UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE … · departamento de fisiologia e farmacologia programa de pÓs-graduaÇÃo em farmacologia patricia xavier lima gomes abrasamento induzido

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

PATRICIA XAVIER LIMA GOMES

ABRASAMENTO INDUZIDO POR NICOTINA: ESTUDO DA PROGRESSÃO

TEMPORAL E INFLUÊNCIA DO SEXO NAS ALTERAÇÕES

NEUROQUÍMICAS EM RATOS PERIADOLESCENTES

FORTALEZA/CE

2016

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Tese submetida à Coordenação do

Programa de Pós-Graduação em

Farmacologia, da Universidade Federal

do Ceará, como requisito parcial para

obtenção do grau de Doutor em

Farmacologia.

Orientadora: Dra. Danielle Macêdo

Gaspar

FORTALEZA/CE

2016

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4





Tese apresentada a Coordenação do Programa de Pós-graduação em Farmacologia

como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Farmacologia.

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________

Profa. Dra. Danielle Macêdo Gaspar (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará - UFC

______________________________________________________

Prof. Dr. Jair Guilherme dos Santos Júnior

Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo

______________________________________________________

Prof. Dr. Vasco Pinheiro Díogenes Bastos

Centro Universitário Estácio do Ceará - ESTÁCIO

______________________________________________________

Prof. Dr. Eduardo Ribeiro Honório Júnior

Centro Universitário Christus (UNICHRISTUS)

______________________________________________________

Profa. Dra. Mariana Lima Vale

Universidade Federal do Ceará - UFC

5

À minha mãe, por todas as renúncias, em prol

de mais um degrau atingido em minha vida;

por todas as orações, por todas as suas

palavras de fé e ‘siga em frente’, que me

fizeram chegar até aqui.

6

AGRADECIMENTOS

À DEUS, por ser o meu refúgio e minha fonte de força nos momentos felizes e adversos

encontrados ao longo desta caminhada;

À minha tão amada Mãe, Mairtes Xavier, por ter abdicado durante muito tempo de seus

sonhos em prol da realização profissional de seus filhos. Nada que eu faça poderá

recompensar tão sublime amor;

Ao meu pai e meus irmãos, Evandro Teixeira, Ana Karolinne e Evandro Júnior, por

formarem a base familiar que sempre precisei;

Ao meu noivo Marcelo, por ser tão presente e incentivar-me na busca por novos

horizontes;

À minha orientadora Danielle Macedo Gaspar, na qual tive a oportunidade de conviver

academicamente por todos estes anos, sendo inspiração para todos que seus orientandos;

À minha banca de qualificação: Professores Vasco Diógenes, Marta do Carmo,

Emiliano Vasconcelos por terem corrigido com tanto empenho e contribuído de forma

engrandecedora para a finalização deste trabalho;

Aos professores Jair Guilherme, Vasco Diógenes, Eduardo Ribeiro e Mariana Vale, por

terem aceitado participar da minha banca de defesa de tese e pela grande contribuição

neste trabalho;

Ao meu braço direito e esquerdo Fernanda Yvelize e Gersilene, por toda a ajuda nos

experimentos e pela amizade verdadeira em todas as horas;

Aos meus amigos que conheci através da bancada, por toda a ajuda nos experimentos e

pelas conversas descontraídas: Adriano, Taciana, Alyne Mara, Leonardo, Vládia,

Isabelle, Adriana, Rafaela, Germana, Roberta, Tatiane.

Aos técnicos do laboratório que põem ordem em nossa casa científica: Vilani e Lena;

À profa. Mariana Vale e sua orientanda Anamaria, que sempre se mostraram tão

acessíveis e dispostas a auxiliar na execução de parte metodológica deste trabalho;

Aos professores do laboratório de neuropsicofarmacologia pelos conhecimentos

repassados: profa. Glauce, profa. Silvania, profa. Cléa, profa. Geanne, prof. David;

Aos professores do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, pela contribuição na

construção da minha formação como docente;

Às agencias de fomento à pesquisa: CNPq e CAPES;

E a todos que direta ou indiretamente, contribuíram para a finalização deste ciclo.

Muito Obrigada!!!

7

“Enquanto mais me aprofundo nas ciências,

mais me aproximo de Deus.”

Albert Einstein

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RESUMO

O abrasamento tem sido usado classicamente como um modelo experimental para a

epilepsia do lobo temporal. Nas últimas décadas, tem sido também usado para

conceituar os mecanismos gerais envolvidos na progressão de uma vasta gama de

desordens neuropsiquiátricas. O modelo de abrasamento pode ser induzido por

estimulação sublimiar elétrica ou química. Recentemente, o abrasamento induzido por

nicotina (NIC) foi caracterizado farmacologicamente e histologicamente, abrindo

perspectivas para melhor compreender os efeitos comportamentais e neuroquímicos da

NIC na neuroprogressão envolvida no fenômeno do abrasamento. Neste contexto, foram

atribuídos efeitos relevantes dependentes do sexo na neurobiologia do abrasamento

induzido pó NIC, cujos mecanismos não foram totalmente elucidados. Baseado nisto, o

presente estudo objetivou investigar a progressão temporal e influência do sexo nas

alterações neuroquímicas do abrasamento induzido por NIC em ratos periadolescentes.

Ratos Wistar machos e fêmeas periadolescentes (35-37dias) receberam administração

repetida de NIC 2.0 mg/kg, intraperitonealmente, de segunda à sexta-feira. Animais

controle receberam solução salina. As convulsões foram avaliadas de acordo com a

escala de Racine nos dias 1, 10, 19, 22, 24 e 25 de administração de NIC. Trinta

minutos após a administração de NIC nos dias 1, 10 e 19 para fêmeas e 1, 10 e 25 para

os machos, os animais foram eutanasiados e as áreas cerebrais, corpo estriado (CE) e

hipocampo (HC), dissecadas para determinações neuroquímicas e imunofluorescência.

As fêmeas apresentaram maior susceptibilidade ao desenvolvimento do abrasamento

quando comparado aos machos, apresentando estágio 5 de convulsões no 19° dia de

administração de NIC, enquanto os machos apresentaram o mesmo estágio no 24º dia.

Em relação a mortalidade dos animais, as fêmeas foram mais susceptíveis aos efeitos

tóxicos da NIC com 75% de mortes neste grupo. Em relação aos níveis plasmáticos de

17β-estradiol não houve diferenças entre machos e fêmeas tratados com NIC e salina. O

conteúdo de dopamina (DA) e de seus metabólitos, DOPAC e HVA, em CE de machos

se apresentaram aumentados no 1° dia de administração de NIC, seguida por redução

destes níveis na progressão do abrasamento. Nas fêmeas, os níveis de DOPAC

reduziram quando comparado aos controles no 1° dia de tratamento com NIC,

entretanto aumentando significativamente no abrasamento. Ao passo que, os níveis de

HVA estavam reduzidos no abrasamento. No HC, os níveis de DA e metabólito nos

machos estavam reduzidos em relação aos controles no 1° dia de indução do fenômeno

e mantendo-se diminuídos no abrasamento. Quanto ao conteúdo de NE, mostrou-se

elevado em HC de fêmeas ao comparar-se aos machos no abrasamento. De modo

semelhante, a atividade da enzima acetilcolinesterase e a imunoexpressão de p-NR1 e p-

CREB estavam elevados no CE em relação aos machos no abrasamento. Por fim, as

fêmeas tratadas com NIC no abrasamento apresentaram concentrações elevadas de

BDNF no CE em relação aos controles e ratos machos. Portanto, o presente estudo

demonstrou que as fêmeas são mais susceptíveis ao fenômeno do abrasamento. Além

disso, baseado em nossos resultados, sugerimos que esta vulnerabilidade diferencial é

devido ao aumento da excitabilidade neuronal, e consequentemente, dano celular

durante a progressão temporal do abrasamento.

Palavras-chave: abrasamento, nicotina, diferenças sexuais, periadolescência

9

ABSTRACT

NICOTINE-INDUCED KINDLING: STUDY OF TEMPORAL PROGRESSION AND

SEX INFLUENCE IN NEUROCHEMICAL CHANGES IN PERIODOLESCENT

RATS

Kindling classically was used as an experimental model of temporal lobe epilepsy. In

the last decades, it has also been used to conceptualize the general mechanisms involved

in the progression of a wide range of neuropsychiatric disorders. Kindling model can be

induced by subthreshold electrical and chemical stimulus. Recently, nicotine (NIC)-

induced kindling was pharmacologically and histologically characterized, opening

perspectives to better understand the neurochemical and behavioral effects of NIC in the

neuroprogressive course involved in kindling phenomenon. In this context, relevant sex-

dependent effects have been attributed in neurobiology of NIC-induced kindling, whose

mechanisms has not been fully clarified. Therefore, the present study aimed to

investigate the temporal progression and influence of sex of neurochemical alterations

induced by NIC kindling model in periadolescent rats. Male and female Wistar rats

(aging 35-37 days) received repeated intraperitoneal NIC 2.0 mg / kg administration,

from Monday to Friday. Control animals received saline administration. The seizures

were evaluated by Racine Scale on the days 1, 10, 19, 22, 24 and 25 NIC

administrations. Thirty minutes after NIC administration on the days 1, 10 and 19 for

females and 1, 10 and 25 for males, the animals were euthanized and their brain areas,

striatum (ST) and hippocampus (HC) were dissected for neurochemical analysis and

immunofluorescence. Female animals showed greater susceptibility to the development

of kindling when compared to males, presenting stage 5 of seizures on 19th day of NIC

administration, while males presented the same stage on 24th day. In relation to animal

mortality, females were more vulnerable to the NIC toxic effects, presenting 75% of

mortality. Regarding plasma levels of 17β-estradiol, there were no differences between

males and females treated with NIC or saline. The content of dopamine (DA) and its

metabolites, DOPAC and HVA, in ST of males were higher on the 1st day of NIC

administration compared to controls, followed by reduction on the kindling progression

course. In females, DOPAC levels was reduced on the 1st day of NIC treatment,

compared to controls, however it increased in the kindling. Contrarily, HVA levels

reduced in the kindling. In HC, DA levels and its metabolites were lower in male

animals on the 1st day of NIC treatment compared to controls, and remaining reduced in

the kindling. Regarding NE content, it was higher in female HC when compared to

males in kindling model. Similarly, the activity of the acetylcholinesterase enzyme and

the immunoexpression of p-NR1 and p-CREB were higher in female NIC-kindling in

ST related to males. Finally, NIC-kindling females presented higher BDNF levels in ST

compared to NIC-kindling males and control females. Therefore, the present study

demonstrated that female animals are more vulnerable to kindling phenomenon.

Further, based on our results, we suggested that this differential vulnerability was due to

an increase in neuronal excitability and consequently cell damage during the kindling

temporal progression.

Key words: kindling, nicotine, sex differences, periadolescence

10

ABREVIATURAS

μamp – microàmpere

μl – microlitro

μM – micromolar

ºC – grau Celsius

ACh – acetilcolina

AChE – acetilcolinesterase

AMPA – ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazole-propionico

AMPc – adenosina 3',5'-monofosfato cíclico

ATC – acetiltiocolina

ATV – área tegmental ventral

BDNF – fator neurotrófico derivado do cérebro

BSA – albumina de soro bovino

Ca2+ – cálcio

CE – corpo estriado

CID-10 – Classificação Internacional de Doenças e Problemas relacionados à Saúde

CPF – córtex pré-frontal

CYP 450 – citocromo P 450

DA – dopamina

DAPI – 4 ',6-diamino-2-fenilindol

DOPAC – ácido 3,4-di-hidroxifenilacético

DTNB – ácido ditiobisnitrobenzóico

EEG – eletroencefalograma

ELT – Epilepsia do Lobo Temporal

EPM – erro-padrão da média

FGF-2 – fator de crescimento de fibroblasto tipo 2

g – grama

GABA – ácido γ-aminobutírico

iGluRs – receptores glutamatérgicos ionotrópicos

i.p – intraperitoneal

HC – hipocampo

https://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_3,4-di-hidroxifenilac%C3%A9tico

11

HPLC – Cromatografia líquida de alta performance

HVA – ácido homovanílico

mGluRs – receptores glutamatérgicos metabotrópicos

NAC – núcleo accumbens

nAChR – receptor colinérgico nicotínico

nAChRs – receptores colinérgicos nicotínicos

NGF – fator de crescimento do nervo

NIC – nicotina

NMDA – N-metil-D-aspartato

p-CREB – proteína fosforilada de ligação ao elemento de resposta ao AMPc

PD – pós-descarga

PKA – fosfo-quinase A

PKC – fosfo-quinase C

PTZ – pentilenotetrazol

rpm – rotação por minuto

SNC – Sistema Nervoso Central

s.c. – subcutâneo

TH – tirosina hiroxilase

12

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Localização do complexo amigdalóide no rato para a

implantação de eletrodo.

19

Figura 2: Estruturas do sistema límbico. 23

Figura 3: Espécies vegetais que dão origem à nicotina. 23

Figura 4: Estrutura química da nicotina. 27

Figura 5: Delineamento experimental da análise comportamental no

presente estudo.

38

Figura 6: Delineamento experimental das metodologias utilizadas no

presente estudo.

39

Figura 7: Equipamento de High Performance Liquid Chromatograpy

(HPLC) eletroquímico.

42

Figura 8: Desenvolvimento do abrasamento induzido por nicotina em

ratos machos e fêmeas, periadolescentes e adultos, de acordo com o

estágio 5 da escala de convulsão de Racine (1972).

48

Figura 9: Percentual de sobrevivência dos animais submetidos ao

abrasamento induzido por nicotina.

49

Figura 10 – Níveis plasmáticos sanguíneos de 17β-estradiol de animais

machos e fêmeas submetidos ao abrasamento por nicotina.

51

Figura 11: Níveis de DA no corpo estriado de animais machos e fêmeas ao

longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.

53

Figura 12: Níveis de DA no hipocampo de animais machos e fêmeas ao


54

Figura 13: Níveis de DOPAC no corpo estriado de animais machos e

fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.

56

Figura 14: Níveis de DOPAC no hipocampo de animais machos e fêmeas

ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina

57

Figura 15: Níveis de HVA no corpo estriado de animais machos e fêmeas

ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.

59

Figura 16: Taxas de metabolização dos neurotransmissores DOPAC/DA

(A) e HVA/DA (B) em corpo estriado de animais machos e fêmeas ao

13

longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina 61

Figura 17: Taxas de metabolização dos neurotransmissores DOPAC/DA

no hipocampo de animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento

do abrasamento por nicotina.

62

Figura 18: Níveis de NE no corpo estriado de animais machos e fêmeas ao


64

Figura 19: Níveis de NE no hipocampo de animais machos e fêmeas ao


65

Figura 20: Atividade da enzima Acetilcolinesterase no corpo estriado de

animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento

por nicotina.

67

Figura 21: Atividade da enzima Acetilcolinesterase no hipocampo de

animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento

por nicotina.

68

Figura 22: Fotomicrografia da imunoexpressão de p-NR1 e p-CREB no

corpo estriado de ratos machos induzidos ao abrasamento por nicotina.

70

Figura 23: Fotomicrografia da imunoexpressão de p-CREB e p-NR1 no

corpo estriado de ratos fêmeas induzidas ao abrasamento por nicotina.

71

Figura 24: Imunoexpressão da subunidade NR1 fosforilado (p-NR1) do

receptor glutamatérgico NMDA em corpo estriado de animais machos e

fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.

72

Figura 25: Imunoexpressão da proteína de ligação ao Elemento de

Resposta ao AMPc fosforilada (p-CREB) em corpo estriado de animais

machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por

nicotina.

73

Figura 26: Níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em

corpo estriado de animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento

do abrasamento por nicotina.

75

Figura 27: Níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em

hipocampo de animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do

abrasamento por nicotina.

76

Figura 28: Desenho do mecanismo sugerido à susceptibilidade das fêmeas

ao desenvolvimento do abrasamento por NIC.

89

14

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Grupos de tratamento no desenvolvimento do abrasamento por

NIC e metodologias analisadas.

38

Tabela 2: Caracterização dos estágios de comportamento para convulsão, de

acordo com Racine (1972).

