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1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
HAROLDO GURGEL MOTA FILHO
MODULAÇÃO DA ATIVIDADE OSTEOCLÁSTICA IN VITRO MEDIADA POR
DIFERENTES DOSES DO HORMÔNIO DA PARATIREÓIDE
NATAL/RN
2016
2
HAROLDO GURGEL MOTA FILHO
MODULAÇÃO DA ATIVIDADE OSTEOCLÁSTICA IN VITRO MEDIADA POR
DIFERENTES DOSES DO HORMÔNIO DA PARATIREÓIDE
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao
Departamento de Odontologia da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, como parte integrante dos requisitos
para obtenção do título de Cirurgião-Dentista.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza.
NATAL/RN
2016
3
HAROLDO GURGEL MOTA FILHO
Mota Filho, Haroldo Gurgel.
Modulação da atividade osteoclástica in vitro mediada por diferentes doses do
hormônio da paratireóide/ Haroldo Gurgel Mota Filho. – Natal, RN, 2016.
31 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza.
Monografia (Graduação em Odontologia) – Universidade Federal do Rio Gran-
de do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia.
1. Hormônio Paratireóideo – Monografia. 2. Osteoclasto – Monografia. 3. Re-
modelação óssea – Monografia. I. Barboza, Carlos Augusto Galvão. II. Título.
RN/UF/BSO CDU 577.175.4
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
4
A DOSE DO HORMÔNIO DA PARATIREÓIDE MODULA A ATIVIDADE
OSTEOCLÁSTICA IN VITRO
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Departamento de Odontologia da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte integrante dos requisitos
para obtenção do título de Cirurgião-Dentista.
.
Aprovada em: ____/____/_____
Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza
Departamento de Morfologia/UFRN
Profa. Dra. Ruthineia Diogenes Alves Uchoa Lins
Departamento de Odontologia/UFRN
Med. Vet. Esp. Mardem Portela e Vasconcelos Barreto
Departamento de Morfologia/UFRN
5
DEDICATÓRIA
A Deus por sua infinita bondade,
A meus pais, por seu imensurável amor,
A Rodolfo Rufino por seu companheirismo.
6
AGRADECIMENTOS
A Deus,
por continuar me dando forças nos momentos mais difíceis, e sobretudo por ter sido
atendido todas as minhas preces, e por, finalmente poder estar tão próximo de
conquistar meu maior sonho.
A meus Pais,
Por tudo. Por aguentar a distância, por estar presente mesmo estando distante, por
me incentivar quando eu pensei em desistir. Te amo.
A Carlos Augusto Galvão Barboza,
Por todo o conhecimento fornecido durante esses quatro anos e meio sendo seu
orientando. Por, sobretudo, ultrapassar as barreiras acadêmicas e termos
conquistado uma verdadeira e recíproca amizade.
A todos os integrantes do grupo de pesquisa Biologia Crânio Facial,
Sobretudo no nome de Fernanda Ginani, que sempre contribuiu de forma tão direta
no meu aprendizado. Também agradeço a Amanda Alencar, que desde o início da
graduação se mostrou à melhor parceira de laboratório que eu poderia ter, e de hoje
poder contar com a sua verdadeira amizade.
A Rodolfo Rufino,
Por estar ao meu lado durante toda essa jornada e pela imensurável ajuda nos
momentos mais difíceis.
A todos os meus amigos,
Que se mostraram ser minha segunda família.
