre antes de um novo rato iniciar. Os testes aconteceram em uma sala anexa ao
Biotério Central, própria para a realização de testes comportamentais, com controle
de luz e barulho, evitando assim, qualquer estresse aos animais.
4.4 Eutanásia
No 49º dia de tratamento, em agosto de 2015, os animais foram
eutanasiados, após ficarem 8 horas de jejum, por método de decapitação com
guilhotina. A equipe foi previamente treinada e organizada, evitando qualquer
contratempo durante o processo. A eutanásia aconteceu no laboratório do grupo
Neurocan, também localizado no Capão do Leão.
Para evitar estresse aos animais, devido ao cheiro de sangue e barulho dos
demais animais, as caixas ficaram em uma sala separada, e levadas conforme a
ordem de eutanásia para o laboratório. Assim que o animal era decapitado, o
cérebro era dissecado, e o hipocampo separado. O sangue do tronco coletado e
separado em tubos, simples e com EDTA, depois centrifugados por 15 minutos, a
fim de separar soro e plasma. Após centrifugação, foram armazenados no freezer -
80ºC. Enquanto isso, outra equipe dissecava as gorduras, retirava as adrenais, já as
limpando e pesando.
42
4.5 Análises bioquímicas
Primeiro, realizamos a homogeneização do hipocampo, onde metade das
amostras foi destinada as análises de estresse oxidativo, e outra metade para o
Western Blotting. Logo em seguida, foram feitas as análises de leptina, utilizando o
Kit comercial de ELISA. Por último, também utilizando kits comerciais foram feitas
análises de colesterol total, insulina e triglicerídeos.
4.6 Elaboração da dissertação e artigo
Concomitantemente, aos experimentos e análises, foi realizada a revisão
bibliográfica e escrita do trabalho. Todos os dados foram analisados no programa
Graphpad prism 5, bem como a elaboração de gráficos.
43
5. Artigo (segundo normas da revista Appetite)
A influência do consumo crônico de uma dieta de cafeteria e retirada sobre ansiedade e
alterações neuroendócrinas em ratos adultos.
Resumo
Dieta de cafeteria vem sendo utilizada como um modelo fidedigno para indução da obesidade
em ratos, já que refletem em consequências muito semelhantes as da obesidade em humanos.
Tal indução é necessária para que seja possível estudar as consequências dessa condição
durante a vida. Sendo assim, utilizamos a dieta de cafeteria durante as fases do
desenvolvimento, com o objetivo de avaliar as alterações comportamentais, metabólicas e
neuroendócrinas na idade adulta. Além disso, foi verificado o efeito da retirada desta dieta na
adolescência e analisado os mesmos parâmetros na idade adulta do animal. Foram utilizados
36 ratos Wistar machos, divididos em 3 grupos, controle (C) que recebeu dieta padrão, dieta
de cafeteria (DC) que recebeu dieta de cafeteria do 21º dia de vida até o 70º dia e retirada (R)
que recebeu dieta de cafeteria até o 35º dia, sendo ela depois substituída por ração padrão até
o 70º. Como era esperado, o consumo de dieta de cafeteria em alguma fase da vida, aumentou
o peso corporal dos animais quando comparado ao controle. Os animais do grupo DC
apresentaram um indicativo de comportamento ansioso. O consumo crônico desta dieta levou
a alterações metabólicas periféricas como aumento da glicemia, aumento da leptina
plasmática, assim como, aumento da gordura abdominal, inguinal e aumento do peso das
adrenais. Parâmetros esses, que foram revertidos na idade adulta no grupo que teve a retirada
da dieta de cafeteria na adolescência. No hipocampo, foram observadas alterações em
biomarcadores, envolvidos com maturação e plasticidade neural, como diminuição na
expressão dos receptores de glicocorticoides, na proteína oxido nítrico sintase neuronal e no
receptor TRKB. Além disso, também foi observada uma resposta oxidativa celular. Contudo,
esses achados indicam que a dieta de cafeteria ao longo da vida induziu um comportamento
44
ansioso que, em parte, pode ser justificado pela as alterações neuroendócrinas encontradas
tanto no metabolismo periférico como no hipocampo destes animais.
Palavras chaves: Dieta de cafeteria, Retirada, Ansiedade, Alterações neuroendócrinas.
1.Introdução
Nas últimas décadas tem sido observado um processo de transição nutricional
caracterizado pelo rápido declínio da prevalência da desnutrição e o aumento das taxas de
sobrepeso e obesidade (Filho e Rissin, 2003). Sabe-se que hábitos alimentares desregrados,
como frequente consumo de alimentos fast food com alto teor calórico, pobre quantidade de
fibras e elevado consumo de bebidas açucaradas são fatores de risco para o aumento do peso
corporal (Macedo et al., 2012). Diversos modelos animais vêm sendo usados para induzir
sobrepeso/obesidade, incluindo modelos genéticos e com obesidade induzida através do
consumo de uma dieta altamente calórica. Baseado nisto, a dieta de cafeteria (CAF), provou
ser o modelo mais fidedigno a indução de sobrepeso/obesidade assemelhando-se as alterações
na gordura corporal encontradas nos seres humanos (Sampey et al., 2011).
O consumo de uma CAF durante as fases de desenvolvimento não somente promove a
obesidade e desordens metabólicas, mas também tem um impacto sobre o comportamento
emocional e cognitivo na vida adulta (Warneke et al., 2014). Com relação às desordens
metabólicas, estudos tem mostrado que o consumo de alimentos de alta densidade calórica
pode alterar o complexo equilíbrio metabólico e medidores neuroendócrinos, como a leptina,
insulina e adiponectina (Badman e Flier, 2007; Fehm e Kern, 2006) levando ao
sobrepeso/obesidade, aumentando os riscos do desenvolvimento de diabetes tipo 2 e doenças
cardiovasculares (Després, 2012; Haslam e James, 2005).