40

15

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 18

1.1 Abrasamento 18

1.1.1 Histórico 19

1.1.2 Mecanismos gerais envolvidos no abrasamento 20

1.2 Abrasamento no estudo dos transtornos neuropsiquiátricos 22

1.2.1 Epilepsia do Lobo Temporal e Abrasamento 22

1.2.2 Transtornos psiquiátricos e Abrasamento 24

1.3 Nicotina 25

1.3.1 Características farmacológicas da nicotina 25

1.3.2 Efeitos da nicotina no Sistema Nervoso Central 27

1.3.3 Papel da nicotina no sistema monoaminérgico 28

1.3.4 Papel da nicotina no sistema glutamatérgico 30

1.4 Diferenças sexuais quanto aos efeitos da nicotina 31

1.5 Modelo de abrasamento induzido por nicotina 32

1.6 Relevância e Justificativa 33

2 OBJETIVOS 36

2.1 Objetivo Geral 36

2.2 Objetivos Específicos 36

3 MATERIAIS E MÉTODOS 37

3.1 Animais 37

3.2 Droga utilizada 37

3.3 Estratégia experimental 37

3.4 Protocolo experimental I – Tratamento dos animais e esquema de indução

do abrasamento

40

3.5 Protoloco experimental II – Determinação dos níveis de 17β-estradiol em

plasma sanguíneo de animais induzidos ao abrasamento por nicotina

41

3.6 Protocolo experimental III – Testes bioquímicos 41

3.6.1 Dissecação das áreas cerebrais 41

3.6.2 Determinação dos níveis de monoaminas e seus metabólitos em animais

induzidos ao abrasamento por nicotina

41

16

3.6.3 Determinação da atividade da enzima Acetilcolinesterase (AChE)

durante o desenvolvimento do abrasamento por nicotina

43

3.6.4 Determinação dos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro

(BDNF)

44

3.7 Protocolo experimental IV – Determinação da expressão da subunidade

NR1 fosforilada (p-NR1) do receptor glutamatérgico NMDA e da proteína

fosforilada de ligação ao Elemento de Resposta ao AMPc (p-CREB) por

imunofluorescência

44

3.8 Análise estatística 46

4 RESULTADOS 47

4.1 Avaliação do desenvolvimento do abrasamento induzido por nicotina em

ratos

47

4.2 Determinação dos níveis plasmáticos de 17β-estradiol em animais machos

e fêmeas submetidos ao abrasamento por nicotina

50

4.3 Determinação dos níveis de monoaminas 52

4.3.1 Determinação dos níveis de dopamina (DA) de animais machos e fêmeas


52

4.3.2 Determinação dos níveis do metabólito DOPAC de animais machos e

fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina

55

4.3.3 Determinação dos níveis do metabólito HVA de animais machos e


58

4.3.4 Determinação das taxas de metabolização DOPAC/DA e HVA/DA de

animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por

nicotina

60

4.3.5 Determinação dos níveis de noradrenalina (NE) de animais machos e


63

4.4 Determinação da atividade da enzima Acetilcolinesterase (AChE) em


nicotina

66

4.5 Determinação da expressão da subunidade NR1 fosforilada (p-NR1) do

receptor glutamatérgico NMDA e da proteína fosforilada de ligação ao

Elemento de Resposta ao AMPc (p-CREB) por imunofluorescência

69

4.6 Determinação dos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro

17

(BDNF) em animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do

abrasamento por nicotina

74

5 DISCUSSÃO 77

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

7 CONCLUSÃO

88

89

REFERÊNCIAS 90

18

1 INTRODUÇÃO

1.1 Abrasamento

O abrasamento ou kindling é considerado um modelo experimental de

epilepsia progressiva, em que ocorre aumento permanente da propensão à convulsão

seguida por repetidas estimulações elétricas ou químicas em diversas áreas cerebrais,

em intensidade inicialmente incapaz de produzir qualquer resposta comportamental ou

convulsões (KANDRATAVICIUS et al., 2014).

A primeira descrição de abrasamento relatava um processo no qual a

atividade epileptiforme conhecida como pós-descarga (PD) podia ser desencadeada pela

estimulação elétrica ou química de estruturas cerebrais (RACINE; MCLNTYRE, 1986).

Goddard (1967) foi o primeiro a demonstrar que o abrasamento de áreas subcorticais,

por estímulos de baixa intensidade (50 μamp) a intervalos dispersos produziam um

aumento na susceptibilidade para crises ou episódios convulsivos pela diminuição do

limiar da convulsão. Portanto, o abrasamento resulta em modificações progressivas e

duradouras na responsividade neuronal que se manifestam pelo aumento na duração,

complexidade e propagação da PD a partir do local de estimulação, bem como na

progressão previsível da resposta convulsiva que o acompanha (GODDARD;

MCINTYRE; LEECH, 1969; RACINE, 1972).

O fenômeno do abrasamento é considerado um importante modelo no

estudo da epilepsia, visto que, uma vez estabelecido, as mudanças são tão persistentes

que mesmo um estímulo considerado fraco provocará uma convulsão

(KANDRATAVICIUS et al., 2014), assim, podendo tornar-se manifestações

comportamentais permanentes que relembram a gênese e progressão de algumas

desordens epilépticas, como a epilepsia do lobo temporal ou, de forma mais apropriada,

a convulsão parcial complexa (PINEL; ROVNER, 1978).

Exposição a estímulos repetidos originalmente inócuos ou sublimiares,

como fatores farmacológicos (drogas de abuso) ou ambientais (estresse emocional) pode

estar relacionado com o início de alterações comportamentais, visto que após um

número suficiente de exposições, uma progressão à espontaneidade poderá ocorrer

desencadeando em processos patológicos (KRAUS, 2000). Assim, o modelo de

abrasamento é uma ferramenta valiosa para contextualizar os mecanismos gerais

envolvidos em uma variedade de transtornos neuropsiquiátricos que apresentam

19

sintomas recorrentes e cíclicos (POST, 2007), como transtornos de humor, ansiedade,

transtornos obssessivo-compulsivos e toxicodependência (POST, 2002).

Apesar do abrasamento induzido por NIC ter sido inicialmente estudado por

Bastlund et al. (2005), que demonstrou sua relação com à ativação de receptores

nicotínicos α4β2 e α7, como também, receptores NMDA (DAMAJ et al., 1999), pouco

deste mecanismo e a influência do sexo na vulnerabilidade às convulsões induzidas por

nicotina foram elucidadas.

1.1.1 Histórico

O modelo de abrasamento foi inicialmente descrito por Goddard (1967), no

qual demonstrou que através de estimulações elétricas contínuas em limiares

subconvulsivantes (50 μamp), aplicados em estruturas cerebrais de ratos, resultavam no

aparecimento de um quadro progressivo de crises motoras generalizadas, evoluindo para

convulsões, semelhante aos sintomas de alguns tipos de epilepsia (MCINTYRE et al.,

2002; MORIMOTO et al., 2004). Os estímulos eram provenientes da implantação

profunda de eletrodos em regiões cerebrais específicas responsivas ao efeito do

abrasamento, que estendem-se do bulbo olfatório ao córtex entorrinal, incluindo região

septal e hipocampo, sendo a resposta mais expressiva na amígdala, entretanto, havendo

diferenças nos limiares de indução do abrasamento nestas áreas cerebrais (GORTER;

VLIET; SILVA, 2016) (Figura 1).

Figura 1: Localização do complexo amigdaloide no rato para a implantação de

eletrodo.

Fonte: http://www.multiciencia.unicamp.br/art05_3.htm

Acesso em: 25.07.2016

http://www.multiciencia.unicamp.br/art05_3.htm

20

Em décadas recentes muitos outros métodos de abrasamento foram

introduzidos na pesquisa, dentre eles o abrasamento corneal (MATAGNE;

KLITGAARD, 1998; POTSCHKA; LOSCHER, 1999) e abrasamento químico por

compostos como picrotoxina, bicuculina (NUTT et al., 1982), cocaína (ITZHAK;

MARTIN, 2000; MILLER et al., 2000; POST; KOPANDA, 1975; POST; WEISS;

PERT, 1988) e pentilenotetrazol (ERDTMANN-VOURLIOTIS et al., 1998; LITTLE;

NUTT; TAYLOR, 1987). E mais recentemente um fenômeno similar foi descrito pela

retirada após intoxicação por etanol (GONZALEZ et al., 2001), mostrando assim que

não é apenas o estímulo químico ou elétrico que poderá causar abrasamento.

A maior parte das investigações deste fenômeno focou no hipocampo e

amígdala, ao passo que outras áreas cerebrais receberam muito menos atenção, embora

o abrasamento no corpo cingulado tenha sido estudado (LEUNG; BOON, 1990).

Entretanto, isto parece ter sido parcialmente devido ao fato de que as propriedades

anatômicas, celulares e moleculares do hipocampo e amígdala já são conhecidas

detalhadamente, fazendo com que as alterações neuronais associadas ao efeito do

abrasamento sejam mais fáceis de interpretar (GORTER; VLIET; SILVA, 2016).

1.1.2 Mecanismos gerais envolvidos no abrasamento

O modelo do abrasamento mostrou ser valioso para crises convulsivas

parciais complexas, seu desenvolvimento segue um padrão característico bem definido e

tem sido estudado por diferentes pesquisadores (RACINE, 1972). Duas características

principais do abrasamento devem ser mantidas: faz-se necessário ter uma convulsão

para o abrasamento ocorrer e a convulsão induzida não é espontânea. Este fenômeno é

de longa duração, uma vez que, quando o platô é atingido e mantido, existe uma

pequena queda na resposta ao abrasamento após períodos sem estimulação

(GODDARD; MCINTYRE; LEECH, 1969; HIYOSHI; WADA, 1992). A vantagem é

que se pode controlar a frequência, severidade e tempo de intervalo entre as crises

convulsivas, bem como testar o estado e atividade de vias envolvidas (GORTER;

VLIET; SILVA, 2016).

A progressão comportamental no desenvolvimento do abrasamento sugere

que ele começa com um número limitado de circuitos neuronais e, posteriormente,

estende-se para circuitos adicionais, correlacionando-se com o componente

comportamental de crises que evoluem para convulsões, ou seja, há recrutamento de

21

outras áreas cerebrais fora do foco estimulado, que são acompanhadas pela progressão

do estágio de convulsão comportamental envolvendo clônus unilateral e então bilateral

com rearing e queda do animal (BERTRAM, 2007; POST, 2007). O aumento da

duração destas crises sugere que a resistência existente dos circuitos para a atividade

convulsiva está também enfraquecida, mostrando que o abrasamento resulta em

mudanças na capacidade do cérebro em limitar as convulsões (BERTRAM, 2007).

A propensão progressiva ou redução do limiar para induzir convulsões que

está presente durante o abrasamento sugere que algumas alterações estruturais podem

ocorrer. Entretanto, um estudo sobre alterações estruturais ocorridas em ratos induzidos

ao abrasamento em regiões corticais anteriores não mostraram mudanças na ramificação

dendrítica e densidade espinal da região cortical analisada (RACINE et al., 1975).

Posteriormente, foram encontradas que, pelo menos nos neurônios piramidais da 3°

camada do córtex frontal podem ser observadas alterações dependentes do sexo e

tempo, como diminuição da densidade, comprimento e ramificação de dendritos apicais

e basais (TESKEY; HUTCHINSON; KOLB, 1999).

Em termos de mecanismo, este fenômeno tem mostrado causar uma

facilitação da plasticidade funcional atividade-dependente, e juntamente a este processo,

há uma indução espaço-temporal de genes imediatos como c-fos e de genes efetores

tardios incluindo neuropeptídeos, fatores neurotróficos e uma variedade de outros

compostos químicos envolvidos na síntese e liberação de neurotransmissores e ação no

receptor (POST; WEISS, 1992). Mudanças nas vias de sinalização intracelular, função

de neurotransmissores, expressão de canais de íons e morfologia neuronal e

ultraestrutural também têm sido correlacionadas (SATO et al., 1996).

Foi observado um aumento dos níveis de BDNF (fator neurotrófico

derivado do cérebro) no hipocampo, hipotálamo, neocórtex e corpo estriado, no qual

tem mostrado causar hiperexcitabilidade em cortes hipocampais (SATO et al., 1996),

relacionado também ao desenvolvimento do abrasamento, pois evidências mostram que

este requer a ativação do receptor de BDNF – tropomiosina cinase B (TrkB), através de

sinalização de fosfolipases específicas (KOTLOSKI; MCNAMARA, 2010); aumento

progressivo da densidade do receptor GABAA no giro denteado, e downregulation

aguda evoluindo para upregulation deste receptor em CA1 e CA3 (LIU et al., 2009);

aumento da expressão de canais iônicos de sódio Nav1.6 em CA3 causando um

aumento persistente na corrente de sódio, e provavelmente, contribuindo para a

excitabilidade exacerbada (BLUMENFELD et al., 2009).

22

Existem evidências que sugerem que convulsões límbicas em humanos

resultam no aumento das funções afetivas límbicas, em vez de supressão (ADAMEC,

1990). O intervalo de tempo, relativamente longo, entre o início da epilepsia do lobo

temporal e o início da comorbidade dos sintomas psiquiátricos sugerem que o dano de

estruturas-chave é necessário e que se acumula ao longo do tempo, sendo determinantes

para a soma de eventos neurobiológicos que, eventualmente, irá diminuir o limiar

psicopatológico de um estado psiquiátrico normal ou prodrômico (FUJII; AHMED,

2002; KANDRATAVICIUS et al., 2012).

1.2 Abrasamento no estudo dos transtornos neuropsiquiátricos

Os modelos de abrasamento em roedores têm contribuído para o

conhecimento do efeito da ocorrência de crises epilépticas de curta duração na

fisiopatologia da epilepsia do lobo temporal (KOTLOSKI et al., 2002; SAYIN et al.,

2003) e, além disto, podem ser de maior interesse para o estudo da plasticidade neuronal

em geral, visto que as modificações neuronais produzidas pelo abrasamento podem estar

associadas a modificações em outras funções não somente vinculadas a epilepsia

(funções não-epilépticas) ou comportamentais que dependem dos neurônios afetados

(LOSCHER et al., 2003).

1.2.1 Epilepsia do Lobo Temporal e Abrasamento

A epilepsia é uma condição crônica com um grande impacto na qualidade

de vida dos portadores, sendo sua prevalência de 0,5 a 1% em toda a população mundial

e que 75% dos casos começam antes da adolescência (NUNES et al., 2011). É uma das

doenças neurológicas mais comuns e cerca de 10% da população mundial já teve pelo

menos uma crise epiléptica ao longo de toda a sua vida (PERUCCA; TOMSOM, 2011).

É um distúrbio cerebral causado pela predisposição permanente do cérebro

em gerar crises epilépticas espontâneas, recorrentes, acompanhadas de consequências

neurobiológicas, cognitivas e sociais (FISHER et al., 2005). Dentre os fatores

causadores temos fatores genéticos, estruturais, metabólicos ou desconhecidos

(BARRAGAN, 2004).

Dados epidemiológicos mostram que o tipo mais frequente de crise em seres

humanos é a epilepsia de lobo temporal (ELT), sendo a forma mais comum de epilepsia

23

focal, responsabilizando-se por pelo menos 40-50% de todos os casos desta patologia

(GUERREIRO et al., 2000; YACUBIAN, 2004).

Este tipo de epilepsia é caracterizado por crises bastantes peculiares

denominadas “crises parciais complexas”. Os circuitos primariamente envolvidos na

ELT incluem estruturas do sistema límbico, particularmente o hipocampo e a amígdala

(Figura 2). Essas estruturas participam dos processos de memória e aprendizado e

encontram-se seriamente afetadas na ELT (YACUBIAN, 2004; GUERREIRO et al.,

2000). Na forma clássica, refere-se à esclerose do hipocampo, decorrente da perda

seletiva de neurônios e do processo de gliose que acompanha a perda celular, cuja

afecção ocorre na formação hipocampal. No entanto, têm sido descritos casos de ELT

sem esclerose hipocampal, com achados patológicos que afetam outras estruturas

mesiais temporais (amígdala e córtex entorrinal) e pólo temporal, que se denomina

“epilepsia límbica” (ENGEL, 2001; 2006). A ELT com esclerose hipocampal é

caracterizada por uma forte associação a crises febris, cujo desenvolvimento

progressivo se associa a uma resistência à terapêutica medicamentosa (CENDES et al.,

2002).

Figura 2: Estruturas do sistema límbico.

Fonte: The Limbic System Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc modificado

Acesso em: 25.07.2016

24

A esclerose hipocampal refere-se a uma perda neuronal variável e seletiva

nas regiões CA1 (Setor de Sommer), CA3 e no hilo, sendo uma das características

neuropatológicas mais importantes na ELT (MELDRUM; BRUTON, 1992). Há gliose

secundária, ou seja, alteração da substância branca, e atrofia da formação hipocampal

que pode atualmente ser identificada através de ressonância magnética de alta resolução.

A perda de neurônios hilares do giro denteado geralmente é evidente, sendo por vezes a

única anormalidade (nesse caso denominada esclerose do endfolium). Em casos mais

graves, além da esclerose, há perda neuronal também em locais extra-hipocampais,

como córtex entorrinal, giro para-hipocampal, amígdala, tálamo e cerebelo. Entretanto,

a perda celular fora do hipocampo não ocorre a menos que haja também perda neuronal

nesta área (MARGERISON; CORSELLIS, 1966).

Para entender as epilepsias, inúmeras abordagens têm sido feitas, tanto pelo

estudo do tecido epiléptico após remoção cirúrgica do foco epiléptico, bem como

através de estudos dos tecidos cerebrais provenientes de animais de laboratório que são

submetidos aos modelos experimentais de epilepsia (MODY; SCHWARTZKROIN,

1997; FERNANDES et al., 2013). A alta incidência de refratariedade na ELT em

humanos, bem como seu impacto na vida do indivíduo e na sociedade, tem compelido

pesquisadores no mundo a estudar sua fisiopatologia, o que torna estes modelos

particularmente relevantes e os mais utilizados são aqueles que mimetizam a ELT,

como o modelo por pilocapina (TURSKI et al., 1983), o modelo do ácido caínico (BEN-

ARI, 1985) e o abrasamento (GODDARD, 1967).