7
RESUMO
O remodelamento ósseo é um processo regulado pela interação entre células e
diversas moléculas, como o hormônio da paratireoide (PTH). O objetivo do trabalho
foi avaliar a ação de diferentes doses de PTH sobre a atividade osteoclástica em um
modelo de cultura de órgãos ósseos. Camundongos C57Bl/6 (n=14), machos, com
seis dias de nascimento, foram eutanasiados para obtenção das calvárias, que
foram dissecadas e hemissecionadas, conservando-se o periósteo e o endósteo. Os
fragmentos ósseos foram divididos três grupos: Grupo I (controle – sem adição de
PTH), Grupo II (adição de 3 nM de PTH) e Grupo III (30 nM de PTH), todos
cultivados em meio αMEM por até 72 horas. A atividade osteoclástica foi avaliada
pela quantificação bioquímica do cálcio liberado no meio de cultura nos intervalos de
24, 48 e 72 horas e pela análise histomorfométrica das lacunas de reabsorção óssea
em 72 horas. Nossos resultados mostram que o grupo II exibiu valores
significativamente maiores nos níveis de cálcio no meio em comparação com o
grupo I (p<0,05) nos três intervalos de tempo, sendo também maior de que o grupo
III em 24 horas (p<0,05). As lacunas de reabsorção óssea no grupo II mostraram-se
mais amplas (média 4900 µm2/lacuna) e promoveram uma maior área de
desmineralização (média 22052 µm2/campo) do que as encontradas no grupo I
(médias 1042 µm2/lacuna e 2084 µm2/campo) e no grupo III (médias 1492
µm2/lacuna e 8952 µm2/campo). Conclui-se que a atividade osteoclástica do PTH in
vitro é dose dependente, promovendo maior reabsorção óssea quando administrado
em baixas doses.
Palavras-chave: Hormônio da paratireoide; osteoclasto; remodelação óssea.
8
ABSTRACT
Bone remodeling is a process regulated by the interaction between cells and various
molecules such as parathyroid hormone (PTH). The objective of the study was
evaluate the effect of different doses of PTH on osteoclast activity in a culture model
of bone organs. Male C57BL/6 mice (n=14), six-day old, were subbmited to
euthanasia to obtain the calvaria, which were dissected and seccionated in the
middle, keeping the periosteal and endosteal. The bone fragments were divided
three groups: Group I (control - without adding PTH), Group II (addition of 3 nM PTH)
and Group III (30 nM PTH), all cultured in αMEM for up to 72 hours. The osteoclast
activity was evaluated by biochemical quantification of calcium released in the culture
medium at intervals of 24, 48, and 72 hours and by histomorphometric analysis of
bone resorption lacunae at 72 hours. Our results show that group II exhibited
significantly higher values of calcium levels in the medium compared to group I (p
<0.05) in all intervals, being also higher for the group III at 24 hours (p < 0.05). Bone
resorption lacunae in group II were more extensive (average 4900 μm2/gap) and
promoted greater demineralization area (average 22052 μm2/field) than those found
in group I (average 1042 μm2/gap and 2084 μm2/field) and group III (average 1492
μm2/gap and 8952 μm2/field). We concluded that PTH osteoclast activity in vitro is
dose-dependent and promotes higher bone resorption when administered in low
doses.
Keywords: parathyroid hormone; osteoclast; bone remodeling.
9
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................10
2 OBJETIVO..............................................................................................................12
3 METODOLOGIA......................................................................................................13
3.1 Cultivo dos órgãos ósseos................................................................................13
3.2 Análise bioquímica............................................................................................14
3.3 Análise histológico ........................................................................................... 14
3.4 Análise estatística ............................................................................................ 14
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 15
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 18
6 CONCLUSÃO ....................................................................................................... 23
REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 24
ANEXO.......................................................................................................................28
10
1 INTRODUÇÃO
O osso é um tecido mineralizado que confere múltiplas funções mecânicas e
metabólicas ao esqueleto. Este tecido é formado através da proliferação e
diferenciação de células do estroma ao longo de uma via osteogênica de múltiplas
etapas, que é controlada por uma série de eventos envolvendo regulação gênica por
vários hormônios, citocinas e fatores de crescimento [1].
O hormônio da paratireóide (PTH) é produzido nas glândulas paratireóides e
atua no tecido ósseo e rins, controlando a concentração sérica do cálcio e fósforo. É
um hormônio de 84 aminoácidos, cuja fração biologicamente ativa corresponde à
seqüência dos aminoácidos 1-34. O PTH liga-se ao seu receptor específico no rim e
osso pela fração dos aminoácidos 1-34 e seu receptor é denominado
PTH/parathyroid hormone-related protein receptor (PTH/PTHrP), pois pode ser
ativado tanto pelo PTH quanto por fragmentos do PTHrP contendo os aminoácidos
1-34 [2-4].
