UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE … · Entre os tipos de proteínas de sementes várias têm função de reserva, estrutural ou metabólica. ... reservation function, structural

1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR

FACULDADE DE MECIDINA DE SOBRAL

CURSO DE PS-GRADUAO EM BIOTECNOLOGIA

JEDSON ANTONIO DE SOUZA ARAGO

ANLISE E APLICAES BIOTECNOLOGIAS DE PROTENAS LIGANTES

QUITINA DE SEMENTES DE CAJUEIRO ANO-PRECOCE (Anacardium

occidentale var. nanum)

Sobral CE

2015

2





Dissertao submetida coordenao do curso

de ps-graduao em Biotecnologia da

Universidade Federal do Cear, como requisito

parcial para obteno do grau de Mestre em

biotecnologia.rea de Concentrao:

Macromolculas

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Maranguape

Silva da Cunha.

.

Sobral

2015

3

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao

Universidade Federal do Cear

Biblioteca do Curso de Medicina Campus de Sobral

A671a Arago, Jedson Antonio de Souza.

Anlise e aplicaes biotecnolgicas de protenas ogantes quitina de sementes de cajueiro ano-

precoce (Anacardium occidentale var. nanum). / Jedson Antonio de Souza Arago. 2015.

79 f. : il. color., enc. ; 30 cm.

Dissertao (mestrado) Universidade Federal do Cear, Curso de Medicina, Programa de Ps-

Graduao em Biotecnologia, Sobral, 2015.

rea de Concentrao: Macromolculas.

Orientao: Prof. Dr. Rodrigo Maranguape Silva da Cunha.

1. Quitinase. 2. Patgeno. 3. Anacardium. I. Ttulo.

CDD 660.6

4





Dissertao de Mestrado apresentada ao

Programa de Ps-Graduao em Biotecnologia,

da Universidade Federal do Cear, como

requisito parcial para obteno do Ttulo de

Mestre em Biotecnologia rea de

Concentrao: Macromolculas.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Maranguape Silva

da Cunha

Aprovada em ____/____/____

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________

Prof. Dr. Rodrigo Maranguape Silva da Cunha (Orientador)

Universidade Estadual Vale do Acara UVA.

______________________________________________________

Prof. Dr. Joo Garcia Alves Filho (Examinador)

Universidade Estadual Vale do Acara UVA.

_____________________________________________________

Prof. Dr. Victor Alves Carneiro (Examinador)

Instituto de Teologia Aplicada INTA.

5

minha me, Clia de Sousa, por ser

meu exemplo e minha sustentao,

dedico.

6

AGRADECIMENTOS

Finalizada essa etapa da minha vida, no poderia deixar de expressar o mais

profundo agradecimento a todos queles que me apoiaram nesta caminhada e

contriburam para a realizao deste trabalho.

Em primeiro lugar agradeo a Deus, Aquele que tornou tudo possvel, me deu

foras e fortaleceu minha f em todos os momentos da minha vida.

minha famlia, principalmente aos meus pais, Clia e Jos Felipe, ao meu

irmo Jefferson Sousa e minha av materna,Laide Lima, por serem minha base e quem

com todo carinho, dedicao, amor e compreenso me deram foras e incentivo para

realizar meus sonhos.

Ao meu orientador professor Dr. Rodrigo Maranguape Silva da Cunha, pela

oportunidade que me deu desde a graduao, pela contribuio em minha formao

acadmica, orientao e confiana durante a realizao desde trabalho.

Ao professor Thales Granjeiro, pela grande ateno e colaborao nesse trabalho

orientando parte dos estudos.

Aos amigos do laboratrio de Gentica Molecular, do Ncleo de Biotecnologia

de Sobral (NUBIS) que me ajudaram direta e indiretamente na realizao desse

trabalho. No tenho palavras para agradecer por tanta ajuda e carinho, alm da amizade

e dos momentos de descontrao durante o trabalho. As companheiras de longa data,

das quais compartilhei muitos momentos, alegrias e tristezas antes e durante o mestrado:

Aurilene Gomes e Vitoria Virginia. As grandes amigas Nayanne Hardy e Mnica

Valria pela amizade e por todos os momentos que passamos, seja na faculdade ou no

laboratrio. Aos grandes amigos Raulzito Moreira e Daniel de Brito que mesmo estando

longe sempre mostraram-se disponveis quando precisei. Aos companheiros de trabalho

Carlos Franciney, Pedro Cunha, Tatiana Farias, Paulo de Tarso, Rafael Bastos, Erivan

Alves e Flvia Muniz, que sempre se mostraram disponveis quando a ajuda era

necessria. tcnica do NUBIS, Maria Auxiliadora que estava sempre disposta a

ajudar.

amiga Simone Torres, que sem sua ajuda no seria possvel a realizao de

parte desse trabalho, e ao novos colegas do LABGEN: Suellen, Juscelino e Ednsio que

foram de grande ajuda no trabalho.

Aos colegas e professores do mestrado em Biotecnologia, pelo convvio e troca

de conhecimentos.

7

EMBRAPA Agroindstria Tropical, pela disponibilidade das amostras de folha de

cajueiro.

Aos membros da banca examinadora, professores Joo Garcia Alves Filho e

Victor Carneiro pelas contribuies ao trabalho.

CAPES pela bolsa concedida.

Universidade Federal do Cear, por contribuir na minha formao

profissional.

todos aqueles que de alguma forma contriburam para a realizao deste

trabalho.

Obrigado!

8

Esse s o comeo do fim da nossa vida

Deixa chegar o sonho, prepara uma avenida

que a gente vai passar. - Marcelo Camelo

9

RESUMO

O cajueiro (Anacardium occidentale L.) uma planta nativa do Brasil com grande valor

comercial. Isso contribui com a gerao de milhares de empregos diretos e indiretos,

especialmente na Regio Nordeste, em poca de estiagem. Programas de melhoramento

gentico vem selecionando cultivares de cajueiro melhores adaptados ao ambiente

semirido a fim de coloc-lo em um mercado cada vez mais competitivo. Entre os tipos

de protenas de sementes vrias tm funo de reserva, estrutural ou metablica. Alm

disso, as plantas so dispostas de uma variedade de mecanismos de defesa contra o

ataque de patgenos. Uma das respostas de defesa mais estudada diz respeito

expresso de protenas relacionadas com a patognese nas quais se inclui o grupo das

quitinases. A enzima quitinase (EC 3.2.1.14) hidrolisa o polmero de quitina para a N-

acetil glucosamina por qualquer uma das endo ou exo clivagens da ligao (1-4). As

respostas moleculares nos perfis das plantas a nvel transcricional tm demonstrado

serem cruciais para o estabelecimento de um conjunto de mecanismos de defesa contra

patgenos invasores. Usando ferramentas de bioinformtica foram identificados, no

transcriptoma de cajueiro CCP076, dez contigs apresentando alto grau de semelhana

com quitinases, endoquitinases, e quitinases-like das famlias GH18 e GH 19 de Ricinus

communis, Cicer arietinum, Mangifera indica, Citrus sinensis, Euonymus europaeus,

Vitis vinifera, Aegilops tauschii e Hevea brasiliensis. Os ensaios enzimticos das

protenas da castanha confirmaram a presena quitinases em seu proteoma. Ainda

revelaram uma atividade cataltica tima em pH 5. Um perfil de protenas com sitio de

ligao quitina tambm foi encontrado. Dessa forma, demonstrado um grande

potencial biotecnolgico nas quitinases provenientes da castanha de cajueiro CCP76.

Palavras-Chave: cajueiro, patgeno, quitinase.

10

ABSTRACT

The cashew (Anacardium occidentale L.) is a plant native to Brazil with high market

value. This contributes to the generation of thousands of direct and indirect jobs,

especially in the Northeast, in the dry season. Breeding program has been selecting the

best cashew cultivars adapted to semi-arid environment in order to put it in an

increasingly competitive market. Among the types of seed proteins have several

reservation function, structural or metabolic. Furthermore, plants are arranged in an

array of defense mechanisms against pathogen attack. One of the most studied defense

response with respect to the expression of pathogenesis related proteins which are

included in the group of chitinases. The enzyme chitinase (EC 3.2.1.14) hydrolyse the

polymer chitin to N-acetyl glucosamine by either endo or exo cleavage of connection

(1-4). The molecular profiles of responses in plants transcriptional level have been

shown to be crucial for the establishment of a set of defense mechanisms against

invading pathogens. Using bioinformatics tools were identified in the transcriptome

cashew CCP076 ten contigs having high degree of similarity with chitinases,

endoquitinases and chitinase-like the GH18 family and GH 19 of Ricinus communis,

Cicer arietinum, Mangifera indica, Citrus sinensis, Euonymus europaeus , Vitis

vinifera, Aegilops tauschii and Hevea brasiliensis. The enzyme assays of chestnut

chitinase protein confirmed the presence in their proteome. Also revealed a great

catalytic activity at pH 5. A protein profile with chitin-binding site was also found. Of

these, it is demonstrated great potential in biotechnological chitinase from CCP76

cashew nuts.

Keywords: cashew, pathogen, chitinase.

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Fruto e pseudofruto do cajueiro 20

Figura 2 Estrutura qumica de quitina 25

Figura 3 Estrutura tridimensional de quitinases GH18 e GH19 de plantas

definidas por cristalografia disponveis no Protein Data Bank

(PDB)

25

Figura 4 Representao dos domnios conservados no contig identificado

como quitinase de Ricinus communis (XP_002515664.1) 33


como endoquitinase PR4-like de Cicer arietinum

(XP_012570981.1)

34


como quitinase de Mangifera indica (ACD69683.1) 34


como uma quitinase-like de Citrus sinensis (XP_006488866.1) 35


como quitinase de Euonymus europaeus (AAP35272.1) 35


como endoquitinase PR4-like de Vitis vinifera (XP_010650683.1) 36


como endochitinase de Aegilops tauschii (EMT27212.1) 36


como quitinase de Hevea brasiliensis (CAA09110.1) 37


como endoquitinase PR4 de Vitis vinifera (XP_002274537.1) 37


como quitinase de Vitis vinifera (ABD64687.1) 37

Figura14 Representao dos domnios conservados no contig identificado

como albumina 2S de Anacardium occidentale (AAL91665.1).

38

Figura 15 Alinhamento de nucleotdeos realizado pelo programa Clustal

verso 2.0.10, comparando Cajueiro ano-precoce e gigante na 40

12

procura de SNPs.

Figura 16 Alinhamento de aminocidos realizado pelo programa Clustal

verso 2.0.10, comparando Cajueiro ano-precoce e gigante na

procura de SNPs.

41

Figura 17 Estrutura Tridimensional das sequncias de quitinases GH19 de

cajueiros ano-precoce CCP76 e Gigante mostrando posio da

substituio do resduo de aminocido.

