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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE MATERIAIS
ÓXIDO DE GÁLIO AMORFO – SÍNTESE, CARACTERIZAÇÕES, ENSAIOS
IN VITRO DE CITOTOXIDADE E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
RECIFE
2017
ALESSANDRA FLÁVIA DIAS RAMALHO
ÓXIDO DE GÁLIO AMORFO – SÍNTESE, CARACTERIZAÇÕES, ENSAIOS
IN VITRO DE CITOTOXIDADE E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Orientador: Prof. Dr. Marco Antônio Sacilotti
Co-orientador: Prof. Dr. Severino Alves Júnior
RECIFE
2017
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado
em Ciência de Materiais do Centro de Ciências
Exatas e da Natureza da Universidade Federal
de Pernambuco, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em Ciência de
Materiais.
Bibliotecária Joana D’Arc Leão Salvador CRB 4-572
R165o Ramalho, Alessandra Flávia Dias.
Óxido de gálio amorfo - síntese, caracterizações, ensaios in vitro de citotoxidade e atividade antimicrobiana / Alessandra Flávia Dias Ramalho. – 2017.
87 f.: fig., tab. Orientador: Marco Antônio Sacilotti. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCEN. Ciência de Materiais, Recife,
2017. Inclui referências e anexo.
1. Nanotecnologia. 2. Óxidos. 3. Aplicações odontológicas. 4. Nanomateriais. I. Sacilotti, Marco Antônio (Orientador). II. Titulo.
620.5 CDD (22. ed.) UFPE-FQ 2017-17
13 02 2017
Dedico esta dissertação a um grande amigo, Vital Epiphani Lemos (seu Vital) (in memorian),
que não pôde estar presente fisicamente comigo nesta trajetória do mestrado, mas, ao lado de
Deus, tenho certeza de que emitiu muitas energias positivas que me protegeram, iluminaram
e continuam abrindo os meus caminhos na direção certa. Um Mestre na colocação das
palavras certas, nos momentos pertinentes. Um dia nos reencontraremos e eu poderei fazer
meu agradecimento especial a você. Fique na luz, meu amigo!
AGRADECIMENTOS
Primeiramente e sempre a DEUS, meu Grande Amigo, por ter colocado em minha
vida tantas oportunidades desafiadoras e, ao mesmo tempo, guiado meus passos no caminho
certo, ao lado das pessoas do BEM, impulsionando a vontade imensa de vencer os obstáculos
da vida com muita sabedoria.
Aos meus pais, Severino Dias Ramalho e Maria José da Silva Ramalho, por terem
conduzido minha educação de maneira ímpar, pela qual, não mediram esforços em prol de
minhas realizações pessoais e profissionais, enfim, de minha Felicidade! À minha
personalidade batalhadora e determinada, eu dedico especialmente a vocês dois!
Aos meus irmãos, Clóvis Fernandes Dias Ramalho e Ana Cláudia Dias Ramalho,
meus grandes incentivadores, exemplo de pessoas íntegras, vitoriosas na sua essência, os
quais mostraram que, para as grandes conquistas, a lealdade, dignidade e dedicação são
primordiais.
À luz da minha vida, minha cadelinha Poodle, Malu, um presente lindo de Papai do
Céu, que está comigo há doze anos e me faz feliz todos os dias. Ao seu lado, os momentos
mais difíceis foram superados com mais tranquilidade! Te amo, Lulu! Para sempre!
À minha querida amiga, Ana Tereza de Albuquerque Lemos (Tetê). Você é uma das
pessoas do Bem que Deus colocou nessa trajetória que venho seguindo e que me levou a
tantas vitórias. Em dez anos de sua amizade, eu tenho muito a agradecer, principalmente pela
oportunidade da convivência com um ser humano de um coração tão lindo, nas suas principais
virtudes e infinita bondade, e que me faz acreditar nos meus sonhos e ajuda a realizá-los.
Ao meu orientador Prof. Dr. Marco Antônio Sacilloti, do Departamento de Física
(DF), da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), pelo entusiasmo fascinante pela
Ciência, em especial, aplicada ao avanço no campo da Saúde. Sua humildade em acreditar que
ainda há muito o que se aprender foi um dos motivos que me fez optar por sua orientação
nesta pesquisa. Meus sinceros agradecimentos pela aceitação desse convite e ter feito parte
desta etapa vitoriosa, tão importante para mim.
Ao meu co-orientador e Vice-Coordenador do Programa de Pós Graduação em
Ciência de Materiais (PPGMT) da UFPE, Prof. Dr. Severino Alves Júnior, um grande
conhecedor da área de Biomateriais, que sempre esteve disponível, esclarecendo e opinando
nas dúvidas que foram surgindo, durante o desenvolvimento desta dissertação, além do
incentivo constante, com palavras positivas e seu sorriso amigável. Meu muito obrigada,
Professor Júnior!
À minha orientadora externa Profª. Drª. Renata Cimões Jovino Silveira, do
Departamento de Prótese e Cirurgia Buco Maxilo Facial da UFPE, por ter me encorajado a
seguir no rumo certo desta pesquisa que, de fato, proporcionou a coleta de frutos promissores
para novos estudos posteriores. Imensamente grata!
Ao Professor Dr. Eduardo Henrique Lago Falcão, ex Coordenador do Programa de
Pós Graduação em Ciência de Materiais UFPE, pelas palavras gentis e incentivadoras, quando
das primeiras dúvidas ainda sobre o desconhecido, exatamente na fase inicial deste Curso e
durante as diversas vezes que precisei me reportar para esclarecimentos diversos.
A todos os professores do PPGMT da UFPE, com os quais tive a grata oportunidade
de aprender e aplicar novos e importantes conhecimentos, complemento importante para meu
Curso de formação, a Odontologia.
Aos meus companheiros, alunos do Mestrado e Doutorado em Ciência de Materiais da
UFPE, pela agradável convivência diária, aprendizados nas longas maratonas de estudo, e, em
especial às amigas Sueli, Evanise e Sônia. A Carol, Felipe, Leonardo, Stterferson, Rudson
e Talita, agradeço também pela imensa colaboração e orientações pertinentes com o
desenvolvimento desta pesquisa. Vocês fizeram a diferença! Minha eterna gratidão!
À Profª. Drª. Teresinha Gonçalves da Silva, do Departamento de Antibióticos da
UFPE, pela indicação das professoras Drª. Isla Vanessa Bastos e Drª Jaciana dos Santos
Aguiar, do Departamento de Antibióticos da UFPE, na orientação e execução dos Ensaios de
Citotoxidade, presentes nesta pesquisa; e da Profª. Drª. Thaysa Christina Montenegro
Stamford, do Departamento de Medicina Tropical, do Centro de Ciências da Saúde da UFPE,
por sua contribuição ímpar, tão importante durante os Testes de Atividade Antimicrobiana.
Muito obrigada pela gentileza da participação imprescindível das Senhoras!
Aos pesquisadores Sérgio dos Santos Silva, do laboratório de microscopia eletrônica,
do Departamento de Física da UFPE; Gian Silva Duarte, do Centro de Tecnologias
Estratégicas do Nordeste (CETENE) e Miguel Angel Pelagio Flores, do laboratório de
microscopia do CETENE, pelo apoio incondicional com a execução e análise das diversas
técnicas de caracterização, que elevaram significativamente o teor científico desta pesquisa.
Muito Obrigada a todos vocês!
Às secretárias do PPGMT da UFPE, Heloisa Henrique da Silva e Ingrid Vanessa
Almeida da Silva, além de todos os estagiários deste setor, que, com suas informações e
prestações precisas das diversas solicitações, somaram positivamente no prosseguimento
desta minha jornada acadêmica! Aos demais funcionários do Centro de Ciências Exatas e da
Natureza (CCEN), também externo aqui meus sinceros agradecimentos!
Por fim, porém não menos importante, minha gratidão a todos os demais amigos e
amigas do meu convívio profissional e pessoal, que diretamente ou indiretamente,
acreditaram, cooperaram e torceram pela concretização deste sonho! A Vitória é nossa!!!
“O homem jamais teria
conseguido o possível, se por
diversas vezes não tentasse o
impossível”
.
(Max Huber)
RESUMO
O gálio é um metal do grupo III A, número atómico 31 da tabela periódica, descoberto pela
primeira vez em 1875 por Paul-Émile Lecoq de Boisbaudran, na França. Por sua baixa
temperatura de fusão de 28,7 °C; é um dos poucos metais que é quase líquido à temperatura
ambiente e pode derreter quando segurado na mão. Algumas das características do gálio lhes
permitem interagir com processos celulares e proteínas biologicamente importantes,
especialmente aquelas do metabolismo do ferro. Isso levou ao desenvolvimento de certos
compostos de gálio como agentes de diagnóstico e terapêutica em medicina, inclusive para
doenças infecciosas. Neste estudo, foi sintetizado um óxido à base de gálio, de composição
não estequiométrica, por pirólise à combustão espontânea de Trietil Gálio e, posteriormente,
oxidado a três temperaturas distintas, pelo sistema CVD (Chemical Vapor Deposition). As
amostras do pó de óxido de gálio amorfo (a-GaxOy), obtidas, foram caracterizadas por
Difração de Raios X (DRX), comprovando a existência de fase amorfa e início de
cristalinidade; Espectroscopia por Dispersão em Energia (EDS), determinando o percentual
atômico de gálio, oxigênio e carbono; Microscopia eletrônica de varredura (MEV), com
avaliação morfológica estrutural externa das amostras, e Espectroscopia Raman. Visando, em
estudos posteriores, o uso do referido óxido na composição de materiais odontológicos
diversos, com finalidade antimicrobiana, o objetivo desta dissertação foi avaliar, inicialmente,
sua citotoxidade, in vitro, pelo método do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazólio), utilizando dois tipos de linhagem celular (RAW 264.7 e VERO).
Posteriormente, foi avaliada sua atividade antimicrobiana, através da determinação da
Concentração Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração Bactericida Miníma (CBM), pela
técnica da microdiluição, na presença de cepa bacteriana de Streptococcus mutans (S. mutans)
AU 159, potentes bactérias iniciadoras da doença cárie dentária. Das amostras avaliadas, a
que teve melhor resultado, quanto à citotoxidade, foi a amostra de a-GaxOy oxidada a 500 °C,
com indícios de proliferação celular, sugestivo de biocompatibilidade, enquanto pelo ensaio
de atividade antimicrobiana, verificou-se que a amostra de a-GaxOy, oxidada à temperatura de
300 ºC foi a que teve melhor resultado para inibição da multiplicação (bacteriostática) e
crescimento bacteriano (bactericida).
Palavras-chave: Óxido de gálio amorfo. Citotoxidade. Atividade Antimicrobiana.
ABSTRACT
Gallium, atomic number 31, is a metal that belongs to the group III A. It was discovered in
1875 by Paul-Emile Lecoq from Boisbaudran, in France. Due to its low melting temperature
of 28.7 °C, it is one of the few metals that is almost liquid at room temperature and can melt if
held by hand. A few of Gallium’s characteristics allow it to interact with cellular processes
and biologically important proteins, especially those of iron’s metabolism. It led to the
development of specific Gallium compounds as medical diagnostic and therapeutic agents,
including infectious diseases. In this study a Gallium-based oxide of a non-stethymometric
composition was synthetized by pyrolysis of spontaneous combustion of Triethyl gallium and
then oxidized at three different temperatures by the system CVD (Chemical Vapor
Deposition). The samples of amorphous gallium oxide powder were characterized by X Ray
Diffraction, proving the existence of an amorphous phase and a crystallinity initiation;
spectroscopy by dispersion in energy, determining Gallium, Oxygen and Carbon atomic
percentage; Scanning electron microscopy with sample structural external morphology
evaluation and Raman spectroscopy. Looking forward to studying in the future the usage of
the above mentioned oxide in different odonatological material composition with an
antimicrobial goal, this thesis’ goal is to initially evaluate its cytotoxicity in vitro by MTT
method (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio), utilizing two types of cell
line (RAW 264.7 and VERO). Posteriorly its antimicrobial activity was evaluated by
determining its Minimal Inhibitory Concentration and its Minimum Bactericidal
Concentration using the microdilution technique in the presence of Streptococcus mutans (S.
mutans) bacterial strain AU 159, potent bacteria that initiates dental cavity disease. Among all
evaluated samples, the one that had best cytotoxicity results was the a-GaxOy oxidized at 500
°C with signs of cell proliferation, suggesting biocompatibility. Through antimicrobial
activity assay it was possible to verify that the a-GaxOy sample oxidized at 300 °C was the
one with best result for inhibition of multiplication (bacteriostatic) and bacterial growth
(bactericidal).
Key-words: Amorphous gallium oxide. Cytotoxicity. Antimicrobial Activity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura do óxido de gálio cristalino, fase beta, (β-Ga2O3), estrutura do
tipo monoclínica. As esferas marrons e vermelhas representam os átomos
de gálio e oxigênio, respectivamente............................................................. 24
Figura 2 - Resumo dos mecanismos associados ao comportamento antimicrobiano de
nanopartículas metálicas: (1) "efeito Cavalo de Tróia" devido a processos
de endocitose; (2) anexo à superfície da membrana; (3) formação de
radicais livres; e (4) libertação de íons
metálicos........................................................................................................ 27
Figura 3 - Forno de oxidação do Sistema CVD, Chemical Vapor Deposition, (vista
frontal), localizado na Universidade Federal de Pernambuco
(Departamento de Física)............................................................................... 35
Figura 4 - Forno de oxidação do Sistema CVD, Chemical Vapor Deposition, (vista
lateral)............................................................................................................ 35
Figura 5 - Desenho esquemático do forno de Oxidação do Sistema CVD, Chemical
Vapor Deposition, e o fluxo de oxigênio do cilindro do gás até o
forno.............................................................................................................. 36
Figura 6 - Aparelho de Microscopia Eletrônica de Varredura, localizado na
Universidade Federal de Pernambuco (Departamento de
Física)............................................................................................................ 41
Figura 7 - Aparelho de EDS, Energy Dispersive Spectroscopy, localizado na
Universidade Federal de Pernambuco (Departamento de
Física)............................................................................................................ 42
Figura 8 - Pó de óxido de gálio amorfo sendo macerado..............................................
52
Figura 9 - Pó de óxido de gálio amorfo macerado........................................................
52
Figura 10 - Microplaca de 96 orifícios, contendo o caldo Brain Heat Infusion (BHI),
substância teste em diferentes concentrações e inóculo bacteriano.............
55
Figura 11 - Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) de uma
substância teste pela resazurina.....................................................................
57
Figura 12 -
Imagem de microscopia eletrônica de varredura, com magnificação de
100.000X que mostra a morfologia do óxido de gálio amorfo obtido por
pirólise em combustão espontânea de Trietil Gálio.......................................
58
Figura 13 - Imagem de microscopia eletrônica de varredura, com magnificação de
50.000X que mostra a morfologia estrutural externa do óxido de gálio
amorfo oxidado a 300 °C.............................................................................
59
Figura 14 - Imagem de microscopia eletrônica de varredura, com magnificação de
100.000X que mostra a morfologia estrutural externa do óxido de gálio
amorfo oxidado a 500 °C............................................................................. 59
Figura 15 - Imagem de microscopia eletrônica de varredura, com magnificação de
50.000X que mostra a morfologia estrutural externa do óxido de gálio
amorfo oxidado a 700 °C............................................................................... 60
Figura 16 - EDS, Energy Dispersive Spectroscopy, mostrando a composição do pó de
óxido de gálio amorfo, obtido por pirólise em combustão espontânea de
Trietil Gálio...................................................................................................
61
Figura 17 - EDS, Energy Dispersive Spectroscopy, mostrando a composição do pó de
óxido de gálio amorfo, oxidado a 300 °C...................................................... 61
Figura 18 - EDS, Energy Dispersive Spectroscopy, mostrando a composição do pó de
óxido de gálio amorfo, oxidado a 500 °C......................................................
