UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

RELATÓRIO TÉCNICO-CIENTÍFICO

Período: Março de 2015 a Agosto de 2015

( ) Parcial

(X) Final

Identificação do Projeto

Título do Projeto de Pesquisa: Análise da genômica funcional de Corynebacterium

pseudotuberculosis biotipos ovis e equi sob diferentes condições de estresse

biologicamente relevantes

Orientador: Artur Luiz da Costa da Silva

Titulação do Orientador: Doutor

Faculdade: Faculdade de Biotecnologia

Unidade: Instituto de Ciências Biológicas

Laboratório: Laboratório de Polimorfismo de DNA

Título do Plano de Trabalho: Identificação e descrição do genoma central do gênero

Corynebacterium e caracterização filogenômica de suas espécies

Bolsista: David Batista Maués

Tipo de Bolsa: PIBIC/CNPq

1. Introdução

A família Corynebacteriaceae pertence ao filo Actinobacteria, classe

Actinobacteria e ordem Corynebacteriales, e inclui o gênero Corynebacterium, com

mais de 90 espécies (TAUCH & SANDBOTE, 2014). O gênero Corynebacterium

pertence ao grupo CMRN, que inclui grupos de microrganismos de grande importância

médica, veterinária e biotecnológica, sendo estes Mycobacterium, Nocardia e

Rhodococcus (SOARES et al, 2013).

A bactéria Corynebacterium diphtheriae é uma espécie patogênica que acomete

principalmente humano e causa a difteria, doença contagiosa que atinge o trato

respiratório superior, podendo ocasionar dificuldades ou bloqueio total da respiração. C.

ulcerans causa uma doença semelhante a difteria e os sintomas variam de úlceras de

pele a faringite, sinusite, amigdalite e nódulos pulmonares, sendo comum em países

industrializados como Reino Unido e Alemanha (SOARES et al, 2013).

Nos últimos anos, a espécie Corynebacterium pseudotuberculosis tem sido alvo

de diversos estudos. É uma bactéria gram-positiva, parasita intracelular anaeróbio

facultativo e pleomórfico (DORELLA et al, 2006). É o agente etiológico de diversas

doenças de cunho veterinário, afetando a produção de leite, carne, lã e couro,

ocasionando assim diversas perdas econômicas (SOARES et al, 2013). Em caprinos e

ovinos (biovar ovis) causa a linfadenite caseosa (CLA), doença que ocasiona necrose

nas glândulas linfáticas (DORELLA et al, 2006). Em equinos, bubalinos e bovinos

(biovar equi) causa a linfagite ulcerativa, caracterizada por abcessos externos no

abdômen peitoral ou ventral (SPIER, 2008).

A bactéria Corynebacterium glutamicum é uma espécie não-patogênica, muito

importante para a indústria biotecnológica. Esta é um produtor natural de L-glutamato,

L-lisina e outros aminoácidos essenciais, que são gerados por seleção e mutação

clássica (WENDISCH, 2003).

Dorella et al (2006) apontou uma relação estreita entre C. pseudotuberculosis e

C. ulcerans, pois ambas são as únicas corinebactérias que produzem a toxina fosfolipase

D, um importante fator de virulência. Groman et al (1984) realizou testes experimentais

e observou que algumas cepas de C. ulcerans e C. pseudotuberculosis produziam a

toxina difteria, característica da C. diphtheriae. Esses fatores de virulência

compartilhados por estas três espécies desempenham papel importante na

patogenicidade das mesmas.

Atualmente, foram sequenciados, montados, anotados e depositados no banco de

dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) mais de 20 genomas

de C. pseudotuberculosis. Estes dados possibilitaram diversos estudos de genômica

comparativa, como o pan-genoma realizado por Soares et al (2013), que buscam

caracterizar as diferenças associadas à virulência dessa bactéria, e, assim, pensar uma

forma de desenvolver terapias, drogas e kits de diagnóstico.