O PTH aumenta tanto a excreção renal de fósforo quanto a reabsorção renal
de cálcio e acelera a conversão da 25-hidroxicolecalciferol em 1,25-
dihidroxicolecalciferol e assim, indiretamente, aumenta a absorção intestinal de
cálcio e fósforo. No tecido ósseo, o PTH atua nos osteoblastos promovendo a
síntese e secreção de um ativador local de osteoclastos, o que promove um
aumento da atividade destas células e, consequentemente, a reabsorção óssea. Por
outro lado, também é descrito que o PTH pode exercer um efeito anabólico sobre o
tecido ósseo, o que aumenta a massa óssea [2].
A elucidação da fisiopatologia do excesso deste hormônio (causando perda
óssea severa) e sua deficiência (promovendo hipocalcemia) foram unanimidades por
muitas décadas [5]. Com o progresso dos testes de peptídeos do PTH purificados
em humanos, veio o achado paradoxal do hormônio no osso: a administração de
PTH aumenta a massa óssea, especialmente no osso trabecular aumentando a
força/resistência óssea e reduzindo dramaticamente a incidência de fraturas [6-8].
No entanto, o modo de administração é crucial para a ação anabólica do PTH, já que
a infusão contínua da mesma dose do hormônio ou de grandes doses de um de
11
seus fragmentos biologicamente ativos promove o predomínio da ação reabsortiva
em relação à ação anabólica [9].
Alguns passos críticos na ação do PTH que regulam as respostas celulares
específicas que causam um efeito anabólico sobre o esqueleto ainda precisam ser
estabelecidos. O aperfeiçoamento de modelos experimentais, como a cultura de
órgãos ósseos embrionários, é um avanço importante na busca destas questões e
pode estabelecer novas direções na terapia dos distúrbios ósseos humanos.
12
2 OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de duas diferentes doses do hormônio
da paratireóide (PTH) na atividade osteoclástica in vitro, utilizando-se um modelo de
cultura de órgãos ósseos de camundongos.
13
3 METODOLOGIA
O projeto foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no uso de
Animais/CEUA – parecer 008/2009. Camundongos C57Bl/6 selvagens, machos com
6 dias de nascimento foram obtidos do Biotério do Centro de Biociências da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, seguindo os princípios éticos na
Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Os animais foram criados em caixas de polipropileno, com cama de maravalha,
mantidos sob condições controladas de temperatura (22º ± 2ºC), ciclo claro e escuro
de 12 horas, comida e água ad libitum. Os animais (n=14) foram submetidos a
eutanásia (com gás carbônico/CO2 + 10% de oxigênio/O2) para obtenção das
calvárias com o auxílio de um estereoscópio. Os fragmentos de calvárias foram
dissecados sobre condições estéreis em capela de fluxo laminar, englobando os
ossos frontal e temporal e conservando o periósteo e o endósteo. Os espécimes
foram seccionados ao meio, totalizando 28 fragmentos ósseos.
3.1 Cultivo dos órgãos ósseos
Os espécimes foram divididos em grupo controle, cultivados em meio básico
(grupo I) e dois grupos experimentais, cultivados em meio contendo PTH (grupo II e
III). Os órgãos ósseos foram ainda distribuídos em subgrupos, de acordo com o
tempo de cultura: 24, 48 e 72 horas.
No grupo I (controle), os fragmentos foram cultivados em meio α-MEM sem
nucleosídeos (Cultilab, Brasil) e suplementado com 0,05 mg/mL de gentamicina
(Gibco, EUA), 0,25 mg/mL de anfotericina B (Gibco) e 15% de soro equino (Sigma).
Nos grupos experimentais (II e III) foram adicionados, respectivamente, 3 nM (Baixa
Dose) e 30 nM (Alta Dose) de PTH (CIHR Matriz Dynamics, University of Toronto,
Canadá). Os órgãos ósseos foram cultivados individualmente em placas de 24
poços com 300 µL de meio, em estufa a 37 ºC, com 5% de CO2 e 95% de umidade.
Foram utilizados três fragmentos de calvária para cada intervalo de tempo, em cada
um dos grupos estudados.
