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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA
KAMILLA DINAH SANTOS DE LIRA
AVALIAÇÃO DO ULTRASSOM TERAPÊUTICO ASSOCIADO À TERAPIA DE CÉLULAS MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA NA REINERVAÇÃO DO
TECIDO MUSCULAR
Recife, 2013
1
KAMILLA DINAH SANTOS DE LIRA
AVALIAÇÃO DO ULTRASSOM TERAPÊUTICO ASSOCIADO À TERAPIA DE CÉLULAS MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA NA REINERVAÇÃO DO
TECIDO MUSCULAR Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Fisioterapia do Centro
de Ciências da Saúde da Universidade
Federal de Pernambuco (UFPE) para
obtenção do Título de Mestre em
Fisioterapia.
Linha de Pesquisa: Fisioterapia:
Desempenho físico-funcional e qualidade
de vida.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Silvia Regina
Arruda de Moraes.
Coorientadora: Prof.ª Dr.ª Claudia dos
Santos Mermelstein.
Recife, 2013
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“AVALIAÇÃO DO ULTRASSOM TERAPÊUTICO ASSOCIADO À TERAPIA DE CÉLULAS MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA NA REINERVAÇÃO DO TECIDO MUSCULAR”.
KAMILLA DINAH SANTOS DE LIRA
APROVADA EM: 19/02/2013 ORIENTADORA: PROFª. DRª. SILVIA REGINA ARRUDA DE MORAES COORIENTADORA: PROFª. DRª. CLÁUDIA DOS SANTOS MERMELSTEIN COMISSÃO EXAMINADORA: PROFª. DRª. KÁTIA KARINA DO MONTE SILVA – FISIOTERAPIA/UFPE PROFª. DRª. CÉLIA MARIA MACHADO BARBOSA DE CASTRO – MEDICINA TROPICAL/UFPE PROFª. DRª. CELINA CORDEIRO DE CARVALHO – ESTÁCIO DE SÁ RECIFE/FIR
Visto e permitida à impressão
_______________________________________________ Coordenador(a) do PPGFISIOTERAPIA/DEFISIO/UFPE
3
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO REITOR
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
VICE-REITOR Prof. Silvio Romero de Barros Marques
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO (PROPESQ)
Prof. Dr. Francisco de Sousa Ramos
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DIRETOR
Prof. Dr. Nicodemos Teles de Pontes Filho
VICE-DIRETOR Prof.ª Dr.ª Vania Pinheiro Ramos
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FISIOTERAPIA COORDENADORA
Profª. Drª. Daniella Araújo de Oliveira
VICE-COORDENADORA Prof.ª Dr.ª Karla Mônica Ferraz Teixeira Lambertz
CORPO DOCENTE Prof. Dr. Alberto Galvão de Moura Filho
Prof.ª Dr.ª Ana Elisa Toscano Meneses da Silva Castro
Prof.ª Dr.ª Andréa Lemos Bezerra de Oliveira
Prof.ª Dr.ª Armèle Dornelas de Andrade
Prof.ª Dr.ª Caroline Wanderley Souto Ferreira
Prof.ª Dr.ª Daniella Araújo de Oliveira
Prof.ª Dr.ª Daniella Cunha Brandão
Prof.ª Dr.ª Glória Elizabeth Carneiro Laurentino
Prof.ª Dr.ª Karla Mônica Ferraz Teixeira Lambertz
Prof.ª Dr.ª Katia Karina do Monte Silva
Prof. Dr. Marco Aurélio Benedetti Rodrigues
Prof.ª Dr.ª Maria Cristina Falcão Raposo
Prof.ª Dr.ª Maria do Amparo Andrade
Prof.ª Dr.ª Maria do Socorro Brasileiro Santos
Prof. Dr. Murilo Carlos Amorim de Brito
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Profª. Drª. Silvia Regina Arruda de Moraes
Prof.ª Dr.ª Vanessa Regiane Resqueti
ORIENTADORA Silvia Regina Arruda de Moraes
Professora Associada 01 do Departamento de Anatomia do Centro de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE
Doutora em Ciências Morfofuncionais pela Universidade de São Paulo – USP
COORIENTADORA Claudia dos Santos Mermelstein
Professora Associada 03 do Departamento de Histologia e Embriologia do Instituto
de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ
Doutora em Ciências Biológicas (Biofísica) pela Universidade Federal do Rio de
Janeiro – UFRJ
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DEDICATÓRIA
Com muito amor, dedico este trabalho:
Aos meus pais, DAVI QUINTINO DE LIRA e RISONETE SANTOS DE
LIRA, que estiveram sempre ao meu lado. Eu não teria chegado até
aqui sem vocês;
Ao meu irmão, KAIO DANILLO SANTOS DE LIRA;
Ao meu noivo, ALEXANDRE NASCIMENTO DOS SANTOS;
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo seu infinito amor e por estar sempre presente me guiando em todos os
momentos e me amparando nas dificuldades;
Aos meus pais, Davi Quintino de Lira e Risonete Santos de Lira, pelo amor,
dedicação, paciência e perseverança;
Ao meu irmão, Kaio Danillo Santos de Lira, pelos pensamentos positivos e pela
confiança depositada em mim;
Ao meu noivo, Alexandre Nascimento dos Santos, pela paciência e calma para me
confortar nos momentos de angústia;
À minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Silvia Regina Arruda de Moraes, por me adotar
como “filha científica” desde a graduação, me ensinando, incentivando e acreditando
no meu potencial;
À minha coorientadora, Prof.ª Dr.ª Claudia dos Santos Mermelstein, por ter me
recebido em seu laboratório, e estar sempre disponível para me orientar,
independentemente da distância;
Aos docentes e servidores da Pós-Graduação em Fisioterapia, pelo apoio,
auxílio, paciência e amizade;
Aos Departamento de Cirurgia Experimental, Laboratório de Microbiologia Clínica (LIKA) e Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (CETENE), pela disponibilidade na execução das várias etapas do meu projeto;
À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE), pelo apoio financeiro;
7
Aos colegas de mestrado, Clarice Costa (“In Memorian”), Cybelle Nery, Lucas
Ithamar Santos, Renato Melo, Helga Cecília Souza, Ramon Viana, Taciano Rocha,
Marsílio Leitão, Cibelle Lima, Ianny Silva, Silvana Galvão, Rebeca Santos e Karina
Reichow, pelas conversas, companheirismo e amizade;
Aos meus queridos amigos do Laboratório de Plasticidade Neuromuscular (LAPLAN), Rodrigo Andrade, Ana Cristina Esteves, Márcio Bezerra, Deniele Lós,
Patrícia Silveira, Marcos Paulo Coutinho, Raissa Thais Silva, Thainá Figueiredo,
Gabriel Mesquita, Karyne Novaes, Anna Karollyna Nascimento, Marcos Vinícius
Amaral, Filipe Miranda, Ana Camila Brito, Rafael Silva, Diego Oliveira e Simone
Mendonça, pelo empenho e apoio ao longo desses dois anos;
À minha família, pela compreensão e incentivo.
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RESUMO
Introdução: Lesões dos nervos periféricos levam a alterações musculares, desde
atrofia até morte das fibras. Busca-se por recursos que auxiliem o processo de
regeneração nervosa, diminuindo suas consequências no tecido muscular.
Objetivos: Avaliar a eficácia do ultrassom terapêutico (UT) associado à terapia com
células mononucleares da medula óssea (CMMO) no processo de reinervação do
tecido muscular. Material e Métodos: Utilizou-se 32 ratos, Wistar, distribuídos em
grupo controle (GC) e 4 grupos submetidos a neurotmese do nervo ciático [lesionado
(GL), tratado com CMMO (GLT), tratado com UT (GLU), tratado com CMMO+UT
(GLTU)]. No 1º dia pós-neurotmese, foi iniciado o UT pulsátil (1MHz; 0,5W/cm2;
frequência de pulso - 100Hz; duração de pulso - 2ms, 1:5), e o tratamento durou 12
dias. O índice funcional do ciático (IFC) foi avaliado, e o peso muscular e as
quantidades de miosinas lenta e rápida foram aferidos. Foram aplicados os testes
estatísticos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, p<0,05. Resultados: Observou-se
redução nos valores médios do IFC já no 13º dia pós-neurotmese, em todos os
grupos submetidos à lesão nervosa em relação ao GC, diferença essa encontrada
ao longo de todo o experimento. Os grupos tratados com ultrassom terapêutico
apresentaram valores médios do IFC mais altos em relação ao GL apenas no 13º dia
pós-neurotmese. Os grupos submetidos à terapia celular apresentaram maiores
pesos musculares que o GL. Na quantificação da miosina lenta, observou-se
redução dos valores dos GL e GLTU quando comparados ao GC. Porém, na
quantificação da miosina rápida, observaram-se valores maiores nos grupos
submetidos à lesão nervosa quando comparados ao GC, entretanto, o GLTU
apresentou valores mais baixos em relação ao GL. Conclusões: No 13º dia pós-
neurotmese, o UT atuou melhorando a funcionalidade da marcha, mas essa melhora
não foi observada ao longo do experimento. Porém, a terapia celular reduziu a
atrofia do tecido muscular e, os efeitos das intervenções utilizadas variaram de
acordo com o tipo de fibra muscular analisada.
Palavras-chave: Traumatismos dos Nervos Periféricos. Denervação Muscular.
Reabilitação.
9
ABSTRACT
Introduction: Injuries of peripheral nerves leads to muscle disorders, since atrophy
even death of fibers. There is a demand for resources that optimize the process of
nerve regeneration, reducing their effect on muscle tissue. Objectives: To evaluate
the efficacy of therapeutic ultrasound (TU) associated with bone marrow
mononuclear cell (BMMC) therapy in the process of reinnervation of muscle tissue.
Material and Methods: We used 32 Wistar rats divided into control group (CG) and
4 groups underwent neurotmesis of sciatic nerve [injured (IG), treated with BMMC
(IGT), treated with TU (IGU), treated with BMMC+TU (IGTU)]. On the 1st day post-
neurotmesis pulsed TU (1MHz; 0.5W/cm²; pulse rate - 100Hz, pulse duration - 2ms,
1:5) was initiated, and the treatment lasted 12 days. The sciatic functional index (SFI)
was performed, and the muscle weight and the amount of slow and fast myosin were
measured. We applied statistical tests of Kruskal-Wallis and Mann-Whitney test,
p<0.05. Results: A reduction in mean SFI was observed already on 13th post-
neurotmesis day in all groups subjected to nerve injury compared to CG, this
difference was found all along the experiment. The groups treated with therapeutic
ultrasound showed mean of the SFI higher than IG only on 13th post-neurotmesis
day. The groups subjected to cell therapy showed muscle weights higher than IG. In
the quantification of slow myosin, we observed decreased levels of IG and IGTU
compared to CG. However, in the quantification of fast myosin, we observed in the
groups subjected to lesion values higher than CG, but IGTU showed values lower
than IG. Conclusions: On 13th post-neurotmesis day, TU acted improving the
functionality of the march, but this improvement was not observed during the
experiment. However, cell therapy reduced atrophy of the muscle tissue and the
effects of interventions used varied according to the type of muscle fiber.
Keywords: Peripheral Nerve Injuries. Muscle Denervation. Rehabilitation.
10
SUMÁRIO
Pág. APRESENTAÇÃO..................................................................................................... 12 1 INTRODUÇÃO........................................................................................................ 14 1.1 Revisão de Literatura......................................................................................... 14 1.1.1 Lesão Nervosa e Comprometimento do Tecido Muscular................................ 14 1.1.2 Meios Auxiliares para a Regeneração Nervosa e o Restabelecimento do
Tecido Muscular......................................................................................................... 15
1.1.2.1 Tubo de Biopolímero Extraído da Cana-de-Açúcar....................................... 16 1.1.2.2 Terapias Celulares......................................................................................... 17 1.1.2.3 Ultrassom Terapêutico................................................................................... 18 1.2 Hipótese............................................................................................................... 19 1.3 Objetivos............................................................................................................. 19 1.3.1 Geral.................................................................................................................. 19 1.3.2 Específicos........................................................................................................ 19 2 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 20 2.1 Desenho do Estudo............................................................................................ 20 2.2 Local do Estudo................................................................................................. 20 2.3 Período do Estudo............................................................................................. 20 2.4 Aspectos Éticos................................................................................................. 20 2.5 Amostra............................................................................................................... 20 2.6 Procedimentos Experimentais.......................................................................... 21 2.6.1 Modelos Experimentais..................................................................................... 21 2.6.2 Obtenção das Células Mononucleares da Medula Óssea................................ 21 2.6.3 Neurotmese Experimental................................................................................. 22 2.6.4 Aplicação do Ultrassom Terapêutico Pulsátil.................................................... 23 2.6.5 Análise Funcional da Marcha............................................................................ 23 2.6.6 Coleta do Material, Eutanásia dos Animais e Procedimentos para
Imunofluorescência.................................................................................................... 24 2.7 Análise de Dados............................................................................................... 25 2.7.1 Análise dos Resultados..................................................................................... 25 2.7.2 Análise Estatística............................................................................................. 26 3 RESULTADOS ....................................................................................................... 27
11
3.1 Artigo Original 1................................................................................................. 27 3.2 Artigo Original 2................................................................................................. 40 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................... 55 5 LIMITAÇÕES DO ESTUDO.................................................................................... 56 REFERÊNCIAS.......................................................................................................... 57 APÊNDICES.............................................................................................................. 62 ANEXOS.................................................................................................................... 70
12
APRESENTAÇÃO ___________________________________________________________________
Esta dissertação faz parte de uma linha de pesquisa do Laboratório de
Plasticidade Neuromuscular - LAPLAN do Departamento de Anatomia da UFPE, que
tem como objetivo estudar as repercussões do uso de recursos fisioterapêuticos
instrumentais associados ou não a terapia com células da medula óssea na
regeneração dos tecidos nervoso periférico e muscular em modelos animais.