62
Figura 19 - EDS, Energy Dispersive Spectroscopy, mostrando a composição do pó de
óxido de gálio amorfo oxidado a 700 °C ...................................................... 62
Figura 20 - Gráficos comparativos dos percentuais atômicos de Gax, Oy e Cz das
amostras de óxido de gálio amorfo (a-GaxOy) versus suas temperaturas de
pirólise em combustão espontânea e de oxidação por Chemical Vapor
Deposition, em relação ao Ga2 e O3 do óxido de gálio cristalino (β-
Ga2O3)............................................................................................................ 63
Figura 21 - Difratograma das amostras de óxido de gálio amorfo obtidas por pirólise
em combustão espontânea de Trietil Gálio, à temperatura de pirólise (T.P.)
e por oxidação por Chemical Vapor Deposition a 300, 500 e 700 ºC, com
picos característicos de óxido de gálio cristalino (β-
Ga2O3)........................................................................................................... 64
Figur 22 - (A) Espectros Raman do pó de óxido de gálio amorfo oxidado por
Chemical Vapor Deposition a 300, 500 e 700 °C. (B) Referência para os
picos Raman da Figura 3 de Sun Z., Yang L. H., Shen X. et al.
Anisotropic Raman Spectroscopy of a single β-Ga2O3 nanobelt. Chin Sci
Bull, 2012, 57: 565-568, doi: 10.1007/s11434-011-4920-2.......................... 66
Figura 20 -
LISTA DE TABELAS
Tabela1 - Distribuição das substâncias testes nas colunas 1, 2 e 3, em diferentes
concentrações nas linhas A-H, volume do meio de cultura liquido e
inóculo dos microrganismos......................................................................... 56
Tabela 2 - Valores de viabilidade celular do pó de óxido de gálio amorfo, obtido por
pirólise à combustão espontânea de Trietil Gálio frente às linhagens
RAW 264.7 e VERO..................................................................................... 67
Tabela 3 - Valores de viabilidade celular do pó de óxido de gálio amorfo, oxidado a
300 ºC por CVD (Chemical Vapor Deposition), frente às linhagens RAW
264.7 e VERO............................................................................................... 67
Tabela 4 - Valores de viabilidade celular do pó de óxido de gálio amorfo, oxidado a
500 ºC por CVD (Chemical Vapor Deposition), frente às linhagens RAW
264.7 e VERO............................................................................................... 68
Tabela 5 - Valores de viabilidade celular do pó de óxido de gálio amorfo, oxidado a
700 ºC por CVD (Chemical Vapor Deposition), frente às linhagens RAW
264.7 e VERO............................................................................................... 68
Tabela 6 - Atividade antimicrobiana, determinação da CIM e CBM, do pó de óxido
de gálio amorfo, disperso em água deionizada e tween 80, submetido
apenas à pirólise em combustão espontânea TEGa (a-GaxOy/ PIRÓLISE
EM COMBUSTÃO ESPONTÂNEA); e do pó de óxido de gálio amorfo
submetido também à oxidação por CVD a 300 ºC (a-GaxOy/ OXIDAÇÃO a 300 °C), a 500 °C (a-GaxOy/ OXIDAÇÃO a 500 °C) e a
700 ºC (a-GaxOy/ OXIDAÇÃO a 700
°C)................................................................................................................. 70
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADN
ASTM
BHI
CBM
CCEN
CETENE
CIM
CVD
DF
DMEM
DMSO
DQF
DRX
ED
EDS
EGM
FDA
h
HAp
INPI
ISO
Kv
LD
MEV
mA
mg
Min
mL
mM
mW
nm
Ácido Desoxirribonucleico
Sociedade Americana para Testes e Materiais
Brain Heat Infusion
Concentração Bactericida Mínima
Centro de Ciências Exatas e da Natureza
Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste
Concentração Inibitória Mínima
Chemical Vapor Deposition (Deposição Química na Fase Vapor)
Departamento de Física
Dubelcos Minimum Essential Medium
Dimetilsulfóxido
Departamento de Química Fundamental
Difração de Raios X
Dose Efetiva
Energy Dispersive Spectroscopy (Espectroscopia por Dispersão em Energia)
Estreptococos do Grupo Mutans
Food and Drug Administration
hora
Hidroxiapatita
Institut National de Propriété Intelectuelle
International Standard Organization
Quilovolt
Dose Letal
Microscopia Eletrônica de Varredura
miliampere
miligrama
Minuto
mililitro
milimol
miliWatt
nanômetro
NPs
NPs-ZnO
OECD
pH
PPGMT
RDR
ROS
s
slm
S. mutans
SEM
T.P.
TEGa
Tf
UFC
UFPE
Nanopartículas
Nanopartículas de óxido de Zinco
Organização de Cooperação Econômica e Desenvolvimento
Potencial Hidrogeniônico
Programa de Pós Graduação em Ciência de Materiais
Ribonucleosídeo Difosfato Redutase
Espécies Oxidativas de Oxigênio
segundo
standard litre per minute
Streptococcus mutans
Microscópio Eletrônico de Varredura por Emissão de Campo
Temperatura de Pirólise
Trietil Gálio
Ferro-transferrina
Unidade Formadora de Colônias
Universidade Federal de Pernambuco
LISTA DE SÍMBOLOS
a-GaxOy
β-Ga2O3
Ag
Å
Al
Ga-DFOB
C
Cu
CuO
(C2H5)3 Ga
° C
Fe
Ga
Ga-Cit
[Ga(H2O)5(OH)]2+
[Ga(OH)4]–
HNO3
H2O2
W
O2
O2• -
OH
OH-
pi
SnO2
TiO2
ZnO
%
Óxido de gálio amorfo
Óxido de gálio cristalino (fase beta)
Prata
Angstrom
Alumínio
Gálio desferrioxamina
Carbono
Cobre
Óxido de Cobre
Trietil Gálio
Grau Celsius
Ferro
Gálio
Citrato de gálio
Íon pentaaquahidroxigálio
Tetrahidroxigallato
Ácido Nítrico
Peróxido de Hidrogênio
Tungstênio
Oxigênio Molecular
Superóxido
Hidróxido
Hidroxila
Picômetro
Óxido de Estanho
Óxido de Titânio
Óxido de Zinco
Por cento
SUMÁRIO
1 MOTIVAÇÃO E OBJETIVOS .......................................................................................... 19
1.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 20
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. 20
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...................................................................................... 21
2.3 SÓLIDOS AMORFOS ....................................................................................................... 23
2.3.1 Óxido de Gálio Amorfo ................................................................................................... 23
2.4 USO DA NANOTECNOLOGIA - PROPRIEDADE ANTIBACTERIANA ..................... 26
2.4.1 Gálio: ação antibacteriana ............................................................................................. 29
2.5 PIRÓLISE ........................................................................................................................... 33
2.6 SISTEMA CVD (CHEMICAL VAPOR DEPOSITION) ..................................................... 34
2.7 TÉCNICAS DE CARACTERIZAÇÃO ............................................................................. 36
2.7.1 Difração de Raios X (DRX) ............................................................................................. 37
2.7.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) (Scanning Electron Microscopy – SEM) 39
2.7.3 Espectroscopia por Dispersão em Energia (Energy Dispersive Spectroscopy - EDS) ... 41
2.7.4 Espectroscopia Raman .................................................................................................... 42
2.8 BIOCOMPATIBILIDADE ................................................................................................. 42
2.9 ENSAIOS IN VITRO ........................................................................................................... 43
2.9.1 Teste de Citotoxidade ...................................................................................................... 43
2.9.1.1 Células VERO ............................................................................................................. 46
2.9.1.2 Células RAW 264.7 ..................................................................................................... 47
3.0 TESTE DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ............................................................... 48
3.0.1 Streptococcus mutans ...................................................................................................... 48
3 EXPERIMENTAL .............................................................................................................. 50
3.1 MATERIAIS ....................................................................................................................... 50
3.2 MÉTODOS ......................................................................................................................... 50
3.3 SÍNTESE DE A-GAXOY POR PIRÓLISE À COMBUSTÃO ESPONTÂNEA DE
ORGANOMETÁLICO, TRIETIL GÁLIO (TEGA) ................................................................. 51
3.4 OXIDAÇÕES DAS AMOSTRAS DE A-GAXOY PELO SISTEMA CVD ......................... 52
3.5 CARACTERIZAÇÕES DAS AMOSTRAS DE A-GAXOY ............................................... 53
3.6 PREPARO DE DISPERSÕES DE A-GAXOY (1MG/ML) ................................................. 54
3.7 TESTE DE CITOTOXIDADE ........................................................................................... 54
86
19
1 MOTIVAÇÃO E OBJETIVOS
1.1 MOTIVAÇÃO
O rumo pelo qual vem seguindo a Odontologia terá repercussão no futuro dos
materiais dentários, apesar da prática odontológica ser definida pelo desenvolvimento atual e
futuro da Ciência de materiais dentários. Sendo assim, a profissão em questão continuará
focando na prevenção e melhora da saúde bucal, pela redução de propagação da doença cárie,
periodontal, bem como, possibilitando, pelo desenvolvimento de novos biomateriais, o
favorecimento de reabilitações de tecidos duros e moles perdidos e/ ou danificados. Uma cura
para a cárie dentária terá um grande impacto no uso de materiais restauradores, utilizados para
desenvolver a forma e a função de dentes com lesões cavitárias. Para o sucesso clínico da
implantodontia, por exemplo, é necessário que ocorra o fenômeno da osseointegração,
caracterizado pela união física entre o implante dentário e o osso receptor. O tratamento
reabilitador oral, pelo uso de implantes osseointegrados, apresenta um alto índice de sucesso,
apesar do relato de estudos que apontam grandes perdas, após procedimentos cirúrgicos de
instalação de tais biomateriais, devido a infecções peri-implantares, cujo principal fator
etiológico associado é o biofilme bacteriano.
Tem sido reportada, para fins terapêuticos na medicina, com resultados animadores, a
aplicação de compostos contendo o elemento químico gálio, com foco para processos
inflamatórios, infecciosos, neoplásicos e doenças ósseas (OLIVEIRA, N., 2016).
Diante do exposto, a principal motivação para o desenvolvimento desta dissertação
está correlacionada com a verificação, a princípio, in vitro, ou seja, laboratorial, da
citotoxidade do pó de óxido de gálio amorfo e sua atividade antimicrobiana na presença de
Streptococcus mutans, para que, mediante resultados promissores, num segundo momento,
em novos estudos, seja possível a obtenção de novos biomateriais de uso odontológico,
testados, in vivo, contendo a-GaxOy, visando a sua ação antibacteriana para diversas doenças
da cavidade oral, inclusive a cárie dentária, sem causar reações adversas locais, nem
sistêmicas, após sua aplicação. Dessa maneira, será possível contribuir com tratamentos
dentários promissores, de maior longevidade, um marco evolutivo para a Ciência
Odontológica.
20
1.1 OBJETIVO GERAL
Sintetizar, oxidar, caracterizar o pó de óxido de gálio amorfo e, posteriormente, obter
dispersões com este óxido, utilizando tween 80 e água deionizada, para aplicação em ensaios
de citotoxidade em duas linhagens celulares e atividade antimicrobiana na presença de
bactérias indicadoras de cárie dentária.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Sintetizar o pó de óxido de gálio amorfo (a-GaxOy), por pirólise à combustão
espontânea de organometálico – Trietil Gálio, (TEGa), (C2H5)3 Ga;
Oxidar as amostras obtidas de a-GaxOy, através do sistema CVD (Chemical Vapor
Deposition) - Deposição Química na Fase Vapor - a 300 °C (Grau Celsius), 500 °C e 700 °C
Caracterizar todas as amostras de a-GaxOy, por Difração de Raios X (DRX);
Espectroscopia por Dispersão em Energia (EDS), Microscopia Eletrônica de Varredura
(MEV) e Espectroscopia Raman;
Avaliar a atividade citotóxica em células normais (VERO e RAW 264.7), pelo
método do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio);
Avaliar a atividade antimicrobiana frente a cepa de Streptococcus mutans AU 159,
pela determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração Bactericida
Mínima (CBM) – Técnica da Microdiluição.
21
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 INTRODUÇÃO
Toda matéria é um material em potencial. A linha divisória para que algo possa ser
tratado como um material corresponde ao momento em que alguma de suas propriedades
(óticas, magnéticas, mecânicas, catalíticas, elétricas etc.) lhe confira uma função específica.
Materiais podem ser definidos como "substâncias (ou mistura de substâncias) que possuem
propriedades que as tornam úteis em produtos, dispositivos, estruturas e máquinas"
(INTERRANTE; HAMPDEN-SMITH, 1998).
A sistemática relacionada à Química de Materiais envolve quatro componentes
essenciais: (I) síntese/preparação - que se caracteriza pela compreensão das reações
químicas e metodologias que levam à produção de determinados materiais, estudo de
diferentes reagentes e precursores, desenvolvimento de novas rotas de preparação e
modificação e aprimoramento de rotas já existentes, otimização e planejamento de processos
que levem à produção de diferentes materiais. Um controle sintético permite a obtenção de
materiais com diferentes graus de pureza, cristalinidades e estruturas cristalinas, tamanhos de
partículas, reatividades superficiais, além da produção de novos materiais, com composições e
estruturas inéditas; (II) caracterização - que lança mão da utilização de técnicas químicas e
físicas para compreensão de diferentes aspectos relacionados à composição (relação
estequiométrica, presença de defeitos, estados de oxidação, etc) e estrutura (amorfa ou
cristalina) de materiais, além de interações específicas entre fases (para materiais
multifásicos), tamanhos e formas de partículas, etc; (III) estudo de propriedades e relação
estrutura-propriedade, que visa à determinação das diferentes propriedades dos materiais
(elétricas, óticas, magnéticas, catalíticas, mecânicas, etc.), o mecanismo pelo qual estas
propriedades se manifestam, e as relações existentes entre uma propriedade específica e a
estrutura/composição do material; (IV) aplicações - que aproveita uma propriedade específica
de um material para sua utilização como componente ativo em dispositivos, máquinas,
sistemas, etc. A combinação destas quatro linhas de trabalho leva a respostas para as questões
básicas relacionadas a qualquer material: Como são preparados? Como estão estruturados?
Como se comportam? Qual sua utilidade? Onde podem ser empregados? (ZARBIN, 2007).
22
Alguns óxidos têm potencial como agentes anti-infeciosos, antineoplásicos e de
reabsorção óssea (VINARDELL; MITJANS, 2015; KIM et al., 2014). Segundo OLIVEIRA
(2016), materiais podem ser preparados com a intenção de aperfeiçoar sua aplicabilidade em
odontologia, na prevenção de infecção em próteses dentárias e na medicina para tratamento de
células cancerígenas, tratamento ósseo e doenças de pele. Vários artigos já relataram a
funcionalidade terapêutica de compostos contendo metais zinco e gálio individualmente
(BERNSTEIN, 1998; MELNIKOV et al., 2008; RAMUSSEN et al., 2010; VINARDELL;
MITJANS, 2015). A preparação de compostos (Zn, Ga)x Oy surge como uma alternativa de
unir propriedades dos dois óxidos para otimizar esta funcionalidade, visto que apresentarão
dois metais responsáveis pela ação deletéria de micro-organismos e tratamento de doenças
Com o controle cada vez mais rigoroso em relação ao uso de animais de laboratório,
há a necessidade de desenvolver e padronizar testes in vitro que possam detectar a toxicidade
de materiais para uso em seres humanos, principalmente aqueles de aplicação clínica, como os
biomateriais, que não devem causar reações adversas e nem lesar o organismo do paciente
(ROGERO et al., 2003).
Pouco é relatado na literatura sobre a aplicação terapêutica do óxido de gálio na fase
amorfa. Propusemos com este estudo, preparar amostras do pó de óxido de gálio amorfo (a-
GaxOy), por pirólise à combustão espontânea de um organometálico, o Trietil Gálio (TEGa),
(C2H5)3Ga, e subsequentes oxidações pela técnica CVD (Chemical Vapor Deposition -
Deposição Química na Fase Vapor); caracterizá-las, para que posteriormente, dispersas em
água deionizada e tween 80, pudessem ser utilizadas em ensaios de citotoxidade, na presença
de células RAW 264.7 e VERO, bem como, ser avaliada sua atividade antimicrobiana frente a
cepa de Streptococcus mutans (S. mutans), principais patógenos da cárie dentária.
Vale salientar que este trabalho é inédito, não havendo estudos sobre o tema estudado,
analisando-se o comportamento do S. mutans na presença de óxido de gálio amorfo, assim
como, sua citotoxidade. Basicamente quase não há relato da síntese e aplicação médica-
odontológica do a-GaxOy.
23
2.2 CLASSIFICAÇÃO DOS MATERIAIS SÓLIDOS
Os materiais sólidos foram agrupados convenientemente em três categorias básicas:
metais, cerâmicas e polímeros. Esse esquema está baseado principalmente na composição
química e na estrutura atômica, e na maioria dos materiais, enquadra-se em um outro grupo
distinto. Adicionalmente, existem os compósitos que são combinações "engenheiradas" de
dois ou mais materiais diferentes. Outra categoria é a dos materiais avançados - aqueles que
são usados em aplicações de alta tecnologia, como, por exemplo, os semicondutores, os
biomateriais, os materiais inteligentes e os materiais "nano-engenheirados" (CALLISTER;
RETHWISCH, 2012).