14
3.2 Análise bioquímica
A atividade osteoclástica foi avaliada através da dosagem do nível de cálcio
no meio de cultura coletado a cada intervalo de tempo, utilizando o kit Total Calcium
LiquiColor (Stanbio, USA), com leitura de absorbância em espectofotômetro a 550
nm. Os dados das três dosagens em cada grupo em cada intervalo de tempo foram
submetidos aos testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Mann Whitney, com nível de
significância de 5%.
3.3.Avaliação histológica
Após o último intervalo de cultivo (72 horas), os espécimes foram fixados em
solução de paraformaldeído a 4% e corados por Alizarin Red para avaliação
microscópica das áreas mineralizadas, através de microscopia confocal (Leica
Microsystems, Germany). Foram obtidas imagens de cinco campos em cada
espécime e as áreas de reabsorção osteoclástica foram avaliadas histometricamente
com auxílio do software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, USA).
3.4 Análise estatística
Os dados relativos às dosagens bioquímicas de cálcio e à análise histológica
das áreas de reabsorção óssea foram submetidos a testes de normalidade e
posteriormente aos testes estatísticos não paramétricos de Kruskal-Wallis e Mann
Whitney, considerando-se um nível de significância de 5% (p<0,05)
15
4 RESULTADOS
A figura 1 mostra as medidas da concentração de cálcio no meio, nos três
diferentes grupos. Nos fragmentos de calvária, a adição de PTH em baixa dose
(Grupo II) promoveu um aumento com diferença estatisticamente nos níveis de
cálcio no meio nos três intervalos de tempo, quando comparado ao Grupo I (p<0,05).
Nos dois grupos experimentais a concentração de cálcio aumentou quando o tempo
de exposição ao PTH foi maior. Diferenças estatísticas significantes foram
encontradas entre o grupo controle e o grupo de alta dose de PTH (Grupo III)
apenas nos intervalos de 48 e 72 horas (p<0,05). Quando se compara os grupos
experimentais que receberam diferentes doses de PTH, observa-se apenas
diferença estatisticamente significativa (p<0,05) no intervalo de 24 horas.
Figura 1 – Concentração de cálcio no meio nos diferentes grupos e nos intervalos de 24, 48
e 72 horas. *Teste estatístico Mann Whitney com p<0,05.
16
Na microscopia, as lacunas de reabsorção promovidas pelo PTH em baixa
dose se mostraram mais numerosas e mais amplas do que aquelas promovidas pelo
PTH em alta dose, como pode ser observado na figura 2.
Figura 2 – Fotomicrografia das áreas de reabsorção óssea em calvárias cultivadas na
ausência (grupo I) ou presença do PTH (grupo II e grupo III) por 72 horas. (Coloração de
Alizarin Red; barra = 50 μm).
A Figura 3 mostra os valores médios das lacunas de reabsorção calculados
nos três grupos. Pode-se observar que o Grupo II, onde foi administrada uma baixa
dose de PTH, apresentou lacunas com maior diâmetro médio (4900 ± 1459 µm2) do
que aquelas encontradas no Grupo III (1492 ± 134 µm2) e no Grupo I (1042 ± 39
µm2), com diferença estatisticamente significativa (p<0,05) entre todos os grupos.
Grupo I
Grupo II
Grupo III
17
Figura 3 – Médias ± desvio padrão das medidas das lacunas de reabsorção nos três grupos
estudados, no intervalo de 72 horas. Letras iguais indicam diferenças estatisticamente
significativas: (a) p<0.0001; (b) p=0,0157; (c) p=0,0002. Teste de Mann Whitney.
Na Figura 4 estão representados os valores médios da soma das áreas de
reabsorção em cada campo histológicos (n=5) de cada espécime, no intervalo de 72
horas. Os dados mostram que o Grupo II exibiu maiores áreas de reabsorção (média
22068 ± 2193 µm2) do que as observadas no Grupo III (8952 ± 246 µm2) e no Grupo
I (2084 ± 38 µm2), com diferença estatisticamente significativa (p<0,0001) entre
todos os grupos.
Figura 4 – Médias ± desvio padrão das somas das áreas de reabsorção por campo
histológico avaliado nos três grupos estudados, no intervalo de 72 horas. Letras iguais
indicam diferenças estatisticamente significativas: (a) p<0.0001; (b) p<0.0001; (c) p<0.0001.
