UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO … · crescimento específicos. O cordão umbilical humano tem sido uma fonte interessante de obtenção deste tipo celular por

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS CURSO DE BIOMEDICINA

JOHN LENON DE SOUZA SANTOS

PROTEOMA COMPARATIVO ENTRE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS HUMANAS COM CARIÓTIPO NORMAL E INVERTIDO

Natal - RN

Dezembro de 2016

PROTEOMA COMPARATIVO ENTRE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS HUMANAS COM CARIÓTIPO NORMAL E INVERTIDO

por

John Lenon de Souza Santos

Monografia apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Biomedicina.

Orientadora: Prof.ª Drª Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros

Natal - RN

Dezembro de 2016

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB

Santos, John Lenon de Souza.

PROTEOMA COMPARATIVO ENTRE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS

HUMANAS COM CARIÓTIPO NORMAL E INVERTIDO / John Lenon de Souza Santos. - Natal, 2016.

62 f.: il.

Monografia (Graduação) - Universidade Federal do Rio Grande

do Norte. Centro de Biociências. Curso de Biomedicina. Orientadora: Profa. Dra. Silvia Regina Batistuzzo de

Medeiros.

1. Células-tronco - Monografia. 2. Bioinformática - Monografia. 3. Proteoma - Monografia. I. Medeiros, Silvia Regina

Batistuzzo de. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 602.9

AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais por terem me dado o suporte basal, pois sem isso não

teria conseguido realizar as atividades ao longo da minha trajetória acadêmica. Em

especial à minha mãe, sem ela eu não teria o acesso as oportunidades mínimas.

Apesar das grandes barreiras em todos os sentidos que a vida a impôs, ela fez de

tudo para que as nossas origens humildes não me impedissem de crescer.

Aos meus amigos que estão comigo nessa jornada há 4,5 anos, que tentam me

dar suporte na medida do possível. Com certeza sem eles a caminhada até aqui teria

sido bem mais tortuosa. Obrigado Paulinha, Karol, Alan e Thais por todo apoio!

A Válber, seu apoio nos últimos meses tem sido excepcional e eu só tenho a

agradecer independentemente de qualquer situação!

Aos meus amigos de laboratório, Kamilla e Fábio (obrigado pela ajuda na

formatação do trabalho). Especialmente à Jéssyca Tamyres, pelo apoio emocional

irrestrito que tem me dado, você tem sido muito especial nessa minha caminhada por

ser essa pessoa humilde, caridosa, tão boa que parece que come flores! Meus

sinceros agradecimentos!

A Leorik pelas orientações acadêmicas e por ser uma pessoa maravilhosa, seja

dentro ou fora do mundo acadêmico e por aceitar fazer parte da minha banca.

Ao professor Jonathas Santos pela disponibilidade de fazer parte da minha

banca.

À Ana Rocha, ou simplesmente Ana! Sem você eu jamais teria conseguido

realizar esse trabalho, seria impensável sem você. Obrigado pela disponibilidade, pela

cooperação, por ter me abraçado naquele laboratório quando eu pensava que não iria

conseguir ajuda, por ser essa pessoa simplesmente maravilhosa, que apesar de todas

as suas batalhas pessoais me ajudou sempre que possível. Além de trabalho,

compartilhamos nossas histórias e demos forças um para o outro. Houveram tristezas,

mas também houveram muitos sorrisos e gargalhadas! A você minha imensa gratidão,

não apenas pela sua competência acadêmica, mas simplesmente por existir e

proporcionar mais luz a esse mundo cada vez mais sombrio!!

IV

RESUMO

As Células-tronco mesenquimais humanas (CTMH) têm sido alvo de estudos na área

da medicina regenerativa devido à duas características principais, sua capacidade de

autorrenovação e de diferenciação em outros tipos celulares mediante fatores de

crescimento específicos. O cordão umbilical humano tem sido uma fonte interessante

de obtenção deste tipo celular por ser um tecido descartável e de fácil acesso, todavia,

análises citogenéticas realizadas por nosso grupo de pesquisa revelaram que um dos

cordões analisados possuem uma alteração cromossômica constitutiva. O presente

trabalho teve como objetivo geral analisar o perfil proteico de expressão de CTMH

com diferentes cariótipos. Os dados brutos oriundos da espectrometria de massas

previamente realizada foram extraídos utilizando software Scaffold, com ele foi

possível descobrir a quantidade de proteínas presentes nas células com os cariótipos

distintos, além da expressão comparativa de proteínas entre as células. Além disso,

foram utilizadas ferramentas de bioinformática para se descobrir os processos

biológicos e as funções moleculares relacionados a essas proteínas, além da

construção da rede de interação proteína-proteína para se descobrir as proteínas

principais de grupos de proteínas distintos. Foi possível constatar que as células que

possuem a inversão sofreram alterações que levaram a produção de proteínas

relacionadas ao estresse celular, além disso, há possibilidade dessas células se

transformarem em células cancerígenas. Essas análises corroboram para a

importância de se realizar estudos relacionados a instabilidade genética de CTMH,

tendo como parâmetro o perfil proteico de expressão dessas células.

Palavras-chave: Células-tronco; Proteoma; Cordão umbilical; Inversão; Instabilidade

genética.

V

ABSTRACT

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) have been the subject of studies in the field

of regenerative medicine due to its two main characteristics: self-renewal capacity and

the ability to differentiate into other cell types through specific growth factors. Human

umbilical cord has been an interesting source for obtaining these cells for being a

disposable tissue and easily accessible. However, cytogenetic analysis made by our

research group showed that one of the strands have analyzed revealed a

chromosomal change constitutive. The present study had as general objective to

analyze the protein profile of hMSCs expression with different karyotypes. The data

from mass spectrometry were performed using Scaffold software, with it was possible

to discover the amount of protein present in cells with distinct karyotypes, beyond the

comparative expression of proteins between cells. In addition, were used other

bioinformatic tools for discover biological processes and molecular functions related to

these proteins, besides the construction of the protein-protein interaction network to

discover the main proteins of different protein groups. It was possible to verify that the

cells that have an inversion underwent alteration that led to a production of proteins

associated to the cellular stress, in addition, there are possibilities for cells to turn into

cancer cells. These analyzes corroborate the importance of carrying out studies related

to the genetic instability of hMSCs, having as parameter the protein expression profile

of these cells.

Keywords: Stem cells; Proteomic; Umbilical cord; Inversion; Genetic instability.

