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MARCELO GADELHA VASCONCELOS
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DOS MARCADORES
ANGIOGÊNICOS CD105 (ENDOGLINA) E CD34 EM HEMANGIOMAS E GRANULOMAS PIOGÊNICOS ORAIS
NATAL/RN
2008
1
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DESPORTO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DOS MARCADORES ANGIOGÊNICOS CD105 (ENDOGLINA) E CD34 EM
HEMANGIOMAS E GRANULOMAS PIOGÊNICOS ORAIS
Mestrando: Marcelo Gadelha Vasconcelos Orientadora: Profª. Drª. Lélia Maria Guedes Queiroz
NATAL/RN 2008
Dissertação apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação
em Patologia Oral do Departamento de Odontologia do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte –
UFRN, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre
em Patologia Oral.
Vasconcelos, Marcelo Gadelha. Expressão imuno-histoquímica dos marcadores angiogênicos CD105 (endoglina) e
CD34 em hemangiomas e granulomas piogênicos orais / Marcelo Gadelha Vasconcelos. – Natal, RN, 2008.
110f. : il. Orientador: Lélia Maria Guedes Queiroz. Dissertação (Dissertação). Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de
Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia. Programa de Pós-graduação em Patologia Oral.
1. Patologia oral – Dissertação. 2. Angiogênese – Dissertação. 3. Hemangioma –
Dissertação. 4. Granuloma piogênico – Dissertação. I. Queiroz, Lélia Maria Guedes. II. Título.
RN/UF/BSO Black D61
Divisão de Serviços Técnicos Catalogação da Publicação na Fonte UFRN/Biblioteca Setorial de Odontologia
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“Nunca deixe que lhe digam que não vale a pena acreditar
no sonho que se tem.”
(Renato Russo)
DEDICATÓRIA
3
Dedico a concretização deste sonho, aos meus pais, meus irmãos, a toda minha
família pela contribuição e apoio dado a essa conquista.
Aos meus pais, fonte de sabedoria, conselheiros dos momentos decisivos,
símbolos de paciência e tolerância, meus maiores e melhores amigos, mestres e guias
da minha formação moral, meu sincero e eterno obrigado por me ensinarem e
ajudarem a viver e acreditarem nos meus ideais. Amo vocês!!
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AGRADECIMENTOS
“Agradeço todas as dificuldades que enfrentei; não fosse por
elas, eu não teria saído do lugar. As facilidades nos impedem de
caminhar. Mesmo as críticas nos auxiliam muito”
(Chico Xavier)
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Obrigado meu Deus, por mais uma etapa de minha vida conquistada;
Obrigado, porque naqueles momentos em que fraquejei; que não tinha mais forças para
caminhar, tu me ergueste com tua própria vida;
Obrigado porque naquele momento de desânimo lembrei que tu és meu Pai;
Quero agradecer ao Senhor e a Nossa Senhora Maria Auxiliadora por todos os sonhos
que eu tive ousadia em sonhar; por todos os passos que tive coragem em dar; por todas
as decisões que eu resolvi tomar; por todos os obstáculos que enfrentei; pelo meu
desejo de superação; pela minha esperança em querer sempre tentar....
Toda minha gratidão ao amigo que posso sempre, eternamente, contar: DEUS !
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À minha Orientadora;
A Profª. Drª. Lélia Maria Guedes Queiroz, exemplo de sabedoria, dedicação,
seriedade, ética e, sobretudo, de amor pela profissão, agradeço a sua contribuição, aos
seus ensinamentos, por todo entusiasmo e incentivos prestados a mim;
Obrigado por todo tempo a mim despendido, pela tolerância e paciência...
Obrigado por guiar minhas mãos durante esse percurso de dois anos de Mestrado, pela
insistência em ensinar, quando por vezes, eu pensava em desistir....
Obrigado por ser meu Mestre, minha professora Amiga....
Obrigado por me compreender, me estimular e me enriquecer com sua presença e seu
saber!
Obrigado por acreditar em mim e me fazer sentir importante, demonstrando-me que
posso fazer a diferença.
Enfim, juntos vencemos!
Meus sinceros agradecimentos...
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À coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral-UFRN;
Profª. Drª. Lélia Batista de Souza, toda a minha sincera gratidão por repartir
seus conhecimentos, princípios e experiências que grandemente contribuíram para
minha formação. Ao seu exemplo magnífico, pelo carinho com que orienta seus
aprendizes e pela dedicação desmedida a esta Escola, a minha homenagem e
admiração.
Aos professores:
Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Prof. Dr. Angelo Giuseppe Roncalli da
Costa Oliveira, Profª. Drª. Ana Miryam Costa de Medeiros, Profª. Drª. Hébel
Cavalcanti Galvão, Prof. Dr. Heitel Cabral Filho, Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, Profª.
Drª. Márcia Cristina da Costa Miguel e Profª. Drª. Roseana de Almeida Freitas.
Aos senhores, que quando deveriam ser simplesmente professores, foram meus
mestres, transmitindo seus conhecimentos e experiências de vida; que quando deveriam
ser mestres foram meus amigos e em sua amizade me compreenderam e me
incentivaram a seguir o melhor caminho, expresso os meus maiores agradecimentos e o
meu profundo respeito, que sempre serão poucos diante do muito que foi oferecido.
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Aos meus caros e inesquecíveis amigos do Mestrado: Betania Fachetti Ribeiro,
Déborah Pitta Paraíso Iglesias, Domingos Flávio Saldanha Pacheco, Pedro Paulo de
Andrade Santos e Ruth Lopes de Freitas Xavier.
No início, éramos apenas “nomes” de uma lista de aprovação de
Mestrado/2006 em Patologia Oral-UFRN....Confesso que surgiu aquela expectativa
acerca de como seriam as pessoas com quem eu iria conviver durante esses dois anos.
Com o curso, iniciamos a nossa convivência, experimentamos juntos as boas e, por
vezes, árduas sensações que uma pós-graduação nos impõe. Período de muita
compreensão, risos e lágrimas. Fizemos descobertas, ultrapassamos obstáculos que,
muitas vezes, pareciam intransponíveis, apoiados no fato de não estarmos sozinhos.
Assim, com o tempo, por tudo que vivemos e fizemos, os seus “nomes” ganharam forma
e personalidade. Na verdade esses simples “nomes” se transformaram, sim, em meus
verdadeiros Amigos! Então, nesse momento de vitória, só a gratidão é pouco....
Obrigado por acreditarem em mim quando eu achei difícil acreditar em mim mesmo;
agradeço por confiarem e respeitarem os meus pensamentos e sonhos, obrigado por
terem sido presentes em minha vida!
"Depois de algum tempo você aprende que verdadeiras amizades
continuam a crescer mesmo a longas distâncias, e o que importa
não é o que você tem na vida, mas quem você tem na vida."
(W. Shakespeare)
9
Aos amigos da Patologia Oral-UFRN;
Alexandre Pinto, André Galvão, Bruna Rafaela Martins, Bruna Amaral,
Cristina Ruan, Claudine Sousa, Cassiano Nonaka, Éricka Janine, George
Nascimento, Janaína Lemos, Karuza Pereira, Marta Piva, Manoel Antonio Gordón,
Pollianna Alves e Valéria Freitas, agradeço a todos vocês a esse período de
convivência e aprendizado que passamos juntos... Na verdade, posso dizer que foram
momentos de muita compreensão, amizades, risos e lágrimas, de angústias e
expectativas, tropeços e vitórias que jamais serão esquecidos! Meus sinceros
agradecimentos pela contribuição e o apoio prestados a mim durante essa jornada.
“Aqueles que passam por nós não vão sós, não nos deixam
sós. Deixam um pouco de si, levam um pouco de nós”.
(Felipe Cortelline Roque)
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Aos funcionários da Disciplina de Patologia Oral-UFRN,
Francisco Canindé de Macedo, Hévio Lucena, Idelzuite de Souza, Lourdes
Souza, Maria das Graças Galvão e Sandra Oliveira, agradeço ao apoio, a paciência,
ao auxilio e a disponibilidade que me prestaram ao longo dessa caminhada para a
concretização desse trabalho. Obrigado pelas manifestações de carinho e confiança!!
Sou grato a todos vocês!!
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), agradeço
pela oportunidade e pelo apoio financeiro proporcionado para elaboração deste ensaio
científico.
11
RESUMO
“Porque um dia é preciso parar de sonhar, tirar os
planos das gavetas e de algum modo começar.”
(Amyr Klink)
12
RESUMO
A angiogênese é um mecanismo fundamental para o desenvolvimento tumoral,
sendo utilizada para fins de diagnóstico diferencial e determinação de prognóstico em
várias neoplasias de cabeça e pescoço. Este trabalho se propôs avaliar a atividade
angiogênica através da expressão imuno-histoquímica dos anticorpos anti-CD105 e anti-
CD34 em 20 casos de hemangiomas e 20 casos de granulomas piogênicos orais, além de
averiguar a utilidade destes marcadores como um dos recursos de diagnóstico
diferencial para estas duas lesões orais. Os resultados deste experimento demonstraram
que não houve diferença estatisticamente significativa entre as médias de contagem
microvascular (MVC) determinadas pelos os anticorpos anti-CD105 (p=0,803) e anti-
CD34 (p=0,279). O número médio dos vasos obtidos pela MVC nos espécimes de
hemangiomas orais imunomarcados pelo anti-CD105 e anti-CD34 foram
respectivamente 18,75 e 59,72, enquanto nos granulomas piogênicos orais, o número
médio dos vasos obtidos pela MVC pelo anti-CD105 e anti-CD34 foram
respectivamente 20,22 e 48,09. Foi verificado, também, que o CD34 foi mais efetivo na
identificação de vasos sangüíneos quando comparado com o CD105. Entretanto, faz-se
necessário destacar, que o anticorpo anti-CD105 parece estar mais relacionado com a
neoformação vascular. Em linhas gerais, este ensaio reforça a participação dos fatores
angiogênicos na etiopatogênese dos hemangiomas e granulomas piogênicos orais,
porém os resultados mostraram que a quantificação da angiogênese não pode ser
utilizada como parâmetro de diagnóstico diferencial entre as duas lesões analisadas.
Palavras Chaves: CD105 (endoglina), CD34, angiogênese, hemangioma, granuloma
piogênico, imuno-histoquímica, patologia oral.
13
ABSTRACT
"Nas grandes batalhas da vida, o primeiro passo para a
vitória é o desejo de vencer!"
(Mahatma Gandhi)
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ABSTRACT
Angiogenesis, a fundamental mechanism in tumor development, is used for
differential diagnosis and prognosis purposes in various neoplasias of the head and
neck. This study proposes to assess angiogenic activity using immunohistochemical
expression by anti-CD105 and anti-CD34 antibodies in 20 cases of hemangiomas and
20 cases of oral pyogenic granulomas, in addition to determining the usefulness of these
markers as one of the differential diagnosis resources for these two oral lesions. The
results showed no statistically significant difference between microvascular count
(MVC) means determined by anti-CD105 (p = 0.803) and anti-CD34 (p = 0.279)
antibodies. The mean number of vessels obtained by MVC in the oral hemangiomas
immunostained by anti-CD105 and anti-CD34 was 18.75 and 59.72, respectively,
whereas in the oral pyogenic granulomas, the mean number was 20.22 and 48.09,
respectively. It was also shown that CD34 was more effective than CD105 in
identifying blood vessels. However, it must be pointed out that the anti-CD105 antibody
seems to be more related to vascular neoformation. Overall, this assay reinforces the
role of angiogenic factors in the etiopathogenesis of hemangiomas and oral pyogenic
granulomas, but the results showed that angiogenesis quantification cannot be used as a
differential diagnosis parameter between the two lesions analyzed.
Keywords: CD105 (endoglin), CD34, angiogenesis, hemangioma, pyogenic granuloma,
immunohistochemical, oral pathology.
15
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
"Se não puder se destacar pelo talento, vença pelo esforço."
(Dave Weinbaum)
16
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
QUADROS
Quadro 1. Especificação, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos
anticorpos primários utilizados ............................................................................................
FIGURAS
Figura 1. Granuloma piogênico. Fotomicrografia exibindo a superfície da lesão atrófica
e um tecido conjuntivo fibroso frouxo com um intenso infiltrado inflamatório misto
permeando numerosos vasos sangüíneos de calibres variados (H/E – 40x) ........................
Figura 2. Granuloma piogênico. Detalhe em maior aumento mostrando vasos
sangüíneos associados a uma inflamação mista difusa (H/E – 200x) .................................
Figura 3. Granuloma piogênico. Marcação imuno-histoquímica para o anticorpo anti-
CD105 predominantemente em vasos sangüíneos (SABC–100x) ......................................
Figura 4. Granuloma piogênico. Detalhe em maior aumento do quadro histológico
anterior evidenciando a imunoexpressão para o anticorpo anti-CD105 em vasos
sangüíneos e em ocasionais células endoteliais (SABC – 400x) .........................................
Figura 5. Granuloma piogênico. Fotomicrografia evidenciando padrão de marcação do
anticorpo anti-CD34 em vasos sangüíneos de calibres variados (SABC – 200x) ...............
Figura 6. Granuloma piogênico. Detalhe em maior aumento da imunoexpressão pelo
anticorpo anti-CD34 em numerosos vasos sangüíneos de variados calibres (SABC –
400x) ....................................................................................................................................
Figura 7. Hemangioma. Fotomicrografia mostrando numerosos espaços vasculares
associados a uma proliferação endotelial (H/E – 100x) ......................................................
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Figura 8. Hemangioma. Fotomicrografia em maior aumento evidenciando múltiplos
vasos sangüíneos dilatados, sendo a maioria deles ingurgitados por hemácias (H/E –
200x) ....................................................................................................................................
Figura 9. Hemangioma. Imunoexpressão do anticorpo anti-CD105 em vasos sangüíneos
e em ocasionais células endoteliais (SABC – 100x) ...........................................................
Figura 10. Hemangioma. Detalhe em maior aumento da imunoexpressão para o
anticorpo anti-CD105 em vasos sangüíneos (SABC – 400x) ..............................................
Figura 11. Hemangioma. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em múltiplos
vasos sangüíneos (SABC – 100x) ........................................................................................
Figura 12. Hemangioma. Detalhe em maior aumento da imunoexpressão para o
anticorpo anti-CD34 em vasos sangüíneos e ocasionais células endoteliais (SABC –
400x) ....................................................................................................................................
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LISTA DE TABELAS
"A maior vitória na competição é derivada da satisfação interna de
saber que você fez o seu melhor e que você obteve o máximo
daquilo que você deu."
(Howard Cosell)
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LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Imunoexpressão do anticorpo anti-CD105 em granulomas piogênicos e
hemangiomas. Natal/RN, 2008 ............................................................................................
Tabela 2. Imunoexpressão do anticorpo anti-CD34 em granulomas piogênicos e
hemangiomas. Natal/RN, 2008 ............................................................................................
Tabela 3. Valores dos índices angiogênicos determinados pela contagem microvascular
(MVC) de acordo com o marcador nos espécimes de hemangiomas. Natal/RN, 2008 .......
Tabela 4. Valores dos índices angiogênicos determinados pela contagem microvascular
(MVC) de acordo com o marcador nos espécimes de granulomas piogênicos. Natal/RN,
2008 .....................................................................................................................................
Tabela 5. Valores dos índices angiogênicos determinados pala contagem microvascular
(MVC) de acordo com o marcador e o tipo de lesão estudada. Valores “t” e “p” para o
teste “t” de Student. Natal/RN, 2008 ...................................................................................
Tabela 6. Valores dos índices angiogênicos determinados pala contagem microvascular
(MVC) de acordo com o tipo de lesão e marcador estudado. Valores “t” e “p” para o
teste “t” de Student. Natal/RN, 2008 ...................................................................................
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20
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
"O sucesso é ter o que você deseja e a felicidade é ter o
que você já tem."
(Warren Buffet)
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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
• ABNT – Associação Brasileira de Normas e Técnicas
• AP - Adenoma pleomórfico
• AVT - Área vascular total
• aFGF - Fator de crescimento de fibroblasto ácido
• bFGF - Fator de crescimento de fibroblasto básico
• BMP - Proteína morfogenética óssea
• BSA - Albumina sérica bovina
• CD - Grupo designação ou grupo de diferenciação
• CD62L - L-selectina
• CD62E - E-selectina
• CD62-P - P-selectina
• CSA - Catalyzed Signal Amplication Sytem
• CXAP - Ex-adenoma pleomórfico
• DBF - Data Base Format
• ELAM-1 - Molécula endotelial de adesão do leucócito do tipo 1
• FGF - Fator de crescimento de fibroblasto
• FGF- 1 - Fator de crescimento de fibroblastos do tipo 1
• FGF- 2 - Fator de crescimento de fibroblastos do tipo 2
• FNF-α - Fator de necrose tumoral alfa
• FvW - Fator de von Willebrand
• GP - Glicoproteína
• G-CSF - Fator estimulador de colônia de granulócitos
• GlyCAM-1 - Molécula de adesão do tipo 1 que contém glicano
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• HIF-1 - Fator 1 indutor hipóxia
• H/E - Hematoxilina e eosina
• HEV - Vênula especializada de endotélio alto
• IL-1 - Interleucina 1
• IL-8 - Interleucina 8
• IGF-1 - Fator de crescimento insulínico-1
• INF-α - Interferon alfa
• ISSNA - Sociedade Internacional para Estudos de Anomalias Vasculares
• KDa - Kilodalton
• LAM-1 - Molécula de adesão de leucócitos do tipo 1
• MadCAM-1- Molécula de adesão celular adressina da mucosa do tipo 1
• MIS - Substância inibidora mülleriana
• MVC - Contagem microvascular
• MVD - Densidade microvascular
• MVV - Volume microvascular
• PCNA - Antígeno nuclear de proliferação celular
• PGE2 - Prostaglandina E2
• PDGF - Fator de crescimento derivado de plaquetas
• PDGF-β - Fator de crescimento derivado de plaquetas beta
• SABC - Complexo estreptoavidina biotina
• SFB - Soro fetal bovino
• SMC - Actina de músculo liso
• SPSS - Statistical Package for Social Science
• TA - Temperatura ambiente
• TGF-α - Fator de crescimento transformador alfa
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• TGF- β - Fator de crescimento transformador beta
• TIMP-1 – Inibidor de metaloproteinase do tipo 1
• TNM – Tumor-nodo-mestátase
• TPS-1 - Trombospondina do tipo 1
• TRIS HCl - Tris (hydroxymethyl) aminomethane Hydrochloride
• VEGF - Fator de crescimento celular endotelial vascular
• VEGFR-2 - Receptor do tipo 2 do fator de crescimento endotelial vascular
• VEGF-C1 - Fator de crescimento celular endotelial vascular C1
• μm - Micra
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SUMÁRIO
"Quando você quer alguma coisa, todo o Universo conspira para que você realize o seu desejo".