Teste de Mann Whitney.
18
5 DISCUSSÃO
Os efeitos anabólicos de extratos da paratireóide sobre o osso foram
descritos na década de 1930 [10]. Por volta dos anos 1970, os efeitos anabólicos do
PTH foram observados quando o hormônio era injetado in vivo em animais de
experimentação [11], levando à teoria de que a ação anabólica do PTH teria maior
magnitude que sua ação reabsortiva. O PTH incrementaria a massa óssea pelo
aumento do recrutamento e ativação de BMU (basic multicelular units), que atua em
conjunto com os precursores de osteoblastos comprometidos a promover a sua
diferenciação, inibe apoptose de osteoblastos e osteócitos [12] e inibe a produção do
inibidor de formação óssea, sclerostin [13]. No entanto, para exercer seus efeitos
"anabolizantes", seriam necessárias breves exposições e concentrações mais
elevadas do que a média de PTH [14].
Culturas de órgãos ósseos fetais e neonatais, nos quais a interação local
entre células osteoblásticas e osteoclásticas é mantida dentro do contexto da matriz
óssea tridimensional, são freqüentemente usados para análise bioquímica do
remodelamento ósseo [15]. Todavia, poucos estudos examinaram a resposta celular
a fatores que modulam a atividade das células ósseas. Experimentos realizados in
vitro em cultura de tecido (calvária de ratos) demonstraram que a adição do PTH ao
meio de cultura inibia a síntese de colágeno e aumentava a reabsorção óssea,
trazendo certa confusão sobre o assunto [16].
Os resultados do presente estudo corroboram os achados de Suzuki et al.,
2005 [15], mostrando que a adição de baixas doses de PTH no meio de cultura de
órgãos ósseos in vitro promovem um aumento na atividade reabsortiva dos
osteoclastos, maior liberação de cálcio no meio e lacunas de reabsorção
visivelmente maiores do que no grupo com altas doses de PTH.
As ações diferenciadas do PTH sobre formação e reabsorção óssea têm sido
intensamente estudadas e novos aspectos sobre sua ligação com o receptor e as
vias de sinalização intracelular nos osteoblastos têm sido descritas. Os receptores
de PTH foram identificados nos osteócitos, osteoblastos e seus precursores –
células progenitoras pluripotentes de linhagem mesenquimal [17]. Nos osteoclastos
19
ou em seus precursores não foi identificado nenhum receptor de PTH, o que indica
que todos os efeitos do PTH sobre a reabsorção óssea são intermediados pelos
osteoblastos [18].
Além disso, evidências acumuladas demonstram que algumas das ações do
PTH sobre o tecido ósseo são mediadas por efeitos diretos do hormônio em
osteócitos, as células mais abundante no osso [19]. PTH regula negativamente a
expressão do gene Sost, que codifica o inibidor potente de formação óssea
sclerostin, expressa por osteócitos no osso [20, 21], e também aumenta a expressão
do fator de crescimento de fibroblastos 23 (FGF23), um hormônio expresso em
osteócitos (e osteoblastos) que regula a reabsorção de fosfato no rim, que
contribuem para a homeostase mineral [19, 21, 22].
Osteoblastos e células do estroma estão envolvidos na osteoclastogênese
através de suas interações célula a célula com osteoclastos progenitores [23, 24].
Estudos indicam que um dos fatores cruciais para o desenvolvimento de
osteoclastos funcionais é a indução de citocinas, especialmente o ligante do receptor
ativador do fator nuclear kappa B (RANKL). Esta molécula é membro da família do
fator de necrose tumoral, sendo expressa predominantemente por células da
linhagem osteoblástica, com a capacidade de se ligar ao seu receptor de membrana
– RANK, expressos em precursores de osteoclastos sob estímulo do receptor
PTH/PTHrP dos osteoblastos. A identificação das interações RANK/RANKL como o
principal sinal de osteoclastogênese é oriundo de estudos in vitro de diferenciação
de osteoclastos, no qual células hematopoiéticas e células da medula óssea foram
co-cultivadas na presença do PTH ou da vitamina D [25, 26].
