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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPIRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DOENÇAS INFECCIOSAS

CRISTIANI BANHOS FERREIRA

CARACTERÍSTICAS IMUNO-HISTOQUÍMICAS DAS LESÕES DE

HANSENÍASE EM PACIENTES COM HELMINTOS INTESTINAIS

VITÓRIA

2012

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CRISTIANI BANHOS FERREIRA

CARACTERÍSTICAS IMUNO-HISTOQUÍMICAS DAS LESÕES DE

HANSENÍASE EM PACIENTES COM HELMINTOS INTESTINAIS

Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Doenças Infecciosas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Doenças Infecciosas. Orientador: Dr. Rodrigo Ribeiro Rodrigues Coorientadora: Dra. Lucia Martins Diniz

VITÓRIA

2012

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Agradecimentos

À Deus por ter me dado a persistência, iluminação e a força para a

conclusão de todo o trabalho;

À minha mãe Mariliza, minha primeira mestra, que tudo fez pela minha

formação moral, afetiva e intelectual, pelo carinho e dedicação comigo;

À minha irmã Cristina, pela amizade e compreensão nas horas difíceis;

Aos meus queridos gatos, Serrano, Birú e Pepe, que sempre estiveram ao

meu lado estudando;

Aos amigos, que inúmeras vezes puderam me ouvir, e também tiveram ao

meu lado aprendendo sobre o tema da minha tese, hanseníase e helmintos

intestinais, de tanto que conversava com eles sobre o assunto;

Aos amigos de mestrado, em especial Fabíola, Joaquim, Lorenzzo e Renata,

pelas trocas de informações durante o curso e amizade;

Às funcionárias da Patologia, Ester de Andrade Rita, Elielma do Rosário

Silva Santos, Maria de Lourdes Kiabai, e as do SAME que me receberam com

muito carinho e me ajudaram durante a coleta dos dados;

Aos funcionários da Biblioteca Central que sempre me atenderam com

solicitude;

Aos funcionários e professores do Núcleo de Doenças Infecciosas, em

especial, Fátima, Wayna e a professora Angélica, pela paciência e disponibilidade;

Ao professor e orientador, Dr. Rodrigo Ribeiro Rodrigues;

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À Dra. Lucia Martins Diniz, minha amiga e coorientadora, pelo incentivo

ao estudo desde a época da graduação; dedicação, empenho e pelas inúmeras

correções realizadas durante todo o trabalho;

E aos pacientes que foram incluídos no estudo, porque sem eles não teria

sido possível a elaboração deste trabalho.

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Índice de Figuras

Figura 1: Fluxograma na obtenção dos prontuários e blocos dos pacientes do estudo..53 Figura 2: Correlação do diagnóstico clínico com o resultado do estudo histopatológico

dos 53 pacientes analisados ............................................................................................56

Figura 3: Distribuição dos 53 pacientes em percentual segundo classificação

operacional da Organização Mundial da Saúde..............................................................57

Figura 4: Números absolutos do cruzamento entre sexo e o diagnóstico histopatológico

dos 53 pacientes do estudo..............................................................................................58

Figura 5: Números absolutos do cruzamento entre tratamento e classificação

operacional OMS dos 53 pacientes…………………………………………………….59

Figura 6: Distribuição percentual dos 53 pacientes segundo comorbidades..................60

Figura 7: Distribuição percentual dos 53 pacientes segundo resultado do exame

parasitológico de fezes…….............................................................................................61

Figura 8: Distribuição dos 53 pacientes de acordo com a positividade ou negatividade

do exame parasitológico de fezes………………………………………………………61

Figura 9: Distribuição dos 16 pacientes co-infectados pelos helmintos e pela hanseníase

de acordo com a espécie de helminto detectada ao exame parasitológico de fezes

EPF..................................................................................................................................62

Figura 10: Números absolutos da correlação entre o sexo dos 53 pacientes e a presença

de helmintos ao exame parasitológico de fezes…………………………………….…..63

Figura 11: Números absolutos do cruzamento entre a classificação operacional OMS e

a presença de helmintos no exame parasitológico de fezes…………………………….64

Figura 12: Correlação entre a positividade ou negatividade do EPF com o sexo dos 53

pacientes .........................................................................................................................65

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Figura 13: Frequência de células com os marcadores CD4, CD8, CD20, CD138,

FOXP3 e TIA1-CD8 em hansenianos paucibacilares e multibacilares com e sem co-

infecção............................................................................................................................69

Figura 14: Marcação pela imuno-histoquímica de células CD8+ no grupo de pacientes

paucibacilares e multibacilares co-infectados e não co-infectados com

helmintos………………...70 e 71

Figura 15: Frequência de Células FOXP3+ no grupo de pacientes paucibacilares e

multibacilares co-infectados e não co-infectados com helmintos………………...72 e 73

Figura 16: Frequência de Células CD20+ no grupo de pacientes paucibacilares e

multibacilares co-infectados e não co-infectados com helmintos………………...74 e 75

Figura 17: Frequência de Células CD4+ no grupo de pacientes paucibacilares e

multibacilares co-infectados e não co-infectados com helmintos………………...76 e 77

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Índice de Tabelas

Tabela 1: Caracterização dos 53 pacientes segundo a faixa etária...............................55

Tabela 2: Distribuição dos 53 pacientes pelos diagnósticos clínicos e resultados dos

exames histopatológicos com a estatística kappa..........................................................56

Tabela 3: Relação entre o sexo e a classificação operacional dos 53 pacientes

analisados........................................................................................................................57

Tabela 4: Correlação entre o tratamento adotado e a classificação operacional dos 53

pacientes estudados..........................................................................................................59

Tabela 5: Resultados dos exames parasitológicos de fezes dos 53

pacientes.........................................................................................................................60

Tabela 6: Correlação entre o sexo dos 53 pacientes e a presença ou não de helmintos ao

exame parasitológico de fezes.........................................................................................63

Tabela 7: Correlação entre a classificação operacional OMS e a presença ou não de

helmintos ao exame parasitológico de fezes....................................................................64

Tabela 8: Distribuição dos vinte e cinco pacientes segundo o sexo, idade, forma clínica

da hanseníase, histologia das lesões cutâneas, classificação operacional, presença de

helmintos e perfil imuno-histoquímico............................................................................66

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Lista de Abreviaturas e Siglas

APTS - Aminopropiltrietxisilano.

BT- Borderline Tuberculóide.

BB- Borderline Borderline

BL- Borderline Lepromatoso

DNA - Ácido desoxirribonucléico.

CD - Cluster of Differentiation.

DAB - Diaminobenzidine.

EDTA- Ethylenediamine tetraacetic acid

EPF - Exame parasitológico de fezes.

FOXP3- Forkhead box P3.

GM-CSF- Granulocyte macrophage colony-stimulating factor.

H2O2- Peróxido de hidrogênio.

HDT - Hanseníase Dimorfa-Tuberculóide.

HDV - Hanseníase Dimorfa-Virchowiana.

HI - Hanseníase Indeterminada.

HIV- Human Immunodeficiency Virus (Vírus da Imunodeficiência Humana).

HLA - Human Leucocyte Antigens.

HLA-DQ - Human Leucocyte Antigens- Locus DQ.

HLA-DR - Human Leucocyte Antigens- Lócus DR.

HT - Hanseníase Tuberculóide.

HUCAM - Hospital Universitário Cassiano Antônio Moraes.

HV - Hanseníase Virchowiana.

IB- Índice Baciloscópico IgE - Imunoglobulina E.

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IgM- Imunoglobulina M.

IL-1 - Interleukin (Interleucina) 1. IL-2 - Interleukin (Interleucina) 2. IL-4 - Interleukin (Interleucina) 4. IL-5 - Interleukin (Interleucina) 5. IL-6 - Interleukin (Interleucina) 6. IL-7 - Interleukin (Interleucina) 7. IL-8 - Interleukin (Interleucina) 8. IL-10 - Interleukin (Interleucina) 10.

IL-12 - Interleukin (Interleucina) 12.

IL-13 - Interleukin (Interleucina) 13

IL-25 - Interleukin (Interleucina) 25.

IL-33 - Interleukin (Interleucina) 33.

IFN-γ - Interferon-gama.

Km- quilômetros.

LL- Lepromatoso-lepromatoso

M-CSF- Macrophage colony-stimulating factor.

MHC- Major Histocompatibility Complex (Complexo de Histocompatibilidade

Principal).

M. leprae- Mycobacterium leprae.

OMS - Organização Mundial de Saúde.

p- Diferença estatística.

PAMPS - Padrões moleculares associados à patógenos.

PBS - Phosphate Buffered Saline.

PCR - Reação de Cadeia de Polimerase.

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PGL - Glicolipídeo Fenólico.

PQT/PB - Poliquimioterapia Paucibacilar.

PQT/MB - Poliquimioterapia Multibacilar.

SAME - Arquivo Geral do HUCAM.

SIDA - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida.

SINAN - Sistema de Informação de Agravos Notificáveis.

SPSS - Statistical Package for the Social Sciences.

TGF-β1- Transforming growth factor beta 1.

Th1 - T helper 1.

Th2 - T helper 2.

Th17 - T helper 17.

TIA-1 - T Cell intracellular antigen-1.

TLR - Toll Like Receptor.

TNF-α - Tumor Growth Factor-α (Fator de Necrose Tumoral α).

TNF-β - Tumor Growth Factor β - (Fator de Necrose Tumoral β).

Treg - Células T reguladoras.

TSLP - Thymic Stromal Lymphopoietin.

TT - Tuberculóide Tuberculóide.

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SUMÁRIO

� Resumo............................................................................................................... 14

� Abstract..............................................................................................................16

� Introdução......................................................................................................... 18

� Fundamentação Teórica....................................................................................20

� HANSENÍASE………………………………………………………………...20

� Conceito e aspectos epidemiológicos……………………………………........20

� Agente etiológico da hanseníase........................................................................21

� Transmissão do M. leprae..................................................................................22

� Mecanismos Imunológicos da Infecção………………………………………22

� Formas clínicas da hanseníase..........................................................................27

� Diagnóstico da hanseníase.................................................................................31

� Tratamento da hanseníase................................................................................39

� HELMINTOS INTESTINAIS………………………………………………..39

� Imunologia nas infecções helmínticas..............................................................41

� Objetivos……………………………………………………………………….47

� Metodologia……………………………………………………………………48

� Tipo de estudo e caracterização da amostra………………………………...48

� População............................................................................................................48

� Método Imuno-histoquímico………………………………………………….49

� Análise Estatística……………………………………………………………..51

� Considerações Éticas.........................................................................................51

� Resultados...........................................................................................................53

� Discussão.............................................................................................................78

� Conclusão............................................................................................................87

� Referências Bibliográficas……………………………………………………88

APÊNDICE 1: Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da Saúde.............................................................................................................................102 APÊNDICE 2: Ficha de anotação dos dados dos pacientes do estudo........................103

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Resumo

Introdução: A imunomodulação determinada pelos nematóides intestinais no

homem pode intervir na evolução e na progressão de outras doenças infecciosas, dentre

elas a hanseníase. Objetivo: O estudo analisa a presença dos marcadores anti-CD4, anti-

CD8, anti-CD20, anti-CD138, anti-TIA-1 e anti-FOXP3 em amostras de biópsias de

lesões de pacientes com o diagnóstico clínico e histopatológico de hanseníase, com e

sem helmintíase, a fim de determinar a influência das helmintíases intestinais no sistema

imune. Pacientes e métodos: O estudo foi realizado através da análise retrospectiva de

prontuários de pacientes atendidos no Serviço de dermatologia do Hospital

Universitário Cassiano Antônio Moraes (HUCAM), no período de 01/1995 a 01/2010,

com o diagnóstico de hanseníase e que, após a suspeita clínica, foram submetidos à

biópsia e ao exame anátomo-patológico de lesão suspeita na pele, e que realizaram

exame parasitológico de fezes. Quando identificado um caso de hanseníase, confirmado

clinica e histopatologicamente, foram anotados dados referentes ao paciente: idade,

sexo, forma clínica da doença, diagnóstico histopatológico, a presença ou ausência de

verminose, e a espécie envolvida. Após, foram separados os blocos de parafina das

biópsias das lesões cutâneas dos pacientes, os quais posteriormente foram submetidos

ao exame imuno-histoquímico para a pesquisa de marcadores CD4, CD8, CD20,

CD138, TIA-1 e FOXP3. Resultados: Dos 53 hansenianos analisados, observou-se

discreto predomínio do sexo feminino e das formas paucibacilares. Outro achado foi a

concentração dos casos paucibacilares nos pacientes do sexo feminino e dos

multibacilares no sexo masculino, a mediana de idade foi de 43 anos. Embora sem

significância estatística, as verminoses intestinais tiveram ligeiro predomínio nas formas

multibacilares, sendo o helminto mais envolvido o Ascaris lumbricoides. As frequências

de células FOXP3+ e CD20+ foram maiores entre os hansenianos paucibacilares em

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relação aos multibacilares, sendo as células CD20+ significativamente mais elevadas nos

pacientes multibacilares com helmintos intestinais, quando comparados com os

pacientes sem helmintos (p=0,005). Conclusão: O estudo demonstrou frequência

significativa do sexo feminino nas formas paucibacilares da hanseníase, além de ligeiro

predomínio, embora sem significância estatística, de helmintos nas formas

multibacilares da doença com células CD20+, significativamente mais elevadas nos

multibacilares com helmintos intestinais.

Palavras-chave: Hanseníase; Helmintos; Imuno-histoquímica; Imunologia.

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Abstract

Introduction: Immunomodulation determined by intestinal nematodes in humans can

interfere in the evolution and progression of infectious disorders, among them leprosy.

Objective: This study analyses the presence of anti-CD4, anti-CD8, anti-CD20, anti-

CD138, anti-TIA-1 and anti-FOXP3 markers in biopsy samples of skin lesions from

patients with clinical and histopathological diagnosis of leprosy, with and without

helminthiasis, in order to determine their influence on the immune system. Patients and

methods: The study conducted a retrospective analysis of medical records of patients

diagnosed with leprosy from the Department of Dermatology at the University Hospital

Cassiano Antonio Moraes (HUCAM), from january 1995 to january 2010, which, after

clinical suspicion of leprosy, underwent skin biopsy with histopathological study, and

also had stool tests. The following data was collected from leprosy patients: age,

gender, disease’s clinical type, histopathological diagnosis, the presence or absence of

intestinal helminthes and the species involved. Subsequently the paraffin blocks with

the biopsy material from patient’s skin lesions were separated for

immunohistochemichal study of the markers CD4, CD8, CD20, CD138, TIA-1 and

FOXP3. Results: Out of the 53 leprosy patients analyzed, a small predominance of

female patients and paucibacillary types was observed. Another finding was the

concentration of paucibacillary types among female patients, and multibacillary types

among male patients. The patient’s median age was 43 years. Although lacking

statistical significance, helminthic infections were slightly predominant in

multibacillary patients, most frequently caused by Ascaris lumbricoides. The presence

of FOXP3+ and CD20+ cells was higher among paucibacillary patients, and CD20+ cells

were significantly more frequent in multibacillaty patients with intestinal helminthes,

when compared to patients without intestinal helminthes (p=0,005). Conclusion: The

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study showed a higher frequency of female sex in paucibacillary types leprosy, as well

as the small predominance, although without statistical significance, of helminthes in

multibacillary patients. However, CD20+ cells were significantly more frequent among

multibacillary patients with helminthic infections.