41

Figura 18 Estrutura tridimensional obtida por RMN de albumina 2S isolada

de Brassica napus (PDB 1PNB). 45

Figura 19 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 15 % de

protenas de amndoas de cajueiro extradas e fracionadas em pH5

e coradas com de Azul Brilhante de Coomassie R-250

58

Figura 20 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 15 % de

protenas de amndoas de cajueiro extradas e fracionadas em pH2

e coradas com de Azul Brilhante de Coomassie R-250.

60

13

LISTA DE GRFICOS

Grfico 1 Concentrao de protenas solveis em mg/ml em diferentes

tampes de extrao 52

Grfico 2 Atividade quitinsica total dos extratos proteicos em diferentes pH 53

Grfico 3 Atividade quitinsica em unidades em cada 1mL (U/mL) dos

extratos proteicos em diferentes pH 53

Grfico 4 Atividade quitinsica total dos extratos proteicos em diferentes pH

antes e depois da dilise 55

Grfico 5 Atividade quitinsica em unidades em cada 1mL (U/mL) dos

extratos proteicos em diferentes pH antes e depois da dialise 55

Grfico 6 Cromatografia de afinidade realizada com matriz de quitina do

extrato proteico em tampo acetato de sdio pH5 56

Grfico 7 Atividade quitinsica total dos picos cromatogrficos do extrato

em tampo acetato de sdio pH 5,0 57

Grfico 8 Atividade quitinsica (U/mL) dos picos cromatogrficos do extrato

em tampo acetato de sdio pH 5,0 57

Grfico 9 Concentrao de protenas solveis em mg/ml do extrato proteico e

fraes dialisadas em tampo Glicina-HCl pH 2,0. 60

Grfico 10 Teste de concentrao inibitria mnima realizada com a frao

60-90% contra C. albicans 61

Grfico 11 Ensaio de atividade antibiofilme de albumina 2S contra C.

albicans 61

Grfico 12 Teste de concentrao inibitria mnima realizada com a frao

60-90% contra C. tropicalis. 62

Grfico 13 Ensaio de atividade antibiofilme de albumina 2S contra C.

tropicalis 62

14

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais caractersticas dos cajueiros dos tipos comuns e anos

precoce.

20

Tabela 2 Estatsticas de montagem do transcriptoma de cajueiro CCP 76 usando o

programa Velvet/Oases.

32

Tabela 3 Quitinases identificadas manualmente pelo Blastx no

transcriptoma de semente de Cajueiro ano-precoce CCP76.

39

15

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

% Porcentagem

C Grau Celsius

L Microlitro

A260 Absorbncia a 260 nm

A260/280 Relao entre absorbncia 260 e 280

ACC Amndoa da Castanha do Caju

BLAST Ferramenta Bsica de Alinhamento Local (Basic Local Alignment Search

Tool)

CCP

DMAB

Clone de Cajueiro de Pacajus

P- dimetil amino benzaldedo

DNA cido Desoxirribonucleico

EDTA cido etilenodiamino tetra-actico (Ethylene diaminetetra acetic acid)

Embrapa Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria

g

GH

Grama

Glicosil Hidrolases

GO Ontologia Gnica (Gene Ontology)

h Hora

HCl cido Clordrico

KEGG Enciclopdia de genes e genomas de Kyoto (Kyoto Encyclopedia of Genes

and Genomes)

Kg Quilograma

LCC Lquido da Castanha de Caju

m Metro

M

mRNA,

Molar

RNA mensageiro

m/v Massa/volume

mA Mili ampere

min Minutos

mL Mililitro

mM Milimolar

NGS Nova Gerao de Sequenciamento (Next Generation Sequencing)

16

PDB Protein Data Bank

pH

PR

Potencial hidrogeninico

Relacionado a patgeno (pathogenesis-related)

Rpm Rotaes por minuto

TBE Tampo contendo Tris, cido brico e EDTA

TE Tampo contendo Tris e EDTA

W Wats

17

SUMRIO

INTRODUO..........................................................................................................................18

1.REVISO DE LITERATURA...............................................................................................19

1.1 Aspectos Gerais do Caju...................................................................................................19

1.2 Importncia econmica.....................................................................................................21

1.3 Protenas de Semente ........................................................................................................22

1.4 Protenas PR (Pathogenesis-Related)................................................................................22

1.5 Quitinases..........................................................................................................................23

2. ANLISE IN SILICO DE PROTENAS LIGANTES QUITINA PRESENTES NOS

TRANSCRIPTOMA DE CAJUEIRO ANO PRECOCE CCP76.......................................27

2.1 Transcriptoma....................................................................................................................27

2.2 SNP-Single Nucleotide Polymorphism.............................................................................28

2.2 OBJETIVOS.........................................................................................................................29

2.2.1 Objetivo Geral................................................................................................................29

2.2.2 Objetivos Especficos.....................................................................................................29

2.3 MATERIAIS E MTODOS................................................................................................30

2.3.1. Obteno das sequncias do transcriptoma do cajueiro................................................30

2.3.2 Montagem do transcriptoma ..........................................................................................30

2.3.3 Identificao in silico de quitinases e triagem das sequncias com CDS completo......30

2.3.4 Anlise de SNPs.............................................................................................................31

2.4 RESULTADOS E DISCUSSES.......................................................................................32

2. 4.1 Montagem do transcriptoma utilizando o Velvet e Oases.............................................32

2.4.1. Identificao e classificao dos transcritos..................................................................33

2.4.1.2 Identificao de SNP nos contigs identificados .........................................................40

2.5 CONCLUSO.......................................................................................................................42

3. AVALIAO DO EFEITO INIBITRIO DO CRESCIMENTO MICROBIANO DE

ALBUMINA 2S DE CASTANHA DE CAJU (Anacardium Occidentale var. nanum).........44

3.1 Albumina 2s......................................................................................................................44

3.2 OBJETIVOS.........................................................................................................................46

3.2.1 Objetivo Geral................................................................................................................46

3.2.2 Objetivos Especficos.....................................................................................................46

3.3 MATERIAIS E MTODOS................................................................................................47

3.3.1 Extrao de protenas das Castanhas de CCP076..........................................................47

3.3.2 Determinao da concentrao de protenas..................................................................47

3.3.3 Atividade Quitinsica.....................................................................................................47

18

3.3.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida em presena de SDS (PAGE-SDS)...................48

3.3.5 Cromatografia de afinidade em matriz de quitina..........................................................49

3.3.6 Precipitao com Sulfato de Amnio.............................................................................49

3.3.7 Ensaio de atividade antimicrobiana (CIM)....................................................................49

3.3.8 Ensaio de atividade antibiofilme....................................................................................50

3.3.9. Quantificao da biomassa..........................................................................................50

3.4 RESULTADOS E DISCUSSES......................................................................................51

3.4.1 Extrao de protenas solveis.......................................................................................51

3.4.2 Ensaio da atividade quitinsica......................................................................................51

3.4.3 Cromatografia de afinidade em matriz de quitina..........................................................54

3.4.2 Avaliao de albuminas 2S presentes na castanha de CCP076......................................59

3.4.3 Atividade antimicrobiana...............................................................................................59

3.5 CONCLUSES.....................................................................................................................64

4. BIBLIOGRAFIA...................................................................................................................65

19

1. INTRODUO

O cajueiro (Anacardium occidentale L.) uma espcie de origem brasileira,

encontrada principalmente em climas tropicais e subtropicais, e a nica espcie

cultivada comercialmente do seu gnero (PAIVA; CRISSTOMO; BARROS, 2003). A

variedade ano-precoce vem substituindo o cajueiro comum por proporcionar maior

produtividade, facilitar a colheita e a conduo dos pomares em razo do seu baixo

porte. Alm disso, o cajueiro ano-precoce apresenta maior uniformidade da castanha,

do pednculo e da produo, permitindo uma explorao comercial mais rentvel

(BARROS; CRISSTOMO, 1995; OLIVEIRA et al., 2002). O uso de clones representa

uma forma de manejo econmico, ecolgico e seguro, impedindo a invaso de pragas e

doenas, alm de proporcionar uma melhor utilizao da variabilidade gentica da

espcie (PAIVA; BARROS, 2004).

Entre os tipos de protenas de sementes, vrias tm funo protetora, ou

estrutural ou metablica. Embora as protenas PR (Pathogenesis-Related) estejam

envolvidas na defesa de plantas, elas no so necessariamente identificadas por sua ao

antipatognica, mas sim por seu simples acmulo em plantas submetidas situao de

patognese (VAN LOON, 1997). Entre as PR encontram-se as quitinases que parecem

ter um papel direto na defesa do vegetal ao hidrolisar os polmeros de quitina , o

principal componente da parede celular da maioria dos fungos (COLLINGE et al.,

1993).Quitinases so enzimas capazes de hidrolisar as ligaes covalentes -1,4 entre os

resduos de GlcNAc que constituem as cadeias de quitina. Essas enzimas podem ocorrer

em vrios organismos, desde animais, plantas, insetos at vrus e bactrias. (DAHIYA

et al., 2006;).

O desenvolvimento de novas tcnicas de sequenciamento tem proporcionado

uma maneira mais rpida e eficiente de mapear e quantificar o transcriptoma em um

mtodo conhecido como RNA-Seq (WANG et al. 2010). A utilizao da tecnologia do

RNA-Seq oferece uma grande quantidade de informao sobre o transcriptoma como a

avaliao dos nveis de expresso, mapeamento de genes expressos e descoberta de

novos genes, sem haver a necessidade de um genoma previamente sequenciado (WANG

et al. 2009).

20

1. REVISO DE LITERATURA

1.1 Aspectos Gerais do Caju

Pertencente a famlia Anacardiaceae, o cajueiro possui distribuio tropical e

subtropical, incluindo cerca de 70 gneros e 700 espcies, sendo que no Brasil ocorrem

13 gneros e cerca de 60 espcies. Diversas Anacardiaceae apresentam frutos ou

pseudofrutos comestveis, este o caso do cajueiro (Anacardium occidentale), cujo

fruto a castanha de caju, mundialmente conhecida, sendo o seu pseudofruto originado

do desenvolvimento do pednculo, e tem sido comercializado in natura ou na forma de

doces, sucos ou sorvetes (SOUZA; LORENZI, 2008).

Existem dois tipos bem definidos, em relao ao porte da planta, o tipo comum e

ano-precoce. O cajueiro comum apresenta porte grande, variao na distribuio dos

ramos e formatos da copa, a castanha e o pednculo podem apresentar uma grande

variabilidade. Em sua maioria, produz menos de 5 kg de castanha por safra podendo

haver plantas com produo prxima a 200 kg. Sua produo estabilizada apenas aps

8 anos. O tipo ano-precoce tem como caractersticas um porte baixo, copa homognea,

dimetro do caule e envergadura da copa bem inferior ao tipo comum. A propagao da

maioria das plantas feita por sementes ou por enxertia, com florao tendo inicio j no

primeiro ano e apresentando caractersticas com menor variabilidade em relao ao tipo

comum (BARROS, 2002).