Jacome-Galarza et al., 2011 [27] administraram doses diárias de PTH em
ratos por 7 e 14 dias e observaram um aumento da osteoclastogênese in vitro sob
estímulo do RANKL e do fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF).
Baseados nos resultados, os autores sugerem que o tratamento prévio in vivo com
PTH afeta indiretamente os precursores de osteoclastos, tornando-os mais
responsivos ao RANKL e ao M-CSF, o que aumenta a ativação de osteoclastos e
consequentemente a reabsorção óssea nos ensaios in vitro, o que também foi
observado no presente estudo.
20
Nossos resultados corroboram com o estudo de Feng et al., 2015 [28] onde
foi observado um significativo aumento na densidade mineral óssea, no volume de
osso trabecular, no número de osteoblastos, e na atividade da fosfatase alcalina
(ALP) em camundongos alimentados com dieta rica em Ca e tratados com PTH. Os
autores sugerem que grande quantidade de Ca e baixa dose de PTH intermitente
aumenta a expressão de "Ca channel thrombin receptor activator peptide 6" (TRPV-
6), onde sua regulação positiva pode promover a expressão relativa do receptor,
acelerando assim o influxo e acumulação de Ca+2 extracelular.
Jilka et al., 2010 [29] utilizaram doses diárias, durante 5 dias, de PTH (470
ng/h) ou do RANKL (525ng/h) solúvel em camundongos. Resultados mostram que
ambas os grupos aumentaram o número de osteoblastos e osteoclastos no osso
esponjoso, mas a formação óssea foi maior no grupo tratado com PTH. A massa de
osso esponjoso foi mantida em camundongos que receberam PTH, porém foi
diminuída em camundongos que receberam RANKL, indicando que a manutenção
da remodelação equilibrada exige efeitos osteoblastogênicos, além daqueles
mediada pelos osteoclastos.
A osteoprotegerina (OPG) é um receptor solúvel da família do Fator de
Necrose Tumoral (TNF) que inibe a diferenciação e ativação dos osteoclastos por
competir com o RANK pelo RANKL [30], funcionando assim como um fator protetor
da reabsorção óssea. Estudos in vivo demonstraram que infusões contínuas de PTH
desencadeiam uma diminuição da OPG e um aumento do RANKL, capaz de induzir
a diferenciação dos osteoclastos e promover a reabsorção óssea [23].
A ação anabólica do PTH é regulada também pelo receptor adrenérgico β2
(β2AR). Segundo Hanyu et al., 2012 [31], camundongos deficientes para o receptor
β2AR não exibem atividade osteoanabólica, pois a deficiência desse receptor
suprimiu a formação e reabsorção óssea induzida pelo PTH. Os autores sugerem
que a falta de β2AR bloqueia a expressão dos genes que participam na formação e
reabosorção óssea, como o Col1α1, fosfatase alcalina (ALP), e fator de transcrição
relacionados com o Runt (Runx) 2.
A ligação do PTH ao seu receptor cognato é responsável por ativar as
subunidades Gα distintas para sintetizar AMP cíclico, ativar a fosfolipase C para
provocar a liberação de cálcio das reservas intracelulares, e modificar o
21
citoesqueleto de actina. Cada uma destas vias de sinalização está implicada na
mediação mecanosensível de osteoblastos e aos efeitos anabólicos e catabólicos de
PTH no osso [32, 33].
Uma das principais vias de sinalização para o efeito anabólica do PTH está
associado a sua ligação ao receptor do paratohormônio 1 (PTH1R). O receptor
PTH1R está acoplado a proteína G, sendo predominantemente expresso em células
de linhagens osteblasticas no osso. Esta interação é mediada pela Gαs através da
ativação do adenilato ciclase, que estimula a produção de AMPc e posterior ativação
da proteína quinase A (PKA) [12, 34]
As ações de controlar a homeostase mineral extracelular depende em parte
da ativação de quinases reguladas por sinais extracelulares 1 e 2 (ERK1/2), sendo
esta controlada por sequências situadas dentro ou na terminação carboxila do
PTH1R. Por sua vez, a β-catenina regula a sinalização do PTH1R, através da
mudança na sinalização do receptor Gαq para Gαs inibindo a ativação de ERK1/2
pelo PTH [35].
