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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA
DIVERGÊNCIAS MORFOMÉTRICAS E COMPORTAMENTAIS
EM Apis mellifera L. (HYMENOPTERA:APIDAE)
ARLIK RAFAEL SANTIAGO DE SOUSA
SÃO CRISTÓVÃO 2013
SO
US
A, A
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IK R
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TIA
GO
UF
S 2
013
ARLIK RAFAEL SANTIAGO DE SOUSA
DIVERGÊNCIAS MORFOMÉTRICAS E COMPORTAMENTAIS
EM Apis mellifera L. (HYMENOPTERA: APIDAE)
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Sergipe, como requisito à obtenção do título de Mestre em Biotecnologia na área de concentração Biotecnologia em Recursos Naturais.
Orientador: Prof. Leandro Teixeira Barbosa
SÃO CRISTÓVÃO SERGIPE-BRASIL
2013
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
S725d
Sousa, Arlik Rafael Santiago de Divergências morfométricas e comportamentais em apis
mellifera l. (Hymenoptera:apidae) / Arlik Rafael Santiago de Sousa ; orientador Leandro Teixeira Barbosa. – São Cristóvão, 2013.
69f. : il.
Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal de Sergipe, 2013.
1. Abelha - comportamento. 2. Abelha africanizada – Morfologia. 3. Polifenismo. I. Barbosa, Leandro Teixeira, orient. II. Título.
CDU 638.12
ARLIK RAFAEL SANTIAGO DE SOUSA
DIVERGÊNCIAS MORFOMÉTRICAS E COMPORTAMENTAIS EM
Apis mellifera L. (HYMENOPTERA:APIDAE)
Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do título de Mestre em Biotecnologia na área de concentração Biotecnologia em Recursos Naturais.
APROVADO em 31 de julho de 2013
Prof.Dr. Leandro Bacci
Universidade Federal de Sergipe - UFS
Prof.Dr. Lorena Andrade Nunes
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - UESB
Prof.Dr. Leandro Teixeira Barbosa
Universidade Federal de Sergipe - UFS
(Orientador)
SÃO CRISTÓVÃO SERGIPE-BRASIL
2013
―Tudo aquilo que sou, ou pretendo
ser, devo a um anjo: minha mãe.‖
Dedico à minha mãe, Vilma
Santiago de Sousa. (in memorian)
AGRADECIMENTOS
Aos meus irmãos Bruno Vinícius Santiago de Sousa e Brena Carolina Santiago de
Sousa, que me apoiaram em todos os aspectos possíveis na realização deste trabalho, pois
sem o seu apoio o mesmo não teria sido concretizado.
Ao presidente da cooperativa de apicultores de Sergipe, Ananias Azevedo, e aos
apicultores João Fiscal, Zé Adílson, Íviton, Chefe, Neu, Tinda, Magno, Edélsio e Raimundo,
que nos cederam as caixas para estudo e dispuseram de seu tempo e atenção para a
realização do trabalho. Em especial ao Tél do Mel, da Associação de Melicultores do Alto
Sertão Sergipano (AMAS), de Canindé do São Francisco, pelo suporte técnico e material
empreendido no estudo.
Meus agradecimentos aos alunos do Mestrado de Biotecnologia e companheiros de
turma, Alyne Karen, Antônio Fávero, Clesivan Pereira, José Davi, Deysiane, Franciele
Glauber, Julianne, Leise Moreira e Ricardo Celestino.
A todos os colaboradores, o professor Carlos Alberto Ledo, a professora Dra. Ana
Paula e meu orientador Dr. Leandro Barbosa os quais contribuíram para o desenvolvimento
desse trabalho. Ao professor Jódnes e Washington, que abriram as portas do apíario do
Campus para a realização do trabalho. Gostaria de agradecer também ao Ronaldo
Fernandes, do projeto FRUTOS DA FLORESTA.
Ao apoio e colaboração da minha co-orientadora, a Dra. Kátia Peres Gramacho, pelo
engrandecimento do trabalho, e a seus alunos Edgar e Tábata, pela parcela de contribuição
na pesquisa e prospecção dos dados. Ao meu co-orientador Dr.Edílson Araújo, que tornou a
execução desse projeto viável, a professora Lorena Nunes pela atenção e apoio, a todos
vocês, muito obrigado por terem tornado esse projeto possível.
Aos meus amigos, Abel Felipe, Adeline Amorim, Amanda Cristina, Arleu Barbosa,
André Luiz, Danilo Esdras, Erílson Vieira, Jussara Cruz, Marta Jeidjane, Tatiana Maia, Zoila
Catalina Rabanál, pela compreensão e apoio à consecução do trabalho.
À Secretaria de Estado do Meio Ambiente e dos Recursos Hídricos – SEMARH, por
nos ceder os dados meteorológicos do trabalho, especialmente à pessoa de Overland
Amaral Costa, do Centro de Meteorologia do Estado de Sergipe CEMESE, à equipe da
Superintendência de Recursos Hídricos-SRH, e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico - CNPQ -, pela concessão da bolsa de Mestrado. A todos, o meu
obrigado!
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... i
LISTA DE TABELAS .............................................................................................................. ii
RESUMO ............................................................................................................................... iii
ABSTRACT .......................................................................................................................... iv
1.INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1
2.REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................................................. 2
2.1.Aspectos gerais das abelhas Apis mellifera ..................................................................... 2
2.2.Comportamento Higiênico ................................................................................................ 4
2.3.Morfometria Geométrica .................................................................................................. 6
3.MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................... 9
3.1.Ecorregiões ...................................................................................................................... 9
3.2.Análises Morfométricas .................................................................................................. 10
3.3.Método de Perfuração de Crias ..................................................................................... 12
4.RESULTADOS ................................................................................................................. 14
5.DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 23
6.CONCLUSÃO ................................................................................................................... 25
7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 26
CAPÍTULO I
Bee’s Morphometrics and Behavior upon Seasonal Effects from Ecoregions
ABSTRACT ......................................................................................................................... 36
INTRODUCTION ................................................................................................................. 37
MATERIALS AND METHODS ............................................................................................. 39
Study area ........................................................................................................................... 39
Morphometrics ..................................................................................................................... 40
Hygienic behavior ................................................................................................................ 42
RESULTS ............................................................................................................................ 42
DISCUSSION ...................................................................................................................... 50
ACKNOWLEDGEMENTS .................................................................................................... 52
REFERENCES .................................................................................................................... 53
i
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação ilustrativa dos locais onde os estudos foram realizados. .................. 9
Figura 2. Diagrama de sazonalidade, representando os índices de precipitação durante os
períodos seco e chuvoso nas ecorregiões estudadas. ................................................................ 10
Figura 3. A figura acima apresenta os 17 marcos anatômicos plotados nas intersecções das
asas da abelha africanizada Apis melífera L. ................................................................................ 11
Figura 4. Quadro teste de uma colônia de abelhas africanizadas que foi submetido ao teste
do comportamento higiênico pelo método de perfuração de crias. Área (A) representa o
tratamento e (B) o grupo controle. ................................................................................................... 13
Figura 5. Dispersão gráfica das colônias de Apis mellifera em relação ao eixo cartesiano
estabelecido pelas variáveis canônicas (VCA 1, VCA 2). Azul claro: Colônias de Canindé do
São Francisco; Vermelho: Brejo Grande; Verde escuro:Estância; Rosa: São Cristóvão;
Amarelo: Poço verde; Preto:Aquidabã; Verde Claro:Glória; Roxo:Frei Paulo; Azul escuro:
Japaratuba. .......................................................................................................................................... 16
Figura 6. Dispersão gráfica dos grupos de Apis mellifera em relação ao eixo cartesiano
estabelecido pelas variáveis canônicas (VCA 1, VCA 2), obtida a partir da morfometria das
asas. Azul: Zona da Mata, Vermelho: Agreste e Verde: Semiárido. .......................................... 17
Figura 7. Gráfico de dispersão dos apiários de Apis mellifera em relação a eixos cartesianos
estabelecidos pelos variáveis canônicas (VCA1, VCA2) demonstrando a distância entre os
mesmos por meio da distância generalizada de Mahalanobis. .................................................. 18
Figura 8. Relação linear entre o tamaho do centróide (mm) predito pela equação de
regressão e a altitude (m). Os pontos cinzas são os tamanhos dos centróides observados;
os pontos pretos são os tamanhos do centróide preditos pela equação linear; a reta
representa a relação linear entre os tamanhos do centróide e a altitude. ................................ 19
Figura 9. A figura acima demonstra uma colônia não higiênica (A) onde as crias mortas não
foram removidas após 24h e a imagem (B) uma colônia higiênica. ........................................... 20
Figura 10. Diagrama de caixas do comportamento higiênico (%) nas três ecorregiões:
Agreste, Sertão e Zona da Mata. ..................................................................................................... 21
Figura 11. Diagrama de caixas do comportamento higiênico (%) nas estações chuvosa e
seca. ..................................................................................................................................................... 22
Figura 12. Diagrama em cadeia ilustrativo dos efeitos das variáveis explicativas primária
(pluviosidade) e secundárias (altitude e temperatura) sobre a variável resposta
(comportamento higiênico). .............................................................................................................. 23
ii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Origem, localização geográfica, elevação e número de amostras de colônias de
Apis mellifera no Estado de Sergipe. .............................................................................................. 10
Tabela 2. Variáveis canônicas, autovalores, porcentagem de variância e porcentagem da
variância acumulada obtidas com a análise das colônias. .......................................................... 15
Tabela 3.Variáveis canônicas, autovalores, porcentagem de variância e porcentagem da
variância acumulada obtidas com a análise das ecorregiões. .................................................... 16
Tabela 4.Variáveis canônicas, autovalores, porcentagem de variância e porcentagem da
variância acumulada obtidas com a análise das ecorregiões. .................................................... 17
Tabela 5.Teste de Mantel para a comparação das matrizes de forma, tamanho e altitude
utilizando medições de asas da Apis mellifera com 5000 permutações. .................................. 18
Tabela 6. Estimativa dos coeficientes da reta de regressão com respectivo desvio padrão,
valor t e p-valor. .................................................................................................................................. 19