1.2.2 Transtornos psiquiátricos e Abrasamento

O modelo de abrasamento parece ser uma valiosa ferramenta em conceituar

os mecanismos gerais envolvidos na progressão da doença para uma vasta gama de

desordens neuropsiquiátricas (POST, 2007). Em adição a importância do abrasamento

no que diz respeito à epilepsia, este fenômeno tem recebido uma grande atenção nos

esforços em contextualizar a fisiopatologia e história natural das desordens

psiquiátricas. Por exemplo, modelos de abrasamento tem sido propostos para muitos

transtornos psiquiátricos, como transtornos de humor (POST; WEISS, 1992; MULA et

al. 2010), esquizofrenia (BOB et al. 2006), abuso e dependência de drogas (MINOZZI

et al. 2008), transtornos de ansiedade (POST et al. 1997), estresse pós-traumático e dor

crônica (POST, 2007).

25

Analogamente, nessas situações de desordem psiquiátrica, um estímulo que

é, originalmente, inócuo ou sublimiar, como variáveis ambientais ou farmacológicas,

com o avançar da doença, passam a elicitar uma resposta exagerada e patológica. Os

mesmos substratos neuroanatômicos envolvidos na evolução de convulsões parciais

complexas, particulamente as do lobo temporal medial, também estão envolvidos na

modulação da ansiedade e emoção (POST, 2004).

Estudos clínicos e epidemiológicos recentes tem mostrado que, em alguns

casos, desordens psiquiátricas podem anteceder a primeira convulsão, sugerindo que a

depressão e outras doenças relacionadas ao estresse, podem em certos casos, atuar como

fator de risco para a epilepsia (HESDORFFER et al., 2006). É reforçado pelo uso de

fármacos anticonvulsivantes no tratamento de transtornos neuropsiquiátricos que

dependem da influencia dos mecanimos de abrasamento nestas desordens (POST,

2002).

1.3 Nicotina

1.3.1 Características farmacológicas da nicotina

A NIC é o maior componente psicoativo do tabaco e é uma das substâncias

de abuso mais consumidas no mundo (USHHS, 1988). Dados da Organização Mundial

da Saúde estimam que 6 milhões de óbitos sejam atribuídos ao tabagismo no mundo

anualmente (WHO, 2011), dos quais 200 mil são no Brasil (WHO, 2008). Existe um

aumento nas taxas de consumo, particularmente entre os adolescentes e mulheres, como

também uma redução da idade de início ao consumo. Adolescentes constituem o grupo

considerado de alto risco, pois cerca de 60% iniciam o consumo do cigarro aos 13 anos

de idade, e mais que 90% dos fumantes iniciam antes dos 20 anos (WHO, 2013).

É um alcalóide natural derivado de duas espécies vegetais, Nicotiana

tabacum e Nicotiana rustica (Figura 3A e 3B, respectivamente), no qual foi isolada em

1828 da folha do tabaco por Posselt e Reiman. Dos cerca de 3.000 componentes

presentes no cigarro, a NIC é a principal responsável pela tolerância e dependência,

sendo a substância mais estudada (BALFOUR, 2004). O cigarro apresenta 800 mg de

tabaco por unidade, dos quais 9 a 17 mg são de NIC e cerca de dez por cento deste valor

é absorvido pelo indivíduo fumante (BENOWITZ, 1999).

26

Figura 3: Espécies vegetais que dão origem à nicotina.

A - Nicotiana tabacum B - Nicotiana rústica

Fontes: http://www.botanik.de/files/images/Nicotiana%20tabacum.preview.jpg;

http://toxicopoeia.com/botany/plants/image/Nicotiana%20Rustica.jpg

Acesso em: 05.07.2016

A NIC é uma amina terciária composta por anéis de piridina e pirrolidina

(Figura 4). É rapidamente absorvida pelas vias respiratórias, membranas bucais e pele,

entretanto, por ser uma base extremamente forte sua absorção no estômago é limitada,

sendo absorvida mais eficientemente no intestino. Cerca de 80-90% desta substância

são alterados no corpo, principalmente no fígado pelo sistema citocromo 450 (CYP450),

no qual o gene codificador CYP2A6 é ativo nessa metabolização, entretanto podendo

ser metabolizada também nos rins e nos pulmões. A cotinina é o principal metabólito,

enquanto a nicotina-1’-N-óxido e a 3-hidroxicotinina e metabólitos conjugados são

encontrados em menores quantidades. Tanto a NIC quanto seus metabólitos são

rapidamente eliminados pelos rins (BENOWITZ, 1998; ROSEMBERG, 2002;

GOODMAN; GILMAN, 2005).

As ações farmacológicas da NIC são mediadas através da ligação a

receptores colinérgicos nicotínicos (nAChR), encontrados no sistema nervoso central

(SNC), nos gânglios autonômicos periféricos, na glândula supra-renal, em nervos

sensitivos e na musculatura estriada esquelética (MARQUES et al., 2001). Estes

receptores são pentâmeros compostos por diferentes combinações de subunidades α e β,

sendo exemplos típicos de canais iônicos regulados por ligantes, ou seja, receptores

ionotrópicos (GOTTI et al., 2006).

http://www.botanik.de/files/images/Nicotiana%20tabacum.preview.jpg

http://toxicopoeia.com/botany/plants/image/Nicotiana%20Rustica.jpg

27

Figura 4: Estrutura química da nicotina.

Fonte: http://www.quimica.seed.pr.gov.br/modules/galeria/detalhe.php?foto=1866&evento=5

Acesso em: 05.07.2016

A NIC é conhecida por seus efeitos sobre a função cardiovascular através da

estimulação simpática neural. Efeitos simpaticomiméticos da nicotina são mediados por

vários mecanismos, podendo ocorrer pela ativação de quimiorreceptores periféricos e

efeitos diretos no tronco cerebral, resultando em cronotropismo e ionotropismo positivo,

vasoconstrição coronária e da pressão arterial, secreção de adrenalina e noradrenalina

pela medula adrenal (BENOWITZ, 1999). No sistema gastrintestinal leva ao aumento

da motilidade e secreção. Na junção neuromuscular resulta em fasciculações e espamos

musculares (PANUS et al., 2011).

1.3.2 Efeitos da nicotina no Sistema Nervoso Central

A NIC é capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica e exercer efeitos

no SNC através da ligação aos receptores nicotínicos neuronais, ativando e/ou

dessensibilizando estes receptores, nos quais medeiam os efeitos fisiológicos do

neurotransmissor acetilcolina (ACh) (DANI, 2001). Produz vários efeitos,

preponderantemente excitatórios, ou seja, estimulando a liberação de outros

neurotransmissores, como noradrenalina, dopamina, GABA, endorfinas, entre outros

(BRODIE, 1991; KISHIOKA et al., 2014).

Em baixas doses a NIC afeta o aprendizado, diminui a ansiedade, altera as

respostas cardiovasculares, de termorregulação e nocicepção (BENOWITZ, 1999).

http://www.quimica.seed.pr.gov.br/modules/galeria/detalhe.php?foto=1866&evento=5

28

Estudos in vitro têm mostrado que a NIC protege ou atenua danos induzidos por

peptídeos β-amilóides, inflamação por lipopolissacarídeos, álcool e hipóxia (LIU;

ZHAO, 2004; TIZABI et al., 2004; HEJMADI et al., 2003). Esta ação neuroprotetora

parece ser mediada pela ativação de receptores nicotínicos (PICCIOTTO; ZOLI, 2008),

visto que estes mecanismos de transdução de sinal envolvem direta ou indiretamente a

modulação de cálcio e outros mecanismos antiapoptóticos através dos receptores

supracitados, entretanto, estas vias potenciais são ainda pouco compreendidas

(STEVENS et al., 2003; BUCKINGHAM et al., 2009). Em modelos animais, resulta no

desenvolvimento da sensibilização comportamental, tal como aumento da atividade

locomotora e efeitos estereotipados (HARROD et al., 2004).

Em altas doses produz comportamentos mais drásticos, incluindo

eventualmente a indução de convulsões tônico-clônicas em roedores (SALAS et al.,

2003). A administração da NIC in vivo e em culturas celulares desencadeia o aumento

da expressão de vários genes relacionados com a neurossecreção incluindo os

relacionados à síntese das enzimas biossintetizadoras de catecolaminas, estimulando

assim sua liberação (BENOWITZ, 1999).

Em áreas cerebrais como hipocampo, a NIC provoca melhora da atenção e

da memória; no córtex pré-frontal, atua sobre as funções de comportamento social; e

sobre o sistema noradrenérgico do locus coeruleus, relaciona-se com as respostas ao

estresse e está implicado na depressão. Estes efeitos são semelhantes aos produzidos por

outras substâncias, como cocaína ou anfetaminas (SENA; FERRET-SENA, 2004;

WATKINS; KOOB; MARKOU, 2000). A NIC promove também um rápido, mas

pequeno aumento do estado de alerta (HEISHMAN; TAYLOR; HENNINGFIELD,

1994), e diminui o apetite (SENA; FERRET-SENA, 2004).

A NIC também exerce efeitos dinâmicos sobre o cérebro em

desenvolvimento, produzindo diversas consequências que dependem criticamente do

tempo de exposição. Durante a adolescência pode interferir com circuitos límbicos,

resultando na potencialização da vulnerabilidade à dependência, aumento da

impulsividade e transtornos de humor (DWYER et al., 2009).

1.3.3 Papel da nicotina no sistema monoaminérgico

A NIC atua em receptores colinérgicos expressos em vias dopaminérgicas

no cérebro, que estão associados com abuso de substâncias e recompensa. Uma destas

29

vias é a mesolímbica, e é constituída por neurônios dopaminérgicos da área tegmental

ventral que se projetam ao núcleo accumbens localizado no estriado ventral (KLOET;

MANSVELDER; VRIES, 2015). A área tegmental ventral apresenta receptores

colinérgicos e quando estimulados alteram os níveis de DA em várias regiões cerebrais,

incluindo o NAC, no qual tem sido implicado em alterações nos comportamentos

emocionais e cognitivos, especialmente relacionados à regulação da adição induzida

pela recompensa (WILLUHN et al., 2010).

A ativação da via mesolímbica envolve receptores colinérgicos com

subunidades α4/α6β2 e α7, e a sensibilidade à recompensa por NIC pode ser modulada

pela sinalização de dopamina através de interações com receptores D1 e D2, entretanto

os exatos receptores pré e pós-sinápticos ainda não são conhecidos (GOTTI et al., 2010;

LAVIOLETTE et al., 2008).

Assim como outras drogas de abuso, como a cocaína e a anfetamina, a NIC

ao ativar os circuitos cerebrais dopaminérgicos, aumenta a atividade locomotora e

promove o comportamento de auto-administração em humanos e em animais de

laboratório (VEZINA; MCGEHEE; GREEN, 2007). Estudos com microdiálise mostram

que a administração sistêmica ou local de NIC produz aumento dose-dependente nos

níveis de dopamina no NAC de animais (SIDHPURA, REDFERN; WONNACOTT,

2007) e no corpo estriado de humanos fumantes (MONTGOMERY et al., 2007).

Diferenças sexuais são identificadas em relação aos efeitos da NIC neste

sistema. Estudos mostram uma significante ativação de receptores dopaminérgicos no

estriado ventral de machos e menos pronunciada nas fêmeas, apontando a ação da DA

como principal substrato nestas diferenças sexuais biológicas, caracterizadas por uma

resposta rápida (COSGROVE et al., 2014), por outro lado, evidências sugerem que a

liberação de dopamina no corpo estriado é maior em fêmeas do que em ratos machos

(WALKER et al., 2000), como também que os receptores dopaminérgicos D1 e D2

estriatais de ratos machos são hiperexpressos na adolescência em relação às fêmeas,

diminuindo, gradualmente, durante a vida adulta, independentemente das alterações

hormonais da puberdade (ANDERSEN et al., 2000).

Há também diferenças sexuais nos efeitos regulatórios a longo prazo em

receptores nicotínicos (COSGROVE et al., 2012), bem como efeitos a longo prazo

sobre os receptores dopaminérgicos (BROWN et al., 2012). Portanto, exposição a

psicoestimulantes podem causar mudanças robustas nos receptores dopaminérgicos no

30

cérebro em desenvolvimento que manifestarão efeitos em longo prazo no

comportamento na fase adulta (THANOS et al., 2007).

O sistema noradrenérgico também pode ser modulado pela NIC, e leva ao

aumento na atividade simpática periférica (GRASSI et al., 1994). Em modelos animais

a administração sistêmica de NIC aumenta os níveis de noradrenalina (NE) extracelular

e este efeito é mediado pelo locus ceruleus, principal região de neurônios

noradrenérgicos no cérebro. A NIC exerce efeitos diretos no locus ceruleus, como o

aumento da taxa de disparo neuronal e a liberação de NE (MITCHELL, 1993;

CZUBAK et al., 2010).

1.3.4 Papel da nicotina no sistema glutamatérgico

O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do SNC e é um

importante modulador da neuroplasticidade, uma vez que participa da transmissão

sináptica fisiológica, potenciação em longo prazo, a maturação neuronal e sinaptogênese

(MARMIROLI; CAVALETTI, 2012). Por outro lado, o glutamato tem sido implicado

como o principal fator responsável pela excitotoxicidade, um processo em que a

liberação excessiva ocorre em associação a desordens neurológicas, como esclerose

lateral amiotrófica, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, epilepsia, isquemia

cerebral e esquizofrenia (CUOMO et al., 2009; BITANIHIRWE et al., 2009).

A NIC aumenta a transmissão glutamatérgica através da ligação a receptores

nicotínicos homoméricos α7 localizados em terminais pré-sinápticos, sobretudo no

córtex pré-frontal e em estruturas límbicas, e dessensibilização de α4β2-nAChRs em

neurônios gabaérgicos (MANSVELDER; MCGEHEE, 2000; DICKINSON; KEW;

WONNACOTT, 2008). A NIC parece estar relacionada à elevação da sinalização de

glutamato via mecanismos dopaminérgicos, tais como os descritos para a cocaína

(MANSVELDER et al., 2002).

O envolvimento dos receptores NMDA também foi reportado, mostrando

que a liberação de glutamato via estimulação de receptores nicotínicos pré-sinápticos

tem sido implicado na ação convulsiva da NIC, e que um potente antagonista do

receptor de glutamato do subtipo NMDA, MK-801 (dizocilpina), mostrou suprimir o

desenvolvimento de convulsões induzidas por NIC (FEDELE et al., 1998; DAMAJ et

al., 1999). Além de receptores nicotínicos, a liberação de dopamina no núcleo

accumbens é controlada por receptores NMDA (KELLEY; THRONE, 1992) e a

31

ativação acentuada destes receptores podem promover eventos celulares severos,

incluindo prejuízos na homeostase de cálcio neuronal, disfunção mitocondrial e a

ativação de vias apoptóticas (DUCHEN, 2000).

1.4 Diferenças sexuais quanto aos efeitos da nicotina

Homens e mulheres exibem atitudes e habilidades diferentes, experimentam

emoções diferentes em resposta aos estímulos sociais e ambientais, e mostram uma

distinta susceptibilidade ao estresse, doenças e transtornos mentais. Um número

crescente de estudos está direcionado em avaliar as diferenças sexuais na

toxicodependência, assim o gênero também pode influenciar as respostas

comportamentais à exposição aguda e crônica das drogas de abuso (FATTORE et al.,

2014; BECKE; HU, 2008).

As taxas de abuso são mais baixas em mulheres do que em homens,

entretanto o número de mulheres usando e abusando de substâncias prescritas e ilegais

está em ascensão (LYNCH, 2009). Evidências indicam que homens e mulheres podem

diferir em seus hábitos de fumar (GRUNBERG et al., 1991; PERKINS; SCOTT, 2008).

No geral, as mulheres fazem uso de NIC mais cedo, atingem os critérios de dependência

rapidamente e entram em programas de tratamento mais precocemente do que os

homens (CHEN; MATTA; SHARP, 2007; SOFUOGLU; MOONEY, 2009).

Adolescentes do sexo feminino parecem apresentar uma particular vulnerabilidade à

NIC (COLLINS et al., 2004; LEVIN et al., 2003), e estas utilizam mais produtos

derivados do tabaco, além de ter uma maior dificuldade em parar o seu uso quando

comparadas ao sexo masculino (PAULY, 2008; PERKINS; SCOTT, 2008).

Modelos animais têm mostrado também que roedores machos e fêmeas

apresentam diferenças na sensibilidade aos efeitos da NIC. Por exemplo, roedores

fêmeas adquirem comportamento de auto-administração mais rápido e em esquemas de

doses mais baixas, apresentam maior consumo de droga, exibem maior motivação e

comportamento de busca (DELFINO et al. 2001; LYNCH, 2009), e são mais sensíveis a

antinocicepção induzida por esta droga em modelos de dor aguda e crônica (CHIARI et

al., 1999). Exibem também um maior aumento da atividade locomotora após a

administração intravenosa crônica de NIC (BOOZE et al., 1999). Quanto às crises

32

convulsivas induzidas pela mesma, observou-se que estas crises são mais severas em

fêmeas (TESKEY; HUTCHINSON; KOLB, 1999).

