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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS CURSO DE BIOMEDICINA
HELENA VARELA DE ARAÚJO ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO MARCADOR CD5 NA LEUCEMIA LINFOCÍTICA
CRÔNICA DE CÉLULAS B (LLC-B)
Natal – Rio Grande do Norte Outubro - 2016
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO MARCADOR CD5 NA LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA DE CÉLULAS B (LLC-B)
por
Helena Varela de Araújo
Orientadora: Prof. Msc. Christiane Medeiros Bezerra
Natal – Rio Grande do Norte
Outubro – 2016
Monografia apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como Requisito Parcial à Obtenção do Título de Bacharel em Biomedicina.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB
Araújo, Helena Varela de. Análise do Marcador CD5 na Leucemia Linfocítica Crônica de Células B (LLC-B) / Helena Varela de Araújo. - Natal, 2016. 53 f.: il. Orientadora: Profa. Ma. Christiane Medeiros Bezerra. Monografia (Graduação) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Curso de Biomedicina. 1. Leucemia Linfocítica - Monografia. 2. Imunofenotipagem - Monografia. 3. Marcador CD5 - Monografia. 4. Citometria de Fluxo - Monografia. I. Bezerra, Christiane Medeiros. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSE-CB CDU 616.155.392
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, demais familiares e amigos, que sempre depositaram tamanha confiança no que escolhi ser, sem nunca duvidar da minha capacidade, até quando eu mesma duvidei. À Maria Cleide de Araújo Lopes, Doutor Henrique Eduardo Macedo Fonseca e demais amigos da Hemato-Oncologistas Associados LTDA e Instituto de Onco-Hematologia de Natal, pela atenção cotidiana. À Christiane Medeiros Bezerra, que com profissionalismo e disponibilidade, me orientou e colaborou imensamente para/com a realização deste trabalho. Aos professores Francisco Paulo Freire Neto e ao Dr. Henrique Fonseca, por aceitarem participar da banca, colaborando com a minha formação. Aos docentes do curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, assim como aos amigos que conquistei durante esses quatro anos e meio de curso. A todos os pacientes portadores de doenças onco-hematológicas, em especial à memória do meu avô Divanilton Pinto Varela e ao meu amigo Gustavo Adolfo Andrade de Sá Filho, com quem pude conviver e aprender bastante durante toda minha trajetória.
A todos vocês, meu muito obrigada.
RESUMO
A leucemia linfocítica crônica de células B (LLC-B) é caracterizada pela proliferação anormal de linfócitos B maduros, funcionalmente incompetentes, que podem ser observados no sangue periférico e/ou na medula óssea. Com o curso clínico indolente, esta doença afeta adultos de idade avançada, acima de 50 anos, sendo estatisticamente mais prevalente em indivíduos do sexo masculino. Tem-se como principal meio de diagnóstico desta doença a imunofenotipagem por citometria de fluxo que possibilita revelar a expressão dos marcadores CD19, CD23 e CD5 nestes linfócitos neoplásicos. O CD5 está mais relacionado a linfócitos T, porém na LLC-B, observa-se expressão aberrante de linfócitos B com esse marcador. O objetivo deste estudo é avaliar, por citometria de fluxo, a expressão do marcador CD5 em 30 pacientes diagnosticados com LLC-B no laboratório de hematologia Hemato-Oncologistas Associados LTDA. Além disso, objetivou-se observar outros padrões hematológicos destes pacientes, utilizando valores de hemograma e citomorfologia. No presente estudo, dos de 30 pacientes, 19 eram do sexo feminino e 11, do masculino, diagnosticados com LLC-B durante março de 2011 e maio de 2016. Os dados hematológicos foram obtidos a partir de analisador hematológico e os aspectos citomorfológicos dos pacientes diagnosticados a partir de agosto de 2015, foram observados por meio de microscopia de distensão de material biológico corado com corante Leishman. Os resultados de imunofenotipagem obtidos por meio do citometro de fluxo BD® FACScan, foram analisados no software CellQuest® de modo a gerar gráficos e porcentagens de reatividade dos marcadores utilizados. Como resultado, observou-se por meio de hemograma leucocitose acentuada e linfocitose. Todos os pacientes tiveram marcação positiva para o CD5, com positividade variando entre 42% e 98%. Este marcador é de imensa importância no diagnóstico de pacientes com LLC-B, por ser capaz de descartar outras neoplasias de linfócitos B.
Palavras Chaves: Leucemia Linfocítica Crônica de células B; imunofenotipagem; marcador CD5; citometria de fluxo.
ABSTRACT
The B cells chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is characterized by the
abnormal proliferation of mature B lymphocytes, that can be observed in peripheral blood and bone marrow. Without any specific symptomatology, this disease affects adults aged specially more than 50 years old. A prevalence of male patients can be statistically observed. One of the most important tests used in B-CLL diagnosis is the immunophenotyping, using flow cytometry. This technique shows the expression of CD19, CD23 and CD5 in this neoplastic lymphocytes. This last marker, the CD5, is a very important key in B-CLL diagnosis because it may differ this disease of other B cells neoplastic diseases. The CD5 is normally correlated with T lymphocytes, but in B-CLL, can be observed an aberrant expression of this marker. The objective of this present study is evaluate, using flow cytometry, the expression of CD5 marker in 30 patients diagnosed with B-CLL at Hemato-Oncologistas Associados LTDA (Natal/RN-Brazil). In addiction, have been seen others hematologic data, utilizing complete blood count and cytomorphology. In this study, have been analyzed 30 patients, 19 women and 11 men, diagnosed with B-CLL. The hematological data has been obtained from hematologic analyzer. Then, the cytomorphological analyze has been done with the patients diagnosed since august 2015, using optical microscope with blood films and bone marrow films stained by Leishman. The results of immunophenotyping, obtained by BD® FACScan flow cytometry, was analyzed in CellQuest® software, generating plots showing the statistic information about markers. Finally, was observed leukocytosis and lymphocytosis in all patients. The CD5 marker was positive in all cases, with this positivity varying between 42% and 48%. This marker can be used in differential diagnose of other B-cell neoplastic diseases.
Keywords: B Cells Lymphocytic Leukaemia; immunophenotyping; CD5 marker; flow cytometry.
ÍNDICE
Página LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................ viii LISTA DE TABELAS ....................................................................................... X LISTA DE FIGURAS ....................................................................................... Xi LISTA DE ANEXOS ......................................................................................... xii 1- INTRODUÇÃO ............................................................................................. 1
1.1 – Hematopoese e Células Sanguíneas.............................................. a. Hemácias................................................................................ b. Plaquetas................................................................................ c. Leucócitos...............................................................................
1.2 – Marcadores Celulares..................................................................... 1.3 – Citometria de Fluxo........................................................................ 1.4 – Leucemias...................................................................................... 1.5 – Leucemias Linfocíticas Crônicas.................................................... 1.6 – Leucemia Linfocítica Crônica de Células B....................................
1 3 4 4 6 9
10 13 13
2- OBJETIVOS.................................................................................................. 20
2.1– Objetivos Geais .............................................................................. 2.2– Objetivos Específicos .....................................................................
20 20
3- MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 21
3.1 – Seleção de Pacientes....................................................................... 3.2 – Coleta e Microscopia........................................................................ 3.3 – Imunofenotipagem............................................................................ 3.4 – Marcação de Antígenos.................................................................... 3.5 – Leitura e Análise...............................................................................
21 21 22 22 23
4- RESULTADOS ............................................................................................. 25
4.1 - Características Gerais dos Pacientes............................................... 4.2 - Parâmetros Hematológicos............................................................... 4.3 – Classificação Imunológica................................................................
25 25 28
5- DISCUSSÃO ................................................................................................. 31 6- CONCLUSÃO ............................................................................................... 34 7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 35 8- ANEXOS ......................................................................................................
38
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
µL Microlitro
AcMo Anticorpo Monoclonal
B19V Parvovírus humano B19
BFUE Unidade de formação explosiva eritróide
CD Antígenos de diferenciação celular
Células NK Células Natural Killer
CFUE Unidade formadora de colônia eritróide
CFUGEMM Unidade formadora de colônias granulocíticas, eritróides, monocíticas e
megacariocíticas
CO2 Dióxido de carbono
EBV Vírus Epstein-Barr
Fab Região de especificidade de ligação de imunoglobulina
FCR Esquema de terapia associando fludarabina, ciclofosfamida e rituximabe
FITC Fluorescein Isothiocyanate - isotioconato de fluoresceína
FS Forward Scatter – dispersão frontal
IgD Imunoglobulina D
IgE Imunoglobulina E
IgM Imunoglobulina M
LCM Linfoma de Células do Manto
LDGC Linfoma não-Hodgkin Difuso de Grandes Células
LDH Desidrogenase Lática Humana
LF Linfoma Folicular
LH Linfoma de Hodgkin
LLA Leucemia Linfocítica Aguda
LLC Leucemia Linfocítica Crônica
LLC-B Leucemia Linfocítica Crônica de Células B
LLC-T Leucemia Linfocítica Crônica de Células T
LMA Leucemia Mielóide Aguda
LMA-M0 Leucemia Mielóide Aguda do tipo M0
LMA-M5a Leucemia Mielóide Aguda do tipo M5a
LPL-B Leucemia Pró-Linfocítica de Células B
ix
MHC Complexo de Histocompatibilidade Humano
mL Mililitro
MM Mieloma Múltiplo
mm3 Milímetro Cúbico
PE Phycoerythrin – ficoeritina
PerCP Peridinin Chlorophyll Protein
RPM Rotações por minuto
SS Side Scatter – dispersão lateral
TCR Receptores de Linfócitos T
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Relação entre alguns antígenos CD, células e funções
Tabela 2 Algumas anormalidades genéticas mais frequentes em tumores
hematológicos afetando a função de oncogenes
Tabela 3 Alguns marcadores relacionados com prognóstico da LLC-B
Tabela 4 Sistema de estadiamento de Rai para LLC-B
Tabela 5 Sistema de estadiamento de Binet para LLC-B
Tabela 6 Frequência relativa das variantes da Sindrome de Richter
Tabela 7 Painel Imunofenotípico base para análise dos pacientes
Tabela 8 Características dos pacientes quanto ao sexo e faixa etária
Tabela 9 Distribuição dos parâmetros hematológicos quando utilizado sangue
periférico
Tabela 10 Distribuição dos parâmetros hematológicos quando utilizado medula
óssea
Tabela 11 Perfil imunofenotípico, idade e sexo dos pacientes que foram a óbito
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Múltiplos sítios da hematopoese durante o desenvolvimento.