2. Justificativa

A importância dos micro-organismos pertencentes ao grupo Corynebacterium é

notória, e sua aplicação varia desde estudos biotecnológicos, como na produção

industrial de aminoácidos pelas espécies C. glutamicum e C. efficiens, até aplicações

médicas, como na elucidação dos aspectos biológicos da interação patógeno-hospedeiro

nas espécies C. pseudotuberculosis, C. diphtheriae e C. ulcerans. No Brasil, os estudos

genômicos da espécie C. pseudotuberculosis utilizando as plataformas NGS foram

desenvolvidos através da cooperação entre a Universidade Federal do Pará e

Universidade Federal de Minas Gerais. A quantidade de dados gerados, portanto,

permite avaliar a similaridade entre as espécies deste gênero utilizando uma abordagem

filogenômica. Além disso, a detecção do genoma central destas espécies foi realizada a

fim de identificar os genes que são essenciais entre este gênero.

3. Objetivos

3.1.Objetivo Geral

Identificar o genoma central de quatro espécies que compõem o gênero

Corynebacterium: C. pseudotuberculosis, C. ulcerans, C. diphtheriae e C. glutamicum.

3.2.Objetivos Específicos

• Comparar a similaridade e identificar proteínas hipotéticas que possam fazer

parte do genoma central destas espécies;

• Analisar o agrupamento entre as diferentes espécies através de análise

filogenômica.

4. Materiais e Métodos

4.1.Genomas sequenciados

Os genomas completos sequenciados das linhagens das quatro espécies de

Corynebacterium foram obtidos do banco de dados do National Center for

Biotechnology Information – NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Dessa forma,

totalizando 45 genomas, sendo: 18 de C. pseudotuberculosis, 12 de C. diphtheriae, 8 de

C. glutamicum e 7 de C. ulcerans.

Tabela 1 – Classificação quanto ao biovar das linhagens de C. pseudotuberculosis.

Linhagens de C. pseudotuberculosis Classificação quanto ao biovar 1002

Ovis

267 3/99-5

42/02-A C231

FRC41 I19

P54B96 PAT10 1/06-A

Equi

258 31 316

CIP 52.97 Cp162

A tabela 1 lista as linhagens de C. pseudotuberculosis classificadas quanto ao

biovar, que podem ser diferenciado devido suas propriedades bioquímicas: o biovar

equi é redução de nitrato positiva, enquanto o biovar ovis é redução negativa de nitrato à

nitrito (DORELLA et al, 2006). As linhagens 48252, Ft_2193 e CS_10, isoladas de

humano, cabra e uma linhagem de laboratório, respectivamente, não foram analisadas

quanto ao classificação de biovar (HAVELSRUD, 2014).

4.2.Análise filogenômica

Para análise filogenômica foi utilizado o software Gegenees (versão 2.2.1)

(AGREN et al, 2012). Inicialmente todos os genomas foram divididos em pequenos

fragmentos, e uma busca por similaridade através dos genomas foi realizada para

caracterizar o conteúdo mínimo compartilhado entre todos eles. Este foi subtraído de

todos os genomas, gerando o conteúdo variável entre estes genomas representados por

percentuais de similaridade em uma matriz (heatmap) (SOARES et al, 2013; AGREN et

al, 2012).

Posteriormente, uma matriz de distância foi gerada para ser utilizada na

construção da árvore filogenômica no software SplisTree (versão.4.13.1) através do

método UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean). Neste

método, são agrupadas as sequências com maior semelhança entre si (menores

distâncias genéticas), e o ponto de ramificação é dado pela média da distância entre o

par de sequências agrupadas, gerando a árvore filogenômica (BRINKMAN & LEIPE,

2001; SOKAL & MICHENER, 1958).

4.3.Predição do genoma central

Para identificação dos genes ortólogos foi utilizado o software PGAP – Pan-

genome analysis pipeline (versão 1.12) (ZHAO et al, 2011). Para execução do

programa, foram fornecidos os arquivos .pep, .nuc e .function de cada um dos genomas.