Estudos revelam que a exposição dos osteoblastos à quantidades
intermitentes do PTH induz o aumento da expressão das sub-unidades a3 e d2 do
H+ adenosina trifosfatase do tipo vacuolar (vacuolar-type H+ adenosine
triphosphatase/V-ATPase), que quando ativado acelera a acidificação intracelular e
aumenta a capacidade de reabsorção óssea dos osteoclastos. Os autores sugerem
que o PTH se liga ao PTH1R e aumenta a capacidade de reabsorção óssea dos
osteoclatos através do aumenta da expressão da sub-unidade a3 e d2 [36].
No que se refere ás vias envolvidas na remodelação óssea, estudos in vitro
sugerem que a p38α mitogen activated protein kinase (MAPK) é um importante
componente da sinalização do PTH em linhagens de células osteoblasticas.
Thouverey et al., 2016 [36] observou que ratos submetidos a doses diárias de PTH e
com expressão deficiente do gene P38α não conseguiam estimular a deposição de
matriz extracelular. Enquanto ratos com expressão normal do gene P38α exibiam
aumento no número e na longevidade de osteblastos, e maior deposição mineral. Os
autores sugerem que a P38α é um importante mediador do efeito anabólico no
tratamento com administração diária de PTH [36].
22
As ações pró-osteoclastogênicas do PTH estão associadas com a regulação
positiva de RANKL e regulação negativa da OPG. No entanto, a fase precisa de
diferenciação da célula-alvo que suporta a osteoclastogênese mediada pelo PTH
permanece indefinida [37]. Em conjunto, os dados do presente estudo sugerem que
doses elevadas de PTH podem ativar vias metabólicas diferentes daquelas do PTH
em baixas ósseas, possivelmente via bloqueio de RANKL por osteoprotegerina, o
que explicaria a menor reabsorção óssea encontrada nos espécimes do presente
estudo quando tratados com altas doses de PTH. A literatura mostra divergências
nos resultados dos estudos sobre este tema, sendo necessárias mais pesquisas
para a elucidação do mecanismo da função anabólica do PTH, visando futuras
aplicações clínicas e terapêuticas na regulação da homeostasia do cálcio e na
reabsorção óssea.
23
6 CONCLUSÃO
A atividade osteoclástica do PTH in vitro é dose-dependente, promovendo
maior reabsorção óssea quando administrado em doses mais baixas. A utilização
desse modelo experimental, com utilização de diferentes doses de marcadores,
pode ser considerado um avanço para estabelecer novas direções no
desenvolvimento de futuros estudos pré-clínicos que visem a terapia dos distúrbios
ósseos.
24
REFERÊNCIAS
1. Sodek J, McKee MD. Molecular and cellular biology of alveolar bone.
Periodontology 2000. 2000; 24:99-126.
2. Macintyre, S. The pattering of health by social position in contemporary
Britain: directions for sociological research. Social Science & Medicine. 1986; 23:
393-415.
3. Urena P, et al. Parathyroid hormone (PTH)/PTH-related peptide receptor
messenger ribonucleic acids are widely distributed in rat tissues. Endocrinology.
1993; 133: 617–623.
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28
ANEXO
As normas adotadas nesta monografia seguiram as instruções aos autores para
submissão de artigo no Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial.
ESTRUTURA DO TEXTO
Artigos originais
São contribuições destinadas a divulgar resultados de pesquisa original que possam
ser replicados. Os artigos podem conter até 4 mil palavras. A sua estrutura formal
deve seguir o esquema de apresentação do texto para esse tipo de artigo:
Introdução, Objetivos, Material e Método, Resultados, Discussão, Conclusões e
Referências Bibliográficas.
O uso de subtítulos é recomendado, particularmente na Discussão. Implicações
clínicas e limitações do estudo devem ser claramente apontadas. Sugere-se o
detalhamento do tópico Material e Método. Para esses artigos, exige-se a
apresentação de resumos estruturados em português e inglês, com cabeçalhos
obedecendo à apresentação formal do artigo: Introdução, Objetivos, Material e
Método, Resultados, Discussão, Conclusões e Referências. O Abstract (resumo em
inglês) deve ser precedido pelo título em inglês. As referências bibliográficas devem
aparecer no final do texto, obedecendo às normas especificadas a seguir
REFERÊNCIAS
As referências bibliográficas devem aparecer no final do artigo, e ser numeradas
sucessivamente pela ordem em que são mencionadas pela primeira vez no texto.