(Paulo Coelho)
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SUMÁRIO
Página
1 INTRODUÇÃO ...............................................................................................................
2 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................
2.1 Angiogênese ............................................................................................................
2.2 Granuloma Piogênico - Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e
Histopatologia ......................................................................................................................
2.3 Hemangioma - Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia ..........
2.4 Mensuração da Angiogênese ...................................................................................
2.5 Biomarcadores Angiogênicos (CD105 e CD34) .....................................................
3 PROPOSIÇÃO ................................................................................................................
4 MATERIAL E MÉTODOS ...........................................................................................
4.1 Caracterização do Estudo .......................................................................................
4.2 População ................................................................................................................
4.3 Amostra ...................................................................................................................
4.3.1 Critérios de Inclusão da Amostra .............................................................
4.3.2 Critérios de Exclusão da Amostra ............................................................
4.4 Estudo Morfológico ................................................................................................
4.5 Estudo Imuno-histoquímico ....................................................................................
4.6 Análise do Perfil Imuno-histoquímico ....................................................................
4.7 Análise Estatística ...................................................................................................
4.8 Implicações Éticas ..................................................................................................
5 RESULTADOS ...............................................................................................................
5.2 Resultados Morfológicos .......................................................................................
5.3 Resultados Imuno-histoquímicos ...........................................................................
5.3.1 Análise Qualitativa da Marcação Imuno-histoquímica pelos Anticorpos
Anti-CD105 e Anti-CD34 ....................................................................................................
5.3.2 Análise Quantitativa da Marcação Imuno-histoquímica pelos
Anticorpos Anti-CD105 e Anti-CD34 .................................................................................
5.3.3 Análise Estatística da Contagem dos Microvasos Marcados pelos
Anticorpos Anti-CD105 e Anti-CD34 .................................................................................
6 DISCUSSÃO....................................................................................................................
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7 CONCLUSÕES ...............................................................................................................
REFERÊNCIAS .................................................................................................................
APÊNDICES ......................................................................................................................
ANEXOS .............................................................................................................................
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27
INTRODUÇÃO
"É justamente a possibilidade de realizar um sonho que torna a vida interessante"
(Paulo Coelho)
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1 INTRODUÇÃO
A angiogênese é definida como o crescimento e desenvolvimento de novos
vasos sangüíneos a partir de outros pré-existentes, sendo fundamental para uma série de
eventos fisiológicos e patológicos incluindo a inflamação e reparo tecidual, crescimento,
invasão e metástase tumoral. É um processo altamente dinâmico e complexo que
envolve o crescimento e migração de células endoteliais e a morfogênese capilar. Todos
esses mecanismos celulares são regulados por vários fatores pró e antiangiogênicos e
seus receptores, os quais regulam uma ou mais chaves de eventos da neoformação
vascular (FOLKMAN, 1995; SCHIMMING et al, 2004; SOARES, 2007; SOUZA;
FREITAS; MIRANDA, 2007; NETTO et al, 2008).
O granuloma piogênico é designado como uma massa de tecido proliferativo
fibrovascular benigno, de natureza inflamatória que apresenta uma grande incidência na
cavidade oral, consistindo cerca de 30 a 60% de todas as lesões reacionais que
acometem a gengiva. Sua etiologia é bastante complexa, mas segundo a literatura,
possivelmente estar associada a uma resposta tecidual exuberante a uma irritação ou
trauma. Microscopicamente, a lesão é caracterizada por uma intensa reação de
granulação rica em vasos sangüíneos de calibres variados, por vezes dilatados e
ingurgitados por eritrócitos, sendo os mesmos revestidos por células endoteliais e
pericitos mitoticamente ativos (SILVERSTEIN et al, 1996; SILVEIRA et al, 2004;
JAFARZADEH; SANATKHANI; MOHTASHAM, 2006; SHENOY; DINKAR, 2006).
O hemangioma é uma neoplasia benigna cuja patogênese, ainda pouco
elucidada, pode estar relacionada a estímulos endócrinos e inflamatórios que causam
uma série de desequilíbrios nos mecanismos angiogênicos. É a lesão tumoral mais
comum da infância, ocorrendo em 10 a 12% das crianças com até um ano de idade,
sendo encontrada com maior freqüência na região de cabeça e pescoço em 60% dos
casos. Histologicamente observa-se numerosas células endoteliais proliferantes
dilatadas e com o lúmen vascular geralmente indistinto que durante o estágio de
progressão originam abundantes espaços vasculares de diversos tamanhos, podendo,
desta maneira, ser classificado, principalmente, em hemangioma capilar ou cavernoso
(RODRIGUES et al, 1998; FREITAS et al, 2005; GONTIJO et al, 2005; CORRÊA et
al, 2007).
Atualmente, muitas pesquisas têm sido realizadas para o entendimento dos
principais mecanismos angiogênicos com o intuito de obterem novas formas
29
terapêuticas, que possam acelerar a angiogênese durante o reparo tecidual ou inibir este
processo em diversas condições tumorais, bem como subsidiarem para o uso em
diagnóstico e prognóstico (FOLKMAN, 1995; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005;
NETTO et al, 2008).
Sendo assim, diversos marcadores biológicos com afinidade por epítopos
específicos de células endoteliais como, por exemplo, o fator von Willebrand ou fator
VIII, CD31, CD44, CD105 (endoglina) e CD34, têm sido identificados como passíveis
de utilização para o esclarecimento da patogênese em muitos tipos de carcinomas e
lesões benignas de cabeça e pescoço, como o granuloma piogênico e o hemangioma, os
quais exibem, muitas vezes, características clínicas e histopalógicas semelhantes que
podem dificultar o diagnóstico (TAKAHASHI et al, 1994; COHEN, 2002; FREITAS et
al, 2005; SOARES et al, 2007; NETTO et al, 2008).
Diante do exposto, este trabalho tem como proposição avaliar a expressão
imuno-histoquímica através dos anticorpos monoclonais anti-CD105 e anti-CD34 em
hemangiomas e granulomas piogênicos orais por meio da mensuração da atividade
angiogênica com a finalidade de ajudar a delimitar o perfil angiogênico e, assim,
compreender os mecanismos de patogênese destas lesões, bem como apurar se a
proliferação vascular e a expressão destes marcadores poderiam ser úteis como um dos
recursos de diagnóstico diferencial para estas duas lesões orais.
30
REVISÃO DE LITERATURA
“ O poder está dentro de você enquanto você acreditar.”
(Fernando Lapolli)
31
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Angiogênese
O desenvolvimento dos vasos sangüíneos pode ocorrer, basicamente, por dois
processos distintos: vasculogênese e angiogênese. A vasculogênese é caracterizada pelo
estabelecimento de uma rede vascular primitiva por meio dos precursores das células
endoteliais chamadas de angioblastos. Já a angiogênese ou neovascularização, é um
termo de origem grega (aggeîon: vaso, gênesis, formação), usado para descrever o
mecanismo de crescimento de novos vasos sangüíneos a partir de outros pré-existentes
(COHEN, 2002). Segundo Fox (1997), o termo angiogênese foi utilizado por Hertig, em
1935, para configurar o desenvolvimento da placenta, sendo atualmente empregado para
caracterizar os mecanismos fisiológicos e patológicos de neovascularização.
A angiogênese é um processo altamente dinâmico e complexo que envolve um
conjunto de etapas. Inicialmente há uma vasodilatação e aumento da permeabilidade do
vaso pré-existente; em seguida, evidencia-se a degradação proteolítica da membrana
basal do vaso progenitor por metaloproteinases e rompimento do contato célula-célula
entre as células endoteliais do vaso. Por conseguinte, observa-se a migração das células
endoteliais circulantes para o sítio de formação do vaso, onde proliferam e formam uma
espécie de broto ou tubo que depois sofre remodelação e diferenciação, dando origem a
um novo vaso. Durante esse mecanismo, verifica-se o recrutamento de células
periendoteliais, incluindo pericitos e células da musculatura vascular lisa, que atuam na
sustentação e estabilização dos tubos endoteliais, contribuindo, assim, para o
surgimento de um vaso maduro (FOX; GASPARINI; HARRIS, 2001; KUMAR;
ABBAS; FAUSTO, 2005).
A neoformação vascular é fundamental para uma série de eventos fisiológicos
incluindo a embriogênese, lactação, reprodução e reparo tecidual, bem como em eventos
patológicos como, por exemplo, durante o crescimento tumoral e metástase, na
vascularização dos tecidos isquêmicos, em fibroses, na inflamação crônica, retinopatia
diabética, hemangiomas e em algumas doenças auto-imunes como artrite reumatóide e
psoríase (FOLKMAN; SHING, 1992; FOLKMAN, 1995; COHEN, 2002;
SCHIMMING et al, 2004; FREITAS et al, 2005; SOUZA; FREITAS; MIRANDA,
2007).
32
Todos esses mecanismos celulares são regulados por uma série de fatores pró e
antiangiogênicos e seus receptores, os quais regulam uma ou mais chaves de eventos.
Apesar dos processos regulatórios não serem completamente estabelecidos, evidências
sugerem que a cascata de eventos ocorre e que a intervenção de um ou mais passos é
suficiente para prevenir ou promover a vascularização (FOX; GASPARINI; HARRIS,
2001; SCHIMMING et al, 2004).
Em tecidos normais, os vasos sangüíneos estão, geralmente, em estado
quiescente, pois suas células secretam baixos níveis de fatores indutores e altos níveis
de inibidores de sua proliferação. A progressão de uma célula normal para a
malignidade envolve a capacidade desta célula estimular a angiogênese. As células
tumorais aumentam a secreção de fatores vasos-indutores e diminuem a de inibidores.
Depois que os tumores sólidos atingem um volume de 1 a 2 mm2 , seu crescimento
passa a ser diretamente dependente da angiogênese. Portanto, o processo neoplásico é
diretamente relacionado com a neovascularização, a qual é decorrente do desequilíbrio
entre os fatores angiogênicos e anti-angiogênicos. Por conseguinte, a ocorrência ou não
deste processo depende do equilíbrio entre o acúmulo ou diminuição de moléculas
indutoras e/ou inibidoras secretadas pelas células neoplásicas (VOLPERT; DAMERON,
BOUCK, 1997; NETTO et al, 2008).
Entre os principais reguladores pro-angiogênicos estão o fator de crescimento
celular endotelial vascular (VEGF) e o fator de crescimento de fibroblasto (FGF). O
VEGF emerge como o fator de crescimento mais importante, sendo sintetizado e
secretado por células mesenquimais, principalmente por fibroblastos e macrófagos.
Caracteriza-se como um potente indutor da formação dos vasos sangüíneos no
desenvolvimento inicial (vasculogênese) e tem um papel central no crescimento de
novos vasos sangüíneos (angiogênese) em tumores, inflamação crônica e cicatrização de
ferimentos. A ativação do VEGF e sua ligação com receptores específicos da tirosina
cinase, receptor do tipo 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR-2),
existentes nas células entoteliais, desencadeia uma cascata de reações que promovem o
aumento da permeabilidade vascular, crescimento e migração de células endoteliais,
diferenciação e mobilização dos precursores das células endoteliais da medula óssea
para a circulação periférica. As células endoteliais derivadas desses progenitores
formam um plexo capilar delicado, que se desenvolve em uma rede capilar madura. O
FGF é um fator que pode ser secretado por macrófagos, mastócitos, células endoteliais e
fibroblastos. Apresenta-se de duas formas: FGF-1 ou aFGF (ácido) e FGF-2 ou bFGF
33
(básico), ambos com o papel semelhante de induzirem a liberação do VEGF,
potencializando, portanto, o mecanismo da angiogênese (FOLKMAN; SHING, 1992;
SHEIBANI; NEWMAN; FRAZIER, 1997; POON; FAN; WONG, 2001; WAKULICH
et al, 2002; NETTO et al, 2008).
A angiogênese fisiológica e patológica, também, é influenciada por outros
agentes ou condições que estimulam a expressão do VEGF, como certas interleucinas
(interleucina-1 e interleucina-8), angiopoetinas e fatores de crescimento (PDGF – fator
de crescimento derivado de plaquetas; TGF-α - fator transformador de crescimento alfa;
TGF-β - fator de crescimento transformador beta) e, notavelmente, a hipóxia tecidual
que tem sido longamente associada à angiogênese (GASPARINI; HARRIS, 2001;
KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
As angiopoetinas, PDGF e TGF- β participam do processo de estabilização dos
vasos recém-formados, tornando tubos endoteliais simples em estruturas vasculares
elaboradas, ajudando, com isso, a manter a quiescência endotelial (FOLKMAN;
SHING, 1992; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Dentre os fatores que atuam interferindo na angiogênese, encontram-se,
freqüentemente, a angiostatina, endostatina e trombospondina-1 (TPS-1), onde todos
agem impedindo o endotélio de estímulos mitógenos, inibindo a migração de células
endoteliais, reduzindo a proliferação vascular e contribuindo com a apoptose dessas
células (FOLKMAN, 1995; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Alguns autores sugerem que o mecanismo pelo qual os eventos estimuladores e
inibidores ocorrem, esteja relacionado com a ativação de oncogenes ou inativação de
genes supressores de tumor. Oncogenes, como os membros da família do FGF têm a
capacidade de induzir a angiogênese através da codificação de potentes fatores
estimuladores, aFGF e bFGF. Do mesmo modo, o oncogene ras pode codificar potentes
fatores de proliferação vascular como os TGF-α, TGF-β, fator de crescimento
insulínico-1 (IGF-1), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), fator estimulador de
colônia de granulócito (G-CSF), VEGF e prostaglandina E2 (PGE2). Além de
estimular, também, a produção de moléculas pró-angiogênicas da matriz extracelular
como a urokinase, o colágeno IV e as mataloproteinases. Por outro lado, a perda de um
gene supressor de tumor pode contribuir para a diminuição na produção de inibidores da
angiogênese, causando um efeito estimulador na proliferação vascular (FOLKMAN,
1995; FOX; GASPARINI; HARRIS, 2001).
34
Através da literatura, verifica-se que a superexpressão do Bcl-2 regula a
sobrevivência das células endoteliais, a qual é mediada pelo VEGF. No trabalho
desenvolvido por Nur et al (2001) em modelo experimental de pesquisa com células de
carcinoma escamoso oral e sarcoma de Kaposi, em ratos imunodeficientes, objetivando
a produção de tumores humanos vascularizados, foi estudado o papel do gene Bcl-2
celular endotelial. Os resultados obtidos indicaram um aumento da expressão do gene
nas células endoteliais tumorais, o que elevaria a sobrevivência e densidade vascular,
bem como, o crescimento tumoral. Os autores concluíram que as células endoteliais
tumorais que expressam o gene Bcl-2 tem um maior potencial angiogênico, tanto in vivo
como in vitro.
O crescimento e a disseminação de um tumor dependem não só da proliferação
celular neoplásica, mas, também, das respostas dos tecidos benignos do hospedeiro. É
necessário para tal, que uma variedade de interações ocorram entre as células tumorais,
a rede vascular, o sistema imune e o tecido conjuntivo. A neovascularização é
estimulada por fatores liberados pelas células tumorais e/ou células imunes do
hospedeiro localizadas no estroma tumoral, como macrófagos e mastócitos. Os
macrófagos ativados podem secretar substâncias como o TGF-α e bFGF, as quais
ampliam a angiogênese tumoral. Os mastócitos são ricos em heparina, substância capaz
de mobilizar o bFGF da matiz extracelular, protegendo-o da degradação e
potencializando a vascularização. Finalmente, os linfócitos têm a capacidade de secretar
fatores angiogênicos, citocinas e fatores quimiotáticos para as células, dentre elas os
macrófagos e mastócitos (FOLKMAN, 1995; FOX; GASPARINI; HARRIS, 2001).
Atualmente, grandes esforços têm sido realizados para compreender os
mecanismos angiogênicos e sua aplicabilidade clínica, por exemplo, como de auxiliar
no diagnóstico e prognóstico de lesões vasculares e com a finalidade de buscar formas
terapêuticas, que possam acelerar angiogênese durante o reparo tecidual ou interferir
neste processo em diversas condições neoplásicas (FOLKMAN, 1995; FOX;
GASPARINI; HARRIS, 2001; POON; FAN; WONG, 2001; COHEN, 2002; KUMAR;
ABBAS; FAUSTO, 2005; NETTO et al, 2008).