2.3 SÓLIDOS AMORFOS
Enquanto os cristais caracterizam-se pela repetição espacial - tridimensional - dos
átomos ou moléculas que os constituem, as formas amorfas apresentam átomos ou moléculas
distribuídas aleatoriamente tal como em um líquido (ARAÚJO, et al., 2012). Sólidos não-
cristalinos carecem de um arranjo atômico regular e sistemático ao longo das distâncias
atômicas e relativamente grandes. Algumas vezes esses materiais também são chamados de
amorfos (significando, literalmente, "sem forma"), ou de líquidos super-resfriados, visto que
suas estruturas atômicas lembram as de um líquido.
O fato do sólido que se forma ser cristalino ou amorfo depende da facilidade pela qual
uma estrutura atômica aleatória no estado líquido pode se transformar em um estado ordenado
durante a solidificação. Portanto, os materiais amorfos são caracterizados por estruturas
atômicas ou moleculares relativamente complexas. Os metais formam normalmente sólidos
cristalinos, mas alguns materiais cerâmicos são cristalinos enquanto outros, os vidros
inorgânicos, são amorfos (CALLISTER; RETHWISCH, 2012). Já os polímeros podem ser
semi-cristalinos ou baixo grau de cristalinidade, praticamente amorfos.
2.3.1 Óxido de Gálio Amorfo
O óxido de gálio é um material inorgânico que apresenta cinco polimorfos (α, β, γ, δ e
ε). A fase termodinamicamente mais estável é a fase β-Ga2O3. As outras fases apresentam
24
estado meta-estável em condições ambientes e transformam-se em β-Ga2O3 a temperaturas
acima de 600 °C (KUMAR et al., 2014). O β-Ga2O3 apresenta estrutura cristalina monoclínica
(GELLER, 1960) (Figura 1).
Figura 1: Estrutura do óxido de gálio cristalino, fase beta, (β-Ga2O3), estrutura do tipo
monoclínica. As esferas marrons e vermelhas representam os átomos de gálio e oxigênio,
respectivamente.
Fonte: Yinnu and Jinliang, 2015.
Os óxidos amorfos são materiais que apresentam composições indefinidas ou não
estequiométricas, e, por isso, são representados por AxOy, no qual “A” é um átomo de um
cátion metálico e “O” representa o ânion oxigênio. As icógnitas x e y são valores
desconhecidos que representam a quantidade dos respectivos átomos para formação do
material. A identificação de óxido de gálio amorfo se dá, principalmente, através da análise de
Difração de Raios X, que apresentam bandas largas (característicos de material amorfo) ao
invés de picos finos (característicos de material cristalino). Os óxidos amorfos podem ser
considerados mais lábeis em relação aos óxidos cristalinos, com isso podem ser utilizados em
fármacos com a intenção de aumentar a velocidade de entrega do medicamento e acelerar o
processo de cura de doenças (OLIVEIRA, 2016).
O gálio é um metal do grupo III A, número atómico 31 da tabela periódica.
Descoberto pela primeira vez em 1875 por Paul-Émile Lecoq de Boisbaudran na França, o
nome deste metal parece ser derivado de "Gallia", a palavra latina para a França. Ele tem uma
cor brilhante, branco-prateado com uma temperatura de fusão de 28,7 °C; é um dos poucos
metais que é quase líquido à temperatura ambiente e pode derreter quando segurado na mão.
Apesar do gálio não ter função fisiológica no corpo humano, algumas das suas características
lhes permitem interagir com processos celulares e proteínas biologicamente importantes,
especialmente aquelas do metabolismo do ferro. Isso levou ao desenvolvimento de certos
compostos de gálio como agentes de diagnóstico e terapêutica em medicina, especialmente,
nas áreas de doenças ósseas metabólicas, câncer e doenças infecciosas (MELNIKOV et al.,
2008).
25
.
O gálio é um elemento de traço metálico que é quase líquido à temperatura ambiente,
expande-se em estado sólido, e é encontrado como elemento traço no carvão, bauxita e outros
minerais. É usado em tecnologia de semicondutores e como componente de várias ligas de
baixo ponto de fusão. Principalmente trivalente em seus compostos, o íon Ga3+
é um ácido
forte, assim, liga-se fortemente às bases de Lewis fortes, particularmente a hidroxila OH–. O
cátion [Ga(H2O)6]3+
pode atuar como doador de próton, dando [Ga(H2O)5(OH)]2+
,
[Ga(H2O)4(OH)]+, etc. Com o aumento gradual do pH (potencial hidrogeniônico), esta
desprotonação das espécies mononucleares leva à precipitação do hidróxido e maior aumento
do pH permitindo a formação de [Ga(OH)4]–. Assim, há dois íons contendo gálio, adequados
para os processos bioquímicos metabólicos: [Ga(H2O)5(OH)]2+
no meio ácido fraco e
[Ga(OH)4]– em soluções alcalinas de neutro a fraca. O primeiro pode ser encontrado e
provavelmente absorvido no estômago, enquanto que o último é absorvido no duodeno devido
ao bicarbonato presente. O raio iônico do Ga (III) em coordenação tetraédrica é 61 picômetros
(pm) e 76 pm em coordenação octaédrica, então é esperado ser um análogo do Fe (III) (69.0
pm) e Al (III) (67.5 pm), particularmente em combinação com fósforo. A afinidade do gálio
para esse elemento é tão alta que fosfatos de gálio estão entre os mais estáveis compostos
(MELNIKOV et al., 2008).
Segundo ainda Melnikov et al. (2008), o principal interesse clínico deriva da
observação que propriedades metabólicas do gálio são similares aquelas do ferro. Junto com
raios iônicos comparáveis, ambos os elementos mostram quase a mesma capacidade de
ligação com quelato e proteína. Os mais importantes carreadores do ferro, transferrina e
lactoferrina, não distinguem gálio do ferro, portanto, todo gálio no sangue está presente no
plasma na forma de complexos com estas proteínas.
De acordo com Bernstein (1998), o gálio (III) partilha certas propriedades com ferro
(III) com respeito ao seu raio iônico. O raio iônico octaédrico é 0,620 Angstrom (Å) para Ga3+
e 0,645 Å em alta rotação para o Fe3+
, respectivamente; enquanto o raio iônico tetraédrico é
0,47 Å para Ga3+
e 0,49 Å para Fe3+
, respectivamente.
Até agora, o gálio foi adicionado a um material bioativo somente na forma iônica, por
exemplo, em vidro bioativo (VALAPPIL, 2009; POURSHAHRESTANI et al., 2016) ou em
fosfatos de cálcio (MELLIER et al., 2011; MELLIER et al., 2015). No entanto, Kurtjak et al.
(2016) encontraram na literatura sobre o desenvolvimento de um compósito de nanopartículas
(Nps) de Ga com um biomaterial.
26
2.4 USO DA NANOTECNOLOGIA - PROPRIEDADE ANTIBACTERIANA
A nanotecnologia é a ciência que compreende o desenvolvimento tecnológico dentro
da escala nanométrica (entre 1 a 100 nm - nanômetro), aplicadas em várias áreas do
conhecimento humano. Nanopartículas possuem características físico-químicas únicas, tais
como alta proporção de área de superfície para massa e alta reatividade, o que muitas vezes
proporciona efeitos maiores e mais duradouros. Nanopartículas têm sido bem sucedidas em
seu uso na área médica e farmacêutica, como carreadoras de agentes terapêuticos e no
diagnóstico de doenças crônicas (MARTINEZ-GUTIERREZ et al., 2010).
Durante os últimos anos, a nanotecnologia tem produzido uma nova rota para
aplicação antimicrobiana de metais nanoestruturados ativos (GRASS; RENSING; SOLIOZ,
2011). Nanopartículas de metais biocidas podem ser imobilizadas ou revestidas sobre
superfícies para aplicação em vários campos, tais como instrumentos e dispositivos médicos,
tratamento de água e processamento de alimentos, entre outros (RUPARELIA;
CHATTERJEE; DUTTAGUPTA; MUKHERJI, 2008).
As nanopartículas podem dissolver-se mais rapidamente num dado volume de solução
em comparação com partículas maiores, liberando assim uma maior quantidade de íons
metálicos (KARLSSON et al., 2013). Portanto, com base na presença de íons metálicos, as
nanopartículas devem apresentar propriedades antimicrobianas mais fortes do que
micropartículas ou superfícies metálicas. O melhor exemplo de mecanismo, tóxico por
partículas de nano-escala, relaciona-se com a incorporação direta de nanopartículas na célula,
via mecanismos endocitóticos. Posteriormente, a captação celular de íons aumenta à medida
que as espécies iónicas são subsequentemente libertadas dentro das células por dissolução de
nanopartículas, um processo muitas vezes referido como "o mecanismo de cavalo de Tróia".
Esta concentração intracelular elevada, obtida após a dissolução de nanopartículas dentro da
célula, provavelmente, resulta em estresse oxidativo maciço. Um resumo dos possíveis
mecanismos associados ao comportamento antimicrobiano das nanopartículas de metais é
apresentado na Figura 2.
27
Figura 2: (1) "efeito Cavalo de Tróia" devido a processos de endocitose; (2) anexo à
superfície da membrana; (3) formação de radicais livres; e (4) libertação de íons metálicos.
Fonte: Humberto Palza, 2015.
Uma característica importante dos metais é a sua capacidade de participar de reações
redox que determinam a tendência de adquirir elétrons de um doador (LEMIRE; HARRISON;
TURNER, 2013). Os metais essenciais redox ativos podem atuar como cofatores catalíticos
numa vasta gama de enzimas celulares que geram ou catalisam espécies reativas de oxigênio
(ROS). Essas espécies podem induzir um estresse oxidativo, se excederem a capacidade
antioxidante celular, danificando proteínas celulares, lípidos e DNA (SHLEEVA et al., 2005;
PRABHU; POULOSE, 2012). Além destes efeitos, um nível crescente de ROS desencadeia
ainda processos inflamatórios no interior celular capaz de induzir a sua morte programada
(SINTUBIN et al., 2009). Portanto, a toxicidade com o processo de respiração aeróbia produz
formas parcialmente reduzidas de oxigênio molecular (O2), tais como peróxido de hidrogénio
(H2O2) e superóxido (O2•-). Com a presença de alguns metais, a reação de Fenton, citada a
seguir, ocorre intensificando a toxicidade do oxigênio, catalisando a transferência de elétrons
a partir de uma biomolécula doadora para H2O2, produzindo hidróxido (OH) e radical
hidroxila (OH-) altamente reativa. A maioria dos mecanismos que explicam a atividade
biocida dos metais se baseia na presença de ROS.
Fe2+
+ H2O2 → Fe3+
+ OH− + OH
• (reação de Fenton)
A presença de metais externos pode, portanto, aumentar a reação previamente citada,
produzindo um excesso de derivados de ROS e, como consequência, um estresse oxidativo na
célula.
3
4
2
1
28
A atividade antimicrobiana da prata foi primariamente identificada no século 19, e a
prata coloidal foi aceita em 1920 pela US Food and Drug Administration (FDA) como sendo
efetiva na manutenção de feridas. Entretanto, após a introdução da penicilina em 1940, os
antibióticos se tornaram o tratamento padrão para infecções bacterianas e a prata praticamente
caiu em desuso. Seu retorno, em 1960, como agente terapêutico no tratamento de feridas em
pacientes queimados, foi consagrado, desta vez, na forma de solução de nitrato de prata a
0,5% (CHOPRA, 2007).
A prata é conhecida, há muito tempo, por exibir forte toxicidade a grande número de
espécies de microrganismos e, por tal razão, compostos à base de prata têm sido amplamente
utilizados com aplicação bactericida. É positiva a referência de alguns exemplos de
compostos inorgânicos com lenta liberação de percentuais de prata correntemente usados
como conservantes de uma série de produtos, outra aplicação inclui novos feitos de
microesferas de sílica gel que contêm complexo de prata tiossulfato misturado a plástico
como proteção antibacteriana de longa duração; compostos de prata são também usados no
campo médico para tratamento de feridas e uma variedade de infecções (MORONES JR. et
al., 2007).
O desenvolvimento de novas espécies bacterianas resistentes às medicações de uso
corrente tem trazido sérios problemas em saúde pública, todavia, isto é um forte incentivo
para o desenvolvimento de novos bactericidas. Recentes pesquisas com nanomateriais
bactericidas apresentam-se particularmente oportunas.
Em comparação a outros íons de metais pesados, a prata é provavelmente a mais
utilizável por combinar alta atividade antimicrobiana com considerável baixa toxidade
humana (SCHIERHOLZ et al., 1998).
As inovações proporcionadas pela redução do tamanho de partículas tornam o estudo
de materiais nanométricos de enorme importância. Entre essas propriedades, a ação
antimicrobiana de nanopartículas de óxido de zinco (NPs-ZnO) vem se destacando.
Nanometais antibacterianos (como Ag, Cu / CuO, ZnO) são conhecidos por uma dupla
ação antimicrobiana e os íons liberados (SIRELKHATIM et al., 2015; DIZAJ et al., 2014).
Esta dupla ação esperada de NPs (nanopartículas) de Ga, também como potencial redox
negativo de gálio (GREENWOOD; EARNSHAW, 1997) deverá permitir a libertação de íons
Ga3+
antibacterianos. Seguindo a idéia de "nanobiotics" (HUH; KWON, 2011), a utilização de
nanopartículas de gálio em vez de íons pode levar a uma avançada, controlada, prolongada
ação antibacteriana local.
29
2.4.1 Gálio: ação antibacteriana
O gálio no estado iónico (3+) tem encontrado muitas aplicações na medicina:
diagnóstico de tumores, tratamento da hipercalcemia, inibição da reabsorção óssea,
propriedade anticarcinogênica e agente antimicrobiano (BERNSTEIN, 1998; CHITAMBAR,
2010). Entre os outros mecanismos, a ação antibacteriana de íons de gálio é geralmente
explicada pela semelhança entre os íons Ga (III) e Fe (III). Assim, foi observado o maior
efeito em bactérias ferro-dependentes, como Pseudomonas aeruginosa, que podem causar
infecções protéticas articulares agudas e criar biofilmes em biomateriais.
Em geral, pode-se dizer que o amplo espectro de ação farmacológica do gálio se deve
à capacidade de Ga3+
em mimetizar Fe3+
, principalmente pelo fato de que a razão carga/raio
dos dois íons é quase idêntica. Assim, muitos sistemas biológicos são incapazes de distinguir
entre Fe3+
e Ga3+
. Ga3+
apresenta a habilidade de perturbar processos biológicos dependentes
de Fe3+
, porque, ao contrário de Fe3+
, Ga3+
não sofre redução em condições fisiológicas, o que
o impede de participar de processos cruciais dependentes de ferro. O íon Fe3+
é essencial para
o crescimento da maioria dos micro-organismos, uma vez que é necessário em vários
caminhos metabólicos e na síntese do ADN (Ácido Desoxirribonucleico). Ga3+
se liga a sítios
de Fe3+
da transferrina, é adquirido a partir da transferrina por certas bactérias, e é
incorporado por fagócitos mononucleares em sítios de inflamação (KANEKO et al., 2007). .
O íon ferro (Fe3+
) é crucial para a sobrevivência e replicação da maioria dos
patógenos, proporcionando, desse modo, um alvo potencial para as estratégias preventivas e
terapêuticas. A capacidade do gálio para inibir o crescimento de bactérias intracelulares, por
interferir com o metabolismo do ferro, foi estabelecida, in vitro, por incorporação de nitrato
de gálio em meios de cultura com Mycobacterium spp. (OLAKANMI et al., 2000).
Uma abordagem alternativa usa o metal de transição Ga como um "cavalo de Tróia"
para interromper o metabolismo de Ferro bacteriano. (CHITAMBAR; NARASIMHAN et al.,
1991). Ga podem interromper processos Fe-dependentes porque, ao contrário do Fe3+
; Ga3+
não pode ser reduzida; e oxidação sequencial e redução são fundamentais para muitas das
funções biológicas do Ferro.