Tabela 7. Média e Desvio Padrão dos comportamentos higiênicos associados a cada
ecorregião (Agreste, Sertão e Zona da Mata). .............................................................................. 20
Tabela 8. Teste post-hoc com valores da diferença observada e diferença crítica para cada
comparação entre ecorregiões......................................................................................................... 21
Tabela 9. Efeitos diretos (diagonal) e indiretos estimados entre a variável resposta
comportamento higiênico das abelhas e as variáveis explicativas temperatura, pluviosidade
e altitude. ............................................................................................................................................. 23
iii
RESUMO SANTIAGO, Arlik Rafael. DIVERGÊNCIAS MORFOMÉTRICAS E COMPORTAMENTAIS EM Apis mellifera L. (HYMENOPTERA: APIDAE) Sergipe: UFS 2013. (Dissertação - Mestrado em Biotecnologia) As abelhas do gênero Apis estão amplamente distribuídas pelas regiões tropicais do planeta, sendo fundamentais no papel de polinizadores. No Brasil, estas são um poliíbrido formado pelo cruzamento entre a subespécie africana Apis mellifera scutellata e as subespécies europeias. Devido a hábitos generalistas, a introgressão de alelos da subespécie africana tem levado a uma predominância nas características desta em relação às europeias. O presente trabalho teve como escopo a caracterização da divergência entre 71 colônias de A. mellifera africanizadas, situadas em três distintas ecorregiões (Zona da Mata, Agreste e Sertão) do Estado de Sergipe, nordeste do Brasil, por meio de análises morfológicas e comportamentais, com o objetivo de avaliar as relações entre os efeitos da sazonalidade e dos distintos padrões morfoclimáticos das ecorregiões na morfologia, comportamento e distribuição desses grupos de abelhas. Neste estudo foram utilizadas técnicas de morfometria geométrica, com observação dos marcos anatômicos da venação alar, com o auxílio do software Tps/DIG e avaliação do comportamento higiênico pelo método de perfuração de crias em dois períodos estacionais, o seco e o chuvoso. A correlação entre os índices de comportamento higiênico e as variáveis ambientais foi obtida por meio da correlação de Spearman e as relações de causalidade por meio da análise de trilha, com o auxílio do software R. As análises morfométricas foram realizadas por meio de técnicas de análise multivariada, com o auxílio dos softwares MORPHOJ e PAST. Assim, os resultados deste trabalho demonstraram que o intenso fluxo gênico evidenciado entre as colônias estudadas e as diferenças pronunciadas nos distintos apiários e ecorregiões, com influência da altitude na forma (r=0,06239; p= 0.05) e tamanho (0.001) contribuíram, portanto, para a separação desses grupos como resultado da plasticidade fenotípica e não de divergência genética entre as populações de abelhas africanizadas. Além disso, os resultados também demonstraram haver diferença significativa no comportamento higiênico dessas populações, entre os períodos seco e chuvoso (p= 0,022 α=0,05) e entre as ecorregiões (p=0,001; α=0,05), com influência da temperatura (ρ=0,065 p=0,471; α=0,05) e altitude (ρ=-0,294; p=0,001; α=0,05) sobre a pluviosidade (ρ=0,274 p=0,002; α=0,05) sendo esta o principal modulador do comportamento higiênico, reforçando a influência de fatores ambientais na manifestação dessa característica. Portanto, conclui-se pela influência de fatores estocásticos na morfologia, comportamento e distribuição das abelhas africanizadas, onde os polifenismos encontrados denotam a grande variabilidade genética dessas populações, fato esse que pode ser explorado em futuros programas de conservação, manejo e melhoramento. Palavras-chave: Abelhas africanizadas; análise multivariada; comportamento higiênico; morfometria geométrica; plasticidade fenotípica ; polifenismo. Comitê de Orientação: Leandro Teixeira Barbosa - UFS (Orientador)
Edílson Divino de Araújo - UFS (Co-orientador)
iv
ABSTRACT SANTIAGO, Arlik Rafael MORPHOMETRIC AND BEHAVIORAL DIVERGENCES IN Apis mellifera L. (HYMENOPTERA: APIDAE) Sergipe: UFS, 2013. (Dissertação - Mestrado em Biotecnologia) Bees of the genus Apis are widely distributed throughout the tropical regions of the planet, playing fundamental role as pollinators. In Brazil they are a polihibrid formed by the crossbreed of African subspecies Apis mellifera scutellata and European subspecies, where due generalist habits the introgression of alleles of the African subspecies has led to a predominance of the your characteristics in relation to European subspecies. The scope of this work was to characterize the divergence among 71 colonies of Africanized honey bees located in three distinct ecoregions (Forest zone, Ecotone and Semiarid) of the State of Sergipe Brazilian northeast, through morphological and behavioral analyses, in order to assess the relationship between the effects of seasonality and the different patterns morphoclimatic ecoregions in morphology, behavior and distribution of these groups of bees. In this work we used geometric morphometric techniques observing the anatomical landmarks of the wing venation with the aid of software Tps / DIG and evaluation of hygienic behavior by pin-killing method in two distinct seasonal periods, the dry and rainy. The correlation between the hygienic behavior indexes and environmental variables was obtained by Spearman correlation and the causal relations by path analysis, with the aid of software R. The morphometric analyzes were performed by means of multivariate analysis with the aid of software MORPHOJ and PAST. Thus, the results of this study demonstrated that the high gene flow evidenced between studied colonies and pronounced differences in apiaries and ecoregions with influence of altitude on shape (r=0,06239; p= 0.05) and size (0.001) contributed therefore for the separation of these groups as result of phenotypic plasticity rather than genetic divergence among populations of Africanized honey bees. Furthermore, the results also demonstrated significant difference in hygienic behavior of these populations between the dry and rainy season (p= 0,022; α=0,05) and between ecoregions (p=0,001; α=0,05) with the influence of temperature (ρ=0,065; p=0,471; α=0,05) and altitude (ρ=-0,294; p=0,001 α=0,05) upon pluviosity (ρ=0,274; p=0,002; α=0,05) that demonstrated be the main modulator of hygienic behavior, thus reinforcing the influence of environmental factors on the expression of this trait. Therefore, it is concluded by the influence of stochastic factors in the morphology, behavior and distribution of Africanized honey bees, where polyphenisms found denote the high genetic variability of these populations, a fact that can be exploited in future conservation, handling and breeding programs. Key-words: Africanized honey bee; hygienic behavior; morphometrics geometrics; multivariate analysis; phenotypic plasticity; polyphenism. Committee Members: Leandro Teixeira Barbosa - UFS (Adviser)
Edílson Divino de Araújo - UFS (Co-Adviser)
1
1. INTRODUÇÃO
As abelhas são fundamentais para equilíbrio dos ecossistemas, pois no papel de
polinizadores contribuem com a reprodução e dispersão da maioria das espécies de
angiospermas, muitas delas de importância econômica, em um complexo processo
coevolutivo que ocorre ao longo dos últimos 100 milhões de anos (RENNER, 2010
CARDINAL, 2013). Os serviços de polinização, embora sejam difíceis de serem
quantificados, inúmeros estudos já demonstraram seu valor para a agroindústria e
ecossistemas relacionados (KLEIN et al., 2007; AIZEN et al., 2008; ALLSOPP et al., 2008,
GALLAI et al., 2009 LAUTENBACH et al., 2012). A perda desse capital natural, portanto,
poderia afetar negativamente a manutenção da diversidade das plantas silvestres,
estabilidade dos ecossistemas, produção agrícola, segurança alimentar e bem-estar
humanos (POTTS et al 2010; THOMANN, 2013).
As espécies de abelhas têm declinado ao redor do mundo como consequência das
alterações climáticas, proliferação de patógenos, uso extensivo de agrotóxicos e ainda o
efeito sinérgico desses (WILSON-RICH et al., 2009; EVANS & SPIVAK, 2010; GONZALO-
VARO, 2013; GRAYSTOCK, 2013; WAGONER, 2013). As abelhas da espécie Apis mellifera
são bem distribuídas nas regiões neotropicais e ocorrem no continente americano como
poliíbridos, formados pelo cruzamento das subespécies europeias e a subespécie africana
Apis mellifera scutellata. A grande plasticidade genética e capacidade de adaptação de tais
grupos de abelhas fez com que se alastrassem pelos mais variados padrões morfoclimáticos
das regiões tropicais, adquirindo características próprias, sendo chamada de abelha
africanizada (GONÇALVES, 1974).
As abelhas africanizadas possuem, como uma de suas principais características,
alta capacidade de resistência a doenças devido a habilidade inata de algumas de suas
colônias em detectar, desopercular e remover cria morta ou doente, impedindo a
proliferação de doenças na colônia. Essa característica foi denominada de comportamento
higiênico (ROTHENBUHLER, 1964ab; SPIVAK & GILLIAM, 1993; GRAMACHO, 1995;
PALÁCIO et al., 2000), sendo uma forma de imunidade social (CREMER, 2009 ; COTTER &
KILNER 2010; LOCKE et al., 2012) economicamente importante em colônias de abelhas,
devido a sua influência na resistência da colônia à infestação por parasitas e patógenos
(ROSENKRANZ et al., 2009; EVANS & SPIVAK, 2010) e sua relação com as demais
características de interesse (SPIVAK, 1998; DOWNEN & WINSTON, 2001; GARCIA et al.,
2013; PADILHA et al., 2013; GÜLER, 2013).
2
O comportamento higiênico é um atributo que vem sendo amplamente explorado
(IBRAHIM et al., 2007; PEREZ-SATO et al., 2009; HARBO & HARRIS, 2009; RINDERER et
al., 2010; BUCHLER et al., 2010; PERNAL et al., 2012) como índice de seleção para
melhoramento genético de abelhas, embora esteja correlacionado à expressão de grupos de
genes (LAPIDGE et al., 2002; OXLEY et al., 2010), acredita-se que uma complexa
interações entre fatores ambientais (PANASIUK et al., 2009; GÜLER, 2013), sociais
(PANASIUK et al., 2010) e epigenéticos (HERB et al., 2012) seja determinante para sua
manifestação.
A distribuição das populações de Apis pela diversidade de climas e regiões do
continente americano e as pressões seletivas desses locais contribuíram para promover a
variabilidade morfofisiológica e comportamental desses grupos, com formação de ecotipos
característicos para um melhor ajustamento a esses domínios climáticos (ANDERE et al
2008; PARKER et al., 2010; MEIXNER et al., 2010). Neste contexto, a morfometria
geométrica tem se demonstrado uma ferramenta precisa e de baixo custo (FRANCOY, 2008
TOFILSKI, 2009) no estudo das divergências entre populações de abelhas, possibilitando
entender quais as causas e consequências dessas variações (LAWING & POLLY, 2010
KLINGENBERG, 2010).
Para tanto, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar a divergência entre
colônias de Apis mellifera africanizadas e avaliar a relação existente entre fatores
ambientais, tais como temperatura, precipitação e sazonalidade de três distintas ecorregiões
na morfologia, comportamento e distribuição desses grupos de abelhas.
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. Aspectos gerais das abelhas Apis mellifera
As abelhas são organismos haplodiplóides com determinação sexual dependente de
um único locus gênico, o SDL sex determination locus, onde se localiza um único gene, o
denominado Csd complementary sex determiner. Assim, os indivíduos heterozigotos para
esse locus se desenvolvem como fêmeas, os homozigotos em machos estéreis e os
hemizigotos (partenogenéticos) como machos férteis (HASSELMAN, 2008; GEMPE, 2009).
No entanto, os recorrentes aumentos no número de homozigotos em colônias de Apis têm
reduzido o fitness dessas e, segundo alguns autores (HEDRICK et al., 2006; KLUSER,
3
2007; HEIN et al., 2009), tal fato também pode ser apontado como uma das causas do
declínio das abelhas.