35
2.2 Granuloma Piogênico - Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e
Histopatologia
O granuloma piogênico é uma lesão proliferativa fibrovascular, tipicamente
solitária, de natureza não-neoplásica que apresenta uma grande incidência na cavidade
oral, embora possa ocorrer em outras mucosas e pele. (SILVERSTEIN et al, 1996;
SILVEIRA et al, 2004; EPIVATIANOS et al, 2005; FREITAS et al, 2005; PARISI;
GLICK; GLICK, 2006). Foi inicialmente descrita na literatura por Poncet e Dor (1897)
como uma “botriomicose humana” transmitida por uma infecção micótica encontrada
em cavalos. Em seguida, Hartzell (1904) introduziu o termo granuloma piogênico,
sugerindo que a lesão fosse causada por microorganismos piogênicos capaz de
desencadear uma inflamação granulomatosa (IWATA et al, 1996; AL-KHATEEB;
ABABNEH, 2003; NEVILLE et al, 2004). Contudo, apesar desta denominação ser a
mais utilizada, sabe-se que a lesão não é um granuloma verdadeiro, isso, pelo fato de
não se evidenciar uma formação exuberante de material purulento (REGEZI;
SCIUBBA, 2000). Outras terminologias são, também, citadas na literatura para designar
esta lesão, como o termo hemangioma capilar lobular, introduzido em 1980 por
dermatologistas, por ser caracterizado, muitas vezes, por uma intensa proliferação
vascular organizada em lóbulos, e granuloma gravídico, para configurar as lesões que
acometem, freqüentemente, as mulheres em gestação (SILLS et al, 1996; HARRIS et al,
2000).
Existem diversos fatores que poderiam estar associados à patogênese do
granuloma piogênico. Para muitos autores, a lesão representa, na maioria dos casos,
uma resposta tecidual excessiva do tecido conjuntivo a uma irritação local ou a um
trauma (SHENOY; DINKAR, 2006). Conforme Muench, Layton e Wright (1992),
Graham (1996), Akyol, Yalçiner e Dogan (2001) e Silveira et al (2004) o mecanismo de
formação desta lesão, ainda, é incerto e complexo. Acredita-se, que o trauma, o acúmulo
de cálculo dental ou material estranho no sulco gengival, espículas ósseas, raízes
residuais, bordas salientes ou superfícies cortantes de restaurações, infecções, algumas
drogas, influências hormonais e fatores angiogênicos, poderiam determinar o seu
surgimento. Por sua vez, Neville et al (2004) postulam que a presença de bactérias é
acidental e não a base do processo, não tendo, assim, etiologia infecciosa.
Aproximadamente 80% dos pacientes com granuloma piogênico extragengival
relatam história de injúria local antes do desenvolvimento da lesão. A irritação e a
36
inflamação gengival que resultam da má higiene oral poderiam ser um fator principiante
em muitos casos (MILANO; FLAITZ; BENNETT, 2001; NEVILLE et al, 2004).
O papel dos hormônios na etiologia dessa lesão vem sendo, ainda, muito
discutido. As alterações hormonais observadas na puberdade, na gravidez e no uso de
contraceptivos orais podem modificar a resposta reparadora gengival a ação de agentes
irritantes. Nestas circunstâncias, podem ser evidenciadas lesões gengivais múltiplas ou
hiperplasia gengival generalizada (REGEZI; SCIUBBA, 2000). Falabella e Falabella
(1994) verificaram que o desequilíbrio nos níveis de progesterona induz alterações
periodontais significativas como a perda da ceratinização do epitélio gengival,
modificações bioquímicas na matriz extracelular e perturbações na microcirculação,
representadas pela destruição de mastócitos e consequentemente liberação de
substâncias vasoativas. Essas condições, em conjunto, diminuem a resistência local e
favorecem a ação dos agentes irritantes. Adicionalmente, durante a gestação os altos
níveis de estrogênio e progesterona favorecem a liberação pelos macrófagos de um
potente indutor angiogênico, o fator de crescimento celular endotelial vascular (VEGF),
contribuindo, dessa forma, para o estabelecimento da lesão (KANDA; WATANABE,
2005). Adicionalmente, é importante ressaltar que o granuloma gravídico começa a
desenvolver-se durante o 1º trimestre e sua incidência aumenta a partir do sétimo mês
de gravidez, período no qual se verifica alta concentração hormonal (MUENCH;
LAYTON; WRIGHT, 1992).
Através de experimentos realizados em ratas ovariectomizadas submetidas à
injeção de β-estradiol e progesterona, Yuan, Wing e Lin (2002), constataram que os
hormônios esteroidais femininos não apenas intensificam a quantidade de fatores
angiogênicos produzida por monócitos e macrófagos ativados como, também, protegem
os últimos da apoptose, prolongando o seu efeito angiogênico. Tais resultados sugerem
ser o granuloma piogênico um crescimento reacional tanto angiogênico como
hormônio-dependente.
Entretanto, Nichols et al (1992) reportaram em sua pesquisa que a progesterona
e o estrogênio não são fatores determinantes para o surgimento de granuloma piogênico
em gestantes e em mulheres que fazem uso de contraceptivos orais, visto que estas
lesões apresentavam ausência de receptores específicos para esses homônios. Whitaker
et al (1994) sugerem que esses fatores hormonais não são decisivos na patogênese, mas
sim contributórios ou secundários.
37
Lee et al (1994) e Bachmeyer et al (1996) concluíram em seus estudos em quatro
casos de granulomas piogênicos orais em pacientes com a doença do enxerto-versos-
hospedeiro, que algumas drogas, como a ciclosporina, podem estar envolvidas na
patogênese do granuloma piogênico, visto que esses medicamentos exercem um efeito
hiperplásico sobre o tecido gengival, devido à produção de uma grande quantidade de
matriz extracelular, predominantemente de colágeno, associada, geralmente, a uma
intensa vascularização e uma inflamação significante. O efeito da ciclosporina pode se
dar de forma direta, pela regulação do cálcio intracelular, ou de forma indireta, pelo seu
efeito modulatório sobre a resposta inflamatória através de fatores derivados dos
macrófagos, linfocinas, prostaglandinas e histaminas (NEVILLE et al, 2004).
Conforme Bragado et al (1999) e Jafarzadeh, Sanatkhani e Mohtasham (2006),
alguns fatores que incluem a síntese de óxido nítrico, VEGF e bFGF estariam
associados com o desenvolvimento do granuloma piogênico. Yuan, Jin e Lin (2000)
desenvolveram um estudo imuno-histoquímico e detectaram que a expressão de fatores
pró-angiogênicos (VEGF, bFGF) e inibidores angiogênicos (angiostatina e TPS-1) em
granulomas piogênicos, foram expressos em alta e baixa proporções respectivamente
quando relacionados à gengiva saudável e à periodontite. Esses autores corroboram que
distúrbios nos mecanismos angiogênicos desempenham um importante papel na
patogênese do granuloma piogênico.
No tocante aos aspectos clínicos, o granuloma piogênico manifesta-se como uma
massa exofítica plana ou lobulada, geralmente de implantação pedunculada, embora
algumas lesões sejam sésseis. Dependendo do tempo, do grau de vascularização e da
localização anatômica, a coloração pode variar do rosa ao vermelho-violáceo e a
consistência de firme a macia. Inicialmente, são altamente vascularizadas; contudo as
mais antigas tendem a ser mais colagenizadas e de coloração rósea. Caracteristicamente,
a superfície apresenta-se ulcerada podendo conter, de vez em quando, uma membrana
ou crosta branco-amarelada, fibrinopurulenta, devido à infecção secundária por
bactérias piogênicas (MUENCH; LAYTON; WRIGHT, 1992; AGUILO, 2002;
EPIVATIANOS et al, 2005; JAFARZADEH; SANATKHANI; MOHTASHAM, 2006).
Seu tamanho varia de alguns milímetros a vários centímetros, mas raramente
excede 2,5 cm. Na maioria dos casos, a massa apresenta-se com crescimento lento,
assintomática, mas algumas lesões podem ser latejantes e apresentarem discreto ardor.
São, facilmente, sangrantes ao trauma e, dificilmente a perda óssea é verificada
(NEVILLE et al, 2004; PARISI; GLICK; GLICK, 2006).
38
A incidência do granuloma piogênico é descrita entre a faixa de 26,8 a 32% de
todas as lesões reacionais. Apesar de desenvolver-se em qualquer idade, a lesão ocorre,
principalmente, em indivíduos da 1ª a 4ª década de vida com pico de ocorrência na 3ª
década. A raça branca e o sexo feminino são freqüentemente afetados. (SKINNER et al,
1986; SHENOY; DINKAR, 2006).
No que concerne à localização, esta lesão pode ser evidenciada na mucosa oral,
face e dedos. Os granulomas orais mostram uma predileção pela gengiva em 75% dos
casos e, menos frequentemente em lábio inferior, língua e mucosa jugal (REGEZI;
SCIUBBA, 2000; AKYOL; YALÇINER; DOGAN, 2001; SILVEIRA et al, 2004). As
lesões são mais comuns na gengiva superior do que na inferior, sendo a região anterior e
a face vestibular os sítios mais acometidos e, iniciando-se, geralmente, a partir da papila
interdental (PAPAGEORGE; CHRIS DOKU, 1992; NEVILLE et al, 2004;
JAFARZADEH; SANATKHANI; MOHTASHAM, 2006).
Dezotti et al (2000) em uma análise 43 casos de granulomas piogênicos
constataram que a prevalência desta lesão foi na gengiva (76,74%), seguido da língua
lábios e mucosa jugal. A maior incidência foi na 3ª década de vida e o sexo feminino foi
o mais afetado.
Corroborando os achados epidemiológicos citados anteriormente, Al-Khateeb e
Ababneh (2003), num estudo de 108 casos de granulomas piogênicos, verificaram que o
sexo feminino foi o mais acometido numa razão de 1:1,7; a média de idade foi de 30
anos e a gengiva foi a localização mais freqüente em 44,4% dos casos, sendo a maioria
envolvendo a região anterior de maxila. A principal complicação foi o sangramento
(59,3%), mais da metade das lesões eram pedunculada e 9,2% apresentavam ulcerações.
Adicionalmente, Silveira et al (2004) analisando 150 casos de granulomas
piogênicos, observaram que as lesões foram mais encontradas em pacientes do sexo
feminino (72%), da raça branca (56%) com pico de incidência entre a 2ª e 3ª década de
vida e situadas com maior freqüência na gengiva (74%).
Entretanto, Harris et al (2000) realizaram uma pesquisa em 325 casos de
granulomas piogênicos e observaram diferenças epidemiológicas marcantes entre as
lesões cutâneas e orais. Houve uma maior ocorrência de lesões cutâneas em 86% dos
casos, localizadas, predominantemente, nas extremidades superiores da cabeça e
pescoço, quando relacionadas com as lesões orais (12%), situadas em gengiva, lábios e
língua. Nas lesões cutâneas, o sexo masculino, 2ª década de vida, foi o mais atingido,
39
enquanto que as lesões orais predominaram entre o sexo feminino, numa proporção de
2:1 e na 4ª década de vida.
Todavia, os aspectos clínicos do granuloma piogênico são fortemente sugestivos,
mas não específicos, pois o diagnóstico definitivo deve ser realizado apenas através da
microscopia (MODY; RAUT, 1996).
O diagnóstico diferencial pode ser feito com a lesão periférica de células
gigantes, fibroma ossificante periférico, hemangioma capilar, hiperplasia fibrosa
inflamatória, fibroma traumático, sarcoma de Kaposi, angiossarcoma, melanoma e
linfoma de não-Hodkin (HARRIS et al, 2000; SILVEIRA et al, 2004; JAFARZADEH;
SANATKHANI; MOHTASHAM, 2006).
Quanto à histopatologia, o granuloma piogênico consiste de uma proliferação
altamente vascular, lembrando um tecido de granulação, onde os vasos são de calibres
variados, por vezes dilatados e obliterados por hemácias e, revestidos por células
endoteliais e pericitos mitoticamente ativos. Algumas vezes, esses vasos são
organizados em agregados lobulares separados por septos de tecido conjuntivo fibroso
fino, sendo diagnosticados como hemangioma capilar lobular por muitos autores
(SILVA-SOUZA, 2000; NEVILLE et al, 2004; PATIL; MAHIMA; LAHARI, 2006).
A superfície da lesão é revestida por epitélio pavimentoso estratificado atrófico
ou hiperplásico e exibindo, usualmente, uma área ulcerada associada a uma membrana
crostosa fibrinopurulenta. O epitélio na base da lesão é razoavelmente espesso. As
margens da úlcera apresentam áreas hiperplásicas, sendo o epitélio restante, adelgaçado
e de aparência atrófica. Um infiltrado inflamatório misto, cuja proporção varia com o
grau de ulceração superficial, constituído por polimorfonucleares neutrófilos,
plasmócitos, linfócitos e macrófagos espumosos é evidente. Os polimorfonucleares
neutrófilos são mais prevalentes próximos à superfície ulcerada; já o infiltrado
inflamatório crônico é mais encontrado na profundidade do espécime (EPIVATIANOS
et al, 2005; FREITAS et al, 2005; SHENOY; DINKAR, 2006).
O tecido conjuntivo de permeio é fibroso frouxo, delicado, edematoso, rico em
numerosos vasos sangüíneos pequenos e dilatados, revestidos por uma camada de
células endoteliais, e com uma intensa proliferação de fibroblastos volumosos e de
células endoteliais, embora seja possível evidenciarem-se, com freqüência, fascículos de
fibras colágenas mais consistentes atravessando a massa tecidual. Entretanto as lesões
mais antigas podem ter áreas com aparência mais fibrosa. À medida que a lesão
progride, vão reduzindo os componentes vasculares e inflamatórios e aumentando a
40
deposição de fibras colágenas (NEVILLE et al, 2004; JAFARZADEH;
SANATKHANI; MOHTASHAM, 2006).
Os aspectos microscópicos dessa lesão, embora característicos, são um tanto
variáveis. Assim sendo, a atividade fibroblástica, a formação de colágeno e o infiltrado
inflamatório variam de um caso para outro, aparecendo certa relação com o trauma e
irritação, idade da lesão e mecanismo reparativos (PATIL; MAHIMA; LAHARI, 2006).
Harris et al. (2000) enaltecem que embora os achados histopatológicos
determinem o diagnóstico definitivo destas lesões, algumas situações como ausência de
ulceração superficial, com conseqüente diminuição do infiltrado inflamatório misto, e
proliferação vascular atípica podem simular outra lesão vascular dificultando o
diagnóstico do granuloma piogênico.
2.3 Hemangioma - Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia
O termo hemangioma foi empregado durante anos, de forma ampla, para
designar anomalias vasculares totalmente distintas quanto a sua gênese, características
clínicas e histopatológicas, evolução e prognóstico (GONTIJO et al, 2005).
Em 1982, Mulliken e Glowacki propuseram uma classificação das lesões
vasculares baseada nas manifestações clínicas, quadro histopatológico e história natural,
distinguindo-as em hemangiomas e malformações vasculares (ODILE ENJOLRAS,
1999; GONTIJO et al, 2005).
O hemangioma da infância é o tumor vascular mais comum nesta faixa etária.
Entretanto, outros tumores vasculares, mais raros, têm sido descritos. Em função disto,
em 1996, a classificação de Mulliken e Glowacki foi revista e uma nova classificação,
adotada como oficial pela Sociedade Internacional para o Estudo de Anomalias
Vasculares (ISSVA), divide as lesões vasculares em dois grupos: tumores e
malformações vasculares. Os tumores vasculares são neoplasias da vasculatura e
incluem o hemangioma da infância, hemangioma congênito involutivo e não involutivo,
angioma, hemangioendotelioma kaposiforme e o granuloma piogênico. As
malformações vasculares são erros da morfogênese (turnover celular normal) e são
classificadas de acordo com o vaso predominante: capilar, venosa, arterial, linfática e
combinada. Assim como todas as classificações, essa não é absoluta. Porém, sua
simplicidade e relevância clínica possibilitaram um avanço importante na abordagem
41
das anomalias vasculares (ODILE ENJOLRAS, 1999; BRUCKNER; FRIEDEN, 2003;
GONTIJO et al, 2005).
Atualmente os hemangiomas são considerados lesões benignas da infância que
se caracterizam por uma fase de crescimento rápido com proliferação de células
endoteliais, seguidos pela involução gradual; já as malformações vasculares são
anomalias estruturais dos vasos sangüíneos que estão presentes ao nascimento e
evoluem, proporcionalmente, com o índice de crescimento da criança sem tendência à
regressões espontâneas. Estas últimas podem exibir oscilações no tamanho, em resposta
a infecções, trauma ou alterações hormonais, mas não são proliferativas e, são
classificadas de acordo com os aspectos hemodinâmicos e com o tipo de vaso envolvido
(COHEN, 2002; NEVILLE et al, 2004; VIKKULA, 2006; CORRÊA et al, 2007).
A patogênese do hemangioma ainda é pouco compreendida. Estímulos
endócrinos e inflamatórios poderiam ativar esses distúrbios vasculares (RIBAS;
LARANJEIRA; SOUSA, 2004). Segundo Verkarre et al (1999) os tumores são
compostos por microvasos delimitados por células endoteliais mitoticamente ativas e
pericitos, caracterizados pela intensa proliferação do endotélio capilar com acúmulo de
mastócitos e fibroblastos. Em 1974, Folkman formulou o conceito de que as lesões são
angiogênese-dependentes e que moléculas angiogênicas atuariam sobre as células
endoteliais e pericitos induzindo a formação de uma rede capilar (TAKAHASHI et al,
1994).
Recentemente, avanços na angiogênese têm identificados algumas moléculas
chaves que controlam o desenvolvimento vascular, incluindo o VEGF, que é
responsável pela indução da produção de células endoteliais e, o bFGF o qual atua em
sinergia com o VEGF, contribuindo, assim, com ativação de angioblastos. Observa-se
que os níveis de VEGF e bFGF são altos no estágio proliferativo do tumor e baixos
durante a fase evoluída ou de resolução. Ressalta, ainda, que a resposta imunológica
pode, também, estar associada com a evolução e involução dos hemangiomas
(HAMLAT et al, 2005; SUN; ZHAO; ZHANG, 2007).
Sundine e Garrett (2007) descrevem que os principais fatores angiogênicos que
estimulam a formação dos hemangiomas seriam o VEGF, bFGF, TNF-α e IL-8
(interleucina-8), já os fatores antiangiogênicos incluem os inibidores de
metaloproteinases (TIMP-1), TGF-β e interferon alfa (INF-α).