O cajueiro uma planta perene, de ramificao baixa e porte mdio, cuja copa

atinge altura mdia de 5 a 8 metros e dimetro mdio entre 12 e 14 metros no tipo

comum. Podendo atingir at 15 m de altura e dimetro da copa superior a 20 m,

dependendo do gentipo e das condies de clima e solo. No caso do cajueiro ano-

precoce, a altura mdia no ultrapassa 4 metros e a envergadura varia entre 6 e 8 metros.

Suas folhas so simples, inteiras, alternas, de aspecto subcoriceo, glabras e curto-

pecioladas, medindo de 10 a 20 cm de comprimento por 6 a 12 cm de largura

(BARROS, 2002) (Tabela 1).

O fruto (Figura 1) um aqunio, conhecido popularmente como castanha,

consiste de epicarpo, mesocarpo, endocarpo e amndoa. O peso varivel, encontrando-

se castanhas de 3 a 12 g, e o aumento deste limite superior um dos principais objetivos

do melhoramento. Tem colorao esverdeada, de incio, tornando-se avermelhada e por

ltimo apresenta cor acinzentada. Sua superfcie cerosa, brilhante e resistente,

21

ornamentada de inmeras pontuaes escuras. O pseudofruto (Figura 1) tem alto teor de

gua e normalmente rico em vitamina C e em acares, quando maduro. O

pseudofruto apresenta uma epiderme muito fina e brilhante, de colorao varivel do

amarelo ao vermelho, podendo ter pontuaes (BARROS et al., 1993; FERRO, 1995).

Figura 1: Fruto e pseudofruto do cajueiro.

Fonte: Google imagens.

Tabela 1: Principais caractersticas dos cajueiros dos tipos comum e ano-precoce.

Caractersticas Comum Ano-precoce

Porte Alto (8 - 15) Baixo (

22

O sistema reprodutivo da espcie predominantemente alogmico, ou seja, a

fecundao preferencialmente cruzada, sendo que a viabilidade do plen do cajueiro

normalmente alta. Existe a possibilidade de ocorrer polinizao entre flores de uma

mesma planta. Por causa disto, o plantio por sementes resulta em grande variao entre

plantas, o que afeta no s o seu formato como tambm sua produo. A flor tem odor

bastante ativo, indicando ser atrativa para os insetos (BARROS, 2013).

1.2 Importncia Econmica

A cajucultura ocupa no mundo, uma rea estimada de 3,39 milhes de hectares,

com uma produo mundial estimada em 3,1 milhes de toneladas. O Vietn o maior

produtor mundial de castanha de caju. O Brasil o dcimo produtor mundial de

castanha de caju, e possui uma rea cultivada de 740.000 ha, com uma produo de 250

mil toneladas da castanha de caju e dois milhes de toneladas de caju, gerando em

mdia divisas da ordem de U$ 225 milhes anuais (OLIVEIRA, 2008; FAO, 2012).

O Brasil apontado pelas mais renomadas instituies internacionais como um

dos principais supridores de alimentos, fibras e biomassa para um mundo em crescente

demanda e aumento populacional. O agronegcio nacional ganhou outra magnitude e

mais complexidade. As exportaes brasileiras ligadas ao agronegcio foram de US$ 20

bilhes em 2000. Em 2010, passou de US$ 76 bilhes. (LOVATELLI, 2011).

A cajucultura no Brasil distribuda em vrias regies do Pas, tendo como

principal produtor a regio Nordeste, respondendo por 94% da produo nacional, onde

os maiores plantios localizam-se principalmente nas faixas litorneas e de transio dos

estados do Cear, Piau e Rio Grande do Norte. A castanha como matria-prima

alimenta um parque industrial formado por uma dezena de fbricas de grande porte e

cerca de 80 pequenas fbricas, responsveis pela obteno da amndoa de castanha de

caju, destinada em sua maioria exportao, gerando em mdia divisas da ordem de

US$ 225 milhes anuais. Atualmente, as sucessivas estiagens vm prejudicando a

produo de castanha de caju nos principais estados produtores. Em 2014 a produo

foi de apenas 17.023 toneladas gerando US$ 110 milhes (OLIVEIRA, 2008; SECEX,

2015).

23

1.3 Protenas de Semente

Um dos primeiros trabalhos sobre protenas de sementes foi publicado em 1891

por Osborne (apud Vickery, 1945) onde essas foram isoladas de acordo com a

solubilidade em diversos solventes e as classificaram de acordo com as fraes extradas

em gua pura (albuminas), solues salinas diludas (globulinas), solues alcolicas

(prolaminas) e solues alcalinas ou cidas diludas (glutelinas) (HELDT, 2005).

Ainda no existe um sistema de classificao universalmente, mas Shewry

(2000) considera mais vlido dividir as protenas primeiro em relao sua funo e,

para as protenas de reserva, utilizar a classificao de Osborne modificada. Essa

classificao divide as protenas de reserva em quatro grupos, definidos pelas fraes de

Osborne e por seus coeficientes de sedimentao, que representam a medida de seu

tamanho molecular, a saber: prolaminas, albuminas 2S e globulinas 7S e 11S.

Entre os outros tipos de protenas de sementes, vrias tm funo protetora,

estrutural ou metablica. Dentre os protetores, os inibidores de proteinases so,

provavelmente, os mais abundantes e amplamente distribudos, sendo particularmente

comuns em sementes de leguminosas, proporcionando resistncia contra herbivoria.

Existem tambm endo-hidrolases, como as -1,3-glucanases e endoquitinases, que

parecem ter propriedades antifngicas; lectinas, que se ligam glicoprotenas do

intestino e interferem na absoro dos nutrientes; protenas inativadoras de ribossomo;

protenas inibidoras de poligalacturonase, entre outras. Outras protenas estruturais ou

metablicas incluem componentes estruturais da parede celular, transportadores e

protenas estruturais associadas a membranas de clulas e organelas, e enzimas

(SHEWRY; LUCAS, 1997).

1.4 Protenas PR (Pathogenesis-Related)

As plantas so dispostas de uma variedade de mecanismos de defesa contra o

ataque de patgenos (SHARMA et al., 2011). Apesar da ausncia de sistema imunitrio,

que as torna susceptveis a organismos patognicos (HUYNH et al., 1992), as plantas

esto envolvidas numa variedade de mecanismos potentes de defesa que incluem a

sntese de compostos de baixo peso molecular (SELITRENNIKOFF, 2001). Estas

respondem induzindo a expresso de um vasto nmero de genes codificadores de

protenas que assumem um papel importante na defesa (COLLINGE et al., 1993).

24

Uma das respostas de defesa mais estudada diz respeito expresso de protenas

relacionadas com a patognese nas quais se inclui o grupo das quitinases (HUYNH et

al., 1992). Descrita pela primeira vez em 1911 por Bernard em orqudeas, o mesmo

autor observou atividade antifngica sensvel e termo resistente. Desde ento, essa

enzima considerada como parte de mecanismos de defesa que as plantas possuem

contra uma variedade de patgenos. O aumento significativo nos nveis de quitinase por

numerosos agentes abiticos (etileno, cido saliclico, solues salinas, oznio, luz UV)

e por fatores biticos (fungos, bactrias, vrus, virides componentes da parede celular

de fungos e oligossacardeos) embasam a afirmao anterior (GUPTA et al., 2010.).

O termo pathogenesis-related (PR) foi mais tarde introduzido, em 1980, pelo

grupo de trabalho de Antoniw e colaboradores (1980) tendo sido este definido como o

conjunto completo de protenas que so codificadas por uma planta hospedeira,

induzidas em condies de patogenicidade ou relacionadas com a mesma (DATTA;

MUTHUKRISHNAN, 1999). De acordo com a definio, qualquer protena produzida

pelo hospedeiro induzida por qualquer tipo de agente infeccioso, ou condio

comparvel, agrupada neste grupo; ainda assim, as caractersticas de incluso

implicam critrios de identificao como as propriedades qumicas ou a localizao

celular. Foi tambm introduzida a terminologia PR-like proteins de modo a designar as

protenas homlogas a PRs deduzidas a partir de sequncias de aminocidos ou

previstas pela sequncia nucleotdica de seu cDNA correspondente ou gene, mas cujo

desenvolvimento da induo feito controladamente, especificamente em determinados

tecidos (EDREVA, 2005).

O desenvolvimento da pesquisa em mecanismos de defesa das plantas conduziu

a um rpido e contnuo interesse nas quitinases, uma vez que foram as primeiras

protenas induzidas por patgenos cuja funo foi identificada (DATTA;

MUTHUKRISHNAN, 1999).

1.5 Quitinases: Definio e Classificao

A enzima quitinase (EC 3.2.1.14) hidrolisa o polmero de quitina para a N-acetil

glucosamina por qualquer uma das endo ou exo clivagens da ligao (1-4) (VAN

AALTEN et al., 2000). Essa classificada em vrias categorias com base no seu

isolamento, caractersticas funcionais e estruturais. Ela pertence as famlias 18 e 19 de

glicosil hidrolases (GH) (HENRISSAT; DAVIES, 1997), que so enzimas fundamentais

25

para o metabolismo de carboidratos (HENRISSAT, 1991). Estas duas famlias contm

endo e exo quitinases. Endoquitinases clivam aleatoriamente na cadeia de quitina

gerando polimeros ou oligomeros de NacGlc, como a quitotetraose, quitotriose e a

diacetilquitobiose. Enquanto as exoquitinases clivam a partir da extremidade redutora

ou no redutor da cadeia de quitina liberando monomeros de NacGlc. (DAHIYA et al.,

2006; SUZUKI et al., 1999).

A quitina (Figura 2) um biopolmero insolvel, linear e no ramificado de N-

acetil--D-glucosamina (2-acetamido-2-desoxi--D-glucopiranose; GlcNAc), com os

resduos de GlcNAc unidos por ligaes O-glicosdicas -(1,4) [nomenclatura IUPAC:

(14)-2- acetamido-2-desoxi--D-glucano], principal componente estrutural da parede

celular dos fungos e exoesqueleto dos artrpodes. considerado um dos polimeros

naturais mais importantes no mundo (RINAUDO et al., 2006).