Gálio inibe a síntese do ADN e provoca modificação em sua estrutura tridimensional,
exerce efeito modulador na síntese de proteínas e inibe a atividade de enzimas tais como DNA
polimerases e ribonucleotídeo redutase. Gálio altera a permeabilidade da membrana e funções
mitocondriais. Foi demonstrada que a atividade antiproliferativa do gálio ocorre
30
principalmente através da inibição da ribonucleosídeo difosfato redutase (RDR), uma enzima
que está envolvida na catálise da conversão de ribonucleotídeos em desoxirribonucleotídeos
durante a síntese do ADN. A enzima contém, em sua estrutura, duas sub-unidades, R1 e R2.
Na sub-unidade R1, encontram-se os sítios de ligação com o substrato e em R2 há dois íons
Fe3+
ligados entre si por uma ponte de oxigênio e um radical livre tirosila, todos essenciais à
atividade da enzima. Ga3+
bloqueia a ação enzimática substituindo Fe3+
na estrutura da RDR e
provocando, assim, uma mudança de conformação (CHITAMBAR; NARASIMHAN et al.,
1991).
Gálio trivalente também é conhecido por ter propriedades antimicrobianas para
bactérias dependentes de ferro. Mais recentemente, Harrington, Jr. et al. (2006) relataram que
o gálio (III) mata Rhodococcus equi, uma bactéria intracelular, que provoca a pneumonia em
potros. A extensa revisão de Bernstein (1998) mostrou que o gálio foi eficaz no tratamento da
sífilis experimental em coelhos, matou Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium avium e
foi eficaz contra parasitas da malária. Esse autor sugeriu que é provável que a atividade deriva
da capacidade do gálio em entrar nos micróbios através dos seus mecanismos de transporte de
ferro, por interromper o seu metabolismo do ferro e por interferir com a síntese de proteína. A
capacidade da transferrina ligada a gálio para entrar nas células infectadas através do receptor
da transferrina pode ser uma vantagem no tratamento de algumas infecções intracelulares.
Outras infecções bacterianas são tratáveis com nitrato de gálio. Eby Ga (2005) relatou que
uma única aplicação tópica de uma solução de nitrato de gálio foi imediatamente eficaz para
tratamento de acne, furúnculos, carbúnculo e foliculite e outras infecções bacterianas da pele.
O autor também reportou que uma solução salina ocular isotônica de nitrato de gálio a 1%,
sendo utilizada durante algumas horas todos os dias, exterminou durante a noite duas
infecções bacterianas oculares resistentes a tratamento em humanos. Kaneko et al. (2007)
descobriram que o gálio inibe o crescimento de Pseudomonas aeruginosa e a formação de
biofilme, além de matar as bactérias planctônicas e biofilmes in vitro. Os efeitos
antibacterianos do gálio não têm sido explorados sistematicamente ainda, mas eles parecem
amplos, seguros e úteis.
A importância do gálio (III) como agente anti-infecção se dá na sua similaridade com
o Fe (III), sendo que este último, por sua vez, é um importante elemento químico para a
metabolização das células dos patógenos (LESSA et al., 2012; MELNIKOV et al., 2008). O
Ga (III) pode substituir o Fe (III) em enzimas que contém ferro, porém o gálio, diferentemente
do ferro, não sofre os ciclos redox necessários para a metabolização da célula, o que dificulta
sua atividade celular.
31
Levando em consideração que muitas enzimas que apresentam ferro em sua
composição estão envolvidas no metabolismo microbiano de patógenos, o gálio pode atuar
como agente deletério nesses organismos, agindo como inibidor ou destruidor dessas células a
partir da inserção do gálio na composição dessas redes proteicas.
Sabe-se também que o gálio se concentra em focos de inflamação e infecção,
particularmente em leucócitos polimorfonucleares (MELNIKOV et al., 2008). O complexo de
ferro gálio-transferrina é internalizado por receptor-mediador da endocitose (MELNIKOV et
al., 2008). A membrana plasmática oxidoredutase reduz a transferrina ao redor do ferro do
estado para Fe²+, facilitando a remoção do ferro da proteína. Como o gálio não existe na
valência 2+, ele não pode seguir a trilha do ferro mais além na célula. A única explicação
sugerida é a formação do íon pentaaquahidroxigálio [Ga(H2O)5(OH)]2+
que formalmente tem
a mesma carga 2+ como ferro bivalente, leucócitos polimorfonucleares, assim, seriam aptos
para imitar a maneira de condução do íon Fe²+ (MELNIKOV et al., 2008).
Os mais importantes transportadores de ferro, a transferrina e a lactoferrina, não
conseguem distinguir o gálio do ferro; todo gálio no sangue está presente no plasma na forma
de complexos com essas proteínas. Sob circunstâncias normais, mais ou menos um terço de
transferrina é preenchido por ferro (III) e grande número de sítios não ocupados estão
disponíveis para gálio (III); eles alcançam 2.7 mg/ml Ga²+,
que é um valor considerável de
acordo com Brittenham (1991).
Uma vez dentro do citoplasma celular, o gálio parece estar ligado pelas ferritinas,
grandes proteínas que apresenta uma variação específica em respeito aos tecidos, dependendo
da combinação de suas subunidades. A maior parte da ferritina está concentrada nas células de
Kupfer no fígado. Os agregados das moléculas de ferritina com o tempo formam clusters, os
quais são degradados após terem sido fagocitados pelos lisossomos. O produto final deste
processo, a hemosiderina, é um aglomerado amorfo de proteína desnaturada e lipídeos com
intercalações do hidróxido de gálio e seus polímeros. Pouco é conhecido como o gálio é
liberado da ferritina para ser usado. Em todo caso, elemento metabolicamente inativo
armazenado em ferritina e hemosiderina está em equilíbrio com o gálio intercambiável,
circulando no plasma e ligado a moléculas carreadoras de baixo peso molecular (MELNIKOV
et al., 2008).
A capacidade do gálio para interferir com a utilização de ferro por certos micro-
organismos levou algumas investigações interessantes dirigidas a explorar o potencial de gálio
como uma droga antimicrobiana. Nitrato de gálio e transferrina-gálio foram mostrados para
bloquear o crescimento dependente de ferro de Mycobacterium tuberculosis e M. avium, no
32
complexo extracelular, bem como no interior de macrófagos humanos. O gálio interfere na
aquisição de ferro pelo M. tuberculosis dentro do fagossoma dos macrófagos, resultando
numa ação bactericida e que poderia ser impedida por excesso de ferro (OLAKANMI, O. et
al., 2000).
Tem sido previamente demonstrado que íons de gálio apresentam propriedades
antibacterianas e antibiofilme. Rzhepishevska et al. (2011) noticiaram as atividades
bactericidas diferenciais de dois complexos de gálio, gálio desferrioxamina B (Ga-DFOB) e
citrato de gálio (Ga-Cit). Várias linhagens de células humanas testadas; e nenhuma atividade
pró-inflamatória foi detectada nas células epiteliais do pulmão humano após a exposição in
vitro. Análise metabolômica foi utilizada para delinear os efeitos de Ga-Cit na célula
bacteriana. A exposição a gálio resultou em baixas concentrações de glutamato, um
metabólito essencial para P. aeruginosa e de muitos aminoácidos, indicando que Ga afeta
várias vias de biossíntese. Foi demonstrado o efeito antibacteriano do Ga pode variar
dependendo da fonte de carbono, que possui importância no contexto de aplicações médicas
de gálio.
Segundo Harrison et al. (2008); Jonsson et al. (2005), apud Rzhepishevska et al.
(2011), resistência de bactérias patogênicas aos antibióticos é um problema a nível mundial, e,
por conseguinte, o desenvolvimento de drogas antibacterianas alternativas é de grande
relevância. Ao contrário de antibióticos clássicos, que têm como alvo uma reação ou processo
específico, metais e compostos organometálicos, muitas vezes afetam vários grupos diferentes
de biomoléculas, e, por conseguinte, o desenvolvimento de resistência é improvável, o que
torna estes compostos atrativos como agentes antibacterianos.
De acordo ainda com Rzhepishevska et al. (2011), o gálio foi identificado como uma
droga de potencial antibacteriano tanto para gram-positivas e gram-negativas.
Tem sido demonstrado que Ga e outro mimético de Fe, Al, têm toxicidade grave para
Pseudomonas fluorescens, impedindo a funcionalidade da cadeia de transporte de elétrons e
enzimas contendo aglomerados de Fe-S (RZHEPISHEVSKA et al., 2011). Elucidação dos
efeitos metabólicos do Ga em patógenos é uma chave para a compreensão da toxicidade
diferencial de Ga para uma variedade de espécies de bactérias. Tal entendimento pode
permitir o uso mais eficiente de Ga no tratamento de doenças infecciosas.
Segundo Kaneko et al. (2007), casos de infecção hospitalar têm sido relacionados à
presença de bactérias da espécie Pseudomonas aeruginosa. A resistência bacteriana aos
antimicrobianos tem levado à procura por novos fármacos. Nitrato de gálio é usado na clínica
para tratamento de hipercalcemia e, estudos in vitro com este sal demonstram sua atividade
33
antibacteriana e contra a formação de biofilme em P. aeruginosa. Ga3+
interfere com o
metabolismo de Fe3+
da bactéria.
Com base nos últimos estudos, Kurtjak et al. (2016) estão interessados na introdução
de nano-gálio como um novo componente antibacteriano a um material bioativo, isto é, a
hidroxiapatita (HAp), que é amplamente utilizada no implante ósseo/ dentário e engenharia de
tecido (DOROZHKIN, 2012; WANG et al., 2014). Isto iria resultar num compósito que
poderia prevenir a infecção e permitir a cicatrização de feridas, crescimento de tecidos e
reparação em torno dele.
Os resultados apresentados a partir do teste qualitativo realizado na pesquisa de
Oliveira (2016) comprovaram a ação antimicrobiana do elemento químico gálio a partir da
utilização do pó de óxido de gálio amorfo (a-GaxOy) e utilização de solução do óxido de gálio
amorfo (processo conhecido por difusão em disco). A ação antimicrobiana do a-GaxOy em pó
e em solução, frente às Pseudomonas aeuruginosa e Staphylococus aureus, foi identificada a
partir da formação de halos de inibição bacteriana. Esses resultados comprovam as
informações reportadas na literatura a respeito da ação anti-infecção e anti-inflamação deste
elemento químico, tornando-o um elemento promissor para aplicações em fármacos,
cosméticos, e outros.
2.5 PIRÓLISE
A pirólise é um processo de conversão térmica que implica na ruptura de ligações
carbono-carbono e na formação de ligações carbono-oxigênio (ROCHA et al., 2004).
A microestrutura do material é desenvolvida durante a etapa de pirólise, portanto,
deve-se ter acesso às faixas de temperatura nas quais ocorrem evaporação do solvente,
pirólise dos precursores e avaliar sua volatilidade, além de verificar a influência da velocidade
de aquecimento no processo de decomposição térmica (ALVES et al., 2001).
Em sentido estrito, pirólise é uma reação de análise ou decomposição que ocorre pela
ação de altas temperaturas. Ocorre uma ruptura da estrutura molecular original de um
determinado composto pela ação do calor em um ambiente com pouco ou nenhum oxigênio.
34
2.6 SISTEMA CVD (CHEMICAL VAPOR DEPOSITION)
Este método, que consiste na deposição química a partir da fase vapor, realiza-se pela
reação de compostos metálicos sobre um substrato aquecido (CHOPRA, 1983;
MANIFACIER, 1982; VOSSEN, 1977). Baseia-se essencialmente em crescer o filme por
meio de algum tipo de reação química que toma lugar na fase vapor, na superfície do
substrato.
As técnicas baseadas em CVD, sem dúvida, alcançaram grande sucesso devido ao
êxito de sua aplicação na obtenção de filmes semicondutores, constituindo-se atualmente na
mais importante técnica utilizada na indústria de microeletrônica. Além disso, o
desenvolvimento de novos tipos de precursores e a modelagem computacional contribuiu
decisivamente para este crescimento.
Todavia, no caso da obtenção de sistemas óxidos contendo mais de um metal, o
sistema CVD mostra-se sensível às diferenças de volatilidade dos diferentes precursores, o
que dificulta a obtenção de materiais constituídos de uma única fase (ALVES et al., 2002).
Na deposição de materiais pelo processo CVD, ocorrem numerosos e complexos
processos químicos. A cinética das reações envolve as fases condensadas e gasosas das
substâncias do processo (GONÇALVES, 2002)
De um sistema CVD para deposição de materiais, devem fazer parte os equipamentos
necessários para executar as seguintes funções: a - transportar e medir os gases diluentes e
reagentes que entram no reator; b - aquecer e controlar a temperatura da região da reação onde
se encontra o substrato; c - remover os produtos da reação que saem do reator, comumente
tóxicos, tratando-os adequadamente.
O sistema CVD utilizado para oxidação das amostras do pó de a-GaxOy, utilizadas
nesta pesquisa e que foram obtidas por pirólise em combustão espontânea, em ambiente
aberto, está disponível no laboratório de preparação de materiais, localizado no Departamento
de Física (DF) da UFPE (Figuras 3 e 4).
O forno de oxidação é constituído por um cilindro cerâmico horizontal com dois
orifícios nas duas extremidades laterais, onde são inseridas as amostras a serem oxidadas. As
amostras são inseridas num tubo de quartzo que é acoplado de um orifício ao outro. Em um
dos orifícios, tem-se uma mangueira que leva o fluxo de oxigênio do cilindro do gás até o
35
forno. A outra extremidade permanece aberta para saída do fluxo e retirada do material após
oxidação (OLIVEIRA, 2016), semelhante desenho esquemático da Figura 5.
Figura 3: Forno de oxidação do Sistema CVD, Chemical Vapor Deposition, (vista frontal),
localizado na Universidade Federal de Pernambuco (Departamento de Física).
Fonte: Este trabalho.
Figura 4: Forno de oxidação do Sistema CVD, Chemical Vapor Deposition, (vista lateral).
Fonte: Este trabalho.
36
Figura 5: Desenho esquemático do forno de Oxidação do Sistema CVD, Chemical Vapor
Deposition, e o fluxo de oxigênio do cilindro do gás até o forno.
Fonte: Este trabalho.
2.7 TÉCNICAS DE CARACTERIZAÇÃO
As técnicas de caracterização possibilitaram o entendimento dos efeitos dos
tratamentos pelos quais as amostras do pó de óxido de gálio amorfo foram submetidas antes e
após os processos de oxidação.
A “caracterização do material” é uma área da ciência responsável por prever o
comportamento ou elucidar fenômenos físicos, químicos ou biológicos característicos de cada
material, seja de natureza orgânica ou inorgânica (QUEIROZ et al., 2012).
A caracterização de materiais utiliza de técnicas instrumentais de análise visando à
compreensão de diferentes aspectos relacionados à composição (massa molecular, número de
oxidação, etc.) e estrutura (ligações químicas, fase cristalina, etc.) de materiais que estão
diretamente ligadas às propriedades químicas e físicas dos mesmos, sendo que, as
propriedades físicas e químicas estão vinculadas a propriedades mecânicas, ópticas,
catalíticas, entre outras. Desta forma, a caracterização auxilia a determinação da possível
aplicabilidade dos compostos estudados (ZARBIN, 2007).
Os instrumentos de análise química convertem informações sobre características
químicas e/ou físicas em informações que possam ser manipuladas e interpretadas. Os
37
princípios de funcionamento destes instrumentos são baseados em estimular a amostra, por
diferentes meios, como incidência de energia eletromagnética, calor, entre outras, de forma a
produzir uma resposta do sistema em estudo, e que corresponde a fenômenos, cuja natureza e
magnitudes são regidas pelas leis fundamentais da química e da física. Atualmente, existem
variados instrumentos capazes de fornecer informações qualitativas e quantitativas sobre a
composição e estrutura da matéria, sendo essencial a familiarização e compreensão dos
princípios fundamentais de operação da instrumentação analítica moderna de modo a realizar
escolhas apropriadas e empregar de forma eficiente essas ferramentas de análise (SKOOG et
al., 2009).
2.7.1 Difração de Raios X (DRX)
A difração de Raios X tem por finalidade detectar, em forma qualitativa, os
componentes químicos contidos em uma determinada amostra, e tem sido utilizada em
diversos estudos com esta finalidade (CAMILLERI et al., 2005; PARK et al., 2010).
Dentre as várias técnicas de caracterização de materiais, a técnica de difração de Raios
X é a mais indicada na determinação das fases cristalinas presentes em materiais cerâmicos.
