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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE CIRURGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM CIÊNCIAS MÉDICO-
CIRÚRGICAS
EDERSON LAURINDO HOLANDA DE SOUSA
ESTUDO DOS MARCADORES DE VIRULÊNCIA tnpA, tnpB, cagM do
HELICOBACTER PYLORI E SUA ASSOCIAÇÃO COM AFECÇÕES GÁSTRICAS
EM FORTALEZA, BRASIL
FORTALEZA - CEARÁ
2016
EDERSON LAURINDO HOLANDA DE SOUSA
ESTUDO DOS MARCADORES DE VIRULÊNCIA tnpA, tnpB, cagM do
HELICOBACTER PYLORI E SUA ASSOCIAÇÃO COM AFECÇÕES GÁSTRICAS
EM FORTALEZA, BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Cirurgia da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Ciências
Médico-Cirúrgicas.
Orientador: Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa
Campelo Braga
FORTALEZA
2016
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde
S696e Sousa, Ederson Laurindo Holanda de.
Estudo dos marcadores de virulência tnpA, tnpB, cagM do helicobacter pylori e sua associação
com afecções gástricas em Fortaleza, Brasil / Ederson Laurindo Holanda de Sousa. – 2016.
72 f. : il. color.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,
Departamento de Cirurgia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médico-Cirúrgicas, Mestrado
em Ciências Médico-Cirúrgicas, Fortaleza, 2016.
Orientação: Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga.
1. Helicobacter pylori. 2. Genes. 3. Úlcera Péptica. I. Título.
CDD 616.3075
EDERSON LAURINDO HOLANDA DE SOUSA
ESTUDO DOS MARCADORES DE VIRULÊNCIA tnpA, tnpB, cagM do
HELICOBACTER PYLORI E SUA ASSOCIAÇÃO COM AFECÇÕES GÁSTRICAS
EM FORTALEZA, BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Cirurgia da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Ciências
Médico-Cirúrgicas.
Aprovada em: ___/___/______.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________
Prof. Dr. Orleancio Gomes Ripardo De Azevedo
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________
Profa. Dra. Maria Aparecida Alves de Oliveira
Universidade Federal do Maranhão (UFMA)
A Deus, por não me deixar fraquejar nos
momentos mais difíceis.
Aos meus pais, irmãs, familiares e amigos pelo
incentivo e confiança.
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. LÚCIA LIBANEZ BESSA CAMPELO BRAGA, Professora titular
do Departamento de Medicina Clínica da Universidade Federal do Ceará, pela oportunidade
concedida, por sua orientação constante, pelo incentivo e competência com que exerce a vida
acadêmica.
Ao Prof. Dr. LUSMAR VERAS RODRIGUES, professor titular do Departamento
de Cirurgia e Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Médico-Cirúrgicas da
Universidade Federal do Ceará (UFC), por sua dedicação à Pós-Graduação.
Aos professores participantes da banca examinadora Prof. Dr. ORLEANCIO
GOMES RIPARDO DE AZEVEDO e Profa. Dra. MARIA APARECIDA ALVES DE
OLIVEIRA pelo tempo, pelas valiosas colaborações e sugestões.
Ao prof. Dr. CÍCERO IGOR SIMÕES MOURA SILVA, pelo companheirismo no
laboratório e dedicação na conclusão deste estudo, além da amizade que construímos ao longo
desta caminhada.
As Sras. KRÍSSIA MARIA ALBUQUERQUE PARENTE e MICHELLE
SOEIRO DE OLIVEIRA, mestrandas em cirurgia, pelo companheirismo, parceria no
laboratório e pela incansável ajuda para a realização deste trabalho.
A Srta. BRUNA DEISE GURGEL MAIA, técnica de laboratório, pela parceria na
rotina laboratorial e, sobretudo, pela amizade que ultrapassa os limites do laboratório.
A todos que compõem a equipe do Laboratório de Gastroenterologia pelo
companheirismo e parceria no laboratório.
As Sras. MARIA LUCIENE VIEIRA DE OLIVEIRA e MAGDA MARIA
GOMES FONTENELE, secretárias do Programa de Pós-Graduação em Ciências Médico-
Cirúrgicas da UFC, pela presteza e auxílio no desempenho das atividades letivas deste
programa.
Ao prof. Dr. Said Goncalves da Cruz Fonseca, professor do curso de farmácia da
UFC e meu chefe imediato. A quem devo muitos agradecimentos pelos incentivos de fazer o
curso de mestrado e pela presença de espírito fabulosa que atinge a todos que trabalham com
ele.
A minha família pelo apoio de sempre e aos amigos queridos, família que
escolhemos, por sempre estarem dispostos a me ouvir e oferecer um ombro amigo. A todos e a
todas que, de diversas formas, participaram, contribuíram e viabilizaram a realização deste
trabalho.
Ah! Eu me ofereço esse momento
Que não tem paga e nem tem preço
Essa magia eu reconheço
Aqui está a minha sorte
Me descobrir tão fraco e forte
Me descobrir tão sal e doce
E o que era amargo acabou-se
É bom dizer viver, valeu.
Gonzaguinha
RESUMO
Estudo dos marcadores de virulência tnpA, tnpB, cagM do Helicobacter pylori e sua
associação com afecções gástricas em Fortaleza, Brasil. EDERSON LAURINDO
HOLANDA DE SOUSA. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu
em Ciências Médico-Cirúrgicas. Universidade Federal do Ceará. Orientadora: Profa. Dra.
Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga.
O Helicobacter pylori é uma bactéria Gram-negativa que coloniza mais da metade da
população mundial; a infecção por esta bactéria está associada a diversas afecções gástricas,
entre elas: gastrites, úlceras pépticas e câncer gástrico. O grau de lesões e patogenicidade é
muito dependente da diversidade gênica da bactéria. O objetivo do presente estudo foi avaliar
os fatores de virulência tnpA, tnpB e cagM do H. pylori em pacientes com gastrite, úlcera
péptica e câncer gástrico. A genotipagem das cepas de H. pylori oriundas de biópsias gástricas
foi realizada pela técnica de reação em cadeia de polimerase. Foram analisados 147 pacientes,
os quais 50 eram portadores de gastrite, 51 de úlceras péptica e 46 de câncer gástrico; os quais
72 eram do gênero masculino e 75 do feminino com média de idade e desvio padrão de 54,18
± 14,24 anos. A população estudada foi dividida em duas faixas etárias, abaixo e acima de 45
anos; a qual 72,8% estavam acima de 45 anos de idade. A frequência dos genótipos estudados
foi: 70 (47,6%) cepas tnpA; 03 (2,0%) tnpB; 19 (12,9%) cagM. O gene tnpA foi o mais
presente no gênero masculino nas duas faixas etárias estudadas; no entanto, sem associação
estatística do gene com tais variáveis. O gene tnpA apresentou uma associação negativa com o
câncer gástrico; enquanto apresentou associação significativa com a úlcera duodenal (p =
0,002). O gene tnpB foi o de menor prevalência e não obteve nenhuma associação significante.
O gene cagM foi o segundo mais prevalente e apresentou associação significativa com úlcera
duodenal (p = 0,024). Concluiu-se que os genes tnpA, cagM estão correlacionados com o
risco maior de desenvolver úlceras pépticas; sugerindo que tais genes são bons candidatos a
serem marcadores genéticos do H. pylori para a úlcera péptica nestes pacientes de Fortaleza.
Palavras-chave: H. pylori, tnpA, tnpB, cagM, afecções gástricas.
ABSTRACT
Study of the virulence markers tnpA, tnpB, cagM of Helicobacter pylori and its
association with stomach disorders in Fortaleza, Brazil. EDERSON LAURINDO
HOLANDA DE SOUSA. Dissertation (Master Degree). Post-Graduate Program (Stricto
Sensu) in Medical and Surgical Sciences. Federal University of Ceará. Advisor: Profa. Dra.
Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga.
Helicobacter pylori is a Gram-negative strain that colonizes more than half the world's
population; Infection by this strain is associated with various gastric diseases, including:
gastritis, peptic ulcers and gastric cancer. The degree of injury and pathogenicity is very
dependent on the genetic diversity of the strian. The aim of this study was to evaluate the
virulence factors tnpA, tnpB and cagM of H. pylori in patients with gastritis, peptic ulcer and
gastric cancer. Genotyping of H. pylori strains arising from gastric biopsies was performed by
the polymerase chain reaction technique. Were analyzed 147 patients, of which 50 had
gastritis, 51 peptic ulcers and 46 gastric cancer; which 72 were male and 75 female, mean age
and standard deviation of 54.18 ± 14.24 years. The study population was divided into two age
groups below and above 45 years; which 72.8% were above 45 years of age. The frequency of
genotypes was: 70 (47.6%) tnpA strains; 03 (2.0%) tnpB; 19 (12.9%) cagM. The tnpA gene
was more prevalent in males in both age groups; however, no statistical association of the
gene with such variables. The tnpA gene showed a negative association with gastric cancer;
while significantly associated with duodenal ulcer (p = 0.002). The tnpB gene had the lowest
prevalence and got no significant association. The cagM gene was the most prevalent second
and showed a significant association with duodenal ulcer (p = 0.024). It was concluded that
the tnpA genes, cagM are correlated with increased risk of developing peptic ulcers;
suggesting that these genes are good candidates for genetic markers of H. pylori in peptic
ulcer disease in these patients Fortaleza.
Keywords: H. pylori, tnpA, tnpB, cagM, gastric disorders.
LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS
Figura 1 Estrutura da ilha de patogenicidade cag do H. pylori. Localização do cag I,
cag II e IS605....................................................................................................... 35
Figura 2 Gel de agarose para visualização das bandas do gene tnpA (344pb) nas
amostras de câncer gástrico................................................................................. 50
Figura 3 Gel de agarose para visualização das bandas do gene tnpB (569pb) nas
amostras de câncer gástrico................................................................................. 50
Figura 4 Gel de agarose para visualização das bandas do gene cagM (586pb) nas
amostras de úlcera gástrica.................................................................................. 51
Gráfico 1 Distribuição dos pacientes em função do gênero................................................ 44
Gráfico 2 Distribuição dos pacientes em função da faixa etária.......................................... 45
Gráfico 3 Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com o gênero...................... 46
Gráfico 4 Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com a faixa etária................ 47
Gráfico 5 Distribuição dos genótipos do H. pylori nas afecções estudadas........................ 48
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Prevalência de cepas cagA nas diferentes regiões do Brasil............................ 29
Tabela 2 Primers usados na amplificação dos genótipos estudados............................... 42
Tabela 3 Ciclos de amplificação para cada gene............................................................. 43
Tabela 4 Caracterização dos pacientes, por grupos, quanto ao gênero e a idade............. 45
Tabela 5 Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com o gênero.................... 46
Tabela 6 Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com a faixa etária............. 47
Tabela 7 Prevalência dos genótipos cag-PAI do H. pylori de acordo com as afecções
gástricas............................................................................................................. 49
Tabela 8 Análise Univarida e Multivariada dos genótipos tnpA e cagM com as
afecções gástricas.............................................................................................. 49
Tabela 9 Associação de tnpA com os demais genótipos estudados................................. 52
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ureA – gene codificador da urease
cagA – gene associado à citotoxina A do Helicobacter pylori
CagA – citotoxina A do Helicobacter pylori
vacA – gene da citotoxina vacuolizante
cagE – gene associado à citotoxina E do Helicobacter pylori
CagE – citotoxina E do Helicobacter pylori
oipA – gene de proteínas inflamatórias do Helicobacter pylori
hom – gene da membrana externa do Helicobacter pylori
cag-PAI – ilha de patogenicidade cag
C13
- Carbono 13
C14
- Carbono 14
H. pylori - Helicobacter pylori
IL-1 – Interleucina-1
IL-2 – Interleucina-2
IL-6 – Interleucina-6
IL-8 – Interleucina-8
IL-1β – Interleucina-1 β
TNFα – fator de necrose tumoral α
HUWC – Hospital Universitário Walter Cantídio
T4SS – sistema de secreção do tipo IV
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
HpSA – pesquisa de antígenos do H. pylori nas fezes
DUP – doença ulcerosa péptica
UFC – Universidade Federal do Ceará
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 14
1.1 Histórico sobre o Helicobacter pylori ............................................................... 14
1.2 Epidemiologia do Helicobacter pylori .............................................................. 15
1.3 Microbiologia do Helicobacter pylori................................................................ 17
1.4 Diagnóstico do Helicobacter pylori ................................................................... 18
1.4.1 Métodos invasivos............................................................................................... 18
1.4.2 Métodos não invasivos......................................................................................... 20
1.5 Patogênes do Helicobacter pylori...................................................................... 21
1.6 Afecções Gástricas.............................................................................................. 23
1.6.1 Gastrite................................................................................................................. 23
1.6.2 Úlcera Péptica...................................................................................................... 24
1.6.3 Câncer Gástrico.................................................................................................... 25
1.7 Tratamento do Helicobacter pylori.................................................................. 27
1.8 Diversidades do padrão de algumas cepas do H. pylori no Brasil e suas
correlações clínicas............................................................................................. 27
1.9 Marcadores genéticos do Helicobacter pylori .................................................. 31
1.9.1 Ilha de Patogenicidade cag (cagPAI)................................................................... 32
1.9.2 Sequência de Inserção IS605, tnpA e tnpB.......................................................... 34
1.9.3 Gene cagM........................................................................................................... 36
1.10 Justificativa ........................................................................................................ 37
2 OBJETIVOS ...................................................................................................... 38
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................... 38
2.2 Objetivos Específicos ........................................................................................ 38
3 MÉTODO ........................................................................................................... 39
3.1 Casuística ........................................................................................................... 39
3.2 Tipo do Estudo ................................................................................................... 39
3.3 Seleção dos Participantes ................................................................................. 39
3.4 Coleta de Fragmentos de Mucosa Gástrica na Endoscopia........................... 40
3.5 Coleta de Fragmentos de Mucosa Gástrica na Gastrectomia........................ 41
3.6 Extração do DNA de Helicobacter pylori em Tecido de Biópsia Gástrica.... 41
3.7 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)......................................................... 42
3.8 Análise estatística .............................................................................................. 43
4 RESULTADOS .................................................................................................. 44
4.1 Caracterização da amostra estudada .............................................................. 44
4.2 Distribuição da expressão dos marcadores moleculares cag-PAI do H.
pylori.................................................................................................................... 46
4.2.1 Distribuição dos marcadores por gênero............................................................ 46
4.2.2 Distribuição dos marcadores por faixa etária.................................................... 47
4.2.3 Distribuição dos marcadores por afecções gástricas......................................... 48
4.3 Associação de tnpA com os demais genótipos estudados................................ 52
5 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 53
6 CONCLUSÃO ................................................................................................... 56
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 57
APÊNDICES ..................................................................................................... 69
ANEXOS ............................................................................................................ 71
14
1 INTRODUÇÃO
1.1 Histórico sobre o Helicobacter pylori
O Helicobacter pylori (H. pylori) é um bacilo gram-negativo que coloniza o
estômago humano, causando diversas doenças, como: gastrites, úlceras pépticas e câncer
gástrico. A infecção pelo H. pylori é a segunda principal causa de morte por câncer gástrico
em todo o mundo; contribuindo para outras enfermidades, incluindo: deficiências de ferro e
de vitamina B12, Púrpura Trombocitopênica Idiopática (PTI), e retardo de crescimento em
crianças. A colonização ocorre na infância e persiste durante toda a vida, manifestando as
doenças nos adultos (STASI et al., 2009; ATHERTON; BLASER, 2009; FRANCESCHI et al.,
2014 DARVISHI et al., 2015).
As bactérias do gênero Helicobacter habitam a milhares de anos no trato
gastrointestinal de muitas espécies de mamíferos e aves (FALUSH et al., 2001). Através de
análise de nucleotídeos de várias espécies da bactéria, pode-se estimar que o H. pylori tem co-
evoluido com os seres humanos, pelo menos desde o seu êxodo da África a cerca de 60.000
anos (ATHERTON; BLASER, 2009).
