UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ... · 2014-08-19 · 5.3.5-Limites de Detecção (LD) ... decorridos mais de 30 dias de implantação,

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE GEL DE

BIOPOLÍMERO PRODUZIDO PELA FERMENTAÇÃO DE MELAÇO DA

CANA-DE-AÇÚCAR PELO MICROORGANISMO ZOOGLOEA SP.

CONTENDO ÁCIDO ÚSNICO

MOZART DE ARAÚJO NÉRIS

RECIFE-2007

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE GEL DE BIOLÍMERO PRODUZIDO

PELA FERMENTAÇÃO DE MELAÇO DA CANA-DE-AÇÚCAR PELO

MICROORGANISMO ZOOGLOEA SP. CONTENDO ÁCIDO ÚSNICO

Dissertação de mestrado submetida ao Programa

de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do

Departamento de Ciências da Saúde da

Universidade Federal de Pernambuco, como pré-

requisito para a obtenção do grau de Mestre em

Ciências Farmacêuticas, na área de concentração:

Produção e Controle de Medicamentos.

Mestrando: Mozart de Araújo Néris

Orientadora: Profª. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães

Co-Orientador: Prof. Dr. José Lamartine de Andrade Aguiar

Recife, 2007

iii

Néris, Mozart de Araújo

Desenvolvimento e caracterização de gel de biopolímero produzido pela fermentação de melaço da cana-de-açúcar pelo microorganismo Zoogloea sp. Contendo ácido úsnico / Mozart de Araújo Néris. – Recife: O Autor, 2007.

xv, 67 folhas : il.,fig., tab.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de

Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2007.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Farmacotécnica - Biopolímero 2. Farmacotécnica – Ácido Úsnico I. Título.

615.012 CDU (2.ed.) UFPE 615.19 CDD (22.ed.) C CCS2007-30

iv

v

“Depois de grande esforço para

solucionar problema; não se agaste se outro

problema aparece, requisitando-lhe novo

esforço porque Deus renovará suas forças

para recomeçar.”

Francisco Cândido Xavier do livro

RESPOSTAS DA VIDA, ditado pelo Espírito

André Luiz

vi

AGRADECIMENTOS

A Deus pela oportunidade concedida para poder seguir sempre em busca da melhora, do

crescimento íntimo, moral e intelectual visando sempre os preceitos do Cristo.

A minha orientadora Prof. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães, pela confiança,

orientações, e oportunidade durante a realização deste trabalho, além da imensa

bagagem adquirida na participação e colaboração com o Grupo de Sistemas de

Liberação Controlada que muito me ensinou.

Ao Prof. Dr. José Lamartine de Andrade Aguiar, pela indispensável colaboração na

orientação e o apoio na elucidação das dúvidas durante o desenvolvimento deste

trabalho.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFPE,

pela possibilidade de compartilhar dos conhecimentos e experiência durante a realização

do Mestrado.

Ao Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho, Diretor do Laboratório de Imunopatologia Keizo

Asami – LIKA/UFPE, e Prof. Dr.Luiz Bezerra de Carvalho Júnior, responsável pelo

setor Bioquímica- LIKA, onde o presente trabalho foi realizado e que muito contribuie

para a formação de novos cientistas .

Aos funcionários do LIKA: Moises, Otaviano, Felipe, Mª Helena, Rafael, Sergio e

Verinha pela contribuição no suporte técnico, necessário na realização das pesquisas.

A minha família que pelo passar dos anos se preocupou em transmitir ensinamentos que

me deram suporte para abraçar a vida e poder realizar os meus feitos e sonhos

necessários para a minha formação pessoal e profissional.

A minha futura esposa Marcela Kelly por todo o amor e paciência tão necessários em

uma pessoa que desejamos estar ao nosso lado nos momentos difíceis da vida e por ter

acreditado junto a mim na realização dos sonhos.

A meu pai Raimundo Néris e sua esposa Célia, minhas irmãs Thays e Aline (minha

nova família) pelo amor, apoio e consolo nas horas difíceis.

vii

A meus irmãos Murilo e Mallan há quem muito amo, e que são exemplos de

inteligência, vitória e pessoa, mesmo a distância sempre penso em vocês.

Aos colegas do grupo SLC: Noemia Santos, Hercília Rolim, Marcela Vanderley,

Mariane Cajubá, Milena, Cinthia Meireles, Marigilsom, Agenor, Cícero

Moraes,Taciana, Islene, Fábio, Dáfila, Carol, André, Débora Máximo, pelo

companheirismo, troca, apoio e grande amizade.

Aos amigos do laboratório de Bioquímica – LIKA, Givanildo Oliveira, Ian Porto,

Diogo, Sérgio, Ricardo, Érika, Chirleane, Igor pelo incentivo, divisão de espaço,

material, e a possibilidade de criação de um ambiente de trabalho saudável e propício

para as nossas realizações assim como pela amizade e pelos diversos momentos de

alegria.

Aos novos amigos David, Pedro, Felipe Urvaneija, Hugo, Marília, Biju, Magnus, Felipe

Cagada, Ageu, Gabriel, Jéferson, Jerry que me apresentaram as belezas, cantos e magias

da cidade do Recife.

Aos companheiros Douglas e Gustavo Fonseca pela paciente e harmônica divisão de

espaço e vivência.

Aos meus velhos amigos José Hermógenes, Gutemberg Oliveira, Elder Alexandre, José

Ferreira Jr, Wilton Silvestre, Marcos Linhares, Cassiano Guimarães, Maurício, Renato

Alves, Lastênio, Lenivalter com os quais conto nos momentos de alegrias e tristezas,

para apoio, diversão, companheirismo e que estes sim sempre torceram pela minha

vitória.

Aos colegas do Programa de Pós-graduação, em especial André Luis, Cristiane, Ana

Flávia, Yusef Haun, José Alexandro, Danilo Bedor pela amizade, apoio, incentivo e

ajuda e no esclarecimento das dúvidas surgidas durante o desenvolvimento de nossas

atividades.

A Sr.Adalberto e Meire, pela força, exemplo e sabedoria.

A todos que direta e indiretamente contribuiriam para a realização desta dissertação de

Mestrado, meu sincero agradecimento.

viii

SUMÁRIO

1-Introdução 16

2-Revisão da Literatura 18

2.1-Polímeros 18

2.2-Biopolímeros 19

2.2.1-Polissacarídeos 20

2.2.2-Atividade Biológica 21

2.2.3-Aplicações Médicas 21

2.3-Biopolímeros Microbianos 22

2.3.1-Método de Obtenção por Fermentação 23

2.4-Zoogloea sp. 24

2.4.1-Biopolímero Produzido pela Zoogloea Sp. 25

2.4.2-Composição Química 26

2.4.3-Propriedades Físicas 27

2.4.4-Citotoxidade e Resposta Inflamatória 27

2.4.5-Aplicações Terapêuticas 27

2.5-Gel Biopolímero 28

2.5.1-Estudos Experimentais 29

2.6-Ácido Úsnico 30

2.6.1-Características Físico-Químicas 31

2.6.2-Propriedades Biológicas 31

2.6.2.1-Atividade Antibiótica 31

2.6.2.2-Atividade Antitumoral, Citotóxica e Antiproliferativa 32

2.6.3-Perspectivas Futuras 33

2.7-Validação da Metodologia Analítica de Dosagem 33

2.7.1-Especificidade 34

2.7.2-Exatidão 34

2.7.3-Precisão 35

2.7.4-Linearidade e Faixa de Trabalho 36

2.8-Análises Térmicas 37

2.8.1-Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC) 37

2.8.2-Termogravimetria (TG/TGD) 37

3-Objetivos 39

ix

3.1-Geral 39

3.2-Específicos 39

4-Material e Métodos 40

4.1-Material 40

4.2-Métodos 40

4.2.1-Obtenção e Padronização de Gel a Partir da Membrana de

Biopolímero 41

4.2.2-Obtenção de Gel Contendo Ácido Úsnico 41

4.2.3-Preparo de Filme apartir de Gel de Biopolímero

Contendo Ácido Úsnico 41

4.2.4-Avaliação da Estabilidade do Gel de Biopolímero 41

4.2.5-Validação do Método de Extração e Dosagem de Ácido Úsnico em

Gel de Biopolímero 42

4.2.6-Preparo da Solução Estoque de Ácido Úsnico 42

4.2.7-Preparo das Amostras para Dosagem de Ácido Úsnico em


4.2.8-Linearidade 43

4.2.9-Precisão 43

4.2.10-Exatidão 44

4.2.11-Robustez 44

4.2.12-Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ) 44

4.2.13-Micrografia eletrônica 45

4.2.14-Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) 45

4.2.15-Análise Termogravimétrica (TGA/TGD) 45

5-Resultados e Discussões 46

5.1-Obtenção e Padronização do Gel a Partir da Membrana de

Biopolímero 46

5.2-Avaliação da Estabilidade do Gel de Biopolímero 46

5.3- Validação do Método Analítico de Dosagem de Ácido Úsnico em


5.3.1-Linearidade 49

5.3.2-Precisão 51

5.3.3-Exatidão 52

x

5.3.4-Robustez 53

5.3.5-Limites de Detecção (LD) e Quantificação (LQ) 54

5.3.6-Microscopia de Força Atômica 54

5.3.7-Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC) 55

5.3.8-Análise Termogravimétrica (TGA/TGD) 57

6-Conclusões 59

7-Referências Bibliográficas 60

8 - Anexos 67

Anexo I:

Artigo submetido à revista Carbohydrate Polymers

Anexo II:

Figuras e tabela referentes ao artigo

Anexo III:

Pôster apresentado em evento

xi

LISTA DE ABREVIATURAS

AU Ácido úsnico

BSA Albumina Sérica Bovina

HSA Albumina Sérica Humana

FDA Food and Drug Administration

PLA Polímero de Ácido Lático

PGA Polímero de Ácido Glicólico

PLGA Copolímero de Ácido Lático e Glicólico

EPS Polissacarídeos Extracelulares

MC Celulose Microbiana

NaCl Cloreto de Sódio

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

DMSO Dimetilsulfóxido

DSC Calorimetria Diferencial Exploratória

TGA Termogravimetria

DTG Termogravimetria Derivada

AFM Microscopia de Força Atômica

ICH International Conference on Harmonization

USP Farmacopéia Americana

xii

LISTA DE FIGURAS

REVISÃO DA LITERATURA

Figura 1-Aspecto morfológico da membrana de biopolímero produzido por via microbiológica, através da bactéria Zoogloea sp. em mosto de melaço de cana-de-açúcar com diferentes dimensões.

25 Figura 2-- Micrografia eletrônica do exopolissacarídeo produzido pela Zoogloea sp. mostrando uma visão lateral com magnitude de1400× (A) e detalhes de sua superfície a 300× (B) e a 1500× (C) de ampliação (Cavalcante et al., 2006)

26 Figura 3-Gel de biopolímero para múltiplas aplicações na área médica produzido a partir do polissacarídeo extracelular, da bactéria Zoogloea sp. em melaço de cana-de-açúcar.

29 Figura 4-A Forma do gel em implantes subcutâneos: (A) aspecto do biopolímero em tecido vivo decorridos 15 dias de implantação, (B) 30 dias de implantação, (C) decorridos mais de 30 dias de implantação, (D) Aspecto de abdome de camundongo após implante de gel subcutâneo, demonstrando ausência de sinais flogísticos, (E) Aspecto de tecido subcutâneo de cão 1 ano após o implante do gel. Notar a neovascularização e ausência de sinais flogísticos (Rangel et al., 2006).

30 Figura 5-Estrutura dos enantiômeros (-)-ácido úsnico e (+)-ácido úsnico com centro quiral no carbono 9b. (Cocchietto et al., 2002).

31

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Figura 6-Curva de estabilidade da concentração de ácido úsnico a longo prazo de gel de biopolímero contendo ácido úsnico.

48

Figura 7-Espectro de varredura na faixa do UV-Visível do ácido úsnico em solução metanólica (λmáx 280

nm).

49

Figura 8-Curva padrão de ácido úsnico e análise de regressão linear. Os resultados são representados pela média de três experimentos. As barras de erro correspondem ao desvio padrão da média de cada ponto.

50

Figura 9-Imagens de microscopia de força atômica de filmes de gel de biopolímero: puro (A) e contendo ácido úsnico (B). As barras de escala representam à diferença de altura.

55

Figura 10- Curvas de Calorimetria Diferencial Exploratória de ácido úsnico (UA), Filme de biopolímero (BPF), e Filme de biopolímero contendo ácido úsnico (UA-BPF) obtidos usando porta-amostra de alumínio a uma taxa de aquecimento de 10 ºC/min.

56 Figura 11- Curvas de Termogravimetria Diferencial de ácido úsnico, Filme de biopolímero e Filme de biopolímero contendo ácido úsnico a uma faixa de temperatura de 25-700 ºC a uma taxa de aquecimento de 10 ºC min-1. No detalhe são apresentados as curva termogravimétricas do estudo dos materiais.

57

xiii

LISTA DE TABELAS

REVISÃO DA LITERATURA

Tabela 1 - Polímeros utilizados em sistemas de liberação controlada 19

Tabela 2 - Composição de monossacarídeos das frações solúveis produzidas por hidrólise ácida com trifluoracético sob condições moderadas e fortes, determinadas através de HPLC ( Paterson-Beedle et al., 2000).

26

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Tabela 3 - Resultados do estudo de estabilidade em gel de biopolímero placebo. 47

Tabela 4 - Resultados do estudo estabilidade em gel de biopolímero contendo ácido úsnico. 48

Tabela 5 – Teste ANOVA (unilateral) para linearidade do método proposto. 51

Tabela 6 – Resultados do estudo de reprodutibilidade do método de dosagem do ácido úsnico (10 μg/ml) em gel de biopolímero utilizando espectroscopia UV.

52

Tabela 7 – Precisão intermediária do método de dosagem do ácido úsnico em gel de biopolímero através de espectroscopia UV a 280 nm. A concentração teórica de ácido úsnico foi de 10 μg/ml.

52

Tabela 8 – Resultado da exatidão para concentrações baixa, média e alta. 53

Tabela 9 – Teste t de Student aplicado aos parâmetros analisados para robustez do método de dosagem do ácido úsnico em espectrofotometria UV a 280 nm.