Figura 2 Hematopoese
Figura 3 Etapas da eritropoese
Figura 4 Estágios de maturação das células B com exemplos de marcadores
imunofenotípicos expressos no desenvolvimento normal dessas
células
Figura 5 Estágios de maturação das células T com exemplos de marcadores
imunofenotípicos expressos no desenvolvimento normal dessas
células
Figura 6 Parâmetros FS e SS
Figura 7 Padrão de aquisição normal, diferenciando os tipos celulares
Figura 8 Modelo de desenvolvimento de mutações na LLC-B
Figura 9 Plataforma de aquisição de dados no software CellQuest
Figura 10 Modelo de análise dos resultados obtidos no CellQuest
Figura 11 Distensão de sangue periférico em lâmina de paciente diagnosticado
com leucemia linfocítica crônica de células B. 1 – Mancha de
Gumprecht; 2 – Linfócitos característicos da LLC-B
Figura 12 Distensão de medula óssea em lâmina de paciente diagnosticado
com LLC-B
Figura 13 Positividade do marcador CD5 nos pacientes avaliados
Figura 14 Relação dos marcadores utilizados com sua reatividade, agrupando
os resultados em positivos e negativos
xii
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1 Parecer número 1.325.562 do Comitê de Ética em pesquisa da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
1
1- INTRODUÇÃO
1.1 Hematopoese e Células Sanguíneas
Ao processo de formação dos componentes sanguíneos, dá-se o nome de
hematopoese. Esse processo é iniciado ainda na embriogênese, ocorrendo
principalmente no saco vitelínico nas primeiras semanas de desenvolvimento
(HOFFBRAND; MOSS; PETIT, 2007; JAGANNATHAN-BOGDAN; ZON, 2013).
Durante o período embrionário, a hematopoese ocorre em diversos locais até que a
medula óssea assuma suas funções. Primeiramente, o principal local onde esse
processo ocorre é no saco vitelino (CARLSON, 2014). As células mesenquimais de
lá provenientes migram para o baço, fígado, timo e linfonodos, fazendo com que
haja produção de células sanguíneas nesses locais, no decorrer do período
gestacional. A partir do sexto ou sétimo mês de vida intrauterina, a medula óssea
assume papel importante nesse processo, e torna-se o único local de produção de
células sanguíneas a partir da infância. Os sítios da hematopoese durante o
desenvolvimento estão representados na Figura 1. Durante os primeiros anos de
vida, toda a medula óssea é hematopoética, mas há, de forma progressiva, uma
substituição da medula dos ossos longos por gordura. Assim, no adulto, a medula
hematopoética está restrita ao esqueleto central e às extremidades proximais do
fêmur e do úmero (HOFFBRAND; MOSS; PETIT, 2007).
Figura 1 - Múltiplos sítios da hematopoese durante o desenvolvimento. Disponível em http://dev.biologists.org/content/138/6/1017
2
A hematopoese inicia com uma célula pluripotente, também chamada de
célula-tronco hematopoética, que é CD34+, capaz de se replicar, proliferar e
diferenciar em células progenitoras com potencial de desenvolvimento restrito. A
cada mitose, as células-tronco formam uma célula-filha que repõe a célula-tronco
inicial e outra que será destinada à diferenciação. Essas células progenitoras podem
dar origem a células de duas linhagens distintas: a linhagem mielóide e a linfóide,
sendo a seleção dessa linhagem dada por sinais externos ou aleatoriamente
(HOFFBRAND; MOSS; PETIT, 2007; MOORE; KNIGHT; BLANN, 2010) (Figura 2).
Figura 2 – Hematopoese (Adaptado de Servier Medical Art. Disponível em:
http://www.servier.com/slidekit/?item=18)
A regulação desse processo ocorre por meio de fatores de transcrição, alguns
estando relacionados à sobrevivência das células-tronco e outros, envolvidos com o
processo de diferenciação das linhagens. Além disso, fatores de crescimento
também são importantes na proliferação e diferenciação das células maduras, assim
como na supressão da apoptose (HOFFBRAND; MOSS; PETIT, 2007; MOORE;
KNIGHT; BLANN, 2010).
3
Ocorre ainda uma manutenção de certa quantidade de células-tronco e
células progenitoras hematopoéticas, sobre as quais podem agir fatores de ação
tardia, quando há necessidade de aumento da produção de uma linhagem
específica, como por exemplo no processo inflamatório, onde há produção de
interleucina-1 e fator de necrose tumoral e consequente estimulação da formação de
granulócitos e monócitos (HOFFBRAND; MOSS; PETIT, 2007).
a. Hemácias
Como produto final da hematopoese, temos a formação das células
sanguíneas. Em maior quantidade têm-se as hemácias, células bicôncavas
anucleadas que têm como principal função o transporte de oxigênio dos pulmões
para os tecidos. Dá-se o nome de eritropoese o processo de formação desse tipo
celular. Sob regulação da eritropoetina, a eritropoese inicia com a diferenciação de
uma célula-tronco em CFUGEMM (unidade formadora de colônias granulocíticas,
eritróides, monocíticas e megacariocíticas). Em seguida, tem-se a diferenciação em
BFUE (unidade de formação explosiva eritróide), passando por CFUE (unidade
formadora de colônia eritróide) até que se tenha o pró eritroblasto. Este se divide
formando eritroblastos, que se tornam cada vez menores e com concentrações de
hemoglobina crescente. Por fim, o eritroblasto, em seu estágio ortocromático, perde
seu núcleo, ainda na medula óssea, dando origem ao reticulócito que será maturado
até que se transforme em hemácia (eritrócito). O esquema geral da eritropoese é
mostrado na Figura 3 (HOFFBRAND; MOSS; PETIT, 2007).
As hemácias formadas possuem em sua estrutura hemoglobina, uma proteína
importante no transporte e nas trocas gasosas entre os pulmões e demais órgãos e
tecidos, onde o oxigênio captado pelos pulmões é distribuído para o restante do
corpo e o CO2, formado pelos tecidos, exalado pelos pulmões. Para que sejam
eficazes, os eritrócitos devem ser capazes de circular em vasos sanguíneos de
pequeno calibre, propiciando a oxigenação de todos os tecidos, mantendo-lhes
viáveis (HOFFBRAND; MOSS; PETIT, 2007).
4
Figura 3 – Etapas da eritropoese (Adaptado de HOFFBRAND; MOSS; PETIT 2007)
b. Plaquetas
São produzidas a partir da fragmentação de megacariócitos, e, em função
disso, por alguns não são consideradas células. O megacariócito surge da
diferenciação do megacarioblasto, cujo processo de maturação se dá por replicação
endomitótica sincrônica, de forma a aumentar de volume. O principal regulador da
produção de plaquetas é a trombopoetina, produzida pelo fígado e pelos rins
(MOORE; KNIGHT; BLANN, 2010).
As plaquetas são protagonistas no processo de coagulação do sangue após
lesão vascular, seguindo a cascata de coagulação até a formação de um tampão
mecânico como resposta homeostática (HOFFBRAND; MOSS; PETIT, 2007).
c. Leucócitos
Os leucócitos compreendem distintos tipos celulares responsáveis pela
proteção do organismo contra infecções e agentes estranhos externos ao corpo. São
compostos por granulócitos (neutrófilos, eosinófilos e basófilos), monócitos e
linfócitos (HOFFBRAND; MOSS; PETIT, 2007).
O grupo dos granulócitos é proveniente da linhagem mielóide hematopoética
e compreende: os neutrófilos, que são células com núcleo segmentado (2 a 5
lóbulos) e com importante capacidade fagocítica na defesa do organismo contra
bactérias; os eosinófilos, que têm núcleo segmentado, porém com 2 ou 3 lóbulos e
são importantes nos processos alérgicos e na defesa contra parasitas, com
5
capacidade de fagocitar complexos antígeno-IgE; e por fim, os basófilos que têm
núcleo irregular, produzem heparina e histamina e estão relacionados aos processos
de hipersensibilidade imediata (CRUVINEL et al., 2010).