Um dos primeiros relatos de colonização gástrica foi feita por pesquisadores
europeus em 1906, que relataram a presença de espiroquetas. Porém, tais relatos foram
esquecidos pela sociedade científica devido à falta de dados mais conclusivos, como o
isolamento do microrganismo (KRIENTIZ, 1906; STEER, 1975). Já em 1938, analisando
biópsias gástricas, um estudo relatou a presença de bactéria espiralada em 43% das biópsias
analisadas; sem estudar a relação da infecção com as afecções gástricas (DOENGES, 1938).
Em 1983, os pesquisadores australianos Robin Warren e Barry Marshall
publicaram na revista Lancet sobre a resposta imune humana contra o H. pylori; descrevendo
as características microbiológicas da bactéria, inclusive a similaridade com as espécies do
Campylobacter (GUSTAFSON; WELLING 2010). No mesmo ano de 1983, Marshall
encontrou numerosas colônias de microrganismo semelhantes ao Campylobacter em culturas
de biópsia gástrica incubadas por 5 dias, tempo maior do que as tentativas anteriores de
cultivo (3 dias) (MARSHALL; WARREN, 1983; KONTUREK, 2003; LOPES et al., 2014).
O primeiro nome dado à bactéria recém-descoberta foi de Campylobacter
pyloridis, sendo corrigida posteriormente para Campylobacter pylori. Em 1989, o nome foi
atualizado para Helicobacter pylori após vários estudos taxonômicos e por suas características
bioquímicas e genéticas diferirem do gênero Campylobacter (MARSHALL; GOODWIN,
15
1987; GOODWIN, 1989; KONTUREK, 2003; LOPES et al., 2014).
Em 1985, Marshall ingeriu uma suspensão do H. pylori na tentativa de cumprir o
postulado de Koch, postulado que versa sobre à auto experimentação; promovendo os
sintomas gástricos da infecção e depois tratando com antibióticos e sais de bismuto
(MARSHALL; WARREN, 1984; LOPES et al., 2014).
Desde então, o H. pylori está intimamente ligado a um espectro diversificado de
doenças gastrointestinais (MARSHALL; WARREN, 1984); e devido à magnitude desta
descoberta para a gastroenterologia, é que tais pesquisadores foram agraciados com a
premiação Nobel de Medicina em 2005 (LOPES et al., 2014).
1.2 Epidemiologia do Helicobacter pylori
A infecção por H. pylori está disseminada mundialmente, atingindo pouco mais de
50% da população (FOCK; ANG, 2010), sendo considerado um problema de saúde pública,
principalmente em países em desenvolvimento, onde a prevalência é alta devido às baixas
condições higiênicas e sanitárias (PARSONNET et al., 1997).
A prevalência do H. pylori varia de acordo com as regiões geográficas, etnia,
gênero, idade, condição sócio-econômica, nível de escolaridade, profissão e o ambiente de
vida dos indivíduos (BLASER; BERG 2001). Em países em desenvolvimento, entre adultos
de meia idade, a prevalência é em média de 80 a 90%, enquanto que em países desenvolvidos
é menor que 40% (WANG et al., 2003; PEREZ-TRALLERO; ROTHENBACHER;
BRENNER, 2004). Em contraste com a prevalência média mundial da infecção que está em
torno de 58% (CARTER et al., 2011).
Essa prevalência é muito variável entre os países e entre grupos populacionais
dentro do mesmo país, pois pode ser influenciada pelo grau de exposição ao agente etiológico,
pelo hábito alimentar e fatores ambientais aos quais os indivíduos estão expostos (BARBOSA;
SCHINONNI, 2011).
Na Europa, a prevalência de H. pylori tende a ser inferior nos países do Norte em
relação aos do Sul e Leste. Um estudo randomizado na Holanda avaliou a presença de
anticorpos contra o H. pylori e a proteína CagA em 1550 doadores de sangue holandeses
(excluindo os imigrantes); no qual obteve uma prevalência 32% de infecção, com 28% das
cepas cagA positivas (EUSEBI; ZAGARI; BAZZOLI, 2014). Contrariando a estatística dos
países do norte europeu, Portugal apresentou uma prevalência de 84,2%, com 61,7% das
cepas cagA positivas; sendo um dos países europeus com uma maior prevalência da infecção
16
pelo H. pylori (BASTOS et al., 2013).
Na América do Norte, a prevalência de H. pylori é semelhante ao norte da Europa.
Onde um estudo canadense com 203 pacientes indígenas com dispepsia, revelou taxas de
infecção em 37,9% dos pacientes (SETHI et al., 2013). Já nos EUA, um estudo envolvendo
4145 adultos, evidenciou uma soroprevalência de H. pylori de 30.7% (GRAD; LIPSITCH;
AIELLO, 2012).
Na América Latina, um estudo mexicano relatou uma soroprevalência de 52,2%
em mulheres grávidas que vivem em zonas rurais. Enquanto outro estudo relata taxas de 80%
em zonas rurais no Chile (MENTIS; LEHOURS; MEGRAUD, 2015).
Uma das maiores taxas de infecção pelo H. pylori são encontradas nos países
asiáticos, podendo variar de 54% a 76% (LIM et al., 2013; DORJI et al., 2014). Apenas em
um estudo realizado em indivíduos saudáveis na Arábia Saudita mostrou uma baixa
prevalência de infecção de cerca de 28% (HANAFIA; MOHAMED, 2013).
Na China, um estudo utilizou a técnica do teste respiratório com ureia marcada
com C13
para identificação de pacientes infectados pela bactéria. O qual encontrou
prevalência de 63,4% de pacientes infectados entre 5.417 pacientes assintomáticos de 30 a 69
anos. Prevalências semelhantes são encontrados na Índia, Cazaquistão e Butão. A prevalência
a Índia varia de 58% a 62% em dispépticos. Já no Cazaquistão, a taxa de infecção é de 76,5%
entre sintomático e assintomáticos. Da mesma forma, em Butão, a porcentagem de infecção é
de 73,4% (EUSEBI; ZAGARI; BAZZOLI, 2014).
No Brasil, estudos realizados em São Paulo e Minas Gerais, encontraram
prevalência de H. pylori de 40,7% e 69,7%, respectivamente (ARAF et al., 2010; ROCHA et
al., 2003). Outro estudo na zona rural do Amazona reportou prevalência de 82% na população
geral; destes 53% são crianças e adolescentes e 47% são adultos e idosos (REIS JÚNIOR et
al., 2012). Em 2013, um estudo em Fortaleza encontrou um percentual de 44,3% de pacientes
infectados pelo H. pylori diagnosticados pelo teste rápido de urease; sendo este valor abaixo
da média da região, seja pelo número pequeno de participantes (n = 140) ou pela diminuição
das taxas de infecção (ROCHA, 2013).
Outros estudos sugerem que a prevalência de Helicobacter pylori no contexto
mundial tem uma tendência de queda tanto nos países desenvolvidos como nos
subdesenvolvidos (MIENDJE DEYI et al., 2011).
17
1.3 Microbiologia do Helicobacter pylori
O H. pylori é uma bactéria Gram negativa, de forma espiralada, microaerófila, não
esporulada, medindo cerca de 2,5 µm de comprimento e 0,5 a 1,0 µm de diâmetro. Possui de
quatro a seis flagelos, o que confere motilidade à bactéria, permitindo que ela chegue à
superfície gástrica, onde passa a aderir às células do estômago (MARSHALL; WARREN,
1984; LEVINSON; JAWETZ, 1994; JOSENHANS; SUERBAUM, 2001). Esse
microrganismo coloniza a mucosa gástrica e produz algumas enzimas fundamentais para sua
adaptação a esse ambiente inóspito, entre elas: urease, catalase, oxidase, protease e fosfolipase.
As adaptações provenientes do H. pylori para colonizar o estômago humano vão
desde a evasão da resposta imune do hospedeiro até o desenvolvimento de mecanismos
próprios. A morfologia em espiral e a presença de flagelos conferem mobilidade e permitem
que a bactéria penetre na camada de muco que reveste o epitélio gástrico, protegendo-se assim
da acidez e peristaltismo estomacal. Numerosas adesinas permitem a adesão seletiva ao
epitélio gástrico, impedindo a eliminação da bactéria pelos movimentos peristálticos, além de
promover elevadas concentrações de toxinas em determinadas áreas da mucosa gástrica. A
produção de uréase altera o pH, favorecendo a sobrevivência da bactéria no estômago
(HAZEL et al., 1986; BRUCE, 1993; YAMAOKA et al., 2002; SACHS et at., 2003;
ARGENT et al., 2004).
A urease cliva a ureia, produzindo amônia e CO2. A amônia, por sua vez, atua
como receptor de íons hidrogênio presentes no meio ácido estomacal, gerando pH neutro no
ambiente pericelular bacteriano, proporcionando assim sua sobrevivência em um meio ácido
(MOBLEY, 2001).
O H. pylori possui crescimento lento e facilmente transformam-se em formas
cocoides em meios líquidos; sendo de fácil contaminação por microrganismos de crescimento
rápido, por isso meios líquidos não são utilizados para culturas de rotina
(DZIERZANOWSKA-FANGRAT; DZIERZANOWSKA, 2006).
O Helicobacter pylori é um microrganismo de difícil cultivo, sendo sua cultura
realizada em meios de ágar sólido (Brain Heart Infusion (BHI) agar, Brucella agar, Columbia
agar) a 37ºC. Tal bactéria é fastidiosa e requer que o meio seja suplementado com sangue e
suplementos (7-10% de sangue de ovelha ou cavalo; vitamina B12; aminoácidos - L-
glutamina e L-cisteína; antibióticos seletivos Dents ou Skirrows). As placas são incubadas em
ambiente de microaerofilia (2-5% de O2; 5-10% de CO2 e 0-10% de H2) a 37°C durante até
7 dias (HOLTON et al., 1999; DZIERZANOWSKA-FANGRAT; DZIERZANOWSKA, 2006).
18
As colônias do H. pylori atingem um pequeno tamanho (0,5-2,0 mm), são
translúcidas, amareladas ou colônias cinza pálido. É identificado pelos testes de urease,
catalase e oxidase positivos. No entanto, estas enzimas também são produzidas por outras
espécies de Helicobacter, e a urease pode ser sintetizada por algumas cepas de
Campylobacter lari (DZIERZANOWSKA-FANGRAT; DZIERZANOWSKA, 2006).
Uma amostra contendo a bactéria deve ser inoculada em meios de cultura dentro
de 4 horas após a coleta para melhores resultados de análise. Caso o atraso seja inevitável, a
amostra deve ser transportada para o laboratório em meio de transporte apropriado (meio de
transporte Stuart) a 4ºC por um prazo de até 24 horas (DZIERZANOWSKA-FANGRAT;
DZIERZANOWSKA, 2006).
As colônias formadas após 3 a 5 dias de crescimento são circulares, convexas,
translúcidas e não apresentam hemólise. A identificação após o cultivo deve ser feita
observando-se a morfologia da colônia, coloração de Gram e provas bioquímicas positivas
para urease, oxidase e catalase (NDIP et al., 2003). Tendo em vista que H. felis ou de H.
heilmanii também podem estar presentes em amostras gástricas, normalmente são facilmente
distinguidas das H. pylori devido a longa forma saca-rolhas (DZIERZANOWSKA-
FANGRAT; DZIERZANOWSKA, 2006).
1.4 Diagnóstico do Helicobacter pylori
Os métodos de diagnóstico da infecção por H. pylori, estão divididos em testes
invasivos ou não invasivos. Os invasivos dependem da realização de endoscopia digestiva alta
(EDA) para coleta de biópsias; os quais incluem o teste rápido da urease, cultura
microbiológica em placa e o exame histopatológico. Os não invasivos dispensam o exame
endoscópico e incluem: os testes sorológicos; pesquisa de antígenos do H. pylori nas fezes
(HpSA); o teste respiratório com uréia marcada com isótopos de carbono (C13
e C14
)
(CUTLER; PRASAD; SANTOGADE, 1998) e, o Enteroteste, proposto pela primeira vez em
1995, por Perez-Trallero et al. (1995), como uma alternativa à endoscopia para obtenção de
suco gástrico.
1.4.1 Métodos invasivos
O exame histopatológico é o método padrão ouro de diagnóstico de H. pylori, o
qual fornece informações quanto a presença da bactéria e características da mucosa (grau de
19
inflamação, presença de metaplasia, atrofia glandular, displasia e neoplasia). Apesar da
importância diagnóstica, é um método não realizado na rotina clínica por se tratar de um
procedimento caro, invasivo e desconfortável para o paciente. Caso não realizado de maneira
correta, pode subestimar a presença da bactéria com erros diagnósticos e falsos negativos
(VELAPATIÑO et al., 2006; MALFERTHEINER et al., 2012; GARZA-GONZÁLEZ et al.,
2014).