Em estudos prévios realizados pelo grupo de pesquisa, foi observada uma
boa resposta do tecido nervoso à terapia celular associada ao ultrassom terapêutico.
A partir desses resultados, foi utilizado o mesmo modelo de lesão completa do nervo
e terapia com células da fração mononuclear associada ou não a terapia com
ultrassom, a fim de avaliar, se essas intervenções trariam também uma ação
terapêutica sobre o tecido muscular desnervado.
Inicialmente foi aplicado um protocolo experimental em ratos da linhagem
Wistar, com a finalidade de provocar a lesão nervosa do nervo ciático e,
posteriormente, seu reparo com a adição de uma suspensão de células
mononucleares da medula óssea, seguido de tratamento com ultrassom terapêutico.
Dos dados obtidos resultaram dois artigos originais: análise funcional da marcha de
ratos pós-neurotmese submetidos à terapia com células mononucleares da medula
óssea associada ao tratamento com ultrassom terapêutico (submetido para
publicação na Revista Brasileira de Fisioterapia – Conceito A2 para a área 21 da
CAPES); e efeitos no tecido muscular da associação da terapia com células
mononucleares da medula óssea e do tratamento com ultrassom terapêutico em
ratos após neurotmese (artigo ainda não submetido).
Atendendo às normas vigentes do Programa de Pós-Graduação em
Fisioterapia da UFPE para a elaboração da dissertação, o presente exemplar está
estruturado da seguinte maneira:
Capítulo 1: Introdução
Capítulo 2: Material e Métodos
Capítulo 3: Resultados – apresentação dos resultados desse estudo no
formato de dois artigos originais:
13
Artigo Original 1 – Análise funcional da marcha de ratos pós-
neurotmese submetidos à terapia com células mononucleares da
medula óssea associada ao tratamento com ultrassom terapêutico.
Artigo Original 2 – Efeitos no tecido muscular da associação da terapia
com células mononucleares da medula óssea e do tratamento com
ultrassom terapêutico em ratos após neurotmese.
Capítulo 4: Considerações Finais
Capítulo 5: Limitações do Estudo
Referências (do corpo da dissertação)
Apêndices
Anexos
14
1 INTRODUÇÃO ___________________________________________________________________ 1.1 Revisão de Literatura 1.1.1 Lesão Nervosa e Comprometimento do Tecido Muscular
Lesões de nervos periféricos são injúrias graves que induzem a perda parcial
ou completa da função motora e sensorial (CHABAS et al., 2009), levando a
alterações musculares de aspecto metabólico, biomecânico, estrutural e fisiológico
(MIDRIO, 2006).
Depois de uma transecção completa do nervo, é iniciado o processo de
degeneração Walleriana (BURNET; ZAGER, 2004), no qual o coto proximal começa
a sofrer uma degeneração retrógrada, e o coto distal começa a degenerar em virtude
do desarranjo do citoesqueleto, dissolução da membrana celular e perda da mielina
das células de Schwann (SCHMIDT; LEACH, 2003). Estas células juntamente com
os macrófagos começam a degradar e remover a mielina (STOLL et al., 1989).
Ultraestruturalmente há uma desordenação dos neurotúbulos e neurofilamentos, e o
contorno axonal torna-se irregular (BURNET; ZAGER, 2004).
Após a degeneração Walleriana é iniciada a regeneração nervosa (BURNET;
ZAGER, 2004) com o brotamento espontâneo de axônios, podendo conduzir a
restauração da conectividade periférica e funcional (RHRICH-HADDOUT et al.,
2001). Em condições clínicas, a taxa de regeneração axonal é estimada em 1mm
por dia, porém essa taxa varia (BURNET; ZAGER, 2004; LANZA et al., 2012) devido
a natureza e gravidade da lesão, a duração da desnervação e a condição dos
tecidos periféricos, entre outros fatores (BURNET; ZAGER, 2004).
No tecido muscular desnervado, em poucos dias já podem ser observadas
atrofia das fibras, redução da tensão e da força, e alteração na contratilidade
(MIDRIO, 2006), e em longo prazo, perda da sua integridade e morte (GRUMBLES
et al., 2009), além do possível desenvolvimento de contraturas, interferindo, assim,
na função (DELLON; MACKINNON, 1989).
Em condições atróficas, o tecido muscular exibe uma maior degradação do
que síntese de suas proteínas, havendo consequentemente uma redução do teor de
proteínas responsáveis pela manutenção das propriedades intrínsecas do tecido
15
muscular (BRITO; OLIVEIRA; MORAES, 2011). No músculo sóleo a proporção da
síntese proteica é reduzida a valores menores que 50% e a proporção de
degradação proteica aumenta para níveis maiores que 150% (BAJOTTO;
SHIMOMURA, 2006).
Pellegrino e Franzini (1963) descreveram o processo de atrofia muscular por
desnervação em duas modalidades: a primeira, consistindo na degeneração dos
componentes das fibras numa área relativamente grande, relacionando-se com a
rápida redução no volume muscular que ocorre nos primeiros 15 dias após a secção
do nervo; e, a segunda, numa redução das dimensões individuais das fibrilas pela
saída dos filamentos periféricos para os espaços interfibrilares. Em dois meses a
área de secção transversa reduz em média 70%, e os núcleos deixam sua posição
na periferia e assumem uma posição central (BURNET; ZAGER, 2004).
Entretanto, um dos fatores determinantes da proporção e da magnitude do
processo de atrofia no músculo desnervado é o tipo de fibra muscular (BORISOV;
DEDKOV; CARLSON, 2001), pois as fibras tipo I (de contração lenta) e as fibras tipo
II (de contração rápida) contêm diferentes isoformas de cadeia pesada de miosina,
que são as responsáveis pelas suas diferentes atividades ATPásicas e velocidades
de encurtamento (BACOU et al., 1996).
Nessas condições observa-se também uma alteração na proporção de fibras
musculares, com a alteração das características das fibras do tipo I, que passam a
apresentar as características de fibras do tipo II (BOOTH, 1982), sugerindo uma
degradação e/ou substituição das fibras tônicas (tipo I) pelas fibras fásicas (tipo II)
(BRITO; OLIVEIRA; MORAES, 2011).
Logo, a reinervação é necessária para restaurar a excitabilidade, o tamanho e
a função muscular, e por essa razão, é fundamental que as intervenções visando a
reparação nervosa sejam realizadas o mais precocemente possível para assegurar
uma recuperação muscular eficaz (GRUMBLES et al., 2009). Dessa forma,
pesquisas contínuas têm sido realizadas em busca de fatores, mecanismos e
técnicas que possam otimizar o processo de regeneração nervosa (CRISCI;
FERRERA, 2002).
1.1.2 Meios Auxiliares para a Regeneração Nervosa e o Restabelecimento do
Tecido Muscular
16
Estratégias de bioengenharia tecidual têm se concentrado no
desenvolvimento de alternativas terapêuticas com o objetivo de promover um
aumento na recuperação e nos resultados funcionais (DEZAWA et al., 2001;
MOURAD et al., 2001; CRISCI; FERREIRA, 2002; HU et al., 2013), especialmente
para maiores lesões (SCHMIDT; LEACH, 2003).
Uma alternativa é a reconstrução neural utilizando auto-enxertos, mas esta
técnica apresenta desvantagens tais como o tempo cirúrgico prolongado, a perda da
função do nervo doado, a disponibilidade limitada de nervos e a combinação
inadequada do diâmetro e da organização fascicular entre o nervo lesado e o
enxerto (DELISTOIANOV et al., 2008, YANG et al. 2011).
Na tentativa de contornar tais desvantagens, a técnica de tubulização, que se
baseia no uso de materiais não neurais, com a função de envolver a sutura neural e
preencher a falha no tecido nervoso lesado utilizando um tubo com capacidade de
unir os dois cotos (FREITAS; FLORES, 2007), tem se mostrado eficaz no processo
de regeneração nervosa. Esses tubos de orientação servem para direcionar o
brotamento axonal a partir do nervo proximal, gerando um canal para difusão de
fatores de crescimento secretados pelas extremidades do nervo lesionado, e reduzir
a infiltração de tecido cicatricial (SCHMIDT; LEACH, 2003; FREITAS; FLORES,
2007).
Pesquisas nesta área tem se concentrado tanto em materiais naturais quanto
sintéticos (SCHMIDT; LEACH, 2003). A utilização de materiais potencialmente
biodegradáveis evita a necessidade de uma segunda cirurgia para retirada do tubo,
fazendo desses materiais uma alternativa para reconstrução do tecido nervoso
(YANG et al., 2011).
Atualmente, tem sido investigada a combinação de materiais e de
biomoléculas, com a finalidade de criar novas alternativas terapêuticas para
estimular ativamente a regeneração nervosa (SCHMIDT; LEACH, 2003). Dentre
elas, destacam-se a utilização de Biopolímero extraído da cana-de-açúcar, as
terapias celulares e o uso de recursos fisioterapêuticos instrumentais.
1.1.2.1 Tubo de Biopolímero Extraído da Cana-de-açúcar
O biopolímero extraído da cana-de-açúcar é um material de estrutura química
polimérica obtido por síntese a partir do melaço da cana-de-açúcar na Estação
Experimental de Cana-de-Açúcar de Carpina – UFRPE (COELHO et al., 2002;
17
CASTRO et al., 2004; LIMA et al., 2005; MONTEIRO et al., 2007). Apresenta como
principais monossarídeos da sua fração solúvel glicose (87,6%), xilose (8,6%),
manose (0,8%), ribose (1,7%), galactose (0,1%), arabinose (0,4%) e ácido
gicurônico (0,8%) (PATERSON-BEEDLE et al., 2000).
Esse biopolímero apresenta elasticidade, resistência à tração, flexibilidade e
pode ser modelado em diferentes formas, demonstrando assim características físico-
químicas fundamentais para a confecção de implantes biológicos (LIMA et al., 2005).
Além disso, apresenta uma baixa citotoxicidade a um nível que permite a sua
aplicação experimental com segurança (CASTRO et al., 2004).
Vem sendo estudado, com resultados favoráveis, em diversas áreas da
cirurgia experimental, como na cicatrização de feridas cutâneas (COELHO et al.,
2002; MONTEIRO et al., 2007), na reconstrução vascular (MARQUES et al., 2007),
como substituto da membrana timpânica (MAYER et al., 2011), dentre outros.
Embora já tenha sido testado com sucesso em diferentes tecidos, ainda não foi
investigado o seu uso como tubo guia para a regeneração nervosa periférica.
1.1.2.2 Terapias Celulares
Uma forma de se tentar restabelecer a integridade da estrutura nervosa é a
utilização da terapia com células-tronco (WAGERS; WEISSMAN, 2004). Seu uso é
considerado atualmente uma das alternativas mais promissoras para o tratamento
de lesões nervosas (BRAGA-SILVA et al., 2006), uma vez que vários estudos têm
relatado seus benefícios sobre o processo regenerativo de nervo periférico após
lesões traumáticas (DEZAWA et al., 2001; HU et al., 2013) e na aceleração da
recuperação da função motora (BRAGA-SILVA et al., 2006; CHENG et al., 2010;
OLIVEIRA et al., 2010; UEMURA et al., 2012). Entretanto, o mecanismo exato pelo
qual este efeito ocorre ainda não está completamente esclarecido (BRAGA-SILVA et
al., 2006).
Embora o uso da terapia citada seja promissor, ela apresenta algumas
desvantagens na prática clínica, tais como: 1) necessitar de um período das células
em meio de cultura para permitir seu isolamento e expansão antes do transplante,
ficando passiva a uma contaminação microbiana e perda do cultivo; e 2) possuir
células com diâmetros, aproximadamente, 2 vezes maiores que as células
mononucleares da medula óssea (CMMO), acarretando em embolia, caso a via de
administração seja intra-arterial (SOUZA et al., 2010).
18
Desta forma, a terapia com CMMO aparece como uma outra alternativa, pois,
além de não necessitar de um período em meio de cultivo, tem demonstrado
potencial regenerativo e neuroprotetor após lesão nervosa, uma vez que apresentou
uma migração espontânea e transdiferenciação em células de Schwann em um
modelo de degeneração Walleriana (USACH et al., 2011) e aumentou o crescimento
axonal e a sobrevida de células ganglionares da retina (ZAVERUCHA-DO-VALLE et
al., 2011).
1.1.2.3 Ultrassom Terapêutico
Outro recurso que vem sendo avaliado com o propósito de auxiliar a
regeneração nervosa é o ultrassom terapêutico (UT). O UT pode exercer efeitos
físicos sobre as células e tecidos através de mecanismos térmicos e não térmicos
(DOAN et al., 1999). Estes mecanismos podem aumentar a permeabilidade da
membrana celular, além de proporcionar um fluxo circulatório constante na região
irradiada, gerando, no estágio agudo da inflamação e reparo, um aumento da
difusão do cálcio através da membrana celular e da produção e liberação de fatores
que contribuem para a cicatrização (LOW; REED, 2001). Além disso, o UT estimula
a angiogênese através da produção de interleucina-8 (IL-8) e fator de crescimento
vascular endotelial (VEGF) (DOAN et al., 1999; REHER et al., 1999).
Este recurso terapêutico instrumental já é empregado para o tratamento
fisioterapêutico de muitas doenças do sistema musculoesquelético (MONTE-RASO
et al., 2006) e alguns estudos experimentais o têm utilizado no tratamento de lesões
de nervos periféricos (MOURAD et al., 2001; CRISCI; FERREIRA, 2002; CHANG;
HSU, 2004; MONTE-RASO et al., 2005; MONTE-RASO et al., 2006; AKHLAGHI et
al., 2012) obtendo resultados promissores no sentido de acelerar a regeneração
nervosa.