Os monócitos também derivam da linhagem mielóide hematopoiética e têm
núcleo único, grande e central. Ao migrarem para os tecidos passam a ser
chamados de macrófagos. Por apresentarem intensa capacidade fagocítica, os
macrófagos são muito importantes nos processos infecciosos e na fagocitose de
debris celulares. Recebem denominações diferentes dependendo do órgão em que
estão presentes, por exemplo, os macrófagos presentes no fígado são chamados de
células de Kupffer, já no sistema nervoso são chamados de micróglia e no tecido
ósseo de osteoclastos (CRUVINEL et al., 2010).
Células progenitoras linfóides podem se diferenciar em linfócitos B, linfócitos T
e células NK.
o Células Natural Killer (NK): têm origem na medula óssea e constituem 5-20%
das células mononucleares do sangue. São importantes nas respostas de
defesa inespecíficas, lisando células infectadas por microrganismos além de
células tumorais. Podem ainda recrutar neutrófilos e macrófagos, ativar células
dendríticas e linfócitos B e T. A sua ação citolítica está relacionada com
enzimas perforinas e granzinas. Sua ativação está relacionada com receptores
de indução e inibição de sinais, sendo os receptores de inibição mais
abundantes. Dessa forma, ocorre impedimento da lise de células normais, que
expressam MHC de classe I. Por outro lado, células infectadas expressam
baixas quantidades de MHC de classe I, sendo susceptíveis a ação das células
NK (CRUVINEL et al., 2010).
o Linfócitos T: o processo de seleção e maturação dessas células ocorre no
timo. No processo de maturação está envolvida a expressão de receptores de
linfócitos T funcionais, em associação com o complexo CD3, e dos co-
receptores CD4 e/ou CD8. Quando maduros, os linfócitos T deixam o timo e
caem na circulação periférica. Após a maturação, os linfócitos T são divididos
em alguns subgrupos, como linfócitos T auxiliares (CD4) e linfócitos T
citotóxicos (CD8), todos esses com funções importantes no que diz respeito ao
sistema imune (MESQUITA et al., 2010).
6
o Linfócitos B: são componentes muito importantes do sistema imune,
responsáveis pela produção de anticorpos. As células que vão se diferenciar
em linfócitos B permanecem na medula óssea durante a maturação, e quando
maduros, esses linfócitos migram para os órgãos linfóides secundários, como
linfonodos e baço. Para reconhecer antígenos, essas células necessitam de
imunoglobulinas de membrana (IgM e IgD). Essas imunoglobulinas são
compostas por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, além de uma
região de especificidade de ligação, chamada de região Fab (MESQUITA et al.,
2010).
A maturação das células B inicia a partir de células pró-B, que expressam
os genes TdT, RAG1 e RAG2, responsáveis por comandar a produção de
imunoglobulinas. Esse processo inicial de maturação ocorre ainda na medula
óssea, e de modo independente de contato com antígenos. Com o processo de
recombinação das porções variáveis das imunoglobulinas, um número vasto de
especificidades diferentes de reconhecimento são formadas, sendo de extrema
importância haver uma restrição desse repertório, a fim de diminuir as chances
de interação com moléculas endógenas. Para isso, ocorre o mecanismo de
seleção positiva e negativa ainda durante a maturação das células B. Na
seleção positiva, as células que expressam imunoglobulinas funcionais
recebem um sinal para prosseguir na maturação, enquanto na seleção
negativa, células com imunoglobulinas não funcionais (reconhecem antígenos
próprios com alta afinidade) são desviadas para apoptose (CRUVINEL et al.,
2010; MESQUITA et al., 2010).
1.2 Marcadores Celulares
Todas as células possuem, em sua estrutura de membrana, proteínas
específicas que são capazes de serem reconhecidas por anticorpos sintéticos em
laboratório. Com as técnicas de imunofenotipagem pode-se diferenciar os tipos
celulares, além dos seus graus de maturação, observando-se a expressão dessas
diferentes proteínas. Os antígenos de diferenciação celular reconhecidos por grupos
de anticorpos monoclonais foram denominados por grupo de diferenciação ou CD
7
(NAOUM, 2001). Alguns antígenos, suas células específicas e funções são
demonstrados na Tabela 1.
Tabela 1 – Relações entre alguns antígenos CD, células e funções Antígeno CD Células Funções
CD1 a,b,c,d
Timócitos, células
dendríticas, linfócito B
(CD1c), células do epitélio
intestinal (CD1d)
Molécula semelhante ao
MHC de classe I,
especializada na
apresentação de antígeno
CD4
Sub grupo dos timócitos,
linfócitos T auxiliar e
inflamatório, monócitos e
macrófagos
Co-receptor de moléculas de
MHC de classe II. Receptor
para HIV-1 e HIV-2.
CD8
Sub grupo dos timócitos,
linfócitos T citotóxicos
Co-receptor para MHC de
classe I
CD9
Linfócito pré-B, eosinófilos,
basófilos e plaquetas
Possível papel na agregação
e ativação plaquetária
CD33
Células mielóides
progenitoras e monócitos
Desconhecidas
CD34
Precursores hematopoéticos
ou células-tronco pluripotente
Ligante para CD 62 L
CD 62 L
Linfócitos B e T, monócitos e
células NK
Moléculas de adesão de
leucócitos. Participa da
interação com o endotélio
CD66
Atividade leucocitária na
adesão de moléculas
Ativação de linfócitos T e B,
eosinófilos, fibroblasto,
células tímicas e endoteliais e
queratinócitos
Adaptado de NAOUM, 2001.
Na Figura 4, destacam-se alguns marcadores de acordo com o grau de
maturação dos linfócitos B (MESQUITA, 2010), enquanto na Figura 5, estão
representados os marcadores relacionados aos linfócitos T.
8
Em processos patológicos, podem haver alterações quanto aos marcadores
imunofenotípicos expressos nas células, por exemplo, na leucemia linfocítica crônica
de células B, observa-se o aparecimento do marcador CD5 em linfócitos B,
marcador este que é natural dos linfócitos T.
Figura 4 – Estágios de maturação das células B com exemplos de marcadores imunofenotípicos expressos no desenvolvimento normal dessas células (Adaptado de MESQUITA, 2010).
Figura 5 – Estágios de maturação das células T com exemplos de marcadores imunofenotípicos expressos no desenvolvimento normal dessas células (Adaptado de NAOUM, 2001).
9
1.3 Citometria de Fluxo
A citometria de fluxo é uma técnica que utiliza lasers, fluxo hidrodinâmico,
ótica, fluorocromos (ligados a anticorpos monoclonais) e softwares para determinar
parâmetros estruturais e funcionais de partículas biológicas em suspensão. O
citometro de fluxo é o aparelho utilizado para a realização dessa técnica. Este
equipamento aspira uma preparação prévia das partículas que serão analisadas,
como por exemplo, células (PIER, 2007).
Após serem aspiradas, as células passam por uma câmara especial que faz
com que estas fiquem envoltas e centralizadas em um fluxo contínuo de líquido.
Então, uma por uma, as células são interceptadas por um laser, de modo a gerar
dois tipos de informação: o FS (Forward Scatter) ou dispersão frontal, de acordo
com o tamanho da célula, e o SS (Side Scatter) ou dispersão lateral, de acordo com
a sua granulosidade (Figura 6). Além disso, ao passarem pelo laser, as células
marcadas com os fluorocromos emitem luz de acordo com suas características
bioquímicas e moleculares. Essas luzes são captadas e convertidas em pulsos
elétricos. Por fim, a amostragem dos dados, análise e interpretação são analisados
por softwares específicos (Figura 7) (PIER, 2007).
FS
SS
Granulosidade Complexidade
Tamanho
Figura 6 - Parâmetros FS e SS (Adaptado de https://www.youtube.com/watch?v=EQXPJ7eeesQ)
10
Figura 7 - Padrão de aquisição normal, diferenciando os tipos celulares (disponível em http://www.lookfordiagnosis.com)
1.4 Leucemias
A leucemia é uma doença maligna que acomete os leucócitos e é
caracterizada pelo acúmulo de células anormais derivadas de uma única célula na
medula óssea ou no tecido linfóide periférico, que tenha sofrido uma alteração
genética. Como em outras doenças, a combinação de fatores genéticos e
ambientais são responsáveis pelo aparecimento da patologia (HOFFBRAND; MOSS;
PETIT, 2007).
Em relação aos fatores genéticos, já se sabe que há susceptibilidade de
desenvolvimento de leucemias em indivíduos com síndrome de Down, ou anemia de
Fanconi, ou ataxia-teleangiectasia, ou neurofibromatose, ou síndrome de Klinefelter
ou na síndrome de Wiskott-Aldrich, além de algumas outras doenças com alterações
cromossômicas. Há ainda indícios de fraca tendência hereditária na leucemia
mielóide aguda (LMA), na leucemia linfocítica crônica (LLC) e em linfomas, porém o
padrão de herança ainda não é completamente conhecido (HOFFBRAND; MOSS;
PETIT, 2007).