O impacto do consumo de dietas ricas em açúcar ou gordura a longo-prazo no sistema
nervoso central (SNC) é de grande importância, já que estudos clínicos e pré-clínicos
45
demonstraram uma associação entre o aumento do consumo de dietas altamente energéticas
com uma vulnerabilidade aumentada de lesão cerebral e risco para o surgimento de déficits
neurológicos e cognitivos, incluindo demência e alzheimer (Eskelinen et al., 2008; Solfrizzi et
al., 2010; Stangl D e Thuret S 2009; Kanoski e Devidson 2011). O consumo de dietas
altamente calóricas a longo-prazo prejudicou o comportamento cognitivo pela redução da
plasticidade neural, acentuou o impacto negativo do estresse nos casos de ansiedade,
depressão e alterou a atividade do eixo HPA (Souza et al, 2007; Zenni et al, 2013).
Cabe destacar, que das diversas estruturas encefálicas, o hipocampo vem
demonstrando ser bastante vulnerável a mudanças na ingestão alimentar, principalmente por
ter sido observado prejuízos cognitivos em tarefas dependentes do hipocampo de animais
submetidos a ingestão de alimentos ricos em gordura e açúcar (Kanoski e Davidson, 2010;
Murray et al., 2009). Alguns estudos têm identificado alterações no hipocampo que podem
relacionar vias envolvidas entre o aumento do peso corporal induzido pelo consumo de dieta
altamente calórica e prejuízos cognitivos, como por exemplo, alterações em marcadores do
estresse oxidativo, inflamatório e diminuição nos níveis ou expressão de neurotrofinas
(Arcego et al., 2014; Krolow et al., 2013; Molteni et al., 2004; Pistell et al., 2010; Souza et al.,
2007). Outro estudo também mostrou que ratos expostos a uma dieta de cafeteria por seis
semanas, apresentaram uma redução na expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro
(BDNF) no hipocampo (Martire et al., 2014). No entanto, pouco ainda se compreende como
esses alimentos calóricos afetam o metabolismo periférico e central e se essas possíveis
alterações neuroendócrinas possam refletir no comportamento emocional do animal.
Dentro desse contexto, sabe-se que alimentos altamente palatáveis podem levar
alterações metabólicas que refletem no aumento do peso corporal assim como, alterações no
sistema nervoso central (Lottenberg et al., 2012; Martire et al., 2014; Spolidoro et al., 2012).
No entanto, a remoção abrupta desta dieta também tem demonstrado prejuízos no sistema
46
endócrino-metabólico. Um estudo mostrou que a remoção de uma dieta de cafeteria
diretamente ativa a resposta ao estresse por ativar o eixo HPA (Martire et al., 2014). Por outro
lado, tem sido demonstrado que a retirada de uma CAF restaura os níveis séricos de
triglicerídeos, glicose e a sensibilidade à insulina, assim como, melhoraram parâmetros
envolvidos com a síndrome metabólica em ratos (Lalanza et al., 2014). Sendo assim,
entender como o uso e a retirada de uma CAF durante as fases do desenvolvimento podem
programar o comportamento e o metabolismo do animal na idade adulta, torna-se uma
questão relevante de estudo. Baseado no exposto a cima, o objetivo deste estudo foi avaliar a
influência da exposição precoce, crônica e retirada de uma dieta de cafeteria sobre a ansiedade
e alterações neuroendócrinas em ratos Wistar adultos.
2. Material e Métodos
2.1 Animais experimentais
Trinta e seis ratos Wistar machos foram desmamados no 21º dia pós-natal,
randomizados e separados de acordo com peso para o início do experimento. Todos os
animais foram mantidos em gaiolas plexglass (65 x 25 x 15 cm), sob um ciclo claro de 12h e
um escuro também de 12h, a uma temperatura ambiente de 24 ± 2 ° C. Os ratos foram
distribuídos em três grupos aleatoriamente: controle (C, N = 12), dieta de cafeteria (DC; N =
12) ou retirada (R, N = 12). O grupo controle teve livre acesso apenas à ração padrão e água,
enquanto o grupo cafeteria (DC) foram alimentos do 21º dia de vida pós-natal até o 70º dia de
vida com dieta de cafeteria, ração padrão e água. O grupo retirada (R) recebeu dieta de
cafeteria até o 35º de vida e após apenas ração padrão até o 70º dia (cronograma na Figura 1).
Após 7 semanas de tratamento, os animais foram mortos por decapitação e as dosagens
bioquímicas foram realizadas. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas, sob o número 9599-2014.
47
2.2 Dietas
A ração padrão (Nuvilab CR-1, NUVITAL®, Curitiba, PR, Brasil) proporcionou 55%
de carboidratos, proteína 22% e 4,5% de gordura. (Informações fornecidas pelo fabricante), e
a dieta de cafeteria 60% de carboidratos, 15% de proteína e 20% de gordura. (Este valor foi
calculado com base em informações fornecidas pelo fabricante no rótulo da embalagem). Essa
dieta foi adaptada de acordo com a dieta conhecida como dieta de cafeteria ou dieta ocidental,
descrita anteriormente por Macedo et al. (2012). Alimentos utilizados na dieta foram bolachas
recheadas sabor chocolate, wafers sabor chocolate, salsichas, salgadinho, leite condensado. Os
animais que receberam a dieta de cafeteria tiveram livres acesso a ração padrão e água.