VI

LISTA DE ABREVIAÇÕES

APC – Adenomatous Polyposis Coli

ATM – Ataxia-telangectasia mutado

BER – Reparo por excisão de bases

CI – Cariótipo invertido

CN – Cariótipo normal

CT – Células-tronco

CT-adultas – Células-tronco adultas

CT-embrionárias – Células-tronco embrionárias

CT-fetais – Células-tronco fetais

CT-hematopoiéticas – Células-tronco hematopoiéticas

CTM – Células-tronco mensenquimais

CTMH – Células-tronco mesenquimais humanas

CTMs-CUh – Células-tronco mesenquimais oriundas do cordão umbilical humano

FMs – Funções moleculares

GSH – Glutationa

MHL1 – MutL Homolog 1

MO – Medula óssea

NAD – Nicotinamida adenina dinucleotídeo

NER – Reparo por excisão de nucleotídeos

PAF – Polipose adenomatosa familiar

PBs – Processos biológicos

RAM – Região de agrupamento de mutação

VCL – Vinculin

VHL – Von Hippel-Lindau supressor de tumor

VII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Fluxograma da metodologia realizada ....................................................... 21

Figura 2: Diagrama de Venn evidenciando a quantificação das proteínas expressas.

..................................................................................................................................22

Figura 3: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionado aos processos

biológicos encontrados ao se fazer a comparação entre as proteínas exclusivas das

células com CI com as exclusivas das células com CN. ........................................... 23

Figura 4: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionado as funções moleculares

encontradas ao se fazer a comparação entre as proteínas exclusivas das células com

CI com as exclusivas das células com CN. ............................................................... 23

Figura 5: Quantidade de proteínas de cada grupo de processo biológico encontrado

ao se fazer a comparação entre as proteínas up reguladas das células com CI e das

células com CN. ........................................................................................................ 24

Figura 6: Quantidade de proteínas de cada grupo de processo biológico encontrado

ao se fazer a comparação entre as proteínas down reguladas das células com CI e

das células com CN. ................................................................................................. 25

Figura 7: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionada as funções moleculares

encontradas ao se fazer a comparação entre as proteínas up reguladas das células

com CI e das células com CN. .................................................................................. 26

Figura 8: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionada as funções moleculares

encontradas ao se fazer a comparação entre as proteínas down reguladas das células

com CI e das células com CN. .................................................................................. 26

Figura 9: Rede de interação proteica das proteínas exclusivas das células com CI

evidenciando a proteína central. Colorações mais próximas de azul indicam valores

menores de degree, enquanto colorações mais próximas de vermelho indicam valores

maiores. Círculos menores indicam valores menores de betweenness, enquanto

círculos maiores indicam valores maiores. ................................................................ 27

Figura 10: Medida de centralidade das proteínas exclusivas das células com CI

evidenciando a proteína com maior valor de degree e betwenness .......................... 27

Figura 11: Rede de interação proteica das proteínas exclusivas das células com CN



VIII



Figura 12: Medida de centralidade das proteínas exclusivas das células com CN

evidenciando a proteína com maior valor de degree e betwenness .......................... 28

Figura 13: Rede de interação proteica das proteínas up reguladas das células com CI





Figura 14: Medida de centralidade das proteínas up reguladas das células com CI

evidenciando as proteínas com maiores valores de degree e betweenness............. 29

Figura 15: Rede de interação proteica das proteínas up reguladas das células com CN

evidenciandos as proteínas centrais. Colorações mais próximas de azul indicam

valores menores de degree, enquanto colorações mais próximas de vermelho indicam

valores maiores. Círculos menores indicam valores menores de betweenness,

enquanto círculos maiores indicam valores maiores ................................................. 30

Figura 16: Medida de centralidade das proteínas up reguladas das células com CN

evidenciando as proteínas com maiores valores de degree e betwenness............... 30

Figura 17: Rede de interação proteica das proteínas down reguladas das células com

CI evidenciando a proteína gargalo. Colorações mais próximas de azul indicam




Figura 18: Medida de centralidade das proteínas down reguladas das células com CI

evidenciando a proteína com maior valor de degree e betweenness ........................ 31

Figura 19: Rede de interação proteica das proteínas down reguladas das células com

CN evidenciando a proteína principal. Colorações mais próximas de azul indicam




Figura 20: Medida de centralidade das proteínas down reguladas das células com CN

evidenciando a proteína com maior valor de degree e betweenness ........................ 32

IX

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Proteínas exclusivas das células com cariótipo invertido .......................... 43

Tabela 2: Proteínas exclusivas das células com cariótipo normal. ............................ 44

Tabela 3: Proteínas presentes nas células com cariótipo invertido e normal

(interseção). .............................................................................................................. 47

SUMÁRIO

RESUMO .............................................................................................................................................. IV

ABSTRACT ........................................................................................................................................... V

LISTA DE ABREVIAÇÕES ............................................................................................................... VI

LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................................... VII

1 – INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 11

1.1 – Células-tronco mesenquimais humanas – breve abordagem ................................ 11

1.2 – Cordão umbilical humano como fonte de células-tronco ....................................... 12

1.3 – Instabilidade genética ....................................................................................................... 13

1.4 – Genes relacionados ao reparo do DNA e supressores tumorais - breves

considerações ............................................................................................................................... 14

1.5 – Proteoma e Biologia de sistemas .................................................................................. 16

2 – OBJETIVOS ................................................................................................................................. 18

2.1 – Objetivos Específicos ....................................................................................................... 18

3 – METODOLOGIA .......................................................................................................................... 19

3.1 – Determinação das proteínas diferencialmente expressas .................................... 19

3.1.2 – Classes funcionais das proteínas ......................................................................... 19

4 – RESULTADOS ............................................................................................................................. 22

4.1 – Análise quantitativa e qualitativa da expressão proteica ...................................... 22

4.2 – Classes funcionais........................................................................................................... 22

4.3 – Biologia de sistemas ....................................................................................................... 27

5 – DISCUSSÃO ....................................................................................................................................... 33

6 – CONCLUSÃO .............................................................................................................................. 37

7 – REFERÊNCIAS............................................................................................................................ 38

8 – APÊNDICE ................................................................................................................................... 43

11

1 – INTRODUÇÃO

1.1 – Células-tronco mesenquimais humanas – breve abordagem

As células-tronco (CT) podem ser definidas segundo três propriedades: auto-

renovação, ou seja, capacidade de originar outra CT com características idênticas;

habilidade de se diferenciar em mais de uma linhagem celular; e capacidade de

originar células funcionais nos tecidos derivados da mesma linhagem. As CT são

células indiferenciadas capazes de se diferenciar originando progenitores maduros,

bem como células efetoras completamente diferenciadas. Além disso, as CT podem

ser classificadas segundo sua potencialidade em toti, pluri ou multipotentes. São

chamadas de totipotentes as células capazes de gerar todos os tipos celulares

embrionários e extra-embrionários; as pluripotentes podem originar todas as células

que formam um embrião (propriamente dito) e são provenientes da massa interna do

blastocisto (CT-embrionárias); são classificadas como multipotentes as células que

originam apenas um subgrupo de linhagens celulares, por exemplo, as CT-

mesenquimais (CTM) e neurais (Revisado por Schwindt et al., 2005).