Quanto aos fatores ambientais, pode-se citar a relação da exposição crônica
ao benzeno com o aparecimento de mielodisplasia ou leucemia mielocítica aguda, a
11
predisposição ao aparecimento de LMA em pacientes que utilizam fármacos
alquilantes (exemplo clorambucil e melfalan), principalmente quando combinados
radioterapia. Sabe-se ainda que a exposição à radiação é leucemogênica, sendo
observado um aumento da incidência das leucemias (menos LLC) nos sobreviventes
de explosões atômicas. Além disso, algumas infecções podem ocasionar lesões no
material genético e o aparecimento de algumas leucemias. Infecções pelo vírus
Epstein-Barr (EBV), por exemplo, estão associadas a casos de linfoma de Burkitt
endêmico (HOFFBRAND; MOSS; PETIT, 2007). Em outro exemplo, havendo
imunossupressão em crianças e uma posterior infecção pelo parvovírus humano
B19 (B19V), o risco do desenvolvimento de leucemia linfocítica aguda é elevado
(CECÍLIO; OLIVEIRA, 2004).
A transformação de uma célula normal em maligna ocorre por ganho de
mutações genéticas. Quanto ao aparecimento de câncer, destacam-se os
oncogenes e os genes supressores de tumor. Em relação aos oncogenes, estes são
resultado de uma mudança ou ganho de função dos proto-oncogenes, que têm
participação na ativação gênica e controle da apoptose. Essas mutações podem
ocorrer de várias formas, porém quando relacionadas às doenças onco-
hematológicas há uma alta frequência de translocações cromossômicas.
No que diz respeito aos genes supressores de tumor, o mais conhecido e
importante nos casos de câncer humano é o p53. A inativação ou modificação
destes genes gera desregulação no ciclo celular, assim como alterações em
tirosinaquinases também são importantes fatores de desenvolvimento de
malignidade (HOFFBRAND; MOSS; PETIT, 2007). Algumas dessas alterações
relacionadas com cânceres hematológicos estão mostradas na Tabela 2.
12
Tabela 2 – Algumas anormalidades genéticas mais frequentes em tumores
hematológicos afetando a função dos oncogenes
Adaptado de HOFFBRAND; MOSS; PETIT, 2007
Segundo o Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA),
em 2016 serão diagnosticados 10.070 novos casos de leucemias no Brasil, dos
quais 5.540 acometerão homens e 4.530, mulheres. Em crianças, a leucemia
linfocítica aguda (LLA) é a mais comum, enquanto em adultos, há prevalência dos
subtipos de LMA (INCA, 2016).
Um dos fatores mais importantes para a sobrevida dos pacientes é o
diagnóstico precoce. Para isso, deve-se atentar para os sintomas iniciais, que nas
leucemias agudas são secundários à proliferação excessiva de células imaturas na
medula óssea, que podem infiltrar outros tecidos. Além disso, pela diminuição dos
leucócitos normais, estes pacientes estão mais susceptíveis a infecções. Os sinais
importantes ao exame físico são, por exemplo, esplenomegalia, palidez, febre,
sangramentos e hemorragias, petéquias e equimoses. Já nas leucemias crônicas, os
Doença Anomalia Genética Oncogenes
envolvidos
LMA t(8;21)
t(15;17)
Inserção de nucleotídeo
Mutação, TDI
Mutação
ETO/AML1 (CFBα)
PML, RARA
NPM
FLT3
TET-2
LMA secundária Translocação 11q23 MLL
Mielodisplasia -5, del(5q)
-7, del(7q)
RPS 14
N RAS
LMC t(9;22) BRC-ABL1
Mieloproliferativa Mutação pontual
Mutação pontual
JAK-2
TET-2
Linfoma folicular
Linfoma de células do manto
Linfoma de Burkitt
t(14;18)
t(11;14)
t(8;14)
BCL2
Ciclina D1
MYC
LLC Deleção 17p
Deleção 11q22-23
P53
ATM
13
sintomas, quando aparecem, são inespecíficos. Na maioria dos casos, as formas
crônicas são diagnosticadas em exames de rotina (Centro Infantil Boldrini, 2013).
No que diz respeito ao tratamento, levam-se em consideração vários aspectos
para que seja escolhido o protocolo de tratamento, como por exemplo o tipo de
leucemia e o estágio em que a doença se encontra. Vários fármacos estão
disponíveis no mercado para o tratamento desses cânceres. Além disso, ainda há a
possibilidade de realização do transplante de medula óssea na tentativa de
recompor a medula óssea dos pacientes acometidos com essas doenças
(HAMERSCHLAK, 2012).
1.5 Leucemia Linfocítica Crônica
A leucemia linfocítica crônica (LLC) pode acometer os linfócitos T (LLC-T) ou
os linfócitos B (LLC-B). O primeiro tipo, menos comum, tende a ser mais agressivo e
com tratamento mais difícil, enquanto a LLC-B é frequente e com tratamento mais
simples.
1.6 Leucemia Linfocítica Crônica de Células B
Descrita como uma doença monoclonal com aumento progressivo de
linfócitos CD5 positivo, funcionalmente incompetentes, a leucemia linfocítica crônica
de células B (LLC-B) é mais comum em caucasianos e em indivíduos de faixa etária
elevada, acima de 50 anos (BARROS, 2009; ROZMAN, MONTSERRAT, 1995), com
média de idade ao diagnóstico de 65 anos (ROZMAN, MONTSERRAT, 1995).
Representando 25 a 30% de todos os casos de leucemia nos países ocidentais, a
LLC-B é mais comum em homens do que em mulheres e algumas evidências
sugerem que fatores genéticos parecem ser relevantes quando do aparecimento
dessa doença (ROZMAN, MONTSERRAT, 1995).
A LLC-B é extremamente rara na China, na Coréia e no Japão. Esta baixa
incidência também se aplica a emigrantes desses países e seus descendentes,
excluindo assim um modificador ambiental. Além disso, evidências epidemiológicas
mostram que em 5-10% dos casos há uma susceptibilidade familiar com dois ou
mais indivíduos de uma mesma família afetados pela doença (GHIA; FERRERI;
CALIGARIS-CAPPIO, 2007).
14
Analisando morfologicamente as células do sangue periférico de pacientes
com LLC-B, observa-se um número elevado de linfócitos pequenos, homogêneos e
maduros com uma fragilidade peculiar na membrana celular que leva a rupturas
frequentes, formando as manchas de Gumprecht. Pode-se ainda observar pro-
linfócitos, que são característicos da Leucemia Prolinfocítica de células B (LPL-B),
porém quando presentes em pequeno número (<10%), essas células caracterizam a
variante agressiva da LLC, chamada de LLC/LPL (GHIA; FERRERI; CALIGARIS-
CAPPIO, 2007).
Do ponto de vista genético, as células da LLC-B apresentam severas
alterações, porém nenhuma específica da doença. As mais frequentes aberrações
cromossômicas vistas são: deleção do braço longo do cromossomo 13, trissomia do
cromossomo 12, deleções nas bandas 11q22-q23 e deleções nas bandas 17p13
(afetando a p53) (GHIA; FERRERI; CALIGARIS-CAPPIO, 2007). As mutações que
contribuem para o aparecimento das células neoplásicas da LLC-B podem aparecer
em qualquer estágio do desenvolvimento dos linfócitos B, seja ainda na fase de
célula tronco hematopoética ou em células mais maduras, como demonstrado
esquematicamente na Figura 8 (ZHANG, KIPPS, 2014).
Grande parte dos casos são diagnosticados em pacientes assintomáticos ao
fazerem exames de rotina. Porém, alguns podem apresentar sintomas pela
proliferação de células malignas na medula e na circulação. Podem apresentar
fadiga em decorrência da anemia progressiva, aumento de linfonodos,
esplenomegalia, perda de peso, febre sem indícios de infecção e suor noturno. É
comum a queixa de infecções recorrentes, sendo também uma das causas mais
comuns de óbitos em pacientes com LLC-B. Em 10-25% dos casos ocorre anemia
Figura 8 - Modelo de desenvolvimento de mutações na LLC-B (Adaptado de ZHANG, KIPPS, 2014).
15
hemolítica e em 2% dos casos trombocitopenia autoimune, podendo ainda haver,
mesmo que raramente, destruição autoimune de neutrófilos e aplasia (GHIA;
FERRERI; CALIGARIS-CAPPIO, 2007).
A persistente elevação dos linfócitos, comumente associada com outras
doenças linfoproliferativas, torna imprescindível o diagnóstico diferencial para LLC-B.
Doenças como linfoma de células do manto (LCM), leucemia prolinfocítica, leucemia
de células pilosas (Hairy Cell leukemia) e linfoma folicular (LF) são semelhantes e
devem sem descartadas (GHIA; FERRERI; CALIGARIS-CAPPIO, 2007).
Alguns parâmetros são importantes no que diz respeito ao prognóstico desta
doença. Como já mencionado, mais de 10% de pro-linfócitos no sangue periférico
indica um pior prognóstico. Além disso β2-microglobulina é inversamente
correlacionada com a resposta ao tratamento quimioterápico e sobrevivência,
concentração sérica de timidinaquinase também está inversamente correlacionada
com a sobrevida do paciente. Além disso, a expressão de p53 está correlacionada
com transformação prolinfocítica da doença (GHIA; FERRERI; CALIGARIS-CAPPIO,
2007).
