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Departmento de Fisiologia-Disciplina de NeurofisiologiaSP, Brasil
TELMA TIEMI SCHWINDTAGOSTO/2006
Universidade Federal de São Paulo
Escola Paulista de Medicina
CÉLULAS-TRONCO:
HISTÓRICO E CONCEITOS
O QUE SÃO CÉLULAS-TRONCO?
Células-tronco são células capazes de se auto-renovarem e de se diferenciarem em pelo menos um tipo de tecido.
Plasticidade
Totipotente: capaz de dar origem a qualquer tipo celular embrionário ou extra-embrionário
Pluripotente: capaz de dar origem a células dos três folhetos embrionários
Multipotente:capaz de dar origem a um subconjunto de linhagens celulares
Oligopotente: capaz de dar origem a um número mais restrito de linhagens celulares que as multipotentes
Unipotente: capaz de dar origem a um único tipo celular
Expansão
Diferenciação
Células-tronco neurais
Células-tronco embrionárias
Células-tronco da pele e de medula
Células-tronco neurais adultas
Neurônio
Oligodendrócito
Astrócito
Modificaçãogenética
Sources of human neural stem cellsfor research and cell therapySvendsen and Smith, TINS 99
Isolamento de células-tronconeurais
?
?
?FUSÃO?
De onde vem as células-tronco?
1909 – O biologista russo Alexander Maximow fala pela primeira vez na existência de uma população de células no sangue periférico com pluripotencialidade.
1940– Experimentos mostraram que animais poderiam sobreviver após irradiação letal graças à presença de células-tronco.
1950 – Vários grupos iniciam tentativas clínicas utilizando o transplante de células-tronco hematopoiéticas extraídas da medula óssea em pacientes com leucemia.
1970 – São feitos os primeiros transplantes levando em conta a tipagem do HLA, porém ainda utilizando a medula óssea como fonte de células-tronco.
1980 – Vários grupos demonstram a presença de células-tronco hematopoiéticas no sangue periférico de doadores sadios, ainda que em menores quantidades do que na medula óssea.
1990 – É demonstrada a presença da glicoproteína CD34, um marcador de células hematopoiéticas imaturas.
HISTÓRICO I
U marks 30th anniversary of world's first successful bonemarrow transplant
John Kersey and David Stahlexchange smiles over animage from the past.
www1.umn.edu/umnnews/Feature_Stories/30_years_of_hope.html
30 Years of Hope !
1952: Robert Briggs e Thomas King, da Filadélfia, realizam a primeira clonagem de sapos a partir de células embrionárias.
1984: Steen Willadsen da Universidade de Cambridge clona uma ovelha a partir de células embrionárias jovens.
1986: pesquisadores da Universidade de Wisconsin clonam uma vaca a partir de células embrionárias jovens.
1995: Ian Wilmut e Keith Campbell, da Escócia, clonam duas ovelhas idênticas a partir de células embrionárias de nove dias.
1996: Ian Wilmut e Keith Campbell, da Escócia, clonam Dolly, a partir de células congeladas de uma ovelha adulta.
1997: nasce Dolly.
HISTÓRICO II
www.time.com/.../0,16641,7601970310,00.html
www.greenpeace.org/international/photosvideos...
On Feb. 23, 1997, a group of scientists in Scotlandmade an announcement that would forever changethe way scientists view mammalian development—they had successfully cloned Dolly, a Finn Dorsetsheep, from an adult cell.
On Feb. 14, 2003, Dolly was euthanatized afterveterinarians confirmed she had a progressive lungdisease.
PROBLEMAS ÉTICOS!
2003: O médico italiano Severino Antinorianuncia o nascimento de clones humanos, mas não apresenta provas científicas.
HISTÓRICO II
news.bbc.co.uk/2/low/science/nature/1477698.stm
Antinori (esquerda) e seu colaborador americano Dr Panos Zavos
- no Brasil, a Câmara aprova o projeto da Lei de Biossegurança (PL 2401/03) que permite pesquisas com células-tronco humanas.
- cientistas sul coreanos desenvolvem as primeiras linhagens de células-tronco a partir de embriões humanos clonados.
2005
“... é o pesquisador sul-coreano Woo-Suk Hwang, um dos mais incensados cientistas da atualidade na área biomédica, por ter obtido com sua equipe células-tronco a partir de embriões humanos clonados para tratar doenças incuráveis, como diabetes, distrofias musculares, Alzheimer ou mal de Parkinson. “... Hwang destacou a submissão de sua equipe à lei de bioética em vigor na Coréia do Sul e foi categórico ao rejeitar a clonagem humana com finalidade reprodutiva.”