2.3 Consumo da dieta e ganho de peso
As dietas de cafeteria e ração padrão foram pesadas antes e depois de serem oferecidas
aos animais, a fim de mensurar o consumo dos alimentos. O consumo alimentar dos animais
foi obtido pelo peso em gramas do total dos alimentos por gaiola, e foi dividido pelo número
de animais, determinando o consumo médio por animal. Além disso, os animais foram
pesados semanalmente, e o ganho de peso foi definido com a diferença entre o peso inicial
(aos 21 dias de vida pós-natal) e peso final (aos 70 dias de vida pós-natal).
2.4 Testes comportamentais
2.4.1 Teste do campo aberto
O campo aberto foi realizado em uma arena de madeira aberta (60x40cm) com 12
quadrados medindo 15x13.3cm igualmente divididos. Fechado com muros de cinquenta
centímetros nas paredes laterais e fundo. A parede frontal feita de vidro, para possibilitar a
observação dos animais pelo pesquisador. Os animais realizaram o teste durante 5 minutos, e
foram avaliados parâmetros como, a atividade locomotora (número de cruzamentos de linha),
48
latência para deixar o primeiro quadrado, atividade exploratória (elevação de pé-direito com
as patas traseiras, atividade exploratória) e comportamento de limpeza.
2.4.2 Teste do labirinto em cruz elevado
O aparato do labirinto em cruz elevado é feito de madeira constituído de dois o braços
abertos opostos (48,5 × 10 cm), e dois braços fechados sem telhado (48,5 × 9,5 × 49 cm), e
uma porção aberta (13 × 10 cm) no centro. O labirinto foi elevado 50 cm acima do chão. O
animal foi colocado no centro do labirinto em cruz, virado para um dos braços abertos, e
manteve-se no aparato durante 5 minutos. Foram analisados o número de entradas e o tempo
nos braços abertos e fechados, e o índice de ansiedade, calculado de acordo com a equação 1-
[(Tempo no braço aberto/5 minutos) + (Entrada no braço aberto/Total de entradas)/2]. Índice
de ansiedade foi considerado entre 0 e 1, determinando que quanto mais alto fossem os
valores, maior o indicativo de comportamento do tipo ansioso. (Huynh et al. 2011; Walf e
Frye 2005).
2.5 Dissecação de gordura abdominal e inguinal
Quarenta e nove dias depois de receber dieta de cafeteria ou ração padrão os animais
foram mortos por decapitação (após 6 horas de jejum). As porções de gordura abdominal e
inguinal e glândulas adrenais foram cuidadosamente dissecadas e pesadas.
2.6 Análises bioquímicas
2.6.1 Preparação das amostras para medições bioquímicas
O sangue do tronco foi recolhido em tubos de EDTA para glicose, colesterol total,
triglicerídeos. O plasma foi separado e congelado -20°C até o dia da análise. O cérebro dos
animais foi dissecado, e o hipocampo foi removido e armazenado a -80°C até a análise. Parte
dos hipocampos foram homogeneizados em tampão de 50 vol (w: v) de fosfato de potássio 50
mM e 1 mM EDTA (pH 7,4). O homogeneizado foi centrifugado a 1000 x g durante 10 min a
49
4°C e o sobrenadante foi retirado para parâmetros de estresse oxidativo. A outra metade foi
homogeneizada em tampão de lise: 2,5 M de KCl, 10 mM de Hepes, 0,6 mM EDTA (pH 7,9),
0,1% e 1% de NP 40 e coquetel de inibidor de protease para a análise de proteínas por
Western Blotting.
2.6.2 Níveis plasmáticos de leptina, glicose e lipídios
A leptina foi medida por kit comercial de elisa (Milipore). Glicose, colesterol totais e
triglicerídeos foram medidos utilizando kits da empresa Labtest Diagnostica S.A.
2.6.3 Análise do imuno conteúdo de proteínas por Western blot
O hipocampo foi homogeneizados em igual concentrações de proteína (40 microgrma,
utilizando um kit comercial determinado como BCA Protein Assay [Thermo Scientific,
EUA]) foram carregadas em NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gels. Após a eletroforense, as
proteínas foram transferidas (XCell SureLock® Mini-Cell, Invitrogen) para membranas de
nitrocelulose (1 h a 50 V em tampão de transferência [Trizma 48 mM, glicina 39 mM,
metanol a 20%, e SDS a 0,25%]). A membrana foi submetida a 2 horas de incubação em
solução (TBS mais 5% de albumina de soro de bovino) de bloqueio. Após a incubação
durante a noite a 4°C, as membranas foram incubadas com os seguintes anticorpos: anti-
BDNF (1: 1000, Cell Signaling), anti-TrkB (1: 1000, Millipore), anti-AKT (1 1000, Cell
Signaling), anti-fosfo-AKT (Ser473, 1: 1000, Cell Signaling); anti-receptor de glucocorticóide
(GR, 1: 1000; Sigma), anti-sinaptofisina (SYP, 1: 500; Dako), anti-óxido nítrico sintase
neuronal (nNOS 1: 1000; Millipore) e anti-β-actina (1: 2000, Millipore). As membranas
foram lavadas três vezes, em seguida, ficaram 5 minutos com T-TBS e incubadas durante 2 h
em recipiente com solução contendo IgG anti-coelho conjugado com peroxidase (1: 1000,
Millipore). As membranas foram novamente lavadas quatro vezes durante 5 minutos com
TBS-T e depois em TBS. As bandas foram desenvolvidas utilizando um kit de
50
quimioluminescência ECL (Amersham, Oakville, Ontario). A quimiluminescência foi
detectada usando um sistema de imagem digital (Imagem Quant LAS 4000, a GE Healthcare
Life Sciences) e os blots foram analisados utilizando a imagem J Software. Os resultados
foram expressos como a razão entre a intensidade da proteína de interesse com a intensidade
de anti-β-actina a partir da mesma membrana.