Percebe-se na literatura especializada registros isolados que apontam a
eficácia do UT e da terapia celular como auxiliares no processo de regeneração do
nervo periférico. Entretanto, até o momento não há registro de estudo que tenham
avaliado esses recursos terapêuticos, tanto de forma isolada como associada, no
processo de reinervação da musculatura desnervada. Assim, esse estudo
experimental mostra-se relevante no sentido que pode contribuir para fornecer
conhecimentos que possam vir a ser aproveitados e extrapolados para a prática
19
clinica no que diz respeito a recuperação motora de indivíduos com lesões nervosas
periféricas.
1.2 Hipótese
A utilização de células mononucleares da medula óssea associada ou não ao
ultrassom terapêutico pulsátil produz a reinervação do tecido muscular pós-
desnervação completa.
1.3 Objetivos 1.3.1. Objetivo Geral
Avaliar a eficácia da utilização da terapia com células mononucleares da
medula óssea (CMMO) associada ou não à aplicação do ultrassom terapêutico (UT)
pulsátil no processo de reinervação do tecido muscular desnervado após lesão total
do nervo ciático.
1.3.2. Objetivos Específicos
• Avaliar a recuperação funcional da marcha dos animais, através do cálculo do
Índice Funcional do Ciático (IFC)
• Avaliar histomorfometricamente o grau de atrofia do músculo sóleo, através da:
Mensuração da massa muscular
Quantificação e determinação do percentual de miosina lenta e de miosina
rápida, referentes respectivamente a fibras musculares do tipo I e do tipo II
20
2 MATERIAL E MÉTODOS ___________________________________________________________________
2.1 Desenho do Estudo
Este estudo foi quantitativo do tipo experimental.
2.2 Local do Estudo
O estudo foi desenvolvido no Laboratório de Plasticidade Neuromuscular
(LAPLAN) do Departamento de Anatomia da Universidade Federal de Pernambuco
(UFPE), no Laboratório de Microbiologia Clínica do Laboratório de Imunopatologia
Keizo Asami (LIKA) e no Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste
(CETENE), e com a colaboração do Departamento de Cirurgia Experimental da
UFPE.
2.3 Período do Estudo
Os dados foram coletados e analisados no período de Março de 2012 à
Janeiro de 2013.
2.4 Aspectos Éticos O presente estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação
Animal da Universidade Federal de Pernambuco (nº do processo:
23076.020636/2009-36) (ANEXO A).
2.5 Amostra
21
Foram utilizados 32 ratos, machos, albinos, da linhagem Wistar, com idade
inicial entre 67 e 71 dias de vida e massa corpórea média de 290g, provenientes da
colônia de criação do Departamento de Nutrição da UFPE e mantidos no biotério de
experimentação do Departamento de Anatomia (UFPE), em ciclo de luz invertido
claro/escuro (12h/12h), temperatura de 23 ± 2°C, e recebendo ração e água ad
libitum. Para obtenção da medula óssea foram utilizados 6 ratos com as mesmas
características dos animais em estudo.
2.6 Procedimentos Experimentais 2.6.1 Modelos Experimentais
Os animais foram distribuídos em 5 grupos, sendo o 1º denominado de Grupo
Controle (GC, n=6), cujos os animais não sofreram nenhum tipo de intervenção. Os
outros 4 grupos foram submetidos a lesão do nervo ciático e denominados, segundo
a terapia administrada, em:
• Grupo Lesão (GL, n=6) – não submetido às terapias;
• Grupo Lesão + Terapia Celular (GLT, n=7) – submetido à terapia com CMMO;
• Grupo Lesão + Ultrassom Terapêutico (GLU, n=6) – submetido ao tratamento
com UT;
• Grupo Lesão + Terapia Celular + Ultrassom Terapêutico (GLTU, n=7) –
submetido à terapia com CMMO e ao tratamento com UT.
2.6.2 Obtenção das Células Mononucleares da Medula Óssea
Para coleta da medula óssea, os 6 animais foram anestesiados com uma
solução de Cloridrato de Xilazina a 2% e Cloridrato de Ketamina por via
intramuscular (em uma quantidade de 0,2ml da solução para cada 100g de peso
corporal do animal) (MASSONE, 2008), foram eutanasiados com injeção de 1mL de
cloreto de potássio (KCl) por via intracardíaca. O protocolo adotado para obtenção
das CMMO foi baseado nos protocolos utilizados por Usach e colaboradores (2011)
e Zaverucha-do-Valle e colaboradores (2011). Para cada animal, realizou-se
assepsia com álcool 70% e os ossos longos (fêmures e tíbias) foram desarticulados
e dissecados até ficarem livres de tecidos. Em seguida, as epífises eram removidas
22
e a medula óssea aspirada com seringa descartável (3mL) contendo solução salina
estéril e heparina. A suspensão obtida foi colocada em um tubo Falcon (50mL), e
centrifugada a 1200rpm, durante 30 minutos, promovendo assim o isolamento das
células mononucleares pelo gradiente de Ficoll. O volume de células mononucleares
foi ajustado para 40mL com solução salina estéril e submetido a uma nova
centrifugação a 1800rpm, por 10 minutos. Ao final, ao precipitado de CMMO foi
acrescentado o meio de cultura (DMEM suplementado com 20% de soro fetal
bovino, GIBCO/BRL) adicionado de 100unidades/mL de penicilina e 100µg/mL de
estreptomicina. As células foram contadas em câmara de Neaubauer e ajustadas
para 5x106 células/mL para serem administradas nos animais de acordo com o
grupo experimental.
2.6.3 Neurotmese Experimental
Antes do procedimento cirúrgico para causar lesão do nervo ciático
(neurotmese), os animais foram anestesiados com uma solução, via intramuscular,
de Cloridrato de Xilazina a 2% e Cloridrato de Ketamina em uma quantidade de 0,2
ml da solução para cada 100g de peso do animal (MASSONE, 2008). Foi realizada a
tricotomia e a assepsia da região posterior da coxa direita, seguidas de uma incisão
na pele desta região, e os músculos glúteos máximo e médio e isquiotibiais
rebatidos para visualização do nervo ciático. A lesão nervosa foi realizada através de
uma transecção com tesoura cirúrgica a uma distância de 1cm proximal a bifurcação
do nervo. O defeito foi imediatamente reconstituído com o tubo de biopolímero da
cana-de-açúcar (comprimento de 9mm e diâmetro de 2,3mm). Os epineuros dos
cotos neurais foram suturados a 2mm de distância das extremidades do tubo,
ficando os cotos afastados entre si por uma distância de aproximadamente 5mm
(distância suficiente para que, durante o período do experimento, ocorresse a
regeneração do nervo e a consequente repercussão no tecido muscular). Ou seja,
as extremidades do nervo foram completamente introduzidas no interior do lúmen do
tubo produzindo um compartimento fechado (BRAGA-SILVA et al., 2006). Nos GLT
e GLTU, foi administrada a suspensão de células (células monucleares, meio de
cultura e BD Matrigel™), e, nos GL e GLU, apenas meio de cultura e BD Matrigel™
(BD Bioscience) preenchendo o tubo com um volume total de 20μL. Analgésico e
antibiótico foram administrados, via intramuscular, ambos em dose única de 0,1ml
por 100g do animal, em todos os animais cirurgiados.
23
2.6.4 Aplicação do Ultrassom Terapêutico Pulsátil
Um dia após a neurotmese, foi iniciado o tratamento com o UT com protocolo
semelhante ao utilizado por Chang e Hsu (2004), na modalidade pulsátil, com
cabeçote de aplicação com área efetiva de 1cm², na frequência de 1MHz, com
intensidade de 0,5 W/cm², e pulso com frequência de 100Hz e duração de 2ms
[razão de 1:5 (20%)]. O tratamento consistiu de 12 sessões em dias consecutivos,
sendo de 5min/dia, na região próxima a incisão (cobrindo uma área total de 5cm2)
para evitar inflamações. Utilizou-se um hidrogel como meio condutor para aplicação
do UT. O equipamento utilizado foi o SONOPULSE (Ibramed). Os animais dos
grupos sem tratamento com UT (GL e GLT) receberam manuseio idêntico com uso
do cabeçote do ultrassom desligado, para proporcionar a todos o mesmo nível de
estresse.
2.6.5 Análise Funcional da Marcha
Realizada através do cálculo do Índice Funcional do Ciático (IFC), que
consiste da análise das impressões das pegadas das patas traseiras dos animais. O
protocolo adotado foi semelhante ao utilizado por Monte-Raso, Barbieri e Mazzer
(2006), em que as patas posteriores dos animais foram tingidas com tinta de
carimbo e os mesmos colocados para deambular sobre papel sulfite em uma
passarela (10cm de largura x 60cm de comprimento) (Figura 1). Três antes da 1ª
medição, os animais eram postos para deambular na passarela, para conhecerem e
se habituarem a ela. Foram realizadas 7 medições, em todos os grupos estudados:
na semana anterior ao procedimento cirúrgico; no 13º dia pós-operatório; e nas 6ª,
8ª, 10ª e 12ª semanas pós-neurotmese. Para o cálculo do IFC, utilizou-se a seguinte
fórmula proposta por De Medinaceli, Freed e Wyatt (1982) e modificada por Bain,
Mackinnon e Hunter (1989):
8,83,135,1093,38 −⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
×+⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
×+⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
×−=NIT
NITEITNTS
NTSETSNPL
NPLEPLIFC
sendo N patas normais, E patas operadas, PL comprimento da pegada, TS abertura
total dos dedos, e IT abertura dos dedos intermediários. O valor obtido a partir dessa
fórmula indicaria o grau de funcionalidade da marcha do animal, logo, quanto mais
próximos de 0 (zero) fossem os valores, mais funcional estava a marcha desse
24
animal, assim como quanto mais próximos de -100, menos funcional estava a
marcha desse animal.
2.6.6 Coleta do Material, Eutanásia dos Animais e Procedimentos para
Imunofluorescência
A coleta do tecido muscular foi realizada 14 semanas após o procedimento
cirúrgico. Os animais foram anestesiados com uma solução de Cloridrato de Xilazina
a 2% e Cloridrato de Ketamina em uma quantidade de 0,2 ml da solução para cada
100g de peso do animal (MASSONE, 2008). Foram realizadas a tricotomia e a
assepsia, seguidas de uma incisão na porção posterior da pata direita de cada
animal para visualização do tecido muscular. Em seguida dissecou-se o músculo
sóleo, isolando-o dos músculos gastrocnêmios e coletado-o através de uma secção
na sua inserção proximal, ao nível do côndilo femoral, e outra mais distal, ao nível de
sua inserção no calcâneo. Em seguida foi aferido o peso muscular.
O músculo coletado foi recoberto com talco (para protegê-lo do congelamento
instantâneo) e colocado em um recipiente contendo Tissue-Tek® OCT™ Compound
(Sakura). Este recipiente foi imerso em um Falcon (50mL) contendo isopentano,
imerso em nitrogênio líquido (-160ºC). Após o congelamento, o recipiente com o
material coletado foi estocado em um freezer (-80ºC) para posteriormente ser
cortado transversalmente (8µm) em criostato (-27ºC), e montado em lâmina pré-
preparada com APES (para impedir a saída do material da lâmina durante a
imunofluorescência).
Após a coleta do tecido muscular todos os animais foram eutanasiados
recebendo uma injeção de 1mL, via intracardíaca, de Cloreto de Potássio (KCl) a
10%.
Figura 1. Passarela utilizada para a análise funcional da marcha.
25
Posteriormente, o tecido coletado de 2 animais de cada grupo foi selecionado
para ser realizada a análise da tipologia das fibras musculares. Para isto, foi utilizada
a técnica de imunofluorescência, identificando assim a miosina lenta (característica
das fibras musculares tipo I) e a miosina rápida (característica das fibras musculares
tipo II). Nessa técnica, o material foi lavado com solução de Triton 0,3% (300µL em
TBS 0,05M 100mL), bloqueado com solução de leite desnatado em pó 3% em TBS
0,05M por 1h à temperatura ambiente, e incubado overnight com os anticorpos
primários anti-miosina esquelética lenta (M-8421, [1:100], produzido em
camundongo, Sigma-Aldrich) e anti-miosina esquelética rápida (M-4276, [1:100],
produzido em camundongo, Sigma-Aldrich), diluídos em solução de bloqueio
(BSA+PBS+TWEEN20). Posteriormente o material foi incubado (45min) com o
anticorpo secundário anti-camundongo ([1:200], purificado em cabra, Jackson)
conjugado com fluorocromo Cy2, diluído em solução de bloqueio
(BSA+PBS+TWEEN20). Posteriormente foi incubado (3min) com DAPI, [1:1000],
diluído em TBS, para identificação dos núcleos celulares.
2.7 Análise de Dados
2.7.1 Análise dos Resultados
Cada animal recebeu um número de identificação para que os avaliadores
não soubessem identificar a que grupos pertenciam. A massa corpórea foi
verificada, em balança digital, no início do experimento e no dia da coleta do tecido
muscular.
Para análise do IFC, das pegadas obtidas, o par mais nítido de cada animal
em cada medição foi selecionado e digitalizado em uma impressora (HP C3100)
acoplada a um microcomputador. Essas imagens foram analisadas, separadamente,
por três avaliadores utilizando o Software Image Tool 3.0, e, após ser feita uma
média, o IFC final daquele animal foi obtido. Quando não era possível se obter
nenhum par nítido de pegadas de algum animal após a lesão, adotava-se o valor
-100 automaticamente ao IFC desse animal (DIJKSTRA et al., 2000).
A mensuração do peso do músculo sóleo foi realizada em uma balança de
precisão (AdventurerTM - Ohaus) imediatamente após sua coleta.
26
As lâminas obtidas pelo processamento do músculo sóleo foram fotografadas
em um microscópio de fluorescência (Axion Observer.Z1, ApoTome, ZEISS) com
câmera acoplada, conectado a um microcomputador. Para captura das imagens foi
utilizado o Software Axion Vision, e foram feitas 5 imagens de cada lâmina
utilizando-se a objetiva de 20x. Através da quantificação do número de pixels de
cada imagem, pelo Software Gimp 2.8, foi possível identificar a proporção de
miosina rápida e lenta em cada musculo coletado.