53

xiv

RESUMO

Um polissacarídeo extracelular foi produzido por via microbiológica, através da

bactéria Zoogloea sp. utilizando como matéria prima o melaço de cana-de-açúcar

resultando em uma membrana fibrosa que foi utilizado para preparar um gel contendo

ácido úsnico, que apresenta atividade antimicrobiana. Um método de extração de ácido

úsnico do gel de biopolímero foi validado. O ácido úsnico foi caracterizado puro e

incorporado em gel de biopolímero por Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC) e

por análises termogravimétricas (TGA). O conteúdo de ácido úsnico no gel de

biopolímero foi de 100.7%. As análises de DSC de filmes de gel de biopolímero puro e

incorporado mostraram padrões térmicos comparáveis. As curvas de TGA demostraram

que a presença de ácido de úsnico melhora a estabilidade térmica do biopolímero. Na

realidade, uma perda de peso de 86.1% foi achada para o biopolímero, considerando que

para o biopolímero que contém ácido úsnico uma perda de peso de 69.6% foi observada.

Então a incorporação de ácido úsnico em gel de biopolímero oferece um sistema

polimérico novo, facilmente disponível, economicamente viável e biocompatível para a

entrega de drogas.

Palavras-chave: ácido úsnico, biopolímero, polissacarídeos, gel, Zoogloea sp., análises termicas

xv

ABSTRACT

An exopolysaccharide produced by Zoogloea sp. from sugar cane molasses as a

fibrous membrane was used to prepare a gel containing usnic acid, which presents

antimicrobial activity. A method of drug extraction from the biopolymer gel was

validated. The usnic acid, pure and drug-loaded biopolymer gel were characterized

through differential scanning calorimetry (DSC) and thermogravimetric analyses (TGA).

The content of usnic acid in the biopolymer gel was 100.7 %. DSC scans of dried films

of pure and drug-loaded biopolymer showed comparable thermal patterns. In contrast,

TGA curves shows that the presence of usnic acid improves the thermal stability of the

biopolymer. In fact, a weight loss of 86.1 % was found for the biopolymer, whereas for

the biopolymer containing usnic acid a weight loss of 69.6 % was achieved. Therefore

the incorporation of usnic acid in a biopolymer gel offers a new economic feasible and

biocompatible system for drug delivery.

Keywords: usnic acid, biopolymer, polysaccharides, gel, Zoogloea sp., thermal analysis

NÉRIS, A. M. DESENVOLVIMENTO DE E CARACTERIZAÇÃO DE GEL DE BIOPOLÍMERO,,,

16

1-INTRODUÇÃO

Diversos microorganismos têm a habilidade de sintetizar polissacarídeos extracelulares

(EPS) (Paterson-Beedle et al., 2000). No decorrer dos últimos 30 anos o interesse na procura

de novos polímeros produzidos por microorganismos aumentou significativamente e muitos

polissacarídeos foram isolados de cogumelos, fungos, algas, líquens, e plantas (Madla et al.,

2005). Os biopolímeros de maior interesse são os extracelulares, devido a sua maior facilidade

de extração e purificação. Em geral, os EPS não contêm combinações orgânicas voláteis ou

substâncias químicas tóxicas, e podem ser sintetizados por fermentação de recursos renováveis

como subprodutos derivados da cana-de-açúcar (Padilha et al., 1998; Haag et al.,2004). Os

polissacarídeos de origem microbiana, devido as suas características, estão sendo muito

utilizados em diversos segmentos industriais sendo as propriedades funcionais dos

biopolímeros consideradas uma ferramenta poderosa para se criar novos materiais (Padilha et

al., 1998). Um EPS foi produzido por via microbiológica, através da bactéria Zoogloea sp.

isolada na Estação Experimental de Cana-de-Açúcar de Carpina/UFRPE, e identificada no

Instituto de Antibióticos da Universidade Federal Pernambuco, obtendo-se uma excelente

conversão dos açúcares em biopolímeros. Como matéria prima foi utilizada o melaço de cana-

de-açúcar resultando em membranas geleificadas (Melo et al., 1999; Paterson-Beedle et al.,

2000). Em uma avaliação da composição química dessas membranas demonstrou-se que os

principais monossacarídeos encontrados foram à glicose (87,6%), xilose (8,6%), manose

(0,8%), ribose (1,7%), galactose (0,1%), arabinose (0,4%), e ácido glucurônico (0,8%) (Melo

et al., 1999; Paterson-Beedle et al., 2000; Castro et al., 2004; Cavalcante et al., 2006). Em um

estudo de citotoxidade in vitro, por meio do índice de adesividade de macrófagos, de morte

celular e produção de oxido nítrico, demonstrou-se que o biopolímero de cana-de-açúcar

apresentou uma alta biocompatibilidade frente aos três ensaios, confirmando assim a baixa

citotoxidade a um nível que permite a sua aplicação experimental com segurança (Castro et

al., 2004). A partir do biopolímero de cana-de-açúcar está sendo produzido um gel para

múltiplas aplicações na área médica (Lima et al., 2003, Aguiar et al.,2004). Uma dessas

aplicações foi testada em um estudo experimental, utilizando-se ratos wistar e cães, onde os

animais sofreram implantação de gel em espaço subcutâneo. O gel injetado se apresentou


17

biocompatível, de fácil injeção, com reação inflamatória mínima e sem reações do tipo corpo

estranho (Rangel et al, 2006).

O ácido úsnico, [2,6-diacetil-7,9-dihidroxi-8,9b-dimetil-1,3(2h,9bH)- dibenzeno-

furadiona; C18H16O7], é um produto do metabolismo secundário de amplo aspecto de diversas

espécies de líquens (Marcano et al., 1999). Esta molécula, dentre as classes de compostos

derivados de líquens, tem sido o mais extensivamente estudado apresentando diferentes

propriedades biológicas como: antimicrobiana, antiviral, antiproliferativa, antitumoral,

antiinflamatória, entre outras (Vijayakumar et al., 2000; Muller, 2001; Cochieto et al., 2002;

Ingólfsdóttir, 2002; De Carvalho et al., 2005). A literatura relata que na natureza o principal

papel biológico do ácido úsnico é o de antibiótico sendo considerado um agente seletivo

contra Streptococcus mutans (Marcano et al., 1999; Cocchietto et al., 2002) confirmando

também excelente atividade antibacteriana contra Enterococcus faecalis, Enterococcus

faecium e Staphylococcus aureus (Lauterwein et al.,1995). Em 1975, foi publicado o primeiro

estudo da atividade antitumoral do ácido úsnico contra carcinoma pulmonar de Lewis (Muller,

2001) e em pesquisa recente desenvolvida por Ribeiro-Costa et al. (2004) foi avaliado o efeito

citotóxico do ácido úsnico livre e encapsulado em microesferas de PLGA contra carcinoma

epidermóide de laringe (HEp-2). A atividade antitumoral in vivo após administração

intraperitonial em camundongos Swiss de ácido úsnico livre e em microesferas foi avaliada

contra Sarcoma-180 revelando uma importante inibição do tumor de 63% para o ácido úsnico

encapsulado e de 42% para o composto livre. Sendo assim, o presente estudo visou

desenvolver um implante utilizando o gel de biopolímero produzido pela fermentação de

melaço da cana-de-açúcar pelo microorganismo Zooglea sp. como sistema de liberação de

medicamentos capaz de viabilizar a administração do ácido úsnico em uma formulação que

otimize a dose terapêutica diminuindo os efeitos tóxicos do mesmo pela diminuição da sua

presença nos hepatócitos em diversas aplicações médicas.


18

2-REVISÃO DA LITERATURA

2.1-Polímeros

Os polímeros são macromoléculas de alta massa molecular caracterizadas por seu

tamanho, estrutura química e ligações intra e intermoleculares resultantes da condensação de

centenas ou milhares de unidades de moléculas menores ligadas umas as outras de forma

linear, ramificada, ou por ligações cruzadas. Estes possuem unidades químicas ligadas por

covalência, repetidas regularmente ao longo da cadeia, denominadas de “monômeros” (Lloyd

et al., 1998; Hasirci et al., 2001; Kumar et al., 2001).

Uma grande variedade de polímeros naturais e sintéticos foi estudada para a liberação

prolongada de fármacos ou direcionamento sítio específico. Entretanto, apenas poucos destes

são atualmente biocompatíveis. Polímeros naturais como a albumina sérica bovina (BSA), a

albumina sérica humana (HSA), o colágeno e a gelatina já foram estudadas para liberação de

fármacos, porém o uso destes polímeros é limitado devido os altos custos e pela variação de

pureza (Jain, 2000).

Além dos polímeros de origem natural, como os polissacarídeos e proteínas, polímeros

sintéticos (Tabela 1) também têm sido utilizados, nas últimas duas décadas, em decorrência dos

problemas associados aos polímeros naturais como a dificuldade de sua purificação (Jain,

2000). A síntese de novos polímeros tem proporcionado um grande avanço na tecnologia

farmacêutica, no desenvolvimento dos sistemas de liberação de fármacos e nos dispositivos

poliméricos (Costa, 2003; Hasirci et al., 2001; Kumar et al., 2001).

Alguns polímeros foram aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA) no uso

de sistemas de liberação controlada, tais como: polímero de ácido lático (PLA); polímero de

ácido glicólico (PGA) e especialmente copolímero de ácido lático e glicólico (PLGA), que

geram grande interesse devido a excelente biocompatibilidade e biodegradabilidade (Kumar el

al., 2001; Hans et al., 2002; Kang et al., 2002).


19

Tabela 1-Polímeros utilizados em sistemas de liberação controlada (Costa, 2003).

ORIGEM NATURAL

POLÍMEROS

Proteínas Colágeno, albumina, gelatina

Polissacarídeos Agarose, alginato, carragenana, ácido hialurônico,

dextrana, quitosana, ciclodextrina

ORIGEM SINTÉTICA

Poliésteres Poli-ácido lático (PLA), poli-ácido glicólico (PGA),

copolímero de ácido lático e glicólico (PLGA), poli-

caprolactona, poli-dioxanona

Polianidridos Poli-ácido adípico, poli-ácido teraftálico

Poliamidas Poli-amido carbonato, poli-ácido amido

Fósforo Poli-fosfatos, poli-fosfonatos

2.2-Biopolímeros

Os biopolímeros representam as combinações orgânicas mais abundantes na biosfera

estando presentes nos organismos vivos como componentes estruturais das células e tecidos de

muitos organismos, possuindo amplas e diferentes funções. Eles são importantes para vida

exibindo propriedades como a conservação e expressão de informação genética, catálise de

reações, armazenamento de carbono, nitrogênio, fósforo e outros nutrientes, além de energia,

proteção contra o ataque de outras células e ou fatores ambientais intrínsecos perigosos,

comunicação com o ambiente e outros organismos e mediadores de adesão para superfícies

(Kennedy & Bandaiphet, 2004; Kennedy & Kosseva, 2005).

No entendimento geral entre o meio científico, a expressão “biopolímeros” é usada para

seqüências moleculares de proteínas, ácidos nucléicos e para carboidratos, entretanto o campo


20

de atuação dos biopolímeros é muito mais abrangente. Além do seu papel em biologia, os

biopolímeros também despertam interesses em outras áreas como ciência de materiais e

nanotecnologia (Dawson et al., 2004).

Os biopolímeros são produzidos por diferentes sistemas biológicos e muitas vezes

apresentam diferentes grupos funcionais. Alguns biopolímeros possuem importantes

características como resistência à degradação e estabilidade em largas faixas de temperatura e

pH, capacidade de atuar em baixas concentrações. Sua estrutura química e características

especiais lhe conferem a chance de ter as mais diversas aplicações (Padilha et al., 1998; Pinto

et al., 2002; Khachatoorian et al., 2003).

Os biopolímeros apresentam uma grande diversidade de tipos, sendo também muito

abundantes. Pesquisas têm revelado muitos conhecimentos sobre os biopolímeros e as suas

aplicações em diferentes áreas como: a química, Biotecnologia, médica e farmacêutica

(Kennedy & Panesar, 2006; Czaja et al., 2006).

2.2.1-Polissacarídeos

Polissacarídeos incluem uma classe de biopolímeros, produzida universalmente

entre organismos vivos. Eles exibem uma inigualável variedade e em sua maioria

estruturas químicas complexas e diferentes funções fisiológicas (Haag et al., 2004;

Kennedy & Bandaiphet, 2004; Kennedy & Kosseva, 2005), podendo agir como moléculas

farmacologicamente ativas, principalmente com atividade anti-coagulante, anti-viral e

anti-tumoral (Xua et al., 2004).

Denominam-se homopolissacarídeos, quando são formados por um único tipo de

monossacarídeo, que são as unidades que o compõem, e heteropolissacarídeos, quando

apresentam dois ou mais tipos de monossacarídeos (Lloyd et al., 1998).

A sua estrutura pode ser linear, como a celulose, ou ramificada como o

glicogênio. Em relação à massa molecular, os polissacarídeos não apresentam um valor

molecular preciso, pois consistem de uma mistura de moléculas de alto peso molecular

que desempenham duas principais funções: a) É uma forma de estocar combustível


21

celular; b) São elementos estruturais das paredes celulares e constituintes da matriz

extracelular (Lloyd et al., 1998; Lehninger et al., 2000).

2.2.2-Atividade Biológica

As atividades biológicas de muitos polissacarídeos chamaram a atenção mais

recentemente nos campos bioquímicos e médicos por causa de sua imunomodulação e

efeito anti-tumoral (Moucheng et al., 2005). Alguns polissacarídeos são capazes de

estimular o sistema imune criando respostas celulares onde os macrófagos são

considerados elementos importantes, por estarem diretamente relacionados à captação dos

polissacarídeos administrados por via sistêmica e também na produção de citocinas, as

quais ampliam a resposta imune estimulando linfócitos T citotóxicos e células Natural

Killer (Abbas et al., 2000).

2.2.3-Aplicações Médicas

Algumas das características de polímeros contendo carboidratos são a sua potencial

biocompatibilidade, o que viabiliza a sua aplicação farmacológica e biomédica. Algumas destas

aplicações podem ser encontradas no campo médico e podem ser divididos aparentemente em

três categorias: sistemas de liberação de drogas, produtos curativos para ferimentos e

dispositivos de implantes cirúrgicos (Carneiro et al., 2001; Van De Velde & Kiekens, 2002;

Varma et al., 2004; Czaja et al., 2006).

Os polissacarídeos são usados na fabricação de cápsulas biodegradáveis, hidrogéis

biocompatíveis, bioimplantes que atuam controlando a entrega de droga dentro do corpo

humano, em material para sutura, além de malhas que estão disponíveis para a substituição de

tecidos, devendo estes serem biocompatíveis não provocando nenhuma reação alérgica pelo

contato prolongado com o tecido (Lloyd, 1998; Carneiro, et al., 2001; Van De Velde &

Kiekens, 2002; Varma et al., 2004).


22

2.3-Biopolímeros Microbianos

Muitos microorganismos têm a habilidade de sintetizar polissacarídeos extracelulares

(EPS) que podem ser excretados como polímeros solúveis ou insolúveis em água. Estes

microorganismos formam um consórcio funcional para a biossíntese de substâncias poliméricas

extracelulares condicionadas com nutrientes que ajudam as colônias durante o período de

crescimento (Paterson-Beedle et al., 2000; Moucheng et al., 2005; Madla et al., 2005).