Além disso, as abelhas são insetos holometábolos, ou seja, com desenvolvimento
completo (ovo, larva, pupa e adulto) e eussociais, apresentando divisão de trabalho e
dinâmica social complexas. A sociedade das abelhas é dividida em três castas: a rainha, as
operárias e os zangões, com clara distinção morfofisiológica e de atribuições entre estas. A
rainha controla o comportamento social e reprodutivo da colônia por meio de feromônios, as
operárias realizam todas as atividades inerentes à nutrição das crias, construção e limpeza
dos favos, defesa e forrageio, cabendo ao zangão apenas a função reprodutiva (STRAUSS,
2008; LOCKE, 2012). Acredita-se que os hidrocarbonetos cuticulares sejam determinantes
para regulação da dinâmica social, atuando no reconhecimeto dos indivíduos, segregação
espacial e organização da rede de interações em uma colônia de abelhas (SCHOLL &
NAUG, 2011).
A adaptação das abelhas à vida social resultou no surgimento de um sistema de
imunidade social que atua como barreira contra parasitas e patógenos, visando garantir a
sobrevivência e longevidade da colônia. Dentre as estratégias evolutivas apresentadas
pelas abelhas do gênero Apis, estão o comportamento higiênico, auto e alogrooming e o
polietismo temporal; este último consiste na divisão de trabalho na colônia de acordo com a
faixa etária dos indivíduos, expondo a maiores riscos - fora da colônia - somente os
indivíduos mais velhos e com pouca expectativa de vida (TOFILSKI, 2009;
WOYCIECHOWSKI, 2012 ). Alguns autores (HÖLLDOBLER & WILSON, 2008; CREMER,
2009; HABER, 2013) sugerem que, dada a complexidade das interações e especialização
dos indivíduos que integram uma colônia, a mesma possui estrutura análoga a um
organismo multicelular ou superorganismo.
Assim, dentre os grupos de abelhas mais estudados estão as da espécie Apis
mellifera, que possuem ampla distribuição nas regiões Neotropicais e Paleárticas do planeta
(ENGEL, 2009), sendo consideradas como o maior sucesso de invasão de uma espécie
exótica já registrado na literatura (SCOTT-SCHNEIDER et al., 2004). As abelhas com ferrão
da espécie Apis mellifera europeias foram introduzidas no Brasil em 1839, oriundas da
Espanha e Portugal, no entanto, o clima tropical e a baixa resistência a doenças fez com
que a produção rapidamente declinasse. Deste modo, com o intuto de melhorar a
produtividade e resistência a doenças em 1957, foi introduzida a subespécie africana Apis
mellifera scutellata, e hibridizada com as europeias preexistentes. Contudo, o híbrido
enxameou e se espalhou por todo continente americano, com a predominância das
características da subespécie africana, o poliíbrido, foi denominado de abelha africanizada
(KERR, 1967).
4
As abelhas africanizadas do Brasil possuem predominantemente características da
subespécie africana A.m.scutellata, apresentando como principais características: alta
capacidade de resistência a doenças, grande capacidade enxameatória, forte
comportamento defensivo, prolificidade e alta produtividade (GONÇALVES, 1974). Além
disso, no que se refere às abelhas africanizadas, deve-se ressaltar a importância da
melhoria da sanidade ambiental por meio de manejo, pois se sabe que elas são mais
sensíveis aos estímulos mecânicos, sonoros e químicos (odores) sendo, portanto,
fundamentais cuidados especiais no manejo de suas colmeias (GRAMACHO, 2004).
As abelhas africanizadas são mais produtivas que as abelhas nativas e contribuem
para produção de inúmeros produtos de importância econômica com aplicações diversas na
indústria alimentícia, farmacológica, terapêutica e cosmética. De tal modo, o alto valor
nutricional das substâncias contidas no mel (SHULTZ, 2009; ALVAREZ-SUAREZ et al.,
2010 MANYI-LOH et al., 2011), pólen e geléia real (VIUDA-MARTOS et al., 2008; KEMPF
et al., 2010), somada as propriedades farmacológicas e medicinais do própolis (SIMÕES et
al., 2008 CUNHA et al., 2011), cera (LEWIS et al., 2012) e da apitoxina (CHEN , 2010; ALI,
2012), e ainda a utilização de seus subprodutos como matéria prima na indústria cosmética
(KOSTICK et al., 2011), exemplificam a importância dessa atividade para a saúde e bem
estar humanos.
2.2. Comportamento Higiênico
As abelhas apresentam inúmeros parasitas e patógenos pertencentes aos mais
variados grupos taxonômicos, desde bactérias, protozoários, fungos, artrópodes e viroses.
Os cultivos e os ecossistemas relacionados se encontram ameaçados em grande parte pelo
avanço desses patógenos ao redor do mundo (DE LA RUA et al., 2009; GRAYSTOCK et al.,
2013). O ácaro ectoparasita, Varroa destructor (Anderson & Trueman), está no cerne dos
estudos epidemiológicos em abelhas e tem sido apontado como um dos principais
responsáveis pelo declínio das populações de abelhas em todo o mundo (WILSON-RICH et
al., 2009; EVANS & SPIVAK, 2010).
Os efeitos da infestação pelo ácaro Varroa destructor ocorrem tanto a nível individual
como coletivo e, em ambos, os casos com consequências desastrosas para a sobrevivência
e longevidade das populações de abelhas. Além disso, em muitos casos a infestação pelo
Varroa destructor está associada a vírus que utilizam o ácaro como vetor, potencializando
os efeitos danosos sobre o fitness da colônia. A nível individual o ácaro perfura os tecidos
das abelhas e suga a hemolinfa, resultando em interferências na ontogenia das mesmas,
5
comprometendo o seu desenvolvimento. A nível de colônia, as abelhas se desenvolvem
com menor capacidade de aprendizagem e reduz o sentido de navegação, diminuindo as
chances de acasalamento dos zangões e as taxas de retorno das abelhas forrageadoras
(ROSENKRANZ et al., 2010; LOCKE et al., 2012).
Em insetos sociais várias estratégias, tanto individuais como coletivas, foram
desenvolvidas para prevenir a infestação de suas colônias, dentre elas a mais bem sucedida
parece ser a imunidade social. Em contraste com a imunidade individual, a imunidade social
consiste em mecanismos de defesa, comportamentais ou fisiológicos, a nível de colônia e
alcançados pela cooperação de todos os membros do grupo, coletivamente evitando,
controlando ou eliminando as infecções parasitárias (CREMER, 2009; COTTER & KILNER
2010; LOCKE et al., 2012). O comportamento higiênico apresentado pelas abelhas, portanto
dentre os mecanismos de imunidade social demonstrado em outros grupos, tem se
confirmado como umas das mais eficientes barreiras contra infestação por parasitas e
patógenos (ROSENKRANZ et al., 2009; EVANS & SPIVAK, 2010).
O comportamento higiênico foi inicialmente descrito por Rothenbuhler (1964ab) e
consiste em uma defesa natural dirigida principalmente contra as doenças de crias. Este
conceito foi ampliado por Spivak e Moreto (1993) para a doença da Cria Pútrida Americana
Paenibacillus larvae, Cria Pútrida Europeia Melissococus pluton, Cria Giz Ascosphaera apis
e contra parasitas como ácaro Varroa destructor. Segundo Spivak e Gilliam (1993) e
Gramacho (1995), o comportamento higiênico pode ser definido como a capacidade de
algumas abelhas detectar, desopercular os alvéolos com criação parasitada, morta e/ou
doente e efetuar a sua remoção. Inicialmente (ROTHENBUHLER, 1964ab) acreditava-se
que tal comportamento era controlado por dois pares de genes recessivos, o gene para
destapar que foi denominado de U (que é o que controla a abertura dos alvéolos das crias) e
o gene para remoção, que foi chamado de R (o qual controla a remoção das crias afetadas
ou mortas). Outros autores (MORITZ, 1988; GRAMACHO, 1999) sugeriram que tal
comportamento seria desencadeado por até 3 pares de genes, no entanto, alguns estudos
(LAPIDGE et al., 2002; OXLEY et al., 2010) mais recentes sugerem que até 6 loci estejam
envolvidos.
O comportamento higiênico é uma característica de interesse que tem sido
invariavelmente utilizada em programas de melhoramento em abelhas em todo o mundo
(IBRAHIM et al., 2007; PEREZ-SATO et al., 2009; HARBO & HARRIS, 2009; RINDERER et
al., 2010; BUCHLER et al., 2010; PERNAL et al., 2012). Segundo diversos autores (SPIVAK
& REUTERS, 1998; DOWNEN & WINSTON, 2001; GARCIA et al., 2013; PADILHA et al
2013; GÜLER, 2013), a resistência a doenças e defesa contra parasitas das colônias é a
característica de interesse mais usada, devido sua influência direta sobre as demais
6
características de interesse, tais como produção de mel, pólen e própolis, pois ao se obter
colônias sadias, essas tendem a ser mais populosas e, consequentemente, mais produtivas.
O melhoramento genético, portanto, consiste em induzir o aumento da frequência de
genes de interesse dentro do pool gênico de uma população, visando obter linhagens que
reproduzam determinada característica acima da média da geração da qual foi feita a
seleção. Deste modo, a herdabilidade pode ser condiderada um parâmetro genético
fundamental em programas de melhoramento, pois estima o quanto da variância fenotípica
pode ser atribuída a variância genética, ou seja, a magnitude do componente genético
associado a determinada característica (RINDERER, 2008).
Para autores como Harbo & Harris (1999), valores de herdabilidade maiores que 0,25
já demonstram potencial para seleção. Entretanto, devido à grande variação nas estimativas
de herdabilidade encontradas (STANIMIROVIĆ et al., 2008 COSTA-MAIA et al., 2010;
PERNAL et al., 2011; PADILHA et al., 2013; WALIEWSKY et al., 2013) e à complexidade
das interações sociais afetas as características comportamentais, sugere-se que o
comportamento higiênico seja influenciado significativamente por fatores ambientais.
De acordo com Gramacho & Spivak (2003), uma colônia higiênica para fins de
seleção em programas de melhoramento é aquela em que as abelhas removem 80 a 100%
das crias mortas em 24 horas após o teste por perfuração. Este comportamento é avaliado
de acordo com a rapidez de que cada colônia remove uma amostra de criação morta e/ou
doente. Além disso, nos trabalhos de Panasiuk et al., (2010ab) ficou demonstrado que além
das etapas conhecidas de desoperculação e remoção das crias mortas ou doentes, as
abelhas higiênicas realizam uma prévia inspeção das células de cria por meio da introdução
de suas antenas no opérculo, etapa denominada de pontuação. Deste modo, também ficou
constatado que existe polietismo temporal na execução destas tarefas, ou seja, as etapas
deste comportamento são realizadas de acordo com a faixa etária dos indivíduos e, assim,
como já demonstrado em outros trabalhos (SWANSON et al., 2009; PALÁCIO et al., 2010),
o extravasamento do fluido corporal da pupa e a temperatura no interior das células
configuram-se em importantes estímulos para manifestação deste comportamento,
sugerindo que, em colônias higiênicas, as abelhas que realizam a inspeção das células tem
mais habilidades sensoriais de discriminação de odores e temperatura que as não
higiênicas.
2.3. Morfometria Geométrica
A morfometria, de um modo geral, pode ser definida como o estudo da forma e do
tamanho, e ainda de como estas duas variáveis se relacionam entre si (DUJARDIN, 2011).