Com base em similaridade de sequncias as quitinases podem ser classificadas

em 6 classes (KESARI et al., 2015). Como mencionado anteriormente, as mesmas so

agrupadas em duas grandes famlias: GH 18 (classes III e V, contm TIM barrel

domain) e GH19 (I, II, IV e VI). Segundo Kesari e colaboradoras (2015) as classes

pertencentes a GH18 possuem baixa similaridade de sequncia com as agrupadas em

GH19. GH18 amplamente distribuda entre os seres vivos, j GH19 parece ocorrer

principalmente em plantas e algumas bactrias (OHNUMA et al., 2011).

provvel que as quitinases das famlias GH18 e GH19 tenham evoludo de

ancestrais diferentes, pois alm de no compartilharem similaridade em suas seqncias

de aminocidos, possuem estruturas tridimensionais e mecanismos enzimticos

completamente diferentes. Assim, os domnios catalticos de quitinases da famlia

GH18 (Figura 3A) possuem uma estrutura tridimensional caracterizada por um barril

(/), ou barril TIM (triose fosfato isomerase) (BANNER et al., 1975), enquanto que

aqueles de quitinases da famlia GH19 (Figura 3B) tm um elevado contedo de -

hlices devido presena de resduos no polares na regio do ncleo e uma estrutura

semelhante aquelas encontradas em quitosanases e lisozimas (CHUANG et al., 2008).

26

Figura 2. Estrutura qumica de quitina.

(A) Estrutura em cadeira monomero de quitina: -(1-4)-N-acetil-D-glicosamina. (B)

Organizao espacial do polimero de quitina. Fonte: Rinaudo (2006).

Figura 3: Estrutura tridimensional de quitinases GH18 e GH19 de plantas definidas por

cristalografia disponveis noProtein Data Bank(PDB).

(A) quitinaseGH18 de Crocus vernuse cadeia A (PDB: 3SIM) ,(B) quitinase GH19 IV de

Norway spruce (PDB: 3HBD). Fonte:Protein Data Bank.

A B

A B

27

CAPTULO I

ANLISE IN SILICO DE PROTENAS LIGANTES QUITINA

PRESENTES NOS TRANSCRIPTOMA DE CAJUEIRO ANO

PRECOCE CCP76

28

2. ANLISE IN SILICO DE PROTENAS LIGANTES QUITINA

PRESENTES NOS TRANSCRIPTOMA DE CAJUEIRO ANO

PRECOCE CCP76

2.1 Transcriptoma

O transcriptoma o conjunto completo de transcritos (mRNAs, RNAs no

codificados e micro RNAs) em um tecido, e sua quantificao especfica para um

estgio de desenvolvimento ou condio fisiolgica (WANG et al., 2009). O processo

de evoluo das plantas envolve alteraes celulares, moleculares, fisiolgicas e

bioqumicas para se adaptar e sobreviver a condies adversas, como estresse bitico

causado por patgenos. As respostas moleculares nos perfis das plantas a nvel

transcricional tm demonstrado serem cruciais para o estabelecimento de um conjunto

de mecanismos de defesa contra patgenos invasores (FU et al., 2012).

Para estudar o transcriptoma de um organismo o mtodo que tem sido utilizado

atualmente a nova gerao de sequenciamento de DNA, denominada RNA-seq. O

mRNA utilizado para a sntese de cDNA, que ento sequenciado em equipamento de

altssima produtividade. A principal vantagem de RNA-seq a capacidade de

sequenciar uma grande proporo de transcritos presentes em uma amostra, incluindo os

de baixa expresso. Outra vantagem a de no necessitar de conhecimento prvio da

sequncia, como no caso de microarranjo onde se utiliza sequncias conhecidas para

mensurar a expresso gnica. Entretanto, o genoma de referncia de extrema

importncia para estudos de transcriptoma porque permite que seja feita a identificao

dos genes que esto sendo expressos em uma dada condio (CHEN et al., 2007).

A anlise de transcriptoma permite detectar quais tipos de transcritos esto sendo

expressos, incluindo RNA mensageiro (mRNA), variantes alternativos (derivado do

processo de splicing alternativo), RNA no codificador e pequenos RNAs(WANG; et

al., 2009).

Alves Filho (2013) utilizou a abordagem De novo para a montagem do primeiro

esboo do transcriptoma de sementes de cajueiro (A. occidentale L.), utilizando dados

sequenciados pela plataforma Illumina, que descrita na literatura como eficiente para a

verificao da expresso de genes, metilao do DNA, re-sequenciamento, bem como

29

para o sequenciamento de transcriptoma De novo (PARCHMAN et al., 2010; WANG et

al., 2010).

Sequenciamento do transcriptoma usando tecnologias Next Generation

Sequencing - NGS permite rpida e barata descoberta SNP dentro dos genes e evita

regies altamente repetitivas do genoma (MOROZOVA at al., 2008)

2.2 SNP-Single Nucleotide Polymorphism

As variaes allicas dentro de um genoma de uma mesma espcie podem ser

classificados em trs grandes grupos que incluem diferenas no nmero de repeties

em srie num local especfico (microssatlites, ou simples repetio de seqncia -

SSRS ) (WEBER et al. 1987), inseres/delees segmentares (indels) (OPHIR el al.

1997), e polimorfismos de nucleotdeo nico (SNPs) (WANG et al., 1998).

Single Nucleotide Polymorphism (SNP) so marcadores do tipo Polimorfismo de

nica Base que se baseiam em alteraes mais elementares da molcula de DNA, isto ,

mutaes em apenas uma das bases nitrogenadas da cadeia (Adenina, Citosina, Timina e

Guanina). As mutaes mais recorrentes so as do tipo transio, quando h troca de

purina por outra purina (A - G) ou de uma pirimidina por outra pirimidina (C - T), e

transverses, quando h a troca de uma purina por pirimidina e vice-versa (A/C, A/T,

G/C, G/T) (BROOKES, 1999).

Assim, na prtica, SNPs so marcadores bi-allicos, podendo ocorrer tri-allicos

em uma proporo menor, de forma que o contedo informativo em um nico SNP

limitado, em comparao com os marcadores microssatlites (SSR) que so poliallicos

(GRIFFIN; SMITH, 2000; GUPTA et al., 2001; ORAGUZIE et al., 2007).

Em primeiro lugar descobriu no genoma humano, os SNPs provou ser universal,

bem como as formas mais abundantes de variao gentica entre indivduos da mesma

espcie (GHOSH et al.,2002). Os SNPs ocorrem tanto em regies codificadoras como

em no codificadoras dos genomas. Em regies codificadoras, quando resultam em uma

substituio de aminocido na sequncia proteica, so denominados no sinnimos,

podendo a substituio ser conservativa ou no conservativa em funo das

caractersticas dos aminocidos envolvidos na troca. Nesses casos, pode haver

modificaes estruturais e funcionais na protena (GUIMARES; COSTA, 2002).

30

2.2. OBJETIVOS

2.2.1 Objetivo Geral

Identificar e descrever sequncias de proteinas ligantes quitina e identificar

SNPS no transcriptoma de A. occidentale var. nanum CCP76

2.2.2 Objetivos Especficos

Realizar uma nova montagem do transcriptoma usado por Garcia Filho (2013)

Identificar protenas ligantes quitina no transcriptoma de castanha de caju;;

Descrever sequncias de proteinas ligantes quitina no transcriptoma de

castanha de caju;

Realizar anlise de polimorfismo de nica base nos genes identificados

31

2.3 MATERIAIS E MTODO

2.3.1. Obteno das sequncias do transcriptoma do cajueiro

As sequncias do transcriptoma do cajueiro foram previamente obtidas de

trabalhos realizados por Alves-Filho (2013). Amostras de sementes De ano-precoce

CCP 76 foram coletadas em Itapipoca-CE. O RNA das sementes (ALVES-FILHO,

2013) foi extrado a partir das amostras congeladas em nitrognio lquido, no Ncleo de

Biotecnologia de Sobral e encaminhadas para sequenciamento no Laboratrio de

Biotecnologia Animal - Esalq-USP utilizando a plataforma Illumina HiSeq2000. O

sequenciamento das bibliotecas de cDNA foi do tipo paired-end e produziu reads de 50

pb.

2.3.2 Montagem do transcriptoma

Os dados foram processados em um computador HP proliant com 8 ncleos de

processamento e 16,7 Gb de memria RAM. Inicialmente as bibliotecas de reads brutos

(arquivos em formato fastq) foram avaliadas pelo programa FastQCa fim de determinar

a qualidade do sequenciamento. Os reads que apresentaram baixa qualidade foram,

ento,trimados (removidos) utilizando a ferramenta FastX Toolkit. A montagem De

novo foi realizada atravs do programa Velvetseguido por Oases. Os parmetros

utilizados foram: k-mer 31, valor de cobertura de 30, corte de cobertura de 30 e

tamanho mnimo do transcrito (arquivo de sada do Oases) de 300.

2.3.3 Identificao in silico de quitinases e triagem das sequncias com CDS

completo.

A identificao dos genes que codificam enzimas quitinases do cajueiro foi feita

pelo algoritmo Basic Local AlignmentSearch Tool (Com o programa BLASTx)

utilizando as sequncias do transcriptoma de sementes dos cajueiros ano-precoce

CCP76 contra os bancos de dados do Swiss-ProteTrEMBL. Os parmetros foram

ajustados para conter apenas sequncias com o E-value inferior ou igual a 1x10-5.

32

As sequncias dos bancos de dados foram obtidas pelo servidor UniProt e

filtradas por pesquisa booleana para exibir apenas sequncias de quitinases.

Posteriormente foi feita uma busca por genes com a regio CDS completa, atravs de

BLAST manual, alinhando os contigs do cajueiro contra os genes depositados no

Genbank do NCBI. Os genes de quitinases que apresentaram maior percentual de

identidade com os genes depositados no banco de dados, que possuam CDS completo,

foram selecionados e tiveram suas sequncias traduzidas, nos 6 frames de leitura,

utilizando a ferramenta translate tool do ExPASy (http://web.expasy.org/translate/), e as

sequncias traduzidas foram novamente alinhadas, por alinhamento global, utilizando o

software online ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/), a fim de

determinar seu grau de similaridade e verificar se alinhavam completamente.

2.3.4 Anlise de SNPs

Os contigs de CCP76 e Cajueiro comum foram alinhados no software do

MUMmer usando a ferramenta Nucmer. O arquivo de sada foi filtrado e utilizado a

ferramenta show-SNPs para obter as alteraes nucleotdicas. A partir do resultado

obtido, uma triagem foi feita pelas sequncias encontradas anteriormente da qual

somente uma apresentou SNP entre os gentipos. Em seguida, foi feito um alinhamento

global utilizando o Clustalw2 com as sequncias de nucleotdeos e aminocidos a fim

de ver a posio da substituio. Tambm foi feita uma modelagem por homologia

utilizando o SWISS-MODEL para analisar possveis modificaes na estrutura protica.

http://web.expasy.org/translate/http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/

33

2.4 RESULTADOS E DISCUSSES

2. 4.1 Montagem do transcriptoma utilizando o Velvet e Oases

Os parmetros utilizados para montagem para as bibliotecas de cajueiro ano

CCP 76 foi de 31 para o valor de k-mer, a cobertura esperada (Exp_cov) foi 30 e o valor

de corte de cobertura (Cov_cutoff) foi de 2.