Imagina-se que os EPS em seu ambiente natural exercem um papel na proteção da célula

microbiana contra fagocitoses e ataque de antibióticos ou combinações tóxicas, pressão

osmótica, como também no reconhecimento celular (Kumar et al, 2004; Madla et al., 2005).

No decorrer dos últimos 30 anos o interesse na procura de novos polímeros produzidos

por microorganismos aumentou significativamente e muitos polissacarídeos foram isolados de

cogumelos, fungos, algas, líquens, e plantas (Madla et al., 2005).

Segundo Padilha et al., (1998) os biopolímeros de maior interesse são os

extracelulares, devido a sua maior facilidade de extração e purificação. Em geral, os EPS não

contêm combinações orgânicas voláteis ou substâncias químicas tóxicas, e podem ser

sintetizados por fermentação de recursos renováveis que incluem produtos de desperdícios

orgânicos, como subprodutos derivados da cana-de-açúcar, existindo atualmente a tecnologia

eficiente para ampla produção destes EPS (Padilha et al., 1998; Haag et al.,2004).

Muitos polissacarídeos derivados de bactérias e microorganismo, como glicogênio,

celulose, alginatos, xantana, dextrana, levana, etc., são descritos com respeito às propriedades

biológicas, químicas e físicas, produção, processo de recuperação, síntese, produtos novos e

aplicações. Contribuições são providas por autores de várias universidades e institutos ao

longo do mundo (Kennedy & Bandaiphet, 2004; Czaja et al., 2006).

O EPS é o material de construção da matriz de biofilmes tendo um papel

multifuncional para formação de gel, floculação, emulsificação, absorção, formação de filme,

e proteção (Moreira et al., 1998; Pinto et al., 2002; Kumar et al, 2004).

Os polissacarídeos de origem microbiana, devido as suas características físico-

químicas, por exemplo a capacidade de atuar em baixas concentrações, em amplas faixas de

pH e temperatura, estão sendo muito utilizados em diversos segmentos industriais sendo as


23

propriedades funcionais dos biopolímeros consideradas uma ferramenta poderosa para se criar

novos materiais (Padilha et al., 1998).

Muitos polissacarídeos microbianos são polímeros solúveis em água e podem possuir

natureza iônica ou não-iônica. As repetições das unidades deste exopolissacarideos são muito

regulares, dando-se as ramificações e interconexões através de ligações glicosídicas (Kumar et

al, 2004).

Nos últimos anos uma grande ênfase está sendo posta na identificação de novos

polissacarídeos microbianos e suas aplicações assim como o isolamento de uma larga

variedade de linhagens microbianas estão sendo estudados para produzir polissacarídeos com

composições variadas, como por exemplo: a celulose bacteriana usada em paises asiáticos

também na alimentação (Okiyama et al., 1992; Kumar et al, 2004).

A celulose microbiana (MC) é um polímero sintetizado em abundância através de

Acetobacter xylinium, pertencente à classe mais promissora de biopolímeros. As propriedades

físicas e mecânicas únicas da MC como também sua pureza e uniformidade determinam

aplicações que variam de membranas auditivas com alta qualidade a materiais de uso médico

(Czaja et al., 2006).

Diferentes biopolímeros estão sendo objeto de extensos estudos e sendo

comercializados atualmente como produtos comerciais incluindo a xantana derivada da

Xanthomonas campestris, gelana da Sphingomonas paucimobilis, alginatos bacterianos

secretados da Pseudomonas species e Azotobacter chrococcum, celulose bacteriana da

Acetobacter xylinium, acido hialurônico da Streptococcus equii. Ainda assim a maioria dos

polímeros são de ambientes marinhos e derivado de algas (agar, alginatos, e carrageninas),

enquanto que polímeros derivados de origem microbiana representam só uma pequena fração

do mercado atual de polímeros (Kumar et al., 2004).

2.3.1-Método de Obtenção por Fermentação

A produção de biopolímeros para uso comercial por fermentação, comparada com a

extração de gomas de plantas superiores e algas, bem como a síntese química, oferece várias

vantagens potenciais que incluem: a ampla diversidade de polímeros produzidos pelos

microrganismos; a produção em quantidade e com alta qualidade, relativamente independente


24

das condições climáticas, conduzidas por fermentações bem controladas e utilizando matéria-

prima de qualidade constante; a manipulação da composição do produto e suas propriedades

através de alterações nas condições de fermentações (Pinto et al., 2002; Kong et al., 2002).

Os açúcares são um recurso importante para desenvolvimento de novos polímeros.

Devido ao baixo preço, açúcares como sacarose e D-galactose desempenham um papel

importante para este propósito, além disso, eles têm a vantagem de ser potencialmente

biodegradáveis (Carneiro et al., 2001).

2.4 - Zoogloea sp.

A Zoogloea ramigera 115, uma bactéria Gram-negativa, foi primeiramente isolada por

Friedman e Dugan em 1968, produziu um exopolissacarídeo denominado de “zooglan”

demonstrando uma forte afinidade por íons metálicos e aminoácidos, apresentando um

comportamento reológico peculiar. Investigações estruturais deste biopolímero estabeleceu

que o zooglan é um exopolissacarídeo altamente ramificado composto de D-glicose, D-

galactose e ácido pirúvico (Troyano et al., 1996; Paterson-Beedle et al., 2000; Cavalcante et

al., 2006).

Kong, et al. (2002) descreve que em estudos prévios, uma linhagem bacteriana,

identificada como Zoogloea sp. (KCCM10036), isolado do ambiente marinho, produziu dois

polissacarídeos extracelulares distintos: um polissacarídeo solúvel em água e um

polissacarídeo fixo à superfície da célula. Ambos os polissacarídeos continham os açúcares

glicose, galactose e manose como componentes, mas com as relações molares diferentes.

Ambos os polissacarídeos apresentaram um comportamento fluido não-Newtoniano,

pseudoplastico sendo avaliado o comportamento reológico das soluções destes polissacarídeos

frente a uma gama extensiva de pH (2-12) e temperatura (20-80ºC), como a compatibilidade

com Cloreto de sódio (NaCl).


25

2.4.1-Biopolímero Produzido pela Zoogloea Sp.

Após definição para testes do microorganismo inoculado em diversos meios um EPS

foi produzido por via microbiológica, através da bactéria Zoogloea sp. isolada na Estação

Experimental de Cana-de-Açúcar de Carpina/UFRPE, e identificada no Instituto de

Antibióticos da Universidade Federal Pernambuco-PE, obtendo-se uma excelente conversão

dos açúcares em biopolímeros (Melo et al., 1999; Paterson-Beedle et al., 2000; Cavalcante et

al., 2006).

Como matéria prima foi utilizada o melaço de cana-de-açúcar padronizado em Brix

15%, pH-5,0 esterilizado em autoclave. As culturas foram incubadas à 30ºC por um período

máximo de 7 dias resultando, na interface líquido-ar, em membranas geleificadas que foram

lavadas em água deionizada, e tratadas com solução de hipoclorito a 3% (figura 1 e 2) (Melo

et al., 1999; Paterson-Beedle et al., 2000).

Figura 1- Aspecto morfológico da membrana de biopolímero produzido por via microbiológica, através da bactéria Zoogloea sp. em mosto de melaço de cana-de-açúcar com diferentes dimensões.


26

Figura 2 - Micrografia eletrônica do exopolissacarídeo produzido pela Zoogloea sp. mostrando uma visão lateral com magnitude de1400× (A) e detalhes de sua superfície a 300× (B) e a 1500× (C) de ampliação (Cavalcante et al., 2006). 2.4.2-Composição Química

As membranas polissacarídicas sintetizadas pela bactéria Zoogloea sp. em mosto de

melaço de cana-de-açúcar, apresentaram aproximadamente 88% de solubilidade em ácido

trifluoracético sendo os principais monossacarídeos presentes na fração solúvel à glicose

(87,6%), xilose (8,6%), manose (0,8%), ribose (1,7%), galactose (0,1%), arabinose (0,4%), e

ácido glucurônico (0,8%) (Tabela.2) (Melo et al., 1999; Paterson-Beedle et al., 2000; Castro et

al., 2004; Cavalcante et al., 2006).

Tabela 2-Composição de monossacarídeos das frações solúveis produzidas por hidrólise ácida com trifluoracético sob condições moderadas e fortes, determinadas através de CLAE (Paterson-Beedle et al., 2000).

MONOSSACARÍDEOS TOTAL (%, p/p) Fucose 0,01

Arabinose 0,37

Galactose 0,13

Glicose 87,57

Xilose 8,58

Manose 0,82

Ribose 1,68

Ácido glucurônico 0,83


27

2.4.3-Propriedades Físicas

O referido polímero apresentou elasticidade, resistência á tração, flexibilidade podendo

ser modelado em diferentes formas. Através de método de calorimetria diferencial exploratória

(DSC), a biomembrana apresentou uma temperatura de fusão cristalina bem definida (118ºC),

propriedade que indica a relativa pureza do material (Argôlo, 2002).

2.4.4-Citotoxidade e Resposta Inflamatória

Foi avaliado por Castro et al. (2004) à citotoxidade in vitro da biomembrana produzida

por via microbiológica, através da bactéria Zoogloea sp. em mosto de melaço de cana-de-

açúcar, por meio do índice de adesividade de macrófagos, de morte celular e produção de

oxido nítrico, onde o biopolímero de cana-de-açúcar apresentou uma alta biocompatibilidade

frente aos três ensaios, confirmando assim a baixa citotoxidade a um nível que permite a sua

aplicação experimental com segurança.

A resposta inflamatória à membrana de biopolímero e telas de Polipropileno®, um

polímero sintético, implantadas no peritôneo de ratos foi avaliado por Lima, et al. (2005). No

estudo foi observado que em todos os ratos houve incorporação das próteses implantadas ao

peritônio não sendo encontradas coleções, exudato livre e fístulas, mostrando-se comparável

ao polipropileno para a confecção de telas para próteses cirúrgicas.

2.4.5-Aplicações Terapêuticas

Durante os últimos anos o Grupo de Pesquisa Biopolímero da cana de açúcar tem

trabalhado com a apresentação do biopolímero em forma de membrana, que vem sendo

utilizada em diferentes projetos de pesquisa e em curativos cirúrgicos para o tratamento da

incontinência urinária. Pesquisas básicas provaram que o material pode ser satisfatório para

muitos usos em áreas diferentes de cirurgia (Castro et al., 2004; Lima et al., 2006).

Melo, et al. (1999) realizaram uns dos primeiros estudos com o biopolímero da cana-

de-açúcar in natura em investigações no tratamento de ferimentos cutâneos em animais

domésticos, com a finalidade de avaliar a reepitelização. Foi observado nesses estudos que


28

houve um aumento no tecido de granulação, controle da infecção, reduzindo a contaminação

bacteriana, e redução do tempo de cicatrização.

O biopolímero da cana-de-açúcar, comparado com mucosa bucal, também foi utilizado

na comprovação experimental em uretroplastia em cães. Os resultados deste estudo

demonstraram que o enxerto autólogo de mucosa bucal apresentou menor grau de reação

inflamatória e nenhuma reação do tipo corpo estranho, mesmo assim a uretroplastia realizada

com o biopolímero mostrou-se bastante satisfatória no que diz respeito à compatibilidade

tecidual e incorporação como enxerto heterólogo (Chagas et al., 2006).

Em um outro estudo Vilar et al. (2006) testaram experimentalmente a membrana de

biopolímero para a reconstrução da túnica albugínea após cirurgia peniana utilizando o cão

como modelo animal. Eles observaram que a membrana demonstrou ser um material estável,

de fácil manipulação, com reação tissular mínima e incorporação à túnica albugínea do cão

não apresentando reação inflamatória nos estudos histológicos.

Em um estudo recente Cavalcante et al. (2006) propôs a utilização do polissacarídeo

extracelular produzido por via microbiológica, através da bactéria Zoogloea sp. em mosto de

melaço de cana-de-açúcar como uma matriz para imobilização de tripsina. Os resultados

mostraram uma aplicação adicional para esta biomembrana, agindo como uma matriz

reutilizável para imobilização de tripsina na presença de BSA melhorando o seu desempenho.

2.5-Gel Biopolímero

Carvalho (2000) cita em seus trabalhos que um gel consiste de dois ou mais

componentes, um dos quais é um solvente líquido, presente em quantidade substancial

formando uma rede polimérica intumescida unida por ligações covalentes, sendo o gel neste

caso irreversível ou as junções podem ser de natureza física e o sistema é em geral reversível,

não apresentando fluxo quando no estado estacionário.

Embora os géis sejam materiais muito conhecidos e façam parte do nosso cotidiano, só

mais recentemente têm recebido maior atenção do ponto de vista acadêmico e industrial como

uma nova classe de materiais com características bastante distintas dos materiais

convencionais, que na sua maioria são sólidos (Carvalho, 2000).


29

Os hidrogéis estão se tornando populares para aplicações na liberação de drogas

devido a sua biocompatibilidade e semelhança para tecidos biológicos. De um ponto de vista

estrutural, hidrogéis são redes de polímeros hidrófilas tridimensionais que incham em água ou

fluidos biológicos sem dissolver por razão da substância química ou ligações físicas (Serra et

al., 2006).

Algumas bactérias são capazes de produzir polissacarídeo extracelular de elevado peso

molecular que, por suas propriedades físico-químicas, são capazes de formar soluções viscosas

e géis em meio aquoso mesmo em baixas concentrações (Pinto et al., 2002).

A partir do polissacarídeo extracelular produzido por via microbiológica, através da

bactéria Zoogloea sp. em mosto de melaço de cana-de-açúcar estão sendo produzidos um gel

para múltipla aplicações na área médica (figura3) (Aguiar et al.,2004).

2.5.1-Estudos Experimentais

Uma dessas aplicações foi testada em um estudo experimental por Rangel, et al.(2006),

utilizando-se ratos wistar e um cão, onde o gel injetado se apresentou biocompatível, de fácil

injeção, com reação inflamatória mínima e sem reações do tipo corpo estranho. Os animais

sofreram implantação de gel de biopolímero em espaço subcutâneo, sacrificados e analisados

em tempos determinados (figura 4).

Figura 3 - Gel de biopolímero para múltiplas aplicações na área médica produzido a partir do polissacarídeo extracelular, da bactéria Zoogloea sp. em melaço de cana-de-açúcar.


30

A

D

CB

E

Figura 4 - A Forma do gel em implantes subcutâneos: (A) aspecto do biopolímero em tecido vivo decorrido 15 dias de implantação, (B) 30 dias de implantação, (C) decorridos mais de 30 dias de implantação, (D) Aspecto de abdome de camundongo após implante de gel subcutâneo, demonstrando ausência de sinais flogísticos, (E) Aspecto de tecido subcutâneo de cão 1 ano após o implante do gel. Notar a neovascularização e ausência de sinais flogísticos (Rangel et al., 2006).