2.6.4 Conteúdo total de sulfidrila (SH)
Este ensaio foi realizado como descrito por Aksenov e Markesbery (2001), baseado na
redução de DTNB por tióis, que, por sua vez, torna-se oxidado gerando um derivado amarelo
(TNB) cuja absorção é medida espectrofotometricamente a 412 nm. Resumidamente, os
homogeneizados foram adicionados ao recipiente contendo tampão PBS (pH 7,4) contendo
EDTA. A reação foi iniciada pela adição de 5,5'-ditio-bis (2-ácido nitrobenzóico) (DTNB). Os
resultados foram apresentados como nmol por mg de proteína.
2.6.5 Formação de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
A medida da peroxidação lipídica foi determinada pelo TBARS de acordo com o
descrito pelo protocolo Esterbauer e Cheeseman (1990). Os homogeneizados foram
misturados com ácido tricloroacético a 10% e ácido tiobarbitúrico a 0,67% e aquecidos em
banho de água fervente durante 25 minutos. TBARS foi determinado por absorbância a 535
nm. Foram apresentados resultados de TBARS como nmol por mg de proteína.
2.6.6 Atividade da Glutationa Peroxidase (GPX)
Atividade de GPX foi determinada usando kit comercial fornecido pela RANDOX
(Brasil). GPX catalisa a oxidação da glutationa (GSH) por hidroperóxidos. Nas presenças de
glutationa redutase (GR) e NADPH, a glutationa oxidada (GSSG) é convertida para a forma
51
reduzida imediatamente com uma concomitante oxidação de NADPH a NADP+. A
absorbância a 340 nm é medida.
2.6.7 Atividade da Catalase (CAT)
A atividade de CAT foi realizada pelo método de Aebi (1984). Degradação de H2O2
foi continuamente monitorada durante 90s em espectrofotômetro ajustado a 240 nm.
Atividade específica de CAT foi relatada como unidades por mg de proteína.
2.6.8 Atividade da Superóxido dismutase (SOD)
A atividade total SOD foi medida pelo método descrito por Misra e Fridovichn (1972).
Este método baseia-se na inibição de superóxido dependente auto-oxidação adrenalina num
espectrofotômetro ajustado a 480 nm. A atividade específica de SOD foi relatada como
unidades por mg de proteína.
2.6.9 Dosagem de proteína
A concentração de proteína foi determinada nas amostras utilizando o método descrito
por Lowry et al. (1951) com albumina de soro bovino como padrão.
2.7 Análises Estatísticas
Os dados foram analisados por meio de ANOVA de uma via seguida pelo teste de
post-hoc de Tukey demonstrados como média ± SEM, e ANOVA de medidas repetidas,
quando indicado. Todas as análises foram realizadas utilizando o software SPSS 22.0 e o
nível de significância foi considerado quando o P <0,05 para todas as análises.
52
3.0 Resultados
3.1 Consumo de dieta de cafeteria e ganho de peso
Nos animais que receberam dieta de cafeteria do 21º até o 60º dia de vida foi
observado um aumento do consumo de dieta de cafeteria ao longo do tempo [medidas
repetidas ANOVA, F (3,44, 438,49) = 10,35, P <0,001, correção de Greenhouse-Geisser,
seguido de Tukey post-hoc] em relação ao grupo de controle e grupo de retirada, conforme
exibido na Fig. 3. Além disso, em relação ao ganho de peso (Fig. 2), os ratos que receberam
dieta de cafeteria até a adolescência ou idade adulta apresentaram um maior ganho de peso [F
(1,72) = 6,80; P <0,02, seguido pelo post-hoc de Tukey] do que o grupo controle.
3.2 Gordura abdominal e inguinal e peso glândula adrenal
A deposição de gordura inguinal, abdominal e peso das glândulas adrenais foram
analisados e apresentados na Tabela 1. Foram observadas diferenças significativas na gordura
abdominal [One-way ANOVA; F (2,35) = 40,14, P <0,0001], inguinal [One-way ANOVA; F
(2,35) = 38,33, P <0,0001]. O grupo DC teve aumento da gordura abdominal e inguinal
quando comparado com o grupo C e grupo R. No que diz respeito ao peso da glândula
adrenal, houve um efeito significativo da exposição à dieta de cafeteria durante o período da
adolescência [One-way ANOVA; F (2,34) = 3,96, P <0,02], uma vez glândula adrenal do
grupo DC apresentou aumento de peso.
3.3 Testes comportamentais
3.3.1 Campo Aberto e Labirinto em Cruz elevada
Na tarefa do campo aberto foi observado uma maior latência do grupo DC para sair do
primeiro quadrado do aparato diferença significativa na latência para deixar o primeiro
quadrado [F (2,35) = 5,15, P= 0,01] (Tabela 2), sendo esse, maior no grupo DC. No houve
53
diferença significativa em nenhum parâmetro avaliado no teste do labirinto em cruz elevado
(P>0,05) (Tabela 3).
3.4 Análises bioquímicas
3.4.1 Níveis de leptina, glicose e perfil lipídico.
A exposição a dieta de cafeteria aumentou os níveis de leptina [F (2,18) = 10,02, P
<0,001], enquanto o grupo R mostrou os níveis de leptina semelhantes ao grupo controle. Os
níveis de glicose mostraram um efeito significativo da dieta de cafeteria [F (2,16) = 13,78, P =
0,0005]. Não foram encontradas diferenças nos triglicéridos (P> 0,05) e colesterol total (P>
0,05). Os resultados foram analisados utilizando uma ANOVA de uma via e são apresentados
na Tabela 4.