A sensibilidade e a especificidade dos exames histopatológicos para o diagnóstico
do H. pylori variam de 53% a 90%, dependendo da experiência do patologista e da densidade
de colonização. O aumento do número de biópsias com o emprego de coloração específicas
podem aumentar a sensibilidade do método (EL-ZIMAITY; GRAHAM, 1999).
Recomenda-se que sejam retiradas biópsias do antro e do corpo. A interpretação
das amostras segue a classificação de Sydney, que indica amostragem de cinco locais
diferentes: I. pequena curvatura do corpo (4 cm próximo à incisura angularis); II. pequena
curvatura do antro; III. grande curvatura do antro e IV. grande curvatura do corpo e V. incisura
angularis (GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014).
A coloração celular com hematoxilina e eosina (HE) é o bastante para detectar H.
pylori em biópsia. Já coloração mais utilizada é a Giemsa, que pode aumentar a sensibilidade
e especificidade da técnica (BRADEN, 2012).
Outro método é a cultura do microrganismo, a qual possui sensibilidade menor do
que as biópsias; com sensibilidade de 90% e especificidade de 100%, quando bem realizada.
O H. pylori é muito delicado e necessita ser cultivado logo após a colheita. (VELAPATIÑO et
al., 2006; GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014).
Já o teste rápido da urease (TRU), baseia-se na produção de uréase pelo H. pylori,
após a coleta do fragmento de biópsia gástrica. Uma amostra é adicionada em um meio
contendo ureia e um indicador de pH (vermelho fenol). A presença da bactéria é sinalizada
pela coloração do meio de amarelo para rosa; devido à produção da enzima uréase, que
hidrolisa a ureia em amônia e CO2, levando à alcalinização do meio e mudança da cor do
indicador de pH (GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014). Essa mudança deve ocorrer dentro das
primeiras 24 horas para o teste ser considerado positivo (ORNELLAS et al., 2000). É um
teste barato, rápido, amplamente disponível e altamente específico; o qual sendo positivo é
suficiente para iniciar um tratamento de erradicação (MALFERTHEINER et al., 2012).
20
1.4.2 Métodos não invasivos
Vários tipos de ensaios imunológicos foram utilizados para identificar anticorpos
IgG e IgA contra H. pylori. A técnica ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) é um
dos métodos mais utilizados; baseia-se na detecção de IgG Anti-Hp, com sensibilidade e
especificidade variando de 60% a 100% (GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014).
O teste respiratório com ureia marcada, é outro método que baseia-se na ingestão
de um líquido contendo ureia marcada com 13
C (não radioativo) ou 14
C (pouco radioativo).
Caso haja infeção pelo H. pylori, este irá metabolizar a ureia em amônia e 13
CO2 ou 14
CO2;
estes últimos difundem-se para o sangue e são exalados através dos pulmões, o qual podem
ser medidos no ar exalado. O CO2 coletado em um balão específico segue para análise por
espectrometria de massa (no caso do C13
) ou de cintilação líquida (para o C14
) (COELHO,
1998; GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014).
A sensibilidade e especificidade do teste respiratório excedem 90% na maioria dos
estudos. Um estudo com crianças brasileiras mostrou sensibilidade de 95,5% e especificidade
de 99,0% (CARDINALLI; ROCHA; ROCHA, 2003). Outro, com crianças de uma
comunidade urbana de Fortaleza, apresentou sensibilidade e especificidade de 100%
(GONÇALVES, 2010), podendo ser usado em estudos epidemiológicos e como teste de
preferência para o controle da erradicação da infecção, por ser não invasivo (DAHLERUP et
al., 2011).
Outro método não invasivo de grande valor para o diagnóstico da infecção por H.
pylori é a pesquisa de antígenos dessa bactéria nas fezes (HpSA). Baseia-se em um
imunoensaio enzimático para o diagnóstico da infecção ativa e de acompanhamento
terapêutico de erradicação. As amostras podem ser armazenadas durante 24 h em temperatura
ambiente ou até 72 h a 4ºC, mas sem refrigeração sofrem significativa redução em 2 a 3 dias
(GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014). Esse teste é tão acurado quanto o respiratório,
mostrando-se também eficaz no controle da erradicação da bactéria, tendo a vantagem de ser
mais barato, resultado em torno de uma hora, não requer equipamentos sofisticados e ainda
permite estocagem do material para futuras pesquisas (VAIRA; MALFERTHEINER;
MERGRAUD, 2000).
Outra técnica que pode ser utilizada para verificar a presença do H. pylori é a
Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), não sendo ainda utilizada na prática do diagnóstico
clínico, mas de grande importância na pesquisa científica, uma vez que permite conhecer a
virulência das cepas bacterianas circulantes (LEHOURS et al., 2003). O método de PCR
21
permite identificar bactérias em amostras pequenas e de pouca densidade bacteriana; requer
processamento e transporte especiais; as amostras podem ser coletadas por métodos invasivos
e não invasivos; possui menor tempo de análise em relação aos outros métodos. As matrizes
para o PCR podem ser desde as biopsias gástricas, suco gástrico, saliva e até fezes
(LEHOURS et al., 2003; GARZA-GONZÁLEZ et al., 2014).
O PCR baseia-se na amplificação de fragmento específico de DNA, a partir da
sequência de DNA molde. Essa técnica requer a utilização de “primers”, pequenos
fragmentos de DNA, complementares ao DNA de interesse. A partir deles, uma enzima DNA
polimerase (Taq-DNA polimerase) promoverá a síntese de DNA por adição de nucleotídeos
complementares em etapas de termociclador (desnaturação, anelamento e extensão)
(CLAYTON et al., 1992).
Alternativo à endoscopia, o Enteroteste é utilizado para obtenção de suco gástrico
e detecção do H. pylori. Neste método, os pesquisadores cultivam o suco gástrico e fazem
PCR, conseguindo sensibilidade de 75% para cultura de pacientes, sabidamente positivos
(PEREZ-TRALLERO et al., 1995). Nesse teste, o indivíduo ingere um cordão com uma
cápsula contendo um fio no seu interior. Após 1 hora, o fio é retirado e o suco gástrico aderido
ao cordão será utilizado para testes moleculares e cultura (PEREZ-TRALLERO et al., 1995).
Os resultados obtidos com esse método são variáveis, com sensibilidade de 75% a 100%, em
países como Austrália (SAMUELS et al., 2000) e México (TORRES et al., 2001),
respectivamente, e quando comparado com o exame histológico ou cultura da biópsia. Em
Taiwan e no Peru também foi relatada alta sensibilidade e especificidade do método (WANG
et al., 2003; VELAPATIÑO et al., 2006). Na Colômbia, esse método apresentou sensibilidade
de 74% e especificidade de 87% (ARBOLEDA et al., 2013).
1.5 Patogênese do Helicobacter pylori
O H. pylori é um patógeno associado com um aumento de até nove vezes do risco
de desenvolvimento do câncer gástrico. Decorrente disto, em 1994, a Organização Mundial de
Saúde classificou o H. pylori como carcinógeno tipo I para humanos (IARC, 1994; BLASER;
CRABTREE, 1996; KUIPERS, 1998; ATHERTON; BLASER, 2009).
Entre os mecanismos pelos quais o H. pylori produz diferentes quadros clínicos
no estômago e no duodeno dos pacientes, sabe-se que fatores: da bactéria, do hospedeiro e do
meio ambiente (entre eles: tipo de cepa, idade da aquisição da infecção, predisposição
genética do hospedeiro) contribuem para determinar as diversas evoluções clínicas
22
(SUERBAUM; MICHETTI, 2002).
O H. pylori possui 15% do seu teor proteico constituído Urease citoplasmática
pré-formada. Quando o pH externo é inferior a 6,5, um canal específico abre na membrana
citoplasmática bacteriana, permitindo a entrada de ureia. A ureia é hidrolisada em amônia e
CO2, a amônia neutraliza o periplasma, permitindo a manutenção do potencial da membrana
citoplasmática bacteriana (WEEKS et al., 2000).
Além disso, proteínas bacterianas ativam e degranulam mastócitos, liberando
outros ativadores inflamatórios (histamina, prostaglandinas) que aumentam a permeabilidade
vascular, a migração de leucócitos ao sítio da infecção e a expressão de moléculas de adesão
de leucócitos às células endoteliais (CRABTREE et al., 1991; MAEDA et al., 1998;
MOBLEY, 2001).
A presença do H. pylori além de estimular a imunidade inata, estimula fortemente
as respostas imunes humorais e mediadas por células. No entanto, as respostas humorais não
estão envolvidas na proteção; em contraste com as respostas mediadas por células que atuam
na eliminação da bactéria e na patogênese em modelos animais e em seres humanos (EATON;
MEFFORD; THEVENOT, 2001).
Na infecção pelo H. pylori o que predomina é o perfil Th1 das células T humanas,
o qual está associado com a liberação de citocinas pró-inflamatórias e ativação de macrófagos.
Ratos infectados experimentalmente, com forte resposta Th1, desenvolveram intensa gastrite,
mas com baixa carga bacteriana; enquanto que em ratos com perfil Th2 foi observado o
contrário (Th1 – aumento de inflamação e atrofia gástrica; Th2 – inverso dos efeitos do Th1)
(SMYTHIES et al., 2000; FOX et al., 2000).
Dosagens séricas dos níveis das subclasses IgG contra o H. pylori sugere uma
polarização Th2 em partes da população da África e uma polarização Th1 no Japão e do
Reino Unido; possivelmente contribuindo para as baixas prevalências de afecções gástricas na
África em relação aos outros países citados (ROBINSON et al., 2008).
A resposta imunológica desencadeada pela ação do H. pylori nas células gástricas
é acumulada qualitativa e quantitativamente com a idade, levando a uma estimulação dessa
resposta ao longo da vida por uma infecção cronicamente ativa, ocasionando danos a longo
prazo (MICHEL et al., 2014).
No referente à alteração na secreção gástrica do hospedeiro, estudos indicam que
indivíduos infectados com essa bactéria apresentam maior concentração de gastrina
plasmática, elevados níveis de interleucina-1ß (IL-1ß), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6
(IL-6), interleucina-8 (IL-8), Fator de Necrose Tumoral α (TNF-α) e secreção de ácido que
23
indivíduos não infectados, com esses parâmetros retornando ao normal após a erradicação do
microrganismo (CRABTREE et al., 1991; YAMAOKA et al., 2004).
1.6 Afecções Gástricas
A infecção pelo H. pylori é geralmente adquirida durante a infância, persistindo ao
longo da vida; está usualmente associada com o desenvolvimento das principais doenças
gastroduodenais, como, gastrite, úlcera péptica, carcinoma gástrico e linfoma MALT
(GRANSTRÖM; TINDBERG; BLENNOW, 1997; OLEASTRO et al., 2003; BRAGA et al.,
2007 ATHERTON; BLASER, 2009).
Metade da população mundial está infectada pelo H. pylori, e 80% desses
indivíduos permanecem assintomáticos, sem nenhuma evidência clínica de doença, durante
praticamente toda a vida (WISNIEWSKI; PEURA 1997). Cerca de 10% dos indivíduos
infectados desenvolvem úlcera péptica, e apenas 1-3% progride para o câncer gástrico e 0,1%
desenvolve linfoma MALT; indicando o envolvimento de outros fatores na patogênese dessa
bactéria (HANSSON et al., 1993; WATANABE et al., 1997; WARREN et al., 2000).
1.6.1 Gastrite
A fase inicial da infecção pelo H. pylori induz uma resposta inflamatória aguda
que é assintomática, ou sintomática com manifestações clínicas de curta duração (náuseas e
vômitos), que evoluem para uma gastrite crônica de longa duração (CARRASCO;
CORVALAN, 2013).
O epitélio foveolar produz uma espessa camada protetora epitelial de muco
(mucina), local de colonização inicial do H. pylori. Na infecção crônica, o H. pylori causa um
proeminente dano ao epitélio gástrico pelo contato com a membrana superficial de tais células.
As células epiteliais assumem a forma irregular e cuboides, diminuindo a produção de mucina
e acarretando em buracos na camada de muco (BODGER; CRABTREE, 1998; CARRASCO;
CORVALAN, 2013).
O H. pylori tem tropismo pelo antro gástrico, mas podendo infectar qualquer parte
do estômago. Após tratamento, as bactérias migram do antro para o corpo, diminuindo a
gastrite antral (CARRASCO; CORVALAN, 2013; SUERBAUM; MICHETTI, 2002). No
entanto, mesmo em menor proporção, também há casos de gastrite corpal e disseminada
(pangastrite) com o progresso da infecção. É relatado na literatura que cerca de 50% dos
24
pacientes infectados por H. pylori que apresentam pangastrite crônica evoluem para lesões
precursoras do câncer gástrico (SIPPONEN; PRICE, 2011).
Na gastrite aguda inicial surge um grande infiltrado neutrofílico na região da
mucosa e na lâmina própria. Os neutrófilos e o H. pylori destroem o epitélio gástrico,
induzindo a proliferação celular pelo organismo na tentativa de repor o epitélio lesado. A
regeneração deste tecido é caracterizada por perda de mucina, basofilia citoplasmática,
aumento da mitose e núcleos hipercromáticos; assemelhando com um processo de displasia
(CARRASCO; CORVALAN, 2013).
A inflamação neutrofílica e a presença de folículos linfoides com centros
germinativos são as duas principais alterações histológicas oriundas da infecção pelo H. pylori
e sua erradicação provoca rápido desaparecimento dos neutrófilos; desta forma, a
permanência dos neutrófilos é um bom indicador da falha terapêutica. Após a erradicação da
bactéria, há uma rápida reversão das alterações histológicas e as células voltam as suas formas
normais e reorganização espacial. (KONG et al., 2014).
O sistema de classificação Sydney é o mais utilizado para a gastrite (SIPPONEN;
PRICE, 2011). O sistema Sydney classifica gastrite com base na topografia, morfologia, e,
quando possível, na etiologia, em três grandes categorias: aguda, crônica e especiais (ou
distintivos). Recomenda-se a amostragem de três pontos do estômago (antro, incisura
angularis, e corpo); e que haja uma graduação das características patológicas (densidade de H.
pylori, intensidade de neutrófilos e mononucleares, atrofia do antro e do corpo, metaplasia
intestinal). Para cada parâmetro é atribuído um valor numérico ou descritivo: 0 para ausente; 1
para leve; 2 para moderado e 3 intenso; por fim, é feito a média de cada valor, de cada
amostra separado para cada compartimento anatômica (antro e do corpo) (SIPPONEN;
PRICE, 2011; CARRASCO; CORVALAN, 2013).