Key-words: Leprosy; Helminths; Immunohistochemistry; Immnunology.

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1.0 - INTRODUÇÃO

A hanseníase, doença de alta infectividade e baixa patogenicidade, determinada

pelo Mycobacterium leprae, constitui, apesar dos esforços de contenção da endemia, um

grave problema de saúde pública, não só pela magnitude da doença, como também pelo

seu potencial incapacitante, atingindo principalmente, pessoas de faixa etária

economicamente ativa.

O espectro clínico da doença está intimamente ligado à resposta imune. Nos

pacientes com a forma tuberculóide existe uma forte resposta Th1, com presença de

poucos bacilos (hanseníase paucibacilar) e a doença se caracteriza por destruição das

fibras nervosas em áreas específicas, o que resulta no aparecimento de lesões de pele

localizadas e bem demarcadas, com perda da sensibilidade térmica e dolorosa. Na

ausência de uma resposta Th1 efetiva, ocorre um predomínio da resposta Th2, levando a

disseminação dos bacilos (hanseníase multibacilar), na qual os macrófagos ficam

repletos de parasitas, quadro que caracteriza a forma virchowiana da doença.

As infecções por helmintos intestinais são responsáveis por significativa morbi-

mortalidade e perda econômica nos humanos, sobretudo em países subdesenvolvidos e

em desenvolvimento. Os mecanismos de resposta imune nas infecções helmínticas são

múltiplos, devido ao tamanho e à diversidade metabólica dos parasitas, e tipicamente

resultam na indução de forte resposta Th2, com produção de citocinas anti-

inflamatórias, eosinofilia, mastocitose e altos títulos de anticorpos IgE.

Neste contexto, não é raro que um portador de uma parasitose intestinal esteja

exposto à outra infecção, como por exemplo, a hanseníase, a tuberculose, dentre outras,

principalmente em áreas endêmicas do mundo. Prost e colaboradores (1979)

demonstraram que em regiões onde a oncocercose e a hanseníase eram endêmicas, a

frequência de casos graves da hanseníase era significativamente maior quando

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comparada à encontrada em regiões onde apenas a hanseníase era endêmica e com a

mesma prevalência da primeira (regiões livres da oncocercose). Estes autores sugeriram

que pacientes co-infectados poderiam evoluir para as formas mais graves da doença.

A imunomodulação determinada pelos nematóides intestinais pode intervir na

evolução e na progressão de outras doenças infecciosas, fato esse sugerido por alguns

estudos que evidenciaram impacto na clínica e na evolução da malária, da tuberculose e

da hanseníase.

Considerando-se que a evolução da hanseníase tende ao polo mais grave se a

resposta imune humoral, fruto de uma estimulação da resposta Th2, for predominante e

que infecções por helmintos intestinais, também desviam a resposta imune para o lado

Th2, foi proposto um estudo para avaliar a resposta imune nas lesões cutâneas de

hanseníase em pacientes infectados pelos nematóides intestinais comparados aos não

infectados por estes helmintos, através da análise imuno-histoquímica dos tecidos.

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2.0 – FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

HANSENÍASE

Conceito e aspectos epidemiológicos

A hanseníase é moléstia infecto-contagiosa crônica e granulomatosa, de alta

infectividade e baixa patogenicidade, determinada pelo Mycobacterium leprae,

transmitida de pessoa a pessoa através do convívio com doentes contagiantes sem

tratamento (TALHARI e col., 2006).

O Ministério da Saúde (2000) define como caso de hanseníase, o indivíduo que

apresenta um ou mais dos seguintes sinais cardinais e que necessita de tratamento

poliquimioterápico: 1) presença de lesão(ões) e/ou áreas da pele com diminuição ou

alteração da sensibilidade; 2) acometimento de nervo(s) periférico(s) com ou sem

espessamento, associado a alterações sensitivas e/ou motoras e/ou autonômicas, e 3)

baciloscopia positiva de esfregaço intradérmico.

Apesar da implementação da poliquimioterapia, das novas estratégias e dos

esforços na condução dos programas para o controle da moléstia, a hanseníase continua

sendo um problema de saúde pública e social, devido às deformidades e incapacidades

físicas por ela determinadas, que resultam na discriminação e segregação dos doentes e

de seus familiares, sobretudo na Ásia, África e América Latina, em especial na Índia e

no Brasil (OMS, 2008).

O panorama internacional da endemia demonstrou que o Brasil, Nepal e Timor

Leste foram responsáveis em 2007 por 17% de todos os casos novos registrados no

mundo, e em 2008 por 23% desses casos (OMS, 2008).

O número de casos novos detectados no mundo em 2010 foi de 228.474, sendo o

Brasil responsável por 34.894 ou 15,3% de todos os casos novos detectados, superado

apenas pela Índia com 126.800 ou 55,5% (OMS, 2011).

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No Brasil, a distribuição da endemia é heterogênea, sendo as regiões Norte,

Centro-Oeste e Nordeste, os espaços geográficos responsáveis pelos maiores índices de

prevalência da hanseníase e com coeficiente de detecção em patamares muito altos,

correspondendo a 53,5% dos casos atendidos em todo o país (ANDRADE e col., 2000;

MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).

Em relação à região Sudeste, o Espírito Santo no ano de 2008, apresentou o

coeficiente de detecção de 31,27 casos novos para cada 100.000 habitantes e no grupo

de zero a 14 anos, este coeficiente foi de 12,46 casos para cada 100.000 habitantes,

parâmetro considerado como hiperendêmico e importante indicador de

transmissibilidade da doença (SESA, 2008).

Agente etiológico da hanseníase

A hanseníase é doença infecciosa causada pelo Mycobacterium leprae, bactéria

intracelular obrigatória, de 1,5 a 8 micra de comprimento por 0,2 a 0,5 micra de largura,

que se apresenta sob a forma de bastonete reto ou ligeiramente encurvado, álcool- ácido

resistente, corando-se em vermelho pela fucsina ácida (Ziehl-Neelsen) e não se

descorando pela lavagem no álcool-ácido. O bacilo apresenta um tropismo pela célula

de Schwann, encontrada nos nervos periféricos, e pelos macrófagos da pele

(SCOLLARD e col., 2006).

Tem reprodução muito lenta (12 a 14 dias), permanecendo viável até 36 horas no

meio ambiente ou aproximadamente nove dias na temperatura de 36,7°C e 77,6% de

umidade média, e necessita de temperatura inferior à média de 37°C do corpo humano,

em torno de 35°C para se desenvolver, aspecto esse que explica a localização

preferencial do bacilo nas regiões mais frias do corpo, como por exemplo: nariz,

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testículos e locais onde os nervos periféricos se encontram muito próximos à pele, como

os cotovelos e os tornozelos (FOSS, 1999).

Análise da ultraestrutura do M. leprae demonstra sua semelhança com outras

micobactérias, porém difere das demais por apresentar constituintes específicos,

especialmente a espessa parede lipídica formada principalmente pelos glicolipídeos

fenólicos (PGL-I, II e III). O PGL-I tem sido objeto de inúmeros estudos, por tratar-se

de um antígeno envolvido na interação com a laminina das células de Schwann, o qual

facilita a penetração do bacilo nos nervos periféricos afetados (SHIMOJI e col., 1999).

Transmissão do M. leprae

Acredita-se que o homem seja o único reservatório natural do bacilo, apesar de

existirem relatos de animais selvagens naturalmente infectados, como tatus e macacos,

os quais aparentemente não são considerados problemas na cadeia epidemiológica de

transmissão (KIRCHHEIMER & STORRS 1971; LEININGER e col., 1980;

BOLOGNIA e col., 2011).

Apesar do papel dos pacientes portadores da forma paucibacilar ter sido

documentado na cadeia de transmissão da doença, os pacientes multibacilares são

considerados a principal fonte de infecção (HALDER e col., 2001).

A pele com presença de solução de continuidade, eventualmente, poderia

desempenhar um papel na infecção, porém, as vias aéreas superiores constituem a

principal porta de entrada e via de eliminação do bacilo (TALHARI e col., 2006).

Mecanismos imunológicos da infecção

Depois de penetrar no organismo do homem, através das vias aéreas superiores

ou, excepcionalmente, por abrasões de pele, os bacilos são fagocitados pelas células

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apresentadoras de antígenos, como exemplo macrófagos e células dendríticas, dentre

elas as células de Langerhans (subtipo de células dendríticas que iniciam a resposta

imune na pele), processados e expressos na superfície dessas células, via moléculas de

MHC II, e, desta forma, reconhecidos pelos linfócitos T CD4+, que promovem a

liberação de citocinas pró-inflamatórias, dentre elas a IL-2 e IFN-γ (QUARESMA e

col., 2009).

Células dendríticas desempenham papel importante na modulação da resposta

imune inata à infecção pelo M. leprae, e a interação do bacilo à essas células

apresentadoras de antígeno resulta na produção local de citocinas e quimiocinas, que,

dependendo do tipo, são capazes de regular a inflamação e determinar o curso da

resposta imune adaptativa mediada por células via linfócitos T: respostas Th1 e Th2

(DEMANGEL & BRITTON, 2000). Hansenianos com a forma virchowiana apresentam

número significativamente menor de células de Langerhans na pele quando comparados

aos pacientes tuberculóides e a indivíduos não infectados, sugerindo a importância do

infiltrado dessas células nas formas onde há predomínio da resposta imune celular

eficaz (GIMENEZ e col., 1989).

Os linfócitos T CD4 na presença de IL-12 e na ausência de IL-4 diferenciam-se

em Th1, importantes na ativação da imunidade celular, com predomínio de dois tipos de

citocinas: IL-2 e IFN-γ. Por outro lado, os linfócitos T CD4 em contato com a IL-4 se

transformam em Th2, envolvidos na ativação da imunidade humoral, com produção de

vários tipos de interleucinas: IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13 (ALMEIDA e col.,

1996).

A destruição ou a multiplicação do bacilo no interior dos macrófagos são

determinadas por mecanismos imunológicos e a resposta imunológica montada pelo

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hospedeiro determina o fenótipo clínico que o paciente irá desenvolver (GOULARD e

col., 2002).

Sabendo-se que a hanseníase possui diferentes formas clínicas e que existem

pelo menos dois tipos de macrófagos com funções opostas, alguns trabalhos começaram

a avaliar o impacto desses diferentes subgrupos em resposta ao Mycobacterium leprae.

Maquino e colaboradores (2007) mostraram que após estímulo com Mycobacterium

leprae, macrófagos diferenciados com M-CSF perdem a capacidade de ativar linfócitos

T, enquanto os macrófagos diferenciados com GM-CSF apresentam elevada capacidade

estimulatória sobre os linfócitos T.

Os macrófagos infectados pelo Mycobacterium leprae produzem e liberam as

citocinas: TNF-α, IL-12, IL-10 e TGF-β1 (MOURA e col., 2007). Essas citocinas são

opostas em muitas formas de ação, incluindo suas ações sobre o próprio M. leprae. De

um lado, o TNF-α promove ativação de macrófagos com capacidade de destruir o bacilo

intracelular e potencializa os efeitos do IFN-γ. Por outro lado, TGF-β1 e IL-10

desativam os próprios macrófagos, aumentando a proliferação bacilar. Desta forma,

citocinas como IL-10 e TGF-β contrapõem os efeitos do TNF-α e IFN-γ, acreditando-se,

portanto, que a exposição de macrófagos a determinada citocina, no tempo apropriado,

seja o requisito para a destruição intracelular do parasito (ROJAS-ESPINOSA e col.,

1994).

Na hanseníase tuberculóide, o M. leprae é destruído completamente nos

fagolisossomos das células apresentadoras de antígenos, e os antígenos expressos por

essas células via complexo MHC, recruta o sistema imune mediado por células através

da liberação de IFN-γ e IL-2, com a formação de granulomas de células epitelióides

(ABULAFIA &VIGNALE, 2001). Já na hanseníase virchowiana, os macrófagos, por

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serem incapazes de impedir a multiplicação do M. leprae, estão repletos de bacilos

(KRUTZIK e col., 2003).

O padrão de citocinas encontradas nas lesões cutâneas é produzido por

subclasses de linfócitos T CD4+ e CD8+ predominantes, dependendo da forma clínica da

doença (QUARESMA e col., 2009).

Demonstrou-se, através de técnicas de imuno-histoquímicas, que no padrão de

resposta tipo 1 (Th1), característico da hanseníase paucibacilar, predominam os clones

T CD4+, relação CD4+/CD8+de 1,9:1, que se distribuem em toda a lesão, produtores de

IFN-γ, citocina ativadora de macrófagos; IL-2, fator de crescimento autócrino para

células T helper; e níveis indetectáveis de IL-4; já nas lesões virchowianas a relação

CD4+/CD8+ é de 0,6:1, sendo a maioria das células CD8+ que infiltram as lesões

lepromatosas de fenótipo CD28 – (supressor), enquanto que as células de fenótipo T

citotóxico (CD28+) predominam nas lesões tuberculóides (MODLIN e col., 1983).

A presença do bacilo no interior de macrófagos induz sua ativação que culmina

na produção de citocinas IL-1, TNF-α e IL-12, que atuam sobre os linfócitos T,

geralmente a população de fenótipo CD4+, tornando-os ativados e com capacidade de

produzir citocinas próprias. A IL-12 estimula diretamente a célula Natural Killer,

produtora de IFN-γ, que associada ao TNF-α, estimulam o macrófago e atuam

sinergicamente, incrementando a atividade bactericida macrofágica, através da produção

de radicais microbicidas, os reativos intermediários do oxigênio e do nitrogênio. A

subpopulação Th1 de linfócitos T produz citocinas pró-inflamatórias, IL-2, IFN-γ e

TNF-β, responsáveis pela manutenção da resposta imune celular, formação do

granuloma e destruição bacilar (SCOLLARD e col., 2006).

26

Na hanseníase virchowiana, os bacilos são parcialmente digeridos e depósitos de

fosfolipídeos intracitoplasmáticos podem se formar, o que confere o aspecto de células

espumosas nessa forma de hanseníase (ABULAFIA &VIGNALE, 2001).

O padrão de resposta tipo 2 (Th2), característica dos pacientes multibacilares,

produz e libera a IL-4, fator de crescimento para células T supressoras, que contribui

para a diferenciação de células B e produção de anticorpos. Também, produz clones de

células T CD8+, que liberam IL-4, IL-5, IL-6, IL-8 e IL-10, como padrão de citocinas

supressoras da atividade macrofágica, contribuindo para o aumento na produção de

anticorpos via linfócitos B, escape à oxidação intramacrofágica e disseminação bacilar

(ABULAFIA &VIGNALE, 2001; GOULART e col., 2002).