Para a montagem do cajueiro ano CCP 76, foi utilizado um total de 42.786.272

reads e a montagem revelaram a presena de 2.243 contigs sendo que o maior deles

possui 5.382 nucleotdeos de tamanho. O valor de N50 460 com a montagem feita

utilizando 17,205 % dos reads. O programa Oases utilizou os dados processados pelo

Velvet adicionando como parmetro o menor transcrito possuindo 100 pb resultando em

68.811 transcritos (Tabela 2).

O resultado da montagem do Velvet foi otimizada aps a utilizao do programa

Oases, o qual reduziu o nmero de contigs. O programa Oases foi desenvolvido

especificamente para a montagem de transcriptomasDe novo usando reads curtos e leva

em considerao a montagem feita pelo Velvet.Garg e colaboradores (2011) sugerem

que a montagem no Velvet seguido pelo Oases produz os melhores contigs/transcritos.

Ashrafi e colaboradores (2012) obtiveram 68.737 contigs na montagem De novo

do transcriptoma de pimento (Capsicumannuum), utilizando o programa Velvet com

valor de k-mer de 31. No presente estudo, foram obtidos 68.811 contigs no cajueiro,

utilizando parmetros de montagem semelhantes aos utilizados por Ashrafi e

colaboradores.

Tabela 2 Estatsticas de montagem do transcriptoma de cajueiro CCP 76 usando o programa

Velvet/Oases.

Dados de Montagem - CCP76

Tamanho do k-mer 31

Cobertura esperada 30

Corte de cobrtura 2

Tamanho mnimo de contig 300

N de reads 42.786.272

N de ns 8.568

34

N50 460

Tamanho do maior contig 5.382

Porcentagem de reads usados 7.361.509 (17,205 %)

N de contigs 2.243

N de transcritos 68.811

Fonte: O Autor

2.4.2. Identificao e classificao dos transcritos

Na busca de genes pelo transcriptoma foram identificados dez sequncias que

obtiveram alguma similaridade com quitinases vegetais (Tabela 2). O primeiro contig

(Figura 4) identificado com de 1457 bases, obteve 86% de similaridade com a sequncia

de uma possvel quitinase de Ricinus communis (XP_002515664.1). Apresentando

regies conservadas que o caracteriza como pertencente superfamlia lisozima-like e

da famlia quitinase GH19 indo do resduo 428 ao 1136. Ainda apresenta outras duas

regies conservadas. A primeira de um possvel stio de ligao a acar que esto nos

resduos de nmero 518521(GGGA), 554557 (ATAA), 782788 (GTTGAAG),

800--803 (AGGA), 893896 (TTCC), 959962 (CTGG) e a segunda regio com

resduos catalticos de 794797 (GTAA), 893896 (TTCC), 959962 (CTGG).

Figura 4: Representao dos domnios conservados no contig identificado como quitinase de

Ricinus communis (XP_002515664.1).

Fonte: NCBI

O segundo contig (Figura 5), com 1325 bases, obteve 57% de similaridade com

uma endoquitinase PR4-like de Cicer arietinum (XP_012570981.1). Apresentando


da famlia quitinase GH19 indo do resduo 494 ao 1084. Ainda apresenta outras duas

35

regies conservadas. A primeira de um stio de ligao a carboidrato de resduos 386

388 (AGT), 392400 (TACGGTTAT), 404406 (GGC), 419421 (TAT) e a

segunda regio com resduos catalticos 674676 (GAA).

Figura 5: Representao dos domnios conservados no contig identificado como endoquitinase

PR4-like de Cicer arietinum (XP_012570981.1).

Fonte: NCBI

Tambm foi identificado um contig (Figura 6) com 1071 bases e 88% de

similaridade com uma quitinase de Mangifera indica (ACD69683.1). Apresentando


da famlia quitinase GH 19 indo do resduo 290877. Ainda apresenta outras trs

regies conservadas. A primeira de um stio de ligao a carboidrato nos resduos 173

175 (AGT), 179187 (TTTGGTTAC), 191193 (GGC), 206208 (TAC); a segunda

regio com resduos catalticos no residuos 467469 (GAA), 530532 (AAC), 590

592 (ACC) e um possvel stio de ligao a acar de resduos 467469 (GAA), 530

532 (AAC), 594596 (CAG), 599604 (TACAAC), 564566 (AAT), 800802

(AAG).


Mangifera indica (ACD69683.1).

Fonte: NCBI

36

O terceiro identificado com 1157 bases, esse contig (Figura 7) obteve 84% de

similaridade com uma quitinase-like de Citrus sinensis (XP_006488866.1).

Apresentando regies conservadas que o caracteriza como pertencente superfamlia

lisozima-like e da famlia quitinase GH19 indo do resduo 228938. Ainda apresenta

outras duas regies conservadas. A primeira de um possvel sitio de ligao a acar nos

resduos 402404 (AAA), 468470 (GAA), 561563 (CCT), 576581 (TACAAC),

807809 (TAT), 846848 (TCC); e a segunda regio com resduos catalticos no

resduos 402404 (AAA), 468470 (GAA), 567569 (TAC).

Figura 7: Representao dos domnios conservados no contig identificado como uma quitinase-

like de Citrus sinensis (XP_006488866.1).

Fonte: NCBI

Um contig (Figura 8), com 433 bases, obteve 78% de similaridade com uma

quitinase de Euonymus europaeus (AAP35272.1). Apresentando regies conservadas

que o caracteriza como pertencente superfamlia lisozima-like e da famlia quitinase

GH19. Ainda apresenta outra regio conservada com resduos catalticos na posio

104106 (GAA), 170172 (GAA), 551553 (TCT).


Euonymus europaeus (AAP35272.1).

Fonte: NCBI

37

Com 210 bases, um quinto contig (Figura 9) obteve 73% de similaridade com

uma endoquitinase PR4-like de Vitis vinifera (XP_010650683.1). Apresentando regies

conservadas com um stio de ligao a carboidrato nos resduos 811 (GCCA), 1423

(ATAGCCAAAT), 2629 (ACTG).


PR4-like de Vitis vinifera (XP_010650683.1).

Fonte:NCBI

Tambm foi identificado um contig (Figura 10) com 297 bases que obteve 77%

de similaridade com uma endoquitinase de Aegilops tauschii (EMT27212.1).

Apresentando regies conservadas do resduo 104 ao 297 que o caracteriza como

pertencente superfamlia lisozima-like e da famlia quitinase GH19.


Aegilops tauschii (EMT27212.1).

Fonte: NCBI

Com 306 bases, outro contig (Figura 11) obteve 83% de similaridade com uma

quitinase de Hevea brasiliensis (CAA09110.1). Apresentando regies conservadas que

o caracteriza como pertencente superfamlia lisozima-like e da famlia quitinase

GH18.

38

Figura 11: Representao dos domnios conservados no contig identificado como quitinase

Hevea brasiliensis (CAA09110.1).

Fonte: NCBI

Com 522 bases, esse contig (Figura 12) obteve 66% de similaridade com uma

endoquitinase PR4 de Vitis vinifera (XP_002274537.1). Apresentando regies

conservadas nos residuos 56 ao 476 que o caracteriza como pertencente superfamlia

lisozima-like e da famlia quitinase GH19. Ainda apresenta outra regio conservada

com resduos catalticos na posio 231233 (GAA).


PR4 de Vitis vinifera (XP_002274537.1).

Fonte: NCBI

Com 115 bases, esse contig (Figura 13) obteve 76% de similaridade com uma

quitinase de Vitis vinifera (ABD64687.1). Apresentando regies conservadas nos

residuos 2 ao 109 que o caracteriza como pertencente superfamlia lisozima-like e da

famlia quitinase GH18.


Vitis vinifera (ABD64687.1).

Fonte: NCBI

39

Tambm foi identificado um sequncia que obteve similaridade com albumina

vegetal. O contig identificado (Figura 14) com de 490 bases, obteve 100% de

similaridade com uma sequncia de uma albumina 2S de Anacardium occidentale

(AAL91665.1). Este apresenta regies conservadas que o caracteriza como pertencente

subfamilia de inibidores de alfa-amilase (AAIs) e protenas de armazenamento de

sementes (SS) indo do resduo 128--311. Ainda apresenta outras duas regies

conservadas. A primeira de um possvel stio de ligao alfa-amilase que esto nos

resduos de nmero 128131(AAAC), 251254 (CTCT), 272281 (CCTTCTGTCT)

e a segunda regio de interface de dmeros de 128131 (AAAC), 251254 (CTCT),

272281 (CCTTCTGTCT), 137140 (GCCC), 155158 (ACTG), 163166

(TTCA), 185188 (TTCA)

Figura14: Representao dos domnios conservados no contig identificado como albumina 2S

de Anacardium occidentale (AAL91665.1).

Fonte: NCBI

A subfamlia AAI_SS composta por protenas que so simultaneamente

inibidoras da alfa-amilase (AAI) tem funo de armazenamento em sementes (SS). So

encontradas principalmente nas sementes de plantas superiores. AAI desempenham um

papel importante nas defesas naturais das plantas contra insetos e organismos

patognicos tais como fungos, bactrias e vrus. AAI impedem a digesto de amido e

protenas de plantas por inibio alfa-amilases e proteases digestivas. Tambm esto

includos nesta subfamlia so protenas SS tais como albumina 2S, gama-gliadina,

napina, e prolaminas. Estas protenas aais e SS so tambm conhecidos alergnios em

humanos. (STROBL et al., 1998; KUMARI; HOORN, 2011)

40

Tabela 3: Protenas ligantes quitina identificadas manualmente pelo Blastx no transcriptoma de semente de Cajueiro ano-precoce CCP76.