7
Assim, a morfometria se constitui em uma ferramenta precisa e de baixo custo (FRANCOY
2008; TOFILSKI, 2009), quando comparada aos métodos moleculares, para entender a
relação destas variáveis com diversas outras, como, por exemplo, a idade, o sexo, relações
de parentesco e os efeitos da variação geográfica entre os organismos. A morfometria é
uma ferramenta poderosa que identifica as diferenças nas formas dos organismos e ajuda a
explorar as causas dessas variações dentro e entre os indivíduos (LAWING & POLLY,
2010). O objetivo da morfometria, portanto, não é o estudo da forma propriamente dita, mas
sim de suas causas, efeitos e consequências (ROLFH, 1990; BOOKSTEIN, 1997).
Todavia, há uma desatenção para com a importância do tamanho, forma e
comportamento que os organismos apresentam em relação às restrições ecológicas e
pressões seletivas do ambiente. Assim, a temperatura, humidade, altitude, competição,
predação e o parasitismo, por exemplo, podem exercer influências sobre o metabolismo
destas características, resultando em fenótipos distintos daqueles previamente programados
pelo seu genótipo (HANDLEY et al., 2011; TUNEZ et al., 2013). Neste contexto, a grande
diversidade de ecotipos apresentada pelas abelhas Apis mellifera, são bons exemplos da
acomodação genética e da plasticidade fenotípica de suas populações em resposta às
pressões locais dos distintos domínios morfoclimáticos em que ocorrem (ANDERE et al.,
2008; GRUBER et al., 2013). Nos organismos que voam, por exemplo, padrões de voos
distintos podem necessitar de condições fisiológicas e bioquímicas diferentes, resultando em
alterações na morfologia dos indivíduos. Nas abelhas A. mellifera, estudos (HEPBURN et
al,. 2011; DILLON et al., 2013) demonstraram que a área da superfície da asa aumenta a
uma taxa maior do que a massa de todo o corpo com a elevação da altitude reduzindo o
gasto energético com o voo.
As asas desses insetos são amplamente utilizadas em análises morfométricas
bidimensionais, uma vez que são estruturas planas e possibilitam que grande parte das
informações de forma e tamanho sejam extraídas (NUNES et al., 2007). Além disso, em
abelhas do gênero Apis a herdabilidade, no sentido restrito (proporção da variância genética
aditiva sobre a variância total), para esse caráter é usualmente alta, próxima a 1, permitindo
a realização de inferências sobre os atributos genéticos dessas populações por meio de
carácteres fenotípicos (DINIZ-FILHO & BINI, 1994).
Assim, os primeiros trabalhos utilizando morfometria geométrica e padrões de
venação das asas para diferenciação de grupos de abelhas foram realizados com as
abelhas africanizadas e suas subespécies parentais. Nestes trabalhos, constatou-se uma
proximidade morfológica das abelhas africanizadas com a subespécie africana A. m.
scutellata, com pouca influência das subespécies europeias (FRANCOY, 2008). A principal
diferença da morfometria geométrica em relação aos métodos morfométricos tradicionais,
8
baseados principalmente no estudo de ângulos e distâncias é a análise multivariada,
baseada em pontos de coordenadas cartesianas. Além disso, na morfometria geométrica, as
imagens são submetidas à Procustes superimposition, ou seja, são rotacionadas,
transladadas e proporcionalizadas (removendo os efeitos de posição, orientação e
tamanho), dissociando o tamanho da forma, permitindo uma maior acurácia das
mensurações (MITTEROECKER & GUNZ, 2009).
Além disso, diversos estudos (ZAMORA et al., 2008; FRANCOY et al., 2009 e 2011;
MIGUEL et al., 2010; MAY-ITZÁ et al., 2012) já demonstraram conformidade entre dados
morfométricos e genéticos, atestando a confiabilidade dos estudos morfométricos. Deste
modo, as análises morfométricas estão revelando que o desenvolvimento dos organismos
resulta de uma complexa interação entre fatores genéticos e ambientais que afetam a forma.
A evolução, portanto, resulta de alterações nessas interações, e assim a seleção natural
favorece as formas que realizam mais eficazmente algumas funções relacionadas com o
ajustamento dos indivíduos ao meio que vivem (KLINGENBERG, 2010).
A identificação e a procura por marcadores morfológicos e genéticos, que pudessem
distinguir o perfil das abelhas do gênero Apis, nortearam os primeiros estudos com essas
espécies de abelhas (FRANCOY et al., 2006 e 2008). No entanto, atualmente busca-se um
padrão fenotípico para as características de desempenho desejadas, assim tais marcadores
podem ser utilizados para maximizar a produtividade dessas abelhas por meio do
melhoramento genético da espécie (JEVTIĆ et al., 2011).
Além disso, os métodos que se baseiam em parâmetros morfométricos
correlacionam às distâncias medidas nas estruturas dos animais, sendo que as relações
entre essas medidas e os conceitos estatísticos associados são à base de toda a análise
multivariada. Portanto, foi a partir desta necessidade de levar em consideração,
simultaneamente, os diferentes níveis de variação e covariação entre as medidas, que
surgiram todos os métodos multivariados usados atualmente (CRUZ & REGAZZI, 1997;
MONTEIRO & REIS, 1999).
A estatística multivariada pode ser definida como um conjunto de técnicas
exploratórias de sintetização (ou simplificação) da estrutura de variabilidade dos dados,
consistindo em estudar diversas variáveis simultaneamente. Dentre as técnicas de análise
multivariada, está a de variáveis canônicas, que consiste em transformar um conjunto de
variáveis originais em um pequeno número de combinações lineares de dimensões
equivalentes. O objetivo é obter variáveis que retenham o máximo possível de informações
e expliquem a maior parte da variabilidade total, revelando o tipo de relação existente entre
as variáveis em estudo (MONTEIRO & REIS, 1999).
9
Além disso, a técnica de análise de variáveis canônicas é a mais utilizada no intuito
de identificar e quantificar a associação entre dois ou mais conjuntos de variáveis
(JOHNSON & WICHERN, 1998). Ao determinar o número de variáveis canônicas que
acumulam um mínimo de 80% da variância total disponível, estimam-se os escores de cada
variável canônica, que podem ser plotados em gráficos bi ou tridimensionais, sendo as
variáveis canônicas usadas como eixos de referência, em que podem ser visualizadas as
distâncias gráficas que representam as similaridades e dissimilaridades entre o objeto de
estudo (PIASSI, 1995).
A análise de variáveis canônicas fornece uma descrição das diferenças entre os
grupos especificados a priori em um conjunto de dados multivariados. Através do uso dessa
técnica é possível verificar a relação da magnitude de diferenças entre os grupos e aquela
dentro de cada grupo. Assim, a análise de variáveis canônicas maximiza a variação de uma
matriz de variâncias e covariâncias e descreve os eixos de variação máxima possibilitando a
formação dos grupos (MONTEIRO & REIS, 1999).
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Ecorregiões
Os estudos foram realizados em três distintas regiões geomorfológicas do Estado de
Sergipe, nordeste do Brasil, apresentando homogeneidade das características
morfoclimáticas dentro, e heterogeneidade entre as regiões, caracterizando, assim, três
regiões ecologicamente bem definidas, denominadas ecorregiões (Tabela 1) e (Figura 1e 2).
Figura 1. Representação ilustrativa dos locais onde os estudos foram realizados.
10
Tabela 1. Origem, localização geográfica, elevação e número de amostras de colônias de
Apis mellifera no Estado de Sergipe.
Localidade/ Apiário Latitude Longitude Elevação (m) Clima Nº /amostras
1- São Cristóvão 11°0′54″ 37°12′21″ 31m Tropical úmido 7 2 – Estância 11°16′4″ 37°26′16″ 10m Tropical úmido 8 3 – Japaratuba 10°35′34″ 36°56′24″ 109m Tropical úmido 8 4 - Brejo Grande 10°25′28″ 36°27′44″ 17m Tropical úmido 8 5 - Frei Paulo 10°32′56″ 37°32′2″ 272m Tropical seco 8 6 – Aquidabã 10°16′ 52″ 37°29′40″ 226m Tropical seco 8 7 - N. S. da Glória 10º13‘06″ 37º25‘13″ 234m Semi-árido 8 8 - Canindé do S.F 9°38´31″ 37°47´16″ 214m Semi-árido 8 9 - Poço Verde 10°42′28″ 38°10′58″ 273m Semi-árido 8
Figura 2. Diagrama de sazonalidade, representando os índices de precipitação durante os
períodos seco e chuvoso nas ecorregiões estudadas.
3.2. Análises Morfométricas
As asas anteriores direitas de 710 indivíduos foram montadas entre lâminas de
microscópio e fotografadas com uma câmera digital acoplada a um estereomicroscópio,
utilizando o software de captura de imagens Leica Application suite versão 2.0. Foram
plotados 17 marcos anatômicos homólogos (Figura 3) nas intersecções das nervuras das
asas, como descrito em Francoy et al., (2008). Utilizando o software tpsDig versão 2.04
11
(ROHLF, 2005), as imagens foram alinhadas pelo quadrado de Procrustes e o tamanho do
centróide obtidos com o auxílio do software MorphoJ (KLINGENBERG, 2011).
Figura 3. A figura acima apresenta os 17 marcos anatômicos plotados nas intersecções das
asas da abelha africanizada Apis melífera L.
A análise de Variáveis Canônicas (AVC) foi utilizada, com o auxílio dos softwares
MORPHOJ (2011) e PAST (2001), para maximizar a variação entre as populações explicada
por cada variável canônica, em relação à variação entre as populações, e testar se as
médias destes grupos são significativamente diferentes, além de possibilitar a identificação
da similaridade entre os grupos em gráficos de dispersão bidimensionais facilitando assim a
sua interpretação geométrica.
A importância relativa das variáveis canônicas foi medida pela porcentagem de seus
autovalores (variâncias) em relação ao total dos autovalores, ou seja, é a porcentagem das
variâncias total que elas explicam (PIRES, 2002). Utilizando o programa NTSYSpc, também
aplicou-se o teste de Mantel, utilizando 5000 permutações para avaliar a correlação entre as
matrizes de altitude, Procrustes e tamanho. Posteriormente foi realizado o teste de
Validação Cruzada (Cross-Validation), para verificar a confiabilidade dos resultados. Além
disso, foi verificada a relação entre a variável independente tamanho do centróide das asas
das abelhas e a variável explicativa altitude, por meio da análise de regressão linear com o
auxílio do software R (2008), onde a equação linear aplicada foi:
y = a + bx,
12
onde y é o tamanho do centróide (mm), x é a altitude (m), a é o intercepto e b é o coeficiente
de inclinação da reta, e onde a e b são parâmetros desconhecidos a serem estimados.