A análise de subpopulações de linfócitos realizada por Modlin e colaboradores

(1983) demonstrou que em lesões de hanseníase tuberculóide, os linfócitos entremeados

no granuloma epitelióide eram CD4+ e o manto circunjacente CD8+. Na forma

virchowiana, as células CD4+ e CD8+ estavam entremeadas com histiócitos vacuolados

sem definir um manto linfocitário. Para esses autores, a disposição entre CD4+ e CD8+

estaria associada à maturação dos monócitos, lise bacilar e resposta de

hipersensibilidade tardia. Por outro lado, a distribuição ao acaso de linfócitos T CD4+ e

CD8+ poderia impedir a apresentação do antígeno as células imunocompetentes, como

também não estimular a maturação para células epitelióides.

Portanto, o balanço e a interação complexa das citocinas, quimiocinas,

moléculas de adesão, seus receptores e as células do sistema inato e adaptativo

conjuntamente, formarão uma rede complexa que irá caracterizar a resposta imune do

hospedeiro e consequentemente a evolução clínico-patológica da doença.

27

Formas clínicas da hanseníase

Rabello foi o pioneiro em estabelecer o conceito das formas polares da

hanseníase. Segundo este autor, a partir da forma indeterminada, os pacientes sem

tratamento, podem evoluir espontaneamente para a cura ou para a forma tuberculóide,

caso o sistema imune seja efetivo, ou para a forma virchowiana, se o sistema imune não

conseguir organizar uma resposta imune satisfatória (RABELLO, 1937).

Em 1953, no VI Congresso Internacional de Lepra em Madrid, foram mantidos

os critérios propostos por Rabello, isto é, a forma inicial da doença (indeterminada), o

tipo lepromatoso (virchowiano), que corresponde ao polo disseminado da doença, e o

tipo tuberculóide, polo localizado, e foi estabelecido um novo grupo, o borderline,

instável clinicamente, por caracterizar-se entre as formas polares (VI

INTERNATIONAL CONGRESS LEPROL. MADRID, 1953).

Nesse sistema há duas formas polares da doença, que são clinica e

imunologicamente distintas, denominadas hanseníase tuberculóide e virchowiana, e

além dessas formas polares estáveis, existem dois grupos intermediários instáveis,

denominados hanseníase dimorfa ou borderleine e hanseníase indeterminada. A

evolução da doença para um desses tipos está diretamente relacionada à resposta

imunológica do indivíduo frente ao Mycobacterium leprae (VI INTERNATIONAL

CONGRESS LEPROL. MADRID, 1953).

Na década de 60, Ridley e Jopling estabeleceram a classificação espectral da

hanseníase, subdividindo o grupo borderline ou dimorfo em dimorfo-tuberculóide,

dimorfo-dimorfo e dimorfo-virchowiano, baseada em parâmetros clínico,

bacteriológico, histopatológico e imunológico. Através dessa classificação, subdividiu-

se a hanseníase em cinco grupos no espectro imunológico: a) tuberculóide-tuberculóide

(TT), que corresponde à forma polar e estável da classificação de Madrid, b) borderline-

28

tuberculóide (BT), c) borderline-borderline (BB), d) borderline-lepromatoso (BL) e e)

lepromatoso-lepromatoso (LL), equivalente à forma lepromatosa e mais agressiva na

classificação de Madrid (RIDLEY & JOPLING, 1966).

Em 1982, a Organização Mundial de Saúde definiu que pacientes paucibacilares

(PB) eram representados por aqueles com a forma indeterminada, tuberculóide ou

borderleine-tuberculóide, com índice baciloscópico menor do que dois em qualquer sítio

avaliado, já os pacientes multibacilares eram definidos como os borderleine-borderleine,

borderleine-lepromatosos e lepromatosos-lepromatosos ou os que apresentassem índice

baciloscópico maior ou igual a dois (WHO, 1982).

Posteriormente modificou-se essa classificação definindo que um paciente seria

considerado multibacilar quando tivesse baciloscopia positiva em qualquer sítio

examinado, independente do índice baciloscopia, ou seja, acima de zero (WHO, 1998).

Entretanto, tendo em vista a dificuldade em determinadas regiões do mundo,

com poucos recursos diagnósticos, de se estabelecer uma classificação baciloscópica de

qualidade, a estratégia foi a simplificação do método de classificação dos pacientes com

hanseníase. Dessa forma, em 1995, a Organização Mundial de Saúde recomendou para

países endêmicos e para regiões sem acesso a exames laboratoriais complementares

para o diagnóstico, uma classificação simplificada e operacional, essencialmente clínica,

que utiliza o número de lesões cutâneas e/ou troncos nervosos acometidos para alocação

de pacientes nos esquemas poliquimioterápicos (WHO, 1995).

A Organização Mundial de Saúde estabeleceu como pacientes paucibacilares, os

casos de hanseníase com até cinco lesões cutâneas e/ou apenas um nervo acometido, e

multibacilares os casos com mais de cinco lesões cutâneas e/ou mais de um tronco

neural acometido (WHO, 1995). Critério esse falho, pois não leva em consideração a

baciloscopia, histopatologia e o tamanho das lesões, o que pode implicar em erros no

29

diagnóstico e no tratamento, uma vez que se tem observado lesões únicas com quadros

histopatológicos e baciloscópicos próprios dos multibacilares, o que pode contribuir

para o retorno e disseminação da doença (FLEURY, 2006).

Gallo e colaboradores (2003) para avaliar a recomendação de critérios clínicos

para a alocação dos pacientes com hanseníase no grupo paucibacilares e multibacilares e

para verificar o método clínico de classificação baseado no número de lesões cutâneas

correlacionando com o exame baciloscópico de esfregaços de pele, estabeleceram a

comparação dessa classificação exclusivamente clínica tomando-se como método

padrão referência a classificação segundo o padrão de baciloscopia. A avaliação da

concordância entre o método clínico e o baciloscópico foi realizada através do cálculo

do índice kappa, com demonstração de concordâncias de 83,3%, sendo a sensibilidade e

a especificidade relativas dos critérios clínicos de 89,6% e de 83,8%, respectivamente

(GALLO e col., 2003).

Foram selecionados para análise 837 casos de hanseníase obtidos no registro do

Centro Colaborador em Hanseníase para o Ministério da Saúde do Departamento de

Medicina Tropical do Instituto Oswaldo Cruz, RJ, do período de 1986 a 1999. Dos 652

casos com baciloscopia positiva, 584 (89,6%) tinham mais de cinco lesões cutâneas, e,

dos 185 casos com baciloscopia negativa, 155 (83,8%) tinham até cinco lesões cutâneas,

o que evidenciou que o método clínico baseado no número de lesões cutâneas para a

classificação dos pacientes e o resultado do exame baciloscópico apresenta limitações

que não invalidam sua operacionalidade (GALLO e col., 2003).

Geralmente, a hanseníase se inicia pela forma indeterminada, caracterizada

clinicamente por áreas hipoestésicas ou manchas hipocrômicas de limites imprecisos,

com hipoestesia térmica ou dolorosa, única ou até cinco lesões, que poderão evoluir

para a cura espontaneamente ou para uma das formas polares (TALHARI e col., 2006).

30

A hanseníase tuberculóide, forma de resistência imune ao M. leprae, manifesta-

se com lesões cutâneas, bem delimitadas, bordas papulosas e infiltradas, coloração

eritêmato-acastanhada, hipohidrose ou anidrose, queda de pelos, hipoestésicas ou

anestésicas, geralmente única, podendo ser acompanhadas de espessamento do tronco

neural próximo à lesão. Essas manifestações estão relacionadas à exacerbação da

resposta imune celular, com a formação de granuloma, limitação das lesões e, às vezes,

sequelas neurais significativas (FOSS, 1999).

A hanseníase virchowiana, forma associada a uma resposta imune celular

ineficaz, é caracterizada pela excessiva multiplicação bacilar e disseminação da doença

para todo o tegumento e, às vezes, para as vísceras, podendo evoluir insidiosamente.

Está associada às lesões infiltradas e amareladas, pápulas e nódulos eritêmato-violáceos,

hansenomas, xerose cutânea devido à anidrose associado à desnervação das glândulas

sudoríparas, rarefação de pelos e alopecia nas extremidades. Com a progressão da

doença, afeta múltiplos nervos, que se tornam espessados a palpação e pouco dolorosos

(ABULAFIA & VIGNALE, 1999; FOSS, 1999).

Nas formas intermediárias ou borderline/dimorfa as manifestações clínicas são

variadas, principalmente nas formas dimorfo-dimorfo, apresentando em geral, lesões em

placa, eritêmato-edematosas de limites internos bem definidos e externos imprecisos,

centro hipocrômico e anestesia local. A presença de nódulos infiltrados na face e

pavilhão auricular aproxima o quadro cutâneo do polo virchowiano, tratando-se da

dimorfo-virchowiana, e lesões cutâneas pouco numerosas e assimétricas revelam

tendência ao polo tuberculóide, a forma dimorfa-tuberculóide (VERHAGEN e col.,

1998; FOSS, 1999).

31

Diagnóstico da hanseníase

O diagnóstico da hanseníase se baseia em: a) critérios clínicos, através da

anamnese e do exame físico criterioso, com a pesquisa de alteração da sensibilidade

térmica, dolorosa e tátil das lesões cutâneas, incluindo a avaliação da sensibilidade

protetora das mãos e dos pés através do teste de incapacidade com estesiômetro; b) nas

provas da histamina e da pilocarpina, em situações duvidosas; e c) nos exames

complementares: baciloscopia de raspado dérmico, histopatologia de lesões cutâneas, e

nos centros de pesquisa, pode-se contar com testes sorológicos, de imuno-histoquímica,

biologia molecular e cultura do bacilo através da inoculação no coxim da pata de

camundongo (TALHARI e col., 2006).

• Baciloscopia de Raspado Dérmico

O exame baciloscópico evidencia a presença ou não de bacilos através da coleta

de linfa do raspado dérmico. O material é coletado mediante pequena incisão na pele

feita com lâmina de bisturi de lesões cutâneas, lóbulos de orelhas, cotovelos e joelhos.

Este material é submetido à coloração específica, variante do método Ziehl-Neelsen,

onde nos pacientes multibacilares, a baciloscopia é positiva, com presença de bacilos

íntegros e nos casos paucibacilares é negativa, o que não afasta o diagnóstico de

hanseníase. Além da finalidade diagnóstica, a baciloscopia possibilita o

acompanhamento do tratamento, sendo recomendável a coleta em pelo menos quatro

sítios cutâneos, no momento do diagnóstico (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010). O

índice baciloscópico (IB) dos pacientes tratados diminui lentamente até sua negativação.

Em geral, o IB diminui em média, uma unidade após um ano e depois,

aproximadamente 0,66 por ano (TALHARI e col., 2006).

32

• Histopatologia de lesões cutâneas

O exame histopatológico das lesões cutâneas complementa o diagnóstico dos

casos de hanseníase. O material obtido por biópsia é fixado em formol a 10% e

processado para duas colorações: hematoxilina-eosina e Wade-Klingmuller ou Fite-

Faraco, sendo as duas últimas para a pesquisa de bacilos nas lâminas (TOMIMORI-

YAMASHITA e col., 1996).

Na histopatologia da forma indeterminada da doença observa-se infiltrado linfo-

histiocitário discreto, perineural ou invadindo nervos e ao redor de anexos, com a

bainha perineural com aumento da celularidade (TOMIMORI-YAMASHITA e col.,

1996).

Na forma tuberculóide, os histiócitos se diferenciam em células epitelióides, que

reunidas formam os granulomas com maior capacidade de destruição bacilar. Os

granulomas estão presentes na derme e entram em contato íntimo com a epiderme,

produzindo atrofia. A alteração histopatológica característica da hanseníase tuberculóide

é o granuloma de células epitelióides com quantidades variadas de linfócitos e células

gigantes multinucleadas, sendo o dado fundamental para o diagnóstico o bacilo em

ramos nervosos, mas estes frequentemente não são detectados (URA e col., 2004).

A forma virchowiana apresenta infiltrado difuso na derme de macrófagos

carregados de bacilos e globias (bacilos íntegros, dispostos paralelamente), separado da

epiderme por faixa de colágeno, a faixa de Unna. Na coloração convencional, o

citoplasma do macrófago mostra-se espumoso e com aspecto vacuolar, contendo

lipídeos no seu interior, sendo denominado de célula de Virchow, representando

macrófago modificado, contendo bacilos íntegros e degeneração lipoídica

(TOMIMORI-YAMASHITA e col., 1996).

33

No grupo borderline, o exame pode revelar estruturas semelhantes ao polo

tuberculóide ou ao virchowiano. Na hanseníase borderline-tuberculóide, a presença da

zona subepidérmica clara faz a diferenciação com a tuberculóide; os focos de células

epitelióides com halo linfocitário ou a presença de células gigantes tipo Langerhans

diferencia da borderline-borderline, sendo que nesta última as células epitelióides estão

dispersas nos granulomas bem desenvolvidos, mas menores que as do tuberculóides e as

células gigantes tipo Langerhans são ausentes (RIDLEY & JOPLING, 1966;

TOMIMORI-YAMASHITA e col., 1996).

• Imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica é um método de análise dos tecidos observados ao

microscópio óptico, no qual um anticorpo específico, quimicamente ligado a uma

enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido, in situ, é utilizado

para identificar um determinado receptor/marcador celular, antígenos, etc. O método

busca identificar as características moleculares das doenças, baseando-se na conjugação

de distintos marcadores com imunoglobulina, que com auxílio de um substrato

específico, localiza o antígeno tecidual (MURPHY, 2010). A utilização de anticorpos

monoclonais ou policlonais para a identificação de antígenos específicos é importante

no diagnóstico e no estudo da hanseníase. Huerre e colaboradores (1989) foram os

primeiros a empregar esta técnica na hanseníase, através da utilização de anticorpos

monoclonais contra o PGL-1 (antígeno glicolipídeo-fenólico-1).

Em 1992, Wang e colaboradores descreveram cinco padrões para análise dos

achados de bacilos na hanseníase:

1- solitário, no qual o bacilo é uniformemente detectado;

2- granular, no qual o bacilo apresenta áreas não coradas em seu interior;

3- com “debris”, isto é, bacilo com distribuição irregular;

34

4- vacuolar, com margens bem definidas; e

5- amorfo, apresentando-se como uma reação de fundo difusa.

Nas formas virchowiana e borderline-virchowiana, o padrão predominante foi o

vacuolar; na forma borderline-borderline os bacilos apresentavam padrão granular no

citoplasma; nas formas borderline-tuberculóide foi difícil a visualização do antígeno e

nas formas tuberculóide não se detectaram antígenos nas células epitelióides,

gigantócitos e vasos sanguíneos (WANG e col., 1992).

Diferentes marcadores podem ser utilizados com a finalidade de identificar a

presença e a disposição de células nos tecidos, dentre eles CD4, CD8, CD20, CD138,

FOXP3 e TIA-1.