N de acesso Protena Organismo Tamanho Similaridade Famlia Sitio Locus F L

XP_002515664.1 Quitinase Ricinus communis 1457 86% GH19 Acar, cataltico 410 -2

XP_012570981.1 Endoquitinase

PR4-like

Cicer arietinum 1325 57% GH19 Carboidrato,

cataltico

1421 +2

ACD69683.1 Quitinase Mangifera indica 1071 88% GH19 Acar, cataltico,

carboidrato

4849 +2

XP_006488866.1 Quitinase-like Citrus sinensis 1157 84% GH19 Acar, cataltico 5472 +3

AAP35272.1 Quitinase Euonymus europaeus 433 78% GH19 Cataltico 8370 +2

XP_010650683.1 Endoquitinase

PR4-like

Vitis vinifera 210 73% ChtB Carboidrato 8715 -3

EMT27212.1 Endoquitinase Aegilops tauschii 297 77% GH19 11904 -2

CAA09110.1 Quitinase Hevea brasiliensis 306 83% GH18 17280 +3

XP_002274537.1 Endoquitinase PR4 Vitis vinifera 522 66% GH19 17811 +3

ABD64687.1 Quitinase Vitis vinifera 115 76% GH18 56367 +2

AAL91665.1 Albumina 2S Anacardium occidentale

490 100% AAI_SS Ligao alfa-

amilase

-1

Fonte: NCBI

41

2.4.3 Identificao de SNP nos contigs identificados

Na busca por SNPs nos contigs identificados como quitinases foi observado a

presena de uma alterao nucleotdica em apenas um dos genes identificados. Essa

mutao foi observada no primeiro contig de cajueiro ano-precoce CC76 (Figura 4) de

1457 bases e 86% de similaridade com uma sequncia de uma possvel quitinase de

Ricinus communis quando comparado com o mesmo gene de cajueiro gigante. Na

posio 1113 do contig de CCP76 h uma citosina, enquanto no contig correspondente

de cajueiro comum h uma adenina na posio 1032 (Figura 15) em uma regio

codificante. H uma predominncia de SNPs em regies codificantes, o que observado

no trabalho de Klheim et al, (2009). Segundo Gonzales Martinez e colaboradores

(2006), SNPs localizados em regies codificantes tm grande importncia por ser mais

provvel que estas variaes nucleotdicas tenham algum tipo de significado funcional,

em nvel fenotpico, nos organismos.

Figura 15: Alinhamento de nucleotdeos realizado pelo programa Clustal verso 2.0.10,

comparando Cajueiro ano-precoce e gigante na procura de SNPs.

A regio destacada em vermelho mostra a localizao dos SNP. Fonte: autor.

Essa alternncia de nucleotdeo caracteriza uma transverso, quando a

substituio do nucleotdeo de uma purina para uma pirimidina nesse caso. A mutao

observada nesse estudo no acorre com maior frequncia, as substituies por transio

tem com maior ocorrncia no genoma de diversos organismos (LEWIN, 2008). Embora

as variaes de transio ocorram numa frequncia mais alta que as transverses em

genomas eucariotos, possivelmente como resultado de mecanismos moleculares pelos

quais so geradas, existem evidencias que isso no universal (KELLER et al., 2007).

Em trabalhos realizados com cafeeiros, foram encontrados 80% de mutaes causadas

42

por transverses e 20% decorrentes de transies (ZARATE et al., 2010), o que embasa

ocorrncia de uma transverso nesses contigs.

Essa mutao ocasionou uma mudana no cdon codificante que resultou em

uma alterao no aminocido codificado de uma arginina (R), carregado positivamente,

no CCP76 para uma leucina (L), apolar, no cajueiro gigante na posio 75 da protena

(Figura 16). Esse um caso de mutao no sinnima, isto , a mudana no cdon

gerou alterao do aminocido. Essa alternncia no ocorreu em uma estrutura

funcional (Figura 17), dessa forma, presume-se que sua funo no foi afetada.

Figura 16: Alinhamento de aminocidos realizado pelo programa Clustal verso 2.0.10,

comparando Cajueiro ano-precoce e gigante na procura de SNPs.

A regio destacada em vermelho mostra a localizao dos SNP. Fonte:autor

Figura 17 Estrutura Tridimensional das sequncias de quitinases GH19 de cajueiros ano-

precoce CCP76 e Gigante mostrando posio da substituio do resduo de aminocido.

(A) quitinase GH19 de CCP76 ,(B) quitinase GH19 Cajueiro Gigante. Fonte:Protein Data Bank.

43

2.5 CONCLUSO

Foram detectados 10 contigs com sequncias semelhantes quitinases de

diversos organismos. Ainda foram identificados domnios conservados de stios

catalticos e de ligao a carboidratos e acares. No contig identificado como quitinase

de Ricinus communis observou-se a presena de um SNP havendo uma substituio de

nucleotideo do tipo transverso no qual resultou um mutao no sinnima. Foi

identificado um contig com 100% de similaridade com uma albumina 2S de

Anacardium occidentale apresentando regies conservadas que o caracteriza

pertencente subfamlia AAI_SS e dominios conservados de stio de ligaco alfa-

amilase e regio de interface de dmeros.

44

CAPTULO II

CARACTERIZAO DE PROTEINAS DE CASTANHA DE

CAJU (Anacardium occidentale var. nanum) LIGANTES QUITINA

E AVALIAO DO SEU EFEITO INIBITRIO NO

CRESCIMENTO MICROBIANO

45

3 CARACTERIZAO DE PROTEINAS DE CASTANHA DE CAJU

(Anacardium occidentale var. nanum) LIGANTES QUITINA E AVALIAO

DO SEU EFEITO INIBITRIO NO CRESCIMENTO MICROBIANO

3.1 Albumina 2S

A primeira albumina 2S foi isolada a partir de soja corresponde a uma cadeia

polipeptdica rica em cido asprtico com massa molecular aparente 4.4 kDa (ODANI,

KOIDE; ONO, 1987). As albuminas 2S podem ser consideradas um dos maiores grupos

de protenas presentes nos tecido de reserva da semente, juntamente com as globulinas

(BERROCAL-LOBO et al., 2002).So protenas solveis em gua, amplamente

distribudas por sementes de dicotiledneas e monocotiledneas, so ricas em cistena,

arginina, glutamina e asparagina (MONSALVE et al., 2007).Seu nome devido ao

coeficiente de sedimentao prximo a 2S(DA SILVA et al., 1996), e est foi relatada

em sementes de importncia comercial, como a soja (LIN et al., 2006) e amendoim

(LEHMANN et al., 2006 ).

Estas protenas podem ser classificadas de acordo com a distribuio conservada

das cistenas ao longo da cadeia polipeptdica (KREIS et al., 1985) como pertencentes

superfamlia das prolaminas, que incluem tambm inibidores de tripsina e -amilase do

tipo cereal, puroindolinas e protenas de transferncias de lipdeos no especficos. Elas

so produzidas no retculo endoplasmtico rugoso e depositadas em vacolos

especficos, onde atuam principalmente como reserva proteica para o desenvolvimento

do embrio at a formao da radcula (LEE et al., 2003). Contudo, estudos comprovam

que as albuminas 2S tambm esto associadas processos regulatrios durante o

desenvolvimento do embrio, por apresentarem atividade antimittica(GALVEZ; DE

LUMEN, 1999)

As albuminas 2S podem ser compostas por duas cadeias polipeptdicas unidas

por duas pontes dissulfeto, sendo que a cadeia curta apresenta aproximadamente 3 a

5kDa e a cadeia longa apresenta aproximadamente 8 a 10 kDa (Figura 1), sendo ambas

codificadas por um mesmo gene (KOPPELMAN et al., 2004).

46

Figura18 - Estrutura tridimensional obtida por RMN de albumina 2S isolada de Brassica napus

(PDB 1PNB).

A estrutura em verde indica a cadeia curta - com duas - hlices, enquanto a estrutura em azul

indica a cadeia longa, com trs -hlices. As ligaes em vermelho indicam as pontes dissulfeto.

Fonte: Protein Data Bank - PDB

Alm da 2S apresentar atividade contra tripsina, como j citado anteriormente

muito destas protenas apresentam potencial biotecnolgico, podendo atuar como

agentes emulsificantes (BURNETT et al., 2002) , fungicidas (RIBEIRO, 2010),

bactericidas (NETO, 2009), Ribonuclease RNAse (FANG; WONG; LIN; NG, 2010)

atividade alergnica em humanos (NASCIMENTO et al., 2011).

As albuminas 2S podem estar associadas tambm reaes alrgicas. Embora o

mecanismo ligado ao potencial alergnico das albuminas, estudo indicam que essa

caracterstica pode estar relacionado regio denominada regio hiper varivel, que

corresponde aos aminocidos 30 -50, sendo possvel que este loop seja responsvel por

desencadear a produo de anticorpos do tipo IgG (Imunoglobulina do tipo G) e IgE

(Imunoglobulina do tipo E), o que desencadeia a produo de histamina, causando a

reao alrgica (MONSALVE et al., 2007).

47

3.2 OBJETIVOS

3.2.1 Objetivo Geral

Avaliar o perfil de protenas ligante quitina presentes em castanha de caju e o

efeito inibidor microbiano de albumina 2S ligante a quitina.

3.2.2 Objetivos Especficos

Extrair protenas das castanhas de caju;

Fazer uma cromatografia de afinidade em matriz de quitina;

Fazer eletroforese em gel de poliacrilamida com presena de SDS das pores

retidas na matriz cromatogrfica;

Precipitar protenas em sulfato de amnio;

Fazer eletroforese em gel de poliacrilamida com presena de SDS das fraes;

Fazer um teste de concentrao mnima inibitria contra microrganismos;

Realizar ensaio de atividade antibiofilme.

Quantificao da biomassa do biofilme

48

3.3 MATERIAIS E MTODOS

3.3.1 Extrao de protenas das Castanhas de CCP076

A fim de obter o melhor rendimento protico para uma posterior anlise da

atividade quitinsica foram preparados nove tampes de extrao com diferentes nveis

de pH . Os tampes utilizados foram:tampo glicina-HClpH2 e pH3; tampo acetato de

sdio pH4 e pH5; tampo fosfato de sdio pH6 e pH7, tampo tris-HClpH8;tampo

glicina-NaOH pH9 e pH10, todos em uma concentrao de 50mM.

A castanha do caju foi macerada com nitrognio liquido. A farinha obtida, ento,

foi de lipidada em acetona e misturada em tampo de extrao na proporo de 1:14

(M/V) e deixada sob agitao por 2 horas a 25 C. Em seguida a soluo foi

centrifugada a 12.000 x g por 20 minutos a 4 C e coletado o sobrenadante.Os extratos

obtidos foram imediatamente utilizados para as anlises ou armazenados a -20 C.

3.3.2 Determinao da concentrao de protenas

A concentrao de protenas solveis foi determinada usando a metodologia

descrita por Bradford (1976). A cada 100 L de amostra (diluda ou no) foram

adicionados 2,5 mL do reagente de Bradford, e a mistura agitada e deixada em repouso.

As leituras de absorbncia a 595 nm foram realizadas a seguir, em espectrofotmetro

Genesys 10UV Scanning (Thermo Fischer Scientific - Waltham, MA, USA). A

concentrao proteica foi estimada utilizando uma curva obtida a partir de

concentraes conhecidas de albumina srica bovina (BSA).