Pode-se dividir as fontes de CT em três classes: embrionária, fetal e adulta. As

CT-embrionárias (CTE) são derivadas da massa interna do blastocisto cinco dias após

fertilização (em humanos). O uso dos fatores tróficos é essencial, visto que, na sua

ausência, as CTE se diferenciam espontaneamente em todos os tipos de tecidos.

Tem-se as CT-adultas que, ao contrário das CTE, não são capazes de manter suas

propriedades por longos períodos em cultura e podem ser induzidas à diferenciação

com a administração de fatores de crescimento apropriados ou outros sinais externos.

Uma das fontes mais utilizadas para extração de CT-adultas é a medula óssea,

amplamente estudada face ao uso clínico em transplantes. Nesse tecido,

encontramos dois tipos de CT: as hematopoiéticas e as mesenquimais. As CT-

hematopoiéticas são responsáveis por toda progênie granulocítica e mielocítica. Além

da medula óssea, vários outros tecidos possuem suas próprias CTM, como sangue

periférico, tecido adiposo e sangue de cordão umbilical, entre outros. Ao que concerne

as CT-fetais, assim como as adultas, não se diferenciam espontaneamente e ainda

apresentam outras vantagens: estão presentes em abundância por todo o organismo

em desenvolvimento e possuem maior potencial de autorrenovação. Teoricamente,

pode-se isolar CT-fetais de qualquer tecido, desde que a extração ocorra durante a

12

formação destes tecidos no período fetal. No entanto, há importantes questões éticas

envolvidas na extração de tais células de humanos (Revisado por Schwindt et al.,

2005).

Ao que concerne às CTM, é sabido que a existência delas foi inicialmente

sugerida por Cohnheim, há mais de 130 anos. No entanto, foi com os achados de

Friedenstein et al., em meados de 1970, que essa teoria veio a ser comprovada. Eles

encontraram, em uma cultura de células da medula óssea, uma população de células

aderidas ao plástico em forma de fuso, semelhantes a fibroblastos. Observaram

também que essas células possuíam capacidade para se diferenciar em colônias que

lembravam pequenos depósitos de osso ou cartilagem (Revisado por Schwindt et al.,

2005). As CTM são uma linhagem de células-tronco somáticas residentes em regiões

perivasculares de todos os tecidos desenvolvidos (adultos), incluindo a medula óssea

(MO), o tecido adiposo, o tecido muscular, entre outros. Essas células são

multipotentes e capazes de se diferenciar e produzir vários tipos de linhagens

celulares necessárias num processo de reparação, como osteoblastos, condroblastos,

hepatócitos, neurônios, entre outras (Revisado por Monteiro et al., 2010). Por esses

motivos, as células-tronco mesenquimais humanas (CTMH) têm sido alvo de estudos

na área da medicina regenerativa devido à sua capacidade de diferenciação em

diversos tipos celulares e de autorrenovação (Lemischka IR et al., 2005).

1.2 – Cordão umbilical humano como fonte de células-tronco

O cordão umbilical humano tem sido tratado como um resíduo de risco biológico

após o nascimento. Todavia, a literatura tem evidenciado que esse tipo de tecido é

uma fonte mais rica de células-tronco mesenquimais ao se comparar com o sangue

(Revisado por Yun et al., 2016). Além disso, essas células provenientes do cordão

umbilical humano (CTMs-CUh) podem ser usadas sem levantar nenhum problema

ético, já que trata-se de um tecido extraembrionário geralmente descartado. Outros

pontos positivos são que as CTMs-CUh possuem um potencial de diferenciação

multipotente, estreita relação ontogenética com as células-tronco embrionárias e

proliferam mais rapidamente do que as células-tronco mesenquimais adultas

(Revisado por He et al., 2016). Então, por esses motivos, entre outros, o cordão

umbilical humano é uma excelente fonte para se obter células-tronco mesenquimais

que podem ser usadas na área da medicina regenerativa, por exemplo.

13

1.3 – Instabilidade genética

Dados prévios obtidos a partir de uma análise citogenética por bandeamento G

que foi realizada pelo nosso grupo de pesquisa, técnica relevante para detectar

alterações cromossômicas, revelaram uma inversão paracêntrica no braço curto do

cromossomo 3 (3p25–26) das CTMH oriundas de um cordão umbilical.

Inversões cromossômicas podem levar a instabilidade genética. Uma inversão

ocorre quando um único cromossomo sofre duas quebras e é reconstituído com este

mesmo segmento entre os pontos de quebra invertido. As inversões não afetam o

indivíduo fenotipicamente, entretanto, o portador de cada tipo de inversão apresenta

o risco de produzir gametas anormais que podem levar a uma prole desbalanceada,

tanto com a duplicação quanto deficiência de segmentos de cromossomo invertido

(Revisado por Vieira & Ferrari, 2011)

Entre as inversões, há as inversões paracêntricas, que são rearranjos

cromossômicos balanceados envolvendo 2 quebras no mesmo braço cromossômico

seguidos de uma rotação de 180° do segmento cromossômico e sua re-inserção.

Considera-se que a maioria das inversões tem pontos de interrupção únicos. A

incidência em seres humanos é considerada rara, sendo estimada em 0,1-0,5 / 1.000

na população. Em geral, as inversões paracêntricas mais aparentemente balanceadas

parecem ser inofensivas. Entretanto, infertilidade, abortos espontâneos e retardo

mental também foram relatados em alguns portadores desse tipo de inversão.