� CD4 e CD8

São glicoproteínas de superfície dos linfócitos T, expressas de forma isolada em

subgrupos exclusivos de células maduras, com padrões distintos de restrição do MHC.

Servem como moléculas acessórias na interação entre os linfócitos T e as células

apresentadoras de antígenos ou as células alvo (MICELI & PARNES, 1993).

As células T CD4+ virgens podem se diferenciar em diversos tipos de células T

efetoras depois de ativadas pelo antígeno. Os dois tipos de células T CD4+ efetoras são

chamados de células Th1 e Th2, que assim se diferenciam dependendo do

microambiente de citocinas, no qual essas células estão expostas. Em particular, o IFN-

γ, a IL-12 e a IL-18 são essenciais na fisiologia do desenvolvimento de células Th1, e a

IL-4 no desencadeamento da resposta Th2 (KINDT, 2008).

As células Th1 são capazes de controlar determinadas infecções intracelulares,

como as causadas pelas micobactérias, por ativar macrófagos infectados, induzindo a

fusão de seus lisossomos às vesículas que contêm as bactérias. Também, auxiliam a

produção de anticorpos por meio da liberação de sinais co-estimuladores e pela

35

interação com os linfócitos B. Já as células Th2 estão inteiramente dedicadas à ativação

das células B virgens, na produção de anticorpos (MURPHY, 2010).

CD4 é uma molécula de 59 kDa, composta por quatro domínios semelhantes à

imunoglobulina (D1, D2, D3, D4), de cadeia única, com afinidade específica para o

MHC classe II, expressa na superfície de algumas células T, macrófagos, monócitos e

células dendríticas. CD8 é dímero de 34 kDa, formado por duas cadeias diferentes (alfa

e beta), ligadas por uma ponte dissulfidrila, que contém um único domínio, semelhante

a imunoglobulina, ligada à membrana por um segmento de cadeia polipeptídica

estendida, altamente glicosilado e importante na conformação e na proteção de clivagem

por proteases. É capaz de interagir com o receptor de célula T como co-receptor para

moléculas de MHC da classe I no reconhecimento antigênico (MURPHY, 2010).

Na hanseníase tuberculóide, os linfócitos T CD4+ se dispõem no centro do

granuloma e os linfócitos TCD8+ predominam ao seu redor, enquanto que na hanseníase

virchowiana, os linfócitos T CD4+ e T CD8+ estão distribuídos difusamente no infiltrado

inflamatório, sem constituir um granuloma (MAEDA, 2003).

Massone e colaboradores (2011) ao avaliarem o imunofenótipo do infiltrado de

linfócitos em hansenianos co-infectados com o vírus da Imunodeficiência Adquirida

através da técnica de imuno-histoquímica, observaram que as células T CD8+

predominavam no infiltrado celular de hansenianos multibacilares co-infectados com

HIV (99,4%). Na forma borderline-tuberculóide e na reação reversa da hanseníase, a

presença dessas células estava localizada dentro e ao redor dos granulomas, com

ausência de identificação de células T CD4+.

Gonzalez e colaboradores (1999), através de análise de fenótipos de superfície

de células inflamatórias pela imuno-histoquímica, concluíram que as células T são mais

frequentes nos grupos TT/BT, existindo maior número destas células nestes casos que

36

no grupo LL. Demonstraram também, predomínio de anticorpos contra subpopulações

de células T CD4+ nos casos TT e BT e maior proliferação de células T CD8+ nos casos

LL.

� CD20

É um heterodímero com peso molecular de 33 a 37 kDa, da superfamília

protéica de transposição-transmembrana-4, expressada especificamente em células da

linhagem B do sangue periférico e tecidos linfóides, cuja ligação com os antígenos ativa

as vias dependentes de tirosina quinase, determinando a proliferação e a diferenciação

dos linfócitos B (KINDT, 2008).

Iyer e colaboradores (2007) identificaram nas lesões de pele de pacientes com

hanseníase, através do estudo imuno-histoquímico, um número grande de células CD20+

nos casos dimorfo-virchowianos e nos virchowianos, enquanto que nos dimorfo-

tuberculóides a presença desse marcador foi esporádica, o que reforçou o predomínio da

resposta imune humoral no espectro mais disseminado da doença.

Estudos recentes têm demonstrado papel importante de linfócitos B (CD20) na

defesa contra patógenos intracelulares como bactérias e fungos. Nas lesões de

hanseníase, as células B são cruciais para reduzir o dano tecidual resultante da resposta

vigorosa do hospedeiro ao M. leprae e para a contenção da bactéria através da

manutenção e do desenvolvimento do granuloma (IYER e col., 2007).

� CD138 (Sindecano-1)

É uma proteína transmembrana tipo I heparan-sulfato, membro da família

proteoglicana dos sindecanos, de 30,5 kDa codificada por um gene localizado no braço

curto do cromossomo 2. Os sindecanos medeiam a ligação celular, sinalização celular e

a organização do citoesqueleto, funcionando como uma proteína integral da membrana

celular e participam da proliferação, migração e integração com a matriz celular via

37

receptor para proteínas da matriz extracelular. É expressa em células pré-B, células B

imaturas, plasmócitos, superfícies basolaterais de células epiteliais, células

mesenquimais embrionárias, células do músculo liso vascular, endotélio, células neurais

e de câncer de mama, mas estão ausentes nos linfócitos B maduros circulantes (KINDT,

2008).

Iyer e colaboradores (2007) demonstraram através da análise imuno-

histoquímica num estudo prospectivo em hansenianos, moderada positividade de células

CD79 e CD138 no infiltrado celular dos pacientes dimorfo-virchowianos e nos

virchowianos, enquanto que, nos dimorfo-tuberculóides a positividade ou a

negatividade foi esporádica, confirmando a presença de células B maturas e

plasmócitos, respectivamente, naquelas lesões, resultando no aumento dos títulos de

anticorpos circulantes naquelas formas de hanseníase.

� FOXP3

Fator de transcrição da família das proteínas FOX, de 50 a 55 kDa, expresso em

células T reguladoras naturais, envolvido na modulação da resposta imunológica contra

diferentes patógenos (MURPHY, 2010). Células T reguladoras que expressam o

FOXP3 são críticas na determinação de tolerância imunológica, suprimindo a função de

células T auto-reativas, além de modificar a apresentação de algumas doenças, como a

tuberculose, cuja presença de células Tregs em elevada frequência, está associada com a

redução dos níveis de IFN-γ e no comprometimento funcional das células T, o que tende

a determinar uma evolução da doença para o pólo mais grave (RIBEIRO-RODRIGUES

e col., 2006).

Massone e colaboradores (2009) demonstraram através de um estudo

retrospectivo envolvendo vinte hansenianos, a presença de células FOXP3+ em 95% dos

casos, com uma densidade média de 2,9% do infiltrado, sem diferença estatística na

38

expressão nos casos TT, BT, BL e LL, enquanto que um significante incremento foi

observado na reação reversa comparado aos pacientes com eritema nodoso hansênico e

nas formas não reacionais. Esses autores também constataram, que nas formas TT e BT,

as células encontravam-se dentro e ao redor dos granulomas, enquanto que, nos BL e

LL estavam dispostas difusa e aleatoriamente no infiltrado inflamatório.

Taflin e colaboradores (2009) sugeriram que a presença de células Treg

(FOXP3+) dentro dos granulomas apresenta papel mais preventivo do que curativo, com

função protetora na manutenção da tolerância imunológica.

� TIA-1 (Antígeno 1 intracelular de células T)

Trata-se de proteína associada a grânulos citoplasmáticos, de 17 kDa, expressa

em células com capacidade citotóxica, podendo estar envolvida na sinalização da

apoptose mediada pela cascata de Fas (IZQUIERDO, 2005).

Harvell e colaboradores (2003) demonstraram a expressão do marcador TIA-1

em leucócitos polimorfonucleares, eosinófilos, mastócitos e em dermatoses benignas

como líquen plano, psoríase, líquen escleroso, morféia, lúpus eritematoso, dermatite

herpetiforme, urticária e eritema anular centrífugo, modificando a idéia que essa

proteína era específica de linfócitos T citotóxicos.

Massone e colaboradores (2011) ao avaliarem o imunofenótipo do infiltrado de

linfócitos em hansenianos co-infectados com o vírus da Imunodeficiência Adquirida

através da técnica de imuno-histoquímica, observaram que as células FOXP3+ e TIA-1+

foram detectadas dentro e ao redor dos granulomas nos pacientes TT e BT, e

distribuídas difusamente no infiltrado macrofágico nos BL, sendo que mais de 75% das

células CD8+ apresentavam o fenótipo de citotoxicidade (TIA-1).

39

Tratamento da hanseníase

O tratamento da hanseníase preconizado pelo Ministério da Saúde se baseia na

poliquimioterapia, oficialmente desde 1990, responsável pela drástica redução da

endemia e pela proposta de se evitar o aparecimento de resistência medicamentosa

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2000).

Para os casos paucibacilares, recomenda-se dapsona 100 mg por dia, auto-

administrada, e rifampicina 600 mg, uma vez por mês, supervisionada, nos pacientes

adultos, seis doses. Estes pacientes não poderão ter mais de três faltas seguidas nas

tomadas mensais da rifampicina. A alta por cura é dada, caso o paciente complete as

seis doses do esquema em até nove meses consecutivos (MINISTÉRIO DA SAÚDE,

2009).

Nos pacientes multibacilares, o esquema preconizado é dapsona dose mensal de

100 mg supervisionada e 100mg auto-administrada, rifampicina 600mg supervisionada

e clofazimina 300mg mensal, com administração supervisionada, e 50 mg auto-

administrada. Será dada a alta quando os pacientes completarem 12 doses em até 18

meses, não podendo haver mais que quatro faltas consecutivas nas tomadas das doses

mensais (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).

HELMINTOS INTESTINAIS

Helmintos ou vermes são animais metazoários, que podem parasitar várias partes

do corpo humano, e através das alterações imunológicas por eles determinadas são

capazes de influenciar na resposta imunológica a outras doenças infecciosas (MOREAU

e col., 2010).

40

Os helmintos podem ser classificados em três grandes grupos: nematódeos ou

vermes cilíndricos; cestóides ou vermes chatos desprovidos de tubo digestivo; e

trematódeos, os vermes providos de ventosas (REY, 2008).

Os nematóides mais frequentes são: Ascaris lumbricoides, Ancylostoma

duodenale, Necator americanus, Enterobius vermicularis, Wuchereria bancrofti,

Trichuris trichiura e Strongyloides stercoralis; no grupo dos cestódeos destacam-se:

Taenia solium e Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Hymenolepis nana e

Hymenolepis diminuta; e dentre os trematódeos a Fasciola hepática e Schistosoma

mansoni (REY, 2008).

Infecções parasitárias por helmintos intestinais, como por exemplo, a

ascaridíase, tricuríase e ancilostomíase são frequentes, 26%, 17% e 15%,

respectivamente, em países de baixo e médio nível de desenvolvimento, sobretudo

naqueles com condições sócio-econômicas e higiênicas precárias (SUPALI e col.,

2010), onde são consideradas problema de saúde pública (MONTRESOR, 2003).

As maiores taxas de infecções por Ascaris ocorrem na China, Sudeste da Ásia,

nas regiões costeiras África Ocidental e na África Central. As infecções por Trichuris

apresentam sua maior prevalência na África Central, Sul da Índia e Sudeste da Ásia e as

infecções por ancilostomídeos são mais comuns na África Sub-Saariana, Sul da China e

Sudeste da Ásia (SILVA e col., 2001; MONTRESOR, 2003).

Mesmo com essa alta frequência de infecções parasitárias, não são consideradas

prioritárias pelas autoridades de saúde, por não estarem associadas com alta

mortalidade. No entanto, as enteroparasitoses podem afetar o equilíbrio nutricional, pois

interferem na absorção de nutrientes, induzem sangramento intestinal, reduzem a

ingestão alimentar e ainda podem causar complicações como obstrução intestinal,

41

diarréia crônica, crises epilépticas, hipertensão portal, prolapso retal e formação de

abscessos (REY, 2008).

O espectro e a prevalência parasitária variam nas diferentes regiões brasileiras,

de acordo com as condições climáticas, sanitárias, sócio-econômicas e educacionais de

cada área. Ludwig e colaboradores (1999) estabeleceram uma correlação entre as

condições de saneamento básico e a frequência de parasitoses e evidenciaram uma

relação inversa entre a prevalência de exames parasitológicos de fezes positivos e a

população atendida por melhoria das condições de saneamento básico.

Imunologia nas infecções helmínticas

Tanto a resposta imune inata quanto a adquirida do hospedeiro são de

fundamental importância no controle das infecções helmínticas, e ambas dependem de

inúmeros fatores, dentre os quais se destacam: a) carga parasitária: intensidade de

infecção, b) espécie do helminto: ciclo de vida, habitat definitivo e migração, c) estágio

de infecção: aguda ou crônica, d) frequência de exposição: primo-infecção, re-infecção

ou tratamento anti-helmíntico prévio, e e) fatores genéticos e intrínsecos do hospedeiro:

estado nutricional, imunomodulação promovida por produtos parasitários e status

imunológico (WANG e col., 2008; HELMBY, 2009).

Apesar do complemento e de outros fatores da resposta imune natural

contribuírem para a defesa contra a infecção pelos helmintos, a resposta imune

específica com a produção de anticorpos é de suma importância na eliminação desses

parasitas. Há forte estimulação da resposta imune Th2, com expressão aumentada das

citocinas IL-4, IL-5 e IL-13, as quais, dentre outras funções, induzem a produção de IgE

pelas células B e ativação de eosinófilos, mastócitos e basófilos, componentes

42

fundamentais na defesa contra helmintos (BENTWICH e col., 1996; MULCAHY e col.,

2003; HELMBY, 2009).

Dados recentes indicam que moléculas lipídicas derivadas de helmintos

(PAMPS) são responsáveis pela ativação de TLR2 (Toll Like Receptor), que induzem

tanto a expressão de células T reguladoras (inibem a produção de citocinas pró-

inflamatórias e a expressão de moléculas co-estimulatórias, MHC II), quanto estimulam

as células dendríticas no direcionamento da resposta Th2 (VAN DER KLEY e col.,

2002; MULCAHY e col., 2003; HEWITSON, 2009; EVERTS, 2010; SMITS e col.,

2010). Esse fenômeno explica como a estimulação imune crônica, contínua,

determinada pela infecção crônica por nematóides é tolerada apesar da forte resposta

Th2 (BORKOW e col., 2000).

Para facilitar sua sobrevivência em hospedeiros imunocompetentes, os helmintos

desenvolveram sofisticadas estratégias, incluindo a capacidade de modular e manipular

o sistema imune do hospedeiro. Essa habilidade em alterar a resposta imune, torna o

hospedeiro hiporresponsivo, através da indução de células T reguladoras e modulação

da resposta imune inata, tais como macrófagos, células dendríticas e células do estroma

local, com aumento de níveis de IL-10 e TGF-β, como também interfere na resposta

imune contra antígenos parasitários e na proteção contra outros patógenos (HELMBY,

2009).