3.3. Método de Perfuração de Crias
O comportamento higiênico foi avaliado a partir da metodologia descrita por Newton
& Ostasiewki (1986), adaptado por Gramacho & Gonçalves (1994 e 2009), e consistiu em
promover perfurações com alfinete entomológico (1 mm) (método de perfuração de crias)
nas pupas com idade em torno de 14 dias. Assim, foram perfuradas (10x10) 100 crias
(Figura 4) e após 24h observou-se quantas dessas foram removidas da colônia. O cálculo
para obtenção da porcentagem das colônias higiênicas segue descrito abaixo:
C = CV24h CV0h
C0
100
Onde:
CV24h = Nº de células vazias 24 horas após a perfuração
CV0h = Nº de células vazias antes da perfuração
C0 = Nº de células operculadas antes da perfuração
Z = fator de correção obtido no grupo controle
=
A 100
Onde:
Z = % de células onde as crias operculadas foram removidas naturalmente no
controle
A = Número de células de cria operculadas no controle antes da introdução do
favo na colônia para o teste de limpeza;
13
Y = Número de células na qual a cria foi removida naturalmente no controle,
sendo que: Y = C – B;
C = Número de células vazias do controle após o favo ter sido submetido ao teste
de limpeza na colônia analisada;
B = Número de células vazias da área B antes do favo ser submetido ao teste de
limpeza.
Figura 4. Quadro teste de uma colônia de abelhas africanizadas que foi submetido ao teste
do comportamento higiênico pelo método de perfuração de crias. Área (A) representa o
tratamento e (B) o grupo controle.
Sustentando o que foi descrito por Gonçalves (2006): que os números de
enxameações por abandono devido às condições climáticas e ambientais adversas
(temperatura, escassez de alimento e/ou água etc.) alcançam índices de abandono de até
50% no Nordeste. Durante o período de estudo que ocorreu de fevereiro à junho, 8 colônias
enxamearam e não puderam ser avaliadas por meio do teste da perfuração. Assim, a
metodologia foi aplicada em 63 colônias em dois períodos estacionais distintos, o seco e o
chuvoso, onde foi avaliada se a capacidade de remoção seria influenciada por fatores
ambientais tais como: altitude, temperatura, precipitação e sazonalidade.
14
A correlação entre as variáveis ambientais e a variável básica comportamento
higiênico foi obtida por meio da correlação de Spearman, as variações dos índices de
remoção entre as ecorregiões e entre os períodos seco e chuvoso foram avaliadas pelo
teste de Krustal-Wallis seguido do post-hoc de Siegel e Castellan (1988) para avaliar se as
diferenças encontradas foram de fato significativas.
Além disso, a análise de trilha (WRIGHT, 1921) foi usada para estimar os efeitos
diretos e indiretos das variáveis explanatórias temperatura, pluviosidade e altitude sobre a
variável resposta comportamento higiênico das colônias, estudadas através das correlações
entre estas variáveis. A análise de trilha foi aplicada, conforme Cruz, Regazzi e Carneiro
(2004), para quantificar as relações de causa e efeito entre variáveis utilizando-se de
equações de regressão, em que essas variáveis são padronizadas. As análises estatísticas
das variáveis anteriormente citadas ,bem como as técnicas utilizadas foram realizadas com
o auxílio do software R (2008).
4. RESULTADOS
No estudo das populações de A. mellifera, comparando a forma das asas, foram
necessárias as 14 primeiras variáveis canônicas para explicarem 80 % da variação total
entre as colônias avaliadas (Tabela 2). Deste modo verificou-se que não foram formados
grupos, sugerindo a existência de um intenso fluxo gênico entre as colônias (Figura. 5).
Resultado esse, também constatado pela análise de validação cruzada, onde demonstrou a
similaridade existente entre os indivíduos da A. mellifera nas localidades estudadas, pois
apenas 33% dos indivíduos foram classificados corretamente.
15
Tabela 2. Variáveis canônicas, autovalores, porcentagem de variância e porcentagem da
variância acumulada obtidas com a análise das colônias.
VCA λi σ2 % σ2 acumulada % 1. 2,998 23,966 23,966
2. 0,971 7,763 31,729
3. 0,824 6,592 38,322
4. 0,666 5,330 43,652
5. 0,629 5,033 48,684
6. 0,613 4,905 53,590
7. 0,542 4,340 57,930
8. 0,519 4,151 62,081
9. 0,466 3,731 65,812
10. 0,447 3,580 69,392
11. 0,432 3,456 72,848
12. 0,369 2,950 75,798
13. 0,339 2,711 78,509
14. 0,302 2,417 80,926
15. 0,295 2,365 83,291
16. 0,263 2,107 85,398
17. 0,238 1,904 87,301
18. 0,230 1,841 89,142
19. 0,193 1,546 90,689
20. 0,185 1,481 92,170
21. 0,159 1,276 93,446
22. 0,146 1,172 94,618
23. 0,133 1,066 95,685
24. 0,103 0,829 96,514
25. 0,102 0,817 97,331
26. 0,094 0,754 98,085
27. 0,076 0,615 98,701
28. 0,064 0,515 99,216
29. 0,052 0,417 99,633
30. 0,045 0,367 100,000
* VCA= Variável Canônica; λi = autovalores; σ2 = variância.
16
Figura 5. Dispersão gráfica das colônias de Apis mellifera em relação ao eixo cartesiano
estabelecido pelas variáveis canônicas (CVA 1, CVA 2). Azul claro: Colônias de Canindé do
São Francisco; Vermelho: Brejo Grande; Verde escuro: Estância; Rosa: São Cristóvão;
Amarelo: Poço verde; Preto: Aquidabã; Verde Claro: Glória; Roxo: Frei Paulo; Azul escuro:
Japaratuba.
As análises iniciais, apesar de não haverem demonstrado diferenças significativas
entre os indivíduos quando se compara as colônias de A. mellifera como um todo, ao se
observar a sua distribuição por ecorregião, entretanto, verifica-se a formação de grupos,
sugerindo que a localização interfere na variação da forma das asas dessa espécie. Além
disso, quando essas mesmas colônias, ao serem comparadas por ecorregião, a segunda
variável canônica já explicava 100% da variação total dos indivíduos (Tabela 3). Nas
análises de divergência das populações de abelhas africanizadas a configuração da
distribuição dos grupos, foi representada em um espaço bidimensional para facilitar a
visualização das similaridades entre as colônias, definidas por dois vetores canônicos,
utilizando os escores das variáveis canônicas obtidas a partir das duas primeiras variáveis
canônicas (Figura. 6).
Tabela 3.Variáveis canônicas, autovalores, porcentagem de variância e porcentagem da
variância acumulada obtidas com a análise das ecorregiões.
VCA λi σ2 % σ2 acumulada %
1 0,320 57,729 57,729
2 0,234 42,271 100,000
* VCA= Variável Canônica; λi = autovalores; σ2 = variância.
-6.4 -4.8 -3.2 -1.6 0 1.6 3.2 4.8 6.4CVA 1
-8
-6.4
-4.8
-3.2
-1.6
0
1.6
3.2
4.8
CV
A 2
17
Figura 6. Dispersão gráfica dos grupos de Apis mellifera em relação ao eixo cartesiano
estabelecido pelas variáveis canônicas (AVC 1, AVC 2), obtida a partir da morfometria das
asas. Azul: Zona da Mata, Vermelho: Agreste e Verde: Semiárido.
Entretanto, quando as colônias foram avaliadas por apiários somente as duas
primeiras variáveis canônicas foram necessárias para explicar 72,107% da variação total
dos indivíduos (Tabela 4). Essa variação também pode ser verificada no gráfico de
dispersão da variação por apiários (Figura. 7).
Tabela 4.Variáveis canônicas, autovalores, porcentagem de variância e porcentagem da
variância acumulada obtidas com a análise das ecorregiões.
VCA λi σ2 % σ2 acumulada %
1 1.30389 47.03 47.03
2 6.95253 25.07 72.107
3 5.51556 19.89 92.001
4 2.21745 7.99 100.000
* VCA= Variável Canônica; λi = autovalores; σ2 = variância.
-4.8 -3.6 -2.4 -1.2 0.0 1.2 2.4 3.6 4.8AVC 1
-6.0
-4.8
-3.6
-2.4
-1.2
0.0
1.2
2.4
3.6
4.8
AV
C 2
18
Figura 7. Gráfico de dispersão dos apiários de Apis mellifera em relação a eixos cartesianos
estabelecidos pelos variáveis canônicas (AVC 1, AVC 2) demonstrando a distância entre os
mesmos por meio da distância generalizada de Mahalanobis.
Deste modo, foi aplicado o teste de Mantel (Tabela 5) para avaliar as correlações
entre as matrizes de distância de Procrustes (forma), tamanho e altitude. Portanto, verificou-
se a existência de correlação positiva entre as matrizes de forma e de altitude, com
significância alta e margens de erro inferior a 5%, indicando uma colinearidade entre estes
efeitos. Logo, pode-se verificar que a forma das asas são influenciadas pela altitude,
sugerindo que essa característica contribuiu para a divergência dos grupos de A. mellifera
entre os apiários e dentro das ecorregiões.
Tabela 5.Teste de Mantel para a comparação das matrizes de forma, tamanho e altitude
utilizando medições de asas da Apis mellifera com 5000 permutações.
ESTRUTURA MATRIZES COMPARADAS r R2 P
D2 de Procrustes vs Altitude 0,06239 0,00389 0.0098*
ASA D2 de Procrustes vs Tamanho -0.07949 0,00631 0.8384NS
* NS = não significativo / * significativo.
Além disso, as estimativas da análise de regressão demonstram que a altitude tem
poder explicativo sobre o tamanho do centróide das asas das abelhas. Como pode ser visto
na (Tabela 6) e na (Figura 8), a inclinação da reta é positiva (0.001), indicando que o
aumento da altitude tem relação linear e positiva com o aumento do tamanho do centróide.
19
Tabela 6. Estimativa dos coeficientes da reta de regressão com respectivo desvio padrão,
valor t e p-valor.
Estimativa Desvio Padrão Valor t p-valor
Intercepto 6,571 0,028 237,241 < 2∙10-16
Altitude 0.001 0.0001 8,475 < 2∙10-16
Figura 8. Relação linear entre o tamaho do centróide (mm) predito pela equação de
regressão e a altitude (m). Os pontos cinzas são os tamanhos dos centróides observados;
os pontos pretos são os tamanhos do centróide preditos pela equação linear; a reta
representa a relação linear entre os tamanhos do centróide e a altitude.
Os resultados também revelaram que das 63 colônias que foram submetidas ao
tratamento, 28 apresentaram comportamento higiênico (Figura. 9) médio acima de 80%,
indicando potencial para seleção, como matrizes em programas de melhoramento genético.
O resultado do teste de Kruskal-Wallis verificou que o comportamento higiênico das abelhas
africanizadas varia sazonalmente (p=0,022; α=0,05) e entre as ecorregiões (p=0,001;
α=0,05): ona da mata, Agreste e Sertão (Figura.10).
20
Figura 9. A figura acima demonstra uma colônia não higiênica (A) onde as crias mortas não
foram removidas após 24h e a imagem (B) uma colônia higiênica.
Tabela 7. Média e desvio-padrão dos comportamentos higiênicos associados a cada
ecorregião (Agreste, Sertão e Zona da Mata).
Ecorregiões Agreste Sertão Zona da Mata
Média 68,594 (b) 57,271 (c) 81,848 (a)
Desvio - Padrão 17,859 31,851 11,813
* (P =0, 05)
Uma vez encontrada diferença significativa entre as ecorregiões a, b e c, foi possível
a aplicação do teste post-hoc de Siegel e Castellan (1988) para se conhecer quais delas são
de fato diferentes. Desse modo, os resultados do teste (Tabela 8) evidenciaram que a
diferença observada excede a diferença crítica somente no Agreste e Sertão em relação a
Zona da Mata, assim, aceitamos, neste caso, que as populações são de fato diferentes.