Os valores proporcionais das miosinas foram expressos em porcentagem (%).
2.7.2 Análise Estatística
O teste de comparação de médias aplicado foi o teste de Kruskal-Wallis para
identificação da diferença entre os 5 grupos. Em caso de diferença estatística, era
aplicado o teste de Mann-Whitney, para a localização de onde havia essa diferença.
Com os dados, foi construído um banco de dados no Software Excel 2003 e a
análise estatística foi realizada pelo Software SPSS 18.0. Adotou-se uma margem
de segurança de 95% de confiabilidade. Os dados foram expressos em média e
desvio padrão.
27
3 RESULTADOS
_______________________________________________________________
3.1 Artigo Original 1 Artigo submetido para publicação na Revista Brasileira de Fisioterapia (ISSN 1413-
3555) – Conceito A2 para a área 21 da CAPES (ANEXO B). Sua formatação está de
acordo com as normas da revista.
Título Completo: ANÁLISE FUNCIONAL DA MARCHA DE RATOS PÓS-
NEUROTMESE SUBMETIDOS À TERAPIA COM CÉLULAS MONONUCLEARES
DA MEDULA ÓSSEA ASSOCIADA AO TRATAMENTO COM ULTRASSOM
TERAPÊUTICO
Título Resumido: ANÁLISE FUNCIONAL DA MARCHA DE RATOS...
Autores: Kamilla Dinah Santos de Lira1, Raissa Thais Belarmino da Silva2, Thainá
de Gomes Figueiredo2, Anna Karollyna de Brito Nascimento2, Rodrigo Fragoso de
Andrade3, Silvia Regina Arruda de Moraes4.
1Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia, Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE), Recife, PE, Brasil. 2Departamento de Fisioterapia, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE),
Recife, PE, Brasil. 3Departamento de Fisioterapia, Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza,
CE, Brasil. 4Departamento de Anatomia, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife,
PE, Brasil.
Palavras-chave: Lesão do Nervo Periférico, Reabilitação, Índice Funcional do
Ciático. Keywords: Peripheral Nerve Injuries, Rehabilitation, Sciatic Functional Index.
28
Resumo Contextualização: Lesões dos nervos periféricos são graves e levam a alterações
musculares. Há uma procura por recursos que otimizem o processo de regeneração
nervosa, na tentativa de diminuir suas consequências no tecido muscular.
Objetivos: Avaliar funcionalmente a utilização da terapia com células
mononucleares da medula óssea (CMMO) associada à aplicação do ultrassom
terapêutico (UT) no processo de reinervação do tecido muscular desnervado após
lesão total do nervo ciático. Método: Os ratos foram distribuídos em grupo controle
(GC) e 4 grupos submetidos a neurotmese do nervo ciático [lesionado (GL), tratado
com CMMO (GLT), tratado com UT (GLU), tratado com CMMO+UT (GLTU)]. No 1º
dia pós-neurotmese, foi iniciado o UT pulsátil (1MHz; 0,5W/cm²; frequência de pulso
- 100Hz; duração de pulso - 2ms, 1:5), e o tratamento durou 12 dias. O índice
funcional do ciático (IFC) foi avaliado na semana anterior a neurotmese, no 13º dia
pós-neurotmese e quinzenalmente até a 12ª semana. Para análise estatística foi
aplicado o teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Mann-Whitney (p<0,05).
Resultados: Observou-se redução nos valores médios do IFC já no 13º dia pós-
neurotmese, em todos os grupos submetidos à lesão nervosa (GL=-95,23±11,69,
GLT=-78,21±24,09, GLU=-73,53±11,71 e GLTU=-70,74±14,62) em relação ao GC
(-13,29±17,06), diferença essa encontrada ao longo de todo o experimento. Os
grupos tratados com ultrassom terapêutico (GLU e GLTU) apresentaram valores
médios do IFC mais altos em relação ao GL apenas no 13º dia pós-neurotmese.
Conclusões: No 13º dia pós-neurotmese, o UT atuou melhorando a funcionalidade
da marcha, mas essa melhora não foi observada ao longo do experimento.
Abstract Background: Injuries of peripheral nerves are serious and leads to muscle
disorders. There is a demand for resources that optimize the process of nerve
regeneration, reducing their effect on muscle tissue. Objectives: Evaluate
functionally the use of bone marrow mononuclear cell (BMMC) therapy associated
with the application of therapeutic ultrasound (TU) in the reinnervation process of the
denervated muscle tissue after total lesion of the sciatic nerve. Method: The rats
were distributed into control group (CG) and 4 groups underwent neurotmesis of
sciatic nerve [injured (IG), treated with BMMC (IGT), treated with TU (IGU), treated
with BMMC+TU (IGTU)]. On the 1st day post-neurotmesis pulsed TU (1MHz;
29
0.5W/cm²; pulse rate - 100Hz, pulse duration - 2ms, 1:5) was initiated, and the
treatment lasted 12 days. The sciatic functional index (SFI) was evaluated in the
week prior the neurotmesis, the 13th post-neurotmesis day and fortnightly until the
12th week. For statistical analysis we used Kruskal-Wallis test followed by Mann-
Whitney test (p<0.05). Results: A reduction in mean SFI was observed already on
13th post-neurotmesis day in all groups subjected to nerve injury (IG=-95,23±11,69,
IGT=-78,21±24,09, IGU=-73,53±11,71 e IGTU=-70,74±14,62) compared to CG
(-13,29±17,06), this difference was found all along the experiment. The groups
treated with therapeutic ultrasound (IGU and IGTU) showed mean of the SFI higher
than IG only on 13th post-neurotmesis day. Conclusions: On 13th post-neurotmesis
day, TU acted improving the functionality of the march, but this improvement was not
observed during the experiment.
30
INTRODUÇÃO Lesões de nervos periféricos são injúrias graves que induzem a perda parcial
ou completa1 da transmissão de impulsos nervosos2, e da função motora e
sensorial1, levando a alterações musculares de aspecto metabólico, biomecânico,
estrutural e fisiológico3. A desnervação prolongada do tecido muscular acarreta em
progressiva atrofia das fibras musculares, ocasionando na perda da sua integridade
e sua morte4.
A reinervação é estritamente necessária para restabelecer a excitabilidade, a
integridade morfológica e a função da fibra muscular4, entretanto, a reinervação só
será bem sucedida se houver a presença de fibras musculares5. Por este motivo é
fundamental que as intervenções visando a reparação nervosa sejam realizadas o
mais precocemente para assegurar uma recuperação muscular eficaz4.
Nesse sentido, pesquisas têm sido realizadas em busca de estratégias que
possam otimizar essa recuperação6. A maioria delas são de caráter experimental e
seus desfechos são avaliados principalmente através de parâmetros
eletrofisiológicos e/ou histomorfométricos7. Embora estes sejam úteis, é importante
também conhecer o grau de recuperação funcional que estão relacionados2,8.
Novas estratégias de bioengenharia para recuperação de lesões do Sistema
Nervoso Periférico têm se concentrado no desenvolvimento de tratamentos que
promovam um aumento da recuperação e dos resultados funcionais através do
direcionamento do brotamento axonal a partir do nervo proximal9. No momento, o
foco das pesquisas está na combinação de materiais e biomoléculas para criar
novos compostos materiais que possam estimular ativamente à regeneração
nervosa9. Nesse sentido, a terapia com células mononucleares da medula óssea
(CMMO) aparece como uma alternativa, pois tem demonstrado potencial
regenerativo e neuroprotetor após lesão nervosa10,11.
Além dos recursos biológicos, alguns estudos experimentais tem também
utilizado o ultrassom terapêutico no tratamento de lesões de nervos
periféricos2,6,12,13,14,15 obtendo resultados promissores.
Percebe-se na literatura, entretanto, que muitos dos estudos que tratam o
tecido nervoso periférico lesionado a partir de recursos que possam otimizar
processo de regeneração nervosa focalizam sua atenção na estrutura do próprio
tecido nervoso, sem especificar a evolução dessa recuperação sobre o tecido
muscular.
31
Por esse motivo, este estudo avaliou funcionalmente a utilização da terapia
com CMMO associada à aplicação do ultrassom terapêutico (UT) pulsátil no
processo de regeneração nervosa e reinervação do tecido muscular desnervado
após lesão total do nervo ciático.
MÉTODO Foram utilizados 32 ratos, machos, albinos, da linhagem Wistar, (idade inicial
entre 67 e 71 dias de vida e massa corpórea média de 290g), mantidos em ciclo de
luz invertido claro/escuro (12h/12h), temperatura de 23 ± 2°C, e ração e água ad
libitum. Para obtenção da medula óssea foram utilizados 6 ratos com as mesmas
características dos animais em estudo. Os animais foram distribuídos em 5 grupos,
sendo 1 Grupo Controle (GC, n=6), não submetido a lesão e aos tratamentos, e 4
grupos submetidos a lesão nervosa: Grupo Lesão (GL, n=6) – não submetido aos
tratamentos; Grupo Lesão + Terapia Celular (GLT, n=7) – tratado com CMMO;
Grupo Lesão + Ultrassom Terapêutico (GLU, n=6) – tratado com UT; e Grupo Lesão
+ Terapia Celular + Ultrassom Terapêutico (GLTU, n=7) – tratado com CMMO e com
UT. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da
Universidade Federal de Pernambuco (nº: 23076.020636/2009-36).
Obtenção das Células Mononucleares da Medula Óssea
Os 6 animais foram anestesiados para coleta dos seus fêmures e tíbias. Em
seguida, as epífises foram removidas, a medula óssea aspirada e centrifugada a
1200rpm por 30 min, para promover o isolamento das células mononucleares por
gradiente de Ficoll. Em seguida, ajustou-se o volume de células mononucleares para
40mL, com adição de solução salina estéril, seguido de nova centrifugação a
1800rpm, por 10 min. Por fim, ao precipitado (fração de CMMO) foi acrescentado o
meio de cultura (DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino, GIBCO/BRL)
adicionado de 100 unidades/mL de penicilina e 100µg/mL de estreptomicina. As
células eram contadas em câmara de Neaubauer e ajustadas para 5x106 células/mL
para serem administradas nos animais.
Neurotmese Experimental
Após anestesia com uma solução de cloridrato de xilazina a 2% e cloridrato
de ketamina (0,2 ml da solução/100g de peso do animal), foi realizada uma incisão
na pele da região posterior da coxa direita dos animais, exceto no GC, para
exposição do nervo ciático. A transecção nervosa foi realizada a uma distância de
32
1cm proximal a bifurcação do nervo. O defeito era imediatamente reconstituído com
o tubo de biopolímero da cana-de-açúcar (comprimento de 9mm e diâmetro de
2,3mm). Os epineuros dos cotos neurais foram suturados as extremidades do tubo,
ficando os cotos afastados entre si por uma distância de aproximadamente 5mm.
Nos GLT e GLTU, foi administrada a suspensão de células (células monucleares,
meio de cultura e BD Matrigel™), e, nos GL e GLU, apenas meio de cultura e BD
Matrigel™ (BD Bioscience) preenchendo o tubo com um volume total de 20μL. No
pós-operatório, foram administrados analgésico e antibiótico em todos os animais
cirurgiados.
Aplicação do Ultrassom Terapêutico Pulsátil
Um dia após a neurotmese, foi iniciado o tratamento com o UT com protocolo
semelhante ao utilizado por Chang e Hsu13, na modalidade pulsátil, cabeçote de
aplicação com área efetiva de 1cm2, frequência de 1MHz, intensidade de 0,5 W/cm2,
pulso com frequência de 100Hz e duração de 2ms [razão de 1:5 (20%)]. Foram
realizadas 12 sessões consecutivas, sendo 5min/dia, próximo a incisão (cobrindo
uma área total de 5cm2) para evitar inflamações. Utilizou-se um hidrogel como meio
condutor para aplicação do UT. Os animais dos grupos sem tratamento com UT (GL
e GLT) receberam manuseio idêntico com uso do cabeçote do ultrassom desligado.
Análise Funcional da Marcha
Foi avaliada utilizando-se o cálculo do Índice Funcional do Ciático (IFC),
segundo Monte-Raso et al.8. Três antes da 1ª medição, os animais eram postos para
deambular na passarela, para conhecerem e se habituarem a ela. Foram realizadas
7 medições, em todos os grupos estudados: na semana anterior ao procedimento
cirúrgico; no 13º dia pós-operatório; e quinzenalmente até a 12ª semana pós-
neurotmese. Para o cálculo do IFC, utilizou-se a seguinte fórmula proposta por De
Medinaceli et al.16 e modificada por Bain et al.17: IFC=-38,3[(EPL-
NPL)/NPL]+109,5[(ETS-NTS)/NTS]+13,3[(EIT-NIT)/NIT]-8,8. Sendo N patas normais,
E patas operadas, PL comprimento da pegada, TS abertura total dos dedos, e IT
abertura dos dedos intermediários. Quanto mais próximos de 0 (zero) os valores
mais funcional é a marcha, e quanto mais próximos de -100, menos funcional. Cada
animal recebeu aleatoriamente um número de identificação para que os avaliadores
não soubessem identificar a que grupos pertenciam. Das pegadas obtidas, o par
mais nítido de cada animal em cada medição foi selecionado e digitalizado. As
imagens foram analisadas, separadamente, por três avaliadores utilizando o
33
Software Image Tool 3.0, e obtida uma média do IFC para cada animal. Quando não
era possível se obter nenhum par nítido de pegadas de algum animal após a lesão,
adotava-se o valor -100 automaticamente ao IFC desse animal7.
Análise Estatística
Os valores foram expressos em média ± desvio padrão, e foi aplicado o teste
estatístico de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Mann-Whitney, quando havia
diferença significativa entre os grupos (Software SPSS 18.0). Adotou-se uma
margem de segurança de 95% de confiabilidade.