Estas diferenças sexuais são suportadas pela influência dos hormônios

gonadais, visto que os níveis destes hormônios mudam através do ciclo menstrual

(humanos) ou estral (roedores). Estudos em humanos que mostram os efeitos da fase do

ciclo menstrual sobre o consumo de cigarros e sobre as ações psicoativas da NIC são

conflitantes, entretanto a maioria relata que a fase do ciclo menstrual pode influenciar os

sintomas auto-relatados de abstinência em mulheres (ALLEN et al., 2008). Pesquisas

em animais sugerem que os hormônios ovarianos podem influenciar nos efeitos agudos

da NIC, como por exemplo, a administração exógena de estrógeno em fêmeas tem um

efeito pró-convulsivante, ou seja, acelera o tempo para o início da convulsão (TESKEY;

HUTCHINSON; KOLB, 1999).

Apesar da prevalência de adição à NIC parecer ser maior em homens, os

efeitos a curto e longo-prazo do uso dessa droga podem ser particularmente mais

danosos em mulheres. Contudo, os mecanismos neurobiológicos destas diferenças ainda

não estão elucidados (PAULY, 2008).

1.5 Modelo de abrasamento induzido por nicotina

A ação convulsiva da NIC está bem documentada (BENOWITZ, 1999), mas

pouco de seu mecanismo foi determinado. Foi demonstrado que estas convulsões

induzíveis são originadas no hipocampo e são centralmente mediadas envolvendo os

receptores nicotínicos com subunidades α3, α7 e β4 (DAMAJ et al., 1999; KEDMI et

al., 2004), pontuando o papel destes receptores na modulação da excitabilidade cerebral,

(LOSCHER et al., 2003).

Nesse contexto, a primeira evidência de abrasamento induzido por NIC foi

descrita por Bastlund et al. (2005), no qual mostraram que exposição repetida a doses de

NIC (2mg/kg) levam a um aumento da responsividade comportamental e ao surgimento

de crises convulsivas com o decorrer do esquema de administrações. Esse modelo

apresenta um padrão distinto de envolvimento neuroanatômico, em relação aos modelos

de abrasamento gabaérgico e de estimulação elétrica da amígdala já propostos, e parece

depender da ativação de receptores nicotínicos α4β2 e α7 e receptores NMDA, já

33

envolvidos em convulsões agudas induzidas por NIC (SALAS et al., 2004;

BASTLUND et al., 2005).

Além disso, semelhante a outros modelos de convulsão, como os induzidos

por ácido caínico, pilocarpina e pentilenetetrazol (PTZ) (SHIN et al. 2011), e de

abrasamento induzido por PTZ (AGARWAL et al. 2011), a produção de radicais livres

e o dano oxidativo resultante também tem sido destacados no desenvolvimento do

abrasamento por NIC. Estudos realizados por nosso grupo de pesquisa mostraram que

há importante redução das defesas antioxidantes e aumento da peroxidação lipídica no

córtex pré-frontal, hipocampo e corpo estriado de ratos submetidos a esse modelo,

sendo estes efeitos atenuados por uma substância antioxidante. Evidenciou-se também

uma sensibilidade diferencial em relação à idade e ao sexo dos animais na indução deste

modelo, cujos animais periadolescentes e fêmeas mostraram-se mais vulneráveis aos

efeitos da NIC (GOMES et al., 2013; OKAMURA et al., 2016).

Nos últimos anos, um crescente corpo de evidências sugere que o estresse

oxidativo, a inflamação e mudanças na neurotransmissão glutamatérgica e

dopaminérgica podem desempenhar um importante papel em muitas doenças

neuropsiquiátricas, incluindo adição, transtornos de humor e esquizofrenia. Esses novos

conhecimentos acerca da fisiopatologia destas desordens permitem que novos alvos

terapêuticos sejam desenvolvidos e explorados (DEAN et al., 2011).

1.6 Relevância e Justificativa

O abrasamento tem recebido uma grande atenção nos esforços para entender

a fisiopatologia e história natural dos transtornos psiquiátricos, visto que, uma ampla

gama destes transtornos foi implicada nos mecanismos de sensibilização, como também

a convulsão tem sido relacionada a várias patologias neurológicas, o que faz sua

prevalência ter números consideráveis, mostrando-se como um importante modelo no

estudo da epilepsia do lobo temporal. Nesse modelo, não apenas os episódios

comportamentais podem tornar-se mais severos como também podem mostrar uma

tendência à recorrência, e, por fim, à espontaneidade (POST, 2007). Com isso, o

fenômeno do abrasamento além de notável importância para o desenvolvimento da

epileptogênese, também tem se mostrado bastante conveniente para a explicação dos

cursos progressivos e de longa evolução de muitos transtornos neuropsiquiátricos.

34

O cigarro é uma das drogas de abuso mais comercializadas em todo o

mundo, e embora exista uma alta prevalência acerca do consumo de tabaco pelos

adolescentes, estudos relacionados à neurobiologia da adição por NIC têm sido

direcionados, em ensaios pré-clínicos, principalmente, em animais adultos, visto que,

um dos desafios de modelos pré-clínicos de adolescência é definir a faixa etária que seja

compatível aos humanos.

Adolescência em ratos é definida do 21° ao 59° dia pós-natal (TIRELLI;

LAVIOLA; ADRIANI, 2003), visto que há semelhanças no processo puberal de ratos e

humanos (PLANT, 2015). Outro importante fator é na investigação da sensibilidade ao

sistema de recompensa, pois um argumento que tem sido em favor de ratos como um

modelo animal para o estudo da adolescência, é que ambos, ratos e humanos

adolescentes, diferem de suas contrapartes adultas em motivação e recompensa, ou seja,

há maior sensibilidade à recompensa em grupos etários mais jovens do que adultos

(DOREMUS-FITZWATER; VARLINSKAYA; SPEAR, 2010).

Há evidências no qual a exposição cada vez mais precoce às drogas de

abuso possa ser um forte preditor do uso prolongado e dependência às drogas e dados

indicam que o cérebro em desenvolvimento pode ser afetado diferentemente dos adultos

quando expostos à NIC devido receptores nicotínicos regularem aspectos críticos do

cérebro neste período (DWYER; MCQUON; LESLIE, 2009).

Recentemente, estudos realizados por nosso grupo de pesquisa

demonstraram haver uma influencia relacionada ao sexo na susceptibilidade ao

desenvolvimento do abrasamento por NIC, pois foi evidenciado que as fêmeas

periadolescentes, faixa etária que corresponde à adolescência em humanos, apresentam

uma maior vulnerabilidade aos efeitos nocivos neste fenômeno, acompanhadas de

alterações sexo-dependentes no sistema oxidativo, como redução dos níveis de defesas

antioxidantes (GOMES et al., 2013). A influência do estresse oxidativo pode ser

confirmada pelo fato destas alterações terem sido parcialmente revertidas pelo fármaco

com propriedade antioxidante, a N-acetilcisteína (OKAMURA et al., 2016).

Considerando as características únicas de responsividade à NIC do cérebro

adolescente, e que as diferenças sexuais pertinentes relacionadas a neurobiologia deste

fenômeno não terem sido, até o presente momento, totalmente elucidada, a análise

detalhada dos mecanismos que estão envolvidos nestas diferenças, certamente poderia

abrir novos caminhos para decifrar a complexidade acerca das bases biológicas que

35

envolvem os transtornos psiquiátricos e, possivelmente, contribuir para novas

perspectivas quanto ao tratamento.

36

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

• Investigar a progressão temporal e influência do sexo nas alterações

neuroquímicas induzidas pelo fenômeno de abrasamento por NIC em ratos

periadolescentes.

2.2 Objetivos Específicos

• Verificar as diferenças comportamentais em animais machos e fêmeas

submetidos ao fenômeno do abrasamento induzido por NIC;

• Analisar os níveis de monoaminas e metabólitos em corpo estriado e hipocampo

de animais machos e fêmeas periadolescentes durante o desenvolvimento do

abrasamento por NIC;

• Avaliar as diferenças em relação ao sexo da atividade da acetilcolinesterase em

corpo estriado e hipocampo durante o desenvolvimento do abrasamento por

NIC;

• Investigar as diferenças na expressão da subunidade NR1 fosforilada (p-NR1) do

receptor glutamatérgico NMDA e proteína fosforilada de ligação ao elemento de

resposta ao AMPc (p-CREB) nestes grupos de animais induzidos ao

abrasamento;

• Analisar os níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em ratos

periadolescentes machos e fêmeas.

37

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Animais

Foram utilizados ratos Wistar machos e fêmeas 35 dias após o nascimento

(periadolescentes), pesando entre 80-100g, provenientes do Biotério Central da

Universidade Federal do Ceará (UFC), ambientados em grupos de 6 animais em caixas

de propileno 26 ± 2 ºC, a um ciclo claro/escuro de 12 h, recebendo ração padrão e água

“ad libitum”. A presente pesquisa foi iniciada após aprovação do Comitê de Ética e

Pesquisa Animal (CEPA) da UFC, com protocolo nº 49/2014 e os experimentos foram

conduzidos de acordo com o Guia de Cuidados e Usos de Animais de Laboratório do

Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos da América (OLFERT

et al., 1993).

3.2 Droga utilizada

A solução de NIC foi obtida sob a forma de base livre, (−)-Nicotine

hemisulfate salt (Sigma-Aldrich®, EUA). A dose foi escolhida baseada em um estudo

anterior realizado por este grupo de pesquisa, no qual a dose 2.0 mg/kg (dose

subconvulsivante) foi capaz de induzir o abrasamento com baixa incidência de mortes

dos animais (GOMES et al., 2013). As soluções foram preparadas diariamente e

administrada por via intraperitoneal (0,1ml/ 100 g de peso corporal).

3.3 Estratégia experimental

As metodologias descritas abaixo visaram investigar a progressão temporal e a

influência do sexo nas alterações neuroquímicas durante a indução do abrasamento por

NIC em animais machos e fêmeas periadolescentes. A primeira metodologia utilizada

foi a indução do abrasamento em ratos machos e fêmeas periadolescentes (n=8 por

grupo), a fim de verificar o período de tempo que este leva para ocorer, bem como as

diferenças quanto ao desenvolvimento do fenômeno (Figura 5).

38

Figura 5: Delineamento experimental da análise comportamental no presente

estudo.

Fonte: elaborado pelo autor.

Após a indução do abrasamento e determinação dos períodos para o

desenvolvimento do fenômeno, no qual foram 25 dias de tratamento para os machos e

19 dias de tratamento para as fêmeas, justificado pelo estudo de Gomes et al. (2013)

desenvolvido no Laboratório de Neuropsicofarmacologia que tomou por base o modelo

desenvolvido por Bastlund et al. (2005), os animais foram foram tratados novamente

com NIC 2.0 mk/kg, bem como os grupos controles foram tratados com solução salina,

e divididos em grupos (Tabela 1) para que as análises bioquímicas fossem realizadas

(Figura 6).

Tabela 1: Grupos de tratamento no desenvolvimento do abrasamento por NIC e

metodologias analisadas.

Grupos Metodologias / N° de animais por sexo

Controle Macho

1 dia

Controle Fêmea

1 dias

- Monoaminas e metabólitos / 8 animais

- Acetilcolinesterase / 8 animais

- BDNF / 8 animais

Controle Macho

10 dias

Controle Fêmea

10 dias



- BDNF / 8 animais

39

Controle Macho

Abrasamento

Controle Fêmea

Abrasamento

- Dosagem hormonal



- BDNF / 8 animais

- Imunofluorescência / 4 animais

Nicotina Macho

1 dia

Nicotina Fêmea

1 dia



- BDNF / 8 animais


Nicotina Macho

10 dias

Nicotina Fêmea

10 dias



- BDNF / 8 animais

Nicotina Macho

Abrasamento

Nicotina Fêmea

Abrasamento

- Dosagem hormonal



- BDNF / 8 animais


Figura 6: Delineamento experimental das metodologias utilizadas no presente

estudo.


40

3.4 Protocolo experimental I - Tratamento dos animais e esquema de indução do

abrasamento

O abrasamento foi induzido de acordo com método previamente descrito

por Bastlund et al. (2005). Os animais (n=8 por grupo) receberam repetidas injeções de

NIC na dose de 2.0 mg/kg, i.p., administradas todos os dias da semana (segunda-feira à

sexta-feira) durante 4 semanas, entretanto na 4º semana a última aplicação ocorreu na

quinta-feira. A quantificação das convulsões foi feita por observação visual por um

período de 15 minutos imediatamente após a administração de NIC nos dias 1, 10, 19,

22, 24 e 25. O tempo de observação limitou-se por 15 minutos, visto que estudos

prévios mostraram que para a dose de NIC utilizada este tempo é suficiente

(BASTLUND et al., 2005; GOMES et al., 2013). Os animais controle receberam

solução salina pelo mesmo intervalo de tempo (4 semanas).

Para determinação da atividade convulsivante, os animais foram avaliados

pela escala de Racine (1972), modificada por Itzhak e Martin (2000), nos quais os

estágios são classificados conforme mostrado na Tabela 2.

Tabela 2: Caracterização dos estágios de comportamento para convulsão, de

acordo com Racine (1972).

Escala de comportamento de Racine (1972)

Estágio Alterações comportamentais observadas

1 Comportamento normal

2 Hiperatividade

3 Movimentos verticais repetidos, estereotipados

4 Movimentos clônicos das patas dianteiras e “rearing”

5 Movimentos clônicos de patas dianteiras e traseiras, flexão da

cabeça e corpo inteiro e perda completa do controle postural

Fonte: adaptada de Itzhak e Martin (2000).

O abrasamento completo foi considerado quando o animal apresentou

manifestações correspondentes ao estágio 5, caracterizado por clonias de membros

41

anteriores e posteriores, flexão da cabeça e corpo inteiro e perda completa do controle

postural, ou seja, ataques motores completos.

3.5 Protocolo experimental II – Determinação dos níveis de 17β-estradiol em

plasma sanguíneo de animais induzidos ao abrasamento por nicotina

Após a indução do abrasamento por NIC, os animais (n=8 por grupo) foram

submetidos à coleta de sangue por punção do sinus retro-orbital. Os níveis de 17β-

estradiol foram determinados através do kit ADVIA Centaur (Bayer Diagnostics,

Tarrytown, NY, EUA) usando o método de quimioluminescência, de acordo com as

instruções do fabricante. Os níveis plasmáticos de 17β-estradiol são dados em

picogramas por ml (pg/ml).

3.6 Protoloco experimental III - Testes bioquímicos

3.6.1 Dissecação das áreas cerebrais

Ao longo da administração de NIC para indução do abrasamento, os

animais foram eutanasiados por decapitação, os encéfalos retirados rapidamente e

colocados sobre papel alumínio em uma placa de Petri com gelo. O córtex cerebral foi

divulsionado e rebatido para os lados, expondo parte do corpo estriado. O hipocampo

e corpo estriado foram isolados das estruturas circunjacentes por divulsionamento

(ZILLES; WREE, 1985). Terminada a dissecação, o corpo estriado (CE) e hipocampo

(HC) foram colocados em eppendorfs devidamente identificados, pesados e

conservados em freezer – 80ºC para uso nas determinações abaixo.

3.6.2 Determinação dos níveis de monoaminas e seus metabólitos em animais

induzidos ao abrasamento por nicotina

A determinação dos níveis de monoaminas e seus metabólitos ocorreram ao

longo do desenvolvimento do abrasamento induzido por NIC. Os animais (n=8 por

grupo) foram decapitados e seus cérebros imediatamente dissecados sobre gelo nos dias

1, 10 e 19 (fêmeas) e dias 1, 10 e 25 (machos) de indução do abrasamento por NIC. O

CE e HC foram retirados e utilizados para preparar homogenatos a 10% e 20%,

42

respectivamente. Estas áreas foram utilizadas por estarem envolvidas na fisiopatologia

da adição, visto que a NIC é uma droga de abuso e seu uso desencadeia alterações

neuroquímicas nestas áreas.

Para a determinação dos níveis de catecolaminas, foi utilizado o

equipamento de High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Figura 7). Os

detectores eletroquímicos que medem corrente associada com a redução ou oxidação de

solutos são chamados detectores amperométricos ou coulométricos. Neste estudo, foi

utilizado o tipo amperométrico que reage com uma quantidade muito menor de soluto,

em torno de 1%.

Figura 7: Equipamento de High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

eletroquímico

Fonte: Arquivo pessoal.

- Procedimento experimental

O CE e HC foram sonicados em ácido perclórico (HCLO4) a 10% e 20%,

respectivamente, por 30 segundos e centrifugados por 15 minutos em centrífuga

refrigerada a 15.000 rpm. Uma alíquota de 20 µl do sobrenadante foi, então, injetada no

equipamento de HPLC para a análise química.

Para a análise das monoaminas e metabólitos, uma coluna CLC-ODS(M)

com comprimento de 25 cm, calibre 4,6 mm e diâmetro da partícula de 3µm da

Shimadzu-Japão foi utilizada. A fase móvel utilizada foi composta por tampão ácido

cítrico 0,163 M, pH 3,0, contendo ácido octanosulfônico sódico, 0,69 M (SOS) como

reagente formador do par iônico, acetonitrila 4 % v/v e tetrahidrofurano 1,7 % v/v.

Noradrenalina (NE), Dopamina (DA), Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético (DOPAC) e

Ácido homovanílico (HVA) foram eletroquimicamente identificados através de um

detector amperométrico (Modelo L-ECD-6A, Shimadzu, Japão) pela oxidação em um


43

eletrodo de carbono vítreo fixado em 0,85 V, relativo a um eletrodo de referência de

Ag-AgCl (HALLMAN; JONSSON, 1984). Valores de HVA em HC não foram

apresentados nos resultados por não terem sido identificados no cromatograma.