O material implantado demonstrou parecer estar intacto quando observados

macroscopicamente na hora de sacrifício, não sendo achado nenhum sinal de migração do

material nos órgãos estudados (Rangel et al, 2006).

2.6.-Ácido Úsnico 2.6.1-Características Físico-Químicas

O ácido úsnico, [2,6-diacetil-7,9-dihidroxi-8,9b-dimetil-1,3(2h,9bH)- dibenzofurano;

C18H16O7], é um produto do metabolismo secundário de amplo aspecto de diversas espécies de

líquens (Marcano et al., 1999). Na natureza o ácido úsnico apresenta-se através de duas


31

formas enantioméricas (+) e (-) ácido úsnico, as quais diferem na orientação do grupo metila

localizado na posição 9b (figura.5) (Ingolfsdottir, 2002, COCCHIETTO et al., 2002).

O ácido úsnico apresenta-se como cristais na forma de pó amarelo insolúveis em água,

menos de 10 mg / 100 mL a 25ºC, solúvel em acetona, clorofórmio, metanol, acetato de etila e

diclorometano. O seu ponto de fusão é em torno de 204ºC (Index Merck, 1995;

Kristmundsdóttir et al., 2002).

Figura 5 - Estrutura dos enantiômeros (-)-ácido úsnico e (+)-ácido úsnico com centro quiral no carbono 9b. (Cocchietto et al., 2002).

2.6.2-Propriedades Biológicas

O ácido úsnico dentre as classes de compostos de baixo peso molecular, derivados de

líquens, tem sido o mais extensivamente estudado apresentando diferentes propriedades

biológicas com potencial terapêutico tais como: antimicrobiana, antiviral, antiproliferativa,

antitumoral, antiinflamatória, analgésica, antipirética, antileshimanicida e antiprotozoária

(Vijayakumar et al., 2000; Muller, 2001; Cochieto et al., 2002; Ingólfsdóttir, 2002; De

Carvalho et al., 2005, Santos, et al., 2005, Santos et al., 2006).

2.6.2.1-Atividade Antibiótica

A literatura relata que na natureza o principal papel biológico do ácido úsnico é o de

antibiótico demonstrando ser um potente inibidor de bactérias gram-positivas, de

microrganismos aeróbiocos e anaeróbicos sendo considerado um agente seletivo contra

Streptococcus mutans, devido à sua capacidade de modificar a permeabilidade da membrana,


32

pela alteração na produção de ATP, e a atividade enzimática da bactéria ( Marcano et al., 1999

Cocchietto et al., 2002).

Lauterwein et al. (1995) avaliaram a atividade in vitro do (+) e (-)-ácido úsnico contra

cepas de microorganismos patogênicos aeróbios e anaeróbios. A efetividade foi confirmada

para cepas bacterianas padrões (ATCC) e isolados clínicos independente de seu fenótipo de

resistência. Os dois isômeros exibiram excelente atividade antibacteriana contra Enterococcus

faecalis, Enterococcus faecium e Staphylococcus aureus, incluindo cepas resistentes a

meticilina e mupirocin. A avaliação realizada por Ingólfsdóttir (1998) da atividade

antimicobacteriana utilizando cinco compostos liquênicos revelou que a melhor ação foi

exibida pelo ácido úsnico extraído da Cladonia arbuscula, a CIM de 32 µg/mL frente ao

Mycobacterium aurum (Lauterwein et al.,1995; Ingólfsdóttir, 1998).

2.6.2.2-Atividade Antitumoral, Citotóxica e Antiproliferativa

A atividade anti-tumoral do ácido úsnico foi revelada há mais de duas décadas. Em

1975, Kupchan e Kopperman publicaram o primeiro estudo da atividade antitumoral do ácido

úsnico contra carcinoma pulmonar de Lewis (Muller, 2001).

Recente pesquisa desenvolvida por Ribeiro-Costa et al. (2004) avaliou o efeito

citotóxico do ácido úsnico livre e encapsulado em microesferas de PLGA contra carcinoma

epidermóide de laringe (HEp-2) demonstrando que a concentração requerida para inibir 50%

da proliferação celular (IC50) foi de 12,6 e 14,4 µg/mL, respectivamente. A atividade

antitumoral in vivo após administração intraperitonial em camundongos Swiss de ácido úsnico

livre e em microesferas foi avaliada contra Sarcoma-180 revelando uma importante inibição

do tumor de 63% para o ácido úsnico encapsulado e de 42% para o composto livre (Ribeiro-

Costa et al., 2004).

Células de carcinoma de pulmão humano (NCI-H 292) foram utilizadas na

investigação da ação antiproliferativa do ácido úsnico livre e em nanocápsulas, os resultados

desse trabalho exibiram uma atividade citotóxica considerável com IC50 de 10 e 13,8 µg/mL

para o ácido úsnico livre e encapsulado, respectivamente (Santos et al., 2005).


33

2.6.3-Perspectivas Futuras

Apesar do seu mecanismo de ação não ser tão esclarecido, existem sugestões que o

ácido úsnico age interferindo a síntese de RNA, na inibição da respiração na mitocôndria e

pelo ocasionamento do estresse oxidativo (Francolini et al., 2004). A aplicação do ácido

úsnico, na terapia do câncer ainda é limitada, devido à sua insolubilidade em água e da elevada

toxicidade em células normais (Han et al., 2004).

Na atualidade o objeto principal de investigação da farmácia galênica baseia-se no

desenvolvimento de novas formas de administração de medicamentos que possam melhorar a

biodisponibilidade e, conseqüentemente, diminuir a toxicidade de fármacos (Couvreur et al.,

1995).

Grasso et al., (1989) descrevem a utilização do ácido úsnico na prevenção e tratamento

de placas e cárie dentária, uma vez que o ácido é um agente antimicrobiano seletivo contra

Streptococcus mutants, principal causa da placa dentária e principal agente etiológico das

cáries e doenças periodontal. Contudo, essas atividades terapêuticas tornam-se limitadas, pois

o ácido úsnico possui propriedades físico-químicas desfavoráveis como baixa hidrofilicidade

(0,01g/100ml a 25oC), fotosensibilidade com provável degradação da molécula e possível

perda da atividade farmacológica, hepatotoxicidade (Han et al, 2004). Deste modo, a

utilização do ácido úsnico na sua forma livre torna-se bastante restrito.

Portanto, torna-se imprescindível o desenvolvimento um sistema de liberação de

medicamentos capaz de viabilizar a administração do ácido úsnico em uma formulação que

melhore sua solubilidade, bem como, otimize a dose terapêutica diminuindo os efeitos tóxicos

do mesmo pela diminuição da sua presença nos hepatócitos.

2.7-Validação da Metodologia Analítica de Dosagem

O FDA, a USP e a ICH fornecem as diretrizes para a validação de metodologias

analíticas com a finalidade de estabelecer as características e as especificações de qualidade

que um método deve satisfazer. A validação da metodologia analítica é uma forma de

estabelecer evidência documental da segurança de que o método validado produz resultados

confiáveis (Campos, 2003).


34

Os parâmetros analíticos típicos considerados em um processo de validação são:

exatidão, precisão (repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade), especificidade,

linearidade e faixa de trabalho (ICH Q2B, 1999).

2.7.1-Especificidade

A especificidade ou seletividade é definida como a habilidade da metodologia analítica

em identificar o fármaco de interesse face à presença de outras substâncias comuns, tais como

os subprodutos da síntese, componentes da formulação e produtos da degradação (ICH Q2B,

1999).

Segundo Leite (2002), a espécie de interesse deve ter o sinal analítico isento de

interferências que possam levar a dúvidas na identificação ou dar margem de não

confiabilidade ao resultado quantitativo. A seletividade depende de quanto o método é

indiferente à presença na amostra de espécies que poderiam interferir na determinação do

analito. Um teste específico é aquele que não permite duplicidades, onde um sinal medido

corresponde apenas à substância a ser analisada. A especificidade é determinada analisando-se

diversas amostras da matriz (n ≥ 6), para que se investigue a possível presença de compostos

que interfiram ou se sobreponham ao sinal do composto de interesse (Cass e Degani, 2001).

2.7.2-Exatidão

O parâmetro exatidão foi definido pela USP (2003) como o grau de concordância entre

os resultados encontrados e o valor verdadeiro. A exatidão de um método deve ser calculada

dentro de sua faixa de trabalho, sendo calculada como porcentagem de recuperação da

quantidade incorporada de um analito ou pela diferença entre o valor médio dos ensaios e o

valor verdadeiro sendo levado em consideração os intervalos de confiança.

Leite (2002) comenta que a exatidão traduz a concordância dos valores experimentais

com o valor verdadeiro.

Segundo Cass e Degani (2001), a exatidão pode ser determinada de várias formas:

• Análise de uma amostra certificada e sua comparação com o valor medido.


35

• Comparação com resultados obtidos por intermédio da utilização de um método

já existente e de exatidão conhecida.

• Baseando-se na preparação de uma solução de concentração conhecida, por

intermédio da adição de uma determinada quantidade da amostra à matriz.

A ICH Q2B (1999) recomenda a realização de no mínimo nove determinações

analíticas dentro de no mínimo três níveis de concentrações que cubram a faixa de trabalho

especificada, ou seja, para três níveis de concentração devem ser realizadas três réplicas de

análises.

2.7.3-Precisão

A USP (2003) descreve esse parâmetro de validação como sendo o grau de

concordância entre os resultados de análises individuais quando o procedimento é aplicado

repetidamente para múltiplas análises de uma mesma amostra homogênea.

Leite (2002) define precisão como sendo a concordância entre os vários valores

experimentais obtidos, quanto mais próximos entre si estiverem, ou seja, maior será a precisão

quanto menor for a amplitude das medidas.

Segundo Cass e Degani (2001), a avaliação da precisão é subdividida em três etapas,

que são diferenciadas pelo intervalo de tempo em que são feitas as análises e pelas condições

de realização destas, embora esta classificação não seja universal.

a) Repetibilidade: mede o grau de variação de uma série de replicatas de injeção em

um curto intervalo de tempo, ou seja, em uma mesma seqüência, nas condições originais do

método. É a máxima diferença aceitável entre duas repetições, vale dizer dois resultados

independentes, do mesmo ensaio e no mesmo laboratório, sob as mesmas condições. Ex.:

múltiplas medidas de uma mesma amostra por um mesmo analista (Leite, 2002).

b) Precisão intermediária: expressa o efeito das variações dentro de um mesmo

laboratório devido a análises em diferentes dias não consecutivos e por diferentes analistas

(Cass e Degani,2001).

c) Reprodutibilidade: mede a precisão do método quando executado em diferentes

laboratórios. É a máxima diferença aceitável entre dois resultados individuais, um em cada um


36

dos dois laboratórios, para um mesmo processo e com demais condições como especificado

(ligado a ensaios interlaboratoriais) (Leite, 2002).

A precisão de um método analítico é usualmente expressa por intermédio do desvio

padrão, variância ou coeficiente de variação das medidas obtidas.

2.7.4-Linearidade e Faixa de Trabalho

Segundo Leite (2002) a busca da linearidade está em obter os resultados em proporção

direta às concentrações das substâncias em estudo. Para o estudo da linearidade, faz-se

necessária a confecção de uma curva de resposta, sendo representadas nos eixos das ordenadas

e abscissas, respectivamente. Segundo a USP (2003) um método é linear quando os seus

resultados são diretamente proporcionais ou, através de uma transformação matemática,

tornam-se proporcionais à concentração do analito dada uma faixa de trabalho.

Para a ICH Q2B (1999), uma relação linear dos resultados pode ser obtida diretamente

a partir da substância ativa (através da diluição de uma solução estoque) e/ou através de

diferentes avaliações e concentrações de misturas dos componentes da formulação.

Segundo Cass e Degani (2001), a linearidade é avaliada por intermédio de medidas da

amostra em diversas concentrações, ou seja, da construção de curvas de calibração. Sua

determinação é normalmente realizada por intermédio da análise de amostras extraídas da

matriz apropriada em, no mínimo, cinco concentrações diferentes. Recomenda-se a análise das

amostras em replicata (n ≥ 2). Inicialmente, pode-se determinar a linearidade através de uma

análise visual do gráfico das respostas obtidas como função da concentração do analito.

Quando os resultados podem ser descritos através de uma equação do primeiro grau, diz-se

que o método é adequado, sendo então obtidos os coeficientes linear, angular e de correlação

que referem respectivamente a mínima concentração detectada, inclinação da reta e ao grau de

ajuste dos dados experimentais ao modelo proposto. Consideram-se aceitáveis valores de

coeficiente de correlação superiores a 0,998 para análises do parâmetro linearidade (Campos,

2003).

A faixa de trabalho é o intervalo entre a maior e a menor concentração do analito que

demonstram ser determinados com adequados níveis de precisão, exatidão e linearidade. Esse


37

parâmetro pode ser determinado verificando se o método origina precisão, exatidão e

linearidade quando aplicado a amostras do analito nos extremos e dentro da faixa (USP, 2003).

2.8-Análises Térmicas

2.8.1-Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC)

A análise térmica de polímeros tem sido cada vez mais utilizada como instrumento

para caracterização destes materiais. Pode ser definida como um conjunto de técnicas que

permitem medir mudanças de uma propriedade física ou química de uma substância ou

material, em função da temperatura (Argôlo, 2002).

A caracterização térmica por Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC) tem como

principal vantagem a utilização de um equipamento de fácil manuseio e que necessita de

pouca quantidade de material para efetuar a análise (4mg- 20mg).O resultado da análise de

DSC fornece informações a respeito de mudanças morfológicas, cisões moleculares ou

reticulações ocorridas no polímero durante a biodegradação, as quais terão um reflexo direto

sobre as propriedades térmicas do mesmo, sendo de fundamental importância o

monitoramento destas propriedades durante o período de biodegradação (Argôlo, 2002).

Canotilho et al. (1992), descreve que atualmente o recurso á análise térmica por DSC

no domínio farmacêutico é considerável pela sua versatilidade em muitas aplicações:

a) Estudo de compatibilidade fármaco-fármaco, fármaco-excipiente a nível de pré-

formulação;

b) Estudo de polimorfos, compostos de inclusão, e dispersões sólidas;

c) Determinação de pureza química;

d) Estudos de reações (estabilidade e térmica e parâmetros cinéticos)

e) Controle qualidade, entre outros.