Portanto, são necessários métodos moleculares citogenéticos para detectar ou

descartar a presença de uma alteração cromossômica desbalanceada, principalmente

quando se trata de células-tronco mesenquimais utilizadas em terapias gênicas. A

maioria das inversões aparentemente balanceadas são geralmente clinicamente

assintomáticas, pois não envolvem uma variação quantitativa do material genético. As

inversões paracêntricas foram descritas em todos os cromossomos humanos, mas

são mais comuns nos cromossomos 1, 3, 5, 6, 7, 11 e 14 (Rigola et al., 2015).

14

1.4 – Genes relacionados ao reparo do DNA e supressores tumorais - breves

considerações

Nosso genoma está exposto continuamente a uma infinidade de agentes que

podem danificar o DNA. As vias de reparo do DNA fazem parte de uma das linhsa de

defesa contra lesões citotóxicas e mutagênicas que ocorrem no DNA. A fim de manter

a integridade do genoma, a maquinaria de reparo do DNA deve ser muito eficiente e

precisa e para tanto, para reconhecer os diferentes tipos de lesões, existem diversas

vias de reparo nomeadas de Mismatch repair, Reparo por excisão de bases (BER),

Reparo por excisão de nucleotídeos (NER), Reparo direto e Reparo por

recombinação. Além disso, deve fazê-lo em uma variedade enorme de diferentes

contextos genômicos, desde atuar dentro da heterocromatina altamente compactada

à lesões expostas na cadeia molde de um gene ativamente transcrito. Falhas nesse

sistema de reparação nesses contextos pode dar origem a mutações que contribuem

para o desenvolvimento de câncer e de outras doenças humanas (Wyrick & Roberts,

2015).

Câncer é uma doença em que as células com alterações genéticas crescem de

forma anormal, invadindo outros tecidos e perdendo sua função original. As causas

primárias ainda não estão muito bem esclarecidas, mas as neoplasias surgem devido

às mutações genéticas espontâneas ou induzidas por agentes patogênicos como

metais, radiações, radicais livres do oxigênio, inflamações crônicas e xenobióticos

(tabaco, álcool, pesticidas, por exemplo) entre outros que promovem desordem no

ciclo celular, ocorrendo excesso na taxa de proliferação e deficiência nas taxas de

morte celular. Este processo culmina com a formação de agrupamentos de clones de

células neoplásicas, ou seja, tumores (Revisado por Fernandes & Mafra, 2005). Os

genes envolvidos com o desenvolvimento câncer são: Ataxia-telangectasia

mutado (ATM) – principal regulador da via de reparo da quebra da cadeia dupla de

DNA após estresse genotóxico (Zhao Y, et al., 2014) –, BRCA – Este gene codifica

uma fosfoproteína nuclear que desempenha um papel na manutenção da estabilidade

genômica, além de atuar como um supressor de tumor –, MutL Homolog 1 (MHL1) –

É um homólogo humano do gene mutL responsável pela reparação do DNA de E.coli,

– XPA – Responsável pelo reconhecimento e reparo de dano do DNA –, APC

(Adenomatous Polyposis Coli) – Este gene codifica uma proteína supressora de

tumor. Também está envolvido em outros processos, incluindo migração celular e

https://www.ufpe.br/biolmol/GenMendel/mutacoes%26reparo.htm#1._Mismatch_repair__

https://www.ufpe.br/biolmol/GenMendel/mutacoes%26reparo.htm#2._Reparo_por_excis%C3%83%C2%A3o_de_bases_(BER)__

https://www.ufpe.br/biolmol/GenMendel/mutacoes%26reparo.htm#2._Reparo_por_excis%C3%83%C2%A3o_de_bases_(BER)__

https://www.ufpe.br/biolmol/GenMendel/mutacoes%26reparo.htm#3._Reparo_por_excis%C3%83%C2%A3o_de_nucleot%C3%83%C2%ADdeos_(NER)__

https://www.ufpe.br/biolmol/GenMendel/mutacoes%26reparo.htm#4._Reparo_direto__

https://www.ufpe.br/biolmol/GenMendel/mutacoes%26reparo.htm#5.Reparo_por_recombina%C3%83%C2%A7%C3%83%C2%A3o_

https://www.ufpe.br/biolmol/GenMendel/mutacoes%26reparo.htm#5.Reparo_por_recombina%C3%83%C2%A7%C3%83%C2%A3o_

15

adesão, ativação transcricional e apoptose –, RB – A proteína codificada por este gene

é um regulador negativo do ciclo celular e foi o primeiro gene supressor tumoral

encontrado. Os defeitos neste gene são uma das causas do câncer retinoblastoma na

infância –, TP53 (P53 Supressor de tumor) – Este gene codifica uma proteína

supressora de tumor contendo domínios de ativação transcricional, ligação ao DNA e

oligomerização -, VHL (Von Hippel-Lindau supressor de tumor) – Defeitos neste gene

causam a polipose adenomatosa familiar (PAF), uma doença pré-maligna

autossômica dominante que geralmente progride para malignidade. As mutações

associadas à doença tendem a ser agrupadas numa pequena região designada região

de agrupamento de mutação (MCR) e resultam numa proteína truncada

(http://www.genecards.org).

Ao que concerne ao desenvolvimento de tumores, o que ocorre é que nas

células cancerosas há o silenciamento dos genes supressores de tumor. Ocorrem

mutações de perda de função no locus onde há esses genes supressores de tumor.

As deleções, inserções, mutações nonsense (quando um códon de resíduo de

aminoácido é substituído por um códon de terminação) mutações frame-shift (inserção

ou a deleção de pares de nucleótideos), mutações missense (substituição de

nucleotídeo que resulta em troca de aminoácido) ou alterações epigenéticas (O termo

epigenética significa “em adição à informação genética codificada no DNA” e é

utilizado para definir alterações que ocorrem na expressão gênica sem, no entanto,

ocorrer nenhuma alteração na sequência do código genético) (Revisado por Costa, E.

B. O.; Pacheco, C. 2013) que inativam a atividade funcional de uma proteína são todas

observadas em genes supressores de tumor. Na maioria dos genes supressores de

tumor, tais como RB, ambos os alelos do gene devem ser inativados para ocorrer a

tumorigênese. Em outros genes supressores de tumor, tais como TP53 e PTEN, uma

mutação num único alelo pode ser suficiente para dar origem a um fenótipo celular

alterado, resultando em diminuição da função supressora de tumor, acarretando no

desenvolvimento e progressão de tumores (Liu et al., 2012). Portando, modificações

tanto nos genes relacionados ao reparo do DNA quanto alterações ligadas aos genes

supressores de tumor, podem levar ao desenvolvimento de patologias nos indivíduos

que as portam. Na região da inversão encontrada nas CTMH do cordão umbilical,

estão presentes genes relacionados com o reparo do DNA e os genes supressores

de tumor.