RESULTADOS
Houve uma perda amostral no grupo GLT após o procedimento cirúrgico,
devido a morte do animal, causa desconhecida. Observou-se uma redução nos
valores médios do IFC, a partir da 2ª avaliação (13º dia pós-neurotmese), em todos
os grupos submetidos à lesão nervosa (GL, GLT, GLU e GLTU). Os grupos
submetidos ao tratamento com ultrassom terapêutico (GLU e GLTU) apresentaram
valores médios mais altos em relação ao grupo lesão (GL) no 13º dia pós-
neurotmese. Outro dado percebido foi a redução do IFC na 4ª semana pós-
neurotmese do GLT em comparação ao GL (Tabela 1).
DISCUSSÃO O objetivo do atual estudo foi avaliar se a associação da terapia com células
mononucleares oriundas da medula óssea com o ultrassom terapêutico poderia
acelerar a regeneração nervosa a ponto de melhorar a funcionalidade da marcha em
animais pós-neurotmese.
É sabido que o tecido nervoso periférico lesionado tem a capacidade de se
regenerar e que várias técnicas são estudadas com a finalidade de auxiliar e
otimizar essa recuperação. Isso é de extrema importância uma vez que o tecido
muscular desnervado pode desenvolver contraturas em longo prazo, interferindo,
assim, na marcha18 e sua funcionalidade.
Sob condições atróficas, existe desequilíbrio entre a degradação e a síntese
das proteínas do músculo esquelético, desencadeando uma redução do teor de
proteína responsável pela manutenção das propriedades intrínsecas do tecido
muscular19. Sakakima et al.20, em um estudo experimental que utilizou o
congelamento do nervo ciático como modelo de lesão nervosa, observaram que a
34
reinervação teve um papel crucial na recuperação da atrofia do músculo sóleo e
provavelmente esteve envolvida no restabelecimento da integridade funcional do
músculo esquelético estudado.
Neste estudo, embora os grupos tratados com o ultrassom terapêutico (GLU e
GLTU) tenham demonstrado no 13º dia pós-neurotmese valores do IFC mais
próximos da normalidade, ou seja, mais próximos de 0, esse achado não pôde ser
observado ao longo de todo o experimento, possivelmente devido ao padrão de
marcha adotado pelos animais que não permitia, muitas vezes, a identificação dos
pontos-chaves necessários para o cálculo do IFC. Uma pesquisa comparando três
métodos diferentes para análise funcional da marcha corroborou nossos achados ao
demonstrar uma diminuição na quantidade de pegadas mensuráveis a partir da 10ª
semana pós-operatória devido ao arrastar do membro lesionado em substituição do
padrão de marcha em passos7.
Mesmo os estudos que utilizam modelo de lesão nervosa menos agressiva,
como por exemplo, esmagamento do nervo, descrevem dificuldade de avaliar a
marcha nas 2 ou 3 semanas iniciais após a lesão já devido a uma paralisia da pata
operada8 e grande deformidade, ocasionando uma queda da pata e padrão dos
dedos em garra, não permitindo uma pegada confiável21.
Precocemente já podem ser observadas atrofia, redução da tensão e da
força, e alteração na contratilidade muscular3. Pellegrino e Franzini22 encontraram
uma grande redução na massa muscular e no diâmetro das fibras musculares já nos
primeiros 15 dias depois da lesão nervosa. As pesquisas citadas corroboram o
presente estudo, uma vez que, demonstram que tais alterações musculares
interferem na deambulação possivelmente desde a 2ª semana pós-lesão.
Diversos estudos com cultura de células-tronco diferenciadas têm
demonstrado boa resposta da regeneração nervosa e mais acelerada recuperação
da função motora2,23,24,25, diferindo, assim, dos achados do presente estudo onde
foram utilizadas CMMO. A medula óssea apresenta distintas populações de células
progenitoras: progenitoras de células endoteliais26; progenitoras hematopoiéticas; e
progenitoras mesenquimais27, estas representam <0,01% das CMMO28. Isto sugere
que, no atual estudo, a concentração de células-tronco mesenquimais, por ser mais
baixa em relação a estudos com cultura de células, não tenha sido suficiente para se
obter uma resposta regenerativa na mesma velocidade a ponto de evitar o
desenvolvimento das alterações musculares no membro lesionado.
35
Porém vale salientar que as CMMO, quando comparadas às células-tronco
mesenquimais, apresentam a vantagem de não necessitarem de determinado tempo
em meio de cultura para permitir seu isolamento e expansão antes do transplante28.
O que justifica o motivo da escolha das células utilizadas neste estudo.
No que se refere a aplicação do UT, Akhlaghi et al.15 compararam 19
protocolos diferentes de UT para o tratamento de uma lesão parcial do nervo ciático
durante 14 dias intermitentes a partir do 2º dia pós-operatório, e demonstraram
melhores resultados com um protocolo semelhante ao adotado neste experimento
(diferindo o período de aplicação diária que era de 2min). Este dado reforça a
escolha do protocolo de tratamento adotado no presente estudo, apesar de se tratar
de modelos de lesão nervosa com gravidade e processo de recuperação distintos.
Alguns estudos com lesão nervosa por esmagamento (modelo de lesão
nervosa parcial) que avaliaram a funcionalidade da marcha, porém com diferentes
protocolos de tratamento com UT, relataram uma influência positiva deste recurso
terapêutico na regeneração dos nervos periféricos lesados2,12,14. O nervo periférico
lesionado passa por uma resposta sofisticada, que depende da gravidade da lesão e
do processo de degeneração29, logo uma lesão nervosa parcial apresenta
mecanismo e tempo de reparo diferentes de uma lesão nervosa total. Isso nos leva a
sugerir que o protocolo de UT adotado não foi eficaz o suficiente a ponto de acelerar
a regeneração nervosa antes do desenvolvimento das alterações na estrutura
muscular.
Concluindo, no 13º dia pós-neurotmese, o UT atuou melhorando a
funcionalidade da marcha, mas essa melhora não foi observada ao longo do
experimento, entretanto, mesmo não havendo resultados que apontem para valores
de normalidade do IFC, não é o ideal supor que não houve uma regeneração
nervosa, uma vez que a recuperação funcional da marcha não depende apenas da
integridade do tecido nervoso, e sim concomitantemente da presença de outros
fatores, entre eles a integridade do tecido muscular. Portanto, a utilização de um
programa de reabilitação musculoesquelética associado às técnicas usadas nesse
estudo, parece ser um procedimento viável para estimular a regeneração nervosa
juntamente com a manutenção da estrutura muscular.
AGRADECIMENTOS
36
À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco –
FACEPE (nº dos processos: PBPG-0732-4.08/10 e APQ-0710-4.08/10) pelo apoio
financeiro.
REFERÊNCIAS 1. Chabas JF, Alluin O, Rao G, Garcia S, Lavaut M-N, Legré R., et al. FK506
Induces changes in muscle properties and promotes metabosensitive nerve fiber
regeneration. J Neurotrauma. 2009;26:97-108.
2. Monte-Raso VV, Barbieri CH, Mazzer N, Fazan VPS. Os efeitos do ultra-som
terapêutico nas lesões por esmagamento do nervo ciático de ratos: análise
funcional da marcha. Rev Bras Fisioter. 2006;10(1):113-9. Portuguese.
3. Midrio M. The denervated muscle: facts and hypotheses. A historical review. Eur
J Appl Physiol. 2006;98:1-21.
4. Grumbles RM, Sesodia S, Wood PM, Thomas CK. Neurotrophic factors improve
motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons.
J Neuropathol Exp Neurol. 2009;68(7):736-46.
5. Miyamaru S, Kumai Y, Ito T, Yumoto E. Effects of long-term denervation on the
rat thyroarytenoid muscle. Laryngoscope. 2008;118:1318-23.
6. Crisci AR, Ferrera AL. Low-intensity pulsed ultrasound accelerates the
regeneration of the sciatic nerve after neurotomy in rats. Ultrasound in Med &
Biol. 2002; 28(10):1335-41.
7. Dijkstra JR, Meek MF, Robinson PH, Gramsbergen A. Methods to evaluate
functional nerve recovery in adult rats: walking track analysis, video analysis and
the withdrawal reflex. J Neurosci Methods. 2000;96:89-96.
8. Monte-Raso VV, Barbieri CH, Mazzer N. Sciatic functional index in smashing
injuries of rats’ sciatic nerves. Evaluation of method reproducibility among
examiners. Acta Ortop Bras. 2006;14(3):133-6.
9. Schmidt CE, Leach JB. Neural tissue engineering: strategies for repair and
regeneration. Annu Rev Biomed Eng. 2003;5:293-347.
10. Usach V, Goitia B, Lavalle L, Vivot RM, Setton-Avruj P. Bone marrow
mononuclear cells migrate to the demyelinated sciatic nerve and transdifferentiate
into Schwann cells after nerve injury: attempt at a peripheral nervous system
intrinsic repair mechanism. J Neurosci Res. 2011;89:1203-17.
37
11. Zaverucha-do-Valle C, Gubert F, Bargas-Rega M, Coronel JLL, Mesentier-Louro
LA, Mencalha A, et al. Bone marrow mononuclear cells increase retinal ganglion
cell survival and axon regeneration in the adult rat. Cell Transplant. 2011;20:391-
406.
12. Mourad PD, Lazar DA, Curra FP, Mohr BC, Andrus KC, Avellino AM, et al.
Ultrasound accelerates functional recovery after peripheral nerve damage.
Neurosurgery. 2001;48(5):1136-41.
13. Chang C-J, Hsu S-H. The effects of low-intensity ultrasound on peripheral nerve
regeneration in poly (DL-lactic acid-co-glycolic acid) conduits seeded with
Schwann cells. Ultrasound in Med & Biol. 2004;30(8):1079-84.
14. Monte-Raso VV, Barbieri CH, Mazzer N, Fazan VS. Can therapeutic ultrasound
influence the regeneration of peripheral nerves? J Neurosci Methods.
2005;142:185-92.
15. Akhlaghi Z, Mobarakeh JI, Mokhtari M, Behnam H, Rahimi AA, Hosseini MSK, et
al. The effects of altered ultrasound parameters on the recovery of sciatic nerve
injury. Iran Biomed J. 2012;16(2):107-12.
16. De Medinaceli L, Freed WJ, Wyatt RJ. An index of the functional condition of rat
sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Exp Neurol.
1982;77(3):634-43.
17. Bain JR, Mackinnon SE, Hunter DA. Funcional evaluation of complete sciatic,
peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plast Reconstr Surg.
1989;83(1):129-38.
18. Dellon AL, Mackinnon SE. Sciatic nerve regeneration in the rat. Validity of walking
track assessment in the presence of chronic contractures. Microsurgery.
1989;10(3):220-5.
19. Brito VC, Oliveira BDR, Moraes SRA. Effects of immobilization on rat skeletal
muscle tissue. J Morphol Sci. 2011;28(4):217-21.
20. Sakakima H, Yoshida Y, Morimoto N, Sakae K. The effect of denervation and
subsequent reinnervation on the morphology of rat soleus muscles. J Phys Ther
Sci. 2002;14(1):21-6.
21. Monte-Raso VV, Barbieri CH, Mazzer N, Yamasita AC, Barbieri G. Is the sciatic
functional index always reliable and reproducible? J Neurosci Methods.
2008;170(2):255-61.
38
22. Pellegrino C, Franzini C. An electron microscope study of denervation atrophy in
red and white skeletal muscle fibers. J Cell Biol. 1963;17(2):327-49.
23. Braga-Silva J, Gehlen D, Roman JA, Menta C, Atkinson EA, Machado DC, et al.
Bone marrow stem cells and platelet-rich plasma effects on nervous regeneration
and functional recovery in an acute defect model of rats’ peripheral nerve. Acta
Ortop Bras. 2006;14(5):273-5.
24. Cheng FC, Tai MH, Sheu ML, Chen CJ, Yang DY, Su HL, et al. Enhancement of
regeneration with glia cell line-derived neurotrophic factor-transduced human
amniotic fluid mesenchymal stem cells after sciatic nerve crush injury. J
Neurosurg. 2010;112(4):868-79.
25. Uemura T, Takamatsu K, Ikeda M, Okada M, Kazuki K, Ikada Y, et al.
Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived neurospheres for
peripheral nerve repair. Biochem Biophys Res Commun. 2012;419(1):130-5.
26. Herzog EL, Chai L, Krause DS. Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood.
2003;102(10):3483-93.
27. Tohill M, Terenghi G. Stem-cell plasticity and therapy for injuries of the peripheral
nervous system. Biotechnol Appl Biochem. 2004;40(Pt 1):17-24.
28. Souza CF, Napoli P, Han SW, Lima VC, Carvalho ACC. Células-tronco
mesenquimais: células ideais para a regeneração cardíaca? Rev Bras Cardiol
Invasiva. 2010;18(3):344-53. Portuguese.
29. Yegiyants S, Dayicioglu D, Kardashian G, Panthaki ZJ. Traumatic peripheral
nerve injury: a wartime review. J Craniofac Surg. 2010;21(4):998-1001.