2.8.2-Termogravimetria (TGA/TGD)

É um método analítico em que a variação de massa da amostra é avaliada em função da

temperatura ou do tempo do ciclo de aquecimento ou arrefecimento originando uma curva

termogravimétrica que expressa a dependência da variação de massa com a temperatura que


38

por aumento desta ou do tempo observa-se um decréscimo na massa da amostra. Uma curva

termogravimétrica derivada (TGD) permite, por exemplo, distinguir duas transformações que

ocorram em extensões diferentes.

Segundo Canotilho et al. (1992), dentro dos diversos domínios de sua aplicação a

termogravimetria é usada de um modo geral para:

a) Obter os parâmetros cinéticos das reações de decomposição;

b) Identificar uma oxidação ou uma redução;

c) Isolar fases intermediárias que possam surgir durante a história térmica de uma

amostra;

d) Determinar a estabilidade térmica de compostos orgânicos e minerais;

e) Controlar e conhecer o estado de hidratação dos sais.


39

3-OBJETIVOS

3.1-Geral

O presente trabalho teve como objetivos o desenvolvimento e caracterização de um

veículo farmacêutico para o ácido úsnico para diversas aplicações médicas utilizando o gel de

biopolímero produzido pela fermentação de melaço da cana-de-açúcar pelo microorganismo

Zooglea sp.

3.2-Específicos

1. Desenvolver uma formulação de gel de biopolímero contendo ácido

úsnico;

2. Realizar um estudo preliminar acelerado e a longo prazo de

estabilidade do gel desenvolvido;

3. Desenvolver e validar um método espectrofotométrico UV para

determinação de ácido úsnico no gel de bioplímero;

4. Analisar a morfologia do polímero através de microscopia de força

atômica.

5. Caracterizar o gel de biopolímero puro e incorporado com ácido

úsnico através de análises térmicas de calorimetria diferencial

exploratória (DSC) e de termogravimetria (TG/TGD);


40

4-MATERIAIS E MÉTODOS:

4.1-Materiais

As membranas de biopolímero foram sintetizadas na Estação Experimental de Cana-

de-Açúcar de Carpina, da Universidade Federal Rural de Pernambuco-UFRPE e purificadas

no Núcleo de Cirurgia Experimental da Universidade Federal de Pernambuco-UFPE.

Enquanto que a produção e a padronização física do gel foram realizadas no Laboratório de

Imunopatologia Keiso Asami - LIKA na Universidade Federal de Pernambuco. O ácido úsnico

(AU) com 98% de grau de pureza foi adquirido na Sigma-Aldrich (St. Louis, Estados Unidos).

Acetonitrila, clorofórmio e metanol foram adquiridos na Merck (Darmstadt, Alemanha), o

DMSO (dimetilsulfóxido) foi adquirido na Sigma-Aldrich (St. Louis, Estados Unidos) e

Merck (Darmstadt, Alemanha) todos com grau analítico. As membranas filtro hidrofílicas

Millipore® de 0,8 µm tipo AA foram adquiridos na Sigma-Aldrich (St. Louis, Estados

Unidos).O sonicador e a lavadora ultra-sônica USC 750 produzidos pelo fabricante UNIQUE

(Brasil).Todas as Leituras quantitativas foram realizadas em espectrofotômetro UV-Vis

Ultrospec 3000 Pro (Amersham Pharmacia Biotech) utilizando células de quartzo de 10 mm

de caminho óptico.

4.2-Métodos

4.2.1-Obtenção e Padronização de Gel a Partir da Membrana de Biopolímero

A membrana de biopolímero de escolha para processamento deve ser translúcida,

uniforme e apresentar homogeneidade em sua organização, devendo possuir também rigidez

relativa não sendo interessantes as muito hidratadas com aspecto “gelatinoso” que resultam em

um gel muito fluido, tão pouco as membranas muito densas e rígidas que dificultam o

processo de formação de gel além de apresentarem grumos na formulação.

A membrana foi repartida, com auxílio de tesoura, em tamanhos menores e em um

béquer imerso em banho de gelo submetido à sonicação (ultra-som) obedecendo aos seguintes

parâmetros: 2-3 ciclos pulsáteis de 100 segundos e potência de pulsação de 70% (25 Hz).


41

O gel resultante foi tamisado em peneira comum e submetido à centrifugação a 5000

r.p.m. por 10 minutos para a retirada do excesso de água. As preparações finais foram

acondicionadas em tubos de penicilina, rotuladas e armazenadas à temperatura ambiente a 25

ºC.

4.2.2-Obtenção de Gel Contendo Ácido Úsnico

Foram pesados 5 mg de ácido úsnico, e a este acrescentado 1 ml de DMSO sendo

homogenizado em vortex por ± 3 min e submetido a banho de ultra-som por 10 minutos. Esta

solução foi incorporada 5 g de gel de biopolímero e homogenizado em vortex por 5 minutos.

As preparações finais foram acondicionadas em tubos de penicilina, rotuladas e armazenadas à

temperatura ambiente a 25 ºC.

4.2.3-Preparo de Filme apartir de Gel de Biopolímero Contendo Ácido Úsnico

Pesaram-se quatro alíquotas de 0,25 g (1g) de gel de Biopolímero contendo ácido

úsnico e a cada alíquota foi acrescentado 2 ml de água destilada e homogenizado em vortex.

Em seguida uma solução de 0,25 g de gel em 2 ml de água destilada foi submetido a filtração à

vácuo em membranas hidrofílicas Millipore® de 0,8 µm por ± 5 minutos. Logo após repetiu-

se o mesmo procedimento com as outras 3 soluções restantes sobrepondo as camadas após

cada filtração. Terminadas as quatro filtrações o filme foi levado para secagem em estufa a

uma temperatura de 37 ºC por 12 horas. As preparações finais foram acondicionadas e

armazenadas à temperatura ambiente a 25 º C.

4.2.4-Avaliação da Estabilidade do Gel de Biopolímero

Foram realizados testes de estabilidade acelerada pelo método de centrifugação (2500-

3.000 r.p.m./1h), ciclos de congelamento e descongelamento (16 h à -4 °C e 8 h a 25 °C), e

estresse mecânico (120 movimentos horizontais por 48 h a 37 °C ± 1 °C), para avaliação da

estabilidade das formulações (Santos-Magalhães et al., 2000). Para estes testes foram

realizados utilizando-se três lotes de gel preparados da mesma maneira com três repetições


42

para cada lote em cada teste, contendo 1ml de gel cada, de formulações de gel placebo (n=27)

e gel contendo ácido úsnico (n=27).

A avaliação de estabilidade a longo prazo teve por objetivo testar a durabilidade das

formulações. Nesta etapa, características físico-químicas dos géis e a concentração de ácido

úsnico foram avaliadas, segundo metodologia descrita, nos dias 0, 90, 120 e 180 ao final do

processo de fabricação, armazenadas em prateleira a 25 ºC ± 1 ºC sem proteção contra luz.

Parâmetros como aspectos macroscópicos e a concentração de ácido úsnico foram analisados.

4.2.5-Validação do Método Extração e Dosagem de Ácido Úsnico em Gel de Biopolímero

O estudo de validação do método foi realizado segundo protocolo da ANVISA (RE nº 899

de 05/03) e pela Farmacopéia Americana (USP, 2003) determinando os seguintes parâmetros:

Linearidade, verificada através da média de três curvas de calibração ajustadas pelo método de

análise de regressão; precisão, avaliada pela concordância entre os resultados obtidos em dois dias

por analistas diferentes; exatidão, determinada pelo método de recuperação; seletividade,

analisada pela avaliação de possíveis interferências dos excipientes da formulação de gel e a

robustez, verificada variando a temperatura (4 e 25 ºC) e o fabricante de DMSO.

4.2.6-Preparo da Solução Estoque de Ácido Úsnico

Pesou-se o equivalente a 20 mg de ácido úsnico e solubilizou-se em uma mistura de

solventes (8 ml de acetonitrila e 20 ml de metanol), e então, sonicado por 5 minutos. Esta

solução foi aquecida em banho-maria a 37 ºC até total solubilização do ácido. Por fim, a

solução foi resfriada a temperatura ambiente e transferida para balão volumétrico de 50 ml

completando o volume com metanol. A concentração final de ácido úsnico é 0,4 mg/ml.

Alíquotas desta solução estoque foram tomadas e diluídas em metanol para obter

concentrações no intervalo de 1 a 15 μg/ml.


43

4.2.7-Preparo das Amostras para Dosagem de Ácido Úsnico em Gel de Biopolímero

Retirou-se um volume da formulação de gel (1 g) equivalente a 1 mg de ácido úsnico.

Em seguida, a essa alíquota foram adicionados 0,5 ml de DMSO e 5 ml de uma solução

extrativa composta de clorofórmio e metanol na proporção de 3:1, submetendo-se a agitação

em Vortex por 3 minutos e centrifugado por 5 minutos a uma rotação de 2000 r.p.m. para

quebrar a estrutura do gel e liberar o conteúdo de ácido incorporado. Esse material foi

transferido para um funil de separação e a solução extraída transferida para um balão

volumétrico de 10 ml. Lavou-se o material do funil com a mesma solução extrativa e após

completou-se o volume; a concentração final de ácido úsnico na amostra foi de 100 μg/ml.

Alíquotas desta solução de análise foram tomadas e diluídas em metanol para obter

concentrações no intervalo de 5 a 15 μg/ml.

4.2.8-Linearidade

Foi estabelecida pela média de três curvas padrão autênticas, as quais foram obtidas em

sete níveis de concentrações diferentes de ácido úsnico: 1; 3; 5; 8; 10; 12 e 15 μg/ml. A faixa

de variação da concentração corresponde de 10 a 150% da concentração teste. Cada

concentração foi determinada em triplicata para cada curva padrão (n = 63). A linearidade foi

avaliada através de análise de regressão linear utilizando o método de ajuste pelo método dos

mínimos quadrados. Para avaliar numericamente a qualidade do ajuste do modelo utilizou-se a

análise de variância (ANOVA) com teste unilateral, p < 0,05.

4.2.9-Precisão

Para o estudo de precisão foi utilizada a concentração de 10 μg/ml do ácido úsnico

extraídas das amostras de gel (concentração teste) determinada 6 vezes (sextuplicata). As

análises foram realizadas em dois dias diferentes por dois analistas diferentes. As médias dos

resultados obtidos foram avaliadas pelo teste t de Student (teste bilateral, p < 0,05).


44

4.2.10-Exatidão

A exatidão foi avaliada pelo método de recuperação do analito adicionado em

quantidades conhecidas à formulação placebo em três concentrações diferentes: 5,0; 10,0 e

15,0 μg/ml, correspondendo respectivamente a 50, 100 e 150% da concentração teste. Todas

as amostras foram preparadas em triplicata (n = 9). O coeficiente de variação e a porcentagem

de recuperação foram utilizados para avaliar a exatidão definida como:

Exatidão = (concentração experimental obtida / concentração teórica) x 100

4.2.11-Robustez

A robustez do método proposto foi verificada pela variação de temperatura de análise

(4 ºC e 25 ºC) e pela mudança de fabricante do DMSO (Merck e Sigma-Aldrich). A

concentração de 10 μg/ml de ácido úsnico foi determinada em triplicata. A avaliação da

robustez foi realizada pela análise dos coeficientes de variação entre as médias obtidas,

utilizando o teste t de Student (teste bilateral, p < 0,05).

4.2.12-Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ)

Os limites de detecção (a) e quantificação (b) foram determinados matematicamente a

partir da curva padrão resultante da média das três curvas de calibração autênticas. O cálculo

para determinar os valores correspondentes ao LD e LQ baseia-se no desvio padrão do

residual da linha de regressão e sua relação com a inclinação da reta (coeficiente angular) na

curva padrão.

LD = (D.P./I) x 3,3 (a)

LQ = (D.P./I) x 10,0 (b)

Onde,

D.P.: desvio padrão do intercepto com relação ao eixo dos Y;

I: valor da inclinação da curva de calibração.


45

4.2.13-Microscopia de Força Atômica

A morfologia de filme do gel de biopolímero puro e contendo ácido de úsnico foi

examinada por microscopia de força atômica (microscópio MFP-3D, Asylum Research,

USA.). Cantilevers AC240TS (Olympus, Tóquio, Japão) foi usada em modo de contato com

uma força de varredura de 2 N/m. As imagens foram adquiridas a uma taxa de varredura de

0,60 Hz, utilizando lâminas de mica como suporte.

4.2.14-Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC)

A varredura DSC foi mensurada usando um DSC Q-1000 (T.A Instruments, USA), na

faixa de temperatura compreendida entre 25 a 220 ºC numa razão de 10 ºC/min em panelas de

alumínio seladas.

4.2.15 – Análise Termogravimétrica (TGA/TGD)

A análise de TGA foi realizada usando um Q-500 (TA Instruments, E.U.A.) em qual a

mudança de peso era determinada como uma função da temperatura (25-700 ºC), em

atmosfera controlada de nitrogênio (50 mm3/min) e uma taxa de aquecimento de 10 ºC/min.

Esta análise foi levada a cabo com amostras de ácido úsnico livre, ácido úsnico incorporado

em gel de biopolímero, e gel de biopolímero placebo. Todas as amostras estavam em estado

sólido (AU polvilhado e gel de biopolímero em forma de filme). A termogravimetria derivada

(DTG) foi calculada pela primeira derivada de TGA de cada amostra.


46

5-RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1-Obtenção e Padronização do Gel a Partir da Membrana de Biopolímero

Um gel, de aspecto que variou desde translúcido até a opacidade, foi obtido pela

sonicação de membrana de biopolímero previamente selecionada de acordo com os critérios

estabelecidos de padronização.

O gel pode ser obtido a partir de diferentes tipos de membrana, e também sob diversas

condições de lise por ultra-som. Podemos afirmar que o principal fator que influencia na

qualidade do gel obtido no final do processo é o tipo de membrana que é submetida à lise. O

tipo de membrana pode variar de acordo com a cepa bacteriana utilizada no processo inicial de

obtenção do biopolímero, sendo também influenciado por outros fatores como o processo de

clarificação feito com solução de NaOH. Tais processos influenciam a capacidade de

hidratação da membrana parecendo ser essa característica preponderante na qualidade do gel.

Com relação às condições de lise pelo ultra-som foi observado que estas variavam de

acordo com a qualidade da membrana. Desta forma algumas membranas precisavam passar

cerca de 300 segundos ou mais na potência padrão para a formação de gel com rendimento

satisfatório. Estes fatores evidenciam a necessidade da implementação de práticas de controle

no processo de obtenção das membranas, permitindo assim a padronização necessária para o

desenvolvimento de preparações farmacêuticas.

A incorporação de ácido úsnico previamente solubilizado em DMSO ao gel de

biopolímero demonstrou ser de manipulação rápida e fácil, resultando em formulações com

coloração amarelo-opaca e com aspecto morfológico uniforme e homogêneo obesrvados por

microscopia óptica.