16

1.5 – Proteoma e Biologia de sistemas

Proteoma não é apenas a soma dos produtos traduzidos a partir das

sequências genômicas, mas inclui também proteínas resultantes de processos pós-

transcricionais e pós-traducionais, bem como complexos formados por essas

biomoléculas. Além de sua grande complexidade, o proteoma é dinâmico e seu perfil

se altera de acordo com o status fisiológico e as fases da diferenciação celular.

Algumas estimativas sugerem que mais de um milhão de diferentes tipos de proteínas

estão presentes nas células, nos tecidos e nos fluidos corporais em condições e/ou

momentos distintos. O termo proteômica refere-se ao estudo do conjunto dessas

moléculas, que são responsáveis direta ou indiretamente pelo controle de todos ou

quase todos os processos biológicos (Revisado por Barbosa et al., 2012). A

proteômica estuda de forma descritiva e quantitativa desde o conjunto de proteínas

de uma organela subcelular até aquelas de um ecossistema, suas variações na

população, mudanças em resposta a um ambiente ou decorrentes do

desenvolvimento normal ou alterado, e modificações e interações com outras

proteínas (Valledor & Jorrin, 2011).

Para se realizar o estudo da proteômica, pode-se consultar as anotações de

proteínas com dados da literatura que estão acessíveis através da base de dados de

proteínas Uniprot (www.uniprot.org) e as suas funções respectivas podem ser

acessadas na base sistemática de proteínas Gene Ontology (GO)

(www.geneontology.org) (The-Gene-Ontology-Consortium, 2015) (Revisado porr

Palmfeldt & Bross, 2016).

Numa análise proteômica quantitativa do perfil de expressão diferencial de

proteínas de superfície de CTMH comerciais submetidas à diferenciação em

osteoblastos, foi encontrado um total de 463 proteínas (Foster et al., 2005). Em outro

experimento no qual também foi realizada a análise quantitativa de proteínas de

superfícies, todavia utilizando CTMH oriundas da medula óssea, foi encontrado um

total de 1,001 proteínas (Lee et al., 2013). Em outro experimento no qual também foi

realizada uma análise proteômica tendo CTMH oriundas da medula óssea e do tecido

nervoso como fontes, verificou-se um total 1664 – 607 oriundas das CT da MO e 1052

proteínas oriundas das CT do tecido nervoso (Bryukhovetskiy et al., 2014).

A Biologia de Sistemas é uma ferramenta que permite através da construção

de modelos matemáticos, simulações e técnicas de processamento de dados, a

17

integração de informações das ciências ômicas e dados clínico-epidemiológicos de

forma que se consiga um maior entendimento das interações entre os componentes

dos sistemas vivos e de seus processos biológicos (Revisado por Mesquita et al.,

2013). Na proteômica, a Biologia de sistemas é uma ferramenta utilizada para se

construir a rede de interação proteína-proteína com o objetivo de se entender

justamente as interações existentes entre essas moléculas.

Portanto, para a análise dos possíveis efeitos da inversão paracêntrica

apresentada nas CTMH do cordão umbilical, em nível proteico, foi utilizada a

proteômica aliada à biologia de sistemas.

18

2 – OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivo geral analisar o perfil de expressão de

células-tronco mesenquimais humanas com diferentes cariótipos.

2.1 – Objetivos Específicos

Identificar, a partir de dados de Espectrometria de Massas, o perfil proteico de

células-tronco mesenquimais oriundas da veia do cordão umbilical humano

com cariótipo invertido e com cariótipo normal;

Identificar as proteínas “up” e “down” reguladas;

Identificar as classes funcionais das proteínas;

Realizar uma análise de Biologia de Sistemas.

19

3 – METODOLOGIA

3.1 – Determinação das proteínas diferencialmente expressas

O cultivo das células com cariótipo normal e invertido, extração proteica,

caracterização em gel de acrilamida (SDS-PAGE) foram realizados previamente no

LBMG/UFRN. O extrato proteico foi enviado ao Laboratório de Espectrometria de

Massas do Laboratório Nacional de Biociências, CNPEM-ABTLuS da UNICAMP, para

a análise de espectrometria de massas pelo espectrômetro Q-Tof.

Os dados gerados pela espectrometria de massas foram então usados no

presente trabalho.

Para averiguar a expressão das proteínas foi utilizado o software Scaffold

(http://www.proteomesoftware.com/products/scaffold/). Com essa ferramenta, é

possível ler os dados brutos oriundos da espectrometria de massas. Ele gera uma

lista com a quantidade e com os nomes das proteínas e o valor de Fold Change. Este

valor revela o aumento na expressão de uma determinada proteína – de um tipo

celular em relação ao outro. Portanto, foi possível observar quais e quantas proteínas

foram expressas nos dois tipos celulares analisados (células com cariótipo normal

(CN), células com cariótipo invertido (CI) de forma exclusiva ou em ambas). Além

disso, o software em questão atribui um número de identifcação próprio (gi number ou

IDs) para cada proteína.

3.1.2 – Classes funcionais das proteínas

Por meio da lista gerada pelo software Scaffold, foram selecionados os IDs das

proteínas exclusivas das células com CN, juntamente com os IDs das proteínas up

reguladas dessas mesmas células (grupo de proteínas utilizado para se descobrir as

funções moleculares (FMs) e os processos biológicos (PBs) das proteínas up

reguladas das células com CN). Também foram selecionados os IDs das proteínas

exclusivas das células com CN com os IDs das proteínas down reguladas dessas

mesmas células (grupo de proteínas utilizado para se descobrir as FMs e os PBs das

proteínas down reguladas das células com CN). Esses mesmos passos foram

repetidos para as células com CI. Também foram selecionados os IDs exclusivos das

http://www.proteomesoftware.com/products/scaffold/)

20

células com CI, assim como os IDs exclusivos das células com CN para se fazer a

comparação entre esses dois grupos de proteínas.