- Padrões

Os padrões foram preparados em uma concentração final de 4 ng de NE,

DA, DOPAC, HVA (Sigma-Aldrich®, EUA). A partir da altura ou área dos picos

desses padrões, as amostras foram calculadas no programa Microsolf Excel® em um

computador e os resultados expressos em nanogramas por grama (ng/g) de tecido.

3.6.3 Determinação da atividade da enzima Acetilcolinesterase (AChE) durante o

desenvolvimento do abrasamento por nicotina

A realização deste método ocorreu ao longo do desenvolvimento do

abrasamento induzido por NIC. Os animais (n=8 por grupo) foram eutanasiados por

decapitação e seus cérebros imediatamente dissecados sobre gelo nos dias 1, 10 e 19

(fêmeas) e dias 1, 10 e 25 (machos) de indução do abrasamento por NIC. O CE e HC

foram retirados e utilizados para preparar homogenatos a 10%. A atividade da AChE foi

determinada segundo Ellman et al. (1961), tendo como princípio a medida da

velocidade de produção de tiocolina à proporção que a acetiltiocolina (ATC), utilizada

como substrato, é hidrolisada. A coloração é medida em 412 nm, através de um

espectrofotômetro (Modelo Beckman Coulter DU 720, EUA).

A atividade enzimática é medida através da leitura da variação da

absorbância por minuto, durante 3 minutos, sendo a reação linear durante pelo menos 10

minutos. A atividade específica foi expressa em nanomoles de ATC hidrolisados por

miligrama de proteína por minuto (nmoles/mg de proteína/min).

- Reação:

44

No presente estudo os tecidos foram homogeneizados em tampão fosfato

10% e o homogenato (5µL) foi adicionado a uma cubeta contendo 500µL do tampão,

895µl de água destilada e 50µL de ácido ditiobisnitrobenzóico (DTNB) 0,01M e a

absorbância zerada.

Após a absorbância ser deixada em zero a cubeta foi retirada e acrescentado

50µL de iodeto de acetiotiocolina (ATC) sendo a absorbância novamente registrada por 3

min em 412 nM. A atividade da enzima foi calculada como modificações na absorbância

do minuto 3 para o minuto 0, relativo ao conteúdo de proteína contido no homogenato. A

dosagem da concentração de proteínas foi realizada utilizando o método de Bradford

(1976).

3.6.4 Determinação dos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)

A realização deste método ocorreu ao longo do desenvolvimento do

abrasamento induzido por NIC. Os animais (n=8 por grupo) foram eutanasiados por

decapitação e seus cérebros imediatamente dissecados sobre gelo nos dias 1, 10 e 19

(fêmeas) e dias 1, 10 e 25 (machos) de indução do abrasamento por NIC. Após

homogeneização das áreas cerebrais a 20 volumes de tampão PBS pH 7,4 adicionado de

inibidores de protease (Sigma-Aldrich®, EUA), o nível de BDNF de cada amostra foi

quantificado por ensaio imunoenzimático (ELISA; R&D Systems, EUA) de acordo com

as instruções do fabricante. Os resultados foram expressos como picograma de

BDNF/mg de proteína total determinada pelo método de Bradford (1976).

3.7 Protocolo experimental IV – Determinação da expressão da subunidade NR1

fosforilada (p-NR1) do receptor glutamatérgico NMDA e da proteína fosforilada

de ligação ao Elemento de Resposta ao AMPc (p-CREB) por imunofluorescência

A determinação deste método ocorreu no 1° dia e último dia (19° para

fêmeas e 25° para machos) de administração de NIC. Os animais (n=4 por grupo) foram

anestesiados, via intraperitoneal, com uma mistura de cetamina (100mg/kg) e xilazina

(10mg/kg); e depois, foi realizada a perfusão intracardíaca com 300 mL de solução

salina e 300 mL de solução de paraformaldeído (PFA) 4%. O encéfalo foi removido, em

seguida, foi colocado em formol tamponado por 2 horas, e após, a crioproteção em

45

sacarose 30% por 2 dias. Posteriormente, os encéfalos foram acondicionados com

tissue-tek®, em freezer, à temperatura de -80°C.

Com os encéfalos extraídos, foram feitos cortes em fatias com espessura de

15µm no criostato (Leica CM1850), à temperatura de -24°C e armazenados em lâminas

gelatinizadas. A marcação para p-NR1 e p-CREB foi realizada em fatias (15 µm de

espessura) representativas do CE. Os cortes foram fixados por 2 minutos em metanol e

ficaram imersos em PBS até o momento de começar a imunofluorescência. Em seguida,

foi feita a recuperação antigênica com tampão citrato 0,1M (pH 6,0), sob aquecimento

em forno micro-ondas, por 15 minutos, à temperatura de 95°C. Após o resfriamento,

obtido em temperatura ambiente, por 20 minutos, foi feita a permeabilização da

membrana nuclear com triton X-100 (0,1%) e foi feito o bloqueio com albumina sérica

bovina (BSA) 5% acrescida de glicina 0,3M por 30 minutos para todas as lâminas. Os

cortes foram lavados com PBS e incubados, durante a noite, à temperatura de 4°C, com

os anticorpos primários feito em coelho anti-phospho NR1 (Ser-897 Millipore®) e

cabra anti-phospo CREB (Santa Cruz Biotechnology®) na diluição 1:200 em BSA 5%.

As lâminas foram lavadas e incubadas, durante 1 hora e 30 minutos, com os anticorpos

secundários anti-igG de coelho Alexa flúor 568 (Invitrogen®) e anti-igG de cabra Alexa

flúor 488 (Invitrogen®) na diluição de 1:400 em BSA 5%. Para a marcação dos núcleos,

os cortes foram incubados, durante 30 minutos, com o anticorpo DAPI (Invitrogen®) na

diluição 4 µl em 200 ml de BSA 5%. Em seguida, as lâminas foram lavadas com PBS,

montadas com Prolong Gold (Invitrogen®) e fotografadas no microscópio confocal

Olympus F1000, com uma magnificação de 20x.

A quantificação da área marcada nas fotos foi feita diferenciando as áreas

marcadas (pixels) pela maior saturação de cor associada à marcação (verde ou

vermelha). Para isso foi utilizado o programa Fiji Image J. O procedimento foi baseado

na saturação da cor associada à marcação positiva para um determinado marcador. Os

limites necessários para definição de pixels marcados e não marcados foram definidos

previamente. Para a quantificação da área marcada foram utilizadas 4 fotos (de animais

diferentes) por grupo experimental. Os resultados dessa quantificação foram

apresentados em porcentagem, a qual foi calculada a marcação positiva de um

determinado marcador em relação à área total da foto, que foi considerada 100%. Os

marcadores quantificados foram p-NR1 e p-CREB, de modo que a co-marcação

(“merge”) foi utilizada para mostrar a expressão de p-NR1 e p-CREB.

46

3.8 Análise estatística

A análise dos dados foi realizada através do software GraphPad Prism,

versão 5.0 para Windows, GraphPad Software, San Diego Califórnia EUA. Os

resultados comportamentais foram analisados através da curva de sobrevivência

utilizando o teste Log-rank (Mantel-Cox). Os dados hormonais foram analisados por

ANOVA de uma via seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls como teste post-hoc.

Os resultados bioquímicos e de imunofluorescência foram analisados por ANOVA de

duas vias seguida pelo teste de Tukey como teste post-hoc. Valores significativos para

as análises foram consideradas quando p< 0,05.

47

4 RESULTADOS

4.1 Avaliação do desenvolvimento do abrasamento induzido por nicotina em ratos

O comportamento decorrente do abrasamento é caracterizado pela

ocorrência de convulsões no estágio 5 (de acordo com a escala de Racine, ver

metodologia). Foi observado que a administração diária (segunda-feira à sexta-feira) de

NIC na dose de 2.0 mg/kg em ratos machos periadolescentes (n=8) e fêmeas

periadolescentes (n=8) foi capaz de induzir o abrasamento ao longo do tempo. No

primeiro dia de administração, nenhum animal convulsionou. No dia 19, as fêmeas

apresentaram estágio 5 mais precocemente (p<0,05 quando comparado aos machos)

após o início do tratamento mantendo-se até o último dia de tratamento, enquanto que

os machos apresentaram estágio 5 apenas no 24º dia de tratamento (Figura 8). No 25°

dia de administração todos os animais fêmeas e machos apresentaram, respectivamente,

estágio 5 de convulsão (p<0,05 quando comparado ao 1° dia de tratamento). Os machos

se mostraram mais resistentes ao desenvolvimento do abrasamento, quando comparados

às fêmeas visto que apenas 75% (n=6) dos animais deste grupo apresentaram convulsão

estágio 5, enquanto no grupo de fêmeas 87,5% (n=7) atingiram este estágio (Figura 8).

Evidenciou-se também que as fêmeas periadolescentes foram mais

susceptíveis à morte com o tratamento com NIC na dose 2.0 mg/kg, pois houve apenas

25% de sobrevivência neste grupo ao longo do tempo quando comparado com os

machos (p<0,05) (Figura 9).

48

Figura 8 – Desenvolvimento do abrasamento induzido por nicotina em ratos

machos e fêmeas periadolescentes, de acordo com o estágio 5 da escala de

convulsão de Racine (1972).

1 1 0 1 9 2 2 2 4 2 5

0

1

2

3

4

5

6

7

8

M a c h o s

F ê m e a s

*, a

*, b

**

* *

D ia s d e t ra ta m e n to

Es

tág

io 5

de

co

nv

uls

ão

(N

º d

e r

ato

s)

Cada linha representa o número de animais que apresentaram o estágio 5 de convulsão

em relação ao tempo de tratamento. Os animais receberam NIC na dose 2,0 mg/kg, via

intraperitoneal, por 25 dias durante a semana de segunda a sexta-feira. A análise dos

resultados foi feita através da curva de sobrevivência utilizando o teste Log-rank

(Mantel-Cox). *p<0,05 quando comparado ao primeiro dia de administração de NIC (dia 1). a, b p<0,05 no 19º dia e 22º dia em relação ao macho periadolescente, respectivamente.

49

Figura 9 – Percentual de sobrevivência dos animais submetidos ao abrasamento

induzido por nicotina.

M a c ho s F ê m e a s

0

20

40

60

80

100

*

% d

e S

ob

rev

ivê

nc

ia

Cada barra representa o número de animais que sobreviveram após 25 dias de

administração de NIC. Os animais receberam NIC (2,0 mg/kg, via intraperitoneal) por

25 dias durante a semana, segunda-feira à sexta-feira. A análise dos resultados foi feita

através de ANOVA de uma via seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls como

teste post-hoc. *p<0,05 quando comparado aos animais machos.

50

4.2 Determinação dos níveis plasmáticos de 17β-Estradiol em animais machos e

fêmeas induzidos ao abrasamento por nicotina

Após a indução do abrasamento por NIC, os animais foram submetidos à

coleta de sangue por punção do sinus retro-orbital. Não houve diferenças significativas

nos níveis de 17β-estradiol em ratos machos e fêmeas periadolescentes submetidos ao

abrasamento, permanecendo com os níveis hormonais similares aos animais controles

congêneres [Controle macho: 909,9 ± 42,99 pg/ml (n=5); Abrasamento macho: 949,1 ±

50,91 pg/ml (n=4); Controle fêmea: 850,6 ± 63,97 pg/ml (n=5); Abrasamento fêmea:

954,8 ± 52,39 pg/ml (n=4)]. Portanto, nenhuma diferença foi observada em relação ao

sexo nos níveis plasmáticos deste hormônio.

51

Figura 10 – Níveis plasmáticos sanguíneos de 17β-estradiol em animais machos e

fêmeas submetidos ao abrasamento por nicotina.

C o n t ro le A b ra s a m e n t o C o n t ro le A b ra s a m e n t o

0

500

1000

15001

7

-Es

tra

dio

l (p

g/m

l)

M a c h o s F ê m e a s

Cada barra representa a média ± EPM de 4-5 animais por grupo. A análise dos

resultados foi feita através de ANOVA de uma via seguida pelo teste de Student-

Newman-Keuls como teste post-hoc para comparações múltiplas.

52

4.3 Determinação dos níveis de monoaminas

4.3.1 Determinação dos níveis de dopamina (DA) de animais machos e fêmeas ao

longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina

Os resultados na Figura 11 mostram uma elevação significativa dos níveis

de DA no CE de ratos machos no 1° dia de administração de NIC na dose de 2.0 mg/kg

quando comparados às fêmeas tratadas com NIC no mesmo período [NIC macho 1 dia:

4,92 ± 0,28 ƞg/g (n=6); NIC fêmea 1 dia: 0,34 ± 0,05 ƞg/g (n=8), p<0,05], bem como

em relação aos animais Controle macho [NIC macho 1 dia: 4,92 ± 0,28 ƞg/g (n=6);

Controle macho 1 dia: 0,96 ± 0,17 ƞg/g (n=6), p<0,05], porém os níveis deste

neurotransmissor diminuem ao longo do desenvolvimento do abrasamento nos machos

tratados com NIC em relação ao 1° dia de administração [NIC macho 1 dia: 4,92 ± 0,28

ƞg/g (n=6); NIC macho 10 dias: 3,02 ± 0,31 ƞg/g (n=5); NIC macho Abrasamento:

0,326 ± 0,07 ƞg/g (n=7), p<0,05].

Não houve diferenças significativas quanto ao conteúdo de DA em CE de

fêmeas tratadas com NIC ao longo do desenvolvimento do fenômeno (Figura 11).

No HC os níveis de DA mostram-se reduzidos significativamente no grupo

NIC machos 1 dia quando comparados ao controle e mantendo-se diminuídos no

abrasamento [NIC macho 1 dia: 0,027 ± 0,006 ƞg/g (n=6); Controle macho 1 dia: 0,084

± 0,008 ƞg/g (n=6); NIC macho Abrasamento: 0,022 ± 0,007 ƞg/g (n=6), p<0,05]

(Figura 12).

Não houve diferenças significativas nas fêmeas em relação aos machos nos

níveis de DA em HC nas fêmeas no início de indução e desenvolvimento do fenômeno

(Figura 12).

53

Figura 11: Níveis de DA no corpo estriado de animais machos e fêmeas ao longo do

desenvolvimento do abrasamento por nicotina.

D

A n

an

og

ram

as

/g t

ec

ido

1 d ia 10 d ia s A b ra s a m e n t o

0

1

2

3

4

5

6

7C o n tro le M a c h o

N ic o tin a M a c h o

C o n tro le F ê m e a

N ic o tin a F ê m e a

a

a ,b

*

b ,c

#


resultados foi feita através de ANOVA por duas vias seguida pelo teste de Tukey como

teste post-hoc. a,b,c p<0,05 quando comparado com animais controle, NIC 1 dia e NIC 10 dias,

respectivamente, pareados por sexo.

* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 1 dia. # p<0,05 quando comparado ao grupo macho 10 dias.

Abreviaturas: DA = dopamina

54

Figura 12: Níveis de DA no hipocampo de animais machos e fêmeas ao longo do


DA

na

no

gra

ma

s/g

te

cid

o


0 .00

0 .05

0 .10

0 .15

0 .20C o n tro le M a c h o




a

b

a ,b

a ,c

c





Abreviaturas: DA = dopamina

55

4.3.2 Determinação dos níveis do metabólito DOPAC de animais machos e fêmeas


Os resultados na Figura 13 mostram um aumento significativo dos níveis de

DOPAC no CE de ratos machos no 1° dia de administração de NIC na dose de 2.0

mg/kg quando comparados às fêmeas tratadas com NIC no mesmo período [NIC macho

1 dia: 3,42 ± 0,19 ƞg/g (n=6); NIC fêmea 1 dia: 0,51 ± 0,06 ƞg/g (n=8), p<0,05], bem

como em relação aos animais Controle macho [NIC macho 1 dia: 3,42 ± 0,19 ƞg/g

(n=6); Controle macho 1 dia: 1,72 ± 0,23 ƞg/g (n=6), p<0,05], porém os níveis deste

metabólito diminuíram ao longo do desenvolvimento do abrasamento nos machos

tratados com NIC em relação ao 1° dia de administração [NIC macho 1 dia: 3,42 ± 0,19

ƞg/g (n=6); NIC macho 10 dias: 1,66 ± 0,32 ƞg/g (n=5); NIC macho Abrasamento: 0,94

± 0,06 ƞg/g (n=7), p<0,05].

O conteúdo de DOPAC em CE de fêmeas está reduzido no 1° dia de

indução do fenômeno em relação aos controles [NIC fêmea 1 dia: 0,51 ± 0,06 ƞg/g

(n=8); Controle fêmea 1 dia: 1,57 ± 0,16 ƞg/g (n=6), p<0,05]. No entanto, no

abrasamento, estes níveis no grupo NIC fêmeas estavam aumentados ao comparar-se

com o 1° e 10° dias de adminitração da substância [NIC fêmea 1 dia: 0,51 ± 0,06 ƞg/g

(n=8); NIC fêmea 10 dias: 0,60 ± 0,10 ƞg/g (n=6); NIC fêmea Abrasamento: 1,48 ±

0,20 ƞg/g (n=8), p<0,05] (Figura 13).