3.4.2 Estresse Oxidativo
Parâmetros de estresse oxidativo foram analisados após a exposição à dieta de
cafeteria dieta (Fig. 4). Para a atividade da GPx, houve um efeito expressivo de dieta e sua
remoção [F (2,11) = 25,27, P = 0,002]. Houve aumento da atividade de SH com a remoção da
dieta [F (2,14) = 7,19, P = 0,008]. Dieta de cafeteria aumentou atividade da SOD [F (2,13) =
9,37, P = 0,004]. Os resultados demonstraram que não houve diferença nos grupos do CAT e
TBARS.
3.4.3 Western Blotting
Os níveis de receptores de glicocorticóides [F (2,20) = 4,86; P = 0,02, seguido post-
hoc de Tukey], receptor TrkB [F (2,17) = 6,92; P <0,01, seguido de teste de post-hoc de
Tukey] e nNOS [F (2,15) = 5,35; P = 0,02, seguido de teste de post-hoc de Tukey foram
reduzidos pelo acesso crônico a dieta de cafeteria. No entanto, o imuno conteúdo de BDNF,
54
AKT, p-AKT e sinaptofisina não apresentaram diferença em nenhum dos grupos (P> 0,05, ver
Figura 5).
4. Discussão
No presente estudo, nós avaliamos os efeitos do consumo precoce e crônico de uma
dieta altamente calórica sobre o comportamento ansioso, parâmetros metabólicos e
neuroquímicos em animais adultos. Além disso, também foram verificados os efeitos da
retirada abrupta desta dieta na adolescência analisando os mesmos parâmetros na idade adulta.
De acordo com os parâmetros comportamentais avaliados para determinar ansiedade, apenas
em um parâmetro de análise, da tarefa do campo aberto, foi observado um comportamento do
tipo ansioso nos animais que receberam dieta de cafeteria ao longo da vida. Além disso,
ambos os animais que receberam dieta de cafeteria ao longo da vida e também até
adolescência aumentaram o ganho de peso quando este foi avaliado na idade adulta. O
consumo crônico desta dieta altamente calórica levou a alterações metabólicas periféricas
como aumento da glicemia, aumento da leptina plasmática, assim como, aumento da gordura
abdominal, inguinal e aumento do peso das adrenais. Com relação às alterações hipocampais
observadas, foi verificada uma resposta oxidativa celular equilibrada e uma diminuição na
expressão de proteínas como receptores de glicocorticoides, oxido nítrico sintase neuronal e
no receptor TRKB. Interessante, que alguns dos parâmetros alterados pelo consumo crônico
desta dieta altamente calórica, foram revertidos na idade adulta pela retirada deste alimento
durante a adolescência.
O comportamento emocional pode ser influenciado pela ingestão de alimentos
altamente palatáveis (Benton et al., 2010; Canetti et al., 2002; Sinha et al., 2013). Baseado
neste contexto, em situações de estresse ou ansiedade pode ocorrer um aumento na ingestão
de alimentos altamente calóricos como forma de tentar reduzir o impacto negativo ocasionado
55
por alterações no comportamento emocional (Bennett et al., 2013; Sinha et al., 2013). No
entanto, pensar se o consumo crônico de alimentos ricos em açúcar e gordura possa induzir
alterações no comportamento emocional é um campo a ser compreendido visto que, os
estudos ainda são bastante contraditórios e pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos na
interação entre o consumo alimentar de dietas palatáveis e alterações comportamentais no
SNC. Interessante que o consumo de dieta de cafeteria pode ter efeitos opostos no que tange o
comportamento do tipo ansioso nos animais. Um estudo mostrou que ratos obesos induzidos
pelo consumo crônico de dieta altamente calórica foram mais ansiosos e agressivos do que
ratos não obesos (Buchenauer et al., 2009). Por outro lado, um recente estudo mostrou que
ratos que receberam dieta de cafeteria desde o desmame até a idade adulta mostraram uma
redução no comportamento ansioso em diferentes tarefas comportamentais (Lalanza et al.,
2014). No nosso estudo, foi encontrado um indicativo de comportamento ansioso, pois os
animais que receberam dieta de cafeteria quando realizaram a tarefa do campo aberto
apresentaram uma maior latência para sair do primeiro quadrado e explorar o aparato. Este
tipo de análise já é estabelecido e indicativo de comportamento do tipo ansioso, (Filho et al.,
2016). Além disso, é importante destacar que quando a dieta de cafeteria foi retirada os
animais diminuíram o tempo de latência para sair do primeiro quadrado e explorar o aparato.
Baseado neste contexto, ainda não está claro as implicações emocionais diretas do
comportamento alimentar, sendo necessário mais estudos para elucidar a influência de dietas
altamente calóricas sobre diferentes tipos de comportamento emocional.
Considerando o ganho de peso até os 70 dias de idade, os grupos que receberam dieta
de cafeteria ou de forma crônica ou até os 35 dias de idade aumentaram o ganho de peso o que
possivelmente foi refletido pelo o aumento de consumo de dieta em gramas como foi
observado nos grupos que receberam dieta de cafeteria em algum momento da vida. Com
relação ao depósito de gordura corporal, o grupo que recebeu dieta de cafeteria até a idade
56
adulta aumentou o depósito de gordura abdominal e inguinal. No entanto, quando houve a
retirada desta dieta na adolescência houve uma redução no depósito de gordura corporal
comparada ao grupo que recebeu dieta altamente calórica até a idade adulta. Esses achados
sugerem que o período de retirada foi importante para reduzir o depósito de gordura corporal,
mas não foi suficiente para reduzir o ganho de peso destes animais.