Folkman (1995) destaca que existem possíveis mecanismos inibidores da
angiogênese em hemangiomas como a ação reguladora dos pericitos, o seqüestro de
42
potentes mitógenos da matriz extracelular, as integrinas e os mecanismos de alterações
na forma da célula endotelial, determinando a redução da sua sensibilidade aos fatores
de crescimento endotelial.
Análises imuno-histoquímicas, realizadas por Takahashi et al (1994), em
hemangiomas de pele encontraram a presença marcante do VEGF e colágeno tipo IV na
fase proliferativa da lesão. Houve uma significante expressão do fator de von
Willebrand (FvW), CD31 e bFGF tanto na fase proliferativa como no estágio de
involução. A elevada expressão dos inibidores TIMP-1, actina de músculo liso (SMC-
actin) foi exclusivamente observada no estágio de involução. Estes resultados sugerem
segundo os autores, que os marcadores imuno-histoquímicos poderiam determinar o
estágio de desenvolvimento dos hemangiomas.
Adicionalmente, Freitas et al (2005) avaliaram a expressão imuno-histoquímica
do fator de crescimento celular endotelial vascular C1 (VEGF-C1), bem como
mensuraram a atividade angiogênica, através da marcação pelo FvW e CD31, em
granulomas piogênicos e hemangiomas orais. Averiguaram, ainda, se a imuno-
expressão destes marcadores poderia ser útil no diagnóstico diferencial entre as mesmas.
Os resultados deste experimento reforçaram a participação dos fatores angiogênicos na
etiopatogênese dos hemangiomas e granulomas piogênicos orais, entretanto, mostraram
que a quantificação da angiogênese não se apresentou como indicador de diagnóstico
capaz de diferenciar a atividade angiogênica entre estas lesões. Além disso, o anticorpo
FvW mostrou-se mais efetivo que o CD31 na identificação das células endoteliais dos
espécimes avaliados e que a forte expressão e o padrão de marcação uniforme do
VEGF-C1 nos hemangiomas denotaram o caráter proliferativo das lesões avaliadas
Pesquisas evidenciam que a apoptose poderia ser a responsável pela involução
dos hemangiomas. Mancini e Smoller (1996) encontraram que o proto-oncogene Bcl-2,
o qual inibe a morte programada das células, estava menos expresso nos estágios
evoluídos dos hemangiomas. Iwata et al (1996), em um estudo comparativo entre
hemangiomas capilares e granulomas piogênicos, encontraram uma alta atividade
apoptótica nos primeiros, sugerindo, dessa forma, o processo apoptótico como causa de
involução espontânea dos hemangiomas.
Quanto aos aspectos clínicos, o hemangioma é o tumor mais comum na infância,
ocorrendo em 10 a 12% das crianças com até um ano de idade. Acomete,
preferencialmente, indivíduos do sexo feminino, numa proporção de 3:1. Cerca de 80%
43
dos pacientes apresentam lesões únicas, porém 20% dos afetados possuem tumores
múltiplos (GONTIJO et al, 2005).
A pele é o órgão mais atingido e as regiões de cabeça e pescoço (60%) e tronco
(25%) são as mais afetadas. As lesões orais são encontradas mais comumente nos
lábios, língua e mucosa jugal. Em raras ocasiões, podem atingir o tecido ósseo, com
predileção pelo crânio e vértebras. O tamanho é variável dependendo de diversos fatores
que incluem, entre outros, idade do paciente e local da lesão (REGEZI; SCIUBBA,
2000; TOLEDO et al, 2004).
Souza et al (2004) observaram que dos 18 casos de hemangiomas orais, a maior
prevalência foi do sexo masculino com 10 casos (55,55%), a faixa etária mais afetada
foi entre 3-12 anos (50,03%). A maioria dos casos era da raça branca (50,03%) e a
língua foi a região mais atingida em 9 casos (50,03%), seguida da mucosa labial
(27,78%).
Corrêa et al (2007) analisaram 154 casos de lesões vasculares categorizadas
como hemangiomas, malformações vasculares e varizes de boca. Destas, as varizes de
boca foram as lesões mais freqüente (65,6%). Os pacientes do sexo feminino foram os
mais acometidos pelos hemangiomas e varizes de boca. As malformações vasculares e
varizes de boca foram mais prevalentes na 7ª e 6ª décadas de vida, respectivamente. A
localização prevalente dos hemangiomas e das varizes de boca foi a superfície ventral
da língua, e das malformações vasculares, os lábios.
Os hemangiomas completamente desenvolvidos dificilmente estão presentes ao
nascimento, embora uma mácula pálida com telangectasias filiformes possa ser
evidenciada na pele. Durante as primeiras semanas de vida, o tumor pode apresentar
desenvolvimento rápido em 90% dos casos (NEVILLE et al, 2004).
A maioria das lesões ocorre esporadicamente, entretanto história familiar de
hemangiomas tem sido observada em 10% dos casos (SUNDINE; GARRETT, 2007).
Os hemangiomas podem ser divididos em superficiais, profundos ou
combinados de acordo com sua aparência clínica. Os superficiais, em 50-60% dos
casos, são bem delimitados, firmes e elásticos à palpação, de coloração vermelho-vivo,
brilhosos, nodulares, bosselados ou em forma de placa, com pele normal ao redor e, por
vezes, de aspecto semelhante a um morango. Com a regressão da lesão, a cor
avermelhada vai clareando, do centro para a periferia, adquirindo um tom azul-
acinzentado. Os hemangiomas profundos, em 15% dos casos, são lesões ligeiramente
elevadas, da cor da pele ou de tom azulado, algumas vezes com telangectasias na
44
superfície, acometendo a derme profunda e subcutânea. As lesões mistas ou combinadas
respondem pelos 25 a 35% dos casos restantes (CHILLER; PASSARO; FRIEDEN,
2002; NEVILLE et al 2004; GONTIJO et al, 2005).
A fase de crescimento rápido, proliferativo, normalmente dura dos seis aos dez
meses de vida. Geralmente o tamanho máximo é atingido ao final do primeiro ano de
vida, embora alguns poucos casos se apresentem como uma forma frusta, de
crescimento muito discreto, e permaneçam quase indistinguíveis da lesão precursora.
Posteriormente, o hemangioma entra em uma fase quiescente, que persiste por alguns
meses, e então involui lentamente. Estima-se que 50% das lesões regridam total ou
parcialmente até os cinco anos de idade e 90% até os dez anos de idade (VERKARRE et
al, 1999; GARZON; FRIEDEN, 2000).
Após a completa resolução do tumor, a normalização da pele é restaurada em
50% dos pacientes; entretanto 40% dos indivíduos apresentam lesões residuais como
telangectasias, atrofia, hipopigmentação, rugosidade e cicatriz (BRUCKNER;
FRIEDEN, 2003). Todavia, essa resolução não é influenciada pelo tamanho da lesão,
ulceração, profundidade, sexo ou idade de apresentação, mas parece estar relacionada
com o início precoce de involução (GONTIJO et al, 2005).
Em cerca de 10 a 20% dos hemangiomas ocorrem complicações. Deve-se
ressaltar que a ulceração é a mais freqüente, ocorrendo em 15 a 13% dos casos. É mais
comum na fase de proliferação rápida e normalmente ocasiona dor e desconforto,
principalmente quando acomete lábios, região perianal, genital ou flexuras. Algumas
vezes, os tumores nas regiões de cabeça e pescoço, dependendo do volume, podem,
ainda, levar à obstrução das vias aéreas, complicações visuais e causarem
comprometimento na respiração, deglutição, fonação e audição (NEVILLE et al 2004;
GONTIJO et al, 2005).
Estima-se que 80% dos hemangiomas periorbitais, principalmente os localizados
na região da pálpebra superior, apresentam complicações visuais. A alteração mais
comum é o astigmatismo, mas outros distúrbios como ambliopia, ptose, erros de
refração, estrabismo e ceratites podem ocorrer. Em relação ao comprometimento da
respiração, as crianças com maior risco de acometimento subglótico são as que
apresentam quatro ou mais lesões localizadas nas regiões pré-auriculares, lábio inferior,
mento e pescoço. Distúrbios da audição e otites de repetição podem instalar-se quando
há obstrução do conduto auditivo externo, o que usualmente ocorre com os
hemangiomas localizados em glândula parótida. A desfiguração pode ser conseqüência
45
dos hemangiomas grandes, principalmente os que acometem a face e pescoço, tendo os
locais mais críticos o nariz, boca e pavilhão auricular (SUNDINE; GARRETT, 2007).
Os hemangiomas intra-ósseos representam menos de 1%, sendo a maior parte
dos casos ocorrendo na região de cabeça e pescoço. A mandíbula apresenta-se mais
afetada do que a maxila, numa proporção de 2:1, atingindo, principalmente mulheres na
segunda década de vida. Costumam apresentar imagem radiográfica radiolúcida única
ou multilocular. As loculações podem ser pequenas com aspecto de “favo de mel” ou
grandes com aparência de “bolhas de sabão”. Pode-se evidenciar, também, em lesões
extensas, a expansão da cortical óssea, produzindo o padrão radiográfico de “raios de
sol” Clinicamente, apresentam-se com diferentes formas. Geralmente ocorre um
aumento de volume indolor e de consistência endurecida, podendo provocar assimetria
facial. Em outros casos, pode ocorrer dor ou sangramento gengival em torno dos dentes
localizados na região da lesão (MODY; SATHAWANER; RAI, 1995; NEVILLE et al,
2004; RIBAS; LARANJEIRA; SOUSA, 2004).
A diascopia é um importante auxiliar no estabelecimento do diagnóstico
diferencial. Durante a compressão pela lâmina de vidro, o hemangioma reduz de
tamanho e adquire coloração pálida devido o esvaziamento vascular. Geralmente no
diagnóstico diferencial inclui o granuloma piogênico, melanoma, nevo, malformações
vasculares e algumas síndromes associadas à lesão como a síndrome de Sturge-Weber,
síndrome de Klippel-Trenaunay, síndrome de Rendu-Osler-Weber. Com relação aos
hemangiomas centrais, os achados radiográficos podem simular lesões císticas e
tumores de origem odontogênica, além de osteossarcoma (MODY; SATHAWANE;
RAI, 1995; RIBAS; LARANJEIRA; SOUSA, 2004; FREITAS et al, 2005). Regezi e
Sciubba (2000) enfatizam a importância da associação entre o exame clínico, história
médica e exames complementares para o diagnóstico definitivo correto da lesão.
Histologicamente, os tumores têm sua origem a partir de células endoteliais
mitoticamente ativa e pericitos, que formam vasos de pequenos capilares constituídos
por uma única camada de células, ou ainda, por capilares que formam grandes espaços
cavernosos, podendo haver proliferação de vasos linfáticos nesta estrutura. Além disto,
são lesões que não possuem cápsula em sua massa. Dessa maneira, os hemangiomas
podem ser classificados principalmente em hemangioma celular, capilar e/ou cavernoso
dependendo, assim, do número de células endoteliais e do tamanho dos espaços
vasculares proliferantes (RODRIGUES et al, 1998).
46
Na fase inicial de formação, a lesão caracteriza-se por numerosas células
endoteliais dilatadas, roliças e lúmen vascular freqüentemente indistinto. Nesse estágio,
tais lesões são usualmente conhecidas como hemangioma juvenil ou celular. Nas lesões
maduras, as células endoteliais tornam-se achatadas e pequenas, e os espaços vasculares
de tamanho capilar apresentam-se mais evidentes. Conforme os hemangiomas sofrem
involução, os espaços vasculares ficam mais dilatados, cavernosos e amplamente
espaçados. Em algumas situações, as lesões podem apresentar uma mistura de vasos
sangüíneos capilares e cavernosos (REGEZI; SCIUBBA, 2000; NEVILLE et al, 2004;
FREITAS et al, 2005; CORRÊA, 2007). Segundo Blei et al (1998) nos estágios de
involução observam-se alterações microscópicas como fibrose do tecido proliferante,
com conseqüente diminuição do componente celular endotelial e deposição de tecido
fibroadiposo e nas lesões ulceradas evidencia-se uma exuberante reação de granulação
no estroma proliferante, dificultando, assim, o diagnóstico histopatológico destas lesões.
2.4 Mensuração da Angiogênese
Ultimamente, vários marcadores biológicos, empregados para determinação de
índice angiogênico, com afinidade por epítopos específicos de células endoteliais como,
por exemplo, o fator von Willebrand ou fator VIII, CD31, CD44, CD105 e CD34, têm
sido identificados como passíveis de utilização para a informação diagnóstica e
prognóstica em muitos tipos de carcinomas e em lesões benignas, por exemplo, de
mama, útero, ovário, pele, estômago, rim, pulmão, fígado e de cabeça e pescoço, como
o granuloma piogênico e o hemangioma, os quais exibem apresentação clínica e
histopalógica semelhantes motivo pelo qual, algumas vezes, dificultam o diagnóstico.
(TAKAHASHI et al, 1994; COHEN, 2002; FREITAS et al, 2005; SANDLUND et al,
2006; SOARES et al, 2007; NETTO et al, 2008).
Apesar de vários trabalhos verificados na literatura acerca da importância da
relação da angiogênese e a evolução e prognóstico de lesões neoplásicas existem, ainda,
muitas controvérsias a respeito do tema, principalmente, no que diz respeito à
sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade das técnicas utilizadas em suas
determinações e, também, na possibilidade de seu uso como marcador de prognóstico
(SOARES et al, 2007).
47
A mensuração da angiogênese pode ser realizada nos mais variados tumores e
lesões não-neoplásicas através de uma análise qualitativa e/ou quantitativa dos vasos
imunomarcardos por anticorpos específicos. A avaliação qualitativa é realizada pela
verificação da intensidade de marcação (WAKULICH et al, 2002; FREITAS et al,
2005); enquanto a quantitativa pode ser analisada pela densidade microvascular (MVD)
que expressa a média de vasos por espécime; pela técnica de contagem microvascular
(MVC) ou pelo volume microvascular (MVV). (MAEDA et al, 1995; VERMEULEN et
al, 2002).
Comforme Weidner, Sample e Folkman (1991), a técnica de quantificação pela
MVD consiste na seleção de três diferentes áreas de maior área de densidade
microvascular (“hot spots”) num aumento de 100x. Em seguida procede-se a contagem
manual em microscopia de luz, num aumento de 200x, em cada uma destas áreas;
expressando-se, portanto, a MVD em número de vasos por mm2. Nesse sistema de
análise, as células ou grupos de células com ou sem lumens definidos que são
claramente separados por vasos, células tumorais e por outros constituintes do tecido
conjuntivo são contabilizados como vasos.
Muitos estudos indicam que a MVD intratumoral pode predizer o potencial
metastático e, conseqüentemente, o prognóstico do paciente (FOX; GASPARINI;
HARRIS, 2001). A densidade vascular em tumores tem sido avaliada pela marcação
com anticorpos contra antígenos tais como Fator de von Willebrand (FvW), CD34 e
CD31 (WEIDNER; SAMPLE; FOLKMAN , 1991).
A MVC, para obtenção do índice angiogênico, configura-se como o método
mais simples de ser empregado e apresenta um excelente valor prognóstico em tumores
de cabeça e pescoço. Assim, através de um aumento de 40x, observam-se cinco áreas de
maior densidade tecidual, por conseguinte, com aumento de 200x, contam-se
manualmente os vasos, sendo o resultado expresso pelo número médio de vasos em
cada secção histológica (MAEDA et al, 1995; FREITAS et al, 2005). No ensaio
desenvolvido em 108 amostras de carcinoma gástrico, Maeda et al (1995) observaram
que os pacientes que apresentavam um pior prognóstico tinham alta MVC e elevado
índice de PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular). Com isso, os autores
sugerem que ambos os índices são bons indicadores de gravidade para os portadores
desta neoplasia.
Em relação ao MVV, representa uma análise de determinação de volume de
mensuração vascular em que são selecionados 15 campos e contado 100 pontos
48
coincidentes em cada, totalizando, assim, 1500 pontos, sendo o resultado expresso em
porcentagem de volume (PAZOUKI et al, 1997). Os referidos pesquisadores
asseveraram que a determinação da vascularização através do MVV é um método
sensível e que indica a transição de displasia para carcinoma epidermóide, podendo ser
empregado com indicador de prognóstico em cânceres orais iniciais e adjuvante nas
terapias anti-oncogênicas.
2.5 Biomarcadores Angiogênicos (CD105 e CD34)
O CD105 (endoglina) caracteriza-se como uma glicoproteína homodimérica
transmembrana de 180-kDa, codificada pelo gene CD105 localizado no cromossomo
9q34 e que apresenta grande especificidade, principalmente, para células endoteliais de
capilares, veias e artérias, sendo utilizado na avaliação da vascularização tanto de
tecidos normais como neoplásicos. Evidencia-se, também, a sua expressão em
macrófagos ativados, proeritroblastos imaturos, sinciciotrofoblastos e fibroblastos
(DUFF et al, 2003; ABBAS; LICHTMAN, 2005; MINHAJAT et al, 2006a; LIORCA et
al, 2007; NETTO et al, 2008).
Conforme Grudzinski et al (2006), a endoglina é preferencialmente expressa em
vasos em proliferação durante a angiogênese, enfatizando que há estudos demonstrando
que a expressão aumentada de CD105, em uma área de neoangiogênese de um tumor de
mama, está relacionada com pior prognóstico. Minhajat et al (2006a), Nikiteas et al
(2007) e Netto et al (2008) corroboram, também, que essa glicoproteína é um indicador
de neovascularização em diversos tumores sólidos para avaliação do grau de
malignidade.
A anti-endoglina monoclonal de rato, SN6h, foi originalmente descrita como
reagente com a GP160, uma glicoproteína de superfície celular associada à leucemia,
que foi posteriormente identificada como endoglina (DUFF et al, 2003). Ela é
importante para um correto desenvolvimento do vaso sangüíneo, segundo Li et al
(1999), e mutações no seu gene codante causa telangiectasia hemorrágica hereditária do
tipo I (MCALLISTER et al, 1994).