Outro fator relacionado à prognóstico é o estado de mutação dos genes da
região variável da cadeia pesada de imunoglobulinas (genes IgHV). Dessa forma,
pacientes com homologia <98% costumam apresentar evolução clínica mais branda,
enquanto pacientes com homologia >98% são acometidos por doenças mais
agressivas (VASCONCELOS, 2005).
Há ainda uma relação quanto ao sexo que confere, estatisticamente, curso
clínico mais desfavorável em homens (VASCONCELOS, 2005). Outro marcador de
prognóstico é o padrão de infiltração na histologia da medula óssea, de forma que
portadores de LLC contendo padrão difuso de infiltração linfocitária possuem perfil
evolutivo mais agressivo (VASCONCELOS, 2005).
Na Tabela 3 estão representados alguns fatores mais importantes
relacionados ao prognóstico da LLC.
16
Tabela 3 – Alguns marcadores relacionados com prognóstico da LLC-B
Biomarcador Consequência
Gene IgHV Agressividade da doença
Tempo médio de sobrevida
CD38 Tempo médio de sobrevida
ZAP-70 Mau prognóstico
Anormalidades Cromossômicas Tempo médio de sobrevida
Na LLC-B, os sistemas de estadiamento clínico são importantes no que diz
respeito ao entendimento do comportamento da doença, colaborando na
determinação do prognóstico e na conduta terapêutica a ser utilizada. Utilizam-se
dois sistemas de estadiamento: o sistema de Rai e o sistema de Binet, mostrados
nas Tabelas 4 e 5, respectivamente. O primeiro, utilizado amplamente nos Estados
Unidos, foi criado em 1975 e posteriormente modificado, e o segundo, criado em
1981 é amplamente utilizado na Europa. Nesses sistemas, levam-se em
consideração os achados clínicos e laboratoriais para determinação de grupos de
risco e da sobrevida desses pacientes (ROZMAN; MONTSERRAT, 1995).
Tabela 4 – Sistema de estadiamento de Rai para LLC-B
Sist. de Rai
Original
Aspectos Clínicos e Laboratoriais Sist. de Rai
Modificado
Sobrevida
Mediana
(anos)
0 Linfocitose (>5.000/mm3) por mais de 4
semanas
Baixo 14,5
I Linfocitose + linfonodomegalia Intermediário 7,5
II Linfocitose + esplenomegalia e/ou
hepatomegalia
Intermediário 7,5
III Linfocitose + anemia (hemoglobina
<11,0 g/dl)
Alto 2,5
IV Linfocitose + plaquetopenia (plaquetas
<100.000/mm3)
Alto 2,5
Adaptado de ROZMAN; MONTSERRAT, 1995
Retirado de GHIA; FERRERI; CALIGARIS-CAPPIO, 2007.
17
Tabela 5 – Sistema de estadiamento de Binet para LLC-B
Estágios Aspectos Clínicos Sobrevida
Mediana
(anos)
A Hemoglobina 10,0 g/dL
Plaquetas 100.000/mm3
Menos de 3 áreas linfoides envolvidas
14
B Hemoglobina 10,0 g/dL
Plaquetas 100.000/mm3
3 ou mais áreas linfoides envolvidas
5
C Hemoglobina <10,0 g/dL ou
Plaquetas <100.000/mm3
Adaptado de ROZMAN; MONTSERRAT, 1995
No que diz respeito a aberrações citogenéticas, as mais comuns na LLC-B
são a trissomia do cromossomo 12 e a deleção do 13q14 (AMIEL et al, 2001).
Outras anormalidades que podem ser encontradas são a deleção do braço longo do
cromossomo 11, deleção 6q21-23, trissomia 8q e 3q e deleção 17p13
(CALLIGARIS-CAPPIO; DALLA-FAVERA, 2005).
Com relação à imunofenotipagem na LLC-B, o linfócito B normal apresenta
inicialmente CD19, antígeno restrito a linhagem B, HLADR e CD34. Com as etapas
de maturação, ocorre o aparecimento do CD10, perda do CD34 e ganho do CD20.
Prosseguindo no processo de maturação, os linfócitos maduros em repouso ganham
CD21 e CD22, e posteriormente, com a ativação desse linfócito, ocorre o
aparecimento de CD23 (GUIPAUD et al., 2003).
Na LLC-B, o ganho do CD5 é observado, mesmo sendo um antígeno
naturalmente relacionado aos linfócitos T. Além disso, CD79a, ZAP-70, CD52
aparecem nesta doença. Dessa forma, células B malignas expressam CD19,
HLADR, CD5, CD52 e CD23 (GUIPAUD et al., 2003).
O antígeno CD5 pode ser considerado associado a linfócitos T, aparecendo
na maturação destas células após estágio de pró-timócito. Todavia não é específico
destas células, uma vez que também é encontrado em 17-25% de linfócitos B do
sangue periférico. Além disso, esse antígeno é expresso em hematogônias,
linfócitos B no baço fetal, no centro germinativo e no timo. Por fim, CD5 pode ser
18
expresso em certo subconjunto de células dendríticas e células NK (ORTOLANI,
2011). Como regra, CD5 não é expresso em neoplasias de células B imaturas,
porém isso pode acontecer em casos isolados. Por outro lado, em doenças de
células T imaturas esse antígeno é geralmente expresso, enquanto nas doenças de
células T maduras esse antígeno pode não ser expresso. Em menos de 10% dos
casos de LMA há expressão de CD5 (LMA-M0, LMA-M5a) (ORTOLANI, 2011).
Quanto à expressão de CD5 em doenças de células B maduras, pode-se
dizer que a presença desse marcador divide esse grupo de doenças em dois. O
primeiro, onde há CD5 positivo, estão inclusas a LLC-B e o Linfoma de Células do
Manto (LCM). O segundo, com CD5 negativo, compreende as doenças restantes.
Por fim, do ponto de vista histopatológico, uma porcentagem maior que 35% de
linfócitos B CD5+ em uma análise de biopsia de linfonodo é indicativo de linfoma de
células B (ORTOLANI, 2011).
Com o tratamento adequado, a maioria dos pacientes entram em remissão
completa, porém alguns casos de recaída são observados (GHIA; FERRERI;
CALIGARIS-CAPPIO, 2007). Se necessário, o tratamento deve ser escolhido pelo
médico de acordo com alguns aspectos, como o estado físico do indivíduo. Utiliza-se
o Cumulative Illness Rating Scale (CIRS) para classificação dos pacientes quanto a
comorbidades. Para pacientes com status performance adequado (paciente Go Go)
é geralmente recomendado o esquema FCR (fludarabina, ciclofosfamida e
rituximabe) como primeira linha de tratamento. Em indivíduos com algum
comprometimento (paciente Slow Go) do estado clínico ou idade avançada utiliza-se
geralmente o tratamento de intensidade reduzida (HAMERSCHLAK, 2012). Por fim,
pacientes com significativas comorbidades (pacientes No Go), devem ser tratados
de forma paliativa. Além disso, em alguns casos, ainda utiliza-se como alternativa o
transplante alogênico de medula óssea. Este procedimento é indicado em casos de
recidivas em menos de 24 meses após tratamento com fludarabina, em pacientes
com mutação no gene p53, em pacientes refratários ao tratamento com fludarabina
ou em pacientes com múltiplas recidivas.
Classicamente, podia-se observar a transformação da LLC-B em linfoma não-
Hodgkin difuso de grandes células (LDGC), caracterizando a Síndrome de Richter
(SR). Atualmente, tem-se relatos de outras neoplasias secundárias a LLC, como
leucemia pró-linfocítica (LPL), linfoma de Hodgkin (LH), mieloma múltiplo (MM) e
19
leucemia linfóide aguda (LLA), cujas frequências estão descritas na Tabela 6
(DOBBIN, 2005).
Tabela 6 - Frequência Relativa das variantes da síndrome de Richter
Variantes Frequência Relativa
Linfoma não-Hodgkin Difuso de
Grandes Células (LDGC)
60-75%
Leucemia Pró-linfocítica (LPL) 15-20%
Linfoma de Hodgkin (LH) 15%
Mieloma Múltiplo (MM) <1%
Leucemia Linfóide Aguda (LLA) <1%
Retirado e modificado de DOBBIN, 2005
A SR é rara, correspondendo a 2-6% dos casos de LLC, porém resulta em
sobrevida mediana de 5-8 meses após a transformação da doença. É caracterizada
por febre, perda de peso, aumento rápido e assimétrico de linfonodos, súbita
deterioração clínica e aumento da atividade da desidrogenase lática sérica (LDH).
Quanto a sua patogênese, a síndrome de Richter apresenta comumente a trissomia
do cromossomo 12, seja isoladamente ou em conjunto com outras anormalidades,
incluindo alterações nos cromossomos 13q, 11q, 6q e 14q. A presença da trissomia
12 está fortemente relacionada com o aumento de pró-linfócitos e linfócitos atípicos,
e com negatividade de CD5 na imunofenotipagem, além de forte expressão de
CD20. Além disso, a imunossupressão dos pacientes com LLC tratados com
fludarabina, já demonstrou estar relacionada com aumentando o risco de uma
segunda neoplasia maligna. Supressão do gene supressor tumoral p53 podem ser
detectados em 10-17% dos pacientes com LLC, o que está intimamente relacionado
a resistência a terapia, além do aumento do número de pró-linfócitos. Outro ponto
importante a se considerar, é a infecção pelo vírus Epstein-Barr (EBV) em pacientes
com LLC, podendo haver transformação para o LDGC e para LH (DOBBIN, 2005).