Através da indução de células T reguladoras (CD4+CD25+FOXP3+ Treg) e do

desvio do sistema imune para Th2, infecções por nematóides intestinais apresentam

papel benéfico no controle de desordens auto-imunes e nas doenças que cursam com

resposta imune celular exacerbada, em que há predomínio da resposta Th1, como no

caso das doenças inflamatórias intestinais (WANG e col., 2008). No entanto, a

43

interferência das infecções por nematóides intestinais tem evidenciado papel deletério

na evolução de outras doenças infecciosas (HELMBY, 2009; SMITS, 2010).

Bentwich e colaboradores (1999) demonstraram que indivíduos co-infectados

pelos HIV e S. mansoni apresentaram cargas virais elevadas em comparação com

indivíduos HIV em áreas não-endêmicas, não portadores dessa verminose. No entanto,

quando a terapêutica anti-helmíntica foi administrada aos infectados pelo S. mansoni,

houve redução da carga viral plasmática do HIV, comparável aos indivíduos não

infectados, em áreas não endêmicas. Este fato sugere que o tratamento com drogas anti-

helmínticas é capaz de restaurar a resposta imune e retardar a progressão da doença,

como por exemplo, na infecção pelo HIV.

Tristão-Sá e colaboradores (2002) encontraram em um estudo caso-controle,

uma maior frequência de nematóides intestinais no grupo com tuberculose pulmonar

quando comparado ao grupo controle sem tuberculose, sugerindo que o efeito

modulador da resposta imunitária induzida por nematóides intestinais possa ter

contribuído para a infecção pelo Mycobacterium tuberculosis e/ou progressão da doença

(TRISTÃO-SÁ e col., 2002).

Considerando-se que a imunidade efetiva contra o Mycobacterium tuberculosis é

dependente da eficiência da resposta imunitária Th1/Th17, é possível que uma infecção

prévia por nematóides intestinais possa facilitar uma infecção subsequente pela

micobactéria e/ou promover a progressão da doença para formas mais severas, através

do aumento da atividade de células T reguladoras ou da produção de citocinas Th2

(DINIZ e col., 2010).

Diniz e colaboradores (2001), em um estudo caso-controle retrospectivo,

observaram um aumento na frequência da infecção por nematóides intestinais em

pacientes com hanseníase quando comparados aos controles (pacientes sem hanseníase,

44

controlados para idade e gênero e oriundos de um mesmo hospital), sendo essa relação

mais significativa nas formas mais graves da doença, ou seja, nas formas dimorfa e

virchowiana da doença. Esses dados sugerem que a infecção por helmintos intestinais

pode facilitar a infecção por Mycobacterium leprae e/ou a progressão da doença para o

polo lepromatoso.

Diniz e colaboradores (2010), em um estudo prospectivo de hansenianos

multibacilares com nematóides intestinais, demonstraram um aumento significativo na

liberação das citocinas IL-4 e IL-10 em culturas de células do sangue periférico destes

pacientes, estimuladas com antígenos do M. leprae, quando comparados a pacientes não

infectados por helmintos intestinais. Esses dados sugeriram que a presença de helmintos

possa ter favorecido a resposta imune Th2.

Estudos em seres humanos têm sugerido que infecções por helmintos afetam

também a susceptibilidade à infecção por malária. Spiegel e colaboradores (2003)

mostraram que crianças infectadas pelo Schistosoma mansoni, especialmente aquelas

com alta carga parasitária, apresentaram uma frequência maior de surtos de ataques

maláricos. Porém, outros estudos sugeriram que a indução de citocinas anti-

inflamatórias por infecções helmínticas concomitantes, foi capaz de reduzir a resposta

inflamatória e suprimir o desenvolvimento de malária cerebral (HELMBY, 2009).

Geiger e colaboradores (2002) demonstraram, através da condução de um estudo

em duas comunidades rurais (Motas e Pires), localizadas a 70 km da cidade de Belo

Horizonte, na região Sul, que a co-infecção Ascaris lumbricoides e/ou Trichuris

trichiura e a alta carga parasitária, não somente resultou no aumento da resposta celular

específica contra os parasitas, como também reduziu a resposta Th1. Foi observado

também, que citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-12 e IFN-γ) estavam suprimidas

45

no grupo com alta carga parasitária, mono infectados com Ascaris ou co-infectados

pelos Ascaris lumbricoides e Trichuris trichiura.

Tendo em vista que os mecanismos reguladores induzidos por agentes

infecciosos também inibem a exacerbação da resposta Th1, seria esperado que as

infecções tivessem capacidade de prevenir o surgimento de doenças auto-imunes.

Summers e colaboradores (2003) demonstraram através de um ensaio clínico, que a

exposição a helmintos inibiu as manifestações clínicas da doença de Crohn e da

retocolite ulcerativa, doenças auto-imunes, através da regulação da resposta Th1.

Silva e colaboradores (2010) conduziram um estudo transversal com o objetivo

de avaliar a associação entre a dermatite atópica e a ascaridíase em crianças entre dois e

dez anos, residentes no bairro de Pedregal, Campina Grande (PB), área de baixos

indicadores sócio-econômicos. Verificou-se, através desse estudo, que a exposição

parasitária diminuiu a ocorrência da forma grave da dermatite atópica devido à

tolerância imunológica.

A observação em países em desenvolvimento, com alta carga de infecções

parasitárias, sugeriu um efeito protetor das infecções parasitárias contra as

manifestações alérgicas mediadas pela IgE. Nesses países, a prevalência de doenças

atópicas é muito menor do que nas nações industrializadas. As infecções parasitárias se

correlacionam com a produção de IL-10, induzida por helmintos, a qual, por sua vez, foi

inversamente associada à sensibilização alérgica. Esses achados sugeriram que as

propriedades anti-inflamatórias da IL-10, induzida pela infecção por helmintos, podem

atenuar a resposta alergênica ou promover tolerância (VAN DEN BIGGELAAR e col.,

2000). Essa relação inversa com sensibilidade reduzida ao teste cutâneo foi demonstrada

em infecções por helmintos, tais como: ascaridíase, tricuríase e ancilostomíase

(COOPER e col., 2003).

46

Portanto, o que se observa, é que as infecções helmínticas causam alterações nas

células T, no perfil de ativação dessas células, determinando importante impacto na

resposta imune do hospedeiro, o que culmina na interferência da defesa a outras

doenças, aumentando ou diminuindo a capacidade do hospedeiro em reagir a outros

patógenos.

47

3.0 - OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

� Determinar as características imuno-histoquímicas das lesões das formas

clínicas da hanseníase em pacientes com e sem helmintos intestinais.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

� Realizar estudo epidemiológico para verificar a existência de associação entre as

variáveis: a) forma clínica da hanseníase e classificação operacional, b)

diagnóstico clínico e histopatológico, c) forma clínica e sexo dos pacientes, e d)

presença de verminoses e sexo dos pacientes.

� Analisar a presença e frequência de células CD4+, CD8+, CD20+, CD138+, TIA-

1+ e FOXP3+ através da imuno-histoquímica, em amostras de biópsias de lesões

de pele, de pacientes com o diagnóstico clínico-histopatológico de hanseníase

com e sem verminose intestinal.

48

4.0- METODOLOGIA

4.1-Tipo de estudo e caracterização da amostra

Estudo descritivo, baseado na análise retrospectiva de prontuários e de exames

anátomo-patológicos de biópsias de pele de pacientes atendidos no período de 1995 a

2010, no Serviço de Dermatologia e Patologia do Hospital Universitário Cassiano

Antônio Moraes, situado em Vitória (Espírito Santo).

Esses prontuários foram selecionados mediante análise prévia dos arquivos

existentes no Serviço de Dermatologia, de todos os pacientes que foram submetidos à

biópsia e ao exame histopatológico e encaminhados à sessão de dermatopatologia,

realizada uma vez por semana.

Quando identificado um caso de hanseníase, através da análise do prontuário,

confirmado tanto clinica quanto histologicamente, eram anotados os seguintes dados

dos pacientes: idade, sexo, forma clínica de apresentação da doença, diagnóstico

histopatológico e a presença ou ausência de verminose e a espécie envolvida.

Em seguida, foram separados os blocos de parafina da biópsia cutânea desses

pacientes, que se encontravam no Setor de Patologia do Hospital, e foram

encaminhados para o Serviço de Imunologia do Hospital da Universidade de Graz,

Graz, Áustria, para a realização da análise imuno-histoquímica para a pesquisa de

marcadores anti-CD4, anti-CD8, anti-CD20, anti-TIA-1, anti-CD138 e anti-FOXP3.

4.2- População

Pacientes atendidos no período de 1995 a 2010, no Serviço de Dermatologia do

HUCAM, com o diagnóstico de hanseníase e que, após a suspeita clínica, foram

submetidos à biópsia e exame anátomo-patológico de lesão de pele.

49

Critérios de Inclusão dos pacientes:

♦ Pacientes com diagnóstico clínico de hanseníase e confirmado pelo

exame histopatológico.

♦ Pacientes que realizaram exame parasitológico de fezes e tiveram seu

resultado anotado no prontuário médico

Critérios de Exclusão dos pacientes:

♦ Pacientes com hanseníase confirmada pelo exame histopatológico, mas

que não realizaram ou não foi anotado no prontuário o resultado do

exame parasitológico de fezes.

4.3- Método Imuno-histoquímico

O exame imuno-histoquímico, técnica essencialmente qualitativa, consiste no

método de análise molecular dos tecidos, observado ao microscópio, buscando

identificar as características moleculares das doenças. Esse procedimento foi realizado a

partir do processamento dos blocos de parafina obtidos do Setor de Patologia do

Hospital Universitário Cassiano Antônio Moraes e encaminhados para o Serviço de

Imunologia do Hospital da Universidade de Graz, Graz, Áustria.

As fitas de parafina e as etapas consistiram em: microtomia, com a obtenção de

cortes histológicos de dois a três µm de espessura. As fitas de parafina obtidas no

processo de corte pela microtomia foram cuidadosamente colocadas em banho-maria

histológico e os cortes depositados em lâminas previamente tratadas com 3-

aminopropiltrietxisilano (APTS). As lâminas com os cortes foram levadas à estufa a

60ºC e deixadas por 24 horas para melhor adesão do tecido.

50

Os cortes passaram por três banhos de xilol, por pelo menos cinco minutos cada,

e três banhos em uma série de diluições de etanol indo de etanol 100% a etanol a 10%

de álcool absoluto (10 segundos em cada), para completar a desparafinização. Por

último, foram deixadas em banho de solução salina tamponada (PBS, pH 7,2) por cinco

minutos. Após as lâminas terem permanecido por pelo menos cinco minutos no PBS,

foram transferidas para a bandeja e iniciaram-se os procedimentos de bloqueio,

recuperação de epítopos e incubação. Procedeu-se ao bloqueio da peroxidase endógena

com dois banhos, de 10 minutos cada, de solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) a

3% em metanol; seguindo-se de lavagens com água destilada e PBS (pH 7,2). As

lâminas foram incubadas no ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) a 0,1 mM para

recuperar os epítopos de CD4 e CD8, pelo calor, durante quatro minutos, contados a

partir da fervura, seguindo-se de lavagens em água corrente e destilada. Após as etapas

de recuperação de antígeno, as lâminas foram mergulhadas novamente na solução salina

de PBS (pH 7,2), transferidas para a bandeja e incubadas com os anticorpos específicos

(anti-CD4, anti-CD8, anti-CD20, anti-CD138, anti-FOXP3 e anti-TIA-1), diluído em

tampão PBS, durante 16 a 18 horas a 4°C, em câmara úmida. Após a incubação durante

a noite, as lâminas foram lavadas com PBS e os anticorpos secundários adicionados. O

anticorpo secundário empregado nessa técnica foi marcado com biotina, e a enzima

apresentou-se sob a forma de um complexo diretamente ligado a avidina ou

estreptoavidina.

O anticorpo secundário ligado à biotina foi submetido à incubação por 30

minutos e então, se procedeu com novas lavagens em PBS. Acrescentou-se o complexo

estreptoavidina conjugado com a peroxidase, incubou-se por mais 30 minutos e

novamente realizou-se lavagem com PBS, enxugando o excesso e pingando a solução

de 3,3’-Diaminobenzidine (DAB), substância cromógena, que ficou por cinco minutos.

51

Finalizado os cinco minutos, as lâminas foram mergulhadas em água corrente, contra-

coradas com hematoxilina, hidratadas, diafanizadas e montadas com bálsamo e

analisadas através de um microscópio óptico.

4.4- Análise estatística

As variáveis foram estudadas através do programa de estatística SPSS 17.0 e

Prisma 5 OSX, versão 5 de 2009, tomando-se como base o nível de significância p <

0,05.

Para a análise da concordância clínico-histopatológica foi empregado o teste

kappa, que se baseia no número de casos cujo resultado é o mesmo entre os

diagnósticos. O kappa varia de -1 a +1. O valor +1 representa total concordância entre

os dois avaliadores, ou seja, os dois avaliadores classificaram todos os domínios

exatamente da mesma forma, o valor zero significa a existência de relação entre as

classificações dos dois avaliadores, e o valor -1 significa que os dois avaliadores

classificaram exatamente o oposto, sugerindo discordância, mas não a intensidade da

discordância. Em geral, observam-se as seguintes classificações para a interpretação do

kappa: menor de 0,40 significando pequena concordância, valores entre 0,41 e 0,60

representando concordância regular, valores entre 0,61 e 0,80, boa concordância e maior

de 0,80 excelente concordância.

4.5 – Considerações Éticas

O projeto foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da

Saúde, da Universidade Federal do Espírito Santo, sob o número 042/11, sendo

aprovado em Reunião Extra Ordinária realizada em 04 de maio de 2011.

52

O estudo não trouxe prejuízos aos sujeitos envolvidos. Os participantes tiveram

assegurado sua identidade no anonimato, de acordo com o prescrito na Resolução

196/96 do Conselho Nacional de Saúde, que contêm diretrizes e normas

regulamentadoras de pesquisas envolvendo seres humanos, e todos os aspectos éticos e

legais referentes às fases do projeto foram respeitados de acordo com essa resolução.

53

5.0- RESULTADOS

Foram selecionados no arquivo de Dermatologia, 152 pacientes atendidos

durante o período do estudo, com o diagnóstico clínico de hanseníase e confirmado pelo

estudo histopatológico das lesões cutâneas. Destes, 101 prontuários foram obtidos no

arquivo geral do Hospital (SAME), sendo, portanto, excluídos 51 por não serem

disponibilizados pelo setor. Em seguida procedeu-se a análise dos prontuários obtidos,

sendo excluídos 58 prontuários por falta de registro de exame parasitológico de fezes

(EPF), quer seja pela não anotação do resultado deste exame ou pela ausência de

solicitação por parte da equipe, e por falta de dados clínicos e/ou histopatológicos dos

pacientes.