1.6.2 Úlcera Péptica
Úlceras pépticas são identificadas como lesões na mucosa com um diâmetro de
pelo menos 0,5 cm, com penetração até a mucosa muscularis. As úlceras gástricas ocorrem,
principalmente, ao longo da curvatura menor do estômago; em particular, na zona de transição
do corpo para o antro. Geralmente, úlceras duodenais ocorrem no bulbo duodenal, região mais
exposta ao ácido gástrico. Nos países ocidentais, úlceras duodenais são cerca de quatro vezes
mais comuns do que úlceras gástricas. Úlceras duodenais ocorrerem entre 20 e 50 anos de
idade, enquanto que úlceras gástricas surgem, predominantemente, em indivíduos com mais
25
de 40 anos (KUSTERS; VAN VLIET; KUIPERS, 2006).
O H. pylori está presente em 95% dos pacientes com úlceras duodenais e em 70%
daqueles com úlceras gástricas; os quais são tipicamente contaminados pela via fecal-oral
durante primeira infância (FASHNER; GITU, 2015). O uso de antiinflamatórios não
esteroides é apontado como a segunda causa direta de úlcera péptica, principalmente em
pacientes idosos, associada a outras afecções do trato gastrointestinal como a Síndrome de
Zollinger-Ellison e doença de Crohn (COELHO, 1998).
A úlcera duodenal, geralmente, é derivada de uma gastrite antral, que é a forma
mais comum de gastrite causada pelo H. pylori. Já, indivíduos que apresentam gastrite corpal
e atrofia multifocal são mais propensos ao desenvolvimento de úlcera gástrica, atrofia gástrica,
metaplasia intestinal e, por último, do carcinoma gástrico (SUERBAUM; MICHETTI, 2002).
Marshall demonstrou a relação entre a infecção pelo H. pylori e a úlcera péptica
ao observar que após a erradicação da bactéria, ocorre um processo de cicatrização da úlcera
sem a necessidade de utilizar medicamentos supressores da secreção ácida (MARSHALL;
WARREN, 1983). A erradicação do H. pylori mudou drasticamente o curso natural da úlcera,
impedindo quase que completo a recorrência da mesma. A recorrência da úlcera após a terapia
pode ser devido à resistência bacteriana, uma reinfecção, uso de AINEs (anti-inflamatórios
não-esteroidais) ou mesmo uma úlcera idiopática (KUSTERS; VAN VLIET; KUIPERS,
2006).
1.6.3 Câncer Gástrico
O Câncer Gástrico possui etiologia multivariável, pela interação dos fatores
genéticos dos pacientes, fatores socioambientais, bem como pelos fatores de virulência das
cepas de Helicobacter pylori (SUERBAUM; MICHETTI, 2002). Indivíduos fumantes,
alcoólatras, com dietas ricas em sal possuem maior risco de desenvolver o câncer gástrico;
enquanto indivíduos com dietas ricas em frutas e verduras, em especial as frutas cítricas,
possuem um menor risco (DHOBI et al., 2013).
Em 1994, o H. pylori foi classificado como agente cancerígeno da classe I
(definitivo) pela Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer (IARC - International
Agency for Research on Cancer), uma divisão da Organização Mundial da Saúde (OMS).
Devido ao H. pylori ser o principal fator de risco para o câncer gástrico em estudos animais,
bem como em estudos clínicos em humanos (IARC, 1994; AHN; LEE, 2015).
A associação entre infecção pelo H. pylori e o câncer gástrico é forte e bem
26
descrita pela literatura mundial (BRENNER et al., 2000); a qual sugere um alto risco de
desenvolver câncer gástrico pela infecção de cepas mais virulentas e positivas para o gene
associado a citotoxina (cagA) e o gene vacuolizante (vacA s1m1) (CAVALCANTE et al.,
2012).
Outro importante fator de risco para o indivíduo desenvolver o câncer gástrico é
história familiar positiva para a doença. Pois estudos epidemiológicos reportam significância
estatística para a referida relação (MARCOS-PINTO et al., 2012).
As úlceras duodenais possuem colonização bacteriana na região antral e está
associada com: altos níveis de gastrina; alta produção de ácido gástrico; e menor risco de
ocorrência do câncer gástrico (DE; ROYCHOUDHURY, 2015; AHN; LEE, 2015). Já no
adenocarcinoma gástrico, a colonização se dá em regiões mais próximas (pangastrite).
Provocando danos em glândulas gástricas, desencadeando gastrite atróficas associada a
hipocloridria ou acloridria; baixos níveis do pepsinogénios I; baixa relação pepsinogénios I/II
e altos níveis de gastrina. Tais alterações gástricas, evoluem em várias etapas incluindo
metaplasia intestinal, displasia e adenocarcinoma, segundo a hipótese de Correa. As quais
podem levar de 70 a 80 anos e que está associado ao adenocarcinoma do tipo intestinal
(AMIEVA; EL–OMAR, 2008; NAM et al., 2011; AHN; LEE, 2015; DE; ROYCHOUDHURY,
2015).
O adenocarcinoma gástrico possui dois tipos histológicos, o tipo intestinal e o
difuso; segundo a classificação de Lauren (SANTORO et al., 2007; NAM et al., 2011). O
adenocarcinoma do tipo difuso tem associação com o H. pylori; possui aspecto histológico
com poucas glândulas gástricas; células não coesivas com infiltrado na parede gástrica e de
maior incidência em pacientes jovens (SANTORO et al., 2007; POLK; PEEK, 2010; AHN;
LEE, 2015). Porém, o tipo Difuso não tem uma sequência de alterações histológicas com o
adenocarcinoma do tipo Intestinal.
Enquanto que a sequência de manifestações clínicas da infecção pelo H. pylori até
o desenvolvimento do câncer gástrico do tipo intestinal são: Gastrite Crônica, presente na
maioria dos paciente e assintomáticos; Úlceras duodenais, ocorre em 10%-15% dos
indivíduos; Úlceras Gástricas/Adenocarcinoma, evoluindo até câncer gástrico em 1% a 3%
dos indivíduos infectados; linfoma MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) que se
desenvolve em 0,1% dos indivíduos (SANTORO et al., 2007; AMIEVA; EL–OMAR, 2008;
AHN; LEE, 2015).
Adenocarcinoma gástrico também é classificado em Tumores Proximais (junção
gastresofágica e cárdia) e Tumores Distais (antro, corpo e fundo gástricos). As duas
27
classificações do câncer possuem fisiopatologia e epidemiologia distintas; sendo o tipo distal
relacionado ao H. pylori (AHN; LEE, 2015).
1.7 Tratamento do Helicobacter pylori
O protocolo de primeira linha de tratamento do H. pylori consiste na combinação
de um inibidor de bombas de prótons (IBP), claritromicina e amoxicilina ou metronidazol; de
acordo com os consensos internacionais (MALFERTHEINER et al., 2012; LOPES et al.,
2014). A terapia dura de 7 a 14 dias, com duas tomadas ao dia. As taxas de erradicação por 14
dias de terapia tríplice é cerca de 70% em pacientes com dispepsia não-ulcerosa e 80% em
pacientes com úlcera péptica (ZULLO et al., 2013).
Na Europa, Ásia e América do Norte são relatadas taxas de erradicação entre 20 a
45%; as quais são distantes das taxas propostas pela Organização Mundial de Saúde (OMS)
como desejável para doenças infecciosas. A principal limitação da eficácia do tratamento é a
falta de adesão terapêutica, devido aos efeitos adversos e desconfortos após altas e múltiplas
doses dos medicamentos propostos; o que contribui para o aumento da resistência bactérias
aos antibióticos disponíveis (MALFERTHEINER et al., 2012; LOPES et al., 2014).
Na busca de superar as limitações do tratamento convencional, novas alternativas
estão sendo propostos, como o uso de: probióticos; fitoterápicos; sistemas de aprisionamento
gástrico de medicamentos; desenvolvimento de vacinas. Entretanto, uma das terapias mais
promissoras baseia-se na utilização de micro e/ou nano partículas com propriedades muco-
adesivas para a administração direta dos fármacos (SELGRAD; MALFERTHEINER, 2008;
VÍTOR; VALE, 2011; LOPES et al., 2014).
1.8 Diversidades do padrão de algumas cepas do H. pylori no Brasil e suas correlações
clínicas
Os genótipos (cagA, cagE, vacA, dupA, babA, oipA) do H. pylori são bastantes
variáveis de acordo com a localidade estudada. Por isso há uma diversidade de prevalência
dos genes das cepas de acordo com as regiões no Brasil, ressaltando a importância do estudo
das cepas circulantes em cada população.
Para o gene cagA, Rasmussen et al. (2012) encontrou a presença geral de 72,0%
de cepas cagA positivas em 62 biópsias gástricas na cidade de São Paulo - SP, dado este
similar ao encontrado em Recife - PE que foi de 70,5% em 61 pacientes H. pylori positivos
28
(BRITO et al., 2003); um percentual um pouco maior foi encontrado em Belo Horizonte - MG
com 79,81% em 208 pacientes (OLIVEIRA et al., 2003). Já em Porto Alegre - RS foi
encontrado valores bem menores, 40,2% de cepas cagA positivas em 87 pacientes (MEINE et
al., 2011) e em Marília, interior do estado de São Paulo, o percentual também foi baixo,
47,8% de cepas cagA positivas em 205 participantes do estudo (PEREIRA et al., 2014).
A proteína CagA é uma das mais importante na patogenicidade da infecção do H.
pylori e a correlação da presença do gene cagA com as afecções gástricas. Por isto é um dos
genes mais estudados no mundo e no Brasil. A Tabela 1 traz uma visão panorâmica da
prevalência deste gene nas diversas regiões do Brasil.
Como observa-se na Tabela 1, a região Sul é a que possui menores valores de
prevalência do gene cagA e com pouca associação com as afecções gástricas; mesmo não
apresentando associações, o estudo de Cogo et al. (2011) difere dos demais para a região.
Enquanto que a regiões Norte e Nordeste possuem os maiores valores de prevalência,
associando o gene às afecções graves com as úlceras e o câncer gástrico.
Para o gene cagE, Módena et al. (2007) obteve 88,9% de cepas cagE em 172
pacientes com diversas doenças gástricas na cidade de Ribeirão Preto - SP. Enquanto que
Oliveira (2014) encontrou 47,4% de cepas cagE positivas em uma amostra de 137 pacientes
com gastrite e úlcera na cidade de Fortaleza - CE; apresentando grande associação deste gene
com a úlcera péptica.
Lima et al. (2010) encontrou a prevalência de 53,2% de cepas cagE positivas em
101 pacientes com câncer gástrico em Fortaleza. Enquanto que Braga Neto (2015) relata que
25/62 (40,3%) são cepas cagE positivas em pacientes com câncer gástrico na mesma cidade,
sem associação do gene com a neoplasia. Com os familiares dos pacientes com câncer
gástrico, Braga Neto (2015) observou que 53/95 (55,8%) destes eram cagE positivos;
associando tal gene como fator de risco para os familiares dos pacientes acometidos pelo
câncer gástrico.
Ao estudar o gene vacA, Pereira et al. (2014) obteve que a combinação alélica
vacA s1m1 do gene vacA é predominante com 50,2% de positividade nas cepas de 205
pacientes da cidade de Marília. Rasmussen et al. (2012) encontrou dados distintos, pois
56,0% das cepas possuem o gene vacA s1m1 em 62 biópsias gástricas na cidade de São Paulo.
Gonçalves et al. (2013) encontrou que 51,5% são cepas vacA s1m1 em 50 crianças
assintomáticas de uma comunidade carente de Fortaleza. Enquanto, Lima et al. (2011) relata
que a prevalência do gene vacA s1m1 é de 75,5% em 94 pacientes com câncer gástrico
infectados pelo H. pylori na mesma cidade. Tais dados sugerem a necessidade de mais estudos
29
sobre os marcadores genéticos desta bactéria em mais regiões e em grupos etários distintos.
Tendo em vista a gravidade da infecção na primeira infância, pois crianças assintomáticas já
estão contaminadas com cepas que expressam genes de maior virulência que podem,
eventualmente, levá-las a desenvolver doenças graves como o câncer gástrico (LIMA et al.,
2011; GONÇALVES et al. 2013).
Tabela 1: Prevalência e associações de cepas cagA diagnosticado pelo PCR nas diferentes regiões do
Brasil
Região/Cidade Prevalência do cagA (%)
na amostra populacionais
estudada
Associação com as
afecções gástricas
Autor e ano
Norte
Belém – PA 78,0 (G, UP) Úlcera MARTINS et al., 2005
Belém/Bragança – PA 76,0/87,0 (G) Gastrite SILVA JÚNIOR et al., 2013
Belém – PA 85,6 (G, UP, CG) Úlcera VINAGRE et al., 2015
Nordeste
Recife – PE 70,5 (G, UP) Úlcera BRITO et al., 2003
Fortaleza – CE 64,9 (CG) Câncer Gástrico LIMA et al., 2010
Fortaleza – CE 82,8 (G, UP, CG) Câncer Gástrico CAVALCANTE et al., 2012
Fortaleza – CE 66,7 (AS) Sem associações* GONÇALVES et al., 2013
Sul
Porto Alegre – RS 40,2 (CG) Câncer Gástrico MEINE et al., 2011
Curitiba - PR 92,0 (G, UP) Sem correlações COGO et al., 2011
Pelotas – RS 45,6 (DP) Sem correlações RAMIS et al., 2013
Porto Alegre - RS 29,6 (DP) Sem correlações* OLIVEIRA et al., 2014
Suldeste
Belo Horizonte - MG 69,1 (UP) Úlcera* ASHOUR et al., 2002
Belo Horizonte - MG 79,81 (G, UP, CG) Gastrite e Câncer OLIVEIRA et al., 2003
Ribeirão Preto - SP 73,4 (G, UP) Úlcera GATTI et al., 2006
São Paulo - SP 72,0 (G) Gastrite RASMUSSEN et al., 2012
Marília - SP 47,8 (DP, G) Gastrite** PEREIRA et al., 2014
Fonte: Elaborada pelo autor.