20
2- OBJETIVOS
2.1 – Geral
Objetiva-se avaliar a expressão do marcador CD5 em pacientes
diagnosticados com LLC-B no Laboratório Hemato-Oncologistas Associados LTDA/
Instituto de Onco-Hematologia de Natal, por meio de imunofenotipagem.
2.2 – Específicos
o Avaliar os resultados de hemograma e imunofenotipagem de pacientes
diagnosticados com LLC-B na Hemato-Oncologistas Associados LTDA
entre 2011 e 2016.
o Analisar os resultados de CD5 desses pacientes.
o Identificar os principais marcadores positivos na LLC-B.
o Realizar análise citomorfológica do material biológico dos pacientes
diagnosticados desde agosto de 2015.
21
3- MATERIAIS E MÉTODOS
a. Seleção de Pacientes Foram selecionados pacientes diagnosticados com Leucemia Linfocítica
Crônica de Células B e acompanhados pelo Laboratório de Hematologia da Hemato-
Oncologistas Associados LTDA, entre março de 2011 e maio de 2016. Dos 30
selecionados, 11 pacientes eram do sexo masculino e 19, do sexo feminino, sendo
todos com idade superior a 54 anos.
Foram excluídas da seleção as análises imunofenotípicas realizadas com
finalidade de controle da doença, tendo sido utilizados, portanto, apenas os
resultados dos exames para confirmação diagnóstica.
Após a coleta do material biológico, obtiveram-se os valores de hemograma
utilizando analisador hematológico Sysmex KX-21N. Posteriormente, utilizou-se o
restante do material biológico para análise imunofenotípica por citometria de fluxo.
Dos pacientes diagnosticados entre março de 2011 e julho de 2015 foram
analisados apenas os resultados e anotações contidas em prontuários. A partir de
agosto de 2015, houve acompanhamento de todas as etapas, desde a coleta do
material biológico até o desenvolvimento do laudo.
b. Coleta e Microscopia Coletou-se o sangue periférico e/ou medula óssea1 dos pacientes. Para
sangue periférico, foram utilizados tubos contendo EDTA. Para medula óssea,
utilizou-se material aspirado por mielograma em seringa heparinizada. Realizou-se
então hemograma rotineiro.
Após serem coradas por corante de Leishman, lâminas do sangue periférico
e/ou medula óssea dos pacientes foram analisadas no microscópio óptico Nykon®
Alphaphot-2 YS2 com objetivas de 40x e imersão 100x.
Na avaliação morfológica de distensão do sangue periférico e/ou medula
óssea, fez-se contagem diferencial de leucócitos, além de análise de alterações
citomorfológicas, observando presença de células atípicas, restos celulares e
presença de células imaturas.
1 A escolha do material para análise fica a critério do médico responsável.
22
Os valores do hemograma foram obtidos a partir de Analisador Hematológico
Sysmex® KX-21N.
c. Imunofenotipagem
O sangue periférico ou medula óssea dos pacientes foram analisados por
imunofenotipagem utilizando citômetro de fluxo BD® modelo FACScan. Utilizando
anticorpos monoclonais BD® conjugados com fluorocromos isotioconato de
fluoresceína, conhecido como FITC (fluorescein isothiocyanate); e/ou ficoeritina,
phycoerythrin (PE) e/ou peridinin chlorophyll protein (PerCP). Estes correspondem a
fluorescências verde, vermelha e laranja, respectivamente, sendo possível uma
marcação múltipla em uma única etapa.
Para análise do sangue periférico, utilizou-se a mesma amostra colhida para o
hemograma. Quando analisado medula óssea, utilizou-se material aspirado de
medula óssea por mielograma em seringa heparinizada, coletado pelo médico
responsável.
d. Marcação de Antígenos Para a marcação de antígenos de superfície, utilizou-se 50 microlitros (µL) de
suspensão de células totais de medula óssea ou sangue periférico, com
homogeneização prévia. Adicionou-se 20 µL de anticorpo monoclonal específico,
seguido de incubação por 25 minutos em local com luminosidade reduzida, em
temperatura ambiente. Após os 25 minutos, a suspensão foi homogeneizada
novamente, adicionando posteriormente 2 mililitro (mL) de solução de lise (Lysing
Solution BD®), havendo nova incubação por 5 minutos, para haver hemólise, em
ambiente escuro e com temperatura ambiente. Após esta etapa, a suspensão foi
centrifugada por 5 minutos a 1.500 RPM. O sobrenadante foi desprezado e o
sedimento ressuspenso em PBS/formaldeído 1%.
Para marcação de antígenos intracitoplasmáticos, fez-se lavagem do material
biológico com solução de lise, para permeabilização celular, previamente à adição
do anticorpo. Antígenos como o ZAP-70 e TdT necessitam desse processamento
prévio.
O painel imunofenotípico base utilizado para análise está descrito na Tabela
7.
23
Tabela 7 - Painel imunofenotípico base para análise dos pacientes
Marcador Correspondência N de Pacientes Testados
CD45 Linfócitos 30 CD14 Monócitos 29 CD34 Células Imaturas 30 CD13 Células Mielóides 24 CD19 Linfócitos B 30 CD3 Linfócitos T 29 CD5 Linfócitos T 28
CD38 Linfócitos Ativados e Plasmócitos 26 CD23 Linfócitos B 26 CD22 Linfócitos B 24 CD10 Antígeno CALLA 25 CD33 Células Mielóides Imaturas 12 CD25 Receptor de IL-2 22
ZAP-70 Marcador de Prognóstico 9 HLADR Antígeno de Histocompatibilidade de Classe II 30 CD16/56 Células NK 3
KI-67 Marcador de Proliferação Celular 9 Anti-Kappa Cadeia Leve de Imunoglobulina 12
Anti-Lambda Cadeia Leve de Imunoglobulina 12
e. Leitura e Análise A aquisição e análise dos dados foi realizada utilizando citômetro de fluxo
(FACScan Becton & Dickinson BD®). O software utilizado foi o CellQuest®, pré-
formatado para aquisição de 20.000 células (Figura 9), que foram avaliadas pelos
parâmetros FSC e SSC, que avaliam tamanho e complexidade celular
respectivamente, e FL1, FL2 e FL3, que detectam a fluorescência de reação
antígeno-anticorpo.
Figura 9 - Plataforma de aquisição de dados no software CellQuest
24
Considerou-se como positivo quando mais de 25% das células reagiram contra
os antígenos relacionados. Os resultados foram representados por meio de
histogramas, utilizando porcentagem para caracterizar reação positiva ou negativa.
Um exemplo de representação dos resultados está mostrado na Figura 10.
A realização deste trabalho foi aprovada pelo comitê de ética em pesquisa da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, sob parecer de número 1.325.562,
apresentado no Anexo 1.
Figura 10 - Modelo de análise dos resultados obtidos no CellQuest
25
4- RESULTADOS
4.1 Características Gerais dos Pacientes
Na Tabela 8 estão agrupados os dados demográficos dos 30 pacientes
diagnosticados com LLC-B nos últimos 5 anos na Hemato-Oncologistas Associados
LTDA. Foi observado o predomínio de indivíduos do sexo feminino na faixa etária
dos 60 aos 69 anos.
Tabela 8 – Características dos pacientes quanto ao sexo e faixa etária
Características Número %
Sexo
Masculino 11 36,6
Feminino 19 63,3
Faixa etária (anos)
<50 0 0
50 - 59 7 23,3
60 - 69 13 43,3
≥70 10 33,3
4.2 Parâmetros Hematológicos
Nas Tabelas 9 e 10 estão resumidos os dados laboratoriais dos pacientes em
questão quanto à leucometria, contagem global de linfócitos e contagem de
plaquetas. Na Tabela 9, tem-se os dados dos exames que foram realizados
utilizando sangue periférico como amostra, enquanto na Tabela 10, medula óssea.