3.3.3 Atividade Quitinsica

A atividade quitinoltica foi determinada segundo o mtodo colorimtrico

descrito por Boller (1985), tendo como parmetro a liberao de N-acetil-D-

glucosamina a partir da ao hidroltica da protena sobre a quitina coloidal, obtida a

partir de quitosana (MOLANO et al., 1977), pela metodologia descrita por Boller

(1992).

As amostras (250 L) foram incubadas com quitina coloidal 1% (m/v) (250 L)

a 37 C, por 1 h, com agitao constante A reao foi interrompida por aquecimento a

49

100 C, em banho-maria, por 5 min. Aps resfriamento, as amostras foram

centrifugadas (13.000 x g, 10 min, a 25 C) e o sobrenadante (300 L) foi transferido

para novo tubo, contendo - glucuronidase (10 L). A mistura foi incubada a 37 C por

1 h e a reao interrompida por aquecimento (100 oC, 5 min). Em seguida, tampo

acetato de sdio 0,05 M pH 5,2 (100 L) e tetraborato de potssio 0,6 M (190 L)

foram adicionados mistura, que foi novamente aquecida (100 C, por exatos 5 min).

Aps resfriamento em banho de gelo, foi adicionada soluo de p- dimetil amino

benzaldedo [DMAB 10% (m/v) preparado em cido actico contendo 12,5% de HCl

11,5 M] diluda 1x em cido actico PA. A mistura foi incubada a 37 C por 20 min e, a

leitura da absorbncia a 585 nm foi realizada.

Para o clculo da quantidade de acar liberado na reao, foi utilizada uma

curva padro construda a partir de concentraes conhecidas de N-acetil-D-

glucosamina, variando de 100 a 1.000 M (REISSIG et al., 1955). Uma unidade de

atividade enzimtica (U) foi definida por 1nmol de GlcNAc.

3.3.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida em presena de SDS (PAGE-SDS)

A eletroforese de protenas (SDS-PAGE) foi realizada segundo protocolo de

Laemmli (1970), com modificaes para montagem dos gis (espessura de 2 mm) entre

placas de vidro. O gel de concentrao continha acrilamida 4% e SDS 1%, e foi

montado em tampo Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, enquanto que o gel de separao possua

acrilamida 15% e SDS 1%, montado em tampo Tris-HCl 3 M pH 8,8. As amostras a

serem analisadas foram diludas em tampo de amostra [Tris-HCl0,0625 M, pH 6,8;

SDS 2% (m/v) e azul de bromofenol 0,001%(m/v)], aquecidas a 100 C por 7 min,

resfriadas a temperatura ambiente. A corrida eletrofortica foi realizada a voltagem

constante de 120 V em tampo decorrida Tris-HCl 0,025 M pH 8,3, contendo glicina

0,192 M e SDS 0,1% (m/v). Aps acorrida, os gis foram corados com soluo de Azul

Brilhante de Coomassie R-250 0,2%(m/v), preparado em metanol 50% (v/v), cido

actico 10% (v/v). Para deteco das bandas de protenas, e descorados com uma

soluo deisopropanol 12,5% (v/v), cido actico 10% (v/v).

50

3.3.5 Cromatografia de afinidade em matriz de quitina

A cromatografia foi realizada utilizando uma matriz de quitina bruta lavada com

HCl 0,1 M, NaOH 0,1 M e gua. Aps a montagem a coluna foi equilibrada em tampo

acetato de sdio no mesmo pH de extrao da amostra. Os picos retidos foram eludos

com cido actico 0,1 M e 0,5M e logo em seguida foram dialisados contra tampo

acetato de sdio 50 mM no mesmo pH do equilbrio.

No processo cromatogrfico, o fluxo de eluio foi de 1mL/min,cada alquota

com 3 mL. Todas elas foram analisadas por medida da absorbncia a 280 nm (A280) em

espectrofotmetro Genesys 10UV Scanning (Thermo Fischer Scientific - Waltham, MA,

USA).

3.3.6 Precipitao com Sulfato de Amnio

O extrato proteico foi submetido precipitao com sulfato de amnio

(NH4)2SO4, empregando trs intervalos de saturao: 0-30% (m/m), 30-60% (m/m), 60-

90% (m/m). A cada saturao com sulfato de amnio a soluo foi deixada em descanso

por uma noite (overnight), centrifugada a 12.000 x g por 20 minutos e coletado o

precipitado.

3.3.7 Ensaio de atividade antimicrobiana (CIM)

A atividade antibacteriana do extrato dever ser verificada segundo o teste

de microdiluio em placas de poliestireno de 96 poos, padronizada segundo a diretriz

M07 A 9 edio, Metodologia para Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos por

Diluio para Bactrias de Crescimento Aerbico (CLINICAL AND LABORATORY

STANDARDS INSTITUTE, 2012).

Para o teste com a albumina, cada poo da placa ser preenchido com 100

L de meio de cultura SDB caldo estril com exceo da primeira linha, a qual vai ser

preenchida com 200 L da frao proteica na concentrao de 1.640 g.mL. Sero

feitas diluies seriadas na base dois para obteno de diferentes concentraes

proteicas. Em seguida 100 L de bactria 2 x 106 UFC.mL-1sero adicionados aos poos

da placa obtendo um volume final de 200 L com concentrao bacteriana de 1 x 106

UFC.mL-1. Os poos que contiver apenas inculo e meio de cultura SDB caldo estril

51

devero ser utilizados como controle de crescimento da bactria e poos que tiverem os

tratamentos antimicrobianos sem a presena de inoculo sero utilizados como controle

de turbidez. Para determinao da Concentrao Inibitria Mnima (CIM), ser

considerada a menor concentrao de capaz de inibir visualmente o crescimento

bacteriano aps 24 h de incubao.

3.3.8 Ensaio de atividade antibiofilme

As placas de poliestireno de fundo chato sero montadas como descrito

anteriormente. Entretanto, aps 24 h de incubao aerbica em estufa a 37 C a

biomassa do biofilme formado ser quantificada atravs da colorao com Cristal

Violeta (CV) como descrito a seguir.

3.3.9 Quantificao da biomassa

Para a quantificao da biomassa com CV, as clulas planctnicas sero

removidas e os poos lavados trs vezes com gua destilada. Aps secagem da placa a

temperatura ambiente, 200 L de lcool metlico P.A. sero adicionados e deixados em

contato por 15 minutos para fixao das clulas aderidas. Aps a remoo do metanol,

200 L de CV 0,1% sero ainda adicionados por 10 minutos para permitir uma

quantificao indireta da biomassa do biofilme atravs da colorao. Em seguida o CV

ser removido e repetir-se- o processo de lavagem e secagem da placa onde sero

adicionados 200 L de cido actico 33% por 10 minutos para dissoluo do corante

preso ao biofilme. A suspenso obtida em cada poo ser transferida para uma nova

placa de 96 poos e ser realizada a medio da absorbncia com o auxlio de um leitor

de microplacas a 590 nm.

52

3.4 RESULTADOS E DISCUSSES

A partir de evidencias da presena de quitinases no transcriptoma do Cajueiro

ano-precoce CCP76 resolveu-se avaliar as condies nas quais as proteinas ligantes

quitina atuam. Os estudos sobre quitinases em Anacardium occidentale so escassos. O

nico trabalho envolvendo essa enzima foi publicado em 1991 por Marques e Xavier

Filho. Esse trabalho avalia a atividade enzimtica e inibitria do exsudato do cajueiro

mostrando a presena de quitinase.

Devido a essa escassez de dados referentes presena de quitinases e sua

atividade cataltica em Anacardium occidentale foi iniciada uma investigao para

determinar as condies ideais de funcionamento dessas protenas nas sementes desse

organismo.

3.4.1 Extrao de protenas solveis

A fim de obter o melhor rendimento proteico para uma posterior anlise da

atividade quitinsica foram preparados nove tampes de extrao com diferentes nveis

de pH. Os extratos proteicos apresentaram as seguintes concentraes: 0,38 mg/ml em

tampo glicina-HCl pH2;1,62 mg/ml em tampo glicina-HCl pH3;1,17 mg/ml em

tampo acetato de sdio pH4;3,89 mg/ml em tampo acetato de sdio pH5;5,79 mg/ml

em tampo fosfato de sdio pH6;12,65 mg/ml em tampo fosfato de sdio pH7, 15,24

mg/ml em tampo tris-HCl pH8; 15,17 mg/ml em tampo glicina-NaOH pH9; 16,18

mg/ml em tampo glicina-NaOH pH10 (Grfico 1).

Silva e coladoradores (2012) observaram uma maior concentrao de protenas

totais de Eichhornia crassipes utilizando tampes de extrao com nveis de pH mais

elevados corroborando com os resultados obtidos nesse trabalho. Tonelli e

colaboradores (2015) tambm conseguiram um maior rendimento proteico usando um

tampo mais alcalino para extrao proteica de sementes de Albizianio poides.

3.4.2 Ensaio da atividade quitinsica

As condies para que uma quitinase seja ativa so bastante variveis de acordo

com o organismo em que atua ou produzida de maneira heterloga. A quitinase da

classe III de Bambusa oldhamii tem sua atividade quitinsica estvel em pH 3,0 e 4,0

53

(KUO et al., 2008). J a endoquitinase de Limonium bicolor, produzida em Pichia

pastoris, que tem sua atividade quitinsica mantida estvel em uma faixa de pH 3,0

pH 10,0 (LIU et al., 2010).

Desse modo, para chegar condio tima de atividade das quitinases presentes

na amndoa do caju CCP076 foi realizado um ensaio quitinoltico de todos os extratos

proteicos brutos em seus respectivos valores de pH. Os extratos proteicos apresentaram

as seguintes atividades totais: 580,50 U em tampo glicina-HClpH2; 580,50 U em

tampo glicina-HCl pH3; 446,55 U em tampo acetato de sdio pH4; 626,35 U em

tampo acetato de sdio pH5; 548,64 U em tampo fosfato de sdio pH6; 473,09 U em

tampo fosfato de sdio pH7, 252,59 U em tampo tris-HCl pH8; 208,38 U em tampo

glicina-NaOH pH9; em tampo glicina-NaOH pH10 no houve atividade (Grfico 1).

Aps observaros extratos com pH 4, 5 e 6 com os resultados mais promissores, na

atividade quitinoltica total (Grfico 2) e da atividade por ml obtido (Grfico 3), as

anlises seguiram como descritas posteriormente. Antes de dar continuidade com a

investigao, as amostras foram submetidas a uma dilise para certificar-se do pH

presente na amostra, visto que foi observada uma mudana desse nos extratos proteicos

(dados no mostrados).