Os IDs foram convertidos pela ferramenta de conversão de IDs em Uniprot

(http://www.uniprot.org/uploadlists/) para a conversão dos números de identificação

gerados pelo Scaffold para números de identificação compatíveis com a ferramenta

String

Para se descobrir as classes funcionais das proteínas pela ferramenta String

(http://string-db.org/cgi/input.pl), primeiramente foi utilizada a ferramenta de

conversão de IDs em Uniprot (http://www.uniprot.org/uploadlists/) para a conversão

dos números de identificação gerados pelo Scaffold para números de identificação

compatíveis com a ferramenta String. Esse processo levou a formação de 6 listas –

proteínas up e down reguladas das células com CI e proteínas up e down reguladas

das células com CN, além da lista das proteínas exclusivas das células com CI e

exclusivas das células com CN.

As 6 listas geradas com os dados de identificação compatíveis foram

importadas para a ferramenta String, onde se acessaram os PBs e as FMs das

proteínas envolvidas. Para cada lista foram geradas mais duas com os dados dos PBs

e das FMs, portanto, 12 listas.

Em seguida, foi utilizada a ferramenta REVIGO (http://revigo.irb.hr/) para filtrar

os termos redundantes das listas e para se poder visualizar os grupos de proteínas

mais expressos. Com os dados gerados pela ferramenta, foi feita a comparação dos

PBs e das FMs existentes entre as proteínas up reguladas das células com CI e CN,

além das proteínas down reguladas e entre as proteínas exclusivas das células com

CI e as exclusivas das células com CN.

Por fim, foi feito o estudo da Biologia de Sistemas. As redes geradas na

ferramenta String foram exportadas para a ferramenta Cytoscape

(http://www.cytoscape.org/) para a identificação das medidas de centralidade –

quando a proteína apresenta os maiores valores de betweenness (quantidade de

caminhos mais curtos que passam pela proteína) e degree (quantidade de conexões

que a proteína faz com as outras) – e com isso identificar as proteínas centrais ou

proteínas gargalo, que são justamente as proteínas com maiores valores de

centralidade.

http://www.uniprot.org/uploadlists/)

http://string-db.org/cgi/input.pl)

http://string-db.org/cgi/input.pl)

http://www.uniprot.org/uploadlists/)

http://revigo.irb.hr/)

http://www.cytoscape.org/)

21

Figura 1: Fluxograma da metodologia realizada.

.

22

4 – RESULTADOS

4.1 – Análise quantitativa e qualitativa da expressão proteica

Foi encontrado um total de 324 proteínas expressas, sendo que 15 foram

expressas apenas nas células com CI (Apêndice, Tabela 1), 43 foram expressas

apenas nas células com CN (Apêndice, Tabela 2) e 266 foram expressas em ambas

as células (Apêndice, Tabela 3) (Fig. 2). Além disso, das 266 proteínas da interseção,

156 proteínas foram suberexpressas nas células com CI comparando-se às células

com CN e 91 foram superxpressas fazendo a mesma comparação.

Figura 2: Diagrama de Venn evidenciando a quantificação das proteínas expressas.

4.2 – Classes funcionais

Ao se fazer a comparação dos PBs e das FMs entre os grupos de proteínas

exclusivas das células com CI com as exclusivas das com CN, foram observados dois

PBs centrais: organização do citoesqueleto – processo encontrado nas células com

CI – e organização do citoesqueleto – processo encontrado nas células com CN –

(Fig. 3). Quando foi realizada a comparação das FMs, também foram encontrados

apenas dois grupos: constituição do citoesqueleto – função encontrada nas células

com CI – e ligação ao RNA – função encontrada nas células com CN – (Fig. 4).

CI CN

15 266 43

23

Processos Biológicos

CN

CI

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Organização do citoesqueleto Transporte intracelular

Figura 3: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionado aos processos biológicos encontrados

ao se fazer a comparação entre as proteínas exclusivas das células com CI com as exclusivas das

células com CN.

Figura 4: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionado as funções moleculares encontradas ao

se fazer a comparação entre as proteínas exclusivas das células com CI com as exclusivas das células

com CN.

Ao se fazer a comparação entre as proteínas up reguladas das células com CI

e CN encontradas, levando em consideração os PBs, foram observados apenas

processos gerais as quais as proteínas estavam relacionadas. Foram encontrados

grupos de proteínas relacionados a regulação negativa dos processos biológicos,

regulação negativa dos processos celulares, regulação da qualidade dos processos

biológicos, regulação dos processos apoptóticos, resposta ao estresse e resposta a

estímulos. Sendo estes encontrados apenas nas células com CI. Além desses, foram

encontrados os seguintes PBs: inibição da tradução, regulação da morte celular,

Funções Moleculares

CN

CI

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Ligação ao RNA Constituição do citoesqueleto

24

regeneração teidual, resposta a lesão tecidual e regulação dos fluidos corporais.

Processos estes encontrados apenas nas células com CN (Fig. 5).

Figura 5: Quantidade de proteínas de cada grupo de processo biológico encontrado ao se fazer a

comparação entre as proteínas up reguladas das células com CI e das células com CN.

Ao se fazer uma comparação similar, todavia dos grupos de proteínas down

reguladas, também foram encontrados processos muito gerais. Os PBs relacionados

a resposta a lesão tecidual, regenaração tecidual e proteínas de ligação foram

encontrados apenas nas células com CI. Já os processos relacionados a resposta a

estímulos, regulação negativa dos processos biológicos, regulação dos fluidos

corporais, regulação dos processos do sistema imune e regulação da qualidade

biológica foram encontrados apenas nas células com CN. Dos 10 processos

biológicos encontrados nas proteinas down reguladas, apenas 2 são comuns aos dois

tipos celulares, processos de regulação negativa dos processos celulares e regulação

dos processos apoptóticos. Sendo que há uma quantidade maior de proteínas nas

células com CI que estão relacionadas a esses processos aos se comparar as

proteínas presentes nas células com CN (Fig. 6).

Processos Biológicos - UP

Regulação negativa dos processos biológicos

Regulação negativa dos processos celulares

Regulação da qualidade do processos biológicos

Regulação dos processos apoptóticos

Resposta ao estresse

Resposta a estímulos

Inibição da tradução

Regulação da morte celular

Regeneração tecidual

Resposta a lesão tecidual

Regulação dos fluidos corporais

0 10 20 30 40 50 60

CN CI

25

Figura 6: Quantidade de proteínas de cada grupo de processo biológico encontrado ao se fazer a

comparação entre as proteínas down reguladas das células com CI e das células com CN.