5.2-Avaliação da Estabilidade do Gel de Biopolímero

Os dados apresentados nas tabelas 3 e 4 demonstram que para todos os lotes, tanto das

formulações de gel branco quanto as que continham ácido úsnico permaneceram estáveis aos

testes estabilidade acelerada e estresse mecânico não apresentando nenhuma modificação

estrutural de suas características iniciais. O mesmo não foi verdadeiro para os testes de ciclos


47

congelamento e descongelamento para ambos os tipos de formulações, sendo que as

preparações de gel de biopolímero branco se desestruturaram mais precocemente em um

tempo médio de ± 14 ciclos. Inicialmente se apresentavam límpidas à observação

macroscópica sendo que após os testes passaram a apresentar separação da fase aquosa do

polímero com formação de duas fases e presença de sedimentados floculados de gel. Embora

os experimentos contendo ácido úsnico tenham apresentado desestruturação em um tempo

médio de ±44 ciclos, portanto significativamente maior que as preparações de gel branco, as

mesmas somente apresentaram uma ligeira separação da água do gel, sem a formação de

precipitados ou grumos.

As análises de estabilidade a longo prazo de gel de biopolímero contendo ácido úsnico

(figura 6) demonstraram uma diminuição da concentração de ácido úsnico no decorrer do

tempo. As amostras dosadas no dia 0 demonstraram uma concentração de 9,9 μg/ml (± 99%).

As amostras referentes aos dias 90, 120, 180 demostraram concentrações de 9,7 (± 97%) 8,7

μg/ml (± 87%), 7,4 μg/ml (± 74%).

As formulações de gel retiveram suas propriedades físico-químicos iniciais durante

aproximadamente 180 dias durante armazenamento a 25 ºC ± 1º C. Depois disso, formulações

exibiram mudanças morfológicas com a presença de um subrenadante aquoso que evidencia

uma separação de fase.

Tabela 3. Resultados do estudo de estabilidade em gel de biopolímero placebo. Gel Placebo

Agitação Mecânica (120 movimentos/

min / 48 h.)

Centrifugação (2500rpm/ 1 h)

Ciclo congelamento-descongelamento

(16 h à -4 ± 2o C/ 8 h à 25 ±2oC)

Média ciclos ±

Lote1 Estável Estável 18 Lote1 Estável Estável 13 Lote1 Estável Estável 15

15


12


14

Média 14


48

Tabela 4. Resultados do estudo estabilidade em gel de biopolímero contendo ácido úsnico.

Gel Contendo

Ácido Úsnico

Agitação Mecânica (120 movimentos/

min / 48 h.)

Centrifugação (2500rpm/ 1 h)

Ciclo congelamento-

descongelamento (16 h à -4 ± 2o C/ 8 h à

25 ±2oC)

Média ciclos ±


44


47


41

Média 44

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 20070

75

80

85

90

95

100

Con

cent

raçã

o de

AU

(%

)

Tem po (d ias)

Figura 6 – Curva de estabilidade da concentração de ácido úsnico a longo prazo de gel de

biopolímero contendo ácido úsnico.


49

5.3-Desenvolvimento do Método de Dosagem de AU por Espectrofotometria UV

Entre os solventes utilizados o metanol foi escolhido pela excelente capacidade de

solubilizar o ácido úsnico simplificando o preparo tanto da solução padrão quanto das

amostras. A combinação dos solventes, clorofórmio-metanol-DMSO, mostrou-se a mais eficaz

para a extração do ácido úsnico contido no gel. O espectro da varredura da solução metanólica

de ácido úsnico revelou absorbância máxima no comprimento de onda de 280 nm (Figura 7),

resultado este de acordo com relatos prévios (Takani et al., 2002, Siqueira-Moura et al., 2007).

225 250 275 300 325 350 375 4000,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Abs

orbâ

ncia

Comprimento de onda (nm)

Figura 7 – Espectro de varredura na faixa do UV-Visível do ácido úsnico em solução

metanólica (λmáx 280 nm).

5.3.1-Linearidade

A curva de calibração resultante da média de três curvas padrão está representada na

Figura 8. A equação da regressão linear obtida foi Y = 0,01757 + 0,06932[X], n = 21, onde Y

é a absorbância em 280 nm e X a concentração de ácido úsnico em μg/ml. O coeficiente de

correlação foi de 0,9997, significando que 99,97% da variação total em torno da média é

explicada pela regressão linear, com os resíduos (erro) de apenas 0,03%.


50

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abs

orbâ

ncia

Concentração de ácido úsnico (mg.mL-1)

Figura 8 – Curva padrão de ácido úsnico e análise de regressão linear. Os resultados são representados pela média de três experimentos. As barras de erro correspondem ao desvio padrão da média de cada ponto.

O teste unilateral de análise de variância (ANOVA) avaliou a qualidade do ajuste do

modelo linear. A análise dos dados da linearidade demonstraram ser a regressão altamente

significativa, bem como, não haver evidência de falta de ajuste do modelo; uma vez que, os

valores de F calculados foram menores do que os valores de F críticos no nível de 95% de

confiança (Tabela 5). Portanto, o método analítico desenvolvido possui faixa de linearidade

entre as concentrações de ácido úsnico de 1 e 15 μg/ml.


51

Tabela 5 – Teste ANOVA (unilateral) para linearidade do método proposto.

Valores de F Fonte de

variação

Soma

Quadrática

Graus de

liberdade

Média

Quadrática Fcalculado Fcrítico

Regressão 2,182919942 1 2,182919942 4545,79 4,3807

Resíduos 0,009123933 19 0,000480207 Curva Linear

Falta de ajuste 0,001426216 5 0,000285243 0,51878 2,9582

Erro puro 0,007697717 14 0,000549837 Não há falta de ajuste

Total 2,192043875 20 0,109602194 - -

5.3.2-Precisão

A precisão foi avaliada pelos estudos de repetibilidade e precisão intermediária. A

repetibilidade revelou um coeficiente de variância de 0,48% portanto menor do que o valor

máximo exigido de 5% (Tabela 6). A concentração de ácido úsnico nas amostras de gel de

biopolímero foi de 10,07 ± 0,05 μg/ml depois da produção. (100,7 %, n=6) indicando uma boa

extração da droga. Já a precisão intermediária avalia a variação de ensaios realizados em dias e

com analistas diferentes. Neste estudo o maior valor do desvio padrão relativo foi de 0,80%.

Através do teste t de Student foi avaliada a possível existência de diferença estatisticamente

significativa entre as médias obtidas para os ensaios realizados em dias diferentes e com

analistas diferentes. Como pode ser observado na Tabela 7 em todos os casos o t calculado foi

sempre menor do que o t crítico demonstrando não existir diferença estatisticamente

significativa entre as médias, ou seja, os resultados obtidos expressam o mesmo valor (p <

0,05).


52

Tabela 6 – Resultados do estudo de reprodutibilidade do método de dosagem do ácido úsnico (10 μg/ml) em gel de biopolímero utilizando espectroscopia UV.

Dados Absorbâncias em 280nm

Concentração (µg.mL-1)

0,71 9,988 0,713 10,032 0,715 10,061 0,718 10,104 0,717 10,089 0,719 10,118

Média 0,715 10,07 D.P.* 0,004 0,05

C.V. *(%) 0,48 0,48 *D.P. = desvio padrão; C.V.= coeficiente de variação.

Tabela 7 – Precisão intermediária do método de dosagem do ácido úsnico em gel de biopolímero através de espectroscopia UV a 280 nm. A concentração teórica de ácido úsnico foi de 10 μg/ml.

Variação entre analistas Variação intra dias

Dia p tcalculatdo média Analista p tcalculado média

1 0,31288 1,06277 10,06 A 0,12351 1,68188 10,03

2 0,95355 1,05973 10,00 B 0,11415 1,73089 10,02

5.3.3-Exatidão

A exatidão foi verificada para três níveis de concentração: baixa, média e alta. Os

dados experimentais obtidos revelaram uma média de recuperação do analito de 99,47%

(99,18; 99,31; 99,93%) e que o maior coeficiente de variação foi de cerca de 1% (Tabela 8).

Os resultados do estudo de exatidão demonstram que pequenas variações da concentração de

ácido úsnico podem ser prontamente quantificadas pelo método, bem como, não haver

interferência dos excipientes da formulação no doseamento do produto final, portanto, o

método analítico desenvolvido é suficientemente exato.


53

Tabela 8 – Resultado da exatidão para concentrações baixa, média e alta

Concentração (µg/mL) Concentração teórica

(µg/mL)

1

2

3

Média

Desvio padrão

C.V. (%)

5,0 4,911 5,012 4,954 4,959 0,050 1,00

10,0 9,888 9,945 9,960 9,931 0,04 0,40

15,0 15,00 14,96 15,03 14,99 0,035 0,23

5.3.4-Robustez

A variação da temperatura de análise não afetou a absorbância do ácido úsnico. As

concentrações médias obtidas para análise nas temperaturas de 4 e 25 ºC foram de 10 (±0,052)

μg/ml e 10,11 (±0,042) μg/ml, respectivamente. A mudança de fabricante de DMSO resultou

em concentrações médias de 10,11 (±0,042) μg/ml para o tipo A (SIGMA) e 9,916 (±0,118)

para o tipo B (MERCK). Entre todos os resultados experimentais o valor máximo de

coeficiente de variação encontrado foi 1,18%. De acordo com o teste t de Student (Tabela 9)

não há diferença estatisticamente significativa entre os resultados obtidos quando da alteração

na temperatura de análise ou do fabricante do solvente durante as análises realizadas, ou seja,

no nível de 95% de confiança as variações dos parâmetros analisados não influenciam a

quantificação do ácido úsnico.

Tabela 9 – Teste t de Student aplicado aos parâmetros analisados para robustez do método de dosagem do ácido úsnico em espectrofotometria UV a 280 nm.

Valores de t e p

Pcalculado tcalculado tcrítico

Temperaturas 0,16025 2,18717

Fabricantes 0,09956 2,92757

4,30a

a=valor teórico (teste bilateral, p< 0,05).


54

5.3.5-Limites de Detecção (LD) e Quantificação (LQ)

O método demonstrou ser sensível a pequenas concentrações tendo como valor de LQ

0,3050 µg/mL, o qual corresponde a 3,05% da concentração teste. Já o LD encontrado foi de

0,2013 µg/mL, concentração esta equivalente a 2% da concentração teste. Em comparação

com publicações de métodos analíticos para determinação de ácido úsnico por CLAE, o

método espectrofotométrico proposto apresenta capacidade similar de determinar o analito em

questão, uma vez que, a faixa de linearidade do método desenvolvido pode ser considerada

equivalente aos métodos para microesferas (1-10 µg/mL) e nanocápsulas (2-20 µg/mL). O

método espectrofotométrico proposto também apresenta conformidade com recente publicação

para determinação de ácido úsnico por espectrofotometria UV em Lipossomas (3-15 µg/mL),

(Ribeiro-Costa et al., 2004, Siqueira-Moura et al., 2007).

5.3.6-Microscopia de Força Atômica

A figura 9 apresenta a imagem de AFM de filme de gel de biopolímero puro e

contendo ácido de úsnico. Os filmes exibiram uma morfologia lisa e homogênea muito

compacta com uma superfície enrugada, características da estrutura fibrosa do biopolímero. A

incorporação do ácido úsnico no gel de biopolímero foi confirmada pela ausência de cristais

de droga na superfície do filme. Além disso, a incorporação de ácido úsnico parece não causar

nenhuma mudança estrutural na matriz polimérica, comprovando a compatibilidade entre a

droga e o gel de biopolímero.

Estas imagens do biopolímero estão de acordo com um trabalho prévio obtido onde foi

utilizada a microscopia eletrônica de varredura (Cavalcante et al., 2006) quando uma estrutura

fibrosa foi observada. A microscopia eletrônica de varredura é uma técnica comumente usada

para caracterizar a topografia da superfície de muitos tipos de polímeros inclusive

polissacarídeos (Krishnamoorthi, et al, 2007). De fato, esta técnica pode verificar a diferença

entre uma estrutura lamelar de uma mucilagem pura e uma estrutura organizada de enxerto-

mucilagem como comprovado em um recente estudo administrado por Mishra, et al., 2007.


55

A B

Figura 9 – Imagens de microscopia de força atômica de filmes de gel de biopolímero: puro (A) e contendo ácido úsnico (B). As barras de escala representam à diferença de altura.

5.3.7-Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC)

Foi investigada a influência da incorporação de ácido úsnico na estabilidade térmica de

filme seco de gel de biopolímero usando DSC (Figura 10). O termograma do ácido úsnico

apresentou um único pico endotérmico a 201,6 ºC com uma mudança de entalpia de 85,2 J.g-1

que são relativos ao ponto de fusão. Estes resultados estão conforme a literatura onde é

informado que o ponto de fusão do ácido úsnico se apresenta a aproximadamente 204 ºC

(Índice Merck, 2002). O termograma do filme de biopolímero apresenta um pico fusão

endotérmico largo de 75 ºC até 150 ºC com um pico de temperatura máxima (Tmax) a 116,4

ºC que podem ser atribuídos ao ponto de fusão do biopolímero. Um pico semelhante foi

observado em uma goma, sendo relativo à gelatinização do material (Mano, et al., 2003). Os


56

picos de fusão do ácido úsnico e o biopolímero são ambos apresentados na varredura por DSC

em filme seco incorporado a 115,2 ºC e 200,6 ºC, respectivamente.

Os termogramas de DSC de filmes de biopolímero puro e biopolímero incorporado

mostraram padrões térmicos semelhantes que indicaram que a incorporação da droga não

afetou as propriedades de termotrópicas da estrutura do biopolímero.

Figura 10-Curvas de Calorimetria Diferencial Exploratória de ácido úsnico (UA), Filme de biopolímero (BPF), e Filme de biopolímero contendo ácido úsnico (UA-BPF) obtidos usando porta-amostra de alumínio a uma taxa de aquecimento de 10 ºC/min.


57

5.3.8 - Análise Termogravimétrica (TGA/TGD)

Os termogramas de TGA e DTG de ácido úsnico e filme de gel de biopolímero puro e

incorporado com ácido úsnico são apresentados na figura 11. Como esperado nenhuma perda

de peso de ácido úsnico foi observada sobre 170 °C, sugestionando uma estabilidade térmica

de droga a esta temperatura. A decomposição do ácido úsnico acontece em um processo de

três etapas (inicia em 183 e termina a 386 ºC) com Tmax degradação nos picos cumes a 213

ºC, 290 ºC e 309 ºC. Uma perda de peso de 70,6% foi determinada para o processo inteiro de

degradação.