Isto é possível, porque na maior parte dos sólidos (cristais), os átomos se ordenam em planos
cristalinos separados entre si por distâncias da mesma ordem de grandeza dos comprimentos
de onda dos Raios X.
Dentre as vantagens da técnica de difração de Raios X para a caracterização de fases,
destacam-se a simplicidade e rapidez do método, a confiabilidade dos resultados alcançados,
pois o perfil de difração obtido é característico para cada fase cristalina, a possibilidade de
análise de materiais compostos por uma mistura de fases e uma análise quantitativa destas
fases (ALBERS et al., 2002).
A difração de Raios X fornece informações sobre o arranjo estrutural dos átomos que
constituem um sólido, indicando, a princípio, se a amostra possui características de um sólido
cristalino ou amorfo a partir da presença ou ausência de picos no difratograma. Sólidos
cristalinos apresentam picos relativos ao espaçamento interplanar, sendo possível determinar a
distância interplanar, enquanto sólidos amorfos não apresentam tais picos, devido à ausência
de planos característicos, ocasionada pela desordem estrutural dos mesmos. Porém, não é
38
possível identificar diretamente qual plano é responsável pela difração em um sólido
cristalino. A identificação dos planos é feita, quando possível, por meio da correlação
empírica dos difratogramas obtidos com outros difratogramas contidos em um banco de
dados, com auxilio de um software específico. Entretanto, se a amostra contém diferentes
componentes cristalinos, a identificação torna-se complexa (SKOOG et al., 2009; SMART;
MOORE, 2005)
A difração é uma diferença de fase entre as ondas eletromagnéticas, as quais são
causadas por interferências. Para observar uma interferência em ondas de luz visível, é preciso
passar dois ou mais feixes através de fendas bem próximas umas das outras, para que a
interferência apareça. Neste sentido, a distância entre essas fendas não pode ser muito maior
que o comprimento de onda da luz. Visto que os cristais possuem planos bem regulares e bem
próximos uns dos outros, permitem a possível difração de um feixe de Raios X. Ao incidir um
feixe de Raios X em um cristal, o mesmo interage com os átomos presentes, originando o
fenômeno de difração. A difração de Raios X ocorre segundo a Lei de Bragg (N l= 2d sem q),
onde n representa número inteiro, l comprimento de onda dos Raios X incidentes, d distância
interplanar, q ângulo de difração; a qual estabelece a relação entre o ângulo de difração e a
distância entre os planos que a originaram (característicos para cada fase cristalina). Desta
forma, sempre que a diferença de fase entre duas ondas for zero, seus comprimentos se
interferem construtivamente e suas amplitudes se somam. Mas se a diferença de fase for de
meio comprimento de onda, elas interferem destrutivamente e suas amplitudes se subtraem
(os raios se anularão). Portanto, a difração acontece quando se tem uma interferência
construtiva. A maioria dos compostos cristalinos apresenta um pouco de fase amorfa, isso
significa que não houve tempo de cristalizar os átomos ou moléculas em arranjos ordenados
no espaço (estes arranjos são interpretados como picos característicos para cada composto),
então uma parte fica com as moléculas ou átomos sem entrar nestes arranjos, por isso, o sinal
na difração é tipo uma montanha ou um ruído mais forte expressados no difratograma
(GARCIA et al., 2011).
39
2.7.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) (Scanning Electron Microscopy – SEM)
A principal função de qualquer microscópio é tornar visível ao olho humano o que for
muito pequeno para tal. A máxima resolução dos microscópios ópticos fica limitada a um
aumento máximo de 2000 vezes, porque acima deste valor, detalhes menores são
imperceptíveis. Um Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) utiliza um feixe de elétrons
no lugar de fótons utilizados em um Microscópio Óptico, o que permite solucionar o
problema de resolução relacionado com a fonte de luz branca. O MEV é um aparelho que
pode fornecer rapidamente informações sobre a morfologia de uma amostra sólida (PEREIRA
et al., 2013).
O MEV é um dos mais versáteis instrumentos disponíveis para a observação e análise
de características microestruturais de objetos sólidos. A principal razão de sua utilidade é a
alta resolução que pode ser obtida quando as amostras são observadas; valores da ordem de 2
a 5 nanômetros são geralmente utilizados (NAGATANI et al., 1987, apud DEDAVID et al.,
2007).
Outra característica importante é a aparência tridimensional da imagem das amostras,
resultado direto da grande profundidade de campo. Permite, também, o exame em pequenos
aumentos e com grande profundidade de foco, o que é extremamente útil, pois a imagem
eletrônica complementa a informação dada pela imagem óptica.
Essa técnica é utilizada para obtenção de imagens tanto de superfícies polidas, como
rugosas, com grande profundidade de campos e alta resolução (MANNHEIMER, 1992).
O princípio de um Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) consiste em utilizar
um feixe de elétrons de pequeno diâmetro para explorar a superfície da amostra, ponto a
ponto, por linhas sucessivas e transmitir o sinal do detector a uma tela catódica, cuja varredura
está perfeitamente sincronizada com aquela do feixe incidente. Por um sistema de bobinas de
deflexão, o feixe pode ser guiado de modo a varrer a superfície da amostra, segundo uma
malha retangular. O sinal de imagem resulta da interação do feixe incidente com a superfície
da amostra. O sinal recolhido pelo detector é utilizado para modular o brilho do monitor,
permitindo a observação. A maioria dos instrumentos usa como fonte de elétrons um
filamento de tungstênio (W) aquecido, operando numa faixa de tensões de aceleração de 1 a
50 quilovolts (kV). O feixe é acelerado pela alta tensão criada entre o filamento e o ânodo. Ele
é, em seguida, focalizado sobre a amostra por uma série de três lentes eletromagnéticas com
40
um spot menor que 4 nm. O feixe interagindo com a amostra produz elétrons e fótons que
podem ser coletadas por detectores adequados e convertidas em um sinal de vídeo.
Para serem detectadas, as partículas e/ou os raios eletromagnéticos, resultantes da
interação do feixe eletrônico com a amostra, devem retornar à superfície da amostra e daí
atingirem o detector. A profundidade máxima de detecção, portanto, a resolução espacial,
depende da energia com que essas partículas ou raios atingem o detector, ou são capturadas
pelo mesmo. Por exemplo, elétrons retroespalhados possuem maior energia do que os elétrons
secundários, assim, o detector de elétrons retroespalhados irá operar na faixa de energia maior
e o de elétrons secundários na faixa menor. A imagem formada a partir do sinal captado na
varredura eletrônica de uma superfície pode apresentar diferentes características, uma vez que
a imagem resulta da amplificação de um sinal obtido de uma interação entre o feixe eletrônico
e o material da amostra. Diferentes sinais podem ser emitidos pela amostra. Dentre os sinais
emitidos, os mais utilizados para obtenção da imagem são originários dos elétrons
secundários e/ou dos elétrons retroespalhados. (DEDAVID et al., 2007).
Preparação de amostra. As amostras precisam ser resistentes ao vácuo. Amostras
condutoras não exigem nenhuma preparação especial. Todavia, amostras isolantes devem ser
cobertos com uma camada de material condutivo, exceto quando observados com ambiente de
vácuo variável. Uma cobertura ultrafina de material eletricamente condutiva é depositada
tanto por evaporação de alto vácuo quanto por sputter de baixo vácuo na amostra. Isto é feito
para prevenir a acumulação de campos elétricos estáticos na espécime, devido à irradiação
elétrica durante a produção da imagem. Tais coberturas incluem ouro, ouro/paládio, platina,
tungstênio, grafite, etc. Outra razão para a metalização, mesmo quando há condução mais do
que suficiente, é para melhorar o contraste, esta situação é mais comum na operação de
Microscópios Eletrônicos de Varredura por Emissão de Campo (field emission SEM)
(ZANIN, 2012).
Para a análise morfológica e estrutural das amostras de óxido de gálio amorfo
estudadas nesta pesquisa, foi utilizado o aparelho de Microscopia Eletrônica de Varredura do
Departamento de Física, da UFPE (Figura 6).
41
Figura 6: Aparelho de Microscopia Eletrônica de Varredura, localizado na Universidade
Federal de Pernambuco (Departamento de Física).
Fonte: Este trabalho.
2.7.3 Espectroscopia por Dispersão em Energia (Energy Dispersive Spectroscopy - EDS)
EDS é um aparelho acoplado a outros instrumentos que detecta e processa Raios X,
convertendo-os em dados expressos em um histograma. Este espectro (gráfico de Raios X)
consiste numa série de picos que representam o tipo e a quantidade de cada elemento presente
na amostra (BONACCORSO et al., 2008). As amostras podem ser tanto sólidas quanto
líquidas, pós e compósitos também podem ser avaliados e as amostras dependerão do
aparelho ao qual o EDS está acoplado (microscópio eletrônico de varredura ou transmissão,
aparelho de fluorescência de Raios X ou sonda eletrônica para microanálise Raios X).
Dependendo do programa de computador para leitura e interpretação dos dados, pode fornecer
análises pontuais, em linha (técnica scanline) ou, ainda, imagens do mapeamento químico
elementar para quase todos os aparelhos em que estiver acoplado (BRUNDLE et al., 1992).
Para análise da composição química presente nas amostras estudadas de a-GaxOy
deste trabalho, foi utilizado o aparelho de EDS localizado do Departamento de Física, da
UFPE (Figura 7).
42
Figura 7: Aparelho de EDS, Energy Dispersive Spectroscopy, localizado na Universidade
Federal de Pernambuco (Departamento de Física).
Fonte: Este trabalho.
2.7.4 Espectroscopia Raman
Se uma onda eletromagnética atinge a superfície de um meio, uma fração da luz é
refletida, enquanto que o resto é transmitido para dentro do material. Da parcela da radiação
transmitida através da superfície, uma fração desta é absorvida na forma de calor e outra é
retransmitida na forma de luz espalhada. A luz emergente apresenta em seu bojo uma pequena
parcela composta de frequências diferentes daquela incidente; o processo que rege este
fenômeno recebe o nome de espalhamento Raman, ou seja, técnica de espectroscopia que é
governada por processos de espalhamento de luz pela matéria. (RODRIGUES; GALZERANI,
2012).
2.8 BIOCOMPATIBILIDADE
Biocompatibilidade é um assunto que tem sido discutido e analisado por mais de 50
anos. A maioria da comunidade de biomateriais falhou surpreendentemente em entender o
paradigma da biocompatibilidade. Isso é evidenciado pelo uso frequente do adjetivo
"biocompatível" para descrever ou categorizar um biomaterial (WILLIAMS, 2014).
A avaliação biológica ou biocompatibilidade de biomateriais e dispositivos médicos é
realizada por meio de ensaios efetuados de acordo com normas internacionais designadas
mundialmente como “guidelines”. As normas são publicações técnicas internacionais de
protocolos e métodos, in vitro e in vivo, desenvolvidos e padronizados a partir de um
consenso envolvendo revisões literárias, pesquisas científicas, entre outros. A adoção dessas
normas na pesquisa pré-clinica e de biocompatibilidade visa a práticas mais consistentes,
eficazes e eficientes, assim como, aprimoram e uniformizam a avaliação da eficácia e
43
segurança dos produtos para a saúde e possibilitam um melhor gerenciamento do risco destes
produtos pelas agências reguladoras. A Organização de Cooperação Econômica e
Desenvolvimento (OECD) e a International Organization for Standardization (ISO) têm
desenvolvido as normas para estes testes e ensaios, assim como, outras farmacopéias
especificas tal como da Sociedade Americana para Testes e Materiais (ASTM) (ASTM, 2010;
ISO, 2010; OECD, 2010).
Essa avaliação da biocompatibilidade é realizada através de um conjunto de testes, in
vitro e in vivo, que sejam complementares, de maneira a oferecer um resultado com os mais
criteriosos níveis científicos e de informação, e que sejam validados e reconhecidos pelos
meios científicos e pelos órgãos regulamentadores, para utilização nas áreas de aplicações
médicas (SILVA, 2011).
2.9 ENSAIOS IN VITRO
No intuito de se refinar e diminuir a utilização de animais de laboratório na pesquisa
biomédica, iniciou, na década de 80, o desenvolvimento de modelos experimentais in vitro
para a avaliação da eficácia e segurança de produtos. Estes modelos foram utilizados com
sucesso para a demonstração de mecanismos de ações específicas, mostrando-se úteis e
preditivos no que se referem aos sistemas biológicos realizados em microrganismos, células,
tecidos e órgãos, animais ou humanos. Assim, vêm sendo desenvolvidos, validados e
integrados nas normas internacionais, tais como a ISO e OECD (SILVA, 2011).
Os métodos in vitro apresentam vantagens em relação aos, in vivo, tais como poder
limitar o número de variáveis experimentais, obter dados significativos mais facilmente, além
do período de teste ser, em muitos casos, mais curto. O problema da extrapolação dos dados
obtidos in vitro para a aplicação clínica dos biomateriais pode ser superado pelo uso de
materiais de referência apropriados, atualmente em uso em clínicas (ROGERO et al., 2003).
2.9.1 Teste de Citotoxidade
A toxidade corresponde à capacidade de determinadas substâncias causarem danos aos
44
seres vivos. Os sistemas de cultura celular assumem grande importância nos testes de
toxidade devido à sensibilidade e reprodutibilidade, que facilitam o gerenciamento dos testes,
diminuindo os custos. Sistemas de células de mamíferos são utilizados para avaliar o
potencial citotóxico de componentes cosméticos, materiais médico-hospitalares, produtos
farmacêuticos, químicos e poluentes ambientais (PINTO; KANEKO; PINTO, 2010).
Sempre que um novo material é desenvolvido, seu potencial para interações nocivas e
toxicológicas com os seres humanos e animais deve ser considerado. As pequenas
nanopartículas possuem razões de área superficial - por volume, que são extremamente
grandes, o que pode levar a altas reatividades químicas. Embora a segurança dos
nanomateriais seja uma área relativamente inexplorada, existem preocupações de que eles
possam ser absorvidos para o interior do corpo através da pele, dos pulmões e do trato
digestório em taxas relativamente elevadas, e, de que alguns, se presentes em concentrações
suficientes, venham a apresentar riscos à saúde - tais como danos ao DNA ou
desenvolvimento de câncer de pulmão (CALLISTER; RETHWISCH, 2012).
Os testes de citotoxidade medem a proporção de células viáveis. A maioria desses
testes se baseia na ruptura da integridade da membrana que é determinada pela entrada de um
corante, ao qual a célula é geralmente impermeável como, por exemplo, o azul de tripan, ou a
liberação de um corante normalmente adquirido e retido por células viáveis, por exemplo,
vermelho neutro. Esses efeitos, no entanto, são imediatos e não preveem a sobrevivência
posterior das células testadas (FRESHNEY, 2005).
De acordo com o Órgão Internacional de Padronização (International Standard
Organization), ISO 10993, o ensaio de citotoxicidade in vitro é o primeiro teste para avaliar a
biocompatibilidade de qualquer material para uso em dispositivos biomédicos e, depois de
comprovada a sua não toxicidade, é que o estudo da biocompatibilidade do produto pode ter
continuidade realizando-se os ensaios necessários em animais de laboratório. Os testes de
citotoxidade são utilizados em uma pré-seleção para detectar se o material em questão
provoca morte das células ou outros efeitos negativos nas funções celulares (WILLIAMS,
2014).
Vários métodos in vitro, para avaliar a toxicidade de biomateriais, foram padronizados
utilizando-se culturas celulares. Esses testes de citotoxicidade consistem em colocar o
material direta ou indiretamente em contato com uma cultura de células de mamíferos,
verificando-se as alterações celulares por diferentes mecanismos, entre os quais, a
incorporação de corantes vitais ou a inibição da formação de colônias celulares (CRUZ et al.,
45
1987; ROGERO et al., 2000). O parâmetro mais utilizado para avaliar a toxicidade é a
viabilidade celular, que pode ser evidenciada com auxilio de corantes vitais, como o vermelho
neutro, solúvel em água e que passa através da membrana celular, concentrando-se nos
lisossomos, fixando-se por ligações eletrostáticas hidrofóbicas em sítios aniônicos na matriz
lisossomal. Muitas substâncias danificam as membranas resultando no decréscimo de captura
e ligação do vermelho neutro. Portanto, é possível distinguir entre células vivas e danificadas
ou mortas, pela medida de intensidade de cor da cultura celular (CIAPETTI et al., 1996).
A citotoxicidade basal é definida como “os efeitos adversos resultantes da
interferência com estrutura e/ou processos celulares essenciais para a sobrevida, proliferação
e/ou função comum a todas as células do organismo” (EKWALL, 1999).