Além disso, como pode ser visto na (Figura. 10), a Zona da Mata apresentou os maiores
índices de remoção pelo método de perfuração de crias.
21
Tabela 8. Teste post-hoc com valores da diferença observada e diferença crítica para cada
comparação entre ecorregiões.
Ecorregiões Diferença observada Diferença crítica Diferença
Agreste – Sertão 4,943 19,951 Falsa
Agreste – Z. da Mata 22,406 20,124 Verdadeira
Sertão – Z. da Mata 27,348 18,038 Verdadeira
Figura 10. Diagrama de caixas do comportamento higiênico (%) nas três ecorregiões:
Agreste, Sertão e Zona da Mata.
Assim, como já demonstrado na (Figura. 2), os índices de precipitação variam entre
os períodos seco e chuvoso, influenciando nos percentuais de remoção de crias devido a
sazonalidade (Figura. 11). Além disso, os coeficientes de correlação de Spearman entre a
variável dependente comportamento higiênico e as variáveis explicativas ou independentes
temperatura (ρ=0,065; p=0,471; α=0,05), pluviosidade (ρ=0,274; p=0,002; α=0,05) e altitude
(ρ=-0,294 p=0,001; α=0,05), nos permitem identificar que associações significativas foram
encontradas entre o comportamento higiênico das abelhas, a pluviosidade e a altitude,
assim, o aumento da pluviosidade está em fase com o aumento do comportamento
higiênico, enquanto que o aumento da altitude está inversamente associado ao aumento do
comportamento higiênico. As relações de causalidade entre as variáveis ambientais e os
22
seus efeitos sobre o comportamento higiênico das abelhas africanizadas está demonstrado
na análise de trilha (Tabela 9) e (Figura. 12).
Figura 11. Diagrama de caixas do comportamento higiênico (%) nas estações chuvosa e
seca.
Os resultados da análise de trilha (Tabela 9) demonstraram que o efeito direto mais
pronunciado é o da pluviosidade (0,311), seguido pelo efeito negativo da altitude (-0,172) e
temperatura (0,084). Este resultado indica que a pluviosidade é o principal modulador do
comportamento higiênico das abelhas, apresentando efeito positivo sobre este. Por outro
lado, a altitude se apresenta com um importante efeito inverso: o comportameno higiênico
tende a diminuir com o aumento da altitude.
Os efeitos indiretos são descritos como o coeficiente de uma variável via outra
variável. Assim, o efeito da temperatura via pluviosidade (linha 1, coluna 2) é de -0,093
(Tabela 9). Isso significa que a temperatura influencia a pluviosidade e que esta influencia o
comportamento higiênico de forma negativa. O principal efeito indireto é o da altitude via
pluviosidade, ou seja, a altitude tem efeito sobre a pluviosidade, que por sua vez tem efeito
sobre o comportamento higiênico das abelhas.
Desse modo, os resultados demonstram que o principal efeito modulador do
comportamento higiênico é a pluviosidade, seja de forma direta ou indireta (Fig.12).
23
Tabela 9. Efeitos diretos (diagonal) e indiretos estimados entre a variável resposta
comportamento higiênico das abelhas e as variáveis explicativas temperatura, pluviosidade
e altitude.
Temperatura Pluviosidade Altitude
Temperatura 0,084 -0,093 0,069
Pluviosidade -0,025 0,311 0,074
Altitude -0,034 -0,138 -0,172
Figura 12. Diagrama em cadeia ilustrativo dos efeitos das variáveis explicativas primária
(pluviosidade) e secundárias (altitude e temperatura) sobre a variável resposta
(comportamento higiênico).
5. DISCUSSÃO
Os resultados apresentados neste trabalho demonstraram que os distintos padrões
morfoclimáticos das ecorregiões influenciaram na forma (r=0,06239; p= 0.05) e tamanho
(0.001) das asas das abelhas africanizadas, sugerindo que a altitude tenha desempenhado
importante papel na separação dessas populações. Trabalhos semelhantes (SOUZA et al.,
2009; KEKECOGLU et al., 2010; PARKER et al., 2010; NUNES et al., 2012)também
demonstraram como a distribuição das populações de abelhas ao longo de regiões
ecologicamente distintas influenciam na diferenciação desses grupos e que a grande
capacidade de dispersão e a alta plasticidade fenotípica (LE CONTE & NAVAJAS, 2008)
contribuem para a adaptação das abelhas às diferentes regiões geomorfológicas. Neste
sentido, trabalhos (DILLON et al., 2006; HEPBURN et al., 2011) já demonstraram como as
variações topográficas interferem no desenvolvimento dos organismos, contribuindo para a
24
formação desses polifenismos. Segundo Klok et al., (2009), a altitude exerce influência no
tamanho e forma das estruturas dos organismos, pois nestas condições o ar se torna
rarefeito e a hipoxia compromete o desenvolvimento dos indivíduos devido ao baixo
suprimento energético. Além disso, em maiores altitudes a densidade do ar é menor e
fornece menos sustentação para o batimento das asas desses insetos alterando, assim, a
proporção entre o tamanho da asa e massa corporal desses organismos (HARRISON et al.,
2010). Assim, os resultados deste trabalho demonstraram, corroborando com os resultados
apresentados por Gruber et al., (2013), que o intenso fluxo gênico evidenciado entre as
colônias estudadas, a alta variabilidade de tamanhos das asas dos indivíduos e as
diferenças pronunciadas nos distintos apiários e ecorregiões, são resultado da plasticidade
fenotípica e não de divergência genética entre as populações de abelhas africanizadas. As
técnicas de análise multivariada, portanto, mais uma vez demonstraram a exemplo de outros
estudos (FRANCOY, 2008; TOFILSKI, 2009; GÜLER et al., 2010) que, quando associada a
dados morfométricos da venação alar, são eficientes na caracterização das divergências
entre populações de abelhas. Neste contexto, a caracterização dessas divergências, bem
como a compreensão das causas e consequências dessas variações na composição dos
distintos ecotipos de abelhas, como demonstrado por (ANDERE et al., 2008; STRANGE et
al., 2008; SHAIBI et al., 2009; RAHIMI & MIRMOYED, 2013), podem ser exploradas em
programas de manejo, conservação e melhoramento.
Além disso, ficou demonstrado que os efeitos da sazonalidade (p= 0,022; α=0,05) e
das ecorregiões (p=0,001; α=0,05), com influência direta da precipitação (0,311) e
temperatura (0,084), e indireta da altitude (-0,172), interferem no comportamento higiênico
das abelhas africanizadas, fato que pode ser explicado pela diversidade de regimes
climáticos dessas localidades, reforçando a influência dos fatores ambientais na
manifestação dessa característica. Trabalhos semelhantes apresentaram Panasiuk et al.,
(2009) e Güler et al., (2013), quando constataram que existem diferenças nas taxas de
remoção entre os períodos de alto e baixo fluxo de néctar na colônia nos meses
correspondentes a maiores e menores índices de precipitação.
Tal fato pode ser explicado por Invernizzi (2001), onde propõe que durante períodos
de chuva há mais alimento disponível, o que implica maior vigor por parte das abelhas,
servindo de estímulo para limpeza dos favos e armazenamento do alimento. Além disso,
(MESSAGE & GONÇALVES, 1984) sugerem que em períodos chuvosos há uma maior
quantidade de abelhas no interior da colônia, facilitando a detecção de crias mortas doentes
ou parasitadas. Os resultados deste trabalho contrastam com os resultados apresentados
por (STANIMIROVIĆ et al., 2008; PADIL A et al., 2013; WALIEWSKY et al., 2013), que
encontraram forte componente genético associado com a característica. Assim sendo, o
25
presente trabalho corrobora com trabalhos (COSTA-MAIA et al., 2010 e PERNAL et al.,
2011) que sugerem que o componente ambiental esteja envolvido de maneira significativa
na manifestação dessa característica. Ficou demonstrado, ainda, corroborando com
(GRAMACHO & GONÇALVES, 2009 e PALÁCIO et al., 2010), que as colônias higiênicas
são mais eficientes na detecção e remoção de crias mortas pelo método de perfuração de
crias que as colônias não higiênicas.
Deste modo, na busca de um padrão fenotípico correspondente a uma carcaterística
de interesse, vários trabalhos (EDRISS et al., 2002; SOUZA et al., 2002; MOSTAJERAN et
al., 2006) já demonstraram correlação entre características fenotípicas e de desempenho
em abelhas. Neste sentido, Jevtić et al., (2011) encontrou correlação entre padrões
fenotípicos da asa de abelhas com o comportamento higiênico, sugerindo que os
organismos que possuíam maior largura da asa apresentavam maiores taxas de remoção
de crias mortas ou doentes. O presente trabalho, entretanto, não encontrou relação entre as
características fenotípicas avaliadas e o comportamento higiênico das abelhas
africanizadas.
6. CONCLUSÃO
Portanto,conclui-se pela existência de divergências nas populações de abelhas
africanizadas nos apiários e entre as ecorregiões do Estado de Sergipe, comprovando a
influência de fatores estocásticos na morfologia, comportamento e distribuição destes
grupos. Além disso, o intenso fluxo gênico observado entre as populações denotam a
grande variabilidade genética desses grupos, fato este que pode ser explorado em futuros
programas de manejo, conservação e melhoramento. O presente trabalho, entretanto, não
encontrou correlação entre o tamanho da asa e o comportamento higiênico, não se
configurando nesse caso, portanto, em um bom marcador morfológico para esta
característica de interesse.
Por fim, reforça-se a necessidade por mais estudos relacionados à interação entre
fatores genéticos e ambientais, visando entender os efeitos das variações geográficas sobre
o comportamento higiênico e morfologia das abelhas africanizadas.
26
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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35
Sociobiology
An international journal on social insects
Bee’s Morphometrics and Behavior upon Seasonal Effects from Ecoregions
ARS SOUSA1, ED ARAÚJO
2, KP GRAMACHO
3, LA NUNES
4, LT BARBOSA
1
1Federal University of Sergipe (Universidade Federal de Sergipe - UFS), Campus José
Aloízio de Campos, Graduate Centre for Biotechnology and Environmental Resources
(Núcleo de Pós Graduação em Biotecnologia e Recursos Naturais)/São Cristóvão, SE, Brazil.
2Federal University of Sergipe (UFS), Campus José Aloízio de Campos, Biology Department,
Laboratory of Genetics and Conservation of Natural Resources (Laboratório de Genética e
Conservação de Recursos Naturais – GECON)/São Cristóvão, SE, Brazil.
3Tiradentes University (Universidade Tiradentes), Campus Farolândia, Laboratory of
Biological Studies and Natural Products (Laboratório de Estudos Biológicos e Produtos
Naturais-LBPN), Technology and Research Institute (Instituto de Tecnologia e Pesquisa-
ITP)/Aracaju, SE, Brazil.
4Federal University of Reconcavo da Bahia (Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia-
UESB) (Programa da Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação)/Jequié,
BA, Brazil.