Estes arquivos foram gerados a partir do arquivo embl, utilizando o software Artemis

(RUTHERFORD et al, 2000). Para a execução do programa PGAP foram adotados os

parâmetros de e-value 0.00001, identidade de 80% e cobertura de 90%.

Para inferir informações biológicas aos produtos codificados por esses genes, como

processos biológicos e funções moleculares (transportador, enzima, regulador etc) utilizou-

se o programa Blast2Go (CONESA et al, 2005), onde adotou-se o nível 3 de classificação

de gene ontology.

5. Resultados e discussão

5.1.Análise filogenômica

Os resultados mostraram que as espécies comparadas apresentam genomas

muito diferentes entre si (Figura 1), com uma similaridade muito baixa, variando entre

1% e 4%, exceto entre C. pseudotuberculosis e C. ulcerans, cuja similaridade é de

aproximadamente 34% entre essas espécies. Infere-se que C. glutamicum deve possuir

maior similaridade com espécies de Corynebacterium não-patogênicas, como a C.

efficiens (SOARES et al, 2013).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Figura 1 – Heatplot com as matrizes de similaridade entre os genomas de quatro espécies do gênero Corynebacterium gerado pelo software Gegenees. Os

números de 1 a 45 localizados na parte superior da figura representam as linhagens das espécies comparadas, da C. diphtheriae 241 à C. ulcerans FRC11,

listadas na parte esquerda da figura, também enumeradas de 1 a 45. A cor vermelha indica baixa similaridade e a cor verde significa alta similaridade.

A figura 2 mostra o heatplot entre as duas espécies que apresentaram maior

similaridade: C. pseudotuberculosis e C. ulcerans. Estudos demonstraram que estas espécies

possuem uma relação muito próxima, seja por características bioquímicas e metabólicas, tais

como serem positivas à urease e algumas cepas de C. pseudotuberculosis não conseguem

reduzir nitrato, quanto à patogenicidade, pois são as únicas corinebactérias que produzem

fosfolipase D (SOARES etl al, 2013;GROMAN et al, 1984).

Figura 2 – Heatplot com as porcentagens de similaridade entre as linhagens de C. pseudotuberculosis e

C. ulcerans.

A figura 3 refere-se ao heatplot entre as linhagens de C. pseudotuberculosis. As cepas

analisadas mostraram alta similaridade entre si, mesmo as que são de diferente biovares (equi e

ovis). As cepas classificadas como ovis apresentaram mais de 99% de similaridade enquanto as

cepas do biovar equi apresentaram uma similaridade variável: entre 95% e 100%. As linhagens

de C. pseudotuberculosis que mais diferenciam entre si pertencem a diferentes biovares,

apresentando diferenças no metabolismo, bioquímica, patogenicidade e interação patógeno-

hospedeiro (DORELLA et al, 2006; SOARES et al, 2013).

Figura 3 – Heatplot com a similaridade entre as linhagens de diferentes biovares de C.

pseudotuberculosis.

A partir dos resultados do software Gegenees, construiu-se a árvore filogenética pelo

software SplitsTree, através do método UPGMA (Figura 4). Assim como a análise

filogenômica, a árvore filogenética mostrou que as espécies patogênicas de Corynebacterium

são mais próximas, enquanto a espécie não-patogênica C. glutamicum não apresentou

similaridade significativa. Estudos filogenéticos realizados por Pascual et al (1995) utilizando o

gene 16S também mostrou que C. diphtheriae, C. pseudotuberculosis e C. ulcerans apresentam

similaridades e pertencem a um grupo filogenético próximo. Também foram realizadas análises

baseadas no gene rpoB, que codifica a subunidade β da RNA polimerase. Os resultados

revelaram que o gene em C. diphtheriae apresentou uma similaridade em torno de 85% em

relação ao gene C. pseudotuberculosis e C. ulcerans, enquanto entre estas duas últimas, ele

apresenta uma similaridade de 93,6% (KHAMIS et al, 2004).