152 pacientes do arquivo do Serviço de Dermatologia submetidos à sessão de dermatopatologia com confirmação diagnóstica de hanseníase

51 pacientes excluídos por falta de prontuários no arquivo do hospital

101 prontuários encontrados no arquivo do hospital

53 prontuários com registro do EPF

16 pacientes com EPF positivo para nematóides

05 pacientes com EPF positivo para protozoários

32 pacientes com EPF negativo

11 blocos encontrados

20 blocos encontrados

01 bloco encontrado

58 prontuários excluídos: sem registro do EPF e sem dados clínicos e

histopatopatológicos registrados

Figura 1: Fluxograma na obtenção dos prontuários e blocos dos pacientes do estudo.

04 blocos não encontrados

12 blocos não encontrados

05 blocos não encontrados

07 blocos analisados pela

imuno-histoquímica

04 blocos não analisados pela

imuno-histoquímica

17 blocos analisados pela

imuno-histoquímica

03 blocos não analisados pela

imuno-histoquímica

01 bloco analisado pela imuno-histoquímica

54

Dos 53 prontuários de pacientes com hanseníase e com registro de EPF,

dezesseis eram positivos para nematóides, cinco positivos para protozoários e trinta e

dois apresentavam resultado negativo para helmintos e protozoários.

Dos dezesseis pacientes que apresentaram o resultado do exame parasitológico

positivo para nematóides, onze blocos de parafina estavam disponíveis no Setor de

Patologia do Hospital, dos cinco com protozoários foi disponibilizado um bloco, e dos

trinta e dois com resultado negativo no exame, vinte foram encontrados, como pode ser

observado no fluxograma acima.

Esses trinta e dois blocos de parafina de pacientes com hanseníase co-infectados

pelos nematóides intestinais, protozoários e sem a co-infecção foram encaminhados ao

Serviço de Imunologia do Hospital da Universidade de Graz, Graz, Áustria, e

submetidos ao estudo imuno-histoquímico, realizado pelo colaborador Dr. Cesare

Massone.

Dos onze blocos disponibilizados de pacientes com a co-infecção hanseníase e

nematóides intestinais, sete puderam ser analisados pelo exame imuno-histoquímico,

sendo quatro indisponíveis para o exame, quer seja, pela qualidade ruim do bloco ou da

biópsia muito superficial; dos vinte blocos de pacientes com hanseníase sem nematóides

intestinais, dezessete puderam ser analisados, sendo três excluídos pelas mesmas razões

anteriormente mencionadas; e o bloco do paciente co-infectado com Entamoeba coli e

Entamoeba hystolitica pode ser estudado.

A idade mediana dos cinquenta e três pacientes do estudo foi de 43 anos (desvio

padrão de 17 anos e nove meses), sendo a idade mínima de 16 anos e a idade máxima de

78 anos. A caracterização da faixa etária pode ser avaliada na Tabela 1. Em relação ao

sexo, vinte e nove (54,7%) pacientes eram femininos e vinte e quatro (45,3%)

masculinos.

55

Tabela 1- Caracterização dos 53 pacientes segundo a faixa etária.

Faixa etária n % 16 a 19 anos 2 3,8 20 a 29 anos 13 24,5 30 a 39 anos 8 15,1 40 a 49 anos 8 15,1 50 a 59 anos 8 15,1 60 a 78 anos 14 26,4 Total 53 100

A distribuição dos 53 pacientes em relação às formas clínicas da hanseníase

comparada ao resultado do estudo histopatológico das lesões cutâneas pode ser

observada na Tabela 2. Nenhum paciente teve suspeita clínica de hanseníase

indeterminada. Os diagnósticos clínicos nem sempre coincidiram com as formas

clínicas observadas ao exame histopatológico da lesão cutânea. Três pacientes os quais

não tiveram como primeira hipótese diagnóstica a hanseníase, mas sim outras doenças

dermatológicas, como granuloma anular, carcinoma basocelular e vasculite,

apresentaram confirmação de hanseníase ao exame histopatológico, sendo dois da forma

tuberculóide e um da forma virchowiana da doença.

No estudo, observou-se boa concordância (kappa = 0,61) entre o diagnóstico

clínico e o histopatológico (Tabela 2), sendo que a concordância foi maior para as

formas polares: HT e HV (Figura 2), o que de certo modo era esperado, uma vez que

essas formas da doença apresentam características clínico-histológicas peculiares,

enquanto que as formas dimorfas são imunologicamente instáveis, dificultando o

diagnóstico.

56

Tabela 2 – Distribuição dos 53 pacientes pelos diagnósticos clínicos e os resultados dos

exames histopatológicos, com a estatística kappa.

Diagnóstico histopatológico Kappa Diagnóstico Clínico HI HT HDT HDV HV HT (14 casos) 2 12 0 0 0 HDT (16 casos) 1 4 9 1 1 HDV (4 casos) 0 0 0 3 1 HV (16 casos) 0 0 0 1 15 Outros (3 casos) 0 2 0 0 1 Total 3 18 9 5 18

0,61*

* Coeficiente estatisticamente significante. Legenda: HI (Hanseníase Indeterminada), HT (Hanseníase Tuberculóide), HDT (Hanseníase Dimorfa-Tuberculóide, HDV (Hanseníase Dimorfa-Virchowiana), HV (hanseníase Virchowiana). Figura 2: Correlação do diagnóstico clínico com o resultado do estudo histopatológico

dos 53 pacientes analisados.

Legenda: Legenda: HI (Hanseníase Indeterminada), HT (Hanseníase Tuberculóide), HDT (Hanseníase Dimorfa-Tuberculóide, HDV (Hanseníase Dimorfa-Virchowiana), HV (hanseníase Virchowiana).

O resultado do histopatológico foi adotado como padrão na classificação da

hanseníase. Desta forma, trinta (56,6%) pacientes eram paucibacilares (HI, HT e HDT)

e 23 (43,4%) eram multibacilares (HDD, HDV e HV), pela classificação operacional da

Organização Mundial de Saúde (Figura 3).

57

Figura 3 – Distribuição dos 53 pacientes em percentual segundo classificação

operacional da Organização Mundial de Saúde.

56,6%

43,4%

Paucibacilar Multibacilar

Dentre os 24 pacientes masculinos, nove (37,5%) eram paucibacilares (um HI,

três HT e cinco HDT) e quinze (62,5%) eram multibacilares (quatro HDV e onze HV).

Dos vinte e nove pacientes do sexo feminino, vinte e um (72,4%) eram paucibacilares

(dois HI, quinze HT e quatro HDT) e oito (27,6%) multibacilares (um HDV e sete HV),

conforme demonstrado na Tabela 3 e na Figura 4. Foi observado, então, que o sexo

feminino foi mais frequente nos casos paucibacilares e o masculino nos casos

multibacilares (p < 0,05).

Tabela 3 - Relação entre o sexo dos pacientes e a classificação operacional dos 53

pacientes analisados.

Sexo Classificação Operacional Masculino Feminino Total

p-valor

Casos Paucibacilares 9 (37,5%) 21 (72,4%) 30 (56,6%) 0,02 Casos Multibacilares 15 (62,5%) 8 (27,6%) 23 (43,4%) 0,02 Total 24 (100%) 29 (100%) 53 (100%) -

58

Figura 4 - Números absolutos do cruzamento entre o sexo e o diagnóstico

histopatológico dos 53 pacientes do estudo.

11

45

1

3

7

1

4

2

15

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

HI HT HDT HDV HV

Pac

ien

tes

(n)

Masculino Feminino

Legenda: Legenda: HI (Hanseníase Indeterminada), HT (Hanseníase Tuberculóide), HDT (Hanseníase Dimorfa-Tuberculóide, HDV (Hanseníase Dimorfa-Virchowiana), HV (hanseníase Virchowiana).

Os episódios reacionais (reação reversa e/ou eritema nodoso), aos quais os

pacientes podem ter apresentado durante o tratamento, com consequente necessidade do

uso de corticosteróides ou talidomida, não puderam ser avaliados por falta de dados

clínicos anotados nos prontuários dos pacientes.

Em relação ao tratamento adotado nos pacientes do estudo, dos 30 pacientes

paucibacilares, dezessete (56,7%) utilizaram a PQT/PB, e os demais paucibacilares

(n=13 pacientes, 43,3%) a PQT/MB, como também, todos (23 pacientes) os

multibacilares, conforme demonstrado na Tabela 4 e Figura 5.

59

Tabela 4 – Correlação entre o tratamento adotado e a classificação operacional dos 53

pacientes estudados.

Classificação operacional Tratamento

Paucibacilar Multibacilar Total p-valor

PQT-PB 17 (56,7%) 0 (0,0%) 17 (32,1%) 0,000 PQT-MB 13 (43,3%) 23 (100%) 36 (67,9%) 0,000 Total 30 (100%) 23 (100%) 53 (100%) -

Figura 5 – Números absolutos do cruzamento entre o tratamento adotado e a

classificação operacional OMS dos 53 pacientes.

17

0

13

23

0

5

10

15

20

25

Paucibacilar Multibacilar

Pac

ien

tes

(n)

PQT-PB PQT-MB

Legenda: PQT-PB (poliquimioterapia paucibacilar); PQT-MB (poliquimioterapia multibacilar).

Trinta e sete pacientes (69,8%) não apresentavam comorbidades na história

clínica, quatro (7,5%) tinham diabetes mellitus, um era portador de infecção pelo

HIV/SIDA (1,9%), um estava em tratamento de linfoma não-Hodgkin (1,9%) e dez

(18,9%) pacientes, outras doenças que não determinavam imunossupressão, tais como:

hipertensão arterial, epilepsia, anemia e doença pulmonar obstrutiva crônica (Figura 6).

60

Figura 6- Distribuição percentual dos 53 pacientes segundo comorbidades.

18,9%

1,9%

1,9%

7,5%

69,8%

0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0%

Ausente

Diabetes Mellitus

Linfoma NãoHodgkin

HIV/SIDA

Outras

Dos 53 pacientes, 32 (60,4%) não apresentavam nem helmintos e nem

protozoários ao exame parasitológico de fezes, 16 (30,2%) eram positivos para

helmintos e cinco (9,4%) para protozoários (Entamoeba coli e Entamoeba histolytica),

conforme demonstrado na Tabela 5 e nas Figuras 7 e 8.

Tabela 5: Resultados dos exames parasitológicos de fezes dos 53 pacientes.

Variáveis n % Exame Parasitológico de Fezes Negativo 32 60,4 Ascaris lumbricoides 8 15,1 Strongyloides stercoralis 3 5,7 Enterobius vermicularis 2 3,8 Ancylostomídeos 2 3,8 Entamoeba coli e Entamoeba histolytica 5 9,4 Schistosoma mansoni 1 1,9 Helmintos Negativo 32 60,4 Presente 16 30,2 Protozoários 5 9,4 Presença de Helmintos Ausente 37 69,8 Presente 16 30,2 Total 53 100

61

Figura 7- Distribuição percentual dos 53 pacientes segundo resultado do exame

parasitológico de fezes.

60,4%

15,1%

5,7%

3,8%

3,8%

9,4%

1,9%

0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0%

Negativo

Ascaris lumbricoides

Strongyloides stercoralis

Enterobius vermicularis

Ancylostomídeos

Entamoeba coli eEntamoeba histolytica

Schistosoma mansoni

Figura 8- Distribuição dos 53 pacientes de acordo com a positividade ou negatividade do exame parasitológico de fezes.

Figura 12 - Distribuição dos 53 pacientes de acordo com a positividade ou

negatividade do exame parasitológico de fezes.

Dos 16 hansenianos co-infectados pelos helmintos intestinais, oito (50%) eram

positivos para Ascaris lumbricoides, três (18,7%) para Strongyloides stercoralis, dois

(12,5%) para Ancylostomídeos, dois (12,5%) para Enterobius vermicularis, um (6,25%)

para Schistosoma mansoni, como visualizado na Figura 13, sendo onze (68,75%) do se

62

Dos 16 hansenianos co-infectados pelos helmintos intestinais, oito (50%) eram

positivos para Ascaris lumbricoides, três (18,7%) para Strongyloides stercoralis, dois

(12,5%) para Ancylostomídeos, dois (12,5%) para Enterobius vermicularis, um (6,25%)

para Schistosoma mansoni, como visualizado na Figura 8, sendo onze (68,75%) do sexo

masculino e cinco (31,25%) do sexo feminino (Figura 9).

Dos trinta e sete não co-infectados pelos helmintos intestinais, treze (35,1%)

eram do sexo masculino e vinte e quatro (64,9%) do sexo feminino, como demonstrado

na Tabela 6 e Figura 10, com predomínio de exames parasitológicos de fezes negativos

no sexo feminino, embora sem significância estatística (p=0,05).

Figura 9 – Distribuição dos 16 pacientes co-infectados pelos helmintos e pela

hanseníase de acordo com a espécie de helminto detectada ao exame parasitológico de

fezes.

8

3

2 2

1

0

2

4

6

8

10

Ascarislumbricoides

Strongyloidesstercoralis

Enterobiusvermicularis

Ancylostoma sp Schistosomamansoni

63

Tabela 6 – Correlação entre o sexo dos 53 pacientes e a presença ou não de helmintos

ao exame parasitológico de fezes.

Sexo Helmintos

Masculino Feminino Total p-valor

Ausente 13 (54,2%) 24 (82,8%) 37 (69,8%) 0,05 Presente 11 (45,8%) 5 (17,2%) 16 (30,2%) 0,05 Total 24 (100%) 29 (100%) 53 (100%) -

Figura 10- Números absolutos da correlação entre o sexo dos 53 pacientes e a presença

de helmintos ao exame parasitológico de fezes.

24

13

5

11

0

5

10

15

20

25

30

Masculino Feminino

Pac

ient

es (n

)

Ausentes Presentes

Dos 23 pacientes classificados como multibacilares, treze (56,5%) eram

negativos para helmintos e dez (43,5%) positivos para helmintos e dos 30

paucibacilares, vinte e quatro (80%) eram negativos para helmintos e seis (20%)

apresentavam positividade para helmintos, sem diferença estatística no cruzamento

entre positividade de helmintos e a classificação operacional (Tabela 7 e Figura 11).

64

Tabela 7 – Correlação entre a classificação operacional OMS e a presença ou não de

helmintos ao exame parasitológico de fezes.

Figura 11 – Números absolutos do cruzamento entre a classificação operacional OMS e

a presença de helmintos no exame parasitológico de fezes.

24

13

6

10

0

5

10

15

20

25

30

Paucibacilar Multibacilar

Pac

ient

es (n

)

Ausentes Presentes

Dos vinte e quatro pacientes masculinos, onze (45,8%) não tinham vermes ao

exame parasitológico de fezes, cinco (20,8%) apresentaram Ascaris lumbricoides, três

(12,5%) Strongyloides stercoralis, três (12,5%) pacientes apresentavam,

respectivamente, os vermes Enterobius vermicularis, Ancylostomideo e Schistosoma

mansoni e dois (8,4%) os protozoários Entamoeba coli e Entamoeba histolytica. Dos

vinte e nove pacientes do sexo feminino, vinte e um (72,4%) eram negativos ao EPF,

Classificação operacional Helmintos

Paucibacilar Multibacilar Total p-valor

Ausente 24 (80,0%) 13 (56,5%) 37 (69,8%) 0,12 Presente 6 (20,0%) 10 (43,5%) 16 (30,2%) 0,12 Total 30 (100%) 23 (100%) 53 (100%) -

65

três (10,3%) positivos para Ascaris lumbricoides, um (3,45%) paciente apresentava

Enterobius vermicularis, um (3,45%) Ancylostomídeo e três (10,4%) eram positivos

para protozoários. Estes dados podem ser visualizados na Figura 12.