Running head: Combined morphometrics and pin-killing method to assess bee’s data
36
ABSTRACT
The present study characterized the divergences among 71 colonies of Africanized honey bees
located in 3 distinct ecoregions (Zona da Mata, Agreste and Sertão) of the State of Sergipe,
north-eastern Brazil, through morphological and behavioral analyses to assess the relationship
between the effects of seasonality and the morphoclimatic patterns from the ecoregions on the
morphology, behavior and distribution of these groups of bees. The high gene flow evidenced
by the studied colonies and the pronounced differences among distinct apiaries and
ecoregions, with influence of altitude on the shape (r=0.06239; p=0.05) and size (0.001),
contributed to the segregation of these groups via phenotypic plasticity rather than genetic
divergence among the studied populations of Africanized honey bees. Furthermore, the results
also demonstrated a significant difference in the hygienic behavior of these populations
between the dry and rainy seasons (p= 0.022; α=0.05) and between ecoregions (p=0.001;
α=0.05), with the influence of temperature (ρ=0.065; p=0.471; α=0.05) and altitude (ρ=-
0.294; p=0.001 α=0.05) on the rainfall (ρ=0.274; p=0.002; α=0.05) as the main modulator of
hygienic behavior, thereby reinforcing the hypothesis of the influence of environmental
factors on the expression of this trait. Therefore, we conclude that the influence of stochastic
factors on the morphology, behavior and distribution of Africanized honey bees as well as the
identified polyphenisms denoting the high genetic variability of these populations can be
exploited to direct the future conservation, handling and breeding programs for bees.
Keywords: Africanized honey bees, gene flow, hygienic behavior, geometric morphometrics,
phenotypic plasticity, polyphenism
37
INTRODUCTION
Bees are essential to the balance of ecosystems and play a fundamental role as
pollinators and thus contribute to the reproduction and dispersal of the majority of angiosperm
species, with most being economically important, in a complex coevolutionary process that
has occurred over the past 100 million years (Renner & Schaefer, 2010; Cardinal & Danforth,
2013). Although quantifying the pollination services is difficult, several studies have
demonstrated their value for agribusiness and related ecosystems (Aizen et al., 2008; Allsopp
et al., 2008; Gallai et al., 2009; Lautenbach et al., 2012). The loss of this natural capital,
therefore, could adversely affect the maintenance of wild plant diversity, ecosystem stability,
agricultural production, food security and human welfare (Potts et al., 2010; Thomann et al.,
2013).
The increasing decline in bee species around the world, as a result of climate change
(Williams et al., 2010; González-Varo et al., 2013), the proliferation of parasites and
pathogens (Graystock et al., 2013; Wagoner et al., 2013), the indiscriminate use of pesticides
(Carrasco-Latelier et al., 2012; Cresswell et al., 2012; van der Sluijs et al., 2013) and the
synergistic effects of these factors, has attracted attention and resulted in even more studies
aimed at the characterization, technological exploitation and sustainable use of these species
of pollinators.
Apis mellifera species are widely distributed throughout the tropical regions and occur
on the American continent as polyhybrids produced by cross-breeding European subspecies
with the African subspecies A. m. scutellata. The great genetic plasticity and adaptability
shown by these honey bee groups has contributed to their spread throughout several
morphoclimatic patterns of the tropical regions. These groups have acquired their own
characteristics and are known as Africanized honey bees (Gonçalves, 1974).
38
Africanized honey bees have, as one of their main features, high resilience to diseases
due to the innate ability of some of their colonies to detect, uncap and remove dead or
diseased brood, thereby preventing the spread of diseases in their nests. This feature is called
hygienic behavior (Rothenbuhler, 1964a,b; Spivak & Gilliam, 1993; Palacio et al., 2000),
which is a form of social immunity (Cremer & Sixt, 2009; Cotter & Kilner, 2010; Locke et
al., 2012) and is economically important due to its influence on the colony’s resistance to
parasites and pathogen infestations (Evans & Spivak, 2010; Rosenkranz et al., 2010) and its
relationship with other characteristics of interest (Spivak & Reuter, 1998; Downey &
Winston, 2001; Garcia et al., 2013; Güler & Toy, 2013; Padilha et al., 2013).
Hygienic behavior is an attribute that has been widely explored (Ibrahim et al., 2007;
Harbo & Harris, 2009; Perez-Sato et al., 2009; Buchler et al., 2010; Rinderer et al., 2010;
Pernal et al., 2012) as an index for honey bee breeding selection, although it is correlated with
the expression of groups of genes (Lapidge et al., 2002; Oxley et al., 2010). A complex
interaction among environmental (Panasiuk et al., 2009; Guler, 2013), social (Panasiuk et al.,
2010; Palacio et al., 2010) and even epigenetic factors (Herb et al., 2012) is believed to
determine its manifestation.
The distribution of populations of Apis throughout diverse climates and regions of the
American continent and the selective pressures of these sites have contributed to the
promotion of the morphophysiological and behavioral variability of these groups through the
development of typical ecotypes for a better fit to these climatic domains (Andere et al., 2008;
Parker et al., 2010; Meixner et al., 2010). In this context, geometric morphometrics has been
demonstrated to be an accurate and inexpensive tool (Francoy et al., 2006, 2008; Tofilski,
2009) in the study of the differences among populations of bees, allowing relationships to be
established between the causes and consequences of variations in the adjustment of
individuals to their natural habitat (Lawing & Polly, 2010; Klingenberg, 2011).
39
Therefore, this study aimed to characterize the divergences among colonies of
Africanized honey bees and to assess the relationship between environmental factors such as
temperature, precipitation and seasonality of three distinct ecoregions and the morphology,
behavior and distribution of these groups of bees.
MATERIALS AND METHODS
Study area
The experiments were performed in three distinct geomorphological regions of the
state of Sergipe, northeastern Brazil. The morphoclimatic characteristics were homogenous
within the study sites and heterogeneous between them, which characterized the studied
regions as 3 ecologically well-defined areas called ecoregions (Table 1 and Figs. 1 and 2).
. Illustrative representation of the regions where the studies were conducted.
40
Table 1. Origin, geographic location, elevation and number of samples of Apis mellifera
colonies from the state of Sergipe.
Locality Latitude Longitude Elevation Climate Number of
samples
1- São Cristóvão 11°0′54″ 37°12′21″ 31 m Tropical humid 7
2- Estância 11°16′4″ 37°26′16″ 10 m Tropical humid 8
3- Japaratuba 10°35′34″ 36°56′24″ 109 m Tropical humid 8
4- Brejo Grande 10°25′28″ 36°27′44″ 17 m Tropical humid 8
5- Frei Paulo 10°32′56″ 37°32′2″ 272 m Dry tropical 8
6- Aquidabã 10°16′ 52″ 37°29′40″ 226 m Dry tropical 8
7- N. S. da Glória 10º13’06″ 37º25’13″ 234 m Semiarid 8
8- Canindé do S.F 9°38´31´´ 37°47´16´´ 214 m Semiarid 8
9- Poço Verde 10°42′28″ 38°10′58″ 273 m Semiarid 8
Fig. 2. Seasonality diagram representing the rainfall indices during dry and rainy periods.
Morphometrics
The right forewing of 710 individuals was placed between microscope slides and
photographed with a digital camera attached to a stereomicroscope using the image capture
software Leica Application Suite version 2.0. A total of 17 homologous landmarks (Fig. 3)
were plotted at the wing-vein intersections, as described in Francoy et al. (2008), using
41
software version 2.4 tpsDig (Rohlf, 2005). The images were then aligned, and centroid
coordinates were obtained with the aid of MorphoJ software (Klingenberg, 2011).
Fig.3. The picture represents the 17 anatomical landmarks plotted at the wing vein intersections of the
Africanized honey bee Apis mellifera L.
The analyses using the canonical variables technique were used to maximize the
variation among the studied populations as explained by each canonical variable with respect
to the variations among the studied populations and to test whether the groups’ means were
significantly different. The canonical analysis also enabled the identification of similarities
between groups in two-dimensional scatterplots, which facilitates the geometric interpretation
of the data. Thus, using the program NTSYSpc, the Mantel test using 5000 permutations was
applied to assess the correlations among the matrices’ altitude, shape and size. To verify the
reliability of the results, a cross-validation test was performed.
Furthermore, the relationship between the independent variable, honey bee wing
centroid size and the explanatory variable altitude was verified. The following linear equation
was used:
y = a + bx,
where y is the centroid size (mm), x is the altitude (m), a is the intercept, and b is the slope
coefficient; a and b are unknown parameters to be estimated.
42
Hygienic behavior
The hygienic behavior was evaluated by the pin-killing method (Fig. 4) according to
the methodology described by Newton and Ostasiewki (1986) and modified by Gramacho and
Gonçalves (2009). The correlation between environmental variables and the basic variable
hygienic behavior was obtained by the Spearman correlation. Variations in the removal rates
among ecoregions and between dry and rainy periods were evaluated by the Krustal-Wallis
test. Thus, the path analysis (Wright, 1921) was used to estimate the direct and indirect effects
of the explanatory variables of temperature, rainfall and altitude on the variable hygienic
behavior of the colonies by evaluating the correlations among these variables. The statistical
analysis of the variables and the techniques used were performed with the aid of software R
(2008).
Fig.4. Comb of an Africanized honey bee colony that was subjected to the hygienic behavior test by
the pin-killing method. Area (A) represents the treatment group, and area (B) is the control group.
RESULTS
In the comparison of the wing shape, the first 14 canonical variables were necessary to
account for 80% of the total variation among the studied A. mellifera colonies (Table 2). It
was verified that no groups were formed, which suggests a high gene flow between colonies
(Fig. 5). This result is evidenced by the cross-validation analysis that showed the similarity
43
between the individuals of A. mellifera from the studied regions, in which only 33%
specimens were correctly classified.
Table 2. Canonical variables, eigenvalues, variance percentage and percentage of cumulative
variance obtained from the colonies analysis.
VCA λi σ2 % σ2 cumulative % 1. 2,998 23,966 23,966
2. 0,971 7,763 31,729
3. 0,824 6,592 38,322
4. 0,666 5,330 43,652
5. 0,629 5,033 48,684
6. 0,613 4,905 53,590
7. 0,542 4,340 57,930
8. 0,519 4,151 62,081
9. 0,466 3,731 65,812
10. 0,447 3,580 69,392
11. 0,432 3,456 72,848
12. 0,369 2,950 75,798
13. 0,339 2,711 78,509
14. 0,302 2,417 80,926
15. 0,295 2,365 83,291
16. 0,263 2,107 85,398
17. 0,238 1,904 87,301
18. 0,230 1,841 89,142
19. 0,193 1,546 90,689
20. 0,185 1,481 92,170
21. 0,159 1,276 93,446
22. 0,146 1,172 94,618
23. 0,133 1,066 95,685
24. 0,103 0,829 96,514
25. 0,102 0,817 97,331
26. 0,094 0,754 98,085
27. 0,076 0,615 98,701
28. 0,064 0,515 99,216
29. 0,052 0,417 99,633
30. 0,045 0,367 100,000
* VCA: canonical variable; λi: eigenvalues; σ2: variance.