No HC é evidenciado uma diminuição aguda do conteúdo de DOPAC nos

animais NIC macho 1 dia ao comparar com os animais controles [NIC macho 1 dia:

0,179 ± 0,028 ƞg/g (n=6); Controle macho 1 dia: 0,290 ± 0,026 ƞg/g (n=5), p<0,05]. Os

níveis deste metabólito mostram-se também reduzidos acentuadamente em machos

tratados com NIC no abrasamento em relação aos machos que foram submetidos a 1 e

10 dias de adminitração de NIC [NIC macho Abrasamento: 0,033 ± 0,009 ƞg/g (n=8);

NIC macho 1 dia: 0,179 ± 0,028 ƞg/g (n=6); NIC macho 10 dias: 0,276 ± 0,03 ƞg/g

(n=6), p<0,05] (Figura 14).

Em HC de fêmeas observa-se também uma redução dos níveis de DOPAC

no grupo NIC fêmea 1 dia ao comparar-se com o grupo NIC macho [NIC fêmea 1 dia:

0,036 ± 0,005 ƞg/g (n=8); NIC macho 1 dia: 0,179 ± 0,028 ƞg/g (n=6), p<0,05], bem

como ao Controle fêmea [NIC fêmea 1 dia: 0,036 ± 0,005 ƞg/g (n=8); Controle fêmea 1

dia: 0,131 ± 0,012 ƞg/g (n=6), p<0,05], conforme figura 14.

56

Figura 13: Níveis de DOPAC no corpo estriado de animais machos e fêmeas ao


DO

PA

C n

an

og

ram

as

/g t

ec

ido


0

1

2

3

4

5




C o n tro le M a c h o

a

*

b

b

a

b ,c

#






Abreviaturas: DOPAC = Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético


57

Figura 14: Níveis de DOPAC no hipocampo de animais machos e fêmeas ao longo

do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.

D

OP

AC

na

no

gra

ma

s/g

te

cid

o


0 .0

0 .1

0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

0 .6





a

*

a

a ,b

c

#

a ,b ,c






Abreviaturas: DOPAC = Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético


58

4.3.3 Determinação dos níveis do metabólito HVA de animais machos e fêmeas ao

longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina

Na concentração de HVA em CE foi mostrado um aumento significativo no

grupo NIC macho 1 dia quando comparado ao grupo NIC fêmea 1 dia, como também

quando comparado ao Controle macho [NIC macho 1 dia: 0,84 ± 0,03 ƞg/g (n=6);

Controle macho 1 dia: 0,31 ± 0,05 ƞg/g (n=6), p<0,05]. Entretanto, ocorre uma queda

dos níveis deste metabólito em machos ao longo do desenvolvimento do fenômeno

(NIC macho 1 dia: 0,84 ± 0,03 ƞg/g (n=6); NIC macho 10 dias: 0,45 ± 0,06 ƞg/g (n=5);

NIC macho Abrasamento: 0,19 ± 0,02 ƞg/g (n=7), p<0,05] (Figura 15).

As fêmeas tratadas com NIC apresentam uma diminuição da concentração

de HVA no 1° dia de indução do abrasamento em relação ao grupo controle [NIC fêmea

1 dia: 0,19 ± 0,02 ƞg/g (n=8); Controle fêmea 1 dia: 0,56 ± 0,02 ƞg/g (n=6), p<0,05],

como também no desenvolvimento do fenômeno, ou seja, no abrasamento [NIC fêmea

Abrasamento: 0,24 ± 0,02 ƞg/g (n=7)] (Figura 15).

O conteúdo de HVA em HC dos grupos estudados não foi identificado no

cromatrograma.

59

Figura 15: Níveis de HVA no corpo estriado de animais machos e fêmeas ao longo

do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.

HV

A n

an

og

ram

as

/g t

ec

ido


0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0





a

*

b

ba

a ,b

#

a ,c






Abreviaturas: HVA = Ácido homovanílico

60

4.3.4 Determinação das taxas de metabolização dos neurotransmissores

DOPAC/DA e HVA/DA de animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento

do abrasamento por nicotina

As figuras 16A e 16B apresentam as taxas de metabolização dos

neurotransmissores DOPAC/DA e HVA/DA em corpo estriado, respectivamente.

Houve um aumento nas taxas de DOPAC/DA nos grupos NIC machos e fêmeas no

abrasamento em relação aos grupos NIC 1 dia e NIC 10 dias em ambos os sexos [NIC

macho Abrasamento: 3,96 ± 0,41 (n=6); NIC macho 1 dia: 0,70 ± 0,03 (n=7); NIC

macho 10 dias: 1,73 ± 0,24 (n=6); NIC fêmea Abrasamento: 3,97 ± 0,40 (n=6); NIC

fêmea 1 dia: 1,76 ± 0,14 (n=7); NIC fêmeas 10 dias: 0,79 ± 0,25 (n=5), p<0,05]. Nas

taxas de HVA/DA, foi observada uma elevação nos machos no abrasamento quando

comparados ao grupo NIC macho 1 dia [NIC macho Abrasamento: 0,80 ± 0,05 (n=6);

NIC macho 1 dia: 0,17 ± 0,009 (n=7), p<0,05]. Nas fêmeas tratadas com NIC, a taxa de

metabolização HVA/DA apresenta-se inferior aos controles [NIC fêmea 1 dia: 0,67 ±

0,05 (n=7); Controle fêmea 1 dia: 1,85 ± 0,19 (n=6); NIC fêmeas 10 dias: 1,19 ± 01,2

(n=6); Controle fêmea 10 dias: 1,82 ± 0,18 (n=6); NIC fêmea Abrasamento: 0,69 ± 0,04

(n=6); Controle fêmea Abrasamento: 1,85 ± 0,26 (n=6), p<0,05].

A figura 17 apresenta a taxa de metabolização DOPAC/DA em HC, no qual

houve um aumento significativo no grupo NIC machos 1 dia quando comparado ao

grupo NIC fêmea 1 dia [NIC macho 1 dia: 6,4 ± 0,73 (n=6); NIC fêmea 1 dia: 2,39 ±

0,36 (n=6)], sequenciada por uma redução destes valores em animais NIC machos no

dia 10 e abrasamento [NIC macho 1 dia: 6,4 ± 0,73 (n=6); NIC macho 10 dias: 1,83 ±

0,33 (n=6); NIC macho Abrasamento: 1,72 ± 0,25 (n=6), p<0,05]. Os animais fêmeas

não apresentaram diferenças significativas entre os grupos.

61

Figura 16: Taxas de metabolização dos neurotransmissores DOPAC/DA (A) e

HVA/DA (B) em corpo estriado de animais machos e fêmeas ao longo do


D O P A C /D A

Ta

xa

de

me

tab

oli

za

çã

o


0

1

2

3

4

5

6





a ,b ,c a ,b ,c

a

a

H V A /D A

Ta

xa

de

me

tab

oli

za

çã

o


0

1

2

3

4





ba a

*

a





* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 10 dias.

Abreviaturas: DA = Dopamina; DOPAC = Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético; HVA =

Ácido homovanílico

Figura A

Figura B


62

Figura 17: Taxas de metabolização dos neurotransmissores DOPAC/DA no



D O P A C /D A

Ta

xa

de

me

tab

oli

za

çã

o


0

2

4

6

8

10





a

*

bb



teste post-hoc. a,bp<0,05 quando comparado com animais controle e NIC 1 dia, respectivamente,

pareados por sexo.

* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 1 dia.

Abreviaturas: DA = Dopamina; DOPAC = Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético


63

4.3.5 Determinação dos níveis de noradrenalina (NE) de animais machos e fêmeas


Os resultados da Figura 18 mostram os níveis do neurotransmissor NE em

CE reduzidos no grupo NIC macho abrasamento quando comparado ao grupo NIC

macho 10 dias [NIC macho Abrasamento: 0,88 ± 0,11 ƞg/g (n=6); NIC macho 10 dias:

1,55 ± 0,24 ƞg/g (n=5), p<0,05]. Em relação às fêmeas, observou-se diminuição dos

níveis de NE nos animais NIC fêmea Abrasamento quando comparados aos animais

NIC fêmea 10 dias [NIC fêmea Abrasamento: 0,09 ± 0,01 ƞg/g (n=7); NIC fêmea 10

dias: 1,32 ± 0,09 ƞg/g (n=5), p<0,05], como também se mostram reduzidos ao

comparar-se aos machos tratados com NIC no abrasamento [NIC fêmea Abrasamento:

0,09 ± 0,01 ƞg/g (n=7); NIC macho Abrasamento: 0,88 ± 0,11 ƞg/g (n=6), p<0,05].

No HC de ratos machos foi evidenciado que os níveis de NE estão

diminuídos significativamente no grupo NIC macho abrasamento quando comparado ao

grupo NIC macho 10 dias [NIC macho Abrasamento: 0,02 ± 0,004 ƞg/g (n=7); NIC

macho 10 dias: 0,32 ± 0,03 ƞg/g (n=5), p<0,05]. Nas fêmeas, o conteúdo deste

neurotransmissor apresenta-se aumentado nos grupos NIC 10 dias e NIC abrasamento,

em relação ao 1° dia de administração [NIC fêmea 10 dias: 0,58 ± 0,03 ƞg/g (n=6); NIC

fêmea Abrasamento: 0,74 ± 0,11 ƞg/g (n=6); NIC fêmea 1 dia: 0,06 ± 0,01 ƞg/g (n=6),

p<0,05], como também se mostram elevados significativamente ao comparar-se aos

machos tratados com NIC no 10° dia de administração e no abrasamento [NIC fêmea 10

dias: 0,58 ± 0,03 ƞg/g (n=6); NIC macho 10 dias: 0,32 ± 0,03 ƞg/g (n=5); NIC fêmea

Abrasamento: 0,74 ± 0,11 ƞg/g (n=6); NIC macho Abrasamento: 0,02 ± 0,004 ƞg/g

(n=7)] (Figura 19).

64

Figura 18: Níveis de NE no corpo estriado de animais machos e fêmeas ao longo do


NE

na

no

gra

ma

s/g

te

cid

o


0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0




N ic o tin a F ê m e a*

a ,b

a ,b

c

c

#





* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 1 dia. # p<0,05 quando comparado ao grupo macho abrasamento.

Abreviaturas: NE = Noradrenalina

65

Figura 19: Níveis de NE no hipocampo de animais machos e fêmeas ao longo do


N

E n

an

og

ram

as

/g t

ec

ido


0 .0

0 .5

1 .0





a ,b

a ,b

b

*

c

#





* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 10 dias. # p<0,05 quando comparado ao grupo macho abrasamento.

Abreviaturas: NE = Noradrenalina

66

4.4 Determinação da atividade da enzima Acetilcolinesterase (AChE) de animais

machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina

A atividade da enzima AChE mostrou-se elevada significativamente no CE

de animais NIC fêmeas no abrasamento ao comparar com animais NIC machos neste

período [NIC fêmea Abrasamento: 10,59 ± 0,89 nmol/g/min (n=6); NIC macho

Abrasamento: 3,02 ± 0,61 nmol/g/min (n=6), p<0,05], bem como também, quando

comparada aos grupos NIC fêmea 1 dia e NIC fêmea 10 dias [NIC fêmea Abrasamento:

10,59 ± 0,89 nmol/g/min (n=6); NIC fêmea 1 dia: 5,62 ± 0,80 nmol/g/min (n=7); NIC

fêmea 10 dias: 4,26 ± 0,88 nmol/g/min (n=6), p<0,05] (Figura 20).

No HC foi evidenciada uma acentuada elevação da atividade desta enzima

em animais machos submetidos à administração aguda de NIC, ou seja, no 1º dia de

tratamento, quando comparados aos grupos controle macho e NIC fêmeas 1 dia [NIC

macho 1 dia: 11,53 ± 1,18 nmol/g/min (n=6); Controle macho 1 dia: 2,17 ± 0,35

nmol/g/min (n=7); NIC fêmea 1 dia: 3,72 ± 0,50 nmol/g/min (n=8), p<0,05]. Entretanto,

no decorrer do desenvolvimento do fenômeno de abrasamento induzido por NIC nos

machos é observado uma diminuição da atividade da enzima AChE atingindo valores

semelhantes aos seus controles, em comparação aos animais NIC macho 1 dia [NIC

macho 1 dia: 11,53 ± 1,18 nmol/g/min (n=6); NIC macho 10 dias: 2,47 ± 0,35

nmol/g/min (n=8); NIC macho Abrasamento: 2,99 ± 0,43 nmol/g/min (n=8); Controle

macho 10 dias: 1,77 ± 0,29 nmol/g/min (n=6); Controle macho Abrasamento: 2,22 ±

0,42 nmol/g/min (n=6), p<0,05]. Não houve diferenças significativas entre machos e

fêmeas quanto à atividade da AChE nos animais que desenvolveram o abrasamento

(Figura 21).

67

Figura 20 – Atividade da enzima Acetilcolinesterase no corpo estriado de animais

machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.

A

tiv

ida

de

da

AC

hE

m

ol/

µg

de

pro

t/m

in


0

5

10





a ,b ,c

*





* p<0,05 quando comparado ao grupo macho abrasamento.

68

Figura 21 – Atividade da enzima Acetilcolinesterase no hipocampo de animais

machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina.

Ati

vid

ad

e d

a A

Ch

E

m

ol/

µg

de

pro

t/m

in


0

5

10

15





a

bb

*

a



teste post-hoc. a,b p<0,05 quando comparado com animais controle e NIC 1 dia, respectivamente,

pareados por sexo.

* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 1 dia.

69

4.5 Determinação da expressão da subunidade NR1 fosforilado (p-NR1) do

receptor glutamatérgico NMDA e proteína de ligação ao Elemento de Resposta ao

AMPc fosforilado (p-CREB) por imunofluorescência

Na imunofluorescência para a subunidade NR1 fosforilada (p-NR1) do

receptor glutamatérgico NMDA, os resultados apresentados evidenciaram uma elevação

significativa da imunoexpressão no grupo NIC fêmea abrasamento ao comparar-se com

animais NIC machos abrasamento [NIC fêmea abrasamento: 4,70 ± 0,30 % (n=6); NIC

macho abrasamento: 2,80 ± 0,20 % (n=4), p<0,05], bem como também, quando

comparada aos grupos controle fêmea e NIC fêmea 1 dia [NIC fêmea abrasamento: 4,70

± 0,30 % (n=6); Controle fêmea: 1,82 ± 0,12 % (n=4); NIC fêmea 1 dia: 2,61 ± 0,51 %

(n=4), p<0,05] (Figuras 22, 23 e 24).

Na imunofluorescência para a proteína de ligação ao elemento-resposta ao

AMPc, o CREB fosforilado (p-CREB), ocorreu um evento similar ao supracitado, ou

seja, foi observado um aumento da imunoexpressão em CE de animais fêmeas tratadas

com NIC no abrasamento quando comparados ao grupo NIC macho, neste mesmo

período [NIC fêmea Abrasamento: 3,25 ± 0,28 % (n=5); NIC macho Abrasamento: 0,99

± 0,11 % (n=4), p<0,05], como também, quando comparada aos grupos controle e NIC

fêmeas 1 dia [NIC fêmea Abrasamento: 3,25 ± 0,28 % (n=5); Controle fêmea: 0,66 ±

0,23 % (n=5); NIC fêmea 1 dia: 1,38 ± 0,27 % (n=4), p<0,05] (Figuras 22, 23 e 25).

70

Figura 22 – Fotomicrografia da imunoexpressão de p-NR1 e p-CREB no corpo

estriado de ratos machos induzidos ao abrasamento por nicotina.

Azul: DAPI (marcador de neurônio); verde: p-CREB; vermelho: p-NR1; laranja: fusão.

Foto representativa de 1 animal por grupo experimental. Aumento de 20x.

100 µm 100 µm 100 µm

pp-- CC

RREE

BB ++

pp-- NN

RR11

pp

-- NNRR

11

Abrasamento

71

Figura 23 – Fotomicrografia da imunoexpressão de p-CREB e p-NR1 no corpo

estriado de ratos fêmeas induzidas ao abrasamento por nicotina.

Azul: DAPI (marcador de neurônio); verde: p-CREB; vermelho: p-NR1; laranja: fusão.

Foto representativa de 1 animal por grupo experimental. Aumento de 20x.

100 µm 100 µm 100 µm

pp-- NN

RR11

pp

-- CCRR

EEBB

++ pp

-- NNRR

11

Abrasamento

72

Figura 24 – Imunoexpressão da subunidade NR1 fosforilado (p-NR1) do receptor

glutamatérgico NMDA em corpo estriado de animais machos e fêmeas ao longo do


%

de

Áre

a M

arc

ad

a

C o n t r o le 1 d ia A br a sa m e n t o

0

2

4

6

M MF F FM

N ic o t in a

*, # , a



teste post-hoc.

*,# p<0,05 quando comparado com animais controle fêmeas e NIC fêmeas 1 dia,

respectivamente. a p<0,05 quando comparado aos animais machos abrasamento.