Tabela 9 – Distribuição dos parâmetros hematológicos analisados quando
utilizado sangue periférico
Parâmetro N % Leucócitos (/mm3) Total: 16 pacientes
<10.000 1 6,25 10.000 – 30.000 13 81,25 30.000 – 50.000 1 6,25
>50.000 1 6,25 Valor de Referência: 4.000-10.000/mm3
26
Linfócitos (/mm3) Total: 16 pacientes <5.000 1 6,25
5.000 – 10.000 4 25 10.000 – 30.000 10 62,5 30.000 - 50.000 0 0
>50.000 1 6,25 Valor de Referência: 1.000-3.000/mm3
Linfócitos (%) Total: 16 pacientes <10 0 0
10 – 30 0 0 30 – 50 0 0 50 – 70 7 43,75
>70 9 56,25 Valor de Referência: 20-40%
Plaquetas (/mm3) Total: 15 pacientes < 100.000 1 6,67
100.000 – 149.000 3 20 150.000-400.000 10 66,67
>400.000 1 6,67 Valor de Referência: 150.000-400.000/mm3
Valores de referência – BAIN; LEWIS; DACIE, 2012
Tabela 10 - Distribuição dos parâmetros hematológicos analisados quando
utilizado medula óssea
Parâmetro N % Leucócitos (/mm3) Total: 12 pacientes
<10.000 0 0,0 10.000 – 30.000 2 16,67 30.000 – 50.000 1 8,3
>50.000 9 75,0 Linfócitos (/mm3) Total: 11 pacientes
<5.000 0 0,0 5.000 – 10.000 1 9,09
10.000 – 30.000 5 45,45 30.000 - 50.000 1 9,09
>50.000 4 36,36 Linfócitos (%) Total: 11 pacientes
<10 0 0 10 – 30 0 0 30 – 50 5 45,45 50 – 70 5 45,45
>70 1 9,09 Plaquetas (/mm3) Total: 12 pacientes
< 100.000 3 25,0 100.000 – 149.000 2 16,67
≥ 150.000 7 58,33
27
Analisando a Tabela 9, pode-se dizer que ocorreu predomínio de pacientes
com leucometria elevada, com maioria de casos entre os valores da contagem de
leucócitos entre 10.000 e 30.000/mm3 de sangue. Quanto à linfocitose, observou-se
que todos os pacientes obtiveram valores de linfócitos acima de 5.000/mm3, com
predomínio de casos na faixa de 10.000 a 30.000/mm3, correspondendo a 62,5%.
Quanto à Tabela 10, pode-se dizer que o padrão de leucocitose e linfocitose
já visto na Tabela 9, também pode ser observado.
Não se tem a determinação do hematócrito e de hemoglobina de todos os
pacientes, porém dos que se têm essas informações, ou seja, 15 pacientes, foi
observada anemia em 10 deles.
Figura 11- Distensão de sangue periférico em lâmina de paciente diagnosticado com leucemia linfocítica crônica de células B. 1 – Mancha de Gumprecht; 2 – Linfócitos característicos da LLC-B.
28
Os demais padrões citomorfológicos avaliado nos pacientes diagnosticados a
partir de agosto de 2015, também foram observados e estão representados nas
Figuras 11 e 12. Desse modo, viu-se grande número de linfócitos pequenos, com
núcleos redondos, cromatina condensada e citoplasma escasso. Pode-se ainda
identificar manchas de Gumprecht, além de linfócitos atípicos.
4.3 Classificação Imunológica
Foram analisados os dados obtidos por citometria de fluxo dos 30 pacientes
diagnosticados com LLC-B nos últimos 5 anos no laboratório de hematologia da
Hemato-Oncologistas Associados LTDA. Como resultado da imunofenotipagem do
material biológico, 100% dos pacientes apresentaram expressão do marcador CD5,
variando sua positividade entre 42% e 98%, como mostra a Figura 13. Pode-se
ainda observar predominância de positividade entre os valores de 90% a 100%. Na
análise de apenas dois pacientes não se utilizou o AcMo anti-CD5.
Figura 12 - Distensão de medula óssea em lâmina de paciente diagnosticado com LLC-B.
29
Figura 13 - Positividade do marcador CD5 nos pacientes avaliados
As células linfóides neoplásicas da LLC-B são CD19+, CD20+ (fraco), CD22+
(fraco), CD5+, CD23+ e CD10-. O FMC7 e o CD79b são geralmente negativos ou
positivos fracos.
As expressões dos marcadores utilizados nas análises estão representadas na
Figura 14.
Figura 14 – Relação dos marcadores utilizados com sua reatividade, agrupando os resultados em positivos e negativos
100%
0% 3% 10%
93%
10%
87%100%
10%
90%
58%
29%
10%0%
100%
50% 50%
0%
100% 97% 90%
7%
90%
13%0%
90%
10%
42%
71%
90%100%
0%
50% 50%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
Positivo Negativo
0
1
1
0
3
7
16
0 5 10 15 20
30-40%
40-50%
50-60%
60-70%
70-80%
80-90%
90-100%
30
Utilizou-se ainda o marcador ZAP-70, que está relacionado com prognóstico
desfavorável da doença, na análise de 9 pacientes, tendo sido encontrado resultado
positivo em 85% destes casos. Outro marcador relacionado à um mal prognóstico é
o CD38, que foi utilizado na análise de 26 pacientes, obtendo positividade em 29%
dos casos.
31
5- DISCUSSÃO
Os trinta pacientes diagnosticados com Leucemia Linfocítica Crônica de
Células B demostraram, estatisticamente, leucocitose com valores entre 10.000 a
30.000/mm3 de sangue e maiores de 50.000/mm3 de aspirado de medula óssea.
Além disso, observou-se linfocitose com valores entre 10.000 a 30.000 linfócitos por
mililitro de sangue ou medula. Dos pacientes sobre os quais constavam informações
referentes à hemoglobina e hematócrito, cerca de 66,7% deles apresentaram
anemia.
Segundo MONTSERRAT et al. (1995), a LLC-B compromete duas vezes mais
indivíduos do sexo masculino do que o feminino. Porém, observou-se um maior
número de diagnósticos em mulheres, que compreendeu 19 pacientes, do que em
homens (11 pacientes).
Como já previsto, as células neoplásicas da Leucemia Linfocítica Crônica de
células B demonstraram-se CD45+, CD19+, CD23+, CD5+, HLADR+ e CD10-.
O marcador CD5+, como dito anteriormente, pode ser associado a linfócitos T,
porém não é específico destas células, uma vez que também é encontrado em 17-
25% de linfócitos B do sangue periférico. Este marcador, quando expresso em
doenças de células B maduras, divide esse grupo de doenças em dois. O primeiro,
onde há CD5 positivo, estão inclusas a LLC-B e o Linfoma de Células do Manto
(LCM). O segundo, com CD5 negativo, compreende as doenças restantes
(ORTOLANI, 2011). Desse modo, o marcador CD5 é bastante importante para o
diagnóstico da LLC-B, sendo o principal marcador para a exclusão de diversos tipos
de leucemias crônicas de células B.
Nos pacientes analisados, houve expressão do CD5 em 100% dos casos. Dessa
forma, pode-se afirmar que este é o principal marcador para diagnóstico diferencial
da LLC-B, uma vez que os demais marcadores expressos nas células neoplásicas
em questão estão presentes em diversas outras doenças onco-hematológicas de
células B. O CD5 é capaz de diferenciar a LLC-B da leucemia de células pilosas
(Hairy Cell leukemia) e da leucemia pró-linfocítica, porém não é capaz de diferenciar
a LLC-B do Linfoma de Células do Manto (LCM) (CAVALCANTI JR et al., 2005).
Mutações no gene IgVH já se mostraram importantes quanto ao prognóstico da
LLC-B. Porém, como o sequenciamento deste gene não está disponível na grande
maioria dos laboratórios, pode-se utilizar o ZAP-70 mRNA como marcador para com
32
esta finalidade. Utilizou-se o ZAP-70 em 9 pacientes, mostrando-se positivo em 85%
dos casos. Em 26 pacientes, utilizou-se o marcador, também relacionado a
prognóstico, CD38. Embora este seja um pouco menos eficiente quanto o ZAP-70,
também é capaz de indicar o futuro curso da doença (WIESTNER, 2003). Dos 30
pacientes avaliados, obteve-se ainda a informação de sobrevida de 19 destes.
Destes 19, três foram a óbito. Os valores encontrados na imunofenotipagem destes
3 pacientes estão descritos na Tabela 11.
Tabela 11 – Perfil imunofenotípicos, idade e sexo dos pacientes que foram a
óbito Imunofenotipagem Idade Sexo
Paciente 1 CD45 – 76% CD14 – 0%
CD19 – 63% CD3 – 5%
CD3/CD4 – 6% CD3/CD8 – 2% HLADR – 60%
CD34 – 2%
CD22 – 5% CD7 – 5%
CD5 – 71% CD38 – 14% CD10 – 1%
CD23 – 70% CD13 – 44%
ZAP-70 – 71%
80 Feminino
Paciente 2 CD45 – 87% CD14 – 0%
CD19 – 55% CD3 – 3%
CD3/CD4 – 2% CD3/CD8 – 1% HLADR – 30%
CD34 – 1%
CD22 – 21% CD7 – 2%
CD5 – 52% CD38 – 15% CD10 – 1%
CD23 – 32% CD13 – 2%
92 Masculino
Paciente 3 CD45 – 99% CD14 – 1%
CD19 – 87% CD3 – 8%
Kappa – 98% Lambda – 99% HLADR – 90%
CD34 – 1%
CD22 – 35% CD7 – 3%
CD5 – 92% CD38 – 5% CD10 – 1%
CD23 – 86% CD13 – 1%
80 Masculino
Observando a Tabela 11, pode-se observar que apenas um dos pacientes que
foram a óbito tiveram expressão positiva de marcadores de mal prognóstico, no caso
o ZAP-70 na Paciente 1. Porém, com relação à mesma paciente, vê-se que não
houve positividade do marcador CD38, mesmo havendo positividade do ZAP-70.
Desse modo, como não foi utilizado o marcador ZAP-70 para os outros dois
pacientes, não se pode afirmar que estes não apresentavam positividade ou
negatividade deste marcador. Além disso, deve-se levar em consideração a idade
elevada em que estes pacientes foram diagnosticados, podendo seus óbitos
33
estarem relacionados a outras doenças ou fatores.