A avaliação da citotoxicidade basal é importante, uma vez que as funções celulares
basais suportam as funções celulares órgãos-específicas. A citotoxicidade basal é expressa
como IC50 (concentração que inibe 50% das células quando comparado às células controle
não-tratadas), a qual pode ser matematicamente calculada à partir da curva de dose-efeito.
Vários métodos aplicados para testar a toxicidade geral são úteis na toxicologia in vitro.
Como regra geral, as células são expostas a diferentes concentrações de um produto químico
por um dado período de tempo, sendo posteriormente, a função celular mensurada utilizando
diferentes alvos (SU et al., 2009).
Conforme a ISO 10993-5 (2009), os inúmeros métodos utilizados para a determinação
da citotoxidade podem ser agrupados em quatro categorias: as avaliações da morfologia
celular; as determinações dos danos celulares; a avaliação do crescimento celular; e a
avaliação de aspectos referentes ao metabolismo celular. Os testes validados para este fim
são: 3T3 NRU, teste de citotoxidade para formação de colônias, MTT/MTS XTT (2,3-bis (2-
methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hidroxide) de
citotoxidade (NIH, 2001; ICCVAM, 2006).
Os sais de tetrazolium, componentes ativos dos corantes vitais MTT, XTT e MTS, são
utilizados para distinguir as células vivas das células mortas. Eles são reduzidos à formazana
pelo sistema de citocromo das células viáveis e a cor resultante é uma medida direta da
viabilidade celular. As formazanas são excessivamente insolúveis em água e na tentativa de
driblar este inconveniente, foram desenvolvidos os derivados do MTT, os corantes XTT e
MTS, que produzem formazanas mais intensamente coloridas e solúveis em água, facilitando
desta forma a leitura em espectrofotômetro (BARLTROP; OWEN, 1991).
Gálio metálico é considerado um produto químico seguro, que não é problemático
para a saúde humana e para o ambiente (GRAY et al., 1998; YU; LIAO, 2011), mas não há
46
muitas investigações sobre sua citotoxicidade. Um relatório advertiu sobre a toxicidade, após
a implantação subcutânea (REPETTO; PESO, 2012) e há várias investigações sobre
amálgamas à base de gálio, cuja citotoxicidade foi ligada à corrosão e liberação de íons Ga3+
(WATAHA, 1991; KUBÁSEK, 2013). Embora os valores tóxicos (para a sobrevivência de
50%) dos íons Ga3+
lançado no estudo de KURTJAK et al. (2016) variaram de 40 a 2000 mM,
Ga nunca foi menos tóxico do que Ag+ e geralmente menos tóxico do que o Zn
2+ (WATAHA,
1991; MILHEIRO, 2016). Um estudo revelou também que os fibroblastos L-929 e células de
osteossarcoma MG63 foram capazes de proliferar e aderir sobre a liga de Ti-Ga contendo
10% em peso de Ga (QIU et al., 2014). Além disso, um estudo recente da liga eutética de
nanopartículas GaIn mostrou a sua baixa citotoxidade in vitro em células HeLa, na
concentração de 21 mg / L (0,2 Ga), e a sua injeção in vivo em ratos não causou danos nos
tecidos, nenhuma reação alérgica, exibiu muito baixa toxicidade aguda (dose máxima tolerada
de 700 mg / kg), e Ga e In foram excretados nas fezes e urina (LU; HU; LIN et al., 2015).
2.9.1.1 Células VERO
O cultivo de células se iniciou no princípio do século XX com Harrison, em 1907, e
Carrel, em 1912. Essa técnica foi desenvolvida como um método para estudar o
comportamento de células animais fora do organismo, em um meio ambiente controlado. Essa
técnica ainda é uma importante ferramenta de pesquisa nos laboratórios do mundo inteiro.
Em 1962, Nakamura e colaboradores, no Japão, estabeleceram a linhagem VERO,
oriunda de rim de macaco-verde africano (Cercopithecus aethiops).
Segundo França, 2008, a linhagem celular VERO (macaco) é recomendada para
avaliar toxicidade de substâncias químicas in vitro (ISO - International Standardization
Organization, 1999), como a provocada pelo inseticida pentaclorofenol (FERNÁNDEZ
FREIRE et al., 2005) e pelo medicamento Carbamazepina (PÉREZ MARTÍN et al., 2008).
Outros autores já demonstram a utilização dessas células para avaliar nefrotoxicidade
provocada por micotoxinas (HASSEN et al., 2007). São células muito empregadas para
produzir grande quantidade de vírus para caracterização e desenvolvimento de vacinas, pelo
fato dessas células apresentarem um rápido crescimento (TIWARI et al., 2006). Foram
utilizadas para avaliar um método que quantifica a replicação dos vírus da dengue em cultura
de células (LUDERT et al., 2008). A referida linhagem tem sido utilizada também em alguns
47
estudos de toxicologia de metais (ROMERO et al., 2004a; ROMERO et al., 2004b), devido,
principalmente, ao baixo custo (SWANSON et al., 1988).
2.9.1.2 Células RAW 264.7
Os macrófagos são células relativamente grandes, que medem entre 25-50 μm de
diâmetro, apresentam núcleo irregular, possuem um ou mais nucléolos, cromatina pouco
condensada, citoesqueleto bem desenvolvido, inúmeras projeções citoplasmáticas, grande
número de lisossomos, complexo de Golgi e mitocôndrias (AUGER et al., 1992). Eles são,
sem dúvida, um dos mais importantes tipos de células do sistema imune inato e podem
assumir formas morfológicas diferentes, conforme sua localização (HALLIWELL et al.,
1999).
A fagocitose desenvolvida pelos macrófagos compõe o início do conjunto das
atividades biológicas de toda a resposta imunológica e da resposta inata, e é constituída pelas
etapas: aderência ao substrato, quimiotaxia, ingestão de células e partículas inertes e produção
de radicais livres (SPORN et al., 1990; DE LA FUENTE et al., 1991; HOLGATE et al., 1996;
ADEREM et al., 1999; ZAPOLSKA-DONAR et al., 2000). Há "espraiamento" do macrófago,
com alteração da forma (arredondada para achatada), e consequente aumento da área de
contato da membrana plasmática com o substrato a ser fagocitado, e redistribuição das
organelas citoplasmáticas.
Dentre as linhagens imortalizadas de macrófagos disponíveis, destacam-se as RAW
264.7, oriundas de células tumorais peritoneais induzidas por vírus (Abelson Leukemia Virus)
em ratos (RASCHKE et al., 1978, apud RAELE, R., 2013). Estas células são aderentes,
apresentam alta taxa de fagocitose e de multiplicação. São resistentes e relativamente fáceis
de cultivar. São interessantes para testes de toxicidade, pois apresentam metabolismo, que
mimetiza macrófagos de culturas primárias, porém, não sofrem fase de declínio no seu
crescimento, por serem imortalizadas.
48
3.0 TESTE DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Mediante relatos da literatura de que o gálio apresenta propriedade antibacteriana, este
estudo tem como propósito verificar a eficácia da atividade antimicrobiana, in vitro, do óxido
de gálio amorfo sobre Streptococcus mutans, pela determinação da Concentração Inibitória
Mínima (CIM), bacteriostática, e pela Concentração Bactericida Mínima (CBM), bactericida,
ou seja, inibindo a multiplicação, e provocando a destruição celular bacteriana,
respectivamente, utilizando a técnica da microdiluição.
A técnica da microdiluição é uma adaptação da macrodiluição em caldo. É
denominada dessa maneira, porque envolve o uso de pequenos volumes de caldo colocados
em placas estéreis de 80, 96 ou mais poços de fundo redondo ou chato, próprias para
microdiluição (ALVES et al., 2008).
3.0.1 Streptococcus mutans
A cárie dentária pode ser definida como uma perda localizada dos tecidos calcificados
dos dentes, decorrentes da fermentação de carboidratos da dieta por micro-organismos do
biofilme dentário. O termo cárie deriva do latim cariosus, que significa destruição ou
putrefação. As lesões de cárie caracterizam-se pela destruição localizada de tecidos dentários
mineralizados. Para que a cárie dentária ocorra, é necessária a presença dos fatores
predisponentes, interagindo em condições críticas, por determinado período de tempo: o
hospedeiro com dentes suscetíveis, colonizados por micro-organismos cariogênicos e dieta
rica em carboidratos (principalmente a sacarose), consumida frequentemente (JORGE, 2012).
A presença da placa bacteriana sobre a superfície do dente, para a doença cárie
dentária se desenvolver, é fundamental na sua fase inicial (AZEVEDO; HENRIQUES, 2008).
Ao metabolizar os carboidratos que vão permanecer na cavidade oral por algum tempo,
alguns dos grupos de bactérias presentes na placa, como Streptococcus mutans (que incluem
as espécies S. mutans e S. Sobrinus) e os Lactobacilos, que são acidófilos e acidogênicos, vão
fermentar a glicose, sacarose e frutose, hidratos de carbono (AZEVEDO; HENRIQUES,
49
2008). Este processo provoca uma descida sustentada de pH na cavidade oral, durante cerca
de quarenta e cinco minutos, pois origina ácidos como o láctico, acético, propiônico e
fórmico. Consequentemente, ocorre a diminuição do pH na interface placa-esmalte.
Buscando determinar qual o tipo de estreptococos presente na placa estava mais
envolvido com o processo de cárie, em 1924, Clarke isolou um tipo específico de
estreptococos das lesões, o qual denominou Streptococcus mutans, pois sua morfologia
celular e da colônia em meio de cultura contendo sacarose apresentava grande variabilidade
em relação às demais espécies de estreptococos então conhecidos. Demonstrou que o
isolamento de S. mutans de lesões iniciais de cárie ocorria com mais frequência do que o de
espécies de lactobacilos (LEITES et al., 2005).
Após a descoberta por Clarke em 1924, S. mutans permaneceu por aproximadamente
35 anos praticamente ignorado, até que em 1960 foi “redescoberto” por Fitzgerald e Keyes. A
partir daí, a sua correlação com a doença cárie tem sido extensivamente estudada, indicando
ser essa bactéria o principal agente etiológico da cárie. São cocos gram positivos, anaeróbios
facultativos, microaerófilos, acidogênicos e acidúricos, e capazes de formar polissacarídeos
extracelulares.
A situação taxonômica dos estreptococos cariogênicos está bem definida no
“Estreptococos do Grupo Mutans” (EGM). Existem sete espécies que estão incluídas no
EGM: S. mutans, S. sobrinus, S. cricetus, S. rattus, S. ferus, S. macacae, S. downei. Porém
Zhu et al. (2000) sugeriram uma nova espécie de Streptococcus oral, para qual propuseram o
nome de Streptococcus oristatti sp. nov., espécie esta isolada da boca de ratos Sprague-
Dawley. Os autores relatam também ser necessário cuidado, quando ratos Sprague-Dawley
forem usados como modelo para estudar os efeitos desta bactéria oral em cáries dentais, pois
esta nova espécie é morfologicamente similar aos membros do EGM. Das espécies acima, o S.
mutans e S. sobrinus apresentam potencial cariogênico em humanos. As outras espécies são
encontradas em animais e, se estão presentes em humanos, não parecem ser altamente
cariogênicas (LEITES et al., 2005).
A importância deste estudo, verificando-se bons resultados de citotoxidade e
comprovada atividade antimicrobiana frente a S mutans, pelo uso do pó de óxido de gálio
amorfo, obtido por pirólise à combustão espontânea de Trietil Gálio e oxidado pelo sistema
CVD, após novas pesquisas, biomateriais de uso odontológico poderão ser testados, in vivo,
contendo a-GaxOy, visando a sua ação antibacteriana para cárie dentária.
50
3 EXPERIMENTAL
3.1 MATERIAIS
Cilindro do sistema MOCVD, contendo Trietil Gálio
Óxido amorfo à base de gálio;
Tween 80, exemplo de surfactante não iônico e emulsionante derivado do sorbitol;
Água deionizada;
Culturas de células VERO (macaco verde africano - Cercopithecus aethiops), e RAW
264.7 (macrófago murino), obtidas do banco de células do Rio de Janeiro e mantidas
no laboratório de cultura de células no Departamento de antibióticos da UFPE, em
meio de cultura DMEM (Dubelcos Minimum Essential Medium), suplementado com
10 % de soro fetal bovino e 1 % de solução de antibiótico (penicilina e
estreptomicina), permanecendo em estufa a 37 ºC em atmosfera úmida, enriquecida
com 5 % de CO2.
Cepa de S. mutans AU 159, gentilmente cedido pelo laboratório de microbiologia da
UNICAMP , São Paulo – Brasil.
3.2 MÉTODOS
Para obtenção e aplicação das amostras de óxido de gálio amorfo utilizadas nesta
pesquisa, foram seguidas, respectivamente, as seguintes etapas:
1. Síntese de óxido de gálio amorfo, por processo químico de pirólise à combustão
espontânea, em ambiente aberto, de organometálico, Trietil Gálio (TEGa);
2. Oxidações por Chemical Vapor Deposition (CVD) - Deposição Química na Fase
Vapor, a três diferentes temperaturas (300, 500 e 700 °C) das amostras de a-
GaxOy, obtidas por pirólise à combustão espontânea;
3. Caracterizações das amostras de a-GaxOy, por MEV, EDS, DRX e
Espectroscopia Raman;
4. Preparo de dispersões de a-GaxOy (1mg/mL);
51
5. Aplicação das dispersões de a-GaxOy (1mg/mL) em ensaios, in vitro, de
citotoxidade, através do método do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-
2,5-difeniltetrazólio), e de atividade antimicrobiana, feita pela determinação da
Concentração Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração Bactericida Mínima
(CBM) – Técnica da Microdiluição.
3.3 SÍNTESE DE A-GAXOY POR PIRÓLISE À COMBUSTÃO ESPONTÂNEA DE
ORGANOMETÁLICO, TRIETIL GÁLIO (TEGa)
O processo de obtenção do pó de cor acinzentada de a-GaxOy foi realizado no
Departamento de Física (DF) da UFPE, por meio da pirólise à combustão espontânea de
organometálico, Trietil Gálio (TEGa). Por ser altamente pirofórico, essa substância, ao entrar
em contato com o oxigênio atmosférico, sofreu uma forte combustão. Por medida de
segurança, o experimento foi realizado em ambiente externo (aberto). Durante o experimento,
não foi possível medir a temperatura final do Béquer, onde ficou inicialmente acondicionado
o pó de óxido de gálio amorfo, logo após sua obtenção. Segundo a literatura especializada em
organometálicos, não existe uma temperatura definida de combustão para os mesmos, como,
diferentemente, há, por exemplo, para o metano, etano e demais gases combustíveis.
O pó do óxido de gálio obtido foi, posteriormente, submetido a um processo de
maceração, adquirindo uma consistência mais uniforme, e, seguidamente, acondicionado em
eppendorfs (Figuras 8 e 9).
52
3.4 OXIDAÇÕES DAS AMOSTRAS DE A-GAXOY PELO SISTEMA CVD
As amostras de a-GaxOy, obtidas por pirólise à combustão espontânea de TEGa, foram
submetidas à oxidação em atmosfera de oxigênio com um fluxo de O2 de 1slm (standard litre
per minute), por 1,0 hora a 300 °C, 500 °C e 700 ºC, utilizando o forno de oxidação do
Sistema Chemical Vapor Deposition (CVD), do laboratório de preparação de materiais do DF
da UFPE.
O procedimento foi realizado com intuito de observar se haveria alteração no
desempenho, entre si, das amostras oxidadas às três diferentes temperaturas, e em relação ao
material obtido exclusivamente por pirólise à combustão espontânea, quando realizados os
ensaios de citotoxidade e de atividade antimicrobiana.
Figura 9: Pó de óxido de gálio amorfo
macerado.
Figura 8: Pó de óxido de gálio amorfo
sendo macerado.
Fonte: Ramalho, A. (2016)
Fonte: Ramalho, A. 2016
53
3.5 CARACTERIZAÇÕES DAS AMOSTRAS DE A-GAXOY
A análise morfológica e estrutural das amostras de a-GaxOy por Microscopia
Eletrônica de Varredura (MEV) foi feita no laboratório de microscopia eletrônica do
Departamento de Física da UFPE, através do equipamento de marca TESCAN, modelo MIRA
3. A técnica de análise foi por elétron secundário.
Não foi feita a metalização da amostra, pois o equipamento permitia o subsídio de
visualização para a obtenção de micrografias, sem necessidade desse procedimento.