Figura 12 - Correlação entre a positividade ou negatividade do exame parasitológico de

fezes com o sexo dos 53 pacientes.

2

11 11

3

5

21

0

5

10

15

20

25

30

Nematóides Protozoários Negativo

Pac

ien

tes

(n)

Masculino Feminino

Dos cinquenta e três pacientes do estudo, foi possível a realização da imuno-

histoquímica em vinte e cinco (47,2%), sendo sete (28%) co-infectados com helmintos,

dezessete (68%) sem a co-infecção com helmintos ou protozoários, e um (4%) co-

infectado por protozoário.

A distribuição dos vinte e cinco pacientes em relação ao sexo, idade, forma

clínica, diagnóstico histopatológico de lesão cutânea, classificação operacional,

resultado do exame parasitológico de fezes e o perfil imuno-histoquímico pode ser

observada na Tabela 8.

66

Tabela 8 - Distribuição dos vinte e cinco pacientes segundo o sexo, idade, forma clínica da hanseníase, histopatologia das lesões cutâneas, classificação operacional, presença de helmintos e perfil imuno-histoquímico.

Legenda: ID (Identificação); M (Masculino); F (Feminino); CBC (Carcinoma Basocelular); MHI (Hanseníase

Indeterminada); MHT (Hanseníase Tuberculóide); MHDT (Hanseníase Dimorfo-Tuberculóide); MHDV (Hanseníase

Dimorfo- Virchowiana); MHV (Hanseníase Virchowiana); OMS (Classificação Operacional da Organização Mundial

de Saúde); PB (Paucibacilar); MB (Multibacilar); EPF (Exame Parasitológico de Fezes).

Frequência (%) ID Sexo

Idade

(anos)

Diag.

Clínico

Histo-

patologia OMS EPF

CD4 CD8 CD20 CD138 FOXP3 TIA1

1 F 65 CBC MHT PB Ascaris lumbricoides 0 90 10 15 10 90

2 M 40 MHV MHV MB Ascaris lumbricoides 0 95 5 100 15 90

3 M 20 MHT MHT PB Ascaris lumbricoides 0 98 2 0 0 100

4 M 69 MHDT MHT MB E. coli e E. histolytica <1 85 15 30 5 90

5 F 44 MHT MHT PB Enterobius vermicularis <1 95 5 10 5 90

6 M 77 MHT MHT MB Enterobius vermicularis 5 75 20 5 8 90

7 F 55 MHDT MHT PB Ascaris lumbricoides 0 90 10 2 0 100

8 M 78 MHDV MHDV MB Ascaris lumbricoides 0 90 10 5 0 100

9 M 37 MHDT MHDT MB Negativo 0 98 2 100 3 100

10 F 43 MHT MHI MB Negativo 0 100 0 0 2 100

11 M 49 MHV MHV MB Negativo 2 5 3 50 5 100

12 F 73 MHT MHT PB Negativo <1 98 2 0 3 100

13 F 29 MHV MHV MB Negativo 0 90 10 0 5 85

14 F 66 MHDT MHDT MB Negativo 0 100 0 0 10 100

15 M 26 MHDT MHT PB Negativo <1 90 10 0 5 90

16 F 66 MHT MHT PB Negativo <1 80 20 2 10 85

17 F 53 MHT MHT PB Negativo <1 98 2 0 9 95

18 F 42 MHT MHT PB Negativo 3 80 17 0 13 90

19 F 57 MHV MHV MB Negativo 0 97 3 100 4 100

20 F 37 MHT MHI PB Negativo <1 90 10 10 15 100

21 F 57 MHDT MHDT MB Negativo <1 100 0 0 3 90

22 M 57 MHV MHV MB Negativo 0 95 5 5 0 100

23 F 67 MHDV MHDV MB Negativo 0 70 30 5 0 80

24 M 27 MHDT MHDT MB Negativo 0 100 0 0 0 90

25 F 25 MHDT MHDT MB Negativo 0 75 25 5 0 100

67

Dos vinte e cinco pacientes que foram analisados através da imuno-

histoquímica, observou-se predomínio de células T CD8+ no infiltrado inflamatório de

todos os pacientes estudados, isto é, dos pacientes com hanseníase multibacilar co-

infectados e não co-infectados com helmintos e dos casos paucibacilares com e sem a

co-infecção, sem diferença estatística entre os grupos, sendo que, a maioria dessas

células CD8+ apresentava o fenótipo de citotoxicidade (TIA-1+ CD8), atingindo

aproximadamente 95% de todo o infiltrado celular, como pode ser visualizado nas

Figuras 13 e 14.

Nota-se que no grupo dos pacientes paucibacilares co-infectados e não co-

infectados com helmintos, a disposição das células CD8+ predominou ao redor do

granuloma de células epitelióides (Figuras 14 A e B) enquanto que no grupo dos

multibacilares co-infectados e não co-infectados essas células estiveram dispostas

difusamente por todo o infiltrado inflamatório (Figura 14 C e D).

Em relação às células FOXP3+, marcadoras de células T reguladoras, observou-

se predomínio no grupo dos pacientes paucibacilares em relação aos multibacilares, com

significância estatística (p=0,045). A disposição dessas células em relação aos grupos

de pacientes avaliados pode ser visualizada na Figura 15.

As células CD20+, marcadoras de células da linhagem B, estiveram mais

presentes no grupo de pacientes paucibacilares em relação aos multibacilares, com

significância estatística (p=0,035), e dentre os multibacilares, houve predomínio dessas

células nos pacientes multibacilares co-infectados com helmintos em relação aos

pacientes multibacilares não co-infectados (p=0,005). Observa-se que no grupo dos

pacientes paucibacilares, as células CD20 estavam dispostas predominantes ao redor do

granuloma e em maior frequência que no grupo multibacilar (Figura 16).

68

Constatou-se, também, ligeiro aumento de células CD4+ no grupo de pacientes

paucibacilares em relação aos multibacilares, sem significância estatística entre os

grupos (p=0,051), e com baixa representação dessas células em todos os grupos de

pacientes (Figura 13 e 17).

Níveis reduzidos de células CD138+ foram detectados no infiltrado celular dos

pacientes não co-infectados e co-infectados tanto paucibacilares como multibacilares,

sem diferenças estatísticas entre os grupos (Figura 13).

69

Figura 13 - Frequência de células com os marcadores CD4, CD8, CD20, CD138,

FOXP3 e TIA-1CD8 em hansenianos paucibacilares e multibacilares com e sem co-

infecção.

Legenda: HD - total de pacientes com hanseníase; HDV- pacientes com hanseníase co-

infectados com vermes; HDP - pacientes paucibacilares não co-infectados; HDM -

pacientes multibacilares não co-infectados; HDVP- pacientes paucibacilares co-

infectados com vermes; HDVM - pacientes multibacilares co-infectados com vermes.

70

Figura 14- Marcação pela imuno-histoquímica de células T CD8+ no grupo de pacientes

paucibacilares e multibacilares co-infectados e não co-infectados com helmintos.

14.A- Lesão de paciente paucibacilar co-infectado

14.B- Lesão de paciente paucibacilar não co-infectado

71

14.C- Lesão de paciente multibacilar co-infectado

14.D- Lesão de paciente multibacilar não co-infectado

Legenda: 14.A e B- Imuno-histoquímica evidenciando a disposição de células T CD8+ no grupo de

pacientes paucibacilares (PB) ao redor do granuloma de células epitelióides, tanto no grupo co-infectado

(Figura 14.A) quanto no não co-infectado (Figura 14.B); 14.C e 14.D- Disposição aleatória de células T

CD8+ no grupo de pacientes multibacilares (MB) no infiltrado inflamatório tanto no grupo co-infectado

(Figura 14.C) quanto no não co-infectado (Figura 14.D).

72

Figura 15- Frequência de Células FOXP3+ no grupo de pacientes paucibacilares e

multibacilares co-infectados e não co-infectados com helmintos.

15.A- Lesão de paciente paucibacilar co-infectado

15.B- Lesão de paciente paucibacilar não co-infectado

73

15.C- Lesão de paciente multibacilar co-infectado

15.D- Lesão de paciente multibacilar não co-infectado

Legenda: 15.A e B- Imuno-histoquímica demonstrando a disposição de células FOXP3+ no grupo de

pacientes paucibacilares (PB), ao redor e dentro do granuloma de células epitelióides, tanto no grupo co-

infectado (Figura 15.A) quanto no não co-infectado (Figura 15.B); 15.C e 15.D- Disposição aleatória de

células FOXP3+ no grupo de pacientes multibacilares (MB) no infiltrado inflamatório, tanto no grupo co-

infectado (Figura 15.C) quanto no não co-infectado (Figura 15.D).

74

Figura 16- Frequência de Células CD20+ no grupo de pacientes paucibacilares e

multibacilares co-infectados e não co-infectados com helmintos.

16.A- Lesão de paciente paucibacilar co-infectado

16.B- Lesão de paciente paucibacilar não co-infectado

75

16.C- Lesão de paciente multibacilar co-infectado

16.D- Lesão de paciente multibacilar não co-infectado

Legenda: 16.A e B- Imuno-histoquímica demonstrando a disposição de células CD20+ no grupo de

pacientes paucibacilares (PB), ao redor do granuloma de células epitelióides, tanto no grupo co-infectado

(Figura 16.A) quanto no não co-infectado (Figura 16.B); 16.C e 16.D- Menor marcação de positividade

pela imuno-histoquímica de células CD20+, no grupo de pacientes multibacilares (MB) no infiltrado

inflamatório, tanto no grupo co-infectado (Figura 16.C) quanto no não co-infectado, sendo maior nos

primeiros (Figura 16.D).

76

Figura 17- Frequência de Células T CD4+ no grupo de pacientes paucibacilares e

multibacilares co-infectados e não co-infectados com helmintos.

17.A- Lesão de paciente paucibacilar co-infectado

17.B- Lesão de paciente paucibacilar não co-infectado

77

17.C- Lesão de paciente multibacilar co-infectado

17.D- Lesão de paciente multibacilar não co-infectado

Legenda: 17.A, B, C e D- Imuno-histoquímica evidenciando baixa frequência de células T CD4+ no

infiltrado inflamatório nos grupos de pacientes paucibacilares (PB) - Figura 17.A e 17.B e nos pacientes

multibacilares (MB), tanto co-infectados (Figura 17.C) quanto nos não co-infectados (Figura 17.D), com

predomínio dessas células no interior do granuloma de células epitelióides no grupo paucibacilar.

78

6.0 - DISCUSSÃO

A hanseníase, ainda determinante de grande impacto econômico em vários

países em desenvolvimento, em especial no Brasil, apesar de raramente determinar o

óbito, é considerada deformante, incapacitante e estigmatizante. Comporta-se como uma

doença espectral, cujas manifestações clínicas são influenciadas e determinadas pelo

tipo de direcionamento dos mecanismos efetores da resposta imune do hospedeiro

(SCOLLARD e col., 2006).

Os dados do estudo foram obtidos de forma retrospectiva, por busca ativa de

prontuários e de material biológico de pacientes com diagnóstico confirmatório de

hanseníase, por isso, foram encontradas inúmeras dificuldades, tais como: prontuários

extraviados, registros incompletos e/ou insuficientes dos pacientes e falta de resultados

de exames. Assim como, houve prejuízo pela ausência de disponibilização do bloco de

parafina de lesão cutânea do paciente com o diagnóstico de hanseníase no setor de

Patologia do Hospital, quer seja pela perda de material, ou impossibilidade de análise

pela técnica de imuno-histoquímica, pela deterioração do bloco de parafina e/ou biópsia

de pele muito superficial. Todos estes fatos determinaram a exclusão de grande parcela

de pacientes e evidenciaram a importância de se melhorar o sistema de registro e

armazenamento de prontuários e de material biológico, e a necessidade de

informatização dos dados dos pacientes, a fim de se evitar perdas e prejuízos

importantes, tanto para o paciente quanto para a equipe de assistência.

Dos 53 pacientes do estudo, a mediana de idade encontrada foi de 43 anos,

sendo a faixa etária mais acometida entre 30 e 59 anos (43,3%), compatível com os

dados do SINAN do Ministério da Saúde de 2009, que detectou como mais frequente a

faixa etária entre 30 e 59 anos (52,4%) e corrobora os dados da literatura, como

evidenciado nos estudos de Aquino e colaboradores (2003) e de Hinrichsen e

79

colaboradores (2004), que encontraram as faixas etárias de maior frequência da

hanseníase entre 14 e 44 anos (63,3%) e 35 e 64 anos (39%), respectivamente. O longo

período de incubação para a manifestação da doença determina o aparecimento da

hanseníase em faixas etárias como as encontradas no estudo (TALHARI e col., 2006).

Houve ligeiro predomínio do sexo feminino em relação ao masculino, sendo que

os dados representaram os pacientes de um estudo retrospectivo, com muitas exclusões,

não refletindo a totalidade dos casos com hanseníase que procuram à assistência médica

no Estado do Espírito Santo. No Brasil, 55,2% dos casos de hanseníase aparecem no

sexo masculino e 44,8% no sexo feminino (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009). Nos

estudos de Bakker e colaboradores (2002) e de Lima e colaboradores (2010), não houve

diferença significativa entre homens e mulheres, já Lana e colaboradores (2000)

encontraram 55,3% de casos de hanseníase no sexo feminino.

Os casos paucibacilares predominaram no estudo, embora não refletissem os

dados totais do período, devido às exclusões. No Espírito Santo, os casos paucibacilares

têm sido mais frequentes, demonstrando a tendência ao diagnóstico mais precoce da

doença, graças à maior divulgação sobre a hanseníase nos meios de comunicação ou

devido às campanhas realizadas pelo Ministério da Saúde, Estado e Municípios e a

busca ativa pelas equipes de saúde da família, caracterizando o declínio da doença. No

Espírito Santo em 2009, os casos paucibacilares foram 56,5% e os multibacilares 43,4%

do total dos casos de hanseníase (SINAN, 2009). Segundo o Boletim Epidemiológico da

Organização Mundial de Saúde de setembro de 2011 (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL

DA SAÚDE, 2011), a porcentagem de casos multibacilares entre os novos casos de

hanseníase no Brasil era de 40,88%, sendo muito variáveis as frequências entre os casos

paucibacilares e os casos multibacilares nas diversas regiões brasileiras (MINISTÉRIO

DA SAÚDE, Portal Saúde/Gov.)