Outros fatores metabólicos importantes que também foram alterados pelo consumo
crônico de dieta de cafeteria, somado ao aumento do peso corporal podem contribuir para o
risco de síndrome metabólica (Lottenberg et al., 2012; Spolidoro et al., 2012). Neste estudo,
foi verificado um aumento nos níveis plasmáticos de glicose no sangue dos animais que
receberam dieta de cafeteria até a idade adulta. No entanto, quando a dieta na adolescência foi
retirada, verificamos uma diminuição significativa nos níveis plasmáticos da glicose,
indicando que o aumento da glicemia é influenciado pelo o tipo e o tempo de alimento
ingerido. Além disso, também foi verificado aumento nos níveis plasmáticos do hormônio
leptina nestes animais. A produção de leptina correlaciona-se positivamente com a massa do
tecido adiposo (Benoit et al., 2004), e os níveis circulantes de leptina estão envolvidas em
ambas as vias de sinalização como, nas que regulam os estoques energéticos e nas que
regulam a ingestão alimentar. Nós encontramos que os animais que consumiram dieta de
cafeteria de forma crônica aumentaram os níveis circulantes de leptina os quais podem estar
correlacionados com o aumento da gordura abdominal encontrado nestes mesmos animais. O
aumento dos níveis de leptina pode agir no hipotálamo para diminuir o apetite (Casanueva e
Dieguez, 1999). No entanto, neste estudo, os animais que receberam dieta de cafeteria
aumentaram o consumo alimentar em gramas ao longo da vida. Isto pode ter ocorrido devido
à baixa sensibilidade do hormônio leptina no hipotálamo ocorrendo possivelmente resistência
aos efeitos endógenos da leptina (Zhang et al., 2006). Essas alterações no metabolismo
periférico induzidas pelo o consumo de dieta de cafeteria, desde o desmame até o início da
57
idade adulta podem ser fatores de risco para o desenvolvimento de síndrome metabólica e
obesidade, pois o consumo de dietas ricas em açúcar e gordura a longo-prazo associado com
um estilo de vida sedentário tem sido relacionado com o aumento da prevalência a obesisade
(Lottenberg et al., 2012; Spolidoro et al., 2012).
A influência de dietas ricas em açúcar e gordura durante as fases precoces do
desenvolvimento podem modificar a maturação dos circuitos neurais e levar a prejuízos no
comportamento ou doenças na idade adulta (Sisk e Zehr, 2005). Nós avaliamos alguns
biomarcadores importantes para maturação dos circuitos neurais a fim de tentar elucidar
alguns mecanismos de ação que a dieta de cafeteria pode modular no SNC. A estrutura de
análise para esses marcadores foi o hipocampo uma vez que essa estrutura encefálica é
vulnerável aos efeitos do consumo de dietas altamente palatáveis (Arcego et al., 2014;
Molteni et al., 2004; Pistell et al., 2010; Souza et al., 2007; Krolow et al., 2013). Devido o
hipocampo apresentar um maior número de receptores de glicocorticoides foi verificado como
estaria à expressão desses receptores no hipocampo por influência do consumo crônico de
deita de cafeteria. Nós observamos uma diminuição na expressão destes receptores no
hipocampo de animais adultos. Interessante que quando as glândulas adrenais destes animais
foram pesadas, foi verificando um aumento no peso destas glândulas. Essas alterações
encontradas tanto perifericamente como central indicam que possivelmente o eixo
hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) possa estar mais ativo devido à diminuição do sistema de
retroalimentação negativa, mediado pelos receptores de glicocorticoides no hipocampo e o
aumento nas glândulas adrenais. Alguns estudos mostraram que a ingestão de dietas altamente
calóricas alteram alguns mediadores do eixo HPA, incluindo a redução na expressão dos
receptores de glicocorticoides, aumento na expressão dos receptores do hormônio liberador de
corticotropina do tipo 1 (CRH1) e aumento nos níveis plasmáticos de corticosterona
(Abildgaard et al.,2014; Iemolo et al., 2013; Laryea et al., 2015; McNeilly et al., 2015). Essa
58
possível hiperatividade do eixo HPA possa ser o reflexo no comportamento do tipo ansioso
observado nos animais quando expostos ao aparato do campo aberto. Outro ponto importante,
é que muitos mediadores do eixo HPA apresentam receptores para o hormônio leptina,
indicando que este hormônio regula a resposta do estresse diminuindo a hiperatividade do
eixo HPA (Arvaniti et al., 2001; Oates et al., 2000). É possível que os altos níveis circulantes
de leptina encontrados no plasma dos animais que receberam dieta de cafeteria ao longo da
vida possam estar induzindo resistência nos receptores hipotalâmicos e levando a uma
redução nos efeitos endógenos deste hormônio levando a perda do controle do eixo HPA. No
entanto, neste estudo não foram avaliados os receptores para o hormônio da leptina, sendo
importante a realização de mais estudos que possam avaliar os efeitos deste hormônio sobre o
eixo HPA.