G = Gastrite; UP = Úlceras pépticas; CG = Câncer gástrico; DP = Dispépticos; AS = Assintomáticos
*Estudos com crianças
**Estudo com adultos e crianças
Gonçalves et al. (2013) encontrou que 51,5% são cepas vacA s1m1 em 50 crianças
assintomáticas de uma comunidade carente de Fortaleza. Enquanto, Lima et al. (2011) relata
30
que a prevalência do gene vacA s1m1 é de 75,5% em 94 pacientes com câncer gástrico
infectados pelo H. pylori na mesma cidade. Tais dados sugerem a necessidade de mais estudos
sobre os marcadores genéticos desta bactéria em mais regiões e em grupos etários distintos.
Tendo em vista a gravidade da infecção na primeira infância, pois crianças assintomáticas já
estão contaminadas com cepas que expressam genes de maior virulência que podem,
eventualmente, levá-las a desenvolver doenças graves como o câncer gástrico (LIMA et al.,
2011; GONÇALVES et al. 2013).
Gomes et al. (2008) foi a primeira pesquisadora a investigar a prevalência do gene
dupA no Brasil, na ocasião encontrou que 92,32% das cepas circulantes em Belo Horizonte
são dupA positivas em uma amostra de 351 adultos e 131 crianças. Apesar da alta frequência,
não encontrou nenhuma relação com as afecções gástricas. Também em 2008, na cidade de
Ribeirão Preto, Pacheco et al. (2008) encontrou 62,0% de cepas dupA positivas em 79 adultos;
também sem relação do gene com alguma afecção gástrica.
Em 2014 na cidade de Baurú - SP, Pereira et al. (2014) encontrou que apenas
41,5% das cepas eram dupA positivas. Ao comparar o trabalho de Gomes et al. (2008), o
próprio pesquisador ressaltou que as discordâncias dos resultados podem ser explicadas pelos
fatores: diferenças geográficas do Brasil; população estudada; método de análise molecular; a
perda ou rearranjo na zona de plasticidade do gene.
Em 2003, na cidade de Belo Horizonte, Oliveira et al. (2003) encontrou 46,15%
das cepas eram babA2 positivas, as quais tiveram correlação com úlceras duodenais e com o
câncer gástrico.
Gatti et al. (2005) relata a presença de 47% das cepas positivas para babA2 em 89
pacientes na cidade de Marília, as quais estiveram associadas à gastrite crônica. Já no ano
seguinte, em 2006, na cidade de Ribeirão Preto, o mesmo autor refere-se a 40,4% de cepas
babA2 positivas em 95 pacientes; mas sem nenhuma correlação com as afecções gástricas
(GATTI et al., 2006). Mattar et al. (2005) obteve 69,3% de cepas babA2 positivas em 150
pacientes na cidade de São Paulo, com correlação estatísticas com o gênero masculino e sem
correlação com as afecções gástricas. A mesma autora, na mesma cidade encontrou a
prevalência de 64,7% de cepas babA2 positivas em 2010 com 64 pacientes, confirmando a
falta de correlação do gene com as afecções gástricas naquela população (MATTAR et al.,
2010).
Em um estudo realizado em 2013 na cidade de Fortaleza, foi obtido a prevalência
geral de 79,8% de cepas babA2 positivas em uma amostra de 183 indivíduos portadores de
gastrite, úlceras e câncer gástrico. Tal gene mostrou-se ter associação com as úlceras pépticas
31
neste estudo (SILVA, 2013). Outro estudo em Fortaleza no ano de 2015 com 94 crianças
assintomáticas de uma comunidade carente, reporta que 21,3% das cepas são babA2 positivas
em 61 crianças infectadas com o H. pylori (MAIA, 2015).
O trabalhado pioneiro no Brasil sobre o gene oipA foi realizado pelo grupo de
estudo em Gastroenterologia, vinculado a Universidade Federal do Ceará. Na ocasião, Silva
(2013) relatou a prevalência de 44,3% de cepas oipA positivas, não havendo correlação com
as afecções gástricas. Já em crianças assintomáticas de uma comunidade carente, a presença
do gene foi de 36,1% oipA positivas, um pouco abaixo em relação a Silva (2013) (MAIA,
2015). Em um estudo subsequente ao de Silva (2013), Gonçalves (2015) sequenciou o gene
oipA da mesma amostra e observou que 42,0% destes genes apresentam o status ativados,
oipA on. Porém, a presença do gene oipA e seu status ativado ou silenciado não apresentou
correlação com as afecções.
Dados os poucos estudos com os marcadores genéticos do H. pylori no Brasil,
assim como a grande variedade gênica desta bactéria, faz-se necessários mais estudos com
uma variedade maior de genes da bactéria e nas diferentes regiões do país para se obter um
melhor perfil epidemiológico dos marcadores gênicos circulantes no Brasil.
1.9 Marcadores genéticos do Helicobacter pylori
Com o avanço na área da biologia molecular, o genoma do H. pylori tem sido
extensamente estudado, auxiliando no entendimento das variações entre as cepas, de seu
mecanismo de adaptação ao ambiente hostil do estômago e da ação dos marcadores de
virulência na patogênese das afecções gástricas. O cromossomo dessa bactéria tem um
tamanho estimado de 1,68-1,73Mb, e acredita-se que as sequências genômicas apresentam
mais pares das bases nitrogenadas adenina e timina e baixo teor de citosina e guanina, em
média 32,5mol% (TAYLOR; SIMONS; CHANG, 1991).
Estudos evidenciam a presença de diversidade genotípica em cepas de H. pylori e
que, dependendo do tipo de cepa, ocorre diferença no processo inflamatório envolvido, com
liberação de mediadores e citocinas específicos, levando a diversos graus de resposta
inflamatória e diferentes desfechos patológicos (FOX; WANG, 2002). Cepas de H. pylori que
apresentam genes pertencentes à ilha de patogenicidade cag (cag-PAI), por exemplo, induzem
resposta inflamatória mais grave, aumentando o risco de desenvolvimento de úlcera péptica e
câncer gástrico (ISRAEL; PEEK, 2001).
Em outras regiões do cromossomo bacteriano e fora a ilha cag-PAI, existem
32
outros genes que também possuem relação com as patologias causadas pela infeção. Com
exemplo: o gene vacA (vacuolating cytotoxin A) e seus alelos (s1, s2, m1, m2) codificam uma
proteína homônima, que é a citotoxina vacuolizante do H. pylori (VacA), que é secretada da
bactéria pelo sistema de T4SS. Essa toxina pode induzir múltiplas atividades celulares,
incluindo vacuolização da célula, formação de canais na membrana, interrupção das funções
endossomais e lisossomais, apoptose e imunomodulação (LIMA; RABENHORST, 2009).
Há outros genes bacterianos que codificam proteínas de membrana, como por
exemplo: O gene babA codifica a proteína BabA que está relacionada aos antígenos de Lewis,
favorecendo a adesão da bactéria no epitélio gástrico. Foram identificados três genes alelos
(babA1, babA2 e babB), mas somente o produto do babA2 é capaz de aderir as células
(OLIVEIRA et al., 2003). Enquanto que o gene oipA (outer inflammatory protein gene)
codifica uma proteína da membrana externa e é relacionado com o processo inflamatório. A
presença do gene oipA funcional foi associada com o aumento da produção de IL-8 em células
de linhagem de câncer gástrico. Está localizado no cromossomo de H. pylori,
aproximadamente a 100Kb da cag-PAI, e pode apresentar-se tanto o gene funcional como não
funcional (LIMA; RABENHORST, 2009).
Outro gene é o dupA (gene promotor de úlcera duodenal) é descrito como um
novo marcador de virulência do H. pylori, associado ao aumento do risco de desenvolver
úlcera duodenal e diminuição do risco de câncer gástrico no Japão e na Coréia (GOMES et al.,
2008).
1.9.1 Ilha de Patogenicidade cag (cag-PAI)
A cag-PAI é um componente do genoma do H. pylori, presente em 60% a 90%
das cepas mundiais, que contém cerca de 30 genes, dentre eles cagA, cagE, cagT, cagL,
homólogos aos de outras bactérias que codificam componentes do sistema de secreção do tipo
IV (T4SS), que tem a função de injetar moléculas efetoras da bactéria na célula hospedeira,
permitindo assim que a bactéria module vias do metabolismo celular dessa célula, incluindo a
expressão de proto-oncogenes (COVACCI; RAPPUOLI, 2000).
A ilha de patogenicidade cag-PAI é um conjunto de aproximadamente 40 kb de
genes no cromossoma do H. pylori; divide-se em duas regiões, cag I e cag II. Existem em
torno de 14 e 16 Open Reading Frames (ORF) no cag I e cag II, respectivamente. Alguns dos
ORFs no cag-PAI codificam proteínas semelhantes a outros sistemas de secreção bacterianas,
tais como o sistema de secreção de toxina da Bordetella pertussis (IKENOUE et al., 2001).
33
A resposta inflamatória da mucosa gástrica inicia-se quando a ilha de
patogenicidade cag-PAI, presente no genoma bacteriano, induz as células hospedeiras a
liberarem agentes quimiotáticos (entre eles, IL-1 e IL-8) que penetram através do epitélio
lesado e induzem a migração de polimorfonucleares para a lâmina própria e o epitélio
(ATHERTON; BLASER, 2009).
Há cepas de H. pylori em que a cag-Pai pode estar presente, ausente, interrompido
(não funcional); mais comum é estar presente e funcional. A região cag-PAI codifica proteínas
do sistema de secreção do tipo IV (T4SS) – é um canal oco que liga os citoplasmas da
bactéria ao da célula epitelial do hospedeiro. É um sistema não-antigênico; a estrutura
proteica (cagY) que reveste a “seringa” é estável em pH ácido, conferindo estabilidade e
permitindo evasão da resposta imune do hospedeiro (DELAHAY et al., 2008; ATHERTON;
BLASER, 2009).
Na constituição do T4SS, o contato da proteína de extremidade (CagL) com a
célula epitelial transfere e ativa a proteína efetora (CagA), a qual inicia a sinalização e os
efeitos deletérios locais. A proteína CagA também possui outros efeitos celulares, incluindo a
ativação do NF-kB; o qual também é estimulado pela presença do próprio T4SS (BRANDT et
al., 2005).
O primeiro gene cepa-específico identificado no H. pylori foi o gene cagA
(cytotoxin associated geneA), localizado na metade direita da ilha e considerado marcador de
cag-PAI (SOZZI et al., 2005). Esse gene possui entre 35 e 40Kb, sendo encontrado em cerca
de 60% das cepas ocidentais, enquanto no Oriente praticamente todas as cepas são cagA
positivas (HATAKEYAMA, 2004). As cepas cagA-positivas tendem a ser mais virulentas e
induzem níveis mais altos de expressão de citocinas, como IL-1 e IL-8 (BLASER; BERG,
2001).
Após a ligação às células do epitélio gástrico, as cepas do H. pylori cagA-
positivas injetam a proteína CagA no citoplasma celular, através do sistema de secreção tipo
IV. A proteína translocada localiza-se, então, na parte interna da membrana plasmática, onde
sofre fosforilação de tirosina, através de uma das enzimas da família quinase (MURATA-
KAMIYA, 2011). Essa fosforilação ocorre nos sítios EPIYA da proteína e ocasiona
modificações dos sistemas de transdução de sinais, provocando uma série de efeitos
intracelulares, incluindo indução de mediadores inflamatórios, rearranjos no citoesqueleto e
indução de proteínas proliferativas e oncogênicas (HATAKEYAMA, 2004).
As cepas de H. pylori que apresentam cag-PAI estão mais relacionadas à úlcera
péptica e ao câncer gástrico do que as que não apresentam. Enquanto que cepas que
34
expressam o gene cagA têm uma probabilidade três vezes maior de desenvolver úlcera
duodenal ou até mesmo carcinoma gástrico. Estudo realizado no Ceará confirmou elevada
prevalência do genótipo cagA em pacientes com câncer gástrico e úlcera péptica
(CAVALCANTE et al., 2012).
Há outros genes pertencentes a ilha cag-PAI; como o gene cagE que codifica
proteínas estruturais do sistema de secreção tipo IV (CHRISTIE et al., 2005). Alguns estudos
indicam o cagE como responsável pelo aumento da secreção de IL-8 (SU et al., 2003;
TOMASINI et al., 2003; PROENÇA et al., 2007).
Já os genes cagT e LEC estão localizados na ilha de patogenicidade cag-PAI na
região de cagII; o cagT está mais próximo do ponto central da ilha, enquanto o LEC está no
extremo esquerdo desta. Os genes cagT e LEC foram relatados como um marcador de úlcera
péptica no Brasil; com um risco de 27 e 4 vezes, respectivamente, de desenvolver a doença
(MATTAR et al., 2007). Enquanto que em Fortaleza, o gene cagT foi associado à gastrites e o
LEC não apresentou nenhuma associação (GONÇALVES, 2015).
O gene cagT codifica a proteína CagT (HP0532), uma proteína homóloga à VirB7
da Agrobacterium tumefaciens. Bastante presente nas cepas de H. pylori, esta proteína está
envolvida com a inserção da proteína CagA e secreção de IL-8. A proteína CagT está na base
de fixação do pilli do T4SS, na membrana interna bacteriana, e é recoberta pela proteína CagY,
uma proteína homóloga à VirB10 (DING et al., 2012).
1.9.2 Sequência de Inserção IS605, tnpA e tnpB
Sequencias de Inserção (IS) são comuns em diversos organismos, e também
conhecidos como Transposons; é um grupo diversificado de segmentos de DNA que fazem a
movimentação de genes dentro do próprio genoma, por mecanismos que não necessitam de
grandes sequências homólogas de DNA (HOOK-NIKANNE et al., 1998). Tais
movimentações acarretam em mutações por inserção, rearranjo no genoma e mudanças na
expressão de genes próximos; bem como, confere mecanismo de desenvolvimento e
transmissão de resistência de micro-organismos intra e interespécies. Sequencias de Inserção
também serve como marcadores em análise genéticas, assim como marcadores em pesquisas
epidemiológicas para traçar o perfil de transmissão e evolução dos patógenos em populações
infectadas (AKOPYANTS et al., 1998).
Até o presente estudo, a sequência de inserção IS605 foi a única descoberta e
sequenciada em cepas de referências do Helicobacter pylori associadas a fatores de virulência
35
da bactéria (CENSINI et al., 1996; AKOPYANTS et al., 1998). A IS605 contém duas
sequências iniciais de codificação (Open Reading Frames - ORFs), as quais possuem forte
homologia com genes de transposases em outros IS de outras bactérias (HOOK-NIKANNE et
al., 1998). Os dois ORFs da IS605 são os genes tnpA e tnpB: o tnpA que possui alta
semelhança com o gene da transpoase IS200 da Escherichia coli, Salmonella enterica do
sorotipo Typhimurium e Yersinia pestis; já o tnpB é similar à transposase da Thermophylic
bacterrium PS3 (CENSINI et al., 1996).