39
Tabela 1. Índice Funcional do Ciático (IFC) durante o experimento IFC GC GL GLT GLU GLTU p Pré -21,41±6,95 -10,68±10,39 -16,81±8,75 -9,59±13,21 -2,67±15,57 0,079
13º Dia -13,29±17,06 -95,23a±11,69 -78,21a±24,09 -73,53a b±11,71 -70,74a b±14,62 0,001*
4ª Sem -13,13±13,97 -68,78a±8,56 -100,00a b±0,00 -81,59a c±18,71 -67,57a c±19,17 <0,001*
6ª Sem -3,75±8,05 -81,39a±23,35 -90,35a±18,47 -95,40a±7,83 -59,04a c d±9,76 <0,001*
8ª Sem -7,37±11,30 -96,11a±9,52 -78,57a±25,52 -98,35a±4,04 -83,07a±21,21 0,001*
10ª Sem -5,44±11,06 -94,20a±14,20 -100,00a±0,00 -96,79a±7,87 -90,87a±17,40 <0,001*
12ª Sem -13,55±17,99 -95,33a±11,43 -96,15a±9,44 -95,64a±10,68 -94,53a±14,48 0,001*
n 6 6 6 6 7 GC=Grupo Controle, GL=Grupo Lesão, GLT=Grupo Lesão + Terapia Celular, GLU=Grupo Lesão + Ultrassom Terapêutico, GLTU=Grupo Lesão + Terapia Celular + Ultrassom Terapêutico, Pré=Semana Pré-Neurotmese, 13º Dia=13º Dia Pós-Neurotmese, 4ª Sem=4ª Semana Pós-Neurotmese, 6ª Sem=6ª Semana Pós-Neurotmese, 8ª Sem=8ª Semana Pós-Neurotmese, 10ª Sem=10ª Semana Pós-Neurotmese, 12ª Sem=12ª Semana Pós-Neurotmese, n=Número de Amostras por Grupo. Valores expressos em média ± desvio padrão. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do Teste de Mann-Whitney. *p<0,05, aComparação com o GC; bComparação com o GL; cComparação com o GLT; dComparação com o GLU
39
40
3.2 Artigo Original 2 Título Completo: EFEITOS NO TECIDO MUSCULAR DA ASSOCIAÇÃO DA
TERAPIA COM CÉLULAS MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA E DO
TRATAMENTO COM ULTRASSOM TERAPÊUTICO EM RATOS APÓS
NEUROTMESE
Título Resumido: EFEITOS NO TECIDO MUSCULAR DA ASSOCIAÇÃO...
Autores: Kamilla Dinah Santos de Lira1, Rodrigo Fragoso de Andrade2, Deniele
Bezerra Lós1, Filipe Barbosa Cunha de Miranda3, Christina Alves Peixoto4, Celia
Maria Machado Barbosa de Castro5, Claudia dos Santos Mermelstein6, Silvia Regina
Arruda de Moraes7.
1Programa de Pós-Graduação em Fisioterapia, Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE), Recife, PE, Brasil. 2Departamento de Fisioterapia, Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza,
CE, Brasil. 3Departamento de Fisioterapia, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE),
Recife, PE, Brasil. 4Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães,
Recife, PE, Brasil. 5Departamento de Medicina Tropical, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE),
Recife, PE, Brasil. 6Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ),
Rio de Janeiro, RJ, Brasil. 7Departamento de Anatomia, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife,
PE, Brasil.
RESUMO Introdução: As alterações musculares geradas pela desnervação são grandes e
vão desde atrofia até a morte das fibras musculares, em longo prazo. Desse modo,
há a procura por recursos que auxiliem o processo de regeneração nervosa,
41
diminuindo suas consequências no tecido muscular. Objetivos: Avaliar as
repercussões no tecido muscular da associação da terapia com células
mononucleares da medula óssea (CMMO) com o ultrassom terapêutico (UT) no
processo de regeneração do nervo ciático pós-neurotmese. Método: Os ratos foram
distribuídos em grupo controle e 4 grupos submetidos a neurotmese do nervo ciático
(lesionado, tratado com CMMO, tratado com UT, tratado com CMMO+UT). No 1º dia
pós-neurotmese, foi iniciado o tratamento com UT pulsátil (1MHz; 0,5W/cm²;
frequência de pulso - 100Hz; duração de pulso - 2ms, 1:5), durante 12 dias. O peso
muscular foi aferido e as miosinas lenta e rápida foram quantificadas. Para análise
estatística foi aplicado o teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Mann-Whitney
(p<0,05). Resultados: Os grupos submetidos a terapia celular apresentaram
maiores pesos musculares (GLT=0,16±0,03 e GLTU=0,14±0,03) que o grupo lesão
(GL=0,10±0,03). Na quantificação da miosina lenta, observou-se redução dos
valores dos GL e GLTU (287180,90±116303,38 e 223735,60±139022,37,
respectivamente) quando comparados ao GC (431263,60±155049,13). Porém, na
quantificação da miosina rápida, observaram-se valores maiores nos grupos
submetidos à lesão nervosa (GL=540696,60±127965,28,
GLT=442849,40±206626,60, GLU=472530,00±257292,49 e
GLTU=422649,50±132208,06) quando comparados ao GC (244874,10±83173,14),
porém, o GLTU apresentou valores mais baixos em relação ao GL. Conclusões: A
terapia celular atuou reduzindo a atrofia do tecido muscular e restabelecendo a
quantidade de fibras lentas, enquanto que, o uso do UT de forma isolada foi eficaz
para aumentar a quantidade de fibras tipo I e associado à terapia celular foi mais
eficiente para reduzir os níveis de fibras tipo II.
Palavras-chave: Lesão do Nervo Periférico, Terapia Celular, Ultrassom Terapêutico,
Atrofia Muscular
42
INTRODUÇÃO Lesões de nervos periféricos são injúrias graves que induzem a perda parcial
ou completa da função motora e sensorial (CHABAS et al., 2009).
As alterações musculares geradas pela desnervação são muitas, e
precocemente já podem ser observadas atrofia, redução da tensão e da força, e
alteração na contratilidade muscular (MIDRIO, 2006), gerando em longo prazo a
perda da integridade das fibras musculares e sua morte (GRUMBLES et al., 2009).
Sob tais condições atróficas, existe desequilíbrio entre a degradação e a síntese das
proteínas do músculo esquelético, desencadeando uma redução do teor de proteína
responsável pela manutenção das propriedades intrínsecas do tecido muscular
(BRITO; OLIVEIRA; MORAES, 2011).
A reinervação é estritamente necessária para restabelecer a excitabilidade, a
integridade morfológica e a função da fibra muscular (GRUMBLES et al., 2009),
entretanto, só será bem sucedida se houver a presença de fibras musculares
(MIYAMARU et al., 2008). Por este motivo é fundamental que as intervenções
visando a reparação nervosa sejam realizadas o mais precocemente para assegurar
uma recuperação muscular eficaz (GRUMBLES et al., 2009).
Nesse sentido, novas estratégias de bioengenharia para recuperação de
lesões do Sistema Nervoso Periférico buscam o desenvolvimento de tratamentos
que promovam um aumento da recuperação e dos resultados funcionais através do
direcionamento do brotamento axonal a partir do coto proximal (SCHMIDT; LEACH,
2003). No momento, o foco das pesquisas está na combinação de materiais e
biomoléculas para criar novos compostos materiais que possam estimular
ativamente a regeneração nervosa (SCHMIDT; LEACH, 2003).
Diante disso, o uso da terapia utilizando células-tronco em lesões de nervos
periféricos é considerado uma das alternativas mais promissoras para o tratamento
de lesões nervosas (BRAGA-SILVA et al., 2006), uma vez que vários estudos têm
relatado seus benefícios sobre o processo regenerativo do nervo periférico após
lesões traumáticas (DEZAWA et al., 2001; BRAGA-SILVA et al., 2006; OLIVEIRA et
al., 2010; HU et al., 2013). Como a medula óssea apresenta distintas populações de
células progenitoras: células endoteliais (HERZOG; CHAI; KRAUSE, 2003);
hematopoiéticas; e mesenquimais (TOHILL; TERENGHI, 2004), uma alternativa de
terapia celular adicional é a utilização de células mononucleares da medula óssea
(CMMO). Estas apresentam a vantagem de não necessitarem de tempo em meio de
43
cultura para permitir seu isolamento e expansão antes do transplante (SOUZA et al.,
2010), em comparação às células-tronco mesenquimais.
Além dos recursos biológicos, alguns estudos experimentais tem também
avaliado o uso do ultrassom terapêutico (UT) no tratamento de lesões de nervos
periféricos (MOURAD et al., 2001; CRISCI; FERREIRA, 2002; CHANG; HSU, 2004;
MONTE-RASO et al., 2005; MONTE-RASO et al., 2006, AKHLAGHI et al., 2012)
obtendo resultados promissores no sentido de acelerar a regeneração nervosa.
Por esse motivo, neste estudo, buscou-se avaliar a utilização da terapia de
CMMO associada à aplicação do UT pulsátil no processo de regeneração nervosa,
reduzindo, assim, as alterações no tecido muscular desnervado.
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi desenvolvido no Laboratório de Plasticidade Neuromuscular
(LAPLAN) - Departamento de Anatomia da Universidade Federal de Pernambuco
(UFPE), em parceria com o Laboratório de Microbiologia Clínica - Laboratório de
Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), com o Departamento de Cirurgia Experimental
– UFPE, e com o Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (CETENE).
Utilizou-se 32 ratos, machos, albinos, da linhagem Wistar, com idade inicial
entre 67 e 71 dias de vida e massa corpórea média de 290g, mantidos em biotério
com ciclo de luz invertido claro/escuro (12h/12h), temperatura de 23 ± 2°C,
recebendo ração e água ad libitum, distribuídos em 5 grupos, sendo 1 Grupo
Controle (GC, n=6), não submetido a lesão e aos tratamentos, e 4 grupos
submetidos a lesão nervosa: Grupo Lesão (GL, n=6) – não submetido aos
tratamentos; Grupo Lesão + Terapia Celular (GLT, n=7) – tratado com CMMO;
Grupo Lesão + Ultrassom Terapêutico (GLU, n=6) – tratado com UT; e Grupo Lesão
+ Terapia Celular + Ultrassom Terapêutico (GLTU, n=7) – tratado com CMMO e com
UT. Para obtenção da medula óssea foram utilizados 6 ratos com as mesmas
características dos animais em estudo. O estudo foi aprovado pela Comissão de
Ética em Experimentação Animal da UFPE (nº: 23076.020636/2009-36).
Obtenção das Células Mononucleares Medula Óssea
Para a coleta da medula óssea, os fêmures e tíbias dos 6 animais foram
desarticulados e dissecados, após anestesia. Em seguida, as epífises foram
removidas, a medula óssea aspirada e encaminhada para centrifugação a 1200rpm
por 30 min, promovendo o isolamento das células mononucleares por gradiente de
44
Ficoll. Em seguida, foi adicionada uma solução salina estéril às células
mononucleares, ajustando-se o volume para 40mL, seguido de nova centrifugação a
1800rpm, por 10 min. Por fim, ao precipitado, que representava a fração de CMMO,
foi acrescentado o meio de cultura (DMEM suplementado com 20% de soro fetal
bovino, GIBCO/BRL) adicionado de 100 unidades/mL de penicilina e 100µg/mL de
estreptomicina. As células eram contadas em câmara de Neaubauer e ajustadas
para 5x106 células/mL para serem administradas nos animais.
Neurotmese Experimental
Após anestesia com uma solução de Cloridrato de Xilazina a 2% e Cloridrato
de Ketamina (0,2 ml da solução/100g de peso do animal), foi realizada uma incisão
na pele da região posterior da coxa direita dos animais, exceto no GC, para
exposição do nervo ciático. A transecção nervosa foi realizada a uma distância de
1cm proximal à bifurcação do nervo. O defeito foi imediatamente reconstituído com o
tubo de biopolímero da cana-de-açúcar (comprimento de 9mm e diâmetro de
2,3mm). Os epineuros dos cotos neurais foram suturados as extremidades do tubo,
ficando os cotos afastados entre si por uma distância de aproximadamente 5mm.
Nos GLT e GLTU, foi administrada a suspensão de células (células monucleares,
meio de cultura e BD Matrigel™), e, nos GL e GLU, apenas meio de cultura e BD
Matrigel™ (BD Bioscience) preenchendo o tubo com um volume total de 20μL. No
pós-operatório foram administrados analgésico e antibiótico em todos os animais
cirurgiados.
Aplicação do Ultrassom Terapêutico Pulsátil
No dia seguinte à neurotmese, foi iniciado o tratamento com o UT com
protocolo semelhante ao utilizado por Chang e Hsu (2004), na modalidade pulsátil,
cabeçote de aplicação com área efetiva de 1cm2, freqüência de 1MHz, intensidade
de 0,5 W/cm2, pulso com frequência de 100Hz e duração de 2ms [razão de 1:5
(20%)], consistindo de 12 sessões, 5min/dia, próximo a incisão para evitar
inflamações (cobrindo uma área total de 5cm2). Utilizou-se um hidrogel como meio
condutor para aplicação do UT. Os animais dos grupos sem tratamento com UT (GL
e GLT) foram manuseados de forma semelhante, porém com uso do cabeçote do
ultrassom desligado.
Coleta do Tecido Muscular
Para a coleta do tecido muscular, 14 semanas após o procedimento cirúrgico,
os animais foram anestesiados com uma solução de Cloridrato de Xilazina a 2% e
45
Cloridrato de Ketamina (0,2 ml da solução/100g de peso do animal), e foi realizada
uma incisão na região posterior da pata direita do animal, seguida de dissecação,
coleta e pesagem do músculo sóleo. O músculo coletado foi recoberto com talco e
colocado em um recipiente contendo Tissue-Tek® OCT™ Compound (Sakura),
resfriado em isopentano e congelado em nitrogênio líquido (-160ºC). O material foi
estocado em um freezer (-80ºC) e posteriormente seccionado transversalmente
(8µm) em criostato (-27ºC). Posteriormente, o tecido coletado de 2 animais de cada
grupo foi submetido a técnica de imunofluorescência, para identificação dos tipos de
miosinas. Foram utilizados os anticorpos primários anti-miosina esquelética lenta (M-
8421, [1:100], produzido em camundongo, Sigma-Aldrich) e anti-miosina esquelética
rápida (M-4276, [1:100], produzido em camundongo, Sigma-Aldrich) overnight,
seguidos do anticorpo secundário Cy2 anti- camundongo ([1:200], purificado em
cabra, Jackson), e do DAPI, [1:1000], para identificação dos núcleos celulares.