Devem seguir as normas do Estilo Vancouver. Os títulos dos periódicos deverão ser
referidos na forma abreviada de acordo com o Index Medicus (List of Journals
Indexed in Index Medicus). Se a lista de referências não seguir a norma adotada, os
trabalhos serão imediatamente rejeitados, sem revisão de conteúdo.
Os autores devem certificar-se de que as referências citadas no texto constam da
lista de referências com datas exatas e nomes de autores corretamente grafados. A
exatidão das referências bibliográficas é de responsabilidade dos autores.
Comunicações pessoais, trabalhos inéditos ou em andamento poderão ser citados,
quando absolutamente necessários, mas não devem ser incluídos na lista de
referências bibliográficas; apenas mencionados no texto ou em nota de rodapé. A
lista de referências deve seguir o estilo dos exemplos abaixo.
Exemplos: Artigos de periódicos (um só autor)
Fry PH. O significado da anemia falciforme no contexto da ‘política racial’ do governo brasileiro 1995-2004. Hist Cienc Saude Manguinhos. 2005; 12: 347-70. PubMed PMID: 16353330.
Artigos de periódicos (até seis autores) Barbosa AJA, Queiroz DM, Mendes EN, Rocha GA, Lima GF Jr, Oliveira CA. Immunocytochemical identification of Campylobacter pylori in gastritis and correlation with culture. Arch Pathol Lab Med. 1988 May; 112(5): 523-5. PubMed PMID: 3282485.
Artigos de periódicos (mais de seis autores) Rocha GA, Queiroz DM, Mendes EN, et al. Indirect immunofluorescence
29
determination of the frequency of anti-H. pylori antibodies in Brazilian blood donors. Braz J Med Biol Res. 1992; 25(7): 683-9. PubMed PMID: 1342599.
Artigo de periódico on-line Polgreen PM, Diekema DJ, Vandeberg J, et al. Risk factors for groin wound infection after femoral artery catheterization: a case-control study. Infect Control Hosp Epidemiol [Internet]. 2006 Jan; 27(1): 34-7. Disponível em: http://www.journals.uchicago.edu/ICHE/journal/issues/ v27n1/2004069/2004069.web.pdf.
Livros no todo (dois autores) Eyre HJ, Lange DP. Informed decisions: the complete book of cancer diagnosis, treatment, and recovery. 2nd ed. Atlanta: American Cancer Society; 2002.
Capítulos ou parte de livro editado por outro autor Mendeenhall WM. Treatment of head and neck cancer. In: DeVita VT Jr, Lawrence TS, Rosenberg SA , editors. Cancer: principles and practice of oncology. 9th ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins; 2011. p. 729-80.
Parte de livro em meio eletrônico São Paulo (Estado). Secretaria do Meio Ambiente. Tratados e organizações ambientais em matéria de meio ambiente. In: São Paulo (Estado). Entendendo o meio ambiente. São Paulo; 1999. v. 1. Disponível em:http://www.bdt.org/sma/entendendo/atual/htm.
Evento em meio eletrônico Christensen S, Oppacher F. An analysis of Koza's computational effort statistic for genetic programming. In: Foster JA, Lutton E, Miller J, Ryan C, Tettamanzi AG, editores. Genetic programming. EuroGP 2002: Proceedings of the 5th European Conference on Genetic Programming; 2002 Apr 3-5; Kinsdale, Ireland. Berlin: Springer; 2002. p. 182-91.
Tese ou dissertação Silva MAL. Estudo da identificação de haplótipos e a relação com as manifestações clínicas em pacientes com doença falciforme. 2008. [dissertação]. Programa de pós-graduação em Ciências Médicas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul; 2008.
Citações no texto Devem ser identificadas por algarismos arábicos (números-índice). Podem também ser acrescentados o nome do autor e o ano. As referências com mais de um autor devem conter o sobrenome do autor seguido da expressão et al., como, por exemplo, Higashi et al.