O elemento IS605 está inserido na região onde separa as duas partes da ilha cag-
PAI, a parte cag I e cag II e gera cepas do H. pylori com diferentes níveis de virulência (LAI
et al., 2013). Conforme representação esquemática da Figura 1.
Figura 1. Estrutura da ilha de patogenicidade cag do H. pylori. Localização do cag I, cag II e IS605.
Fonte: Adaptado de Lai et al. (2013).
A prevalência da IS605 é baixa nas cepas do H. pylori. Antonio-Rincon et al.
(2011) encontrou uma prevalência de apenas 8% (4/50) em um estudo no México. Enquanto
que outro estudo em Taiwan obteve prevalência de 15,2% do IS605; apresentando associação
significativa com o câncer gástrico (LAI et al., 2013).
Os genes tnpA e tnpB são subunidades do IS605, os quais podem interferir na
virulência do H. pylori. Apesar de ser descrito há 20 anos (CENSINI et al., 1996), são dois
genes pouco estudados quanto ao seu exato papel biológico e sua relevância clínica (ABADI
et al., 2014).
Abadi et al. (2014), estudando a população do Irã, encontrou uma alta prevalência
do gene tnpA em doentes com câncer gástrico, sugerindo um papel do gene no
desenvolvimento do câncer induzido pelo H. pylori; fato não encontrado com o gene tnpB, o
qual não apresentou nenhuma relação com as afecções gástricas.
Outro estudo realizado no Brasil aponta que os genes tnpA e LEC estão associados
com câncer gástrico; enquanto o tnpB não houve nenhuma relação. No entanto, são resultados
36
inconclusivos por se tratar de uma amostra muito pequena; necessitando de estudos futuros e
de maior amostragem para determinar o seu papel dos genes na carcinogênese gástrica
(MATTAR et al., 2010). De acordo com esses resultados inconclusivos a respeito da
relevância clínica dos genes tnpA e tnpB, faz-se necessário mais estudos para investigar
melhor tal relevância e suas variações em diversos grupos populacionais.
1.9.3 Gene cagM
O gene cagM, presente na região do cag I, codifica uma proteína no formato de
“gancho” similar à proteína do tipo 3 do Vibrio parahaemolyticus, com a capacidade de
induzir a produção de IL-8 pelas células epiteliais gástricas (JENKS; MÉGRAUD; LABIGNE,
1998).
A proteína CagM faz parte da constituição da porção periplasmática e extracelular
do pilli do T4SS. Outra ação biológica do produto do gene cagM é o aumento do pH
estomacal no hospedeiro pela inibição da secreção ácida. As proteínas CagA, CagE, CagL e
CagM estão envolvidas no mecanismo de inibição da transcrição do RNAm da subunidade α
da enzima H, K-ATPase (HKα) nas células parietais (SAHA et al., 2010).
Smolka e Backert (2012) também estudou os genes CagA, CagE, CagL e CagM,
genes codificantes do T4SS e confirmou o envolvimento de tais na inibição da transcrição do
HKα e também na ativação do NF-κB. Desta forma, descrevendo o mecanismo de acloridria
na infecção pelo H. pylori.
Um estudo realizado no Brasil em 2007 encontrou que a presença do cagM está
associado com o risco de 8 vezes de desenvolver a úlcera péptica; podendo ser um marcador
útil para identificar indivíduos com risco mais elevado de desenvolvimento de úlcera péptica
no Brasil (MATTAR et al., 2007). Enquanto que a prevalência do cagM gira em torno de 90 a
100% na China; mas sem nenhuma associação da presença do gene com as afecções gástricas
(LAI et al., 2013).
37
1.10 Justificativa
A infeção pelo H. pylori é pandêmica, silenciosa e de consequências desastrosas
para a saúde pública devido ao potencial de virulência desta bactéria. Tal potencial difere em
cada região e em cada população infectada por conta da alta variabilidade genética das cepas.
Por isto a importância deste estudo dos genes tnpA, tnpB e cagM nas cepas circulantes em
Fortaleza, para se obter qual a associação de tais genes com as afecções gástricas na
população estudada; bem como agregar conhecimento aos genes já estudado por este grupo de
estudo da região Nordeste do brasil. Desta forma, tais estudos de perfil genético das cepas
circulantes poderão ajudar na tomada de decisão para o correto diagnóstico, manejo clínico e
tratamento da população infectada pelo H. pylori; além de ajudar na orientação de políticas
públicas para o combate e tratamento.
38
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar os fatores de virulência tnpA, tnpB e cagM de cepas do H. pylori em
pacientes portadores de gastrite, úlcera péptica e câncer gástrico atendidos no Hospital
Universitário Walter Cantídio – UFC.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar a distribuição dos genes da ilha cag-PAI (tnpA, tnpB, cagM) das cepas de H. pylori
nos pacientes do presente estudo.
Analisar a associação da presença dos genótipos do H. pylori com gênero e faixa etária dos
pacientes estudados.
Analisar a associação de tais genes com as afecções gástricas (gastrite, úlcera péptica, câncer
gástrico).
Verificar associação entre os genes estudados da ilha cag-PAI (tnpA, tnpB, cagM).
39
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Casuística
Esse estudo faz parte dos trabalhos do laboratório de Gastroenterologia/UFC. No
qual foram avaliados, prospectivamente, indivíduos portadores de câncer gástrico, úlcera
péptica e gastrite, diagnosticados por meio de endoscopia digestiva alta ou análise
histopatológica de biópsia gástrica, atendidos no serviço de Gastroenterologia do Hospital
Universitário Walter Cantídio (HUWC), da Faculdade de Medicina da Universidade Federal
do Ceará – UFC, que aceitaram participar do estudo e assinaram o termo de consentimento
livre e esclarecido (Apêndice A), perfazendo um total de 147 pacientes, no período de 2012 a
2015. O estudo foi submetido à análise e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa -
Universidade Federal do Ceará (COMEPE/UFC) (ANEXO A).
3.2 Tipo do Estudo
Estudo descritivo transversal. Os pacientes atendidos pelo serviço de
Gastroenterologia foram encaminhados para a realização da endoscopia; e após a coleta da
biópsia gástrica com o laudo endoscópico, foram incluídos no estudo para a realização das
análises genéticas.
3.3 Seleção dos Participantes
Foram critérios de inclusão:
Idade mínima de 17 anos e máxima de 90 anos de ambos os gêneros;
Indivíduos portadores das principais afecções gástricas (gastrite, úlcera péptica ou câncer
gástrico) confirmadas por endoscopia ou exame histopatológico, infectados pelo H. pylori.
Pacientes que aceitaram participar do estudo e assinaram o termo de consentimento livre e
esclarecido.
Foram critérios de exclusão:
Gravidez ou lactação;
Indivíduos que realizaram cirurgia prévia de ressecção gástrica ou vagotomia, ou
40
apresentando síndrome de Zolliger-Ellison, estenose pilórica;
Portadores de insuficiência renal, insuficiência hepática, insuficiência cardíaca congestiva
ou instabilidade hemodinâmica (variação de pressão arterial, sangramentos e hemorragias)
que contraindicasse a investigação endoscópica.
3.4 Coleta de Fragmentos de Mucosa Gástrica na Endoscopia
De todos os participantes do estudo submetidos à endoscopia digestiva alta, foram
colhidos fragmentos de mucosa gástrica. A endoscopia foi realizada com o paciente em jejum
de, no mínimo 8 horas. Antes do procedimento, o paciente recebeu anestesia tópica da
orofaringe com Cloridrato de Lidocaína (Xilocaína spray a 10%) e uma dose de Diazepam (5
mg por via oral). O endoscópio foi submetido a rigoroso processo de assepsia, entre um
procedimento e outro, sendo lavado vigorosamente com água e sabão e mergulhado em uma
solução de glutaraldeído a 2% por 30 minutos.
A coleta dos fragmentos obedeceu ao protocolo validado do Sistema de Sydney
(SIPPONEN; PRICE, 2011), os locais da coleta dos espécimes foram os seguintes: (IA) - 2
fragmentos da Incisura Angularis; (A1) - 2 fragmentos da pequena curvatura do antro; (A2) -
2 fragmentos da grande curvatura do antro; (B1) - 2 fragmentos da pequena curvatura do
corpo; (B2) - 2 fragmentos da grande curvatura do corpo gástrico. Obtendo-se 10 fragmentos
em frascos separados com as seguintes especificações a depender do local da coleta (IA, A1,
A2, B1, B2).
Um fragmento extra foi colhido para a realização do teste da urease. Nele, o
fragmento da região antral é imerso em um tubo contendo uma solução de ureia e indicador
de pH. A análise foi efetuada imediatamente após a coleta do material e uma leitura final foi
realizada vinte e quatro horas após. O teste da urease foi considerado positivo quando houve
mudança da coloração da ureia de “amarelo” para “vermelho”. Nos casos em que a solução
permaneceu “amarela” por vinte e quatro horas após a coleta, o teste foi considerado negativo.
Quando houve dificuldade em estabelecer a mudança de coloração, o teste foi tido como
indeterminado.
O procedimento do exame endoscópico tinha duração de, aproximadamente, 20
minutos. Após na realização do mesmo, as amostras coletadas foram armazenadas,
imediatamente, a 4°C para serem transportadas até o laboratório, onde eram estocadas em
freezer -80ºC, até o seu processamento e análise.
41
3.5 Coleta de Fragmentos de Mucosa Gástrica na Gastrectomia
Os fragmentos dos portadores de câncer gástrico foram colhidos no momento da
cirurgia de ressecção do tumor (gastrectomia parcial ou total). Foram coletados, após a
retirada do estômago, 10 fragmentos da peça cirúrgica, sendo 6 fragmentos de tecido distal ao
tumor e 4 fragmentos da região da borda tumoral. Os fragmentos foram colocados em tubos
específicos e armazenados imediatamente a 4°C para serem transportadas até o laboratório,
onde foram estocados em freezer -80ºC, até o seu processamento e análise.
3.6 Extração do DNA de Helicobacter pylori em Tecido de Biópsia Gástrica
A extração do DNA do H. pylori nas amostras de tecido gástrico colhidas dos
pacientes estudados, foi feita a partir da maceração dos fragmentos de biópsia gástrica. O
material genômico foi extraído das amostras seguindo o protocolo de QIAGEN®
, com os
reagentes do QIAamp DNA mini kit, conforme orientação do fabricante.
Primeiramente, efetuou-se a digestão do material tecidual, que foi colocado em
minitubos de 2 mL, com 180μL de tampão ATL e 20μL de Proteinase K, e submetidos a
banho-maria a 56ºC por vinte e quatro horas.
Após a digestão, seguiu-se a lise celular, onde foram adicionados 200μL de
tampão AL, e incubou-se novamente as amostras em banho-maria, a 70ºC, por dez minutos.
Em seguida, adicionou-se 200μL de Etanol 100%.
O conteúdo da lise celular foi transferido para coluna Spin QIAamp®
, para etapa
de eluições com intuito de filtrar o conteúdo celular, o primeiro filtrado foi centrifugado a
8.000 rpm por 1 minuto em tubo de microcentrífuga de 2 mL, depois foi descartado e foram
adicionados 500μL de tampão AW1 (QIAGEN®
), e foi feita eluição por centrifugação a 8.000
rpm por um minuto. Em seguida, foram colocados 500μL de tampão AW2 (QIAGEN®
), com
centrifugação a 14.000 rpm por três minutos.
Por último, adicionaram-se 200μL de tampão AE, centrifugando a 8.000 rpm por
um minuto e repetindo essa última lavagem para uma eficaz extração do material genético.
Após a extração do DNA, as amostras foram estocadas em freezer a -20ºC até o seu
processamento.
42
3.7 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)
O DNA do H. pylori extraído das biópsias gástricas foi utilizado para a
amplificação dos genótipos de interesse nesse estudo, a partir das sequências de nucleotídeos
(primers) específicos, previamente descritos na literatura. A solução “Master mix” para
amplificação do DNA, continha: 12,5μL da enzima Taq-DNA polimerase GoTaq green -
Promega®
; 1,0μL dos “primers” específicos para cada gene a ser estudado, partindo da
terminação 5’ para a 3’, em ambos os sentidos (senso e antisenso). Em cada microtubo, foram
acrescentados 5,0μL do DNA extraído em microtubos específicos de 200μL. As reações
ocorreram separadas para cada gene. A Tabela 2 indica os primers que foram utilizados para
cada marcador.
Tabela 2: Primers usados na amplificação dos genótipos estudados
Primer Sequência (5' - 3') Pares de base Referência
cagM – F ACAAATACAAAAAAGAAAAAGAGGC 586 Kidd et al., 2001
cagM – R ATTTTTCAACAAGTTAGAAAAAGCC
tnpA – F ATCAGTCCAAAAAGTTTTTTCTTTCC
344 Kidd et al., 2001 tnpA – R TAAGGGGGTATATTTCAACCAACCG
tnpB –F CGCTCTCCCTAAATTCAAAGAGGGC 569 Kidd et al., 2001
tnpB –R AGCTAGGGAAAAATCTGTCTATGCC
Fonte: Elaborada pelo autor
A amplificação do DNA extraído foi realizada em termociclador (My Cylcler –
Bio-Rad, CA.-USA®), obedecendo ao protocolo de ciclos específicos para cada gene
estudado, conforme Tabela 3.
Após a amplificação de cada gene, procedeu-se à corrida eletroforética em géis de
agarose a 2%, corado com brometo de Etídio, para visualização dos marcadores genéticos do
H. pylori. Foi utilizado tampão Tris Acetato EDTA (TAE) como veículo líquido para a
corrida dos géis. A eletroforese ocorreu nas seguintes condições: 100 volts, 400 miliamperes
por 40 minutos.
Os géis foram processados em aparelho transluminador com câmara eletrônica de
ultravioleta para evidenciação dos pares de bases, estabelecendo assim, o resultado positivo
ou negativo para os marcadores genéticos estudados, a partir da presença ou ausência das
bandas de nucleotídeos pertencentes a esses genes.