Revista Ciência Hoje, 2005
“A revista americana "Science", um dos maiores periódicos científicos do mundo, está enfrentando problemas para preparar o cancelamento do artigo de maio passado do sul-coreano Woo-Suk Hwang. O trabalho supostamente revolucionário com clonagem humana para fins terapêuticos foi totalmente fraudado.”Folha de S. Paulo
FRAUDE NA CIÊNCIA!
Ethics scandal could bolsterstem-cell foes
seattletimes.nwsource.com/html/nationworld/20...
U.S. biologist Gerald Schattenabruptly quit collaborating withHwang Woo-suk last week.
Hwang cloned Snuppy
O Sistema nervoso central adulto não se regenera
“Once development was ended, the fonts of growth and regeneration of the axons and dendrites dried up irrevocably. In the adult centers, the nerve paths are something fixed, and immutable: everything may die, nothing may be regenerated.”
Santiago Ramon y Cajal, 1928
Quebra de Paradigma!
História da neurogênese em adultos
1960’s J Altman: Células em divisão que podem originar novos neurônios
1970’s M. Kaplan: EM confirma novas células neuron-like
1980’s F. Nottebohm & S. Goldman: Neurogênese em pássaros
1990’s P. Barlett, B. Reynolds, S. Weiss, F. Gage: Isolamento de células-tronco neurais multipotentes do cérebro de roedores adultos
1998 P. Eriksson & F. Gage: Neurogênese em humanos adultos
2002 van Praag & F. Gage: Novos neurônios do hipocampo são
funcionais no cérebro adulto
late 1990’s E. Gould, B McEwen, E. Fuchs, P. Rakic: Neurogênese em
roedores adultos e primatas
Limites do transplante “cerebral”
• Requer tecido fetal e, portanto, envolvequestões éticas e não é prático
• É necessário encontrar uma fontealternativa de células neurais…
• CÉLULAS-TRONCO!
FGF/EGF
Célula formadora de esfera/célula-tronco
Indução: IGF, BMPs, RA, etc.
Stem Cell
GRP
O2A
NRP
Reynolds, Tetzlaff and WeissJ. Neuroscience 12: 4565 (1992)
2 wks 6 wks 20 wks
hNPCs (human neural progenitor cells)sobrevivem após transplante no cérebro
Não houve formação de tumor em maisde 1000 transplantes!
CONT DOWNS0.0
0.5
1.0
1.5
Neu
ron
/ Glia
Rat
io
CONT DOWNS0
25
50
75
100
Neu
rite
Leng
th ( μ
m)
CONT DOWNS0
100
200
Cel
l Bod
y Vo
lum
e( μ
m)
Genes, Brain and Behavior, vol.2, 179-186, 2003A. Bhattacharyya and C.N. Svendsen
CTEProgenitor não comprometido
Progenitor específico
Precursor neuronaldopaminérgico
Neuroblastodopaminérgico
Expansão
Seleção Nurr-1 Citocinas & meio cond.
Expansão bFGF, bx O2,ác. ascórbico
bx O2
bFGF + Shh +FGF8 + ác. ascórbico
Indução/diferenciação
Imortalização Expansão EGF
Glia co-culturaCTM
NEUROBLASTOS DOPAMINÉRGICOS TRANSPLANTE
Substituição Celular
Importância dos fatores de crescimentona neuro-regeneração
Desafios
Quem governa?
ProliferaçãoMigraçãoDiferenciaçãoSobrevivência
Fator deCrescimento
Função Doença Empresa
BDNF sobrevivência depressão Amgen
CTNF neuroproteção Huntington RegeneronPharmaceuticals
EGF proliferação derrame ImCloneSystems
FGFs Sobrevivência/proliferação
derrame ViaCell
*GDNF Sobrevivência/neuroproteção/
proliferação
Parkinson/ELA Amgen
Fatores de crescimento e aplicações
Importância dos fatores de crescimentona neuroregeneração
AVEFGFs e EGF regeneração pós-derrame
DepressãoProzac aumenta a neurogênese. Melhora do humor compatível com o tempo da neurogênese (30 dias)AlzheimerPouca neurogênese ou morte dos neurônios recém-nascidosFGFs podem causar melhorias
Moléculas grandes demais para transpor a barreira hemato-encefálica
CÉLULAS MODIFICADAS GENETICAMENTE!