A análise por Espectroscopia por Dispersão em Energia (EDS) das amostras de a-
GaxOy foi feita no laboratório de microscopia eletrônica do Departamento de Física da UFPE,
através do equipamento de marca OXFORD INSTRUMENTS, modelo X-MaxN .
Foi feito o mapa de Raios X ou mapa EDS e EDS qualitativo e semiquantitativo
(discriminação e percentual atômico, respectivamente, dos elementos presentes nas amostras),
conforme resultados (Figuras 16, 17, 18 e 19). Dos valores obtidos por essa técnica de
caracterização, foram construídos alguns gráficos, comparando o percentual atômico de Gax,
Oy e Cz das amostras de óxido de gálio amorfo (a-GaxOy) versus suas temperaturas de pirólise
e de oxidação por CVD, em relação ao Ga2 e O3, do óxido de gálio cristalino (β-Ga2O3),
(Figura 20).
Para fixar as amostras, foi utilizada tinta de prata, cujo elemento químico ficou
evidenciado no mapa EDS das amostras de a-GaxOy, oxidadas a 300 °C e 500 °C (Figuras 17
e 18, respectivamente).
A análise via MEV/EDS permite a determinação da composição química na superfície
da amostra. As quantidades indicadas nas tabelas de microanálise por EDS são apenas
semiquantitativas, servindo como um indicador da quantidade de cada elemento presente e
não podem ser tomadas como análises quantitativas.
A técnica de caracterização por Difração de Raios X (DRX) das amostras de a-GaxOy
foi feita no CETENE. Foi utilizado Difratômetro de Raios X da marca Bruker e modelo D8
Advance Davinci. Radiação: Tubo de Cu K(alfa). Voltagem: 40 Kv. Corrente: 40 mA. Filtro:
Níquel. Os Parâmetros utilizados foram: intervalo angular de 3° - 80°; Passo de 0,03° e
Tempo de 1,0 segundo.
54
A análise por Espectroscopia Raman das amostras de a-GaxOy foi feita no laboratório
de microscopia do CETENE. O equipamento usado foi o microscópio Raman confocal Alpha
300 AR da WITEC. Para as análises, foi usado um laser de 532 nm, com potência de 100
mW, um tempo de integração de 5,0 segundos e 10 acumulações. Para a preparação das
amostras, simplesmente, foi colocado um pouco das mesmas sobre a lâmina de microscopia e,
posteriormente, feita a sua medida.
3.6 PREPARO DE DISPERSÕES DE A-GAXOY (1MG/ML)
Para os ensaios de citotoxidade e teste de atividade antimicrobiana, precisou-se
descobrir, inicialmente, o meio que melhor dispersar-se o pó de a-GaxOy. Após testar em água
destilada, soro fisiológico e DMSO (Dimetilsulfóxido), percebeu-se que o referido composto
dispersou-se mais adequadamente em ácido nítrico (HNO3) a 5%, porém, por sua alta
toxicidade, não seria indicada sua aplicação nos testes in vitro em questão. Diante disso,
optou-se pela água deionizada e tween 80 no preparo da dispersão de a-GaxOy (1mg/mL),
obtendo-se quatro amostras distintas, seguindo as seguintes etapas, respectivamente:
1. Pesou-se 1,0 mg da amostra do pó de a-GaxOy;
2. Pipetou-se 1,0 microlilitro (µL) de tween 80 sobre a amostra de a-GaxOy e adicionou-se 1,0
mL de água deionizada;
3. Para melhorar a dispersão, utilizou-se um ultrasson de alta potência (modelo Ultrasonic
Processor), com pulso ligado por 5s (segundos), desligado por 1s, durante 30min (minutos),
com amplitude de 40%.
A atividade citotóxica foi realizada através do método do MTT (brometo de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) (ALLEY et al., 1988; MOSMANN, 1983).
As células VERO e RAW 264.7 (105 células/mL) foram plaqueadas em placas de 96
poços e incubadas por 24h (horas). Em seguida, 10 µL das amostras dissolvidas em tween 80
3.7 TESTE DE CITOTOXIDADE
55
foram adicionadas aos poços em concentração final de 5 a 0,625 µg/mL. Após 72 horas de
reincubação, foram adicionados 25 µL de MTT (5 mg/mL), e depois de 3h de incubação, o
meio de cultura com o MTT foi aspirado e 100 µL de DMSO foram adicionados a cada poço.
A absorbância foi medida em um leitor de microplacas no comprimento de onda de 560 nm
(nanômetro).
Os experimentos foram realizados em triplicata e a média da percentagem de inibição
e desvio padrão foram calculados. A diferença entre os valores das médias de viabilidade
celular foram avaliadas pela Anova one way e pós teste Turkey´s (p< 0,05) no programa
GraphPad Prism 7.0. demo.
3.8 TESTE DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) E DA
CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MINIMA (CBM) – TÉCNICA DA
MICRODILUIÇÃO.
Foram utilizadas microplacas contendo 96 orifícios com fundo chato, distribuídos em
colunas enumeradas de 1 a 12 e linhas em letras de “A” a “H” (Figura 10).
Figura 10 - Microplaca de 96 orifícios contendo o caldo Brain Heat Infusion (BHI),
substância teste em diferentes concentrações e inóculo bacteriano.
Fonte: Este trabalho.
56
Conforme diluições das substâncias testes foram realizadas em triplicata, sendo as
linhas A até H correspondentes a diferentes concentrações da substância teste, começando da
mais concentrada (A) para menos concentrada (H). As diluições das substâncias testes foram
realizadas, conforme Tabela 1. As microplacas foram preparadas e em cada compartimento
teve um volume final de 100 μL, com proporções variadas do Meio Caldo Brain Heat
Infusion (BHI) para bactérias e da substância teste, atingindo, ao final, diferentes
concentrações do produto.
Tabela 1 - Distribuição das substâncias testes nas colunas 1, 2 e 3, em diferentes
concentrações nas linhas A-H, volume do meio de cultura liquido, e inóculo dos micro-
organismos.
POÇOS CALDO BHI
(µL)
Substância
teste (µL)
INÓCULO
(µL)
Volume final
do poço (µL)
Concentração
final da
substância teste
(mg/mL)
A1 A2 A3 20 60 20 100 0,6
B1 B2 B3 30 50 20 100 0,5
C1 C2 C3 40 40 20 100 0,4
D1 D2 D3 50 30 20 100 0,3
E1 E2 E3 60 20 20 100 0,2
F1 F2 F3 65 15 20 100 0,15
G1 G2 G3 70 10 20 100 0,10
H1 H2 H3 75 05 20 100 0,05
Fonte: Este trabalho
A todos os poços, foram adicionados 20 μL do inóculo microbiano, previamente
padronizado para concentração final 0,5 na escala de Mc Farland (1,5 x 108
UFC/mL). O
micro-organismo (S. mutans) foi incubado a 37ºC por 24 horas.
Terminado o período de incubação, foram adicionados 30 µL de resazurina em cada
orifício. A microplaca foi então recolocada na estufa a 37ºC. A resazurina (7-hidroxi-3H-
fenoxazina-3-ona-10-óxido) é um composto indicador de óxido-redução de cor azul que, na
presença de células viáveis, é oxidado a resofurina, substância de coloração vermelha
57
(PALOMINO et al., 2002). Logo, a coloração azul indica ausência de crescimento
microbiano; enquanto que as variações de rosa e roxo são indicadoras da presença de células
viáveis para crescimento. Após 1 hora, foi feita a análise da mudança de cor.
Após determinação da CIM, semelhante à representação da Figura 11, a primeira
concentração que houve crescimento visível e todas as que não houve crescimento visível,
foram cultivadas em placas de Petri contendo ágar BHI. Foram transferidos 10 µL das
cavidades da microplaca para as placas de Petri e estas foram incubadas a 37 ºC/ 28 ºC, em
condições de microaerofilia, por 24 horas. A CBM foi determinada através da análise do
crescimento microbiano na placa de Petri com meio de cultura na ausência da substância teste.
Foi considerada CBM, o inóculo transferido com a menor concentração da substância teste, na
qual não houve crescimento microbiano.
Figura 11: Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) de uma substância teste
pela resazurina.
Fonte: Máximo, F. (2012).
58
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA E ESTRUTURAL
A microscopia eletrônica de varredura permitiu observar com mais detalhes a
morfologia formada antes e após o processo oxidativo por CVD das amostras de a-GaxOy.
Foram obtidas imagens com magnificações de 2.000X; 5.0000X; 10.000X; 20.000X; 50.000X
e 100.000X.
Quando alguns parâmetros (temperatura, pressão, tempo, fluxo) são modificados,
diferentes morfologias podem ser obtidas. Ao modificar a temperatura (de combustão
espontânea e de oxidação), percebeu-se que não houve muita mudança na morfologia
estrutural externa de todas as amostras de a-GaxOy obtidas nesta pesquisa, quando comparadas
entre si. Conforme Figuras 12, 13, 14 e 15, são visualizados aglomerados de carbono, gálio e
oxigênio na forma de esferas, pela maceração a frio, na forma de partículas de tamanho
variando do nanométrico ao micrométrico.
Figura 12: Imagem de microscopia eletrônica de varredura, com magnificação de 100.000X
que mostra a morfologia estrutural externa do óxido de gálio amorfo, obtido por pirólise em
combustão espontânea de Trietil Gálio.
Fonte: Este trabalho
59
Figura 13: Imagem de microscopia eletrônica de varredura, com magnificação de 50.000X
que mostra a morfologia estrutural externa do óxido de gálio amorfo oxidado a 300 °C.
Fonte: Este trabalho
Figura 14: Imagem de microscopia eletrônica de varredura, com magnificação de 100.000X
que mostra a morfologia estrutural externa do óxido de gálio amorfo oxidado a 500 °C.
Fonte: Este trabalho
60
Figura 15: Imagem de microscopia eletrônica de varredura, com magnificação de 50.000X
que mostra a morfologia estrutural externa do óxido de gálio amorfo oxidado a 700 °C.
Fonte: Este trabalho
4.2 ESPECTROSCOPIA POR DISPERSÃO EM ENERGIA (EDS)
Observou-se, no EDS, a presença do elemento químico gálio, como observado nas
Figuras 16, 17, 18 e 19, obtido pela pirólise à combustão espontânea do organometálico
Trietil Gálio. A presença do elemento químico prata, visto nas Figuras 17 e 18, é justificada
pela tinta de prata utilizada para fixar as amostras e facilitar a análise por esta técnica de
caracterização. A presença do elemento químico oxigênio é proveniente da combustão em
ambiente aberto, no processo de pirólise à combustão espontânea do TEGa, assim como, por
oxidação em atmosfera de oxigênio com um fluxo de O2 de 1slm, por 01 hora a 300, 500 e
700 ºC, pela técnica de CVD. O carbono residual presente é advindo do processo de
conversão térmica, que implicou na ruptura de ligações carbono-gálio do Trietil Gálio,
(C2H5)3 Ga.
61
Figura 16: EDS, Energy Dispersive Spectroscopy, mostrando a composição do pó de óxido
de gálio amorfo, obtido por pirólise em combustão espontânea de Trietil Gálio
Fonte: Este trabalho
Figura 17: EDS, Energy Dispersive Spectroscopy, mostrando a composição do pó de óxido
de gálio amorfo, oxidado a 300 °C.
Fonte: Este trabalho
62
Figura 18: EDS, Energy Dispersive Spectroscopy, mostrando a composição do pó de óxido
de gálio amorfo, oxidado a 500 °C.
Fonte: Este trabalho
Figura 19: EDS, Energy Dispersive Spectroscopy, mostrando a composição do pó de óxido
de gálio amorfo oxidado a 700 °C.
Fonte: Este trabalho
De acordo com a Figura 20, a seguir, observa-se que, com o aumento da temperatura
de oxidação pelo Sistema CVD, o percentual atômico de gálio e oxigênio do a-GaxOy
63
aumentou, enquanto que o percentual atômico do carbono diminuiu, alterando o aspecto
visual do pó de a-GaxOy, quando oxidado a 700 °C, passou de cinza claro para a cor branca
Quando há uma combustão natural ao ar livre, é esperado que permaneçam ligações do
gálio ao C2H5 (etil) sem serem desfeitas, levando à cor cinza clara do pó, no entanto, nos casos
de uma queima total (por exemplo a 700 °C), há uma quebra total das ligações do gálio ao
C2H5, fazendo com que o pó fique branco, pela diminuição do número de átomos de carbono.
Na temperatura de recozimento a 300 ºC, há uma diminuição no número de compostos C2H5,
presentes no pó de óxido de gálio amorfo.
Figura 20: Gráficos comparativos dos percentuais atômicos de Gax, Oy e Cz das amostras de
óxido de gálio amorfo (a-GaxOy) versus suas temperaturas de pirólise em combustão
espontânea e de oxidação por CVD, Chemical Vapor Deposition, em relação ao Ga2 e O3 do
óxido de gálio cristalino (β-Ga2O3).
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% a
tôm
ico
(a
.u.)
Temperatura °C
Gax
Oy
Cz
Ga2
O3
Fonte: Este trabalho
4.3 DIFRAÇÃO DE RAIOS X (DRX)
A Figura 21 mostra o Difratograma típico do pó de óxido de gálio, quando obtido a
partir da pirólise à combustão espontânea do TEGa e pela oxidação por Chemical Vapor
Deposition (CVD) a 300, 500 e 700 °C, com presença de bandas características de fase
amorfa, significando que não houve tempo para cristalização dos átomos ou moléculas em
64
arranjos ordenados no espaço; então, uma parte fica com as moléculas ou átomos sem entrar
nestes arranjos, por isso, o sinal na difração é tipo uma montanha (pico largo). Ainda pela
Figura 30, percebe-se que o DRX do pó de óxido de gálio oxidado à temperatura de
recozimento de 700 °C apresentou, além da fase amorfa, uma quantidade de material
cristalino, típico de um material policristalino, com presença de picos característicos finos,
cuja intensidade corresponde aos planos cristalinos do óxido de gálio cristalino (β-Ga2O3.
Geralmente em artigos científicos que reportam à síntese e caracterização de óxidos diversos,
os autores desconsideram backgrounds ou presença de ruídos que são evidentes em
difratogramas, desconsiderando também, nesses casos, a possível presença de material amorfo
existente no material cristalino (HUANG et al., 2009, HU et al., 2002).
Figura 30: Difratograma das amostras de óxido de gálio amorfo, obtidas por pirólise em
combustão espontânea de Trietil Gálio, à temperatura de pirólise (T.P.) e por oxidação por
Chemical Vapor Deposition a 300, 500 e 700 ºC, com picos característicos de óxido de gálio
cristalino (β-Ga2O3).
10 20 30 40 50 60 70 80
150
300
450
600
750
1 0
-2
-3 1
3
2 0
0
6 0
0
3 1
2
3 1
01
1 1
4 0
-1 0 0
2
2 0
1
Ga2O
3
a-GaxO
y
T.P.
300°C
500°C
Inte
nsid
ad
e u
.a.
2
700°C
Fonte: Este trabalho
65
4.4 ESPECTROSCOPIA RAMAN
A Figura 22 (A) representa Espectros Raman do pó de a-GaxOy oxidado por Chemical
Vapor Deposition a 300, 500 e 700 ° C. Durante a análise, o a-GaxOy obtido por pirólise à
combustão ambiente de TEGa apresentou muita fluorescência e, quando o laser interagiu com
a amostra, queimou a região que estava sendo observada; impossibilitando a obtenção do
espectro. Talvez utilizando outro comprimento de laser de menor energia, seja possível a
obtenção do espectro, antes não obtido.
Ainda pela Figura 22 (A), observa-se que o pó de óxido de gálio amorfo oxidado a
700 °C apresentou bandas características da fase β-Ga2O3, conforme referência para os picos
Raman da Figura 3 de Sun Z., Yang L. H., Shen X. C. et al. Anisotropic Raman spectroscopy
of a single β-Ga2O3 nanobelt. Chin Sci Bull, 2012, 57: 565-568, doi: 10.1007/s11434-011-
4920-2, Figura 22 (B).
66
Figura 22: (A) Espectros Raman do pó de óxido de gálio amorfo oxidado por Chemical
Vapor Deposition a 300, 500 e 700 °C. (B) Referência para os picos Raman da Figura 3 de
Sun Z., Yang L. H., Shen X. et al. Anisotropic Raman Spectroscopy of a single β-Ga2O3
nanobelt. Chin Sci Bull, 2012, 57: 565-568, doi: 10.1007/s11434-011-4920-2.