Foram feitas 5 imagens de cada lâmina em (Axion Observer.Z1, ApoTome, ZEISS)
com câmera acoplada, e, através da quantificação do número de pixels de cada
imagem (Software Gimp 2.8) foi possível identificar a proporção de miosinas lenta e
rápida em cada musculo avaliado.
Análise Estatística
Foi aplicado o teste estatístico de Kruskal-Wallis, para comparação das
médias, seguido do teste de Mann-Whitney, quando havia diferença significativa
entre os grupos (Software SPSS 18.0). Os valores foram expressos em média ±
desvio padrão e adotou-se uma margem de segurança de 95% de confiabilidade.
Os valores proporcionais das miosinas foram expressos em porcentagem (%).
RESULTADOS Houve uma perda amostral no grupo GLT após o procedimento cirúrgico,
devido a morte do animal por causa desconhecida. Observou-se que não houve
diferença entre os grupos estudados em relação aos valores médios da massa
corpórea no inicio e no fim do experimento (Tabela 1), demonstrando que a massa
corpórea dos animais não interferiu nos resultados obtidos para as demais variáveis.
Durante a coleta do músculo sóleo, houve uma perda amostral no grupo GL,
devido à perda de uma parte do tecido coletado. O peso muscular de todos os
grupos submetidos à lesão nervosa (GL, GLT, GLU e GLTU) demonstraram valores
médios inferiores ao GC, entretanto, os valores médios dos grupos submetidos a
46
terapia celular (GLT e GLTU) apresentaram-se maiores em relação ao GL (Tabela
2).
A quantificação da miosina lenta não demonstrou diferença entre os grupos
submetidos a apenas um tipo de intervenção isoladamente
(GLT=338197,40±136763,46 e GLU=347207,20±161931,26), quando comparados
ao GC (431263,60±155049,13), enquanto os GL e GLTU demonstraram valores
menores do que o GC (287180,90±116303,38 e 223735,60±139022,37,
respectivamente) (Figura 1A).
Na quantificação da miosina rápida, observou-se um aumento em todos os
grupos submetidos à lesão nervosa (GL=540696,60±127965,28,
GLT=442849,40±206626,60, GLU=472530,00±257292,49 e
GLTU=422649,50±132208,06) quando comparados ao GC (244874,10±83173,14).
Porém, o GLTU apresentou valores médios mais baixos em relação ao GL (Figura
1B).
Quanto à proporção de miosina lenta por grupo, observou-se uma redução
em todos os grupos submetidos à lesão nervosa (GL=34,69%, GLT=43,30%,
GLU=42,36% e GLTU=34,61%) em comparação ao GC (63,78%), enquanto que a
proporção de miosina rápida ocorreu o inverso (GC=36,22%, GL=65,31%,
GLT=56,70%, GLU=57,64% e GLTU=65,39%) (Figura 2).
DISCUSSÃO
A desnervação provoca atrofia progressiva dos músculos, com alterações
estruturais e ultraestruturais que conduzem à degeneração muscular, se a
reinervação não ocorrer (MIDRIO, 2006). Esse processo de atrofia é acompanhado
pela significante remodelação das células musculares e por uma progressiva perda
de estruturas específicas do tecido (BORISOV; DEDKOV; CARLSON, 2001), e está
associada a apoptose das células musculares, levando a uma diminuição gradativa
do peso muscular (CHEN et al., 2005). Pellegrino e Franzini (1963) descreveram o processo de atrofia muscular por
desnervação em duas modalidades: a primeira consistindo na degeneração dos
componentes das fibras numa área relativamente grande, relacionando-se com a
rápida redução no volume muscular que ocorre nos primeiros 15 dias após a secção
do nervo; e, a segunda, numa redução das dimensões individuais das fibrilas pela
saída dos filamentos periféricos para os espaços interfibrilares.
47
Neste estudo, foi observada uma redução do peso muscular em todos os
grupos submetidos a neurotmese. Dado também observado por Pellegrino e Franzini
(1963) desde a 1ª semana de desnervação, em um estudo com neurotomia do nervo
ciático. Além disso, Chen e colaboradores (2005) observaram uma redução do peso
mais rápida nos primeiros 28 dias e mais lenta nos 28 dias seguintes após a
neurotomia. Vale destacar que esses estudos observaram apenas o resultado da
desnervação sobre o tecido muscular, sem intervenção terapêutica. No presente
estudo, os grupos submetidos a terapia celular (GLT e GLTU), apesar de não terem
alcançado valores do peso muscular semelhantes ao GC, apresentaram valores
maiores que o GL, sugerindo um efeito benéfico da terapia com CMMO no processo
regenerativo nervoso, promovendo uma atenuação da atrofia muscular.
Contrariamente aos nossos resultados, Oliveira e colaboradores (2010),
utilizando cultura de células-tronco mesenquimais na reparação de uma neurotmese,
não observaram diferença no peso muscular dos grupos submetidos a lesão nervosa
quando comparados ao grupo controle. Vale destacar que o presente estudo utilizou
apenas células mononucleares, contendo <0,01% das células progenitoras
mesenquimais (SOUZA et al., 2010) sem haver nenhum acréscimo de fatores de
crescimento celular, o que pode ter determinado essa divergência de resultados,
tendo em vista a diferença na concentração de células mesenquimais utilizadas e na
qualidade da suspensão celular adicionada ao reparo nervoso.
Um dos fatores determinantes da proporção e da magnitude do processo de
atrofia no músculo desnervado é o tipo de fibra muscular (BORISOV; DEDKOV;
CARLSON, 2001), pois as fibras tipo I (de contração lenta) e as fibras tipo II (de
contração rápida) contêm diferentes isoformas de cadeia pesada de miosina, que
são as responsáveis pelas suas diferentes atividades ATPasícas e velocidades de
encurtamento (BACOU et al., 1996). Os níveis de atrofia das células musculares
individuais variam muito nas fibras de contração rápida e são mais homogêneos nas
fibras de contração lenta (BORISOV; DEDKOV; CARLSON, 2001).
Os resultados desse estudo demonstram que as duas intervenções (terapia
celular e UT) utilizadas de forma isolada conseguiram restabelecer a quantidade de
fibras musculares tipo I, diferentemente do ocorrido quando essas duas intervenções
foram utilizadas conjuntamente. Por outro lado, a associação entre a terapia celular
e o UT conseguiu reduzir a quantidade de fibras musculares tipo II quando
comparado ao GL, mesmo não sendo eficaz a ponto de reduzir a quantidade dessas
48
fibras aos patamares de normalidade. A expressão das isoformas miofibrilares lentas
são mais dependentes da inervação que as rápidas (MIDRIO, 2006), tornando-as
mais suscetíveis a desnervação, sugerindo que a utilização das intervenções
isoladamente pode ter acelerado o processo de regeneração nervosa a ponto de
não ter havido tempo necessário para as alterações observadas na expressão da
miosina lenta além da degeneração dos componentes das fibras tipo I. E o uso
associado dessas intervenções pode não ter acelerado tanto a regeneração nervosa
a ponto de evitar essas alterações, porém foi suficiente para se obter melhores
resultados que o GL.
Os estudos demonstram que a desnervação pós-neurotmese induz alterações
morfológicas e moleculares nos músculos de contração lenta e de contração rápida
(BACOU et al., 1996; BORISOV; DEDKOV; CARLSON, 2001), corroborando os
achados do presente estudo, uma vez que o percentual de fibras musculares tipo I
para todos os grupos submetidos a lesão nervosa foi reduzido e o percentual de
fibras musculares tipo II aumentado.
A partir dos resultados obtidos conclui-se que a terapia celular atuou
reduzindo a atrofia do tecido muscular e restabelecendo a quantidade de fibras
lentas, enquanto que, o uso do UT de forma isolada foi eficaz para aumentar a
quantidade de fibras tipo I e associado à terapia celular foi mais eficiente para
reduzir os níveis de fibras tipo II.
AGRADECIMENTOS
Ao Laboratório de Microbiologia Clínica - Laboratório de Imunopatologia Keizo
Asami (LIKA).
Ao Departamento de Cirurgia Experimental (UFPE).
Ao Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (CETENE).
APOIO FINANCEIRO A Srtª Lira teve apoio da Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do
Estado de Pernambuco (FACEPE) (nº dos processos: PBPG-0732-4.08/10 e APQ-
0710-4.08/10).
REFERÊNCIAS
49
AKHLAGHI, Z. et al. The effects of altered ultrasound parameters on the recovery of sciatic nerve injury. Iran Biomed J, v. 16, n. 2, p. 107-12, 2012. BACOU, F. et al. Expression of myosin isoforms in denervated, cross-reinnervated, and electrically stimulated rabbit muscles. Eur J Biochem, v. 236, p. 539-47, 1996. BORISOV, A. B.; DEDKOV, E. I.; CARLSON, B. M. Interrelations of Myogenic Response, Progressive Atrophy of Muscle Fibers, and Cell Death in Denervated Skeletal Muscle. Anat Rec, v. 264, p. 203-18, 2001. BRAGA-SILVA, J. et al. Bone marrow stem cells and platelet-rich plasma effects on nervous regeneration and functional recovery in an acute defect model of rats’ peripheral nerve. Acta Ortop Bras, v. 14, n. 5, p. 273-5, 2006. BRITO, V. C.; OLIVEIRA, B. D. R.; MORAES, S. R. A. Effects of immobilization on rat skeletal muscle tissue. J Morphol Sci, v. 28, n. 4, p. 217-21, 2011. CHABAS, J.-F. et al. FK506 Induces changes in muscle properties and promotes metabosensitive nerve fiber regeneration. J Neurotrama, v. 26, p. 97-108, 2009. CHANG, C-J.; HSU, S-H. The effects of low-intensity ultrasound on peripheral nerve regeneration in poly (DL-lactic acid-co-glycolic acid) conduits seeded with Schwann cells. Ultrasound Med Biol, v. 30, n. 8, p. 1079-84, 2004. CHEN, Y-S. et al. Effect of low-power pulsed laser on peripheral nerve regeneration in rats. Microsurgery, v. 25, n. 1, p. 83-9, 2005. CRISCI, A. R.; FERRERA, A. L. Low-intensity pulsed ultrasound accelerates the regeneration of the sciatic nerve after neurotomy in rats. Ultrasound Med Biol, v. 28, n. 10, p. 1335-41, 2002. DEZAWA, M. et al. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur J Neurosci, v. 14, p. 1771-6, 2001. GRUMBLES, R. M. et al. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol, v. 68, n. 7, p. 736-46, 2009.
50
HERZOG, E.L.; CHAI, L.; KRAUSE, D.S. Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood, v. 102, n. 10, p. 3483-93, 2003. HU, N. et al. Long-term outcome of the repair of 50 mm long median nerve defects in rhesus monkeys with marrow mesenchymal stem cells-containing, chitosan-based tissue engineered nerve grafts. Biomaterials, v. 34, p. 100-11, 2013. MIDRIO, M. The denervated muscle: facts and hypotheses. A historical review. Eur J Appl Physiol, v. 98, p. 1-21, 2006. MIYAMARU, S. et al. Effects of long-term denervation on the rat thyroarytenoid muscle. Laryngoscope, v. 118, p. 1318-23, 2008. MONTE-RASO, V. V. et al. Can therapeutic ultrasound influence the regeneration of peripheral nerves? J Neurosci Methods, v. 142, p. 185-92, 2005. MONTE-RASO, V. V. et al. Os efeitos do ultra-som terapêutico nas lesões por esmagamento do nervo ciático de ratos: análise funcional da marcha. Rev Bras Fisioter, v. 10, n. 1, p. 113-19, 2006. MOURAD, D. P. et al. Ultrasound accelerates functional recovery after peripheral nerve damage. Neurosurgery, v. 48, n. 5, p. 1136-41, 2001. OLIVEIRA, J. T. et al. Mesenchymal stem cells in a polycaprolactone conduit enhance median-nerve regeneration, prevent decrease of creatine phosphokinase levels in muscle, and improve functional recovery in mice. Neuroscience, v. 170, p. 1295-303, 2010. PELLEGRINO, C.; FRANZINI, C. An electron microscope study of denervation atrophy in red and white skeletal muscle fibers. J Cell Biol, v. 17, n. 2, p. 327-49, 1963. SCHMIDT, C. E.; LEACH, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annu Rev Biomed Eng, v. 5, p. 293-347, 2003. SOUZA, C. F. et al. Células-tronco mesenquimais: células ideais para a regeneração cardíaca? Rev Bras Cardiol Invasiva, v. 18, n. 3, p. 344-53, 2010.
51
TOHILL, M.; TERENGHI, G. Stem-cell plasticity and therapy for injuries of the peripheral nervous system. Biotechnol Appl Biochem, v. 40, pt. 1, p. 17-24, 2004.