44
Fig. 5. Scatterplot of the Apis mellifera colonies in relation to the Cartesian axis established by the
canonical variables (CVA 1, CVA 2). Light blue: Canindé do São Francisco colonies; Red: Brejo
Grande; Dark green: Estância; Pink: São Cristóvão; Yellow: Poço verde; Black: Aquidabã; Light
Green: Glória; Purple: Frei Paulo; Dark blue: Japaratuba.
In the initial analyses, when all the A. mellifera colonies were compared as a whole, no
significant difference was found between them. However, when the colonies were compared
by ecoregions, the formation of groups was observed, suggesting that location affects the
wing-shape variation of this honey bee species. Moreover, when these same colonies were
compared by ecoregions, the second canonical variable accounted for 100% of the total
specimens’ variation (Table 3). In the divergence analysis, the distribution of the groups was
represented in a two-dimensional plot to facilitate the visualization of the colony similarities,
which were defined by two canonical vectors using the canonical variable scores obtained
from the first two canonical variables (Fig. 6).
Table 3. Canonical variables, eigenvalues, variance percentage and percentage of cumulative
variance obtained from the ecoregions analysis.
VCA λi σ2 % σ2 cumulative %
1 0,32073702 57,729 57,729
2 0,23484939 42,271 100,000
* VCA: canonical variable; λi: eigenvalues; σ2: variance.
45
Fig. 6. Scatterplot of the Apis mellifera colonies in relation to the Cartesian axis established by the
canonical variables (CVA 1, CVA 2) obtained from wing morphometrics. Blue: Zona da Mata; Red:
Agreste; Green: Sertão.
Thus, when the colonies were evaluated according to the apiaries, only the first two
canonical variables were necessary to account for 72.107% of the total individual variation
(Table 4). This variation can also be observed in the scatterplot in Fig. 7.
Table 4. Canonical variables, eigenvalues, variance percentage and percentage of cumulative
variance obtained from the ecoregions analysis.
VCA λi σ2 % σ2 cumulative %
1 1.303 47.03 47.03
2 6.952 25.07 72.107
3 5.515 19.89 92.001
4 2.217 7.99 100.000
* VCA: canonical variable; λi: eigenvalues; σ2: variance.
Fig. 7. Scatterplot of the Apis mellifera apiaries in relation to the Cartesian axis established by the
canonical variables (CVA 1, CVA 2) showing the distance between them according to the
Mahalanobis’ generalized distance.
46
The results of Mantel test (Table 5) shown a positive correlation between shape and
altitude matrices, with high significance and less than 5% error, which indicates collinearity
between these effects. Therefore, it can be seen that the shape of the wings are influenced by
altitude, suggesting that altitude contributed to the divergence of the A. mellifera groups
between apiaries and within ecoregions.
Table 5. Mantel test for the comparison of shape and altitude matrices using measurements of
Apis mellifera wings with 5000 permutations. Structure Compared matrices R R
2 P
D
2 of Procrustes vs.
altitude 0.06239 0.00389 0.0098*
Wing D
2 of Procrustes vs,
size -0.07949 0.00631 0.8384
NS
NS: not significantly different; *: significantly different.
Furthermore, estimates of regression analysis showed that the altitude also influenced
the size of the wing centroid. As seen in Table 6 and Fig. 8, the line slope is positive (0.001),
which indicates that altitude has a linear and positive relationship with the centroid size.
Table 6. Estimated regression line coefficients with the respective standard deviation, t value
and p value. Estimates Standard deviation t value p value
Intercept 6.571 0.028 237.241 <2∙10-16
Altitude 0.001 0.0001 8.475 <2∙10-16
47
Fig. 8. Linear relationship between the centroid size (mm) predicted by the regression analysis and
altitude (m). Grey dots are the observed centroid size; black dots are the centroid size predicted by the
linear equation. The straight line represents the linear relationship between the centroid sizes and the
altitude.
The results also showed that from the 63 colonies subjected to treatment, 28 had mean
proportions of hygienic behavior greater than 80% (Fig. 9). The Kruskal-Wallis results (Fig.
10) revealed that the hygienic behavior of the Africanized honey bees varied seasonally
(p=0.022; α=0.05) and among the different ecoregions (p=0.001; α=0.05): Zona da mata
(81.85±11.81%), Agreste (68.59±17.85%) and Sertão (57.27±31.85%).
Fig. 9. The figure above shows a non-hygienic colony (A) in which the dead brood were not removed
after 24 h, and image (B) shows a hygienic colony.
48
Fig. 10. Box plot of the hygienic behavior (%) in the three studied ecoregions: Agreste, Sertão and
Zona da Mata.
As shown in Fig. 2, the precipitation rates fluctuated between the dry and rainy
seasons, influencing the percentage of brood removal due to seasonality (Fig. 11). In addition,
the Spearman’s correlation coefficients between the dependent variable, hygienic behavior
and the explanatory or independent variables temperature (ρ=0.065; p=0.471; α=0.05),
rainfall (ρ=0.274; p=0.002; α=0.05) and altitude (ρ=-0.294; p=0.001; α=0.05) allow us to
identify significant associations between the hygienic behavior of honey bees, the rainfall and
the altitude. Increased rainfall is directly related to the increase of hygienic behavior, while an
altitude increase is inversely associated with a hygienic behavior increase. The causal
relationships between environmental conditions and their effects on the hygienic behavior of
Africanized honey bees are shown in the path-analysis results (Table 7 and Fig. 12).
49
Fig. 11. Box plot of the hygienic behavior (%) during the rainy and dry seasons.
Table 7. Direct (diagonal) and indirect effects estimated between the response variable, honey
bee hygienic behavior, and the explanatory variables temperature, rainfall and altitude. Temperature Rainfall Altitude
Temperature 0.084 -0.093 0.069
Rainfall -0.025 0.311 0.074
Altitude -0.034 -0.138 -0.172
The strongest direct effect was due to rainfall (0.311), followed by negative effects of
altitude (-0.172) and temperature (0.084). These results indicate that rainfall is the main
modulator of honey bees’ behavior, with a positive effect on the behavior. In contrast, altitude
has an important reverse effect: hygienic behavior tends to decrease with increasing altitude.
Indirect effects are described based on the coefficient of a variable via another
variable. Thus, the effect of temperature via precipitation (row 1, column 2) is -0.093(Table 7)
meaning that temperature influences rainfall, which in turn negatively influences the hygienic
behavior. The main indirect effect is the effect of altitude via rainfall: the altitude influences
the rainfall, which in turn has an effect on the hygienic behavior of honey bees.
Therefore, the results show that the main modulating effect of the hygienic behavior is
rainfall, either directly or indirectly (Fig. 12).
50
Fig. 12. Chain diagram illustrating the effects of the primary (rainfall) and secondary (altitude and
temperature) explanatory variables on the response variable (hygienic behavior).
DISCUSSION
The results presented in this study show that the distinct morphoclimatic patterns of
the studied ecoregions influenced the shape (r=0.06239, p=0.05) and size (0.001) of A.
mellifera wings, suggesting that altitude played an important role in the separation of the
populations. Similar study regions (Nunes et al., 2007; Souza et al., 2009; Kekecoglu &
Soysal, 2010; Parker et al., 2010) have also demonstrated how the distribution of bee
populations over ecologically distinct influence the differentiation of these groups and that the
great dispersal ability and high phenotypic plasticity of these insects (Le Conte & Navajas,
2008) contribute to their adaptation to different geomorphological regions. In this regard,
other studies (Dillon et al., 2006; Hepburn & Radloff, 2011) showed how topographic
variations interfere in the development of organisms, contributing to the formation of these
polyphenisms. According to Klok and Harrison (2009), the altitude influences the size and
shape of organisms’ structures because in high altitude the air becomes rarefied, and hypoxia
compromises the development of individuals due to low energy supply. Furthermore, at
higher altitudes, the air density is lower, and the air provides less support for beating wings,
thus changing the ideal ratio between the wing size and weight of these insects (Harrison et
al., 2010). The results of this study demonstrated that the intense gene flow among the studied
colonies, the high variability of wing sizes and the pronounced differences in the different
apiaries and ecoregions are the result of phenotypic plasticity rather than genetic divergence
among populations of the studied populations of Africanized bees, confirming the results
51
reported by Gruber et al. (2013). The multivariate analysis, when combined with wing-
venation morphometric data, could efficiently characterize the differences among honey bee
populations, as previously reported by Francoy et al. (2008), Tofilski (2009) and Güler et al.
(2010). In this context, the characterization of these divergences and the understanding of the
causes and consequences of their variations in the composition of the different bee ecotypes
can be exploited in conservation, handling and breeding programs, as previously described by
Andere et al. (2008), Strange et al. (2008), Shaibi et al. (2009) and Rahimi and Mirmoyed
(2013).
Furthermore, seasonality (p=0.022; α=0.05) and ecoregion (p=0.001, α=0.05) effects,
with the direct influence of rainfall (0.311) and the indirect influence of altitude (-0.172) and
temperature (0.084), interfered with the hygienic behavior of Africanized honey bees, which
can be explained by the diversity of climatic regimes in the study locations, reinforcing the
hypothesis of the influence of environmental conditions on the expression of the hygienic
behavior trait. Panasiuk et al. (2009) and Güler and Toy (2013) reported differences in
removal rates between periods of high and low nectar flow in the colony during months
corresponding to higher and lower levels of precipitation. This pattern can be explained by
Invernizzi (2001), who proposed that during rainy periods, there is more food available,
resulting in greater vitality of the honey bees and serving as a stimulus for comb cleaning and
food storage. In addition, a greater number of bees in the colony and clustering among them,
which are common patterns during rainy periods, could facilitate the detection of dead,
diseased or parasitized brood. These results contrast with the data of Stanimirović et al.
(2008), Padilha et al. (2013) and Wielewski et al. (2012), who found a strong genetic
component associated with this trait. Thus, the present study corroborates the results of Costa-
Maia et al. (2011) and Pernal et al. (2012), who suggested that environmental conditions are
significantly involved in the manifestation of hygienic behavior. Furthermore, the hygienic
52
colonies were more efficient in the detection and removal of dead brood than the non-
hygienic colonies, corroborating the findings of Gramacho and Gonçalves (2009) and Palacio
et al. (2010).
Our findings support the hypothesis that there are divergences in the populations of
Africanized honey bees in the apiaries and among the ecoregions of the State of Sergipe,
proving the influence of stochastic factors on the morphology, behavior and distribution of
these groups. In addition, the high gene flow observed in the studied populations denotes their
high genetic variability, which demonstrates potential for future handling, conservation and
breeding programs. However, the present study did not find any correlation between wing size
and hygienic behavior, indicating that wing size should not be considered to be a good
morphological marker for the hygienic behavior trait.
Finally, we emphasize the need for more studies related to the interaction between
genetic and environmental factors to understand the effects of geographic variations on the
hygienic behavior and morphology of Africanized honey bees.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors are grateful to AMAS (Associação de Melicultores do Alto Sertão
Sergipano) and the project (Frutos da Floresta) for technical support. We thank the
anonymous reviewers for the helpful comments on the manuscript. This study was supported
by the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq).
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