Figura 11-Curvas de Termogravimetria Diferencial de ácido úsnico, Filme de biopolímero e Filme de biopolímero contendo ácido úsnico a uma faixa de temperatura de 25-700 ºC a uma taxa de aquecimento de 10 ºC min-1. No detalhe são apresentados as curva termogravimétricas do estudo dos materiais.


58

O pico a 290 ºC corresponde a maior perda de peso do ácido úsnico (55%). Dentro da

faixa de temperatura de 387 ºC até 700 ºC, uma decomposição gradual de ácido úsnico lugar,

porém a última degradação dos resíduos não foi alcançada até mesmo a 700 ºC.

Os filmes de biopolímero puro e incorporado apresentaram um pico a 50 ºC,

correspondendo à volatilização durante o aquecimento de água adsorvida, com uma perda de

peso de 6,2%. A decomposição térmica do biopolímero acontece entre 167 ºC até 420 ºC que

alcançam um Tmax de 303,4 ºC. Um segundo evento foi descoberto a temperaturas que

variam de 438,6 ºC a 610,1 ºC. Uma perda de peso de 86,1% foi determinada para o processo

inteiro de degradação. Por outro lado, o filme de biopolímero contendo ácido úsnico mostrou

um perfil de decomposição de três - etapas. A primeira etapa de degradação, com início a 174

ºC continuando até alcançar 235 ºC que corresponde à decomposição do ácido único. Um

único pico de 240 ºC até 372 ºC na segunda fase, relativo à degradação de biopolímero, e

finalmente um pico largo de 394 ºC - 640 ºC que acontece durante a última fase de degradação

do biopolímero. Foi calculado o peso de perda total de 69,6% para o filme de biopolímero

contendo ácido úsnico entre 50 ºC e 700 ºC.

Considerando a temperatura na qual a degradação térmica começa como um critério da

estabilidade térmica (Rosca, et al., 2005), todos os resultados indicaram a estabilidade do gel

de biopolímero contendo ácido úsnico. A troca para temperaturas mais altas sugere que a

incorporação de ácido úsnico melhore a estabilidade térmica do gel de biopolímero. Além

disso, deveriam ser executados estudos mais complementares na cinética de degradação

térmica do biopolímero na presença de água e condições de pH diferentes para dar informação

adicional sobre as mudanças físicas que podem acontece quando este polímero é implantado

no corpo. De fato, o volume do gel de biopolímero tende a reduzir quando implantado

subcutaneamente ou intraperitonialmente (dados não publicados). Também é esperado que

possam ser modificadas profundamente as propriedades mecânicas com tempo de

implantação.


59

6-CONCLUSÃO

Uma formulação de gel de biopolímero contendo ácido úsnico foi obtida. O método

analítico espectrofotométrico proposto para doseamento do ácido úsnico a 280 nm demonstrou

ser simples, rápido, preciso, exato e reprodutível sendo capaz de quantificar o ácido úsnico

incorporado em gel de biopolímero sendo uma valiosa ferramenta na caracterização e rotinas

de controle de qualidade de dosagem de gel de biopolímero contendo ácido úsnico. O DSC de

filmes de biopolímero puro e incorporado com ácido úsnico mostrou padrões térmicos

comparáveis, sugerindo assim que a incorporação de ácido úsnico não tem nenhuma influência

em propriedades térmicas do biopolímero. Porém, a TGA do gel de biopolímero contendo

ácido úsnico substanciou o aumento em sua estabilidade térmica, oferecendo informação útil

para aplicabilidade biomédica deste biomaterial. Conseqüentemente o biopolímero poder ser

esterilizado com segurança através de vapor ou através do processo de esterilização por calor

seco. Uma conclusão geral poderia dizer que a incorporação de ácido úsnico em gel de

biopolímero de origem microbiana oferece um sistema polimérico novo com potencial

aplicação em liberação controlada de drogas. Este novo material é facilmente disponível,

economicamente viável, biocompatível e obtido através de um recurso renovável.


60

7-REFÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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67

8 – Anexos

Anexo I:

Artigo submetido à revista Carbohydrate Polymers

Anexo II:

Figuras e tabela referentes ao artigo

Anexo III:

Pôster apresentado em evento

Production and thermal characterization of a biopolymer gel containing usnic acid

N.S. Santos-Magalhães a,b*, M.A. Néris a,b, M.S.O. Wanderley, J.L.A. Aguiar c, J.F.Kennedy d

a Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA), Universidade Federal de Pernambuco

(UFPE), Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária, 50670-901, Recife, PE, Brazil

b Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, UFPE

Av. Prof. Arthur Sá, s/n, Cidade Universitária, 50670-901, Recife, PE, Brazil

c Programa de Pós-Graduação em Cirurgia, UFPE

Av. Prof. Moraes Rego, s/n, Hospital das Clínicas, Bloco A, Térreo, Cidade Universitária,

50670-901, Recife, PE, Brazil.

d Birmingham carbohydrate and Protein technology Group, Chembiotech Laboratories, University of

Birmingham Resarch Park, Birmingham B 15 2 SQ, UK.

Keywords: usnic acid, biopolymer, polysaccharides, gel, Zoogloea sp., thermal analysis

*Corresponding author:

Dr. Nereide Stela Santos Magalhães

Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)

Grupo de Sistemas de Liberação Controlada de Medicamentos

Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA)

Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária,

50670-901, Recife-PE, Brasil.

Phone: +55-81-21268587; fax: +55-81-21268485.

E-mail address: [email protected]

Abstract

An exopolysaccharide produced by Zoogloea sp. from sugar cane molasses as a fibrous

membrane was used to prepare a gel containing usnic acid, which presents antimicrobial

activity. A method of drug extraction from the biopolymer gel was validated. The usnic acid,

pure and drug-loaded biopolymer gel were characterized through differential scanning

calorimetry (DSC) and thermogravimetric analyses (TGA). The content of usnic acid in the

biopolymer gel was 100.7 %. DSC scans of dried films of pure and drug-loaded biopolymer

showed comparable thermal patterns. In contrast, TGA curves shows that the presence of

usnic acid improves the thermal stability of the biopolymer. In fact, a weight loss of 86.1 %

was found for the biopolymer, whereas for the biopolymer containing usnic acid a weight loss

of 69.6 % was achieved. Therefore the incorporation of usnic acid in a biopolymer gel offers a

new economic feasible and biocompatible system for drug delivery.

2

1. Introduction

An exopolysaccharide produced by Zoogloea sp. from sugar cane molasses was obtained

as a white translucent fibrous membrane. This biopolymer was characterized using high

performance liquid chromatography, which presents the following monosaccharide profile:

glucose (87.6 %), xylose (8.6 %), mannose (0.8 %), ribose (1.7 %), galactose (0.1 %),

arabinose (0.4 %), and glucoronic acid (0.8 %) (Paterson-Beedle, Kennedy, Melo, Lloyd &

Medeiros, 2000). This biopolymer can be considered as a cellulosic exopolysaccharide due to

the presence of (1→4)-D-β-glucopyranosyl residues, corroborated by the enzymatic hydrolysis

with cellulase. The biocompatibility of the biopolymer was previously established (De Castro,

Aguiar, & Melo, 2004) and recently such a biopolymer was used as a film matrix for trypsin

immobilization (Cavalcante, Carvalho Jr., & Carneiro-Cunha, 2006). The enzyme was

successfully immobilized onto the film with glutaraldehyde using bovine serum albumin

(BSA) as a spacer. Actually, trypsin-BSA-membrane retained 99.12 % of its initial enzymatic

activity when stored for 54 days at 4 ºC. Besides holding a higher shelf-life, this system

presented thermal stability ever since temperatures rises from 45 ºC to 65 ºC.

Furthermore, a biopolymer-based gel formulation has been produced by our research

group (Lima, Jucá, Aguiar, Santos-Magalhães, & Melo, 2003) and experimentally investigated

in different medical applications such as prosthesis and catgut-like material in dogs (Aguiar,

Lima Filho, Coelho, Câmara Neto, & Melo, 2004).

The usnic acid [2,6-diacetyl-7,9-dihidroxi-8,9b-dimetil-1,3(2H,9bH)-dibenzenofuradione

(Fig. 1) is a product from the secondary metabolism of lichens species such as Cladonia,

Usnea, Lecanora, Ramalina, Evernia, and Parmotrema (Ingólfsdóttir, 2002). Usnic acid has

been extensively studied as it exhibits a number of pharmacological activities such as

antimicrobial (Ingolfsdottir, Chung, Skulason, Gissurarson, & Vilhelmsdóttir, 1998),

antiprotozoal (De Carvalho, Andrade, Silva, Pereira, & Figueiredo, 2005), antiproliferative

3

(Kumar & Muller, 1999), antitumour (Kupchan & Kopperman, 1975), anti-inflammatory

(Cochietto, Skert, Nimis, & Sava, 2002; Vijauakumar, Viswanathan, Reddy, Parvathavarthini,

Kundu, & Sukumar, 2000) and gastroprotective and antioxidant (Odabasoglu, Cakir,

Suleyman, Aslan, Bayir, Halici, & Kazaz, 2006). In spite of the remarkable antimicrobial

activity, the therapeutic use of usnic acid remains nowadays rather limited as a result of the

unfavourable physicochemical properties, especially due to its extremely poor water solubility

(0.01 %) [(Index Merck, 1995)], and high hepatotoxicity (Pramyothin, Janthasoot,

Pongimitprasert, Phrukudom, Ruangrungsi; Han, Matsumaru, Rettori, & Kaplowitz, 2004).

Therefore, in order to be safely and efficiently used as a chemotherapeutic agent, usnic acid

requires a suitable carrier system to improve its bioavailability and to reduce its toxic side-

effects. In this way, our research team had been studying the cytotoxicity and antitumour

activity of usnic acid encapsulated into microspheres (Ribeiro-Costa, Alves, Santos,

Nascimento, Gonçalves, Silva, Honda, Santos-Magalhães, 2004) and nanocapsules (Santos,

Nascimento, Silva, Pereira, Silva, Honda, & Santos-Magalhães, 2005; Santos, Nascimento,

Silva, Pereira, Silva, Honda, & Santos-Magalhães, 2006) as well as its toxicity.

Biopolymer hydrogels such as polysaccharide derivatives are used as carrier in controlled

drug delivery (Lloyd, Kennedy, Methacanon, Paterson, & Knill, 1998) due to their excellent

biocompatibility. Natural materials from renewable sources are currently replacing synthetic

polymers in different medical fields, particularly in prosthesis and esthetic surgery. In this

framework, there has been a renewed interest in biotechnological extracellular polysaccharides

of microbial origin, which have functionality, stable coast and easier supply as a choice to

polysaccharides of plant or algae (Selbmann, Onofri, Fenice, Frederici, & Petruccioli, 2002).

However, a small number of biopolymers are commercially available, partially due to the

difficult to guarantee batch-to-batch reproducibility and well known physicochemical

properties, which can change according to the water holding capacity and the synthesis

4

production. Actually, availability of biopolymers for industrial and medical uses requires

specific thermal and rheological behaviours under a variety of environment conditions (Parikh

& Madamwar, 2006). The thermal stability is a key feature of biomaterials, taking into

account the requirements of sterilization by heating the final product to be used in a medical

application. Thermal analyses such as TGA and DSC are powerful techniques used to monitor

physical and chemical changes in polymers or biopolymers in the presence of water,

chemicals or drugs. Alterations in the chemical structure and composition, or molecular

architecture of polymers or derivatives, and loss of material are detected and registered in the

thermograms (Neto, Giacometti, Job, Ferreira, Fonseca, & Pereira, 2005). The basic principle

underlying DSC is that, when the sample undergoes a physical transformation such as phase

transitions, more (or less) heat will require to flow to it than the reference to sustain both at the

same temperature. Some of material changes involve a weight loss, which can be

quantitatively assessed by thermogravimetry. Thermogravimetric analysis is thereby

imperative for the polymer characterization and it has been used to get insights into

interactions between polymers and drugs in drug delivery systems. Therefore, helpful

information can be obtained regarding the morphology of the polymer, the state of solid or

molecular dispersion of the drug associated with these systems.

Take into consideration medical purposes of the biocompatible biopolymer-based gel, it

becomes imperative a systematic study on the thermal, mechanical and structural properties of

this new product. The aim of this study was thereby to produce and characterize a novel

biopolymer-based gel formulation containing usnic acid as an antimicrobial agent. The

morphology, stability and thermal characteristics of the gel were evaluated by means of using

force atomic microscopy and thermal analysis.

2. Materials and Methods

5

2.1. Chemicals and Materials

(+)-usnic acid (98 %) was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Analytical

grade chloroform, methanol and dimethyl sulfoxide (DMSO) and others chemicals were

furnished by Merck (Darmstadt, Germany). Filtration membranes (Millipore®, pore=0.8 µm)

were acquired from Sigma-Aldrich (St. Louis, USA).The biopolymer, an exopolysaccharide

fibrous membrane produced by Zoogloea sp. from sugar cane molasses (Paterson-Beedle,

Kennedy, Melo, Lloyd & Medeiros, 2000), was furnished by the “Estação Experimental de

Cana-de-Açúcar of Carpina”, Pernambuco, Brazil.

2.2. Methods

Preparation of the biopolymer gel containing usnic acid

A biopolymer gel has been produced in our laboratory (Lima, Jucá, Aguiar, Santos-

Magalhães, & Melo, 2003). A solution of usnic acid (5 mg) in DMSO (1 ml) was prepared and

incorporated in the gel (5 g) through vortex stirring for 5 minutes. The obatined formulations

of biopolymer gel containing usnic acid were stored in darkness at 25 ºC ± 1 °C and their

physicochemical properties were evaluated by long-term stability testing.

Preparation of a dried film of biopolymer gel containing usnic acid

For microscopic and thermal analysis purposes, a dried film constituted of four different

layers of biopolymer gel containing usnic acid was prepared as follows. An aliquot of the gel

(1 g), corresponding to 1 mg of the incorporated drug, was fractioned in four aliquots and

individually homogenized with 2 ml of water using vortex stirring for 1 min. The preparations

were then separately filtered under vacuum, leading to a thin film formation. Four different

layers were superposed, dried at 37 ºC in an incubator (IF 3B, SAKURA, Japan) for 12 hours

and the resulting film was stored in the darkness at 25 ºC ± 1 °C. This dehydrated film was

6

used as a translucent material for the morphology characterization through atomic force

microscopy and thermal analysis.

Characterization of the biopolymer gel containing usnic acid

The biopolymer gel containing usnic acid was characterized by assessing the drug content,

evaluating its morphology using atomic force microscopy, and thermal stability through

differential scanning calorimetry (DSC) and thermogravimetric analysis (TGA).