52
Tabela 1. Massa corpórea dos animais ao início e ao final do período experimental
GC GL GLT GLU GLTU p Massa Corpórea Inicial (g) 277,00±10,10 305,00±22,26 287,33±9,35 289,00±7,01 289,14±21,81 0,146
Massa Corpórea Final (g) 375,33±8,55 416,50±47,71 407,67±22,82 382,67±17,56 402,00±44,66 0,157
n 6 6 6 6 7 GC=Grupo Controle, GL=Grupo Lesão, GLT=Grupo Lesão + Terapia Celular, GLU=Grupo Lesão + Ultrassom Terapêutico, GLTU=Grupo Lesão + Terapia Celular + Ultrassom Terapêutico, Massa Corpórea Inicial=Massa Corpórea dos Animais entre 69 e 71 dias de vida, Massa Corpórea Final=Massa Corpórea dos Animais 14 semanas Pós-neurotmese, n=Número de Amostras por Grupo. Valores expressos em média ± desvio padrão. Teste de Kruskal-Wallis. *p<0,05
Tabela 2. Peso do músculo sóleo ao final do experimento GC GL GLT GLU GLTU p
Peso Muscular (g) 0,22±0,03 0,10a±0,03 0,16a b±0,03 0,12a±0,03 0,14a b±0,03 0,001*
n 6 5 6 6 7 GC=Grupo Controle, GL=Grupo Lesão, GLT=Grupo Lesão + Terapia Celular, GLU=Grupo Lesão + Ultrassom Terapêutico, GLTU=Grupo Lesão + Terapia Celular + Ultrassom Terapêutico, Peso Muscular=Peso Muscular dos Animais 14 semanas Pós-neurotmese, n=Número de Amostras por Grupo. Valores expressos em média ± desvio padrão. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do Teste de Mann-Whitney. *p<0,05, aComparação com o GC; bComparação com o GL
52
53
A
*
*
*
*
B
* *
* * *
Figura 1. Quantificação das miosinas lenta (A) e rápida (B) do músculo sóleo nos grupos estudados, em pixels por imagem. GC=Grupo Controle, GL=Grupo Lesão, GLT=Grupo Lesão + Terapia Celular, GLU=Grupo Lesão + Ultrassom Terapêutico, GLTU=Grupo Lesão + Terapia Celular + Ultrassom Terapêutico. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do Teste de Mann-Whitney. *p<0,05
53
54
Figura 2. Proporção da quantidade de miosinas lenta e rápida do músculo sóleo nos grupos estudados, em percentual (%). GC=Grupo Controle, GL=Grupo Lesão, GLT=Grupo Lesão + Terapia Celular, GLU=Grupo Lesão + Ultrassom Terapêutico, GLTU=Grupo Lesão + Terapia Celular + Ultrassom Terapêutico
54
55
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ___________________________________________________________________
• Através da avaliação do IFC isoladamente, no protocolo experimental utilizado,
não há como supor, que não houve uma regeneração nervosa, uma vez que a
recuperação funcional da marcha não depende apenas da integridade do tecido
nervoso, e sim concomitantemente da presença de outros fatores, entre eles a
integridade do tecido muscular.
• A terapia celular atuou reduzindo a atrofia do tecido muscular e restabelecendo
a quantidade de fibras lentas.
• O uso do UT de forma isolada foi eficaz para aumentar a quantidade de fibras
tipo I.
• A associação do UT à terapia celular foi mais eficiente para reduzir os níveis de
fibras tipo II.
56
5 LIMITAÇÕES DO ESTUDO ___________________________________________________________________
Para avaliação do IFC a fórmula utilizada no presente estudo é a mais
encontrada na literatura especifica, entretanto, não apresenta um ponto de corte
para identificação da normalidade dos valores do IFC. Acarretando uma dificuldade
na interpretação dos resultados obtidos.
57
REFERÊNCIAS ___________________________________________________________________
AKHLAGHI, Z. et al. The effects of altered ultrasound parameters on the recovery of sciatic nerve injury. Iran Biomed J, v. 16, n. 2, p. 107-12, 2012. BACOU, F. et al. Expression of myosin isoforms in denervated, cross-reinnervated, and electrically stimulated rabbit muscles. Eur J Biochem, v. 236, p. 539-47, 1996. BAIN, J. R.; MACKINNON, S.E.; HUNTER, D. A. Funcional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plast Reconstr Surg, v. 83, n. 1, p. 129-38, 1989. BAJOTTO, G.; SHIMOMURA, Y. Determinants of disuse-induced skeletal muscle atrophy: exercise and nutrition countermeasures to prevent protein loss. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), v.52, n.4, p.233-47, 2006. BOOTH, F.W. Effect of limb immobilization on skeletal muscle. J Appl Physiol, v.52, n.5, p.1113-8, 1982. BORISOV, A. B.; DEDKOV, E. I.; CARLSON, B. M. Interrelations of myogenic response, progressive atrophy of muscle fibers, and cell death in denervated skeletal muscle. Anat Rec, v. 264, p. 203-18, 2001. BRAGA-SILVA, J. et al. Bone marrow stem cells and platelet-rich plasma effects on nervous regeneration and functional recovery in an acute defect model of rats’ peripheral nerve. Acta Ortop Bras, v. 14, n. 5, p. 273-5, 2006. BRITO, V. C.; OLIVEIRA, B. D. R.; MORAES, S. R. A. Effects of immobilization on rat skeletal muscle tissue. J Morphol Sci, v. 28, n. 4, p. 217-21, 2011. BURNET, M. G.; ZAGER, E. L. Pathophysiology of peripheral nerve injury: a brief review. Neurosurg Focus, v. 16, n. 5, Art. 1, p. 1-7, 2004. CASTRO, C.M.M.B. et al. Citotoxidade de biopolímero de cana-de-açúcar. An Fac Med Univ Fed Pernamb, v.39, n.2, p.119-23, 2004.
58
CHABAS, J.-F. et al. FK506 Induces changes in muscle properties and promotes metabosensitive nerve fiber regeneration. J Neurotrama, v. 26, p. 97-108, 2009. CHANG, C-J.; HSU, S-H. The effects of low-intensity ultrasound on peripheral nerve regeneration in poly (DL-lactic acid-co-glycolic acid) conduits seeded with Schwann cells. Ultrasound Med Biol, v. 30, n. 8, p. 1079-84, 2004. CHENG, F. C. et al. Enhancement of regeneration with glia cell line-derived neurotrophic factor-transduced human amniotic fluid mesenchymal stem cells after sciatic nerve crush injury. J Neurosurg, v.112, n. 4, p. 868-79, 2010. COELHO, M.C.O.C. et al. Bioplímero produzido a partir de cana-de-açúcar para cicatrização cutânea. Acta Cir Bras, v.17, suppl.1, p.11-3, 2002. CRISCI, A. R.; FERRERA, A. L. Low-intensity pulsed ultrasound accelerates the regeneration of the sciatic nerve after neurotomy in rats. Ultrasound Med Biol, v. 28, n. 10, p. 1335-41, 2002. DE MEDINACELI, L.; FREED, W. J.; WYATT, R.J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Exp Neurol, v. 77, n. 3, p. 634-43, 1982. DELISTOIANOV, N. et al. Implante de tubo de silicone com e sem colágeno na regeneração de nervos em equinos. Ciênc Rural, v. 38, n. 6, p. 1667-74, 2008. DELLON, A.L.; MACKINNON, S. E. Sciatic nerve regeneration in the rat. Validity of walking track assessment in the presence of chronic contractures. Microsurgery, v. 10, n. 3, p. 220-5, 1989. DEZAWA, M. et al. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur J Neurosci, v. 14, p. 1771-6, 2001. DIJKSTRA, J. R. et al. Methods to evaluate functional nerve recovery in adult rats: walking track analysis, video analysis and the withdrawal reflex. J Neurosci Methods, v. 96, p. 89-96, 2000. DOAN, N. et al. In vitro effects of therapeutic ultrasound on cell proliferation, protein synthesis, and cytokine production by human fibroblasts, osteoblasts, and monocytes. J Oral Maxillofac Surg, v.57, p. 409-19, 1999.
59
FREITAS, T. S.; FLORES, L.P. Uso da técnica de tubulização para o reparo de lesões do sistema nervoso periférico. Arq Bras Neurocir, v. 26, p. 16-23, 2007. GRUMBLES, R. M. et al. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol, v. 68, n. 7, p. 736-46, 2009. HU, N. et al. Long-term outcome of the repair of 50 mm long median nerve defects in rhesus monkeys with marrow mesenchymal stem cells-containing, chitosan-based tissue engineered nerve grafts. Biomaterials, v. 34, p. 100-11, 2013. LANZA, C. et al. Expression of antioxidant molecules after peripheral nerve injury and regeneration. J Neurosci Res, v. 90, n. 4, p. 842-8, 2012. LIMA, F.R. et al. Resposta inflamatória a membranas de biopolímero de cana-de-açúcar e telas de polipropileno® implantadas no peritônio parietal de ratos. An Fac Med Univ Fed Pernamb, v.50, n.1, p.37-40, 2005. LOW, J.; REED, A. Ultra-som terapêutico. In: ______. Eletroterapia explicada: princípios e prática. 3.ed. São Paulo: Manole, 2001. cap. 6. MARQUES, S.R.B. et al. Um novo substituto vascular : arterioplastia femora em cães com remendo de membrana de biopolímero de cana-de-açúcar – avaliação hemodinâmica e histopatológica. J Vasc Bras, v.6, n.4, p.309-15, 2007. MASSONE, F. Técnicas anestésicas em animais de laboratório. In: ______. Anestesiologia veterinária: farmacologia e técnicas. 5. ed. ampl. e atual. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. cap. 10. MAYER, D.L.B. et al. Sugarcane biopolymer membrane: experimental evaluation in the middle ear. Braz J Otorthinolaryngol, v.77, n.1, p.44-50, 2011. MIDRIO, M. The denervated muscle: facts and hypotheses. A historical review. Eur J Appl Physiol, v. 98, p. 1-21, 2006. MONTEIRO, V.L.C. et al. Cana-de-açúcar no tratamento de feridas cutâneas por segunda ou terceira intenção. Med Vet (Recife), v.1, n.1, p.1-8, 2007.
60
MONTE-RASO, V. V. et al. Can therapeutic ultrasound influence the regeneration of peripheral nerves? J Neurosci Methods, v. 142, p. 185-92, 2005. MONTE-RASO, V. V. et al. Os efeitos do ultra-som terapêutico nas lesões por esmagamento do nervo ciático de ratos: análise funcional da marcha. Rev Bras Fisioter, v. 10, n. 1, p. 113-19, 2006. MONTE-RASO, V.V.; BARBIERI, C. H.; MAZZER, N. Sciatic functional index in smashing injuries of rats’ sciatic nerves. Evaluation of method reproducibility among examiners. Acta Ortop Bras, v. 14, n. 3, p. 133-6, 2006. MOURAD, D. P. et al. Ultrasound accelerates functional recovery after peripheral nerve damage. Neurosurgery, v. 48, n. 5, p. 1136-41, 2001. OLIVEIRA, J. T. et al. Mesenchymal stem cells in a polycaprolactone conduit enhance median-nerve regeneration, prevent decrease of creatine phosphokinase levels in muscle, and improve functional recovery in mice. Neuroscience, v. 170, p. 1295-303, 2010. PATERSON-BEEDLE, M. et al. A Cellulosic Exopolysaccharide Produced from Sugarcane Molasses by a Zoogloea sp. Carbohydrate Polymers, v. 42, p. 375-83, 2000. PELLEGRINO, C.; FRANZINI, C. An electron microscope study of denervation atrophy in red and white skeletal muscle fibers. J Cell Biol, v. 17, n. 2, p. 327-49, 1963. REHER, P. et al. Effect of ultrasound on the production of IL-8, basic FGF and VEGF. Cytokine, v. 11, n. 6, p. 416-23, 1999. RHRICH-HADDOUT, F. et al. Alpha-motoneurons of the injured cervical spinal cord of the adult rat can reinnervate the biceps brachii muscle by regenerating axons through peripheral nerve bridges: combined ultrastructural and retrograde axonal tracing study. J Neurosci Res, v. 64, p. 476-86, 2001. SCHMIDT, C. E.; LEACH, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annu Rev Biomed Eng, v. 5, p. 293-347, 2003.
61
SOUZA, C. F. et al. Células-tronco mesenquimais: células ideais para a regeneração cardíaca? Rev Bras Cardiol Invasiva, v. 18, n. 3, p. 344-53, 2010. STOLL, G. et al. Wallerian degeneration in the peripheral nervous system: participation of both Schwann cells and macrophages in myelin degradation. J Neurocytol, v. 18, n.5, p. 671-83, 1989. UEMURA, T. et al. Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived neurospheres for peripheral nerve repair. Biochem Biophys Res Commun, v. 419, n. 1, p. 130-5, 2012. USACH, V. et al. Bone marrow mononuclear cells migrate to the demyelinated sciatic nerve and transdifferentiate into Schwann cells after nerve injury: attempt at a peripheral nervous system intrinsic repair mechanism. J Neurosci Res, v. 89, p. 1203-17, 2011. WAGERS, A. J.; WEISSMAN, I. L. Plasticity of adult stem cells. Cell, v. 116, n. 5, p. 639-48, 2004. YANG, Y-C. et al. Sciatic nerve repair by reinforced nerve conduits made of gelatin–tricalcium phosphate composites. J Biomed Mater Res A, v. 96, n. 2, p. 288-300, 2011. ZAVERUCHA-DO-VALLE, C. et al. Bone marrow mononuclear cells increase retinal ganglion cell survival and axon regeneration in the adult rat. Cell Transplant, v. 20, p. 391-406, 2011.
62
APÊNDICES ___________________________________________________________________ Apêndice A – Publicação Paralela (Artigo Completo Publicado em Periódico)
63
Apêndice B – Publicação Paralela (Artigo Completo Publicado em Periódico)
64
Apêndice C – Publicação Paralela (Artigo Completo Publicado em Periódico)
65
Apêndice D – Publicação Paralela (Resumo Publicado em Anais de Congresso)
66
Apêndice E – Publicação Paralela (Resumo Publicado em Anais de Congresso)
67
Apêndice F – Publicação Paralela (Resumo Publicado em Anais de Congresso)
68
Apêndice G – Publicação Paralela (Resumo Publicado em Anais de Congresso)
69
Apêndice H – Treinamento em “Técnicas Relacionadas ao Preparo e Processamento de Amostras de Músculo Esquelético”
70
ANEXOS ___________________________________________________________________ Anexo A – Aprovação da Comissão de Ética em Experimentação Animal
71
Anexo B – Confirmação de Submissão do Artigo Original 1 a Revista Brasileira de Fisioterapia
![[PPT]Apresentação do PowerPoint - Home Page - Portal …cibelle/psicologia_aulas/comp-resumido.ppt · Web viewSão pensados para facilitar a aprendizagem. O conceito de aprendizagem](https://img.document.onl/doc/110x75/5beb678109d3f260758cd1c5/pptapresentacao-do-powerpoint-home-page-portal-cibellepsicologiaaulascomp-.jpg)