Ao que concerne as FMs, também foram encontrados grupos de proteínas com

funções bem gerais, seja quando se faz a comparação das proteínas up ou down

reguladas.

Ao fazer a comparação das FMs encontradas das proteínas up reguladas,

foram encontrados grupos de proteínas relacionados a ativação de moléculas

estruturais e constituintes do citoesqueleto apenas nas células com cariótipo CI e um

grupo de enzimas de ligação apenas nas células com CN. Também foi possível

observar que há uma quantidade maior de proteínas de ligação ao RNA de maneira

geral nas células com CN ao se comparar às células com CI, havendo mais do que o

dobro de proteínas relacionadas a essas funções nas células com CN (Fig. 7).

Processos Biológicos - Down

Resposta a lesão tecidual

Regeneração tecidual

Proteinas de ligação

Resposta a estímulos

Regulação negativa dos processos biológicos

Regulação negativa dos processos celulares

Regulação dos fluidos corporais

Regulação dos processos do sistema imune

Regulação da qualidade biológica

Regulação dos processos apoptóticos

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

CI CN

26

Figura 7: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionada as funções moleculares encontradas ao

se fazer a comparação entre as proteínas up reguladas das células com CI e das células com CN.

Já ao se comparar os grupos de proteínas down reguladas encontrados

relacionados as FMs, observou-se uma ativação de moléculas estruturais apenas nas

células com CN. Além disso, observou-se uma quantidade maior de de proteínas de

ligação ao RNA nas células com CI ao se comparar às células com CN (Fig. 8).

Figura 8: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionada as funções moleculares encontradas ao

se fazer a comparação entre as proteínas down reguladas das células com CI e das células com CN.

Não foi encontrado nenhum grupo de proteínas que indicasse que houve

alguma alteração na supressão tumoral ou no reparo de DNA (região do cromossomo

3 onde houve a inversão) em nenhuma das comparações realizadas, nem no cenário

de comparação entre as proteínas up ou down reguladas.

Função Molecular - UP

Ativação de moléculas estruturais

Constituintes estruturais do citoesqueleto

Enzimas de ligação

Ligação ao cauda poly (A) RNA

Ligação ao RNA

0 10 20 30 40 50 60 70

CI CN

Função Molecular - DOWN

Ligação a cauda poly (A) RNA

Ligação ao RNA

Moléculas estruturais ativadas

0 10 20 30 40 50 60

CI CN

27

4.3 – Biologia de sistemas

Quando se construiu a rede de interação proteica das proteínas exclusivas das

células com CI, a proteína KRT16 foi constatada como a principal da rede (Fig. 9), fato

confirmado pelo gráfico de medida de centralidade, que levou em consideração os

maiores valores de degree (quantidade de conexões que a proteína faz com as outras)

e betweennes (quantidade de caminhos mais curtos que passam pela proteína), (Fig.

10).

Figura 9: Rede de interação proteica das proteínas exclusivas das células com CI evidenciando a

proteína central. Colorações mais próximas de azul indicam valores menores de degree, enquanto

colorações mais próximas de vermelho indicam valores maiores. Círculos menores indicam valores

menores de betweenness, enquanto círculos maiores indicam valores maiores.

Figura 10: Medida de centralidade das proteínas exclusivas das células com CI evidenciando a

proteína com maior valor de degree e betwenness.

Degree

Beetweenness

28

Ao se construir a rede de interação proteica das proteínas exclusivas das

células com CN, a proteína RHOA foi observada como a principal da rede (Fig. 11),

fato confirmado pelo gráfico de medida de centralidade (Fig. 12).

Figura 11: Rede de interação proteica das proteínas exclusivas das células com CN evidenciando a

proteína central. Colorações mais próximas de azul indicam valores menores de degree, enquanto



Figura 12: Medida de centralidade das proteínas exclusivas das células com CN evidenciando a

proteína com maior valor de degree e betwenness.

Degree

Beetweenness

29

Ao se fazer a construção da rede das proteínas up reguladas das células com

CI foi observada uma proteína (GAPDH) em destaque com maior centralidade, além

proteína VCL, todavia com menor centralidade (Fig. 13) e no gráfico de medida de

centralidade foi possível confirmá-la como uma proteína gargalo (Fig. 14).

Figura 13: Rede de interação proteica das proteínas up reguladas das células com CI evidenciando

a proteína central. Colorações mais próximas de azul indicam valores menores de degree, enquanto



Figura 14: Medida de centralidade das proteínas up reguladas das células com CI evidenciando as

proteínas com maiores valores de degree e betweenness.

Degree

Beetweenness

VCL

30

Ao se fazer a construção da rede das proteínas up reguladas das células com

CN, foram observadas duas proteínas com maior centralidade: CCT3 e DECR1 (Fig.

15). Com a construção do gráfico de medida de centralidade foi possível confirmar

essas proteínas como centrais ou proteínas gargalo da rede de interação (Fig. 16).

Figura 15: Rede de interação proteica das proteínas up reguladas das células com CN evidenciandos

as proteínas centrais. Colorações mais próximas de azul indicam valores menores de degree, enquanto



Figura 16: Medida de centralidade das proteínas up reguladas das células com CN evidenciando as

proteínas com maiores valores de degree e betwenness.

Foi observada na rede de interações das proteínas down reguladas das células

com CI que a proteína UBC é a central da rede (Fig. 17) e que possui os maiores

valores de degree e betweenness (Fig. 18).

Degree

Beetweenness

31

Figura 17: Rede de interação proteica das proteínas down reguladas das células com CI evidenciando

a proteína gargalo. Colorações mais próximas de azul indicam valores menores de degree, enquanto



Figura 18: Medida de centralidade das proteínas down reguladas das células com CI evidenciando a

proteína com maior valor de degree e betweenness.

Por fim, na rede de interações das proteínas down reguladas das células com

CN, também foi encontrada a proteína GAPDH como proteína gargalo (Fig.19), fato

evidenciado no gráfico de medida de centralidade (Fig. 20).

Degree

Beetweenness

32

Figura 19: Rede de interação proteica das proteínas down reguladas das células com CN evidenciando

a proteína principal. Colorações mais próximas de azul indicam valores menores de degree, enquanto



Figura 20: Medida de centralidade das proteínas down reguladas das células com CN evidenciando a

proteína com maior valor de degree e betweenness.