-A doença de Parkinson foi descrita pela primeira vez em 1817, pelo médico inglês James Parkinson.-É uma doença neurológica, que afeta os movimentos da pessoa, causa tremores, lentidão de movimentos, rigidez muscular, desequilíbrio, e alterações na fala e na escrita.-Não há evidências de que seja hereditária. Apesar dos avanços científicos, ainda continua incurável, é progressiva (variável em cada paciente) e a sua causa ainda continua desconhecida.
www.parkinson.org.br/
PARKINSON
-Degeneração das células situadas na substância negra.Essas células produzem a dopamina, que conduz as correntes nervosas (neurotransmissores) ao corpo. A falta ou diminuição da dopamina afeta os movimentos do paciente, provocando os sintomas acima indicados.
Afeta pessoas mais idosas. A grande maioria das pessoas tem os primeiros sintomas geralmente a partir dos 50 anos de idade. Mas pode também acontecer nas idades mais jovens, embora os casos sejam mais raros.
Tratamentos:
a) Levodopa ou L-Dopa
b) Cirurgias
c) Estimulação profunda do cérebro (marcapassocerebral)
d) Fisioterapia
e) Terapia ocupacional
f) Fonoaudiologia
www.parkinson.org.br/
www.drugdevelopment-technology.com/projects/r...
“Intraputamenal infusion of glial cell line-derivedneurotrophic factor in PD: a two-year outcome study.”
Ann Neurol. 2005 Feb;57(2):298-302Patel NK, Bunnage M, Plaha P, Svendsen CN, Heywood P, Gill SS.
“Direct brain infusion of glial cell line-derivedneurotrophic factor in Parkinson disease.”
Nat Med. 2003 May;9(5):589-95.Gill SS, Patel NK, Hotton GR, O'Sullivan K, McCarter R, Bunnage M, BrooksDJ, Svendsen CN, Heywood P
PARKINSONPrimeiro “Clinical trial” em humanos
5 pacientes com ParkinsonGDNF liberado diretamente através de uma bomba implantada
Resultados (após 1 ano)•efeitos colaterais clínicos severos não foram detectados•melhora de 39% no sub-score UPDRS (pacientes sem a medicação L-dopa)•61% de melhora nas atividades diárias•Discinesias devido à medicação foram reduzidas em 64% e em pacientes sem medicação L-dopa não foram observadas•aumento de 28% na estocagem de dopamina (após 18 meses)
PARKINSONPrimeiro “Clinical trial” em humanos
Roger Nelson (right) has shown dramaticimprovements
Mr Gill andcolleagues weresurprised at theresults
Two pumps in MrNelson's body feedthe drug to his brain
news.bbc.co.uk/2/hi/science/nature/1935593.stm
células secretandoGDNF
dissociação
TRANSPLANTE
GFPPminCMV GDNFTRETet
VP16PminCMV Tet
tTA
TetVP16
+Dox-Dox
VP16
Journal of NeuroscienceResearch 69:955–965 (2002)Thor Ostenfeld et al.
“Neurospheres Modified To ProduceGlial Cell Line-DerivedNeurotrophic Factor Increase theSurvival of Transplanted DopamineNeurons”
Neuroproteção
CONCLUSÕES
•Células-tronco neurais derivadas do cérebrohumano em desenvolvimento produzemneurônios, astrócitos e oligodendrócitos.
•Sobrevivem após transplante no cérebro lesado.
•São uma grande esperança para substituição de células nas doenças neurodegenerativas, e tratamento em Parkinson– mas temos muito a aprender!
Prof. Luiz Eugênio A. M. MelloTelma T. SchwindtCristina G. MassantGabriela F. BarnabéFabiana L. T. Motta
Universidade Federal de São Paulo Universidade Federal de São Paulo –– UNIFESPUNIFESPLaboratório de Neurofisiologia Laboratório de Neurofisiologia
WaismanWaisman CenterCenter SCRP SCRP –– UWUW
Prof. Clive N. Svendsen
Universidade de São Paulo - USPProf. Niels Olsen Saraiva Câmara
Dr. Antônio Henrique Martins
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJProf. Stevens Kastrup Rehen
Financiadores: FAPESP, CNPq