Fonte: Este trabalho
4.5 TESTE DE CITOTOXIDADE
O pó de óxido de gálio amorfo, disperso em água deionizada e tween 80, obtido por
pirólise à combustão espontânea de Trietil Gálio e oxidado a 300º, 500º e 700 °C pelo
sistema CVD (Chemical Vapor Deposition), testado nas concentrações de 5,0; 2,5; 1,25 e
0,625 µg/mL, apresentou viabilidade celular frente às linhagens RAW 264.7 e VERO,
conforme Tabela 2, Tabela 3, Tabela 4 e Tabela 5, respectivamente, a seguir.
67
Tabela 2 – Valores de viabilidade celular do pó de óxido de gálio amorfo, obtido por pirólise
à combustão espontânea de Trietil Gálio frente às linhagens RAW 264.7 e VERO.
Linhagem RAW 264.7 Linhagem VERO
Concentrações Média da
viabilidade
celular (%)
Desvio padrão
(%)
Média da
viabilidade
celular (%)
Desvio
padrão
(%)
Controle 100,0a
7,40 100,00a 7,25
0,625 µg/ml 88,73ª,b 3,94 77,03
b,c 4,31
1,25 µg/mL 78,98b,c
13,38 77,62b,c
8,03
2,5 µg/mL 62,46c 7,83 94,37
a,c 11,90
5,0 µg/mL 12,16d 1,6 75,56
b 1,93
Médias seguidas de letras iguais não apresentaram diferença significativas para o teste de
análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste Tukey, considerando p < 0,05. Fonte: Este trabalho.
Tabela 3 - Valores de viabilidade celular do pó de óxido de gálio amorfo, oxidado a 300 ºC
por CVD (Chemical Vapor Deposition), frente às linhagens RAW 264.7 e VERO.
Linhagem RAW 264.7 Linhagem VERO
Concentrações Média da
viabilidade
celular (%)
Desvio
padrão
(%)
Média da
viabilidade celular
(%)
Desvio padrão
(%)
Controle 100,03a 7,40 100,00
a 7,25
0,625 µg/mL 116,37a 18,32 87,71
a 4,01
1,25 µg/mL 101,61a 6,30 105,44ª
,c 14,61
2,5 µg/mL 108,67a 8,53 125,19
b,c 14,21
5,0 µg/mL 66,33b 4,97 128,21
b 0,59
Médias seguidas de letras iguais não apresentaram diferença significativas para o teste de
análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste Tukey, considerando p < 0,05. Fonte: Este trabalho.
68
Tabela 4 - Valores de viabilidade celular do pó de óxido de gálio amorfo, oxidado a 500 ºC
por CVD (Chemical Vapor Deposition), frente às linhagens RAW 264.7 e VERO.
Linhagem RAW 264.7 Linhagem VERO
Concentrações Média da
viabilidade
celular (%)
Desvio
padrão
(%)
Média da
viabilidade celular
(%)
Desvio padrão
(%)
Controle 100,00a 7,40 100,00
a 7,25
0,625 µg/mL 138,72b 4,00 94,79
a 4,76
1,25 µg/mL 129,77b 8,74 90,16
a 18,18
2,5 µg/mL 119,56b 18,07 123,37
a 22,54
5,0 µg/mL 123,37b 5,45 123,58
a 26,06
Médias seguidas de letras iguais não apresentaram diferença significativas para o teste de
análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste Tukey, considerando p < 0,05. Fonte: Este trabalho.
Tabela 5 - Valores de viabilidade celular frente do pó de óxido de gálio amorfo, oxidado a
700 ºC por CVD (Chemical Vapor Deposition), frente às linhagens RAW 264.7 e VERO;
Linhagem RAW 264.7 Linhagem VERO
Concentrações Média da
viabilidade
celular (%)
Desvio padrão
(%)
Média da
viabilidade
celular (%)
Desvio
padrão
(%)
Controle 100,00a 7,40 100,00
a 7,25
0,625 µg/mL 89,76a,b
0,92 128,10b 1,93
1,25 µg/mL 78,37b 6,16 118,47
b 12,77
2,5 µg/mL 24,47c 1,73 120,22
b 14,37
5,0 µg/mL 15,82c 2,19 22,14
c 3,16
Médias seguidas de letras iguais não apresentaram diferença significativas para o teste de
análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste Tukey, considerando p < 0,05. Fonte: Este trabalho.
69
Das substâncias analisadas, a que proporcionou, quando presente, a menor
citotoxidade, ou seja, a maior viabilidade celular frente à linhagem RAW 264.7 e VERO, foi a
amostra de óxido de gálio amorfo (a-GaxOy) oxidada à temperatura de 500 ºC pela sistema
CVD (Chemical Vapor Deposition), nas concentrações 0,625 a 5 µg/mL, para ambas células.
Isso seria interessante, pois nessas concentrações, a linhagem RAW 264.7 e VERO mantêm a
viabilidade celular, conforme dados da Tabela 4. Tais produtos induziram, quando de sua
aplicação, uma resposta adequada, com a proliferação celular de forma significativa,
característica de biocompatibilidade (células RAW 264.7, em todas as concentrações),
caracterizando um bom indício para regeneração tecidual, por exemplo em processos de
cicatrização (a cicatrização de feridas consiste em perfeita e coordenada cascata de eventos
celulares, moleculares e bioquímicos que interagem para que ocorra a reconstituição tecidual.
Os mecanismos da cicatrização em sequência ordenada de eventos foram descritos por Carrel
em 1910, e divididos posteriormente em cinco elementos principais: inflamação, proliferação
celular, formação do tecido de granulação, contração e remodelamento da ferida, segundo
ORGILL, D.; DEMLING, R.H., 1988).
Em contrapartida, a amostra de a-GaxOy oxidada à temperatura de 700 ºC pelo
sistema CVD (Chemical Vapor Deposition), células RAW 264.7 – na concentração 2,5 e 5,0
µg/mL e VERO – na concentração 5,0 µg/mL, foi a que proporcionou menor viabilidade para
ambas as células, conforme dados da Tabela 5.
4.6 TESTE DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Atividade antimicrobiana, determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e
Concentração Bactericida Mínima (CBM), do pó de óxido de gálio amorfo, disperso em água
deionizada e tween 80, submetido apenas à pirólise em combustão espontânea de
organometálico, Trietilgálio - TEGa (a-GaxOy/ PIRÓLISE EM COMBUSTÃO
ESPONTÂNEA); e do pó de óxido de gálio amorfo submetido também à oxidação por
Chemical Vapor Deposition (CVD) - Deposição Química na Fase Vapor a 300 ºC (a-
GaxOy/ OXIDAÇÃO a 300 °C), a 500 °C (a-GaxOy/ OXIDAÇÃO a 500 °C) e a 700 ºC (a-
GaxOy/ OXIDAÇÃO a 700 °C), conforme Tabela 6, abaixo.
70
Tabela 6 - Atividade antimicrobiana, determinação da CIM e CBM do pó de óxido de
gálio amorfo, disperso em água deionizada e tween 80, submetido apenas à pirólise em
combustão espontânea de TEGa (a-GaxOy/ PIRÓLISE EM COMBUSTÃO ESPONTÂNEA);
e do pó de óxido de gálio amorfo submetido também à oxidação por CVD a 300 ºC (a-GaxOy/
OXIDAÇÃO a 300 °C), a 500 °C (a-GaxOy/ OXIDAÇÃO a 500 °C) e a 700 ºC (a-GaxOy/
OXIDAÇÃO a 700 °C).
SUBSTÂNCIAS CIM CBM
a-GaxOy/ PIRÓLISE EM
COMBUSTÃO ESPONTÂNEA 0,2 mg/mL 0,4 mg/mL
a-GaxOy/ OXIDAÇÃO a 300 °C 0,05 mg/mL 0,4 mg/mL
a-GaxOy/ OXIDAÇÃO a 500 °C 0,15 mg/ mL 0,5 mg/mL
a-GaxOy/ OXIDAÇÃO a 700 °C 0,15 mg/mL 0,6 mg/mL
Fonte: Este trabalho.
Das substâncias analisadas, a que melhor apresentou atividade antimicrobiana foi a
amostra de óxido de gálio amorfo oxidada à temperatura de 300 ºC, pela técnica de CVD, por
sua ação inibitória da multiplicação celular, numa concentração menor (0,05 mg/mL), além de
que, sua concentração para morte celular bacteriana foi similar a do a-GaxOy/ PIRÓLISE (0,4
mg/mL); e inferior ao comparado das amostras de a-GaxOy/ OXIDAÇÃO a 500 °C (0,5
mg/mL) e a-GaxOy/ OXIDAÇÃO a 700 °C (0,6 mg/mL), conforme dados da Tabela 6.
À temperatura de recozimento de 300 °C, o pó de a-GaxOy, apresenta, conforme
resultados apresentados pela atividade antimicrobiana desta pesquisa, uma redução no número
de ligações de oxigênio ao gálio, que, por sua vez, terá um maior número de ligações
pendentes, favorecendo sua absorção pelas bactérias. Levando em consideração que muitas
enzimas que apresentam ferro em sua composição estão envolvidas no metabolismo
microbiano de patógenos, o gálio pode atuar como agente deletério nestes organismos, agindo
como inibidor ou destruidor dessas células, a partir de sua inserção na composição dessas
redes proteicas. Esses resultados comprovam as informações reportadas na literatura a
respeito da ação antibacteriana desse metal, por sua interferência na utilização de ferro por
certos micro-organismos, e consequentemente, na síntese do Ácido Desoxirribonucleico, no
transporte de elétrons e na defesa contra o stress oxidativo.
É de conhecimento também que na temperatura de oxidação de 700 °C, há uma quebra
total das ligações do gálio ao C2H5, de forma que às ligações pendentes do gálio, haja maior
número de oxigênio, reduzindo consideravelmente sua interação com Streptococcus mutans,
conforme ficou evidenciado nos resultados deste experimento, como a amostra que
apresentou menor atividade antimicrobiana.
71
5 INPI FRANÇA
De acordo com a importância dos resultados iniciais e inéditos obtidos nesta pesquisa,
referentes à baixa citotoxidade do a-GaxOy e a sua atividade antibacteriana favorável para S.
mutans, e, em virtude também do baixo conhecimento na literatura sobre sua aplicação
terapêutica médica-odontológica, foi solicitada a inscrição no enveloppe Soleau, no INPI
(Institut National de Propriété Intelectuelle) da França, para atividade antimicrobiana e de
cicatrização do óxido de gálio amorfo, conforme ANEXO A.
72
6 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
6.1 CONCLUSÕES
A pirólise à combustão espontânea de Trietil Gálio (TEGa) produziu um pó de cor
cinza claro de óxido de gálio amorfo (a-GaxOy), comprovado por Difração de Raios X (DRX).
O pó obtido por queima do referido organometálico, em ambiente aberto, foi submetido à
oxidações pelo sistema CVD - a 300, 500 e 700 °C. Nessa última temperatura, houve uma
mudança na cor do pó, passando de cinza claro para branco, que pôde ser explicada, pela
diminuição do percentual atômico de carbono na amostra, evidenciado pela Espectroscopia
por Dispersão em Energia (EDS), que, também, confirmou, em todas as amostras de pó
obtidas, a presença do elemento químico gálio, oxigênio. Foi confirmado que com o aumento
da temperatura desse processo oxidativo, o percentual atômico de gálio e oxigênio do a-GaxOy
aumentou.
De acordo com as análises feitas pela Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV),
percebeu-se que, ao modificar a temperatura (de combustão e oxidação), não houve muita
mudança na morfologia estrutural externa das amostras de a-GaxOy, visualizando-se
aglomerados de carbono, gálio e oxigênio na forma de esferas em magnificações de 50.000X
e 100.000X.
A partir do DRX, obteve-se o difratograma típico do pó de óxido de gálio, obtido a
partir da pirólise à combustão espontânea do TEGa e pela oxidação por CVD a 300, 500 e 700
°C, com presença de bandas características de fase amorfa (pico largo). Notou-se também que
o DRX do pó de óxido de gálio oxidado à temperatura de recozimento de 700 °C apresentou,
além da fase amorfa, uma quantidade de material cristalino, típico de um material
policristalino (presença de fase amorfa e cristalina), com picos característicos finos, cuja
intensidade corresponde aos planos cristalinos do óxido de gálio cristalino (β-Ga2O3).
Das análises feitas pela Espectroscopia Raman, observou-se que o pó de óxido de
gálio amorfo oxidado a 700 °C apresentou bandas características da fase β-Ga2O3
Todas as quatro amostras de a-GaxOy obtidas foram utilizadas no preparo de
dispersões, por meio de tween 80, tipo de dispersante, e água deionizada, que foram utilizadas
nos testes laboratoriais de citotoxidade em linhagem de célula VERO e RAW 264.7, e de
73
atividade antimicrobiana sobre S. mutans AU 159, potente bactéria iniciadora da doença cárie
dentária.
Pelo ensaio de citotoxidade, concluiu-se que a amostra de óxido de gálio amorfo (a-
GaxOy), obtida por pirólise à combustão espontânea de Trietil Gálio e oxidada à temperatura
de 500 ºC pela sistema CVD, foi a que apresentou menor citotoxidade, independente da
concentração, frente à linhagem de células RAW 264.7 e VERO, quando comparada à
amostra de óxido de gálio amorfo submetida à temperatura de recozimento de 700 ºC, que na
presença de células RAW 264.7 – na concentração 2,5 e 5,0 µg/mL e VERO – na
concentração 5,0 µg/mL, foi a que proporcionou menor viabilidade para as ambas células.
Nessa temperatura, os resultados observados nas células RAW 264.7, em todas as
concentrações, mostraram uma possível proliferação celular; sendo um bom indício para
regeneração tecidual, o que viria beneficiar também os pacientes diabéticos, já que, entre as
principais complicações do diabetes, está a maior dificuldade de cicatrização de ferimentos.
Uma vez comprovados os resultados satisfatórios da sua não toxicidade inicial,
estudos de biocompatibilidade do produto a-GaxOy, obtido por pirólise à combustão
espontânea de Trietil Gálio e oxidado a 500 °C, podem ter continuidade, realizando-se os
ensaios necessários em animais de laboratório, ou seja, in vivo.
De acordo com os resultados da atividade antimicrobiana, percebeu-se que a amostra
de a-GaxOy oxidada a 300 °C por CVD foi a que teve melhor desempenho por sua ação
inibitória da multiplicação celular (bacteriostática) e para morte celular bacteriana
(bactericida) sobre cepa de Streptococcus mutans; quando comparada às demais amostras,
especialmente, aquela submetida à temperatura de recozimento de 700 °C, que teve o pior
resultado para esse tipo de ensaio laboratorial.
6.1.1 PERSPECTIVAS
A toxicidade dos compostos contendo gálio foi, até o presente momento, insuficiente
para provar uma razão de abandono desta via terapêutica. A amostra de a-GaxOy,
quando oxidada a 500 °C por CVD, apresentou-se pouco tóxica.
Estudos de biocompatibilidade deverão, posteriormente, ser complementados, para
que o a-GaxOy possa ser definitivamente utilizado em pacientes humanos.
Apesar do efeito de divisão celular, teste de específico para proliferação celular deverá
ser realizado, já que teste de citotoxidade não indicativo para essa finalidade.
74
Amostras de a-GaxOy, oxidadas à temperatura 300° C por CVD resultaram em
atividade antimicrobiana favorável sobre S. mutans, agentes causadores da cárie
dentária, favorecendo o desenvolvimento de novos estudos na área de biomateriais
odontológicos, com finalidade preventiva para esse tipo de doença de origem
polimicrobiana
Pelos resultados iniciais inéditos e importantes, foi solicitada a inscrição no enveloppe
Soleau, no INPI (Institut National de Propriété Intelectuelle) da França, para atividade
antimicrobiana e de cicatrização do óxido de gálio amorfo. Até o presente momento,
não se têm noticias de que o gálio, na sua forma elementar (gálio metálico) ou na
forma de nanoestruturas de GaxOy (óxido de gálio, amorfo ou cristalino) tenha sido
utilizado na medicina ou odontologia, para tratamento terapêutico e/ ou preventivo.
75
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ANEXO - APPLICATIONS DE L'OXYDE DE GALLIUM AMORPHE COMME AGENT
ANTI-MICROBES ET AGENT CICATRISANT.
DATA: 05/01/2017, COMMANDE N° P000316802