A atuação do CD105 está associada à ligação com receptores existentes nas
moléculas do fator de crescimento transformador (TGF) β1 e β3 e age também na via de
sinalização do TGF-β pela interação com seus receptores de superfície celular TβR-I
e/ou TβR-II, interferindo, dessa forma, com sua ação angiogênica. O TGF-β é um
49
polipeptídeo que tem efeitos múltiplos e, com freqüência, opostos, dependendo do
tecido e tipo de lesão. É um fator que age inibindo muitos tipos celulares epiteliais e
leucócitos, estimula a quimiotaxia fibroblástica e apresenta um forte efeito
antiinflamatório, sendo produzido por vários tipos celulares, como plaquetas, células
endoteliais, linfócitos e macrófagos. O TGF-β pertencem a família de polipeptídeos
homólogos que consistem três isoformas, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, e fatores com
funções de ampla extensão, como proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), ativinas,
inibinas e substâncias inibidora mülleriana (MIS). Na angiogênese o TGF-β atua como
um regulador negativo em tumores, interferindo na proliferação e a migração de células
endoteliais, interrompendo, portanto, a formação de novos vasos sangüíneos; enquanto a
endoglina comporta-se de forma contraria (FONSATTI et al, 2001; DUFF et al, 2003;
NAGATSUKA et al, 2005; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Em consonância com assertiva anterior, Fonsatti et al (2001) e Borut et al
(2007) descrevem que o TGF-β regula várias funções celulares incluindo proliferação,
diferenciação, síntese de matriz extra-celular e hematopoiese, bem como está envolvido
no processo da angiogênese, vasculogênese e reparo tecidual, estimulando a
proliferação de fibroblastos e células musculares lisas.
Segundo a literatura o CD105 apresenta forte expressão em vasos sangüíneos de
tumores e fraca expressão em tecidos normais. Estudos realizados em diferentes
laboratórios usando vários anticorpos anti-CD105 têm revelado uma elevada expressão
dessa proteína em tumores incluindo os cânceres de cólon, pulmão, mama e de cabeça e
pescoço, indicando, dessa forma, ser um potente marcador na neovascularização de
tumores sólidos. A expressão elevada geralmente é induzida por hipóxia e está,
freqüentemente, relacionada com o aumento da proliferação endotelial e diminuição da
apoptose, onde são resultados da ação do fator 1 indutor-hipóxia (HIF-1) que ativa a
produção de VEGF, PDGF-β, óxido nítrico e endotelina, os quais atuam promovendo os
mecanismos angiogênicos (KUMAR et al, 1999; FONSATTI et al, 2001; KYZAS;
AGNANTIS; STEFANOU, 2006).
Reiterando a importância do CD105, Minhajat et al (2006b) realizaram um
estudo imuno-histoquímico comparando a expressão do CD105 com outros marcadores
endoteliais, como o VEGF, CD44, CD31 e TGF-β em neoplasias malignas de cérebro,
pulmão, mama, estômago e cólon, constataram que o CD105 apresentava alta
especificidade nesses tumores.
50
Em um estudo com 58 mulheres portadoras de carcinoma de ovário, Taskiran et
al (2006) investigaram o valor prognóstico do CD105 e compararam-no com o CD31.
Observaram que a endoglina foi um preditor independente de uma pobre sobrevida.
Ainda nesse experimento, os autores sugeriram a indicação dessa glicoproteína em
terapias anti-angiogênicas para carcinomas de ovário.
Avaliando a expressão do VEGF e do CD105 em 100 casos de carcinomas
gástricos, Nikiteas et al (2007), notaram uma alta expressão de ambos marcadores em
relação a metástase linfonodal. Sendo assim, concluiram que tanto o CD105 como o
VEGF são relevantes na metástase linfonodal, além de atuar como dois importantes
indicadores de prognóstico.
Por sua vez, Sandlund et al (2006) avaliaram a expressão do potencial
prognóstico do CD105, em 210 casos de carcinomas de célula renal humana, e
constataram que 76% dos espécimes expressaram a endoglina e que a imunomarcação
havia uma correlação inversa com o tamanho do tumor, envolvimento de linfonodo
regional e metástase distante (TNM), contudo não evidenciaram correlação entre o
CD105 com o sexo, idade, tamanho do tumor ou tipo celular. Assim, pacientes que
apresentaram uma alta expressão do CD105 tiveram um prognóstico mais favorável do
que aqueles com tumores de baixa expressão.
Em decorrência do mecanismo de ação do CD105 vem sugerindo a sua
aplicabilidade clínica como um dos critérios de diagnóstico e para avaliar a progressão e
identificar o risco de recorrência e metástase que determinada neoplasia apresenta e,
com isso, predizer a resposta do tratamento e mensurar a taxa de sobrevida de muitos
pacientes. Pesquisas mostram que indivíduos com doenças metastáticas apresentam
altos níveis de concentração dessa proteína no soro quando comparados a indivíduos
saudáveis (DUFF et al, 2003).
A mensuração do índice angiogênico pela MVD através da imunomarcação pelo
anticorpo anti-CD105 tem sido verificado em uma variedade de tumores malignos com
a finalidade de compreender os mecanismos de progressão dessas lesões (TANIGAWA
et al, 1997).
O carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço também tem sido alvo de
estudo para avaliação do fator prognóstico através do CD105. Kyzas, Agnantis e
Stefanou (2006) evidenciaram que o anti-CD105 foi mais expresso em vasos sangüíneos
intratumorais do que em vasos linfáticos. A alta densidade microvascular (MVD) foi
associada com o fenótipo mais agressivo do tumor, incluindo estágio clínico avançado e
51
a presença de mestátases nos linfonodos no momento do diagnóstico. Houve diferença
estatisticamente significante quando se avaliou o valor prognóstico associado à MVD
entre pacientes com tumor na cavidade oral e na laringe. O CD105 se apresentou,
portanto, como um alvo promissor para o prognóstico tumoral, sendo o biomarcador
mais sensível e específico para avaliação da MVD, quando comparado com os
marcadores pan-endoteliais.
Em um estudo realizado por Martone et al (2005), a MVD foi avaliada em 127
pacientes com carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço por meio da análise
imuno-histoquímica utilizando os anticorpos anti-CD34 e anti-CD105. A MVD foi
significativamente mais alta nos tumores com estágio clínico T3 e T4, entretanto a MVD
foi bem maior quando se usou o anti-CD105 comparado com o anti-CD34. Observou-
se, ainda, que a elevada densidade vascular pela imunomarcação com anti-CD105
estava relacionada com o pior prognóstico, enquanto a positividade para anti-CD34 não
foi associada com a taxa de sobrevida. Análise multivariada confirmou que a densidade
microvascular positiva para o CD105 era um fator de prognóstico independente em
carcinoma de células escamosas.
Chien et al (2006) verificaram em 176 casos de câncer de cabeça e pescoço que
a alta imunomarcação do CD105 e do VEGF estavam correlacionados com nódulos
linfáticos metastáticos, concluindo, assim, que esses marcadores poderiam ser úteis
como preditores na taxa de sobrevida e coadjuvantes no auxílio da escolha da
modalidade terapêutica mais adequada.
Corroborando com os autores supracitados, Soares et al (2007), analisaram a
vascularização tumoral sangüínea em uma série de carcinomas ex-adenoma
pleomórficos (CXAP), que representavam diferentes fases da seqüência adenoma-
carcinoma. Em 8 (CXAP) precoces (intracapsulares ou minimamente invasores), 8
avançados (fracamente invasores) e 10 adenomas pleomórficos (AP) sem transformação
maligna foi avaliada a vascularização, através da MVD e área vascular total (AVT),
pelos anticorpos CD34 e CD105. A MVD pelo CD105 mostrou correlação positiva forte
com a progressão tumoral, porém a MVD pelo CD34 e AVT não apresentaram
nenhuma correlação. Enquanto que nos APs foram detectados raros vasos CD105
positivos, nos CXPA precoces e avançados foi encontrado número aumentado destes,
sendo que o incremento foi mais significativo nos carcinomas em fases avançadas.
De forma consensual, Netto et al (2008) buscando perspectivas para
determinação prognostica e para a terapêutica anti-angiogênica tumoral, utilizaram o
52
marcador de vasos neoformados (CD105) e o CD34 em oligodendrogliomas e
verificaram que ambos marcadores tiveram uma MVD mais significativa nos estágios
tumorais com alta malignidade, contudo somente foi encontrada uma significância
estatística para a MVD pelo CD105 entre os oligodendrogliomas no grau II e III,
indicando um aumento na neoformação vascular nos estágios mais avançados, devendo
ser avaliado, dessa forma, como possível indicador de prognóstico.
Chuang et al (2006), enaltecendo a importância da intensa expressão imuno-
histoquímica dos biomarcadores VEGF e CD105 em espécimes teciduais de 94
pacientes com câncer de língua em estágio T1 e T2 através da análise da MVD,
destacaram que ambos VEGF e CD105 estavam correlacionados com alguns aspectos
clínicos patológicos da lesão (estágio tumoral, invasão perineural, linfonodos positivos,
tamanho da lesão e presença de necrose), contudo somente o CD105 revelou como fator
associado com a taxa de sobrevida dos pacientes.
Adicionalmente, resultados semelhantes foram evidenciados por Schimming et
al (2004), os quais em um estudo quantitativo imuno-histoquímico, pela técnica MVD,
em 51 espécimes teciduais de carcinoma epidermóide oral, o CD105 revelou uma
expressiva marcação nos estágios T2, T3, T4 quando comparado com o estágio T1, e
exibiu, também, uma forte marcação na lesão tumoral em relação à mucosa saudável.
Entretanto, o VEGF não apresentou correlação significativa com a progressão e
prognóstico em câncer oral.
Contudo, em um estudo conduzido por Grudzinski et al (2006) foi verificada a
expressão do CD105 em carcinomas de mama. Das 72 pacientes com tumores primários
de mama, 34 foram considerados CD105 positivos. Dos 15 casos que tiveram
recorrência local, 10 eram CD105 positivos, e 5 eram CD105 negativos. Entretanto, a
imunomarcação do CD105 não apresentou significância estatística como preditor para
recidiva local. Todavia, esses resultados não são concordantes com os relatos de Kumar
et (1999) e Dales et al (2004) os quais demonstraram que a expressão aumentada de
CD105 em câncer de mama estava relacionada com um risco maior de metástases em
pacientes com linfonodos negativos.
Para Duff et al (2003) a discrepância dos resultados entre alguns estudos
destinados para análise angiogênica pode estar associada a vários fatores que incluem o
método de quantificação empregado, o anticorpo selecionado, o tipo de fixador e a
forma do pré-tratamento das secções teciduais.
53
Em relação ao CD34, caracteriza-se como uma glicoproteína transmembrana de
105-120-kDa que possui alta especificidade, principalmente, para células endoteliais de
vasos sangüíneos e para precursores das células hematopoiéticas. (YOSHIDA et al,
1999; ABBAS; LICHTMAN, 2005).
O CD34 atua na adesão célula a célula ao se ligar com domínios existentes nas
selectinas chamados de CD62L. A adesão e a transmigração leucocitária são reguladas
principalmente pela ligação de moléculas de adesão pertencentes aos leucócitos e na
superfície endotelial, e pelos mediadores químicos (quimiotaxinas e determinadas
citocinas) que afetam esses processos modulando a expressão na superfície ou a avidez
dessas moléculas de adesão. Assim, os receptores de adesão envolvidos pertencem a
quatro famílias moleculares, onde podemos citar as selectinas, as quais possuem um
domínio N-terminal extracelular, compreendendo a E-selectina (CD62E) ou molécula
endotelial de adesão do leucócito do tipo 1 (ELAM-1), confinada ao endotélio; a P-
selectina (CD62P), presente no endotélio e plaquetas; e finalmente a L-selectina
(CD62L) ou molécula de adesão de leucócitos do tipo 1 (LAM-1), que se expressa na
maioria dos tipos de leucócitos (ABBAS; LICHTMAN, 2005; KUMAR; ABBAS;
FAUSTO, 2005).
A L-selectina serve de receptor de endereçamento para os linfócitos entrarem
nos linfonodos ligando-se às vênulas especializadas de endotélio alto (HEVs). Ela liga,
ainda, os neutrófilos às células endoteliais ativadas pelas citocinas nos locais de
inflamação. Pelo menos três ligantes das células endoteliais podem ligar a L-selectina: a
molécula de adesão do tipo1, que contém glicano (GlyCAM-1), uma proteoglicana
encontrada nas HEVs dos linfonodos; a molécula de adesão celular adressina da mucosa
do tipo 1 (MadCAM-1), expressa pelas células endoteliais no tecido linfóide associado
às mucosas; e a glicoproteína CD34. (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
O CD34 é um dos principais ligantes de células endoteliais que podem ligar as
L-selectinas e que segundo a literatura é fortemente expresso em diversas neoplasias
incluindo leucemias e em lesões vasculares, sugerindo, dessa forma, que sua
imunomarcação seja utilizada como critério de diagnóstico e prognóstico nessas lesões
(HEIMBURG et al, 1999; YOSHIDA et al, 1999; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Traweek et al (1991), verificaram em várias neoplasias de origem de células
endoteliais, como angiossarcomas, sarcoma de Kaposi e hemangioendotelioma
epitelióide, que o CD34 foi moderado a intensamente expresso quando comparado com
as áreas adjacentes livres de malignidade. Constatou-se ainda que o CD34 representou
54
ser um excelente imunomarcador com alta sensibilidade para determinação de índice
angiogênico, nas referidas lesões, em relação ao fator de von Willebrand.
Enaltecendo e corroborando com o trabalho supracitado em relação à
importância do CD34 como critério de avaliação da atividade angiogênica em tumores,
Di Carlo et al (2002), descreveram a imunoexpressão desse marcador em 65 espécimes
de fígado, contendo áreas com tecido normal, estágios de inflamação crônica e áreas de
carcinoma hepatocelular, verificando que a expressividade no tecido normal foi nula; na
área de inflamação observou-se ausência ou baixa marcação focal; porém, aumentando
a intensidade de acordo com a progressão da lesão; por sua vez, as áreas de carcinoma
obtiveram uma exuberante e forte expressão quando comparado com as demais áreas
analisadas.
Contudo, em uma análise imuno-histoquímica de 113 espécimes de carcinoma
hepatocelular, Yang et al (2006) evidenciaram que o anti-CD34 foi expresso em tecido
normal hepático (86,7%), tecido paracarcinomatoso (93,8%) e em carcinomas (100%),
enquanto a imunomarcação pelo anti-CD105 foi observada somente nos casos de
carcinomas. O estudo constatou, ainda, que o anti-CD105 revelou-se como um
excelente instrumento de quantificação de novos vasos sangüíneos e um relevante
indicador de prognóstico independente para recorrência e metástase em carcinoma
hepatocelular quando comparado com anti-CD34.
Baseados em ensaios prévios que sugerem que a angiogênese em câncer de
mama poderia ser um importante fator na determinação da transformação do carcinoma
in situ para invasivo, Teo et al (2003) verificaram que dos 355 casos de carcinoma
ductal in situ avaliados, 32 desenvolveram recorrência. A MVD, quando detectada pelo
anticorpo anti-CD34, foi significantemente maior nos casos in situ do que nos de
recorrência. No entanto, os achados com o FvW foram mais sutis e sugeriram uma
tendência à diminuição da MVD com o aumento da agressividade tumoral. Como
conclusão, os autores asseveraram que um aumento na imunomarcação dos vasos pelo
CD34 e diminuição pelo FvW poderia ser capaz de predizer os casos de carcinoma
ductal in situ que teriam um alto risco de desenvolver recorrência.
Conforme o estudo realizado por Costa e Guinee (2000) em carcinossarcomas de
genitais femininos e em sarcomas epitelióides com aspectos histológicos análogos,
verificaram que por meio da análise imuno-histoquímica anti-CD34, que a intensidade
de marcação foi mais expressiva nos sarcomas epitelióides do que nos
55
carcinossarcomas, mostrando, portanto, que o CD34 pôde ser útil para se fazer o
diagnóstico diferencial entre essas duas entidades.
Porém, em uma investigação da expressão da angiogênese e sua relação com o
prognóstico do câncer colorretal pela análise da MVD e pelo método informatizado para
quantificação da área endotelial em 126 pacientes, Leme et al (2006) demonstraram que
ambos os métodos não apresentaram relação entre estes parâmetros de angiogênese e o
intervalo livre de doença e a sobrevida global em indivíduos com adenocarcinoma
colorretal.
Lopez-Graniel et al (2001) realizaram um estudo em 33 pacientes com
carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço para analisar os mecanismos
angiogênicos através da análise imuno-histoquímica com anticorpo anti-CD34 e
observaram que a elevada densidade vascular estava relacionada com a recorrência e
com um pior prognóstico.
Adicionalmente, Guttman et al (2004), avaliando a angiogênese, de acordo com
a densidade microvascular, em 23 casos de carcinoma epidermóide em língua,
detectaram que a expressão do CD34 foi mais bem evidenciada em comparação ao
FvW. Além disso, descreveram que a imunomarcação continha uma correlação positiva
com o padrão de invasão tumoral e nódulos linfáticos metastáticos.
Entretanto, objetivando avaliar a densidade microvascular, pelo método imuno-
histoquímico empregando o anticorpo anti-CD34, em 30 casos de carcinoma
epidermóide de língua, no sítio primário e em suas metástases linfáticas, Amar et al
(2002) concluíram que não houve relação significativa entre a densidade vascular no
tumor primário e as diferentes variáveis histológicas avaliadas (grau de diferenciação,
padrão de invasão, infiltrado inflamatório, necrose e desmoplasia); havendo, por
conseguinte, uma relação inversa da densidade microvascular no tumor primário e na
respectiva metástase.