Grfico 1 Concentrao de protenas solveis em mg/ml em diferentes tampes de extrao.

pH

2

pH

3

pH

4

pH

5

pH

6

pH

7

pH

8

pH

9

pH

10

0

5

1 0

1 5

2 0

Pro

ten

as

so

lv

eis

mg

/mL

pH2 (tampo glicina-HCl), pH3 (tampo glicina-HCl), pH4 (tampo acetato de sdio), pH5

(tampo acetato de sdio), pH6 (tampo fosfato de sdio), pH7 (tampo fosfato de sdio), pH8

(tampo tris-HCl) pH9 (tampo glicina-NaOH) pH10 (tampo glicina-NaOH). Fonte:autor.

54

Grfico 2 Atividade quitinsica total dos extratos proteicos em diferentes pH.

pH

2

pH

3

pH

4

pH

5

pH

6

pH

7

pH

8

pH

9

pH

10

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

Ati

vid

ad

e T

ota

l (U

)

Valores de pH em que ocorreram a atividade quitinsica: pH2(tampo glicina-HCl), pH3

(tampo glicina-HCl), pH4 (tampo acetato de sdio), pH5 (tampo acetato de sdio), pH6

(tampo fosfato de sdio), pH7 (tampo fosfato de sdio), pH8 (tampo tris-HCl) pH9 (tampo

glicina-NaOH) pH10 (tampo glicina-NaOH). Fonte: autor

Grfico 3 Atividade quitinsica em unidades em cada 1mL (U/mL) dos extratos proteicos em

diferentes pH

pH

2

pH

3

pH

4

pH

5

pH

6

pH

7

pH

8

pH

9

pH

10

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Ati

vid

ad

e (

U/m

L)

Valores de pH dos tampes em que ocorreram a atividade quitinsica: pH2(tampo glicina-

HCl), pH3 (tampo glicina-HCl), pH4 (tampo acetato de sdio), pH5 (tampo acetato de

sdio), pH6 (tampo fosfato de sdio), pH7 (tampo fosfato de sdio), pH8 (tampo tris-HCl)

pH9 (tampo glicina-NaOH) pH10 (tampo glicina-NaOH). Fonte: autor

55

Novos ensaios quitinolticos foram realizados com os extratos dialisados e uma

alterao no padro dos resultados foi observada (Grfico 4). Houve uma significante

reduo da atividade quitinoltica no pH 4 aps a dilise de 3117 U para 1339U -

reduzindo o potencial de uso das enzimas nessa faixa de pH. O extrato no pH 5 manteve

a mesma faixa de atividade de antes da dilise e no pH 6 houve um aumento da

atividade enzimtica indo de 1623 U para 2403 U. Quando feita uma proporo das

unidades enzimticas pelo volume do extrato (Grfico 5), tambm se observou o extrato

com pH 5 com a maior atividade quitinoltica. As protenas relacionadas patognese,

como as quitinases, apresentam propriedades fsico-qumicas tpicas como estabilidade

em pH baixo, corroborando com os resultados obtidos. Essas protenas ainda so

resistentes a ao de enzimas proteolticas e possuem estabilidade trmica

(CAVALCANTI; BRUNELLI; STANGARLIN, 2005).

Quitinases extradas de sementes de Cucumis melo e Tamarindus indica

apresentaram atividade em pH 5 (WELBAUM et al., 2003; KUMAR et al.,2009).

Endoquitinases de Zea mays e Coix lachryma-jobi mostratam pH timo no mesmo valor

e mesmo tampo desse estudo (ZHE-FU, 1992). Assim como, Chang e colaboradores

(2014) que isolaram uma endoquitinase da famlia GH19 de Glycine max nas mesmas

condies corroborando com os resultados obtidos nesse estudo. Quitinases de sementes

de lentilha vermelha (Lens culinaris) demonstraram atividade enzimtica e inibitria em

pH 5 (WANG , 2007).

3.4.3 Cromatografia de afinidade em matriz de quitina

Aps a eleio do pH 5 como o ideal para a atividade das quitinases presentes no

proteoma da castanha, o extrato proteico sob essas condies foi submetido a uma

cromatografia com matriz de quitina a fim de selecionar as protenas com domnio de

ligao quitina das demais. A cromatografia apresentou um perfil com dois picos

principais. O primeiro pico eludo com acido actico a 0,1 M apresentou uma

absorbncia de 2,372 nm na frao 55, enquanto o segundo, eludo com acido actico

0,5 M , apresentou absorbncia de 218 nm na frao 85.

56

Grfico 4 Atividade quitinsica total dos extratos proteicos em diferentes pH antes e depois da

dilise.

Valores de pH dos extratos proteicos em que ocorreram a atividade quitinsica: pH4:(tampo

acetato de sdio), pH5 (tampo acetato de sdio), pH6 (tampo fosfato de sdio); pH4D extrato

dialisado, pH5D extrato dialisado, pH6D:extrato dialisado. Fonte: autor

Grfico 5 Atividade quitinsica em unidades em cada 1mL (U/mL) dos extratos proteicos em

diferentes pH antes e depois da dilise.

Valores de pH dos extratos proteicos em que ocorreram a atividade quitinsica: pH4:(tampo

acetato de sdio), pH5 (tampo acetato de sdio), pH6 (tampo fosfato de sdio); pH4D extrato

dialisado, pH5D extrato dialisado, pH6D:extrato dialisado. Fonte: autor.

pH

4

pH

5

pH

6

pH

4 D

pH

5 D

pH

6 D

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

Ati

vid

ad

e T

ota

l (U

)

pH

4

pH

5

pH

6

pH

4 D

pH

5 D

pH

6 D

0

2 0

4 0

6 0

8 0

Ati

vid

ad

e (

U/m

L)

57

Grfico 6: Cromatografia de afinidade realizada com matriz de quitina do extrato proteico em

tampo acetato de sdio pH5.

Equilbrio: tampo acetato de sdio50mM a pH 5; Eluio: acido actico 0,1 M (a) e 0,5 M (b)

em fluxo constante de 1 mL/min. Fonte:autor.

Esse perfil cromatogrfico (Grfico 6) evidencia a presena de dois tipos de

protenas ligantes a quitina com interaes diferentes no stio de ligao. A primeira

frao proteica com uma ligao mais fraca e a segunda frao com uma interao mais

forte. A fim de avaliar a atividade quitinoltica das protenas retinas na matriz, alm de

sua afinidade quitina, foi realizado um ensaio quitinsico nas fraes cromatograficas.

Foram submetidas atividade o pico no retido e as fraes eludas com acido actico

0,1M e 0,5M (Grficos 7 e 8).

A frao no retida apresentou atividade cataltica, assim como, a primeira

frao, eluda com cido actico 0,1M, apresentou atividade quitinsica. A concentrao

protica submetida cromatografia pode ter sido superior a quantidade mxima de

ligao da matriz deixando-a saturada, dessa forma, quitinases podem ter passado pela

matriz sem ligar-se quitina dando frao no retida um perfil cataltico. A primeira

frao apresentou atividade cataltica assim como afinidade ao substrato, evidenciando

quitinases com dois domnios em sua estrutura. O perfil proteico da frao no retida e

dos picos retidos mostrado no SDS-PAGE (Figura 19).

58

Grfico 7 - Atividade quitinsica total dos picos cromatogrficos do extrato em tampo acetato

de sdio pH 5,0.

PNR: Pico no retido na matriz de quitina; PR0,11: Pico retido na matriz de quitina e eludo

com cido actico 0,1M ; PR0,5: Pico retido na matriz de quitina e eludo com cido actico

0,5M. Fonte: autor

Grfico 8 - Atividade quitinsica (U/mL) dos picos cromatogrficos do extrato em tampo

acetato de sdio pH 5,0.

PNR: Pico no retido na matriz de quitina; PR0,11: Pico retido na matriz de quitina e eludo

com cido actico 0,1M ; PR 0,12: Pico retido na matriz de quitina e eludo com cido actico

0,1M; PR0,5: Pico retido na matriz de quitina e eludo com cido actico 0,5M. Fonte: autor

PN

R

PR

0,1

.1

PR

0,1

.2

PR

0,5

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Ati

vid

ad

e (

U/m

L)

59

O segundo pico, retido na matriz de quitina e eludo com cido actico 0,5M,

no apresentou atividade quitinsica. Esse resultado uma evidncia da presena de

quitinase-like (QTL) que corrobora com os resultados adquiridos in silico. No

transcriptoma analisado foi identificado contigs com alto grau de similaridade com

quitinases-like de Cicer arietinum, Citrus sinensis e Vitis vinifera embasando a

afirmao anterior. Essas proteinas compartilham alta similaridade na estrutura e

sequncia com quitinases das famlias GH18 e 19, podendo no ter a ligao ou

atividade cataltica devido presena de substituies no domnio de ligao quitina.

(KESARI et al., 2015) A anlise gentica molecular revela que os acontecimentos da

duplicao de genes, seguido de mutao no gene da quitinase existente resultaram na

perda dessa atividade (BUSSINK et al., 2007).

As QTLs tm um grande potencial biotecnolgico, elas so conhecidas por inibir

o crescimento dos fungos pela inibio de xilanases fngicas (PAYAN et al., 2003;

KUMAR et al., 2010). Em outras protenas tais DLQ evoluiram para reconhecer

molculas de quitina desempenhando assim um papel importante nos processos de

crescimento e desenvolvimento (KESARI et al., 2015)

Figura 19: Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 15% de protenas de amndoas

de cajueiro extradas e fracionadas em pH5 e coradas com de Azul Brilhante de Coomassie R-

250.

MW/KDa: marcador de baixo peso molecular com bandas variando de 14,4 a 97 KDa. Ext:

extrato proteico extrado em tampo acetato de sdio com pH5. ExtD: Extrato proteico

dialisado. NR: pico no retido na matriz cromatogrfica; P1: Pico eludo com acido actico

0,1M; P2: pico eludo com cido actico 0,1M; P3: Pico retido com cido actico 0,5M. Fonte:

autor.

60

3.4.4 Avaliao de albuminas 2S presentes na castanha de CCP076

As protenas foram extradas em tampo glicina pH 2 e logo em seguida

submetidas a um fracionamentos por sulfato de amnio. Aps o fracionamento, a

concentrao proteica foi mesurada e os precipitados foram submetidos a uma

eletroforese SDS-PAGE (Figura 20). O extrato proteico bruto apresentou uma

concentrao de 0,3 mg/mL, a frao 0-30% apresentou uma concentrao de 0,17

mg/mL; a frao 30-60% obteve uma concentrao 2,5 mg/mL; e a frao 60-90%

apresentou concentrao de 1,64 mg/mL (Grfico 9). Na raia com do gel SDS-PAGE

com a frao 60-90%

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE … · Entre os tipos de proteínas de sementes várias têm função de reserva, estrutural ou metabólica. ... reservation function, structural