No presente estudo foram avaliados biomarcadores envolvidos com plasticidade
neural. Dentre eles, a neurotrofina BDNF a qual exerce muitas funções biológicas mediadas
pela ligação em seu receptor TRKB desencadeando resposta celular através de cascatas de
sinalização incluindo a via de sinalização da AKT e AKT fosforilada. Os resultados
mostraram que o consumo de dieta de cafeteria até a idade adulta diminuiu a expressão do
receptor TRKB sem alterar a expressão do BDNF ou da via de sinalização mediada pela AKT
e AKT fosforilada. Alguns estudos demonstraram que dietas altamente calóricas alteraram a
expressão do BDNF no hipocampo de animais (Granholm et al., 2008; Cui et al., 2012; Lefa
et al., 2015). Além disso, estudo realizado em animais obesos reportou uma redução na
expressão da neurotrofina BDNF e no receptor TRKB (Yu et al., 2009). Também foi
verificado que o consumo de dieta rica em gordura e açúcar reduziu a expressão de BDNF no
hipocampo resultando um prejuízo no aprendizado e na memória dos animais (Molteni et al.,
2004; Woo et al., 2013).
59
Outros parâmetros envolvidos com a maturação e plasticidade do hipocampo foram
avaliados. Nós encontramos uma resposta oxidativa celular mediada pela dieta de cafeteria,
pois os sistemas antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos se mostraram aumentados. Este
aumento nas defesas antioxidantes é provavelmente resultado da formação de espécies
reativas do oxigênio ou nitrogênio no esforço em proteger a célula contra dano oxidativo. No
entanto, a técnica utilizada neste estudo para avaliação do dano oxidativo lipídico não
mostrou diferença significativa. Muitos estudos já avaliaram parâmetros de estresse oxidativo
no hipocampo de animais que receberam dietas altamente calóricas. Dentre esses estudos,
alguns observaram também um aumento expressivo na atividade da SOD, GPx e no conteúdo
de tióis totais no hipocampo de animais que haviam recebido dieta rica em açúcar ou gordura
(Arcego et al., 2014; Krolow et al., 2012). Adicionalmente, foi verificado uma diminuição na
expressão da enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) no hipocampo dos ratos que
consumiram cronicamente a dieta de cafeteria. Esta enzima é responsável pela conversão do
aminoácido L-arginina na presença de NADPH e oxigênio em óxido nítrico (NO). O NO é um
exemplo de espécie reativa do nitrogênio, mas pode apresentar diferentes efeitos na célula.
NO pode combinar-se com ânion superóxido levando a produção de peroxinitrito, uma
espécie reativa altamente potente para célula, ou pode modular o fluxo sanguíneo, a
plasticidade neural e contribuir para melhorar o aprendizado e a memória em diversas áreas
encefálicas, incluindo o hipocampo (Noschang et al., 2010; Pacher et al., 2007).
Os resultados encontrados neste trabalho sugerem que o consumo precoce e crônico de
dieta de cafeteria induziu alterações sobre o comportamento do tipo ansioso e alterações
neuroendócrinas. O efeito da retirada, desta dieta altamente calórica, na adolescência
contribuiu para melhorar o comportamento do tipo ansioso, assim como alguns parâmetros
metabólicos, principalmente periféricos. Interessante observar que este estudo mostrou que o
consumo de dieta de cafeteria reduziu marcadores importantes para maturação dos circuitos
60
neurais durante a idade adulta. Além disso, estes achados ajudam a compreender, pelo menos
em parte, o potencial efeito das alterações do metabolismo periférico sobre o cérebro. No
entanto, mais estudos são necessários para entender essas alterações neuroendócrinas induzida
pelo consumo e retirada de uma dieta de cafeteria durante as fases do desenvolvimento.
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65
Figuras e Tabelas
Figura 1. Linha do tempo do experimento.
66
1 2 3 4 5 6 70
20
40
60Controle
Dieta de Cafeteria
Retirada
Semanas
Co
nsu
mo
da d
ieta
(g
)
Figura 2. Efeito da dieta de cafeteria e do grupo retirada sobre o consumo da dieta
durante 7 semanas. Dados expressos como média ± SEM. Anova de medidas repetidas
(P <0,05).
67
C DC R
0
100
200
300
400
*
*
Gan
ho
de p
eso
co
rpo
ral
Figura 3. Efeito da dieta de cafeteria e do grupo retirada no ganho de peso avaliado
durante 7 semanas. Dados expressos como média ± SEM. Anova de uma via seguida
por teste de Post hoc de Tukey (P <0,05). * Significativamente diferente do controle.
68
C DC R
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
AT
BA
RS
(nm
ol/m
g p
rote
ína)
C DC R0
20
40
60
*#
B
SH
(nm
ol/m
g p
rote
ína)
C DC R
0
10
20
30
40
C
**
GP
X
nm
ol N
AD
PH
oxid
ize
d/m
in/m
g
C DC R0
1
2
3
4
5
D
CA
T
(un
its/m
g p
rote
ína)
C DC R
0
10
20
30
40 *
E
#
SO
D
(un
its/m
g p
rote
ína)
Figura 4. Efeito da dieta de cafeteria e retirada na formação de TBARS (A), conteúdo
total SH (B), GPX (C), catalase (CAT, D) e superóxido dismutase (SOD, E); no
hipocampo de ratos adultos. Dados foram expressos em média ± SEM, (n = 5/grupo),
e analisados por ANOVA de uma via seguida por teste post hoc de Tukey (P <0,05).
*Significativamente diferente do controle. #Significativamente diferente do grupo
dieta de cafeteria.