43
Foi estabelecido o controle da qualidade dos géis corridos, para monitorar
possíveis contaminações, pela presença de controle positivo e controle negativo para cada
marcador genético estudado. Os pesos moleculares dos pares de base foram aferidos por
padrão de bandas de DNA (DNA Ladder), adicionado aos géis.
Tabela 3: Ciclos de amplificação para cada gene
Gene Desnaturação
inicial Desnaturação/ Anelamento/ Extensão Extensão Final Referência
cagM, tnpB 5min – 94ºC (30s - 94˚C/ 30s - 52˚C/ 30s - 72˚C) 40x 10min - 72˚C Kidd et al., 2001
tnpA 5min – 94ºC (30s - 94˚C/ 30s - 55˚C/ 30s - 72˚C) 40x 10min - 72˚C Kidd et al., 2001
Fonte: Elaborada pelo autor.
Legenda: min – Minutos; s – Segundos; ºC – graus celsos.
3.8 Análise Estatística
Foi utilizado o software SPSS for Windows, versão 16.0; SPSS Inc., Chicago,
Illinois. Os resultados foram analisados através do teste exato de Fisher; do teste do qui-
quadrado de Pearson e realizada análise estatística com regressão logística por multivariada.
O nível de significância considerado foi p ≤ 0.05. O risco foi estimado utilizando-se Odds
Ratio (OR) e o intervalo de confiança de 95%.
44
4 RESULTADOS
4.1 Caracterização da amostra estudada
Foram analisadas 147 amostras de biópsia gástrica de pacientes infectados por H.
pylori atendidos no Hospital Universitário Walter Cantídeo. Sendo, 50 portadores de gastrites,
51 portadores de úlcera péptica e 46 com câncer gástrico. Do total de pacientes, 72 (49,0%)
eram do gênero masculino e 75 (51,0%) do gênero feminino (Gráfico 1).
Gráfico 1: Distribuição dos pacientes em função do gênero
72 (49,0%)
75 (51,0%)
Masculino Feminino
Fonte: Elaborado pelo autor
A idade dos pacientes estudados no geral variou de 17 a 85 anos, com média de
54,18 + 14,24 anos. O grupo foi dividido em duas faixas etárias, menor igual e maior de 45
anos, onde 40/147 (27,2%) eram do grupo menor igual a 45 anos e 107/147 (72,8%) do grupo
maior que 45 anos (Gráfico 2).
No presente estudo, houve 50 pacientes com gastrite, os quais apresentaram
achados endoscópicos em que: 39 (78,0%) eram portadores de gastrite antral, 7 (14,0%)
tinham gastrite corpal e 4 (8,0%) tinham pangastrite. Foi encontrado que 20/50 (40,0%) eram
homens e 30/50 (60,0%) eram mulheres. A idade variou de 17 a 75 anos, com média de 49,3 +
14,3 anos. Não houve nenhuma relação estatística significante entre a presença de gastrite
com o gênero (p = 0,163) nem com a idade dos pacientes (p = 0,434).
45
Gráfico 2: Distribuição dos pacientes em função da faixa etária
Fonte: Elaborado pelo autor
O grupo dos portadores de úlcera péptica foi constituído por 51 pacientes, os quais
37/51 (72,5%) possuíam úlcera duodenal e 14/51 (27,5%) portavam úlcera gástrica. Com
relação ao gênero, 25/51 (49,0%) eram homens e 26/51 (51,0%) eram mulheres. A idade
variou de 32 a 85 anos, com média de 54,5 + 12,8 anos. Não houve nenhuma relação
estatística significante entre a presença de úlcera péptica com o gênero (p = 1,000) nem com a
idade dos pacientes (p = 0,699).
Dos pacientes com câncer gástrico, 27/46 (58,7%) eram do gênero masculino e 19
(41,3%) do gênero feminino. A idade variou de 35 a 84 anos, com média de 59,1 + 14,2 anos.
Não houve nenhuma relação estatística significante entre a presença de câncer gástrico com o
gênero (p = 0,154) e com a idade dos pacientes (p = 0,230). A caracterização dos grupos dos
pacientes estudados com relação ao gênero e à idade estão na Tabela 4.
Tabela 4: Caracterização dos pacientes, por grupos, quanto ao gênero e a idade
Afecções Gástricas Masculino
n (%)
Feminino
n (%) valor de p
Média de Idade
(anos) valor de p
Gastrite (n = 50) 20 (40,0) 30 (60,0) 0,163
49,3 + 14,3
0,434
Antral (n = 39) 16 (41,0) 23 (59,0) 0,267 0,837
Corpal (n = 7) 4 (57,2) 3 (42,8) 0,715 0,390
Pangastrite (n = 4) 0 4 (100,0) 0,120 0,62
Úlcera péptica (n = 51) 25 (49,0) 26 (51,0) 1,000
54,5 + 12,8
0,699
Duodenal (n = 37) 15 (40,5) 22 (59,5) 0,259 0,285
Gástrica (n = 14) 10 (71,4) 4 (28,6) 0,96 0,352
Câncer Gástrico (n = 46) 27 (58,7) 19 (41,3) 0,154 58,1 + 14,2 0,230
Fonte: Elaborada pelo autor.
46
4.2 Distribuição da expressão dos marcadores moleculares cag-PAI do H. pylori.
4.2.1. Distribuição dos marcadores por gênero.
A distribuição dos genótipos cag-PAI do H. pylori mais prevalentes no gênero
masculino foram: tnpA 30/72 (41,6%) e o cagM 11/72 (15,3%); vale salientar que não foi
encontrado nenhum gene tnpB neste grupo. Enquanto no gênero feminino a ordem dos genes
mais prevalentes foi: tnpA 40/75 (53,4%); cagM 8/75 (10,6%); tnpB 3/75 (4,0%). Não
havendo associação significativa entre a presença dos genes e os gêneros. (Gráfico 3)
Gráfico 3: Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com o gênero
Fonte: Elaborado pelo autor
Na Tabela 5, pode-se observar a mesma distribuição dos genótipos de acordo com
gênero, informando os valores de p para cada gene.
Tabela 5: Distribuição dos genótipos do H. pylori de
acordo com o gênero
Genes
Masculino
n = 72
Feminino
n = 75 p
n (%) n (%)
tnpA 30 (41,6) 40 (53,4) 0,187
cagM 11 (15,3) 8 (10,6) 0,466
tnpB 0 (0) 3 (4,0) 0,245
Fonte: Elaborada pelo autor
47
4.2.2. Distribuição dos marcadores por faixa etária
Os pacientes foram divididos em duas faixas etárias, os com idade menor igual e
maior de 45 anos. Nos pacientes com idade menor igual a 45 anos, os genes mais prevalentes
foram o tnpA 22/40 (55,0%), cagM 8/40 (20,0%) e tnpB 1/40 (2,5%). Nos pacientes com
idade maior que 45 anos, os genes mais prevalentes seguiram a mesma ordem: tnpA 42/107
(44,8%); cagM 11/107 (10,3%) e tnpB 2/107 (1,9%). Não houve associação significante entre
a presença dos genes com as faixas etárias dos pacientes. (Gráfico 4).
Gráfico 4: Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com a faixa etária
Fonte: Elaborado pelo autor
Na Tabela 6, pode-se observar a mesma distribuição dos genótipos de acordo com
a faixa etária, informando os valores de p para cada gene.
Tabela 6: Distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo
com a faixa etária
Genes
≤ de 45 anos
n = 40
> de 45 anos
n = 107 p
n (%) n (%)
tnpA 22 (55,0) 42 (44,8) 0,354
cagM 8 (20,0) 11 (10,3) 0,165
tnpB 1 (2,5) 2 (1,9) 1,000
Fonte: Elaborada pelo autor
48
4.2.3 Distribuição dos marcadores por afecções gástricas
Com relação aos marcadores de virulência das cepas de H. pylori foi encontrado o
seguinte perfil nos 147 pacientes estudados: 70 (47,6%) cepas tnpA; 03 (2,0%) cepas tnpB; 19
(12,9%) cepas cagM.
No Gráfico 5, observa-se à distribuição dos genótipos do H. pylori de acordo com
as afecções estudadas nos 147 pacientes avaliados.
No grupo dos pacientes com gastrite o genótipo mais frequente foi o tnpA 29/50
(58,0%), seguido dos genes: cagM 4/50 (8,0%) e tnpB 2/50 (4,0%). Não houve nenhuma
associação de tais genes com a gastrite (p > 0,05).
Assim como na gastrite, no grupo dos pacientes com úlcera péptica os genótipos
mais frequentes também foram o tnpA 32/51 (62,7%) e o cagM 11/51 (21,6%); enquanto
nenhum tnpB foi encontrado. Houve associação estatística da úlcera duodenal com a presença
dos genes tnpA (p = 0,002; O.R: 3,54; 95% I.C: 1,59-7,90) e cagM (p = 0,024; O.R: 3,21;
95% I.C: 1,19-8,67).
No grupo dos pacientes com câncer gástrico, o genótipo mais frequente foi o tnpA
9/46 (19,6%); cagM 4/46 (8,7%) e tnpB 1/46 (1,2%). A presença do gene tnpA teve relação
inversa com o câncer gástrico (p = 0,001; O.R: 0,16; 95% I.C: 0,70-0,36); devido ao valor
encontrado de Oddis Ratio negativo.
Gráfico 5: Distribuição dos genótipos do H. pylori nas afecções estudadas
Legenda: * p < 0,05 (Estatisticamente significante)
Fonte: Elaborado pelo autor.
Na Tabela 7 pode-se observar a distribuição dos genótipos com a afecções
gástricas, informando os valores de p para cada gene.
49
Tabela 7: Prevalência dos genótipos cag-PAI do H. pylori de acordo com as afecções gástricas
Afecções Gástricas tnpA tnpB cagM
n (%) p n (%) p n (%) p
Gastrites (n = 50) 29 (58,0) 0,083 2 (4,0) 0,267 4 (8,0) 0,300
Antral (n = 39) 24 (61,5) 0,061 2 (5,1) 0,172 2 (5,1) 0,103
Corpal (n = 7) 4 (57,2) 0,709 0 (0,0) 1,000 2 (28,6) 0,224
Pangastrite (n = 4) 1 (25,0) 0,622 0 (0,0) 1,000 0 (0,0) 1,000
Úlcera Péptica (n = 51) 32 (62,7) 0,009 * 0 (0,0) 0,552 11 (21,6) 0,037 *
Duodenal (n = 37) 26 (70,3) 0,002 * 0 (0,0) 0,572 9 (24,3) 0,024 *
Gástrica (n = 14) 6 (42,8) 0,784 0 (0,0) 1,000 2 (14,3) 1,000
Câncer Gástrico (n = 46) 9 (19,6) 0,001 * 1 (1,2) 1,000 4 (8,7) 0,428
Legenda: * p < 0,05 (Estatisticamente significante)
Fonte: Elaborada pelo autor.
Quando feito análise estatística, o gene tnpA demonstrou associação significativa
com a úlcera, em particular a úlcera duodenal nas análises não ajustadas (univariada) (p =
0,002; O.R: 3,545; 95% I.C: 1,591-7,903). Após análise multivariada, ajustando para gênero e
idade, o gene tnpA permaneceu demostrando associação significativa com a úlcera duodenal
(p = 0,004; O.R: 3,328; 95% I.C: 1,482-7,476), Tabela 8.
O gene cagM também apresentou associação significativa com a úlcera duodenal,
nas análises univariadas (p = 0,024; O.R: 3,214; 95% I.C: 1,190-8,679). Após análise
multivariada, ajustada para gênero e idade, o cagM continuou associado à úlcera duodenal (p
= 0,025; O.R: 3,215; 95% I.C: 1,158-8,922), Tabela 8.
Tabela 8: Análise Univarida e Mutivariada dos genótipos tnpA e cagM com as afecções gástricas
Afecção
gástrica
tnpA
Univariada Multivariada
Úlcera
duodenal
tnpA O.R 95% I.C p O.R 95% I.C p
26/37 3,545 1,591-7,903 0,002 3,328 1,482-7,476 0,004
cagM
Univariada Multivariada
Úlcera
duodenal
cagM O.R 95 % I.C p O.R 95 % I.C p
9/37 3,214 1,190-8,679 0,024 3,215 1,158-8,922 0,025
Fonte: Elaborada pelo autor.
As figuras 1-3 ilustram alguns dos géis de agarose para os diversos marcadores
avaliados.
50
Figura 2: Gel de agarose para visualização das bandas do gene tnpA (344pb) nas amostras de câncer
gástrico.
Fonte: Arquivos do autor.
Da esquerda para a direita tem-se:
Poço 1: DNA Ladder 600pb Poço 6: tnpA positivo
Poço 2: Controle positivo Poço 7: tnpA positivo
Poço 3: tnpA positivo Poço 8: tnpA positivo
Poço 4: tnpA positivo Poço 9: tnpA positivo
Poço 5: tnpA positivo Poço 10: Controle negativo
Figura 3: Gel de agarose para visualização das bandas do gene tnpB (569pb) nas amostras de câncer
gástrico.
Fonte: Arquivos do autor.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
600 500 400 300 200 100
600 500 400 300 200 100
51
Da esquerda para a direita tem-se:
Poço 1: DNA Ladder 600pb Poço 11: tnpB negativo
Poço 2: Controle positivo Poço 12: tnpB positivo
Poço 3: tnpB negativo Poço 13: tnpB negativo
Poço 4: tnpB negativo Poço 14: tnpB negativo
Poço 5: tnpB negativo Poço 15: tnpB negativo
Poço 6: tnpB negativo Poço 16: tnpB negativo
Poço 7: tnpB negativo Poço 17: tnpB negativo
Poço 8: tnpB negativo Poço 18: tnpB negativo
Poço 9: tnpB negativo Poço 19: tnpB negativo
Poço 10: tnpB negativo Poço 20: Controle negativo
Figura 4: Gel de agarose para visualização das bandas do gene cagM (586pb) nas amostras de úlcera
gástrica.
Fonte: Arquivos do autor.