Usnic acid content

The content of usnic acid in the biopolymer gel was assessed through UV-spectroscopy at

280 nm. A well weighted amount of the biopolymer gel (1 g) corresponding to 1 mg of usnic

acid was firstly dissolved in DMSO (0.5 ml) and then 2 ml of a mixture of chloroform and

methanol (3:1) was added, and finally the volume was filled to 5 ml with this same mixture.

The suspension was centrifuged at 8,776 g and the supernatant was diluted in methanol to

obtain a theoretical drug concentration of 10 μg/ml. The usnic acid content was then

quantified according to a previously validated method (Siqueira-Moura, Lira, & Santos-

Magalhães, 2007) at 280 nm (UV-Vis Ultrospec 3000 Pro spectrophotometer, Amersham

Pharmacia Biotech). A standard curve of usnic acid in methanol was prepared at

concentrations ranging from 1 to 15 μg/ml. The drug extraction procedure was validated by

six different analyses performed by two analysts in two different days. Statistical analysis of

the method reproducibility and intermediate precision was carried out by the t-Student test (p

< 0.05).

Atomic force microscopy

7

The morphology of the dried film of the biopolymer gel containing usnic acid was

examined through atomic force microscopy (MFP-3D microscope, Asylum Research, USA).

AC240TS cantilevers (Olympus, Tokyo, Japan) were used in intermittent contact mode. Such

cantilevers have a nominal spring constant of 2 N/m. Images were acquired at a 0.60 Hz scan

rate, after the fixation of the sample on mica.

Differential scanning calorimetry analysis

Differential scanning calorimetry (DSC) is a thermoanalytical technique in which the

difference in the amount of heat required to increase the temperature of a sample and a

reference are measured as a function of temperature. The DSC thermograms of usnic acid,

pure and drug-loaded dried film of the biopolymer gel were measured using a DSC Q-1000

thermal analyser (T.A Instruments, USA), with emperatures ranging from 25 to 220 ºC with a

heating rate of 10 ºC/min. The analysis was carried out in a sealed aluminium pan.

Thermogravimetric analysis

Thermogravimetric analysis is performed to verify changes in the weight loss of samples

in relation to the difference of the temperature. The TGA curves of usnic acid (powder), pure

and drug-loaded dried film of the biopolymer gel were run through a Q-500 thermal analyser

(TA Instruments, USA) in which the change of weight was determined as a function of the

temperature (25-700 ºC), in air nitrogen atmosphere (50 mm3/min) and a heating rate of 10

ºC/min The differential thermogravimetric curves (DTG) were calculated by the first

derivative of TGA thermograms of each sample.

3. Results and discussion

8

3.1. Characterization of the biopolymer gel containing usnic acid

A gel formulation containing usnic acid (1 mg/g) was obtained from the biopolymer

produced by Zoogloea sp. using sugar cane molasses. This formulation is intended to be used

for odontological purposes in the treatment of periodontites.

Usnic acid content

A method of extraction of usnic acid from biopolymer gel formulations was validated

through intermediate precision and repeatability. The content of usnic acid was assessed using

UV spectroscopy at 280 nm from a calibration curve with concentrations ranging between 10

μg/ml and 15 μg/ml ([UA] = Sample absorbance/0.06932 - 0.01757; r=0.99967, n=21,

p<0.0001). The content of usnic acid in the biopolymer gel samples was 10.07 ± 0.05 μg/ml

after production. (100.7 %, n=6) indicating a good extraction of the drug. The method

repeatability revealed a coefficient of variance (C.V.) of 0.48 %, thereby less than the 5 %

maximum-value usually recognized by regulatory agencies. The intermediate precision, which

evaluates the variation of assays performed in different days by different analysts, was

evaluated by the t–Student test (Table 1). As observed, the computed t-values were always

below the critical t-value, implying no statistical differences between the means at the

significance level p < 0.05.

Taking into accounting a long-term stability evaluation, gel formulations retained their

initial physicochemical properties for approximately 180 days during storage at 25 ºC ± 1º C.

After that, formulations exhibited morphological changes with the presence of an aqueous

supernatant suggesting an evidence of phase separation.

9

Atomic force microscopy

Atomic force microscopy (AFM) has been widely applied to verify the structure of a

variety of materials. AFM is one of the foremost tools for imaging, measuring and

manipulating matter at the nanoscale using a very high-resolution scanning probe. Unlike the

electron microscope, which provides a two-dimensional image of a sample, the AFM provides

true three-dimensional surface profile.

The AFM micrographs of pure and drug-loaded dried film of biopolymer gel are shown in

Fig. 2. Both drug-loaded (Fig. 2a) and unloaded (Fig. 2b) dried films exhibited a very compact

smooth and homogeneous morphology with a wrinkled surface, features of the fibrous

structure of the biopolymer. The incorporation of the usnic acid in the biopolymer gel was

confirmed by the absence of drug crystals at the surface of the dried film. Moreover, the

incorporation of usnic acid seems not to cause any structural change in the polymeric matrix,

evidencing the compatibility between the drug and the biopolymer gel.

These images of the biopolymer are in agreement with previous one obtained using

scanning electron microscopy (Cavalcante, Carvalho Jr., & Carneiro-Cunha, 2006) when a

fibrous structure was observed. The scanning electron microscopy is a very commonly used

technique to characterize the surface topology of many types of polymers including

polysaccharides and their grafted-derivatives (Krishnamoorthi, Mal, & Singh, 2007).

Actually, this technique is able to verify the difference between a lamellar structure of pure

mucilage and an organized structure of the grafted-mucilage as evidenced in a recent study

conducted by Mishra & Pal (2007).

Differential scanning calorimetry

In the present study the influence of the incorporation of usnic acid in the thermal stability

of dried films of biopolymer gel was investigated using DSC (Fig. 3). The usnic acid

thermogram showed a single endothermic fusion peak at 201.6 oC with an enthalpy change of

10

85.2 J.g-1, which is assigned to the melting. These results are in accordance with the literature

when is reported that usnic acid presents a melting point at approximately 204 oC (Index

Merck, 2002). The thermogram of the biopolymer film presents a broad endothermic fusion

peak from 75 oC up to 150 oC with a temperature of peak maximum (Tmax) at 116.4 oC, which

may be attributed to the melting point of the biopolymer. A similar peak was observed in

starch, being assigned to the gelatinization of the material (Mano, Koniarova, & Reis, 2003).

The fusion peaks of the usnic acid and the biopolymer are both presented in the DSC scan of

the dried mixed film at 115.2 oC and 200.6 oC, respectively.

DSC scans of dried films of pure and drug-loaded biopolymer showed similar thermal

patterns, which indicated that the incorporation of the drug did not affect the thermotropic

properties of the biopolymer structure.

Thermogravimetric analysis

TGA and DTG (Fig. 4) scans of usnic acid and dried films of pure and drug-loaded

biopolymer gel are shown in. As expected no weight loss of usnic acid was observed above

170 °C, suggesting a thermal stability of drug at this temperature. The usnic acid

decomposition takes place in a three-stage process (onset on 183 and end at 386 oC) with Tmax

degradation peaks at 213 oC, 290 oC and 309 oC. A weight loss of 70.6 % was determined for

the entire process of degradation. The peak at 290 oC corresponds to the highest usnic acid

weight loss (55 %). Within the temperature range from 387 oC to 700 oC, a gradual

decomposition of usnic acid takes place, however the last degradation of residues was not

achieved even at 700 oC.

The both pure and drug-loaded biopolymer film present a peak above 50 oC,

corresponding to the volatilisation of adsorbed water during heating with a weight loss of 6.2

%. The thermal decomposition of the biopolymer occurs between 167 oC up to 420 oC

11

reaching a Tmax of 303.4 oC. A second event was detected at temperatures ranging from 438.6

oC to 610.1 oC. A weight loss of 86.1 % was determined for entire process of degration. On

the other side, the biopolymer film containing usnic acid showed a three-stage decomposition

profile. The first stage of degradation, with an onset at 174 oC continues until reach 235 oC,

which corresponds to usnic acid decomposition. A single high peak at 240 oC to 372 oC in the

second stage, assigned to the biopolymer degradation, and finally a broad peak at 394 oC –

640 oC that occurs during the last degradation stage of the biopolymer. A total loss weight of

69.6 % was calculated for the biopolymer film containing usnic acid between 50 oC and 700

oC.

Considering the temperature in which the thermal degradation starts as a criterion of the

thermal stability (Rosca, Popa, Lisa, & Chitanu, 2005), all results indicated the stability of the

biopolymer gel containing usnic acid. The shift to higher temperatures suggests that the

incorporation of usnic acid improves the thermal stability of the biopolymer gel. Moreover,

more complementary studies on the kinetics of thermal degradation of the biopolymer in the

presence of water and different pH conditions should be performed in order to give additional

information about the physical changes that may occurs when this polymer is implanted in the

body. Actually, the volume of the biopolymer gel tends to reduce when implanted

subcutaneously or intraperitonealy (unpublished data). It is also expected that mechanical

properties may be deeply modified with time of implantation.

4. Conclusions

A biopolymer gel formulation containing usnic acid was obtained. In addition, a simple,

rapid and precise UV-method for determining usnic acid content was validated, which should

be a valuable tool in the characterization and control quality routines of biopolymer-based gel

dosage forms containing usnic acid. DSC of dried films of pure and drug-loaded biopolymer

12

showed comparable thermal patterns, thereby suggesting that the incorporation of usnic acid

has no influence on thermal properties of the biopolymer. However, TGA plots of the

biopolymer gel containing usnic acid substantiated the increase in its thermal stability,

offering useful information for biomedical applicability of this biomaterial. The biopolymer

should consequently safely steam sterilized or processed by dry heat sterilization. As a general

conclusion it might be said that the incorporation of usnic acid in a biopolymer gel of

microbial origin offers a new polymeric system with a potential application in controlled drug

delivery. This novel system is constituted of an easily available, economic feasible and

biocompatible exopolysaccharide produced by Zoogloea from a renewable resource of sugar

cane molasses.

Acknowledgements

Authors thank the Brazilian National Council for Scientific and Technological Development

(CNPq) for partial financial support. NSSM is grateful to CNPq for an individual grant #

472059-1. Thanks are addressed to Francisco Melo who kindly offered the biopolymer of

Zoogloea sp.

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16

Figure Captions

Figure 1. Chemical structure of usnic acid (C18H16O7; MW=344.31; MP=204 °C).

Figure 2. Atomic force microscopic images of dried films of biopolymer gel formulations:

pure biopolymer gel (A) and biopolymer gel containing usnic acid (B). The scale bars

represent the difference of height.

Figure 3. Differential scanning calorimetric curves of usnic acid (UA), biopolymer film (BPF)

and biopolymer film containing usnic acid (UA-BPF) obtained using dealed aluminium pans

at a heating rate of 10 ºC min-1.

Figure 4. Differential thermogravimetric curves of usnic acid (UA), biopolymer film (BPF)

and biopolymer film containing usnic acid (UA-BPF) in air nitrogen atmosphere at

temperature range of 25-700 ºC at a heating rate of 10 ºC min-1. In the insert are shown the

thermogravimetric curves of the studied materials.

17

Table 1: Intermediate precision of the method of usnic acid extraction from biopolymer gel using

UV spectroscopy at 280 nm. The theoretical concentration of usnic acid was 10 μg/ml.

Between-day variation Within-day variation

Day p tcalculated mean Analyst p tcalculated mean

1 0.31288 1.06277 10.06 A 0.12351 1.68188 10.03

2 0.95355 1.05973 10.00 B 0.11415 1.73089 10.02

critical t-value=2.57 (significance level p < 0.05, n=12).

Figure 1. Chemical structure of usnic acid (C18H16O7; MW=344.31; MP=204 °C).

Figure 2. Atomic force microscopic images of dried films of biopolymer gel

formulations: pure biopolymer gel (A) and biopolymer gel containing usnic acid (B).

The scale bars represent the difference of height.

A B

Figure 3. Differential scanning calorimetric curves of usnic acid (UA), biopolymer film

(BPF) and biopolymer film containing usnic acid (UA-BPF) obtained using dealed

aluminium pans at a heating rate of 10 ºC min-1.

Figure 4. Differential thermogravimetric curves of usnic acid (UA), biopolymer film

(BPF) and biopolymer film containing usnic acid (UA-BPF) in air nitrogen atmosphere

at temperature range of 25-700 ºC at a heating rate of 10 ºC min-1. In the insert are

shown the thermogravimetric curves of the studied materials.

Iª Jornada Científica do LIKA, 15-17 Dezembro de 2005

OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO GEL DE BIOPOLÍMERO DERIVADO DA FERMENTAÇÃO DE MELAÇO DA CANA-DE-AÇÚCAR

PELO MICROORGANISMO Zooglea sp.

NÉRIS,A. M.1; MAGALHÃES,N.S.S.2 ;AGUIAR,J.L.3MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS- LIKA-UFPE1 ; DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA-SLC-LIKA-UFPE2 DEPARTAMENTO DE CIRURGIA-NÚCLEO DE CIRURGIA EXPERIMENTAL -CCS-UFPE3

Um gel com múltiplas possibilidades de aplicação na área médica e

farmacêutica vem sendo desenvolvido no laboratório de bioquímica do Laboratório de Imunopatologia Keiso Asami-LIKA-UFPE.Esse gel, que é obtido a partir de um biopolímero produzido pela fermentação de melaço da cana-de-açúcar pelo microorganismo Zooglea sp está sendo utilizados em estudos experimentais pilotos em áreas como a cirurgia, imunomodulação e sistema de liberação de fármacos. No presente trabalho, foram estabelecidas etapas para a caracterização da obtenção e a avaliação das propriedades físico-químicas do gel de biopolímero em diversas concentrações. Um gel é obtido a partir da sonicação em sonda de ultra-som de uma parte de membrana hidratada com proporções variáveis de água destilada (1:1 e 1:10) em banho de gelo, precisando passar cerca de 200 segundos na potência padrão para formar um gel de excelente qualidade e rendimento razoável. As formulações dos géis obtidas foram observadas e classificadas de acordo com seu aspecto macroscópico (homogeneidade, coloração, formação de precipitados e consistência), observando-se a presença ou não de grumos. Foi obtido um gel de aspecto que variou desde translúcido até a opacidade, com a mesma viscosidade aparente para cada proporção, e que tende a manter sua estabilidade aparente inalterada por longo período quando armazenados em temperatura ambiente ou refrigerados. O gel de ambas as concentrações, após processo de esterilização por UV ou por autoclavação (121°C / 15 min), também permanecem com sua estabilidade aparente inalterada. Verificou-se que o gel pode ser obtido a partir de diferentes tipos de membrana, sob diversos graus de hidratação. Podemos afirmar que o principal fator que influencia na qualidade do gel obtido no final do processo é o tipo de membrana que é submetida à lise. Contudo estudos adicionais ainda devem ser feitos para a caracterização e padronização do gel.

Apoio UFPE-CNPq.

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