69
C DC R
0.0
0.5
1.0
1.5
AB
DN
F/ß
-acti
na
C DC R
0.0
0.5
1.0
1.5
B
*
TR
KB
/ß-a
cti
na
C DC R
0.0
0.5
1.0
1.5
C
AK
T/ß
-acti
na
C DC R
0.0
0.5
1.0
1.5
D
PA
KT
/ß-a
cti
na
C DC R
0.0
0.5
1.0
1.5
E
SY
N/ß
-acti
na
C DC R
0.0
0.5
1.0
1.5
F
*
nN
os/ß
-acti
na
C DC R
0.0
0.5
1.0
1.5
*
G
GR
/ß-a
cti
na
Figura 5. Efeito da dieta de cafeteria nos níveis de BDNF (A), TRKB (B), AKT (C),
PAKT (D), SYN (E), nNos (F) e GR (G) no hipocampo de ratos adultos. Dados foram
expressos em média ± SEM, (n = 5/grupo), e analisados por ANOVA de uma via
seguida por teste post hoc de Tukey (P <0,05). * Significativamente diferente do
controle.
70
Tabela 1. Efeitos da dieta de cafeteria e sua retirada no período da adolescência nos
pesos de gordura abdominal, inguinal e glândula suprarrenal em ratos adultos.
Controle Dieta de Cafeteria Retirada
Gordura abdominal 4,24±0,40 10,10±0,60a
5,50±0,46b
Gordura inguinal 4,37±0,27 9,30±0,51a
5,86±0,40ab
Glândula adrenal 0,09±0,003
0,10±0,006 0,08±0,06b
Os dados foram analisados por ANOVA de uma via seguida por teste post hoc de
Tukey (P <0,05). Os resultados foram expressos em media ± S.E.M. N = 10-12 /
grupo.
aSignificativamente diferente do controle.
bSignificativamente diferente da dieta de cafeteria.
71
Tabela 2. Efeitos da dieta de cafeteria e sua retirada sobre o comportamento de
ratos adultos, mensurado através do teste do Campo aberto, analisando latência para
deixar o primeiro quadrado, número de cruzamentos, quantidade de grooming e
atividade exploratória.
Controle Dieta de Cafeteria Retirada
Latência 9,17±4,18 23,41±4,79*
8,50±0,92#
Cruzamento 80,17±7,11 71,50±5,22
81,75±3,74
Gromming 0,92±0,34
0,83±0,27 0,17±0,11
Atividade Exploratória 4,17±1,05 4,75±1,44 2,83±0,88
Os dados foram analisados por ANOVA de uma via seguida por testes post hoc de
Tukey. (P <0,05). Os resultados foram expressos em media ± S.E.M. N = 10-12 /
grupo.
aSignificativamente diferente do controle.
bSignificativamente diferente da dieta de cafeteria.
72
Tabela 3. Análise dos efeitos da dieta de cafeteria e sua retirada sobre o
comportamento de ratos adultos, através do teste do labirinto em cruz elevada,
analisando o tempo e número de entradas nos braços abertos e fechados, além do
Índice de Ansiedade.
Controle Dieta de Cafeteria Retirada
Tempo no braço fechado 137,1±14,39 155,8±18,52
150,3±16,92
Tempo no braço aberto 81,0±14,26 84,88±16,53
118,50±27,36
Entradas no braço fechado 3,1±0,48 3,81±1,13 3,27±0,50
Entradas no braço aberto 4,1±0,50 5,54±1,01 3,90±0,60
Índice de ansiedade 0,61±0,075 0,6±0,087
0,59±0,07
Os dados foram analisados por meio de ANOVA de uma via seguida por teste post
hoc de Tukey. Os resultados foram expressos em média ± S.E.M. N = 8. Não houve
diferença estatística em nenhum dos parâmetros analisados (P>0,05).
73
Tabela 4. Efeitos da e dieta de cafeteria e sua retirada no período da adolescência
nos níveis plasmáticos de glicose, leptina, colesterol total e triglicérides em ratos
adultos.
Controle Dieta de Cafeteria Retirada
Glicose 128,8±2,88 159,70±6,29a
128,7±4,21b
Leptina 2,95±0,42 25,20±7,15a
3,90±0,52b
Colesterol Total 46,32 ± 0,70
47,81±4,09 41,33±1,69
Triglicerídeos 157,8±19,66 193,4±27,24
162,0±25,14
Os dados foram analisados por ANOVA de uma via seguida por teste post hoc de
Tukey (P <0,05). Os resultados foram expressos em media ± S.E.M. N = 6 / grupo.
aSignificativamente diferente do controle.
bSignificativamente diferente da dieta de cafeteria.
74
Considerações Finais
Após utilizarmos dieta de cafeteria por 7 semanas, encontramos resultados
semelhantes a outros estudos, principalmente relacionados a alterações metabólicas
periféricas, como aumento do peso corporal, peso das gorduras abdominal e
inguinal e aumento nos níveis plasmáticos de glicose e leptina. Além disso,
encontramos um comportamento do tipo ansioso, nos animais que receberam dieta
de cafeteria durante toda vida. Nosso estudo ainda verificou quais seriam as
possíveis alterações no sistema nervoso central devido a essas alterações
periféricas, para isso, foram avaliados biomarcadores importantes dos circuitos
neurais.
Interessantemente conseguimos observar que a retirada abrupta da dieta de
cafeteria no período da adolescência foi crucial para a normalização de alguns
parâmetros metabólicos, além de controlar o comportamento do tipo ansioso.
Tais resultados são de extrema importância, principalmente para fortalecer o
quanto uma dieta rica em açúcar e gordura é prejudicial para a saúde, e como uma
interrupção da mesma, é capaz de normalizar os parâmetros alterados. Sendo
assim, cada vez mais comprovamos a necessidade da preocupação com obesidade
e sobrepeso, já que verificamos, pelo menos em parte, que alterações periféricas
são capazes de refletir no cérebro.
75
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