Por sua vez, a pesquisa conduzida por Ascani et al (2005) em 64 casos de
carcinoma epidermóide oral, afirmaram que a análise da MVD pela imunomarcação
com o anticorpo anti-CD34 não foi possível evidenciar sua correlação clínico-
patológico de acordo com os parâmetros idade, sexo, sítio e tamanho do tumor.
Todavia, nos tumores que exibiam baixa diferenciação, observou-se uma veemente
expressão nas lesões pouco diferenciadas e ausência de marcação nos pacientes sem
metástase nodal.
56
PROPOSIÇÃO
“O valor das coisas não está no tempo em que elas duram,
mas na intensidade com que acontecem.
Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas
inexplicáveis e pessoas incomparáveis.”
(Fernando Pessoa)
57
3 PROPOSIÇÃO
Este trabalho teve como objetivo realizar a mensuração da atividade angiogênica
através da expressão imuno-histoquímica dos anticorpos monoclonais anti-CD105
(endoglina) e anti-CD34 em hemangiomas e granulomas piogênicos orais com a
finalidade de poder contribuir para determinação do perfil angiogênico dessas lesões e
investigar se a proliferação vascular e a expressão desses marcadores angiogênicos
poderiam ser empregados como um dos métodos adequados para diagnóstico
diferencial, visto que estas lesões apresentam, algumas vezes, grande analogia clínica e
histopatológica.
58
MATERIAL E MÉTODOS
“Uma vida sem desafios não vale a pena ser vivida.”
(Sócrates)
59
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Caracterização do Estudo
O presente estudo caracterizou-se como uma pesquisa descritiva constituída pela
observação, análise e registro da intensidade de marcação e dos índices angiogênicos,
obtidos a partir da análise qualitativa e quantitativa de vasos sangüíneos imunomarcados
pelos anticorpos anti-CD105 (endoglina) e anti-CD34 em uma série de casos de
hemangiomas e granulomas piogênicos orais previamente selecionados. Constituiu-se,
também, de uma investigação comparativa das variáveis independentes (hemangiomas e
granulomas piogênicos), visando buscar, dessa forma, o entendimento da patogênese,
bem como apurar se a proliferação vascular e a expressão desses marcadores
angiogênicos poderiam ser aplicados como um dos meios para o diagnóstico diferencial
dessas duas lesões orais.
4.2 População
A população objeto deste estudo foi constituída por casos de hemangiomas e
granulomas piogênicos orais registrados e diagnosticados no período de 1980 a 2007 no
Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de
Odontologia da UFRN.
4.3 Amostra
A amostra selecionada para a realização desta pesquisa foi constituída por 40
espécimes teciduais de lesões orais emblocados em parafina, que foram oriundos do
Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de
Odontologia da UFRN, sendo 20 hemangiomas e 20 granulomas piogênicos orais.
Utilizaram-se na pesquisa 40 espécimes teciduais pelo fato deste número possibilitar
uma boa distribuição e dispersão dos dados.
60
4.3.1 Critérios de Inclusão da Amostra
Foram selecionados para este experimento apenas os casos de hemangiomas e
granulomas piogênicos orais, cujos blocos parafinados, oferecendo condições de corte
em micrótomo, contiveram material biológico suficiente e significativo.
4.3.2 Critérios de Exclusão da Amostra
Foram excluídos da pesquisa os blocos parafinados que não possuíam material
biológico suficiente.
4.4 Estudo Morfológico
O exame histopatológico, foi realizado em microscopia de luz, em cortes de 5μm
de espessura e corados pela técnica de Hematoxilina e Eosina. Em seguida, foi efetuada
uma análise descritiva das características anátomo-patológicas inerentes a cada lesão,
onde foram selecionados apenas os casos que apresentaram os aspectos morfológicos
padrões de hemangiomas e granulomas piogênicos orais.
4.5 Estudo Imuno-histoquímico
Todos os espécimes de hemangiomas e granulomas piogênicos orais fixados em
formol a 10% e emblocados em parafina, referentes aos casos previamente selecionados
para este estudo, foram submetidos a cortes histológicos de 3μm de espessura, os quais
foram estendidos em base de 3-aminopropyltrietoxi-silano (Sigma Chemical Co, St
Louis, Mo, USA). Posteriormente, os referidos cortes foram submetidos ao método da
imuno-histoquímica, pela técnica da Estreptoavidina-Biotina (SABC, streptoavidin-
biotin-complex), utilizando os anticorpos primários anti-CD105 (endoglina) e anti-
CD34, seguindo os passos laboratoriais descritos abaixo:
• Xilol I (30 minutos), estufa 59° - Desparafinização;
• Xilol II (20minutos), Temperatuta Ambiente (TA) - Desparafinização;
• Etanol absoluto I, II, III (05 minutos cada) - TA;
61
• Etanol 95° (05 minutos) - TA;
• Etanol 80° (05 minutos) - TA;
• Remoção do pigmento formólico com hidróxido de amônia a 10% em etanol a
95% (10minutos) - TA;
• Lavagem das lâminas em água corrente (10 minutos);
• Passagem dupla em água destilada (05minutos cada);
• Recuperação antigênica (Quadro 1);
• Lavagem em água corrente (10 minutos);
• Passagem dupla em água destilada (05 minutos cada);
• Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 10 volumes (duas
trocas 15 minutos cada);
• Lavagem em água corrente (10 minutos);
• Passagem dupla em água destilada (05minutos cada);
• Passagem em TRIS HCl (Tris (hydroxymethyl) aminomethane Hydrochloride)
pH 7,4 (duas trocas de 5 minutos cada);
• Incubação em solução de BSA (albumina sérica bovina) a 1% e soro fetal
bovino (SFB) a 5% em TRIS HCl pH 7,4 por 60 minutos, para bloquear a reação
do anticorpo primário com proteínas inespecíficas teciduais;
• Retirar o excesso da solução dos cortes;
• Incubação dos anticorpos primários conforme a determinação do fabricante
(Quadro 1);
• Passagem solução de Tween 20 a 1% em TRIS HCl pH 7,4 (duas trocas de 05
minutos cada);
• Incubação por 15 minutos nos reagentes seqüenciais do Kit CSA (Dako
Cytomation Catalyzed Signal Amplication Sytem (CSA)) para o anticorpo anti-
CD105(endoglina) e incubação por 30min nos reagentes do Kit LSAB (Dako
Cytomation + and LSAB® + Systems) para o anticorpo anti-CD34;
• Passagem em TRIS HCl pH 7,4 (duas trocas de 05 minutos cada);
• Incubação por 03 minutos em solução de di-aminobenzidina (DAB) na
concentração de 30mg em 10ml de TRIS HCl pH 7,4 ativada por peróxido de
hidrogênio 10 volumes para revelação;
• Lavagem em água corrente (10 minutos);
• Passagem dupla em água destilada (05 minutos cada);
62
Quadro 1. Especificação, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários
utilizados
• Contracoloração com Hematoxilina de Mayer (10 minutos) – TA;
• Lavagem em água corrente (10 minutos);
• Passagem dupla em água destilada (05 minutos cada);
• Desidratação em etanol em cadeia crescente de 80° ao etanol absoluto (03
minutos cada);
• Diafanização em xilol (03 passagens de 10 minutos);
• Montagem da lâmina em resina Permount® (Ficher Scientific, Fair Lawn, NJ,
USA) para observação ao microscópio de luz.
ANTICORPO
CLONE ESPECIFICIDADE DILUIÇÃO
RECUPERAÇÃO
ANTIGÊNICA INCUBAÇÃO
CD105(endoglin)
(SN6H)
Dako Corporation
Células endoteliais,
macrófagos ativados,
fibroblastos,
Sinciciotrofoblastos,
proeritroblastos.
1: 500 - Overnight
4°C
CD34
(QBEnd 101)
Dako Corporation
Células endoteliais,
precursores das
células
hematopoéticas
1:100 Citrato pH 6.0
Pascal, 30 min
Overnight
4°C
4.6 Análise do Perfil Imuno-histoquímico
As lâminas coradas pela técnica da imuno-histoquímica com anticorpos anti-
CD105 e anti-CD34 foram analisadas, à microscopia de luz (OLYMPUS BX41),
quantitativa e qualitativamente através do índice angiogênico e da intensidade de
marcação respectivamente. O índice angiogênico foi delimitado empregando-se a
técnica da contagem microvascular (MVC), de acordo com a metodologia de Maeda et
63
al (1995), em que foram selecionadas, de forma criteriosa e subjetiva, cinco áreas bem
significativas da lesão e com o maior número de vasos (densidade microvascular) sob
aumento de 40x (x4 objetiva, x10 ocular). Em seguida, através de aumento de 200x
(x20 objetiva, x10 ocular) foram quantificados manualmente os vasos por dois
observadores com auxílio de um retículo para estereologia, objetivando evitar a
recontagem de estruturas. Assim, o resultado foi expresso pelo número médio de vasos,
nestas áreas, em cada amostra das lesões. Ao final das contagens, obtivemos dois
valores para o MVC, tanto para o CD105 como para o CD34, dos quais se obteve a
média e, então, expresso um único MVC para cada caso analisado. Durante o
procedimento, qualquer célula ou grupo celular endotelial imunomarcado positivamente
separado dos microvasos adjacentes e de outros constituintes do tecido conjuntivo,
assim como os vasos contendo lúmen, foram considerados como vaso unitário. Foram
contados, como vasos, também, estruturas ramificadas e com descontinuidade na sua
conformação (Apêndice A).
Com relação à análise qualitativa da imunopositividade celular para os referidos
anticorpos, foi utilizada a metodologia proposta por Wakulich et al (2002), em que um
escore de 0 a 3 atribuiu subjetivamente a intensidade de imunomarcação dos vasos (0-
ausência de marcação; 1- marcação focal ou fraca; 2- marcação moderada ou
focalmente intensa; 3- marcação intensa e generalizada)(Apêndice B).
4.7 Análise Estatística
Com o intuito de testar as hipóteses aventadas no presente estudo, os resultados
obtidos foram submetidos a testes estatísticos apropriados. Os dados digitados em
planilhas eletrônicas Excel (Microsoft® Office XP Professional) foram exportados para o
formato DBF (Data Base Format), sendo, posteriormente, analisados e tratados
estatisticamente pelo programa SPSS (Statistical Package for Social Science version
13.0 for Windows® XP, Chicago Illinois, USA).
Considerando o parâmetro de marcação imuno-histoquímica de cada anticorpo
(anti-CD105 e anti-CD34) com as lesões analisadas, optou-se pela utilização da análise
descritiva, pois o teste estatístico não-paramétrico Qui-quadrado de Pearson com nível
de significância de 5%, não pôde ser realizada, uma vez que os dados dos resultados não
permitiram a realização dessa estratégia estatística.
64
Em relação à avaliação do índice angiogênico obtido pela contagem
microvascular (MVC), foi efetuado o teste t de Student com intuito de comparação entre
pares de grupos formulados. O intervalo de confiança estabelecido foi de 95% (α=0,05).
4.8 Implicações Éticas
O presente estudo foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP/UFRN) segundo o parecer n°
236/2007, protocolo n° 074/07, CAAE 0081.0.051.000-07 (Em anexo), onde os sujeitos
desta pesquisa assinaram os termos de consentimento livre e esclarecido tornando-se
ciente, dessa forma, de sua participação no estudo (Apêndice C). Ressalta-se, ainda, que
o presente trabalho foi executado a partir de espécimes teciduais, emblocados em
parafina, pertencentes ao arquivo de Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de
Patologia Oral do Departamento de Odontologia da UFRN. Diante disso, não houve,
portanto, exposição ou contato com pacientes portadores das lesões analisadas, as quais
foram removidas com intuito terapêutico.
65
RESULTADOS
“Por mais longa que seja a caminhada o mais importante
é dar o primeiro passo.”
(Vinícius de Moraes)
66
5 RESULTADOS
5.2 Resultados Morfológicos
Ao exame histopatológico, os casos de granulomas piogênicos e hemangiomas,
sob microscopia de luz, em corte de 5µm de espessura, corados pela técnica da
Hematoxilina e Eosina, revelaram as características inerentes as referidas lesões.
Nos granulomas piogênicos orais analisados constatou-se a presença de uma
massa lembrando um tecido de granulação recoberta por epitélio pavimentoso
estratificado atrófico ou hiperplásico, geralmente exibindo áreas ulceradas, cobertas por
tecido necrótico, fibrina e polimorfonucleares neutrófilos. No estroma de tecido
conjuntivo fibroso frouxo observaram-se uma intensa proliferação angioblástica com a
formação de numerosos espaços vasculares de calibres variados, normalmente
ingurgitados por eritrócitos, associados a um exsudato inflamatório difuso, rico em
polimorfonucleares neutrófilos, plasmócitos, macrófagos espumosos e linfócitos, cuja
proporção variava com o grau de ulceração superficial (Figuras 1 e 2).
No que concerne aos espécimes de hemangiomas, foi evidenciada a existência
de múltiplas células endoteliais proliferantes ora dilatadas, ora achatadas e pequenas em
associação com uma intensa proliferação e brotamentos de vasos capilares; com lúmen
freqüentemente indistinto; e cavernosos, amplamente espaçados, sendo alguns deles
obliterados por hemácias. (Figuras 7 e 8).
5.3 Resultados Imuno-histoquímicos
5.3.1 Análise Qualitativa da Marcação Imuno-histoquímica pelos
Anticorpos Anti-CD105 e Anti-CD34
A reatividade celular observada nos hemangiomas e granulomas piogênicos foi
restrita ao citoplasma das células endoteliais de revestimento e aos agrupamentos de
células endoteliais proliferantes sem lúmen, sendo representada pela coloração
acastanhada independente da intensidade de imunomarcação.
Durante a análise qualitativa, o anticorpo anti-CD34 reagiu imunopositivamente
em 100% dos casos de hemangiomas (20) (Figuras 11 e 12) e granulomas piogênicos
(20) estudados (Figuras 5 e 6); enquanto que para o anticorpo anti-CD105 a
67
Tabela 1. Imunoexpressão do anticorpo anti-CD105 em granulomas piogênicos e
hemangiomas. Natal/RN, 2008
*0-ausência de marcação; 1- marcação focal ou fraca; 2- marcação moderada ou focalmente
intensa; 3- marcação intensa e generalizada
imunoexpressão foi de 50% para os hemangiomas (10) (Figuras 9 e 10) e de 80% para
os granulomas piogênicos (16) (Figuras 3 e 4). Além disso, uma maior quantidade de
vasos sangüíneos e grupamentos de células endoteliais, nas duas lesões analisadas,
exibiram imunorreatividade mais expressiva e um padrão de marcação mais uniforme
para o anticorpo anti-CD34 quando comparados com o CD105.
Com relação à intensidade de marcação pelo anticorpo anti-CD105, dos 20
espécimes de granulomas piogênicos pesquisados, 4 (20%) foram negativos; 9 (45%)
mostraram imunoexpressão focal ou fraca; 4 (20%), positividade moderada e
focalmente intensa e 3 (15%), marcação intensa e generalizada (Tabela 1). Por sua vez,
50% dos hemangiomas (20) demonstraram uma marcação ausente para o CD105,
seguidos de 5 espécimes com imunorreatividade focal ou fraca (25%) e 5 (25%),
marcação moderada e focalmente intensa. Nenhum dos casos de hemangiomas obteve
marcação intensa e generalizada para esse anticorpo (Tabela 1).
Granuloma Piogênico Hemangioma Escore*
n % n % 0 4 20,0% 10 50,0% 1 9 45,0% 5 25,0% 2 4 20,0% 5 25,0% 3 3 15,0% 0 0,0%
Total 20 100,0% 20 100,0%
Levando em consideração a avaliação do grau de marcação imuno-histoquímica
pelo anticorpo anti-CD34 em granulomas piogênicos, a maioria (55%) teve uma
marcação forte e generalizada; 4 casos (20%) tiveram uma expressão focal ou fraca; 5
(25%), marcação moderada ou focalmente intensa (Tabela 2). Todavia, analisando os
casos de hemangiomas, grande parte dos espécimes (60%) evidenciou marcação forte
ou generalizada e 8 casos (40%), positividade moderada e focalmente intensa.
Adicionalmente, tanto nos hemangiomas quanto nos granulomas piogênicos não
revelaram marcação negativa para o CD34 (Tabela 2).
68
Tabela 2. Imunoexpressão do anticorpo anti-CD34 em granulomas piogênicos e
hemangiomas. Natal/RN, 2008
*0- ausência de marcação; 1- marcação focal ou fraca; 2- marcação moderada ou focalmente
intensa; 3- marcação intensa e generalizada
Tabela 3. Valores dos índices angiogênicos determinados pela contagem microvascular (MVC)
de acordo com o marcador nos espécimes de hemangiomas. Natal/RN, 2008
* Anticorpo
Granuloma Piogênico Hemangioma Escore*
n % n % 0 0 0,0% 0 0,0% 1 4 20,0% 0 0,0% 2 5 25,0% 8 40,0% 3 11 55,0% 12 60,0%
Total 20 100,0% 20 100,0%
É importante salientar que durante a análise qualitatitiva não foi possível
estabelecer diferença estatística significativa entre os escores de imunomarcação de
cada anticorpo (anti-CD105 e anti-CD34) com as lesões analisadas, uma vez que o teste
estatístico (teste não-paramétrico Qui-quadrado de Pearson) não pode ser aplicado
devido ao tamanho da amostra, sendo realizada então, a análise descritiva.
5.3.2 Análise Quantitativa da Marcação Imuno-histoquímica pelos
Anticorpos Anti-CD105 e Anti-CD34
O número médio dos vasos sangüíneos determinado pela contagem
microvascular (MVC) nos espécimes de hemangiomas imunomarcados com os
anticorpos anti-CD105 e anti-CD34 foram, respectivamente, 18,75, exibindo uma
variação 0,0 a 64,2, e 59,72 com uma variação entre 18,0 a 115,8 (Tabela 3).