A árvore filogenética gerada também agrupou entre si as linhagens de cada biovar de C.

pseudotuberculosis. Assim, podemos inferir que os biovares possuem algumas diferenças entre

si, que podem estar relacionadas ao metabolismo, resistência ao ambiente e interação patógeno-

hospedeiro.

Figura 4 – Árvore filogenética gerada pelo software SplitsTree.

5.2.Predição do genoma central

Os 45 genomas estudados foram submetidos ao software PGAP para identificar o

conteúdo gênico compartilhado entre eles. Os resultados mostraram que as linhagens estudadas

compartilham entre si 8.124 genes, que foram submetidos ao programa Blast2Go, que os

classificou em diversos processos e funções biológicas baseando-se no terceiro nível de

classificação do banco de dados de ontologia gênica Gene Ontology (GO).

Destes 8.124 genes, 315 estão relacionados à resposta a estresses (Figura 5), sendo que

estes podem estar associados à permanência da bactéria no ambiente hostil do organismo

hospedeiro durante o processo de infecção. Há também 5.013 genes relacionados a processos

biossintéticos, os quais necessitam de uma investigação mais profunda para se compreender

melhor estas vias de biossíntese e explorá-las para a obtenção de um produto que possa ser

utilizado na indústria biotecnológica ou alimentícia, como ocorre com os aminoácidos

produzidos por C. glutamicum.

Figura 5 – Classificação dos processos biológicos dos genes ortólogos das linhagens estudadas

utilizando o nível 3 de classificação baseado no Gene Ontology (GO).

Quanto às funções dos genes, a maioria está relacionada à ligação de compostos

variados, atividade enzimática e função estrutural, como mostrado na figura 6. Adotando-se o

nível 2 de classificação, foram reportados 45 genes associados à atividade antioxidante, cujo

potencial pode ser estudado.

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

Estabelecimento da localização

Processo metabólico de substância orgânica

Processo metabólico primário

Organização dos componentes celulares

Processo metabólico de compostos de nitrogênio

Resposta a estímulos externos

Processo catabólico

Processo celular de organismo único

Resposta a estresse

Metilação

405 3176

6328 180

6185 773

270 6455

3519 45 180

5013 450

45 1035

180 315

45 180 135

Proc

esso

s bi

ológ

icos

Número de genes

Figura 6 – Classificação dos processos biológicos dos genes ortólogos das linhagens estudadas

utilizando o nível 3 de classificação baseado no Gene Ontology (GO).

6. Conclusão

A análise filogenômica mostrou que as espécies comparadas não apresentam grande

similaridade entre si, entretanto, C. pseudotuberculosis e C. ulcerans se apresentaram como as

espécies mais semelhantes, no qual compartilham um pouco de seu material genético, incluindo

fatores de virulência, como o gene pld.

As análises também mostraram que as linhagens do biovar ovis de C.

pseudotuberculosis são mais próximas entre si que as linhagens do biovar equi. A árvore

filogenética, ao reunir as linhagens do biovar equi em um grupo e as do biovar ovis em outro,

indica que esses biovares possuem diferenças em seus genomas.

As análises realizadas através do Blast2Go mostraram que os genes compartilhados

pelas linhagens estudados estão envolvidos em processos básicos e essenciais às células e há

genes que codificam produtos que apresentam potencial para as indústrias farmacêutica,

biotecnológica, cosmética e afins. Porém ainda há a necessidade de realizar diversos estudos

experimentais para elucidar esse potencial.

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Bioinformatics, vol. 28, pág. 416-418. 2011

Dificuldades

As constantes quedas de energia elétrica e de conexão com a internet dificultaram

consideravelmente o trabalho

Parecer do orientador

_________________________________________ ASSINATURA DO ORIENTADOR

____________________________________________ ASSINATURA DO ALUNO