80

Dentre os pacientes paucibacilares, observou-se predomínio do sexo feminino e

dentre os multibacilares o sexo masculino foi, com significância estatística, o mais

acometido, corroborando com as notificações brasileiras, onde os hansenianos do sexo

feminino com a forma indeterminada e tuberculóide representaram 56,4% e 55,4%

respectivamente, e 60,3% dos pacientes com as formas dimorfa e 73% dos

virchowianos eram do sexo masculino (SINAN, 2009).

Os estudos de Hinrichsen e colaboradores (2004) e Lima e colaboradores (2010)

evidenciaram o predomínio dos casos multibacilares no sexo masculino e dos

paucibacilares no feminino. Vásquez e colaboradores em 2008 realizaram um estudo

descritivo em Coari (Amazonas) com análise dos casos de hanseníase no período de

1997 a 2006 e encontraram 226 casos, sendo 160 (70,8%) no sexo masculino e 144

(63,7%) eram multibacilares. Longo & Cunha (2006) num estudo entre 1994 e 2005 no

Hospital Universitário de Mato Grosso do Sul encontraram 192 casos de hanseníase,

sendo 62,5% no sexo masculino, dos quais 101 eram multibacilares. Miranzi e

colaboradores (2010) num estudo entre 2000 e 2006, no Município de Uberaba (Minas

Gerais) de um total de 455 casos, encontraram 252 (55,4%) no sexo masculino e 69,1%

tinham a hanseníase dimorfa. Já Campos e colaboradores (2005) num estudo em Sobral

(Ceará) entre 1997 e 2003, onde foram notificados 1305 casos, 661 (50,3%) eram do

sexo feminino, inclusive com aumento importante do coeficiente de detecção nas

mulheres em 2003.

A razão para as formas mais graves serem mais frequentes entre os pacientes

masculinos pode estar relacionada à maior susceptibilidade dos homens às infecções,

uma vez que os andrógenos diminuem a competência imunológica, diferindo dos

estrógenos que aumentam tanto a resposta imune celular quanto a humoral (KLEIN,

81

2000), além dos fatores comportamentais, que podem influenciar na demora a procura

de assistência médica, determinando o diagnóstico tardio da doença.

Em relação ao diagnóstico clínico, constatou-se que a forma indeterminada não

foi aventada em nenhum momento, e em três casos, o primeiro pensamento era de

vasculite, granuloma anular e carcinoma basocelular, no entanto, eram de hanseníase

virchowiana e tuberculóide, reforçando a importância do estudo histopatológico no

auxílio do diagnóstico clínico, quando a lesão cutânea deixa dúvidas diagnósticas.

A concordância entre os diagnósticos clínicos e histopatológicos foi boa no

estudo (Kappa igual a 0,61), sendo mais elevada nas formas tuberculóide e virchowiana,

e menor para a forma clínica dimorfa-tuberculóide, imunologicamente instável. As

formas polares determinam lesões mais características, facilitando o diagnóstico clínico,

já as formas instáveis podem gerar muitas dúvidas no diagnóstico.

Deve ser lembrado que o estudo histopatológico se baseia em critérios

patológicos de um pequeno fragmento de uma área da lesão cutânea, não refletindo o

total da lesão, justificando as discordâncias clínico-histológicas. Bhatia e colaboradores

(1993) encontraram concordância de 69% entre o diagnóstico clínico de hanseníase e os

achados do exame histopatológico de fragmentos de pele, Kalla e colaboradores (2000)

de 64,5% e Khan e colaboradores (2004) de 66%.

O tratamento com a poliquimioterapia não foi compatível nem com a

classificação operacional e nem baseada nos critérios clínico-histopatológicos, havendo

predomínio do emprego do tratamento multibacilar. As causas que provavelmente

explicam a maioria dos pacientes terem recebido tratamento com a poliquimioterapia

multibacilar são: a) receio de profissionais em tratar um caso paucibacilar com a

PQT/PB e não haver cura medicamentosa; b) presença de mais de cinco lesões cutâneas

em um paciente com características clínicas e histopatológicas de caso paucibacilar, que

82

baseado nos critérios diagnósticos de hanseníase do Ministério da Saúde (2000), deve

ser tratado como multibacilar; c) baciloscopia positiva no raspado dérmico em um caso

diagnosticado como paucibacilar pela histopatologia, direcionando o tratamento para

multibacilar. Essas duas últimas justificativas não puderam ser averiguadas, por falta de

registro tanto do número de lesões cutâneas quanto da baciloscopia de raspado dérmico

em grande parte dos prontuários avaliados.

No estudo, apesar do pequeno número de pacientes (53) incluídos na análise dos

dados, uma porcentagem considerada elevada (30,2%) apresentava ao exame

parasitológico de fezes os helmintos intestinais. Isto evidenciou a precariedade das

condições de saneamento básico e de higiene pessoal e a necessidade de melhoria das

condições sócio-econômicas e medidas mais sérias no controle da qualidade dos

alimentos e água nos restaurantes, bares, lanchonetes, escolas, etc. As infecções

helmínticas são muito frequentes em países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento,

devido a pouca ou nenhuma infra-estrutura sanitária, favorecendo a maior exposição e

consequentemente, maior contaminação do solo, água e alimentos pelos ovos e larvas

infectantes dos parasitas (PENNA e col., 1999; CHIEFFI e col., 2003).

Dentre os pacientes com positividade para os nematóides intestinais, o mais

frequente helminto detectado foi o Ascaris lumbricoides, corroborando os dados da

literatura, que demonstraram que esse nematóide está entre os helmintos intestinais mais

prevalentes em seres humanos (STEPHENSON e col., 1990; FERREIRA e col., 1991,

TRISTÃO-SÁ e col., 2001; DINIZ e col., 2001; CARVALHO e col., 2002).

O sexo masculino foi o mais acometido por helmintos, embora sem diferença

estatística entre os grupos. Os dados de um levantamento parasitológico realizado no

Estado de Minas Gerais por Carvalho e colaboradores (2002), demonstraram que dentre

os 18,1% dos escolares parasitados, 52,6% eram do sexo masculino.

83

Não foi observada diferença estatisticamente significante entre a presença de

helmintos e a forma clínica da doença, talvez pelo limitado número de pacientes

arrolados. Houve predomínio dos casos multibacilares nos pacientes co-infectados pelos

helmintos, embora sem diferença entre os grupos, sugerindo a possível influência de

verminoses intestinais no direcionamento da resposta imunológica e na determinação da

forma clínica de hanseníase.

Diniz e colaboradores (2001) evidenciaram um aumento significativo na

frequência de infecções helmínticas em pacientes com hanseníase multibacilar quando

comparados aos paucibacilares e ao grupo controle (sem hanseníase). Hewitson e

colaboradores (2009) descreveram a interferência dos helmintos intestinais no sistema

imune do hospedeiro e Everts e colaboradores (2010) reforçaram o papel dos helmintos

na indução da resposta imune Th2 e T reguladora.

O estudo, apesar do número limitado de pacientes que puderam ser submetidos

ao exame imuno-histoquímico, demonstrou, embora sem significância estatística,

predomínio de células T CD8+ no infiltrado inflamatório de todos os grupos de

pacientes analisados (pacientes paucibacilares co-infectados ou não pelos helmintos e

pacientes multibacilares co-infectados ou não pelos helmintos), o que sugere a

importância dessas células na formação e organização da resposta imunológica contra o

Mycobacterium leprae.

Estes achados discordam dos dados obtidos por Gonzalez e colaboradores

(1999), que demonstraram que no grupo virchowiano as células mais conspícuas foram

os macrófagos, seguidos pelos linfócitos, sendo a subpopulação T CD8+ mais frequente

que a T CD4+; no grupo dimorfo-tuberculóide as células T eram predominantes, com as

CD4+ discretamente mais frequentes que as CD8+, seguidas dos macrófagos; e no grupo

tuberculóide as células T também predominavam, mas com a maior proporção das T

84

CD4+; porém corroboraram o estudo imuno-histoquímico conduzido por Massone e

colaboradores (2011) com a finalidade de investigar a interação entre o Mycobacterium

leprae e a infecção pelo HIV, que evidenciaram predomínio de células T CD8+ em

pacientes com hanseníase co-infectados com HIV, na frequência de 99,4% no infiltrado

inflamatório.

Das células T CD8+ do infiltrado linfocítico das lesões cutâneas dos pacientes

estudados, a maioria apresentava o marcador de citotoxicidade (TIA-1), não diferindo

dentre todos os grupos de pacientes analisados, semelhante aos achados de Massone e

colaboradores (2011), que identificaram a presença desse marcador em mais de 75% das

células T CD8+.

Em relação à frequência de células T CD4+ do infiltrado linfocítico dos pacientes

do estudo, houve ligeiro predomínio no grupo paucibacilar em relação ao multibacilar,

assim como descrito nos estudos de Gonzalez e colaboradores (1999) e Iyer e

colaboradores (2007).

Iyer e colaboradores (2007) detectaram 70 a 80% de células T no infiltrado

celular de pacientes borderleine-tuberculóides, com maior proporção de CD4+, enquanto

que nos pacientes borderleine-virchowianos e virchowianos a concentração de células T

foi moderada, sendo a relação CD4: CD8 de 0,6:1-0,3:1, respectivamente.

Demonstrou-se, com significância estatística, predomínio do marcador FOXP3

nas lesões dos hansenianos paucibacilares não co-infectados em relação aos

multibacilares não co-infectados, sugerindo, provavelmente a importância dessas células

no controle do foco inflamatório, sobretudo, nos casos em que a resposta imune celular

tende a estar exacerbada (TAFLIN e col., 2009).

Massone e colaboradores (2009) evidenciaram que células FOXP3+ se

distribuem dentro e ao redor dos granulomas nas formas clínicas TT e BT,

85

diferenciando das formas BL e LL, que se dispõem difusamente no infiltrado celular.

Esses autores notaram que a distribuição dessas células não estava relacionada com

estruturas granulomatosas ou localização especial, não evidenciando diferenças

estatísticas na expressão de FOXP3+ entre os grupos TT, BT, BL e LL, enquanto que

significativo aumento foi observado naqueles pacientes em reação reversa.

Houve predomínio de células CD20+ nos hansenianos paucibacilares em relação

aos multibacilares e entre os pacientes multibacilares houve maior distribuição de

células com o marcador CD20+ nos co-infectados com vermes, sugerindo que a co-

infecção é capaz de interferir no sistema imunológico, desviando-o para o polo humoral

(Th2).

A possível justificativa para o predomínio de células CD20+ no grupo de

pacientes paucibacilares em relação aos multibacilares é a importância crucial dessas

células no controle da resposta imune do hospedeiro, na tentativa de reduzir o dano

tecidual resultante da resposta vigorosa ao M. leprae e para a contenção bacteriana na

formação e desenvolvimento do granuloma (IYER e col., 2007).

No estudo de Iyer e colaboradores (2007), células CD20+ predominaram nos

grupos em que há exacerbação do sistema imune para Th2, como nos borderline-

virchowianos e nos virchowianos, enquanto que nos dimorfo-tuberculóides a presença

dessa célula foi esporádica.

Níveis indetectáveis de CD138+ (marcador de plasmócitos) foram observados no

infiltrado celular de todos os hansenianos, tanto nos co-infectados, como nos sem

infecção pelos helmintos, assim como, entre os casos paucibacilares e multibacilares

sem helmintos intestinais e co-infectados, discordando do estudo conduzido por Iyer e

colaboradores (2007), que evidenciaram através da análise imuno-histoquímica de

lesões cutâneas de hansenianos, moderada positividade de células CD79 e CD138 no

86

infiltrado celular dos pacientes dimorfo-virchowianos e nos virchowianos, enquanto que

nos dimorfo-tuberculóides a positividade ou a negatividade foi esporádica e sem

significância estatística.

Portanto, nossos achados sugerem, apesar do número limitado de pacientes, que

a realização de rotina de exames parasitológicos de fezes e o tratamento anti-helmíntico,

quando necessário, nos pacientes com hanseníase, portadores de helmintos, possam

contribuir para uma melhor evolução da doença, além de poder interferir na cadeia

epidemiológica de transmissão do Mycobacterium leprae.

87

7.0 – CONCLUSÃO

O estudo, apesar do número limitado de pacientes arrolados, evidenciou o

predomínio de pacientes paucibacilares no sexo feminino e multibacilares no sexo

masculino, com significância estatística.

Houve elevada porcentagem de pacientes com hanseníase co-infectados com

helmintos intestinais, com maior destaque para o Ascaris lumbricoides, sugerindo a

precariedade ainda existente das condições de saneamento básico e de educação

sanitária, com a necessidade de maior conscientização de higiene e de melhoria nas

condições sócio-econômicas da população e de infra-estrutura das cidades.

Além disso, observou-se ligeiro predomínio de exames parasitológicos de fezes

positivo para helmintos no sexo masculino e dos casos multibacilares da hanseníase no

grupo de pacientes co-infectados com vermes, embora sem significância estatística.

O estudo imuno-histoquímico através dos marcadores CD4+, CD8+, TIA-1+,

FOXP3+, CD138+ e CD20+ nas lesões clínicas da hanseníase constatou que não somente

as células T helper desempenham papel importante na formação do granuloma e no

infiltrado inflamatório contra o Mycobacterium leprae, como também outras células,

tais como as reguladoras e as da linhagem B.

Portanto, dados obtidos na condução do estudo sugeriram que as infecções pelos

helmintos intestinais determinam alterações no sistema imunológico, porém estudos

prospectivos, com maior número de casos, se fazem necessários para que se possa

conhecer ainda mais sobre o impacto das infecções helmínticas nas situações de co-

infecção, como na hanseníase.

88

8.0 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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102

APÊNDICE 1 Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da Saúde

103

APÊNDICE 2 Ficha de Anotação dos dados dos pacientes do estudo

1- Identificação

2- Registro prontuário SAME

3- Registro exame anátomo-patológico

4- Sexo F( ) M( )

5- Idade

6- Forma clínica ( ) I ( )TT ( )BT ( )BD ( )BV ( )VV ( ) Outros diagnósticos

7- Diagnóstico Histopatológico ( ) I ( )TT ( )BT ( )BD ( )BV ( )VV

8- IB

9- Classificação operacional ( ) Paucibacilar ( )Multibacilar

10- Tratamento realizado ( ) PQT/PB ( )PQT/MB ( )ROM

11- Comorbidades

• DM S( ) N( ) HAS S( ) N( ) HIV S( ) N( ) • LNH S( ) N( ) Outras..................

12- EPF • Realizado S( ) N( ) • Não realizado S( ) N( ) • Resultado do EPF: ⇒ Helmintos: ( ) Ascaris lumbricoides ( ) Strongyloides stercoralis ( ) Ancilostomídeos ( ) Enterobius vermicularis ( ) Schistosoma mansoni ( ) Trichuris trichiura ⇒ Protozoários S( ) N( ) ⇒ Negativo

13- Exame Anátomo-patológico ( ) Realizado ( ) Não realizado ( ) Bloco encontrado ( ) Bloco não encontrado ou indisponível para análise imuno-histoquímica