Anti* Índices Angiogênicos dos Espécimes de Hemangiomas
CD105 61,6 0,0 64,2 26,8 0,0 38,2 0,0 56,6 0,0 0,0 30,2 0,0 0,0 0,0 0,0 25,4 0,0 29,6 20,2 22,2
CD34 105,8 115,8 114,8 25,6 19,4 32,4 28,4 102,6 28,4 26,2 35,2 104,8 18,0 58,2 64,4 32,4 105,8 86,8 53,2 36,2
69
* Anticorpo
* Anticorpo
O número médio dos vasos sangüíneos determinado pela contagem
microvascular (MVC) nos espécimes de granulomas piogênicos imunomarcados com os
anticorpos anti-CD105 e anti-CD34 foram, respectivamente, 20,22, apresentando uma
variação 0,0 a 38,6, e 48,09 com uma variação entre 14,2 a 129,2 (Tabela 4).
Anti* Índices Angiogênicos dos Espécimes de Granulomas Piogênicos
CD105 0,0 16,4 14,6 29,4 29,6 0,0 0,0 0,0 21,6 45,8 22,2 27,6 18,0 15,6 28,6 31,4 38,6 14,0 31,8 19,2
CD34 88,4 18,4 25,2 45,4 29,6 16,6 16,6 51,6 14,2 44,0 69,8 53,8 65,0 25,2 82,6 129,2 43,2 28,0 78,8 36,2
5.3.3 Análise Estatística da Contagem dos Microvasos Marcados pelos
Anticorpos Anti-CD105 e Anti-CD34
O resultado do teste “t” de Student demonstrou que não houve diferença
estasticamente significativa, durante a determinação das médias de contagem
microvascular (MVC), entre as duas lesões orais analisadas para os anticorpos anti-
CD105 ou anti-CD34 (Tabela 5).
Anti* Lesão n Média Desvio Padrão t p
Hemangioma 20 18,75 22,478 CD105
Granuloma Piogênico 20 20,22 13,182 0,252 0,803
Hemangioma 20 59,72 36,533 CD34
Granuloma Piogênico 20 48,09 30,031 -1,10 0,279
Tabela 4. Valores dos índices angiogênicos determinados pela contagem microvascular
(MVC) de acordo com o marcador nos espécimes de granulomas piogênicos. Natal/RN,
2008
Tabela 5. Valores dos índices angiogênicos determinados pala contagem microvascular (MVC)
de acordo com o marcador e o tipo de lesão estudada. Valores “t” e “p” para o teste “t” de
Student. Natal/RN, 2008
70
* Anticorpo
Entretanto, o resultado do teste “t” de Student revelou, ainda, que houve
diferença estasticamente significativa, durante a determinação das médias de contagem
microvascular (MVC), entre os dois anticorpos pesquisados nos hemangiomas ou
granulomas piogênicos (Tabela 6).
Lesão Anti* n Média Desvio Padrão t p
CD105 20 18,75 22,478 Hemangioma
CD34 20 59,72 36,533 -4,271 < 0,001
CD105 20 20,22 13,182 Granuloma Piogênico
CD34 20 48,09 30,031 -3,80 0,001
Tabela 6. Valores dos índices angiogênicos determinados pala contagem microvascular (MVC)
de acordo com o tipo de lesão e marcador estudado. Valores “t” e “p” para o teste “t” de
Student. Natal/RN, 2008
Figura 1. Granuloma piogênico. Fotomicrografia exibindo a superfície da lesão atrófica e um
tecido conjuntivo fibroso frouxo com um intenso infiltrado inflamatório misto permeando
numerosos vasos sangüíneos de calibres variados (H/E – 40x).
Figura 2. Granuloma piogênico. Detalhe em maior aumento mostrando vasos sangüíneos
associados a uma inflamação mista difusa (H/E – 200x).
Figura 3. Granuloma piogênico. Marcação imuno-histoquímica para o anticorpo anti-CD105
predominantemente em vasos sangüíneos (SABC – 100x).
Figura 4. Granuloma piogênico. Detalhe em maior aumento do quadro histológico anterior
evidenciando a imunoexpressão para o anticorpo anti-CD105 em vasos sangüíneos e em
ocasionais células endoteliais (SABC – 400x).
Figura 5. Granuloma piogênico. Fotomicrografia evidenciando padrão de marcação do anticorpo
anti-CD34 em vasos sangüíneos de calibres variados (SABC – 200x).
Figura 6. Granuloma piogênico. Detalhe em maior aumento da imunoexpressão pelo anticorpo
anti-CD34 em numerosos vasos sangüíneos de variados calibres (SABC – 400x).
Figura 7. Hemangioma. Fotomicrografia mostrando numerosos espaços vasculares associados a
uma proliferação endotelial (H/E – 100x).
Figura 8. Hemangioma. Fotomicrografia em maior aumento evidenciando múltiplos vasos
sangüíneos dilatados, sendo a maioria deles ingurgitados por hemácias (H/E – 200x).
Figura 9. Hemangioma. Imunoexpressão do anticorpo anti-CD105 em vasos sangüíneos e em
ocasionais células endoteliais (SABC – 100x).
Figura 10. Hemangioma. Detalhe em maior aumento da imunoexpressão para o anticorpo anti-
CD105 em vasos sangüíneos (SABC – 400x).
Figura 12. Hemangioma. Detalhe em maior aumento da imunoexpressão para o anticorpo anti-
CD34 em vasos sangüíneos e ocasionais células endoteliais (SABC – 400x).
Figura 11. Hemangioma. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em múltiplos vasos
sangüíneos (SABC – 100x).
77
DISCUSSÃO
“Sonhar é de graça, mas realizá-lo custa muito.”
(Roberto Shinyashiki)
78
4 DISCUSSÃO
A angiogênese é um processo dinâmico caracterizado pelo desenvolvimento de
novos vasos sangüíneos a partir da divisão ou migração da vasculatura pré-existente
sendo essencial em uma série de mecanismos fisiológicos e patológicos sediados na
cavidade oral. Neste contexto, várias pesquisas têm sido conduzidas buscando detalhes
sobre a participação da angiogênese na tumorigênese em virtude da mesma fornecer um
grande aporte nutricional às células neoplásicas proliferantes, bem como estabelecer
condições favoráveis à disseminação metastática (FOLKMAN, 1995; SCHIMMING et
al, 2004; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005; SOARES, 2007; SOUZA; FREITAS;
MIRANDA, 2007; NETTO et al, 2008).
O processo de progressão de uma célula normal para neoplásica envolve, dentre
muitos mecanismos, a capacidade de estimular a angiogênese, através do aumento da
secreção de fatores vaso-indutores e diminuição dos inibidores. Sendo a hipóxia um
importante sinalizador para o desencadeamento da liberação de citocinas angiogênicas
influenciando, assim, na progressão tumoral e metástase (FOX; GASPARINI; HARRIS,
2001; SCHIMMING et al, 2004; KYZAS; AGNANTIS; STEFANOU, 2006).
Tem sido caracterizada uma ampla variedade de fatores de crescimento e
citocinas como estimuladoras da neovascularização, como VEGF, FGF, PDGF, TGF-α
os quais são liberados pelas células tumorais e tidos como estimuladores da
proliferação, invasão e atividade quimiotática endotelial em muitos tipos de carcinomas
e lesões não-neoplásicas de cabeça e pescoço, como o granuloma piogênico e o
hemangioma (FOLKMAN; SHING, 1992; SHEIBANI; NEWMAN; FRAZIER, 1997;
WAKULICH et al, 2002; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005; JAFARZADEH;
SANATKHANI; MOHTASHAM, 2006).
Esse mecanismo da formação vascular também pode ser controlado e
equilibrado por inibidores angiogênicos, como angiostatina, endostatina e TPS-1, que
inibem a proliferação endotelial e induzem o estado de quiescência em lesões tumorais.
Logo, as células neoplásicas têm a capacidade de aumentar a expressão de fatores pró-
angiogênicos, bem como de suprir seus reguladores negativos (FOLKMAN, 1995;
KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
Nesta discussão, acerca da importância do papel da angiogênese, como por
exemplo, durante os mecanismos metastáticos, na vascularização dos tecidos
isquêmicos, nos processos inflamatórios crônicos, nos oligodendrogliomas, em lesões
79
vasculares como hemangiomas, sarcomas de kaposi, angiossarcomas e algumas doenças
auto-imunes, artrite reumatóide e psoríase, Fokman e Shing (1992), Folkman (1995),
Cohen (2002), Schimming et al (2004), Freitas et al (2005), Souza, Freitas e Miranda
(2007) e Netto et al (2008) são concordantes às aplicações clínicas, dos experimentos
sobre a neoformação vascular, na terapêutica para aceleração da angiogênese visando
promover o reparo tecidual, na terapia para inibição da angiogênese, em diversas
condições tumorais, e na quantificação da angiogênese para o uso em diagnóstico e
prognóstico, alicerçando, desse modo, como sendo mais um instrumento para
acompanhamento da evolução e confirmação da eficácia das técnicas terapêuticas
aplicadas atualmente aos pacientes acometidos por tais lesões.
De forma adicional, Folkman (1995), Poon, Fan e Wong (2001) e Souza, Freitas e
Miranda (2007) relatam, ainda, que além do crescimento tumoral e metástase serem
dependentes da angiogênese, a ativação de processos químicos, como a liberação de
fatores de crescimento, são capazes de conduzir a célula endotelial de uma fase inicial
de repouso para uma de rápido crescimento. As células tumorais podem superexpressar
um ou mais reguladores angiogênicos, mobilizar proteínas vasculares da matriz extra-
celular, recrutar células do hospedeiro como macrófagos ou, ainda, envolver vários
mecanismos, com intuito de permitir a perpetuação tumoral. Os autores afirmam,
também, que a maioria das lesões são clinicamente detectáveis e sintomáticas apenas
após o processo de neovascularização, salientando que o desenvolvimento de um
fenótipo angiogênico, nem sempre resulta na rápida proliferação tumoral, fato este
atribuído à ação de fatores inibitórios de crescimento vascular, podendo ser circulantes
ou teciduais.
Associado a este fato, ensaios a respeito da angiogênese, ainda precisam ser mais
desenvolvidos, afim de melhor se entender este processo e sua influência no
crescimento neoplásico, permitindo, deste modo, a avaliação do seu emprego no
diagnóstico e terapêutica (MORIYAMA et al, 1997; POON; FAN; WONG, 2001).
Por conseguinte, apesar da existência de uma variedade de citocinas, estimuladores
e inibidores da vascularização já terem sido identificada (VEGF, PDGF, TNF-α, IL-8,
IL-1, trombospondina, integrinas vasculares e outras) no que concerne na sua
capacidade regulatória sob a atividade angiogênica e, conseqüentemente, do
crescimento tumoral, muitas delas, ainda, não estão bem definidas. Entretanto, a sua
identificação e quantificação proporcionaram um meio de se avaliar a vascularização de
lesões, ressaltando que o reconhecimento das áreas tumorais mais vascularizadas, bem
80
como, a variação inter-observador podem interferir na reprodutibilidade da técnica,
devendo, dessa forma ser realizados estudos que possibilitem a sua análise de forma
padronizada, como também, estabeleçam a sua importância na aplicação clínica
(MORIYAMA et al, 1997; BERTRAN, 2001; SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007).
Esta observação pode ser corroborada pelos achados de Freitas et al (2005) em
granulomas piogênicos e hemangiomas orais; Jafarzadeh, Sanatkhani e Mohtasham
(2006) em granulomas piogênicos e Sundine e Garrett (2007) em hemangiomas orais
que afirmam o valor da participação de uma série de fatores angiogênicos na
etiopatogênese dessas lesões.
Como constatado na revisão de literatura deste trabalho, a angiogênese pode ser
analisada qualitativa e quantitativamente através de várias metodologias por meio da
avaliação microscópica da vascularização tumoral, utilizando-se do emprego de
anticorpos específicos para as células endoteliais, como VEGF, CD31, CD34, CD44,
CD105 e o fator von Willebrand (DUFF et al, 2003; ABBAS; LICHTMAN, 2005;
MINHAJAT et al, 2006; LIORCA et al, 2007; NETTO et al, 2008).
No entanto, os autores são conflitantes na indicação do marcador imuno-
histoquímico que oferece melhores resultados na avaliação da angiogênese, porém de
acordo com Martone et al (2005), Chien et al (2006), Chuang et al (2006), Kyzas,
Agnantis e Stefanou (2006), Taskiran et al (2006), Nikiteas et al (2007), Soares et al
(2007) e Netto et al (2008) o CD105 é um excelente anticorpo de eleição na avaliação
da angiogênese. Por outro lado, Traweek et al (1991), Costa e Guinee (2000), Lopez-
Graniel et al (2001), Di Carlo et al (2002), Teo et al (2003), Guttman et al (2004) e
Ascani et al (2005) recomendam para análise de vascularização o CD34.
Assim, no estudo ora realizado, optou-se em avaliar de forma comparativa a
expressão imuno-histoquímica dos marcadores angiogênicos, CD105 (endoglina) e
CD34, em duas lesões vasculares da cavidade oral, o hemangioma e o granuloma
piogênico, as quais exibem comportamento clínico e histopatológico por vezes
semelhantes e com forte evidência para a participação de fatores angiogênicos na sua
patogênese (YUAN; JIN; LIN, 2000, FREITAS et al, 2005).
Em relação aos achados morfológicos verificados nos casos de granulomas
piogênicos analisados neste estudo, todos estão alicerçados e concordantes com as
citações de Silva-Souza (2000), Neville et al (2004), Epivatianos et al (2005),
Jafarzadeh, Sanatkhani e Mohtasham (2006), Patil, Mahima e Lahari, (2006) e Shenoy e
Dinkar (2006), onde verificaram a presença de uma massa semelhante a um tecido de
81
granulação exuberante exibindo uma proliferação endotelial associada à formação de
numerosos espaços vasculares, além de uma evidente proliferação fibroblástica e de
fascículos de fibras colágenas irradiando-se desde a base ou origem da lesão até o
interior da massa granulomatosa. O epitélio de revestimento encontrava-se adelgaçado e
atrófico ou hiperplásico, na maioria das vezes com a superfície ulcerada e recoberta por
uma membrana crostosa fibrinopurulenta. Nas lesões ulceradas, constatou-se um denso
infiltrado de células inflamatórias com leucócitos polimorfonucleares,
predominantemente concentrados na superfície e, mais disseminados, nas áreas
profundas, evidenciou-se uma grande quantidade de plasmócitos, macrófagos
espumosos e linfócitos (Figuras 1 e 2).
No que concerne aos hemangiomas, tais achados histopatológicos, constituídos
por uma evidente proliferação de células endoteliais roliças e brotamentos com lúmen
vascular geralmente indistinto associados a numerosos capilares e/ou cavernosos
dependendo do tamanho dos espaços vasculares proliferastes, foram condizentes com os
descritos na literatura (Figuras 7 e 8) (RODRIGUES et al, 1998; REGEZI; SCIUBBA,
2000; NEVILLE et al, 2004; FREITAS et al, 2005; CORRÊA et al, 2007).
De acordo com Vermeulen et al (2002), Freitas et al (2005) e Souza, Freitas e
Miranda (2007) a quantificação de vasos sangüíneos em secções histológicas pode ser
útil como indicador de diagnóstico e prognóstico em lesões de cabeça e pescoço. No
entanto, a mesma pode ser influenciada por vários fatores, incluindo o tipo de fixador
utilizado, o pré-tratamento dos espécimes antes da marcação, o método de quantificação
empregado e o anticorpo selecionado. Schor et al (1998) afirmaram que o pré-
tratamento das secções histológicas é a variável que mais exerce influência na
estimativa da vascularização em espécimes teciduais. Através de um estudo
comparativo entre diferentes metodologias destinadas à quantificação da angiogênese,
estes autores demonstraram que a variação no tipo de tratamento dos espécimes
teciduais (digestão enzimática e aquecimento) produzia diferentes valores de índices
angiogênicos colocando em questão os resultados da pesquisa. Diante dessas
observações, no corrente estudo, buscou-se seguir a reprodutibilidade das técnicas
conforme as determinações dos fabricantes de cada anticorpo (Quadro 1) (BOURNE,
1983), ressaltando-se, dessa forma, a necessidade de se padronizar um protocolo para a
determinação da angiogênese, pois variações na metodologia poderiam ocasionar falhas
na técnica de coloração e na obtenção do índice angiogênico (DUFF et al, 2003;
SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007).
82
Em decorrência das diferentes recomendações de técnicas destinadas à
quantificação da angiogênese (WEIDNER; SAMPLE; FOLKMAN, 1991; PAZOUKI et
al, 1997; MAEDA et al, 1995) procedeu-se, inicialmente, uma avaliação da MVD,
MVC e MVV e constatou-se que a MVC foi o método, de obtenção do índice
angiogênico, mais simples, efetivo e de fácil aplicabilidade encontrado para análise da
angiogênese de tumores de cabeça e pescoço (MAEDA et al, 1995; FRIDMAN et al,
2000; FREITAS et al, 2005; SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007).
Com isso, alicerçando a plausibilidade em relação ao método de contagem de
microvasos, Jacquemier et al (1998) procurando estabelecer parâmetros comparativos
de agressividade e sensibilidade terapêutica em pacientes portadores de câncer de mama
entre a determinação da MVC, utilizando o anticorpo anti-CD31, e Erenoglu et al
(2000) buscando uma correlação entre a MVC e dados clínicos patológicos do
carcinoma gástrico, através da marcação com o anticorpo anti-fator VIII; esses
estudiosos asseveraram que a MVC tem grande valor de prognóstico, especialmente na
indicação de pacientes com alto risco de recidiva e com necessidade de terapia pós-
operatória complementar. Todavia, Fridman et al (1998) sugerem que essa técnica deve
ser mais bem estudada e otimizada, antes de ser utilizada na rotina para determinação
prognóstica nos mais variados tipos de cânceres humanos.