Abreviaturas: M = machos; F = fêmeas

73

Figura 25 – Imunoexpressão da proteína de ligação ao Elemento de Resposta ao

AMPc fosforilada (p-CREB) em corpo estriado de animais machos e fêmeas ao

longo do desenvolvimento do abrasamento por nicotina. %

de

Áre

a M

arc

ad

a

C o n t r o le 1 d ia A br a sa m e n t o

0

1

2

3

4

5

N ic o t in a

M MF F FM

*, # , a


resultados foi feita através de two-way ANOVA seguida pelo teste de Tukey como teste

post-hoc.

*,# p<0,05 quando comparado com animais controle fêmeas e NIC fêmeas 1 dia,

respectivamente. a p<0,05 quando comparado aos animais machos abrasamento.

Abreviaturas: M = machos; F = fêmeas

74

4.6 Determinação dos níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) de


nicotina

A análise dos níveis de BDNF pelo teste de ELISA mostrou um aumento

significante deste fator neurotrófico no CE de ratos fêmeas ao longo do

desenvolvimento do fenômeno, ou seja, no grupo NIC fêmea 10 dias, e persistindo com

os níveis elevados no grupo NIC fêmea abrasamento quando comparado aos animais

NIC fêmea 1 dia [NIC fêmea 10 dias: 2383,01 ± 77,67 pg/g (n=7); NIC fêmea

Abrasamento: 2377,42 ± 75,79 pg/g (n=6); NIC fêmea 1 dia: 1797,86 ± 73,93 pg/g

(n=6) p<0,05]. Entretanto, foi observada nos ratos machos, uma redução significativa do

conteúdo de BDNF no abrasamento em comparação às fêmeas tratadas com NIC no

mesmo período [NIC macho Abrasamento: 1349,85 ± 89,83 pg/g (n=7); NIC fêmea

Abrasamento: 2377,42 ± 75,79 pg/g (n=6), p<0,05], bem como, quando comparado aos

animais machos tratados com NIC no 1° e 10° dias [NIC macho Abrasamento: 1349,85

± 89,83 pg/g (n=7); NIC macho 1 dia: 2932,08 ± 139,74 pg/g (n=6); NIC macho 10

dias: 2683,20 ± 114,54 pg/g (n=7), p<0,05] (Figura 26).

Interessantemente, os níveis de BDNF do CE de machos controles são

aumentados em relação às fêmeas (Figura 26).

Em relação ao HC, houve diminuição significante dos níveis de BDNF nos

machos e fêmeas que desenvolveram o abrasamento, quando comparados aos animais

machos e fêmeas no 10° dia de administração de NIC, respesctivamente [NIC macho

Abrasamento: 128,74 ± 12,39 pg/g (n=6); NIC macho 10 dias: 544,94 ± 14,94 pg/g

(n=8); NIC fêmea Abrasamento: 156,57 ± 23,09 pg/g (n=7); NIC fêmea 10 dias: 264,66

± 20,59 pg/g (n=6), p<0,05], conforme apresentado na Figura 27.

75

Figura 26 – Níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em corpo

estriado de animais machos e fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento

por nicotina.

BD

NF

pg

/g t

ec

ido


0

1000

2000

3000





*

a ,b ,c

a ,b a ,b

#

& &&





* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 1 dia. # p<0,05 quando comparado ao grupo macho abrasamento. &p<0,05 quando comparado ao grupo controle macho

76

Figura 27 – Níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em



BD

NF

pg

/g t

ec

ido


0

200

400

600





a ,b

*

c

c





* p<0,05 quando comparado ao grupo macho 10 dias.

77

5 DISCUSSÃO

No presente trabalho foi inicialmente demonstrado que a susceptibilidade ao

abrasamento por NIC é influenciada pelo sexo. Os resultados mostraram que as fêmeas

periadolescentes foram mais susceptíveis aos efeitos tóxicos da NIC, pois estes animais

desenvolveram estágio 5 de convulsão, de acordo com a escala de Racine (1972), no

19° dia administração, ao contrário dos machos periadolescentes que foram mais

resistentes, apresentando estágio 5 apenas no 24° dia de administração de NIC.

Associado a estes dados, foi observado também um elevado número de mortes no grupo

das fêmeas em relação aos machos.

A NIC tem sido descrita como o componente primário responsável por uma

ampla variedade de efeitos comportamentais e neuroquímicos (FOWLER et al., 2008;

SLOTKIN, 2002). É uma das drogas mais socialmente aceitáveis, o que a torna uma

substância de escolha inicial para experimentação entre os adolescentes. Evidências

epidemiológicas sugerem que o início precoce de experimentação desta droga está

associado a um aumento da probabilidade de desenvolvimento de dependência

(SCHRAMM-SAPYTA et al., 2009).

A adolescência é um período de desenvolvimento que implica um aumento

de sensações e busca de novidades, como também apresenta respostas mais fortes para

fatores ansiogênicos quando comparados com crianças e adultos (HOLDER;

BLAUSTEIN, 2014). Apesar do fato de que a busca pelo novo é sugerido ter um valor

preditivo à vulnerabilidade às drogas de abuso (BARDO et al., 1996; BELIN;

DEROCHE-GAMONET, 2012), na adolescência é evidenciada numerosas e dinâmicas

alterações do Sistema Nervoso Central, tais como plasticidade sináptica, eliminação e

maturação de vários sistemas neuroquímicos, bem como, mielinização contínua

(RAKIC et al., 1986; LENROOT; GIEDD, 2006).

Os efeitos da NIC são influenciados por idade e sexo, e isto é reforçado em

estudos pré-clínicos que demonstram que ratos periadolescentes são mais vulneráveis ao

efeitos comportamentais e neuroquímicos desta substância (ADRIANI et al., 2003). Em

linha com esta evidência, ratos periadolescentes quando expostos a repetidas

administrações de NIC apresentaram exacerbação das convulsões durante a idade adulta

em modelo de retirada do etanol (RILEY et al., 2010). As diferenças nos subtipos e

78

número de receptores nícotínicos ajudam a explicar esta vulnerabilidade relacionada à

idade quanto aos efeitos da NIC (DWYER et al., 2009).

Os nAChRs são expressos no cérebro humano no primeiro trimestre de

desenvolvimento e exibem um padrão complexo de expressão desenvolvimental região-

específica e temporalmente regulada. Entretanto, os picos de receptores nicotínicos com

subunidades α4β2 e α7 ligados no neocórtex e hipocampo ocorrem durante o terceiro

trimestre de desenvolvimento (COURT et al., 1997; COURT et al., 2000). Em

roedores, os níveis das subnidades α4β2 e α7 na maioria das regiões do cérebro tem sido

mostrado ser estável desde a adolescência até a idade adulta (ZHANG et al., 1998),

embora outras evidências descrevam um aumento de nAChR em adolescentes (DOURA

et al., 2008). Apesar dessas discrepâncias, subunidades α4β2 nAChR mostram

mudanças funcionais no córtex, hipocampo, estriado e tálamo durante a adolescência,

com o aumento induzido por NIC em comparação com adultos. Estas alterações podem

ser mediadas por aumento do número de receptores nestas regiões, ou por inserção de

subunidades, tais como α5 (KOTA et al., 2007).

Em muitas áreas do cérebro ocorre o aparecimento transiente de nAChRs

durante fases críticas do desenvolvimento, o que pode apresentar um papel funcional

importante na modulação desenvolvimental deste receptor, especialmente durante

períodos críticos, quando a maturação do cérebro é mais sensível à perturbação

(DWYER et al., 2009). Portanto, compreender as alterações comportamentais que

ocorrem durante a adolescência como resultado da exposição à NIC pode ajudar a

explicar porque a iniciação ao fumo neste período está associada a uma dependência em

longo prazo (CHEN; MILLAR, 1998; NIDA, 2012).

Evidências indicam que homens e mulheres podem diferir em seus hábitos

de fumar. Em geral, mulheres fumam menos cigarros por dia e tem menor dependência

de NIC (SHIFFMAN; PATON, 1999; PERKINS, 2001). O menor consumo pode estar

relacionado a diferenças de gênero nas motivações para fumar. Especificamente, as

mulheres que fumam diariamente tendem a fazê-lo em resposta a estímulos não-NIC

(tais como exposição aos estímulos, redução do estresse ou controle de peso), enquanto

os homens são mais propensos a fumar para manter os níveis de NIC (ALLEN;

ONCKEN; HATSUKAMI, 2014). Há também evidências nos resultados de parar de

fumar, em que no geral, as mulheres apresentam taxa de cessação inferiores aos dos

homens (BENOWITZ; HATSUKAMI, 1998; PERKINS; SCOTT, 2008; VOGEL et al.,

2014) e que adolescentes mulheres são particularmente vulneráveis aos efeitos da NIC.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0163725809000321#bib56

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0163725809000321#bib57

79

No entanto, mecanismos neurobiológicos precisos relacionados a estas diferenças ainda

não estão claros (PAULY, 2008).

Em modelos animais, a NIC apresenta efeitos neuronais deletérios que se

mostram mais graves nas fêmeas. Em trabalhos anteriores foi demonstrado uma maior

susceptibilidade das mesmas aos danos causados pela sensibilização por NIC (GOMES

et al., 2013; OKAMURA et al., 2016), visto que o número de óbitos apresentado no

presente estudo foi em torno de 75% ao se equivaler o tempo de administração entre

machos e fêmeas.

Em nosso modelo de abrasamento por NIC, evidenciamos uma diferença de

sexo em relação ao padrão comportamental apresentado, visto que as fêmeas

periadolescentes desenvolveram o abrasamento mais rapidamente que o machos, ou

seja, com 19 dias de administração repetida, ao passo que os machos deu-se com 25

dias, sugerindo respostas distintas à NIC no Sistema Nervoso Central. Foi mostrado

também que as fêmeas não iniciaram o ciclo estral até o dia de desenvolvimento do

abrasamento, visto que esta observação foi confirmada pelos níveis similares do

hormônio 17β-estradiol em ambos os gêneros, ou seja, em animais machos e fêmeas,

descartando assim, a influência de hormônios esteroidais nas alterações

comportamentais e bioquímicas apresentadas neste estudo.

Existem várias explicações possíveis para as diferenças sexuais observadas

na sensibilidade ao abrasamento induzido por NIC. As fêmeas periadolescentes são

mais hiperativas em testes de campo aberto seguindo-se ao tratamento com anfetaminas

em comparação com os machos (BECKER et al., 1982). É possível que a exposição

repetida à NIC durante a adolescência interfira com os processos que normalmente estão

intrínsecos em ratas. Por exemplo, tem sido demonstrado que o estrógeno facilita a

neuroplasticidade e aprendizagem e a exposição crônica à nicotina inibe o elemento de

ligação de resposta ao estradiol em ratos (SHINGO et al., 2000). Hormônios sexuais

influenciam o início e a propagação das convulsões, apesar do estrógeno ser bem

conhecido por apresentar propriedades antioxidantes (KUMAR et al., 2011), no entanto,

nossos resultados sugerem que os níveis de estrógeno não estão envolvidos em

diferenças comportamentais quanto ao sexo apresentados neste estudo.

Está bem estabelecido que receptores nicotínicos facilitam a

neurotransmissão dopaminérgica (THRELFELL; CRAGG, 2011). Receptores que

apresentam a subunidade α4β2 são responsáveis pela liberação de DA (CHAMPTIAUX

et al., 2003), e apresentam-se em upregulation em animais periadolescentes controles e

80

tratados cronicamente com NIC (DOURA et al., 2008), regulando assim, parcialmente

os efeitos comportamentais da nicotina (PONTIERI et al., 1996).

Com base em que a modulação da transmissão dopaminérgica envolve a

participação de receptores nicotínicos e que a atividade de neurônios dopaminérgicos

pode ser inferida através da determinação dos níveis de DA, DOPAC e HVA no cérebro

ou fluido cerebrospinal (MOORE; WEST; DAWSON, 2005) decidiu-se investigar os

níveis de monoaminas e seus metabólitos em ambos os sexos durante o

desenvolvimento temporal do abrasamento por NIC (periadolescentes). Além disso,

foram calculadas as taxas de metabolização para a compreensão da renovação das

monoaminas e, assim, compreender os mecanismos envolvidos neste tipo de

abrasamento.

Os resultados do presente estudo mostram que o conteúdo de DA e

metabólitos DOPAC e HVA em corpo estriado de ratos machos estão aumentados no 1°

dia de administração de NIC, seguida por uma redução destes níveis no abrasamento,

enquanto nas fêmeas o conteúdo de DA é semelhante aos controles ao longo do

abrasamento, ao passo que DOPAC e HVA diminuíram no 1° dia de administração de

NIC, porém apenas os níveis de DOPAC elevaram-se próximo às taxas de controle no

abrasamento. As taxas estriatais de metabolização DOPAC/DA em machos e fêmeas no

abrasamento apresentam-se elevadas, sugerindo baixo fluxo e permanência destas

monoaminas na área analisada, ao passo que as taxas HVA/DA apresentam-se elevadas

no abrasamento apenas nos machos. No hipocampo, os níveis de DA e DOPAC nos

machos estão inferiores aos controles no 1° e último dia de administração de NIC

(abrasamento), ao passo que nas fêmeas o conteúdo de DA está semelhante aos

controles em ambos os períodos supracitados, e DOPAC reduzido apenas no 1° dia,

atingindo taxas próximas ao grupo controle no abrasamento. Os níveis de HVA não

foram identificados no cromatograma. As taxas de metabolização DOPAC/DA no HC

estão elevadas nos machos tratados por NIC no 1° dia de indução do abrasamento,

porém permaneceram semelhantes aos controles em machos e fêmeas no abrasamento.

O sistema dopaminérgico está amplamente difundido no cérebro. A maioria

dos neurônios dopaminérgicos estão presentes na substância negra (que se projeta para o

corpo estriado e sistema límbico) ou na área tegmental ventral (que se projeta para o

córtex frontal, amígdala e núcleo accumbens). Um estudo com administração aguda de

NIC, resultou no aumento dos níveis de DA, DOPAC e HVA no núcleo accumbens de

ratos machos (BEDNAR; FRIBERG; NORDBERG, 2004), estando em linha com

81

nossos achados, relacionando à ativação do sistema dopaminérgico mesocorticolímbico,

formado essencialmente de neurônios, cujos corpos celulares estão localizados na área

tegmentar ventral, e que liberam dopamina e ativam receptores D1 e D2 em regiões

como núcleo accumbens (BASSAREO; DI CHIARA; 1997; MARK; BLANDER;

HOEBEL, 1991). Portanto, os efeitos agudos e de curto prazo da NIC são

primariamente excitatórios e potencializam a atividade neuronal dopaminérgica (TOLU

et al., 2013).

Os neurônios dopaminérgicos são normalmente identificados pela presença

da tirosina hidroxilase (TH), enzima limitante da velocidade envolvida na síntese de

dopamina. A expressão desta enzima em dimorfismo sexual tem sido observado na

substantia negra (MA et al., 2007) e área tegmental ventral (BROWN et al., 2015), e sua

expressão pode ser influenciada pela exposição à NIC (SMITH et al., 1991). Estudo

incluindo modelo animal de doença de Parkinson por 6-OHDA mostrou que a NIC

aguda e subcrônica em doses baixas (0.6 e 0.8 mg kg−1, subcutânea) aumentam os

níveis de DA e TH no estriado de ratos machos lesionados (COSTA et al., 2001;

VISANJI et al., 2006), corroborando, em parte, com nossos dados.

Apesar da exposição aguda à NIC aumentar a RNAm (expressão gênica) de

TH e a exposição crônica aumentar a transmissão dopaminérgica (FERRARI et al.,

2002), os níveis de DA e metabólitos estriatais de ratos machos no presente trabalho

mostraram-se reduzidos em níveis próximos aos controles no abrasamento, tendendo a

um mecanismo adaptativo. Estes dados estão consistentes com estudos que revelam

nenhum efeito de injeções subcrônicas de NIC nos níveis de TH no estriado ou na

atividade desta enzima na área tegmentar ventral (SMITH et al., 1991), sugerindo

adaptações na atividade da TH decorrente à exposição crônica de NIC (BRUNZELL;

RUSSELL; PICCIOTTO, 2003), relacionando assim, a queda do conteúdo de DA com a

baixa síntese. Entretanto, a exposição crônica à NIC parece não alterar a função e

expressão do transportador de DA (VIEIRA-BROCK et al., 2015), proteína

transmembrana pré-sináptica importante na recaptação, não influenciando, portanto, nos

níveis desta monoamina.

Tem-se evidenciado também que a exposição à NIC em longo prazo induz

downregulation de receptores nicotínicos, α6β2 nAChR, subtipo-chave na regulação da

neurotransmissão dopaminérgica endógena no núcleo accumbens e ATV, reduzindo

assim, a liberação de DA (PEREZ, MCINTOSH; QUIK; 2013). Estudo de Koranda et

al. (2014) utilizando animais knockout para β2nAChR, sugeriu que a deleção da

82

subunidade β2 ou desensibilização de nAChR após exposição crônica de NIC induz

adaptações a longo prazo, como redução da transmissão dopaminérgica, e

consequentemente, parecendo prolongar o desenvolvimento do abrasamento.