Da esquerda para a direita tem-se:
Poço 1: DNA Ladder 600pb Poço 11: cagM negativo
Poço 2: Controle positivo Poço 12: cagM negativo
Poço 3: cagM negativo Poço 13: cagM negativo
Poço 4: cagM negativo Poço 14: cagM negativo
Poço 5: cagM negativo Poço 15: cagM positivo
Poço 6: cagM negativo Poço 16: cagM negativo
Poço 7: cagM negativo Poço 17: cagM negativo
Poço 8: cagM positivo Poço 18: cagM negativo
Poço 9: cagM positivo Poço 19: cagM negativo
Poço 10: cagM negativo Poço 20: Controle negativo
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
600 500 400 300 200 100
52
4.3 Associação de tnpA com os demais genótipos estudados
Foi analisado quais amostras eram tnpA positivas e também positivas para os
demais genes do presente estudo. A análise do teste do qui-quadrado de Pearson, buscou
observar se houve alguma correlação da presença de um gene com os outros; e desta forma,
não foi encontrado nenhuma associação significante da presença do tnpA com os demais
genes. Como visto na Tabela 8.
Tabela 9: Associação de tnpA com os demais genótipos estudados
Genes
tnpA (n = 70)
n p
tnpB 3 0,106
cagM 10 0,806
Fonte: Elaborada pelo autor
53
5. DISCUSSÃO
O presente estudo buscou identificar os fatores de virulência tnpA, tnpB e cagM
da ilha cag-PAI das cepas de Helicobacter pylori em amostras circulantes na cidade de
Fortaleza - Ceará, no nordeste brasileiro. Tais genes são importantes no sistema de secreção
do tipo IV da bactéria e os mesmos estão associados às diversas afecções gástricas, segundo a
literatura científica mundial (MATTAR et al., 2007; LAI et al., 2013; ABADI et al., 2014).
Foi estudado o perfil genotípico de 147 cepas de H. pylori, as quais foram
oriundas de 50 pacientes portadores de gastrite, 51 portadores de úlcera péptica e 46
portadores de câncer gástrico atendidos no Hospital Universitário Walter Cantídio – UFC.
Foi observado que o desenvolvimento das afecções gástricas mais graves esteve
acompanhado de um aumento de idade dos pacientes; onde a média de idade dos pacientes
com gastrite foi de 49,3 anos, enquanto que os pacientes do grupo de úlcera péptica e câncer
gástrico foi de 54,5 e 58,1 anos, respectivamente. Neste estudo, os pacientes portadores de
câncer gástrico apresentaram uma maior prevalência do gênero masculino (27/46; 58,7%) e de
idade mais avançada, média de 58,1 anos. Este perfil está de acordo com os trabalhos da
literatura científica mundial, a qual relata que a prevalência de câncer gástrico é cerca de duas
vezes maior entre os homens do que entre as mulheres e mais frequente na faixa etária de 50-
70 anos (BRENNER, ROTHENBACHER, ARNDT, 2009; JAMAL et al., 2011; SEKER et al.,
2013).
Apesar de descrito a mais de 20 anos, são poucos os estudos de prevalência dos
genes tnpA, tnpB, cagM; o mecanismo dos genes no desenvolvimento das afecções gástricas e
as correlações com tais afecções ao redor do mundo (CENSINI et al., 1996; ABADI et al.,
2014).
No presente estudo, o gene tnpA teve maior frequência nas amostras de úlceras
pépticas; em especial nas úlceras duodenais 26/37 (70,3%) (p = 0,002; O.R: 3,54; 95% I.C:
1,59-7,90). Desta forma, na população estudada, a presença de tal gene confere um risco de
3,5 vezes maior de desenvolver a úlcera duodenal. Enquanto que no grupo da gastrite, a
frequência do gene tnpA foi de 58,0% (29/50), mas sem nenhuma associação significativa
com tal afecção gástrica.
Mattar et al. (2007) realizou um trabalho pioneiro ao investigar os genes tnpA e
tnpB no Brasil. Na ocasião, a autora comparou 150 pacientes portadores de úlceras pépticas
com 65 pacientes dispépticos na cidade de São Paulo. Foi encontrado a presença de tnpA em
70,0% dos pacientes com úlcera péptica; a qual houve diferença significativa com o grupo
54
controle (p < 0,01). Desta forma, os achados do presente estudo estão de acordo com os de
Mattar et al. (2007) para a úlcera péptica, mesmo em regiões diferentes do país. Tendo em
vista que 32/51 (62,7%) das cepas deste estudo são portadoras do gene tnpA e esteve
associado com a úlcera péptica (p = 0,009; O.R: 2,57; 95% I.C: 1,277-5,175).
A frequência do gene tnpA nos pacientes com câncer gástrico foi de apenas 9/46
(19,6%). Na análise estatística, encontrou-se uma relação inversa significante entre a presença
do gene e o câncer gástrico (p = 0,001; O.R: 0,16; 95% I.C: 0,70-0,36). Desta forma, na
amostra de Fortaleza, o gene tnpA não está associado ao desenvolvimento do câncer gástrico;
sugerindo que a presença de tal gene seja um fator protetor para esta população.
A associação do gene tnpA e o câncer gástrico também é descrita em outras
localidades. Estudando pacientes com gastrite e com câncer gástrico no Perú, Kersulyte et al.
(2002) relatou a presença do gene tnpA em 15/45 (33,3%) e 9/14 (64,3%) dos pacientes,
respectivamente. Havendo associação significativa do gene com a afecção (p = 0,04).
Entretanto, tal estudo possui um número muito pequeno de amostras (n = 14) o que pode
gerar incertezas quanto ao dado.
Em 2010 na cidade de São Paulo, Mattar et al. (2010) encontrou outros resultados
para a presença do gene tnpA. A autora comparou 34 pacientes com câncer gástrico com 34
pacientes dispépticos; encontrando a presença do gene em 25/34 (73,5%) no grupo com
câncer, com associação significativa (p < 0,0001). No entanto, são resultados inconclusivos
por se tratar de amostras muito pequenas; necessitando de estudos futuros e de maior
amostragem para determinar o real papel do gene na carcinogênese gástrica.
Abadi et al. (2014), analisou 360 pacientes contaminados com o H. pylori no Iran.
95 pacientes com gastrite, 200 com úlceras e 65 com câncer gástrico. Encontrou 39/65 (60,0%)
cepas tnpA positivas nos pacientes com câncer gástrico, com risco relativo de 1,45 (95% I.C:
1,04-1,93). Tal estudo foi o de maior proporção devido ao seu grande número de amostras;
sugerindo uma forte correlação da presença do tnpA com o desenvolvimento do câncer
gástrico.
O presente estudo obteve apenas 03 cepas portadoras do gene tnpB dentre as 147
amostras estudadas. As quais 2/50 (4,0%) tnpB positivas no grupo dos pacientes com gastrite
e 1/46 (1,2%) tnpB positivas no grupo com câncer. Não foi encontrada nenhuma relação
significativa do gene tnpB com nenhuma outra variável (gênero, idade, afecções gástricas e
outros genes).
Assim como os achados deste estudo, outros trabalhos também não encontraram
nenhuma correlação do gene tnpB com alguma afecção gástrica. Abadi et al. (2014) também
55
relata que a maior porcentagem do tnpB também foi no grupo dos pacientes com gastrite,
16/95 (16,8%); mas sem nenhuma relação significante.
Mattar et al. (2007) obteve 24/150 (16,0%) cepas tnpB positivas em pacientes
com úlcera péptica e 5/65 (7,7%) tnpB positivas em dispépticos. Mesmo com um número
maior de achados, não obteve associação estatística entre o gene e as afecções gástricas (p =
0,129). Em outro estudo, Mattar et al. (2010) obteve 2/34 (5,9%) cepas tnpB positivas em
pacientes com câncer gástrico (p = 0,551); reforçando a falta de relação do gene com as
doenças gástricas. Desta forma, os dados encontrados em Fortaleza estão em consonância
com os dados de outras localidades, relacionados à baixa expressividade do gene tnpB.
Em relação ao outro gene da ilha cag-PAI, a frequência do gene cagM no presente
estudo foi maior e significante nas amostras de úlceras pépticas (11/51; 21,6%; p = 0,037;
O.R: 3,025; 95% I.C: 1,130-8,096); em especial nas úlceras duodenais 9/37 (24,3%) (p =
0,024; O.R: 3,21; 95% I.C: 1,19-8,67). Dados estes de acordo com Mattar et al. (2007) que
encontrou 117/150 (78,0%) cepas cagM positivas em úlceras pépticas (p < 0,01). A autora
afirma que o cagM está associado com o risco de 8 vezes do desenvolvimento de úlceras
pépticas nos pacientes infectados com cepas portadores deste gene; podendo ser considerado
um marcador genético para identificar indivíduos com altos riscos de desenvolver úlceras
pépticas no Brasil. Da mesma forma, o presente estudo encontrou um risco de 3,2 vezes de
desenvolver úlceras duodenais e 3,0 vezes de úlceras pépticas quando infectadas com cepas
cagM positivas em Fortaleza.
Na população chinesa, o gene cagM apresenta uma frequência muito maior,
variando de 90 a 100% (93,8% na gastrite; 100,0% úlcera duodenal; 96,8% úlcera gástrica e
95,0% no câncer gástrico). Porém, não foi encontrada nenhuma correlação da presença do
cagM com as afecções gástricas (LAI et al., 2013).
Há poucos estudos que analisam a presença dos genes tnpA, tnpB, cagM com os
desfechos clínicos causados pela infecção de cepas portadoras de tais genes. Desta forma, faz-
se necessários mais estudos em diversas populações para melhor entender a relação desses
genes com as afecções gástricas. É necessário que os estudos deste grupo de pesquisa sobre o
H. pylori na região Nordeste possa expandir-se ainda mais em abrangência e variedade. Desta
forma, agregar mais conhecimentos e informações sobre o perfil genético das cepas
circulantes na região. Além de se reafirmar como um centro de referência em tais estudos e
alicerçar o processo de tomada de decisão no desenvolvimento de políticas públicas de saúde
na prevenção, diagnóstico e tratamento do Helicobacter pylori.
56
6. CONCLUSÃO
O presente estudo obteve como perfil genotípico das cepas de H. pylori na
amostra estudada de Fortaleza as seguintes frequências: 47,6% de cepas tnpA; 2,0% de tnpB;
12,9% de cagM. O gene tnpA foi o mais presente no gênero masculino e de maior prevalência
nas duas faixas etária estudada; no entanto, não se observou associação estatística do gene
com tais variáveis. O gene tnpA apresentou uma associação negativa com o câncer gástrico;
enquanto apresentou associação significativa com a úlcera duodenal. O gene tnpB foi o de
menor prevalência e, consequentemente, não apresentou associação com nenhuma variável
(gênero, idade, afecções gástricas e outros genes). O gene cagM foi o segundo mais
prevalente em todas as afecções gástricas; e assim como o tnpA, apresentaram associação
significativa com úlcera duodenal. Concluiu-se que os genes tnpA, cagM estão associados ao
risco maior de 3,5 e 3,2 vezes, respectivamente de desenvolver úlceras pépticas; sugerindo
tais genes como bons marcadores genéticos para a úlcera péptica nas amostras coletadas na
cidade de Fortaleza.
57
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69
APÊNDICE A
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título: Estudo clínico, epidemiológico e caracterização dos genótipos do H. pylori no Ceará.
Introdução: Você (ou seu filho) está sendo convidado a participar de uma pesquisa. Sua
participação é importante, portanto é fundamental que você compreenda as explicações sobre
os procedimentos propostos. Esta declaração esclarece o objetivo, procedimentos, benefícios,
riscos, desconfortos, precauções do estudo e o seu direito de desistir do estudo a qualquer
momento.
Resumo: O H. pylori é uma bactéria que causa gastrite e úlcera péptica e atualmente existem
fortes evidências de que a infecção é adquirida na infância. Como a infecção pelo H. pylori
acomete cerca de 50% das crianças, é muito importante esclarecer os aspectos relacionados
com a transmissão da infecção e determinação dos fatores envolvidos na aquisição da bactéria.
Objetivo: Esse trabalho tem como objetivo avaliar a infecção e os tipos de cepas de
Helicobacter pylori, através do Teste Respiratório e do Enteroteste (deglutição de uma
cápsula contendo um fio de algodão).
Procedimento: Você irá responder a um questionário. Será realizado o Teste Respiratório,
onde você irá soprar em um balão, em seguida tomará 200ml de suco de laranja contendo uma
substância, ureia marcada com C13
, que não é radioativo, podendo ser utilizado por qualquer
pessoa, inclusive crianças e gestantes. Após 30 minutos, você soprará outro balão. Outro teste
que será realizado é o Enteroteste, onde você irá deglutir uma cápsula, que contém um fio de
algodão estéril medindo 90cm de comprimento e 05mm de largura (semelhante a uma linha
que se usa para fazer trabalhos manuais de crochê). Uma pequena porção ficará para fora da
boca e fixada à bochecha com uma fita adesiva. A cápsula será deglutida com um copo de
água (200ml) e, após 01 hora, o fio será removido. Ambos os testes necessitam de pelo menos
08 horas de jejum prévio. Serão incluídos nesse estudo aqueles que aceitarem participar
voluntariamente do estudo e concordarem em realizar os testes. E será excluído do estudo
aquele que não aceitar, ou não conseguir realizar o teste.
Riscos: Esse método é confiável e não apresenta riscos, apenas causa um leve desconforto
pela sensação de um fio na garganta.
Benefícios: A sua participação será muito importante para o conhecimento da infecção pelo
Helicobacter pylori e poderá contribuir no futuro para melhoria do controle da infecção em
nosso país.
Confidencialidade: Os seus resultados serão mantidos em sigilo. Qualquer publicação dos
dados não identificará o participante.
Desligamento: Poderá se afastar a qualquer momento do estudo sem prejuízo para sua saúde.
Contato com o pesquisador: Dra. Lúcia Libanez B. C. Braga pode ser feito pelos telefones 85
33668444 ou 8865-2042. Caso tenha alguma dúvida sobre os seus direitos como paciente de
pesquisa, você deverá ligar para o Comitê de Ética em Pesquisa da UFC no número 85
33668338.
Consentimento: Li e entendi as informações acima. E estou ciente de que não haverá nenhum
pagamento pela participação no estudo. Tive oportunidade de fazer perguntas e todas as
minhas dúvidas forma respondidas. Este formulário está sendo assinado voluntariamente por
mim, indicando o meu consentimento para que meu filho participe do estudo, até que eu
decida o contrário. Receberei uma cópia assinada deste consentimento.
70
Nome do participante Assinatura
_______________________________ ______________________________
Nome do Responsável Assinatura
_______________________________ ______________________________
Nome do Pesquisador Assinatura
_______________________________ ______________________________
Nome de quem obteve o TCLE Assinatura
_______________________________ ______________________________
71
ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA
72
73