34
6- CONCLUSÃO
No presente trabalho, foi encontrada positividade do marcador CD5 em todos
os pacientes analisados.
Os resultados dos hemogramas revelaram leucocitose acentuada, além de
linfocitose em todos os pacientes. Além disso, por meio da imunofenotipagem,
confirmou-se o fenótipo das células neoplásicas da LLC-B como sendo CD19+,
CD5+, HLADR+, CD10- e CD23+.
A análise citomorfológica mostrou grande número de linfócitos pequenos, com
núcleos redondos, cromatina condensada e citoplasma escasso, tendo sido
identificada também manchas de Gumprecht.
A observação da expressão significativa do marcador CD5 na totalidade dos
pacientes analisados, reforça a importância deste marcador como chave no
diagnóstico diferencial da Leucemia Linfocítica Crônica de células B.
35
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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http://www.servier.com/slidekit/?item=18. Acesso em: 8 Set. 2016.
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28. ZHANG, S e KIPPS, T. J. “The Pathogenesis of Chronic Lymphocytic
Leukemia”. Annu. Rev. Pathol. (2014). Web.
38
8- ANEXOS
8.1 Anexo 1 – Parecer número 1.325.562 do Comitê de Ética em pesquisa da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP DADOS DO PROJETO DE PESQUISA
Título da Pesquisa: Análise da Mudança de Expressão do Marcador CD5 na
Leucemia Linfocítica Crônica de Células B Pesquisador: Christiane Medeiros Bezerra Área Temática: Versão: 1 CAAE: 50194915.0.0000.5537 Instituição Proponente: Centro de Biociências Patrocinador Principal: Financiamento Próprio
DADOS DO PARECER
Número do Parecer: 1.325.562
Apresentação do Projeto: Trata-se de uma pesquisa desenvolvida para fins de trabalho de conclusão de curso vinculada ao Centro de Biociências. Tem por objetivo avaliar o padrão imunofenotípico, por citometria de fluxo, apresentado por pacientes com leucemia linfocítica crônica de células B. Para a realização da pesquisa serão analisados dados referentes à imunofenotipagem de sangue periférico de pacientes diagnosticados com leucemia linfocítica crônica de células B, atendidos no laboratório Hemato-Oncologistas Associados LTDA, no período de janeiro de 2011 até julho de 2016, situado no Instituto de Onco-Hematologia de Natal, IOHN. Esses dados serão captados dos prontuários dos pacientes. Informações adicionais referentes a idade e sexo dos pacientes, bem como dados referentes à análise microscópica das lâminas hematológicas também serão anotados.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE / UFRN CAMPUS CENTRAL
39
Comporão a amostra 40 prontuários. Os critérios de inclusão são: todos aqueles prontuários de pacientes já diagnosticados com leucemia linfocítica crônica de células B, arquivados no laboratório Hemato-Oncologistas Associados LTDA e que contenham os dados referentes à análise imunofenotípica por citometria de fluxo, devidamente registrados. Como critérios de exclusão, são apontados: Os prontuários que porventura não estejam com os dados de imunofenotipagem devidamente registrados. Esses dados serão organizados em planilhas ExCel. Gráficos oriundos do software CELLQuest serão utilizados para ilustração do trabalho. Objetivo da Pesquisa: Objetivo Geral: Avaliar o padrão imunofenotípico, por citometria de fluxo, apresentado por pacientes com leucemia linfocítica crônica de células B. Como objetivo específico, tem-se: Avaliar a mudança de expressão do marcador CD5 nestes pacientes diagnosticados com leucemia linfocítica crônica de células B.
Avaliação dos Riscos e Benefícios: Na avaliação dos riscos, as pesquisadoras estimam que não ocorrerá riscos, uma vez que serão utilizados "apenas" prontuários dos pacientes, e que, em algumas situações, podem até já ter falecido devido ao tempo transcorrido e à gravidade da doença. Como benefícios elas apontam o conhecimento proveniente desta análise que pode contribuir com dados importantes no diagnóstico da neoplasia por citometria de fluxo.
Comentários e Considerações sobre a Pesquisa: Trata-se de uma pesquisa relevante no que tange a sua contribuição para o diagnóstico da neoplasia por citometria de fluxo. No entanto, é fundamental que a equipe de pesquisa considere sempre os direitos do paciente no decorrer da pesquisa. Apesar de ser uma pesquisa que se reporta ao uso de registro (prontuários), a mesma não deixa de apresentar riscos aos sujeitos participantes. E, nesse sentido, cabe ainda considerar que os pesquisadores devem manipular esses registros de forma sigilosa, com respeito as informações que lá constam e ainda: não retirar fotos, documentos, ou realizar anotações que não estejam vinculadas diretamente aos objetivos da pesquisa.
40
Considerações sobre os Termos de apresentação obrigatória:
Foram apresentados os seguintes termos de apresentação obrigatória: Termo de
confidencialidade, garantindo o sigilo das informações; Formulário CEP/UFRN;
Folho de Rosto; Carta de Anuência; Termo de Concessão; Declaração que não
iniciou coleta de dados; Cronograma e Solicitação de dispensa de TCLE, uma vez
que considera a dificuldade de encontrar estes pacientes que podem já ter falecido
em decorrência da doença, e também pelo fato de muitos não residirem em Natal.
Recomendações: Recomendamos que o Termo de Confidencialidade seja assinado por todos os membros da equipe de pesquisa.
Conclusões ou Pendências e Lista de Inadequações: Após análise ética e científica do protocolo de pesquisa e documentos relacionados, o CEP Central/UFRN considerou que o referido protocolo de pesquisa está bem estruturado e em consonância com a Resolução 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde - CNS e, por esse motivo, recebe parecer de APROVADO.
Considerações Finais a critério do CEP: Em conformidade com a Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde - CNS e Manual Operacional para Comitês de Ética - CONEP é da responsabilidade do pesquisador responsável: 1. Elaborar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE em duas vias, rubricadas em todas as suas páginas e assinadas, ao seu término, pelo convidado a participar da pesquisa, ou por seu representante legal, assim como pelo pesquisador responsável, ou pela (s) pessoa (s) por ele delegada(s), devendo as páginas de assinatura estar na mesma folha (Res. 466/12 - CNS, item IV.5d); 2. Desenvolver o projeto conforme o delineado (Res. 466/12 - CNS, item XI.2c); 3. Apresentar ao CEP eventuais emendas ou extensões com justificativa (Manual Operacional para Comitês de Ética - CONEP, Brasília - 2007, p. 41); 4. Descontinuar o estudo somente após análise e manifestação, por parte do Sistema CEP/CONEP/CNS/MS que o aprovou, das razões dessa descontinuidade, a não ser em casos de justificada urgência em benefício de seus participantes (Res. 446/12 - CNS, item III.2u); 5. Elaborar e apresentar os relatórios parciais e finais (Res. 446/12 - CNS, item
XI.2d);
41
6. Manter os dados da pesquisa em arquivo, físico ou digital, sob sua guarda e responsabilidade, por um período de 5 anos após o término da pesquisa (Res. 446/12 - CNS, item XI.2f); 7. Encaminhar os resultados da pesquisa para publicação, com os devidos créditos aos pesquisadores associados e ao pessoal técnico integrante do projeto (Res. 446/12 - CNS, item XI.2g) e, 8. Justificar fundamentadamente, perante o CEP ou a CONEP, interrupção do projeto ou não publicação dos resultados (Res. 446/12 - CNS, item XI.2h).
Este parecer foi elaborado baseado nos documentos abaixo relacionados:
Tipo Documento Arquivo Postagem Autor Situação
Informações Básicas PB_INFORMAÇÕES_BÁSICAS_DO_P 13/10/2015 Aceito do Projeto ROJETO_602338.pdf 10:22:16
Folha de Rosto Folha_Rosto_Helena.pdf 09/10/2015 Christiane Medeiros Aceito 12:39:53 Bezerra
Outros Formulario_CEP_Leucemia.pdf 09/10/2015 Christiane Medeiros Aceito 10:06:02 Bezerra
Projeto Detalhado / PROJETO_TCC_Helena.pdf 08/10/2015 Christiane Medeiros Aceito Brochura 15:40:29 Bezerra
Investigador Declaração de declaracao_coleta_dados.pdf 08/10/2015 Christiane Medeiros Aceito Pesquisadores 15:11:17 Bezerra
Outros carta_anuencia.pdf 08/10/2015 Christiane Medeiros Aceito 15:05:16 Bezerra
Outros termo_confidencialidade.pdf 08/10/2015 Christiane Medeiros Aceito 11:48:31 Bezerra
Outros termo_concessao.pdf 08/10/2015 Christiane Medeiros Aceito 11:46:59 Bezerra
Cronograma Cronograma.docx 08/10/2015 Christiane Medeiros Aceito 11:41:40 Bezerra
TCLE / Termos de Justificativa_dispensa_TCLE.pdf 08/10/2015 Christiane Medeiros Aceito Assentimento / 11:33:26 Bezerra Justificativa de
Ausência
NATAL, 17 de Novembro de 2015
LÉLIA MARIA GUEDES QUEIROZ (Coordenador)
Situação do Parecer: Necessita Apreciação da CONEP: Aprovado Não