É importante ressaltar que durante a avaliação da reatividade pelos anticorpos,
anti-CD105 e anti-CD34, necessitou-se por parte dos examinadores um período de
adaptação e treinamento da técnica, pois ocasionalmente, a marcação não ocorreu de
forma muito evidente e bem definida, em diversos casos de hemangiomas e granulomas
piogênicos imunomarcados, como por exemplo, pelo CD105 (Tabela 1) em
aglomerados de células endoteliais e vasos, devendo, dessa forma, o avaliador estar
familiarizado com a metodologia, a fim de evitar equívocos na contagem. Sendo assim,
a importância de um treinamento prévio para uma satisfatória capacitação dos
patologistas com a metodologia, bem como sua padronização e a do anticorpo a ser
empregado, procurando, com isto, possibilitar um procedimento com mínima
variabilidade e boa reprodutibilidade, afirmações concordantes com os estudos de
Fridman et al (2000), Duff et al (2003) e Souza, Freitas e Miranda (2008).
Observou-se na amostra ora estudada que a expressão imuno-histoquímica dos
anticorpos anti-CD105 e anti-CD34 nos hemangiomas e granulomas piogênicos foi
restrita ao citoplasma das células endoteliais de revestimento e aos agrupamentos de
células endoteliais proliferantes que não formavam lúmen sendo, dessa forma,
83
congruentes com os trabalhos que afirmam ser o CD105 e CD34 anticorpos com
afinidade por epítopos específicos de células endoteliais (MARTONE et al, 2005;
SOARES et al, 2007; YANG et al, 2006; NETTO et al, 2008).
Conforme as citações de Kyzas, Agnantis e Stefanou (2006), existem poucos
estudos sobre a imunomarcação dos anticorpos anti-CD34 e anti-CD105 em vasos
linfáticos, entretanto é possível que dentre os vasos imunomarcados, nesta pesquisa,
existam alguns do tipo linfático, porém de pouca significância na avaliação da
angiogênese. Do mesmo modo, verificou-se que o CD105 apresentava, algumas vezes,
especificidade para certos fibroblastos e macrófagos ativados (DUFF et al, 2003;
LIORCA et al, 2007), contudo durante a análise dos resultados investigou-se, também,
de forma cautelosa a morfologia dos componentes celulares imunomarcados, evitando,
por conseguinte, erro de contagem microvascular. Portanto, estamos convencidos que a
maior parte da marcação ocorreu no endotélio vascular dos espécimes estudados.
As informações contidas nas tabelas 1 e 2 evidenciam os resultados da análise
qualitativa obtidos com os anticorpos anti-CD105 e anti-CD34. Verifica-se que o CD34
reagiu positivamente em 100% dos casos de hemangiomas (Figuras 11 e 12) e
granulomas piogênicos (Figuras 5 e 6). Por outro lado, o CD105 reagiu em 50 e 80%
dos espécimes de hemangiomas (Figuras 9 e 10) e granulomas piogênicos (Figuras 3 e
4) respectivamente, demonstrando, com isso, que o CD34 apresenta alta sensibilidade
de imunomarcação, fato verificado em diversas condições tumorais, conforme
observado por Traweek et al (1991) em angiossarcomas, sarcoma de Kaposi e
hemangioendotelioma epitelióide; Guttman et al (2004) em carcinoma epidermóide de
língua e Yang et al (2006) em carcinoma hepatocelular.
No tocante a intensidade de marcação, a maioria dos espécimes submetidos à
aplicação do anticorpo anti-CD34, tanto nos granulomas piogênicos (55%) como nos
hemangiomas (60%) exibiram imunoexpressão forte e generalizada (Tabela 2),
contrariamente, grande parte dos granulomas piogênicos (45%) e dos hemangiomas
(50%) tiveram marcação focal ou fraca e negativa respectivamente quando submetidos à
aplicação do anticorpo anti-CD105 (Tabela 1). Estes resultados são condizentes com os
achados de Traweek et al (1991), Di Carlo et al (2002), Teo et al (2003), Guttman et al
(2004) e Ascani et al (2005) que reiteram a importância da intensidade de
imunomarcação pelo anticorpo anti-CD34 no estudo da angiogênese.
Os resultados deste experimento não demonstraram boa efetividade do CD105
para quantificação da vascularização para análise da angiogênese, observações estas que
84
se confrontam com os obtidos por Martone et al (2005), Chien et al (2006), Kyzas,
Agnantis e Stefanou (2006) e Soares et al (2007) que recomendam a mensuração da
angiogênese, estabelecida pelo o anticorpo anti-CD105 como excelente indicador de
avaliação e prognóstico para pacientes com carcinomas de cabeça e pescoço.
Adicionalmente, de acordo com Heimburg et al (1999), Yoshida et al (1999) e
Di Carlo et al (2002), o CD34 é o anticorpo de eleição na avaliação da angiogênese.
Tais afirmações não são congruentes com os achados de Saad et al (2004) em um estudo
realizado em câncer colorretal, os quais recomendam o CD105 como o marcador
endotelial ideal para mensuração da angiogênese e de valor preditor de metástase em
comparação com os marcadores pan-endoteliais. Todavia, neste ensaio, em particular,
os espécimes submetidos à marcação com o CD34, exibiram um padrão de marcação
mais uniforme e interpretação mais fácil quando comparado à imunomarcação com o
CD105, embora os índices angiogênicos, obtidos a partir da contagem dos microvasos
(MVC) marcados por estes anticorpos, não tenham mostrado diferença estatisticamente
significativa nas duas lesões orais analisadas (Tabela 5).
Neste contexto, várias pesquisas foram realizadas buscando detalhes acerca da
participação dos anticorpos anti-CD105 e anti-CD34 em diversas lesões tumorais.
Assim, Sugita et al (2006) em um estudo em linfomas do sistema nervoso central;
Erdem et al (2007) em uma pesquisa conduzida em uma série de casos de hiperplasias e
carcinomas endometriais; e no ensaio realizado por Netto et al (2008) em
oligodendrogliomas, esses autores verificaram que pela avaliação da angiogênese pela
MVD o CD34 e o CD105 revelaram-se serem bons marcadores endoteliais, contudo
somente o CD105 mostrou-se eficaz como possível fator de prognóstico e alvo para
terapêutica anti-angiogênica nas referidas lesões.
Conforme os dados apresentados neste estudo, a ausência de diferença na
determinação das médias de contagem microvascular (MVC), entre hemangiomas e
granulomas piogênicos analisadas com os anticorpos anti-CD105 ou anti-CD34 refletem
a semelhança clínica e histopatológica entre as duas lesões, e ao mesmo tempo, revelam
a ineficácia da quantificação da angiogênese como indicador de diagnóstico diferencial
entre as mesmas. A aplicação do teste “t” de Student demonstrou que, mesmo com a
variação do anticorpo (CD105 e CD34), as médias dos índices angiogênicos,
conseguidos a partir da contagem dos microvasos, apresentavam-se semelhantes nas
duas lesões avaliadas (Tabela 5). Esses achados estão em consonância com os
resultados obtidos por Freitas et al (2005), onde através da utilização dos anticorpos
85
CD31 e Fator de von Willebrand para mensuração da angiogênese em hemangiomas e
granulomas piogênicos, verificaram que esses marcadores pan-endoteliais não se
configuraram como indicador de diagnóstico capaz de diferenciar a atividade
angiogênica entre estas lesões por meio da técnica de contagem de microvasos.
De forma não consensual, com os resultados supracitados a respeito do anticorpo
anti-CD34, Costa e Guinee (2000) analisando a expressão imuno-histoquímica pelo o
anticorpo anti-CD34, constataram que a intensidade de marcação foi mais expressiva
nos sarcomas epitelióides do que nos carcinossarcomas, mostrando, portanto, que o
CD34 pôde ser útil para se fazer o diagnóstico diferencial entre essas duas entidades.
Destaca-se, no presente estudo, que os índices angiogênicos verificado pelo
anticorpo anti-CD105 nos hemangiomas e granulomas piogênicos foram bem inferiores
quando comparados com o CD34 (Tabelas 3, 4 e 6), além disso, em muitos casos o
CD105 mostrou-se com o índice igual a zero (Tabela 3 e 4) ou imunoexpressão negativa
(Tabela 1). Com base nesse contexto, poderíamos inferir que a baixa quantidade de
vasos e ausência de marcação pelo CD105 nos espécimes estaria associada ao fato da
endoglina ser um excelente marcador de neoformação vascular (Figuras 3, 4, 9 e 10), no
entanto o CD34 se configura, dessa forma, como um marcador pan-endotelial incapaz
de diferenciar os vasos neoformados dos vasos pré-existentes (Figuras 5, 6, 11 e 12)
(FREITAS et al, 2005; LICHTMAN, 2005; KYZAS; AGNANTIS; STEFANOU,
2006), daí uma maior quantidade de vasos imunopositivos para esse anticorpo. Tais
observações são corroboradas com as declarações de Chuang et al (2006), Grudzinski et
al (2006), Barresi et al (2007), Li et al (2007) e Netto et al (2008) que ressaltam que a
endoglina é preferencialmente expressa em vasos em proliferação durante a
angiogênese, onde, uma área de neoangiogênese de um tumor, está relacionada com
pior prognóstico. Por isso, o seu uso na avaliação do grau de malignidade tumoral e na
mensuração da taxa de sobrevida de muitos pacientes.
Poderíamos deduzir, ainda, baseados nos achados deste experimento através da
imunomarcação pelo CD105, partindo do princípio que esse anticorpo age sobre vasos
neoformados, que os espécimes que obtiveram marcação negativa, poderiam estar em
um estágio evoluído ou quiescente em que os fatores angiogênicos (VEGF, bFGF, TNF-
α, PDGF e IL-8) (TAKAHASHI et al, 1994; GASPARINI; HARRIS, 2001; KUMAR;
ABBAS; FAUSTO, 2005; SUNDINE; GARRETT, 2007) estariam em equilíbrio com
os fatores antiangiogênicos (TGF-β, TIMP-1, angiostatina, endostatina e TPS-1)
86
(FOLKMAN; SHING, 1992; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005; SUNDINE;
GARRETT, 2007).
Sendo assim, 50% dos hemangiomas se encontrariam em fase não proliferativa
e 80% dos granulomas piogênicos, em condição de desenvolvimento ou de proliferação
endotelial (Tabela 1), reforçando, dessa forma, a importância dos mecanismos
angiogênicos na etiopatogênese dessas duas lesões (TAKAHASHI et al, 1994;
KANDA; YUAN; JIN; LIN, 2000; HAMLAT et al, 2005; WATANABE, 2005;
JAFARZADEH; SANATKHANI; MOHTASHAM, 2006; SUN; ZHAO; ZHANG,
2007). Nesse caso, em virtude destes resultados, poderíamos sugerir, outrossim, que as
lesões que se evidenciavam no estágio proliferativo, apresentariam, principalmente, uma
elevada atividade do fator de crescimento endotelial (VEGF), considerado por
Takahashi et al (1994), Yuan, Jin e Lin (2000), Freitas et al (2005), Hamlat et al (2005)
e Sun, Zhao e Zhang (2007) como um potente mitógeno para células endoteliais,
expresso apenas em fases de desenvolvimento e ausente em secções histológicas de
lesões nas fases de involução e involuída.
No entanto, vale salientar que a ação de outros fatores etiológicos já
mencionados na revisão de literatura deste ensaio, para os hemangiomas e granulomas
piogênicos, não deve ser desprezada, já que intensificam a resposta tecidual à ação
desses fatores angiogênicos (RIBAS; LARANJEIRA; SOUSA, 2004; FREITAS et al,
2005; SHENOY; DINKAR, 2006).
Diante do que foi exposto, acreditamos que a importância da angiogênese no
crescimento e desenvolvimento de diversas condições tumorais de cabeça e pescoço é
inquestionável. Os resultados encontrados nesta pesquisa, portanto, sustentam não só a
semelhança entre hemangiomas e granulomas piogênicos orais e a relevância da
imunomarcação pelos anticorpos anti-CD105 e anti-CD34 no estudo da neoformação
vascular, como, também a tendência apresentada pela literatura disponível (HAMLAT
et al, 2005; WATANABE, 2005; JAFARZADEH; SANATKHANI; MOHTASHAM,
2006; SUNDINE; GARRETT, 2007; SUN; ZHAO; ZHANG, 2007; NETTO et al,
2008) de considerar importante a participação de fatores angiogênicos na patogênese
destas lesões.
Todavia, destacamos que o papel exato deste fenômeno e sua relação com o
desenvolvimento de muitas lesões necessita, ainda, ser esclarecido com o objetivo de
que este possa ser mais um parâmetro seguro a ser utilizado como ferramenta na
87
identificação do potencial biológico tumoral e como adjuvante das técnicas terapêuticas
disponíveis.
88
CONCLUSÕES
"Realize o seu próprio sonho. Você mesmo vai ter de fazer isso...
eu não posso acordar você. Você é quem pode se acordar."
(John Lennon)
89
5 CONCLUSÕES
• O anticorpo anti-CD34 mostrou-se mais efetivo na identificação das células
endoteliais e vasos sangüíneos dos espécimes avaliados neste estudo.
• Os resultados deste ensaio demonstraram uma boa efetividade do anticorpo anti-
CD34 para determinação do índice angiogênico pela contagem microvascular
(MVC) nos casos analisados.
• A expressão imuno-histoquímica do anticorpo anti-CD105 sugere ser um
excelente marcador de diferenciação de vasos neoformados dos vasos pré-
existentes nas lesões orais estudadas.
• A quantificação da angiogênese não se apresentou como indicador de
diagnóstico capaz de diferenciar atividade angiogênica entre hemangiomas e
granulomas piogênicos orais estudados.
• Os hemangiomas e granulomas piogênicos orais são lesões angiogênese-
dependentes com proliferação endotelial desencadeada pela ação de moléculas
angiogênicas.
90
REFERÊNCIAS
"Só uma coisa torna um sonho impossível: o medo de fracassar."
(Paulo Coelho)
91
REFERÊNCIAS1
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. Imunologia Celular e Molecular. 5. ed. Rio de
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103
APÊNDICES
“Para realizar um sonho é preciso esquecê-lo, distrair dele a
atenção. Por isso realizar é não realizar.”
(Fernando Pessoa)
104
APÊNDICE A - FICHA DE AVALIAÇÃO DOS ÍNDICES ANGIOGÊNICOS
Ficha de avaliação dos índices angiogênicos determinados pela contagem
microvascular (MVC) em ________________________ orais de acordo com a
expressão imuno-histoquímica do anticorpo _________ .
ÍNDICES ANGIOGÊNICOS Campos Campos
Caso 1 2 3 4 5 Nº Médio de Vasos Caso 1 2 3 4 5 Nº Médio
de Vasos 01
11
02
12
03
13
04
14
05
15
06
16
07
17
08
18
09
19
10
20
105
APÊNDICE B - FICHA DE AVALIAÇÃO DA INTENSIDADE DE MARCAÇÃO
Ficha de avaliação da intensidade de marcação em ____________________ orais de
acordo com a expressão imuno-histoquímica do anticorpo _________ .
INTENSIDADE DE MARCAÇÃO
Caso 0 1 2 3 Caso 0 1 2 3
01
11
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APÊNDICE C - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DESPORTO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Convidamos você para participar da pesquisa sobre a Expressão Imuno-
histoquímica dos Marcadores Angiogênicos CD105 (endoglina) e CD34 em
Hemangiomas e Granulomas Piogênicos Orais o que significa estudar a ação de duas
substâncias protéicas (CD105 e CD34) que atuam em células que compõem vasos
sangüíneos em hemangiomas e granulomas piogênicos de boca (lesões que surgem de
vasos sangüíneos) com a finalidade de entender a formação dessas lesões na boca.
A sua participação não trará nenhum risco previsível ou desconforto. Você não
será submetido a nenhum procedimento, porém você deve autorizar os pesquisadores a
examinarem os seus fragmentos de tecido que já foram tirados de sua boca que estão
guardados em blocos de parafina (cera), sendo as informações confidenciais, guardadas
em local seguro e somente usadas com o propósito científico, sem divulgação do seu
nome.
Sua participação é voluntária, caso queira, você poderá desistir a qualquer
momento, sem que isso lhe traga prejuízo ou penalidade, basta que retire o seu
consentimento em participar.
A pesquisa deverá contribuir para o aumento do conhecimento na área de
diagnóstico de lesões vasculares comuns de boca, que se apresentam de formas muito
parecidas, dificultando, assim, o diagnóstico. Portanto, um melhor entendimento da
formação dessas lesões deverá facilitar na escolha do tratamento mais adequado,
trazendo assim, benefícios para a sociedade de um modo geral.
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Você não terá nenhum gasto financeiro por qualquer procedimento executado
por essa pesquisa e terá direito a reembolso (ressarcimento) de qualquer gasto
comprovadamente que você tenha feito para a realização desse estudo, bem como será
indenizado em caso de dano comprovadamente ocorrido por sua participação na mesma.
Você receberá uma cópia desse termo no seu endereço via correio com aviso de
recebimento e qualquer dúvida a respeito da pesquisa poderá perguntar a Lélia Maria
Guedes Queiroz, no Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, Av. Senador Salgado Filho, 1787, Lagoa Nova, Natal/RN fone (84)
3215-4138 E-mail: lmgqueiroz@ hotmail.com
Consentimento Livre e Esclarecido
Declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os
riscos e benefícios envolvidos e concordo em participar voluntariamente da pesquisa
“Expressão Imuno-histoquímica dos Marcadores Angiogênicos CD105 (endoglina)
e CD34 em Hemangiomas e Granulomas Piogênicos Orais”.
Assinatura ou impressão
Digital do voluntário: _____________________________ Data:___/___/___
Assinatura do pesquisador: _________________________ Data:___/___/___
Quanto à ética dessa pesquisa poderá ser questionada ao Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pelo telefone 3215-33135.
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ANEXOS
“Só existe dois dias no ano que nada pode ser feito. Um se
chama ontem e o outro se chama amanhã, portanto hoje é o
dia certo para amar, acreditar, fazer e principalmente viver”.
(Dalai Lama)