Por outro lado, embora evidências anteriores sugiram que a liberação de DA

no estriado é maior em fêmeas do que em machos (WALKER et al., 2000), nossos

resultados mostraram um padrão diferente, em que o conteúdo de DA nas fêmeas

tratadas com NIC é semelhante ao controle ao longo da indução do fenômeno estudado,

e os metabólitos DOPAC e HVA, estão em níveis próximos e diminuídos em relação

aos controles no abrasamento, respectivamente. Entretanto, estas diferenças podem ser

justificadas pelo fato destas fêmeas não terem entrado em ciclo estral, visto que não

foram encontradas diferenças nos níveis de estradiol entre os grupos analisados. De

forma similar, o estudo de Torres et al. (2015) ao utilizar fêmeas ovariectomizadas

expostas à NIC (3.2 mg/kg s.c.) por 14 dias, mostraram não haver mudanças na

expressão gênica de receptores dopaminérgicos no núcleo accumbens em relação aos

controles, mas reduzido quanto às fêmeas não-ovariectomizadas. Assim, tem sido

hipotetizado que receptores estradiol de membrana (mER) estão anatomicamente

posicionados no estriado facilitando a liberação de DA induzida pela administração de

drogas de abuso e que esses hormônios são capazes de modular o sistema

dopaminérgico em fêmeas mas não em machos (ANKER; CARROLL, 2011; YOEST;

CUMMINGS; BECKER, 2014).

Para investigar os efeitos da NIC no sistema monoaminérgico, os níveis de

outra catelocamina – NE – foram analisados neste fenômeno. A estimulação pré-

sináptica de receptores nicotínicos tem mostrado induzir a liberação de NE

(CHANGEUX et al., 1998), entretanto, nossos resultados evidenciam que o conteúdo de

NE em corpo estriado de fêmeas e machos mostra-se semelhantes aos controles no 1°

dia e último dia do desenvolvimento do abrasamento, enquanto que no hipocampo, foi

identificado elevação destas taxas no abrasamento em fêmeas. Benwell e Balfour (1997)

demonstraram que administração repetida de NIC aumenta os níveis de NE em

hipocampo de ratos, corroborando em parte com nossos dados, na qual a alteração foi

encontrada nas fêmeas. Contudo, estudo de Risso et al. (2004) mostraram que a

administração de NIC por 10 dias promove um aumento na liberação de NE hipocampal

de preparações sinaptossomais resultante da upregulation de receptores glutamatérgicos

ionotrópicos – NMDA, fato este previamente observado neste trabalho, em que a

83

expressão da subunidade NR1-NMDA encontra-se aumentada em corpo estriado de

fêmeas no abrasamento.

Foi quantificado a atividade da enzima AChE e identificou-se que esta

atividade estava aumentada no corpo estriado apenas das fêmeas no abrasamento (19°

dia). Entretanto, a atividade desta enzima na área hipocampal das mesmas permaneceu

inalterada no mesmo período supracitado, sugerindo o não envolvimento da região neste

mecanismo relacionado ao fenômeno.

Acetilcolinesterase (AChE) é a enzima mais rápida nas células de

mamíferos, sendo um componente-chave da sinalização colinérgica, visto que é uma

enzima regulatória responsável pela finalização da transmissão de impulsos nervosos

sinápticos por meio da hidrólise da acetilcolina (MESHORER; SOREQ, 2006). Um

adaptativo aumento ou queda da atividade de AChE em compensação ao aumento ou

queda dos níveis de acetilcolina, respectivamente, tem sido extensamente descrito

(MARTELLA et al., 2009). Entretanto, a atividade de AChE é controlada através de

mecanismos de transcrição e pós-transcrição e está dramaticamente aumentada em

stress toxicológico, físico e psicológico, resultando no aumento da hidrólise e depleção

de acetilcolina em receptores colinérgicos, com consequente declínio da função cerebral

(KAUFER et al., 1998; MESHORER et al., 2002; SHOHAMI et al., 2000). A atividade

da AchE aumentada a longo prazo parece estar associada com a elevação da

excitabilidade, fato observado em estruturas do lobo temporal de ratos epilépticos, cujo

apresentaram disfunção colinérgica e hiperatividade desta enzima (ZIMMERMAN et

al., 2008).

Como discutido acima, a hiperexcitabilidade induz mudanças intracelulares

dependentes de Ca2+ na expressão de proteínas-chave colinérgicas, incluindo a redução

da expressão de colina-acetiltransferase e transportador vesicular de acetilcolina, e o

mais notável nestas alterações é a longa duração da up-regulation da AChE

(GUTIERREZ; HEINEMANN, 2001). Além disso, a AChE possui funções não-

colinérgicas em relação ao desenvolvimento, migração neuronal e crescimento de

neurites (SOREQ; SEIDMAN, 2001). Baseado nisto, pode-se pressupor que as fêmeas

desenvolveram o abrasamento mais precocemente por uma possível hiperexcitabilidade

neuronal relacionada ao aumento da atividade de AChE e que tem mostrado causar dano

às celulas neuronais (DAY; GREENFIELD, 2002), fato este não observado nos machos.

Muitos mecanismos de convulsão induzida por NIC tem sido propostos, e

todos eles envolvem a ativação inicial de nAChR centrais. A liberação de glutamato e

84

aumento da transmissão sináptica glutamatérgica podem elicitar convulsões em modelos

animais, sugerindo o envolvimento, principalmente de nAChR com subunidade α7,

canais de cálcio tipo L, receptores NMDA e formação de óxido nítrico em convulsões

induzidas por NIC (DAMAJ et al., 1999). Assim, a ativação excessiva de receptores

glutamatérgicos está implicada em algumas condições patológicas do SNC, incluindo

desordens neurodegenerativas, epilepsia, inflamação ou transtornos psiquiátricos

(ZIELINSKA et al., 2009).

Neste trabalho, visto que as principais alterações encontradas relacionadas

aos sistemas dopaminérgico e colinérgico ocorreram no corpo estriado, decidiu-se

investigar o envolvimento do sistema glutamatérgico neste modelo de abrasamento

através da imunoexpressão da subunidade NR1 fosforilada de receptores do tipo NMDA

(Ser897), pois a fosforilação direta de receptores glutamatérgicos é um mecanismo

chave na regulação da função e localização de receptores em sinapses (LEE, 2006).

As ações do neurotransmissor glutamato são mediadas por dois grandes

grupos de receptores: os ionotrópicos (iGluRs) e metabotrópicos (mGluRs). Os

receptores ionotrópicos, como NMDA e AMPA, estão envolvidos na rápida

neurotransmissão glutamatérgica, em contraste aos metabotrópicos, que são de ação

lenta e modulam a transmissão do glutamato (KEW; KEMP, 2005). Dentre todos estes

receptores, o mais estudado é o NMDA, devido ao seu envolvimento com a

neurotoxicidade, por localizar-se em membranas pós-sinápticas de sinapses excitatórias,

e alguns em membranas pré-sinápticas. NMDARs são formados pela combinação de

uma subunidade NR1 com um dos 4 subtipos da subunidade NR2 (NR2A-D) e em alguns

casos, com a subunidade NR3 (RUGGIERO et al., 2011).

Embora a NIC promova upregulation de iGluRs (GAO et al., 2010), Pistillo

et al. (2016) e Wang et al. (2007) ao analisarem a expressão de NR1 em estriado e

núcleo accumbens, respectivamente, por western blot, mostraram que a exposição

crônica à NIC não altera os níveis desta subunidade em ratos machos, corroborando

com nossos achados, que não apresentaram mudanças no 1° e último dia de indução do

abrasamento, indicando claramente que o tratamento com NIC não afeta a expressão de

p-NR1 no estriado e, consequentemente, não medeia o desenvolvimento do fenômeno

estudado.

Por outro lado, evidenciou-se um aumento da imunoexpressão de p-NR1

em corpo estriado de fêmeas induzidas ao abrasamento por NIC no dia em que este

fenômeno se desenvolveu. Estudos anteriores relatam uma possível interação entre a

85

atividade da enzima AChE e a função glutamatérgica, pois a superexpressão da AChE

altera o sistema glutamatérgico, e resulta em danos de estruturas sinápticas e da função

excitatória (DONG et al., 2004), como também o uso de inibidores da AChE, pode levar

a internalização de receptores NMDA através da estimulação de nAChR que

apresentam a subunidade α7. O aumento da subunidade NR1 fosforilada potencializa o

influxo de Ca2+, induzido pelo glutamato e desencadeando excitotoxicidade (SHEN et

al., 2010), visto que locais de fosforilação de serinas que têm sido identificados na

subunidade NR1 destes receptores são substratos para diversas proteínas quinases que

regulam o tráfego intracelular ou propriedades dos canais de receptores NMDA,

resultando em mudanças na sinalização subjacente à muitas formas de plasticidade

sináptica (LEE, 2006).

Evidências indicam que a função dos receptores NMDA-NR1 é regulada

por uma variedade de proteínas quinases, por exemplo, a ativação de PKC potencializa

correntes mediadas por receptor NMDA e o efeito sobre a regulação deste é o aumento

na taxa de canais abertos e regulação positiva da expressão do receptor na superfície

(CHEN; HUANG, 1992; LAN et al., 2001). Tal como acontece com PKC, PKA

também regula a função do receptor NMDA aumentando a amplitude de correntes pós-

sinápticas excitatórias mediadas pelo mesmo (RAMAN et al., 1996), pois estudos

recentes tem mostrado que inibidores de PKA reduzem a relativamente o influxo de

cálcio através de receptores NMDA, sugerindo que PKA regula a permeabilidade de

cálcio nestes receptores (SKEBERDIS et al., 2006). Neste trabalho, a fosforilação do

receptor NR1 ocorre na serina 897, no qual é fosforilado por PKA, resultando no

aumento da expressão de receptor NMDA, e sugerindo ser um importante regulador no

tráfego intracelular de subunidade NR1 através da via biossintética (SCOTT;

BLANPIED; EHLERS, 2003).

Outro achado também importante do presente estudo foi o aumento da

imunoexpressão de p-CREB, acompanhado pelo aumento do conteúdo de BDNF na

mesma área cerebral do grupo supracitado, enquanto os machos apresentaram redução

dos níveis deste fator neurotrófico no abrasamento.

Fatores de transcrição e fatores neurotróficos estão fortemente implicados

nos comportamentos relacionados às drogas de abuso (MCCLUNG; NESTLER, 2008).

Alterações na atividade do fator de transcrição CREB tem mostrado estar envolvida em

sensibilização psicomotora, memória, desordens afetivas, além de regular a expressão

de genes envolvidos em neuroplasticidade, sobrevivência celular e cognição,

86

desempenhando um papel crítico nas respostas adaptativas neuronais (PANDEY, 2003;

MCDAID et al., 2006; LIPSKY; MARINI, 2007).

Existe uma dualidade de relatos mostrando que a exposição crônica à NIC

não altera os níveis de p-CREB em áreas relacionadas à adição de drogas

(KIVINUMMI et al., 2011; VIEYRA-REYES; PICCIOTTO; MINEUR, 2008), e de

outros fatores, ΔFosB (MARTILLA; RAATTAMAA; AHTEE, 2006), como também

pode causar elevação da expressão de p-CREB (HU et al., 2002; MCCARTHY et al.,

2011). Entretanto nossos resultados sugerem que o desenvolvimento precoce ao

abrasamento apresentado pelas fêmeas está relacionado ao aumento da expressão de p-

CREB via sinalização NMDA (DAS et al., 1997). A ativação de receptores NMDA

medeia um rápido influxo de Ca2+ e contribuem para uma subsequente cascata de

sinalização intracelular que resulta na fosforilação do CREB (CHOE et al., 2004). Lee

et al. (2008) relataram que injeções repetidas de cocaína (20mg/kg – 9 dias) aumentam a

fosforilação da subunidade NR1-NMDA e p-CREB em estriado dorsal, bem como o uso

de antagonista NMDA, MK-801, reduz a expressão dos mesmos.

A NIC parece ter efeitos importantes e persistentes em fatores neurotróficos,

tais como fator de crescimento do nervo (NGF), fator de crescimento de fibroblasto-2

(FGF-2), neurotrofina-3 e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) (KENNY;

FILE; RATTRAY, 2000). O BDNF é um dos genes-alvo do CREB, e desempenha um

papel importante na sobrevivência, diferenciação, manutenção do desenvolvimento e

maturação de neurônios e na formação do circuito sináptico (CHAO, 2003). Liga-se ao

receptor tropomiosina cinase B – TrkB – e mostra ser importante também na morfologia

de neurônios dopaminérgicos e outros circuitos (OHIRA; HAYASHI, 2009).

Tradicionalmente, três vias de sinalização neuronal são ativadas por BDNF-TrkB, a

cascata Ras-extracelular cinase (ERK), o fosfatidilinositol 3-cinase (PI3K/Akt) e a via

fosfolipase C-gama (PLCγ), sendo esta responsável por iniciar o influxo de cálcio

através da modulação da atividade de canais iônicos via ativação de fosfoquinase C

(PKC) mediado por diacilglicerol (DAG) (YOSHI; CONSTANTINE-PATON, 2010),

contudo, os mecanismos pelos quais a NIC altera a expressão de fatores neurotróficos

ainda não estão esclarecidos e podem envolver diferentes vias de sinalização em

distintas áreas cerebrais (SON; WINZER-SEHAN, 2009).

A expressão de BDNF pode ser aumentada por psicoestimulantes em

neurônios dopaminérgicos da área tegmentar ventral e este aumento persiste durante a

abstinência e retirada destas substâncias (PU et al., 2006; GRAHAM et al., 2007).

87

Exposição repetida à NIC em baixas doses também potencializa o conteúdo de BDNF

no núcleo accumbens (CORRELL et al., 2009), e que mantém-se por 24 horas, como

também, 29 dias após a interrupção do tratamento (KIVINUMMI et al., 2011). Outro

modelo de abrasamento, induzido por pentilenotetrazol, traz a superexpressão de BDNF

dependente da ativação de receptores NMDA-NR2B, como evento associado ao

desenvolvimento deste fenômeno (ZHU et al., 2015). Interessantemente, nossos dados

mostram diferenças sexuais no conteúdo de BDNF do corpo estriado de ratos do grupo

controle, ou seja, os machos apresentam níveis fisiológicos elevados em relação às

fêmeas ao longo do desenvolvimento do abrasamento. Esse resultado corrobora com os

achados de Damborsky e Winzer-Serhan (2012), que também identificou diferenças

similares em hipocampo no 8° dia pós-natal.

A transmissão sináptica e fosforilação do receptor NMDA são reguladas

pelo BDNF-TrkB (MANDARA; LEVINE, 2008), bem como tem sido mostrado o

aumento da expressão da subunidade NR1 em cultura de neurônios hipocampais em

resposta ao tratamento com BDNF, sugerindo que o mecanismo que relaciona os níveis

deste fator neurotrófico à viabilidade de receptores NMDA na superfície celular, dá-se

pela via MAPK (CALDEIRA et al., 2007; KIM et al., 2011).

Sabe-se que o BDNF tem um papel crucial na epileptogênese, e que as vias

de sinalização hiperativadas por este podem incrementar a excitabilidade neuronal

através de alterações em várias propriedades de membrana (MHYRE; APPLEGATE,

2003).

88

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O presente estudo demonstrou que no modelo de indução do abrasamento

por NIC as fêmeas apresentam uma maior susceptibilidade aos efeitos farmacológicos

desta substância, resultante de:

• Desenvolver precocemente as alterações comportamentais inerentes ao

abrasamento;

• Apresentar elevada taxa de mortes decorrentes do abrasamento em relação aos

animais machos, evidenciando uma maior vulnerabilidade;

• Apresentar níveis elevados do neurotransmissor NE em hipocampo ao longo do

desenvolvimento do fenômeno;

• Apresentar um aumento na atividade da enzima Acetilcolinesterase em corpo

estriado no fenômeno;

• No abrasamento foi identificado um aumento na imunoexpressão da subunidade

NR1 fosforilada de receptor glutamatérgico do tipo NMDA em corpo estriado;

• Apresentar um aumento na imunoexpressão do fator de transcrição CREB

fosforilado em corpo estriado no fenômeno;

• Ter sido evidenciado elevado níveis do fator neurotrófico BDNF em corpo

estriado ao comparar-se com os animais machos no abrasamento.

89

7 CONCLUSÃO

Os nossos resultados mostram que as fêmeas são mais susceptíveis ao

modelo de abrasamento induzido por nicotina, fato este observado através do

desenvolvimento precoce das convulsões. Sugere-se que esta susceptibilidade esteja

relacionada à hiperexcitabilidade neuronal, decorrente da hiperatividade enzimática de

AChE associdada a ativação aumentada de subunidades NMDA-NR1, desencadeando

um possível influxo excessivo de Ca2+, que consequentemente, medeia sinalização de

fosfolipases e capaz de ativar p-CREB iniciando a expressão de BDNF, intensificando

assim, a neurotoxicidade. Todas estas alterações encontradas favorecem ao aumento da

excitabilidade neuronal, e consequentemente, dano celular durante a progressão

temporal do fenômeno (Figura 28).

Figura 28: Desenho do mecanismo sugerido à susceptibilidade das fêmeas ao

desenvolvimento do abrasamento por NIC.


Em relação aos machos, novos estudos acerca de mecanismos relacionados

ao desenvolvimento do abrasamento deverão ser realizados, a fim de compreender o

porquê de serem comportamentalmente mais resistentes, visto que poucas alterações

foram encontradas.

Contudo, tornam-se pertinentes estratégias terapêuticas que visem a

reversão destas características, uma vez que os mecanismos de abrasamento estão

relacionados com alguns distúrbios psiquiátricos.

90

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