Degree

Beetweenness

33

5 – DISCUSSÃO

Ao se comparar a quantidade de proteínas encontrada no presente trabalho

com os dados da literatura, observou-se que mesmo quando se realizou a proteômica

apenas das proteínas de superfície de CTMH, a quantidade de proteínas detectada

em outros trabalhos foi maior, como nos trabalhos de Foster e colaboradores (2005)

– 463 proteínas – e Lee e colaboradores (2013) – 1,001 proteínas. Em um trabalho

realizado por Bryukhovetskiy e colaboradores (2014), foi feita a proteômica das células

como um todo de duas fontes de obtenção diferentes e as quantidades de proteínas

encontradas também foram maiores – 607 (proteínas de CT da MO) e 1052 (proteínas

de CT do tecido nervoso). Todavia, para cada experimento desse foi utilizado um

espectrômetro distinto com fontes de ionização diferentes. Provavelmente, esse fato

justifica a quantidade menor de proteínas encontrada na presente análise, pois os

espectrômetros distintos possuem poder de resolução também diferentes.

A organização do citoesqueleto (principal processo biológico encontrado ao se

analisar as proteínas exclusivas das CT com CI) e a constituição do citoesqueleto

(principal função molecular das proteínas exclusivas das CT com CI) provavelmente

indicam as alterações na expressão gênica que ocorrem nas CT para que elas possam

dar origem a uma linhagem celular completamente diferente. Uma das maneiras disso

ocorrer é quando há a transdiferenciação direta, que é quando a célula altera seu

citoesqueleto e sua síntese proteica para rediferenciar-se em outro tipo celular

específico (Revisado por Monteiro et al., 2010). Apesar desse fato, a função e o

processo que foram citados são comuns a todas às CT, independentemente desse

tipo de célula ter o CI ou CN.

Ao se consultar a tabela das proteínas exclusivas das CT com CI, verifica-se a

presença do antígeno 1 do carcinoma de células escamosas (SCC1). O SCC1 foi

encontrado superexpresso em tumores epiteliais de alguns órgãos, incluindo língua,

esôfago, colo uterino e pele, por exemplo (Revisado por J. Liu et al., 2015). Há a

possibilidade dessas CT terem começado a se diferenciar em CT tumorais devido a

inversão.

O principal processo biológico encontrado ao se analisar o grupo de proteínas

exclusivas das CT com CN foi o transporte celular. As proteínas sintetizadas que vão

auxiliar no processo de diferenciação celular das CT, por exemplo, precisam ser

transportadas para esse que elas atuem no RNA (Tsai et al., 2015). O que está de

34

acordo com a principal função molecular das proteínas exclusivas dessas células

(ligação ao RNA). Provavelmente, isso indica o processo de diferenciação celular, pois

há várias proteínas que se ligam ao RNA das CT com a finalidade de levar a produção

de proteínas que vão ocasionar nessa ação (Kwon et al., 2013).

Provavelmente, devido ao número de proteínas encontrado, não se pode

verificar grupos de proteínas com funções mais específicas, pois nos diferentes

cenários – comparação entre as proteínas up ou down reguladas – foram observados

de maneira geral PBs e FMs que são normalmente presentes em qualquer célula.

Apesar disso, foram encontrados PBs relacionados a regeneração celular e a lesão

tecidual em ambos os tipos de células e a resposta ao estresse celular apenas nas

células com CI, indicando assim, que essas células foram submetidas a um estresse

bem maior ao se comparar às células com CN.

Na análise de Biologia de Sistemas das proteínas exclusivas das células com

CI foi observado que a proteína KRT16 foi a principal. A proteína codificada pelo gene

KRT16 é um membro da família de genes da queratina. As queratinas são filamentos

intermediários de proteínas responsáveis pela integridade estrutural das células

epiteliais e são são subdivididas em citoqueratinas e queratinas capilares

(http://www.genecards.org). Provavelmente a presença dessa proteína nas análises

foi devido a contaminação.

Já ao se analisar a rede de interação das proteínas exclusivas das células com

CN, verificou-se que a proteina principal é a RHOA. Essa proteína é um membro da

família Rho GTPase. Ela tem sido relatada como uma reguladora de várias atividades

biológicas, incluindo a formação de fibras de estresse, transcrição gênica, transporte

de membrana e adesões, por exemplo (Revisado por Li, Chen & Xu, 2011). Esse fato

indica que as células-tronco estavam exercendo suas atividades normalmente.

Provavelmente estava havendo transcrição gênica para ocorrer a síntese de proteínas

necessárias para o desenvolvimento e sobrevivências dessas células. Essas células

aderem umas as outras com facilidade, o que também justifica a proteína RHOA como

gargalo dessa rede.

Ao se realizar a análise tanto do grupo de proteínas up reguladas das células

com CI e down reguladas das células com CN, foi verificado que a proteína gargalo

dessas duas redes de interação é a GAPDH. Essa proteína é uma enzima que possui

papel importante na glicólise. No metabolismo da glicose, ela catalisa a fosforilação

de gliceraldeído-3-fosfato a 1,3-bisfosfoglicerato utilizando nicotinamida adenina

http://www.genecards.org/

35

dinucleotídeo (NAD) como um cofator. Evidências experimentais recentes sugerem

que para além das funções glicolíticas, GAPDH é na realidade uma proteína

multifuncional que tem sido relatada com tais funções: regula a expressão/transcrição

de genes, possui atividade de quinase/fosfotransferase, facilita o transporte vesicular,

bem como interage com um número de pequenas moléculas-chave, incluindo

ribozimas, glutationa (GSH), p53 e óxido nítrico, por exemplo (Revisado por El Kadmiri

et al., 2014). A outra proteína de destaque da rede de interação das proteínas up

reguladas das células com CI é a VCL (Vinculin). VCL é uma proteína que se liga à

actina, além disso está associada à membrana e é encontrada nas junções célula-

célula e célula-matriz. Uma das principais características de VCL é a sua capacidade

de montar o citoesqueleto de actina e o ancorar à membrana celular através de

integrinas (Revisado por Zemljic-Harpf et al., 2014). Isso indica justamente a atividade

de adesão que há entre as células-tronco e dessas células com a matriz extracelular.

Já ao se realizar a análise da rede de interação das proteínas up reguladas das

células com CN, as proteínas CCT3 e DECR1 foram caracterizadas como proteínas

gargalos. CCT3 é uma subnunidade proteíca que faz parte do grupo dois de

chaperoninas, essas estão presentes nas células de eucariotos. Chaperoninas

utilizam a energia de hidrólise de ATP para aumentar a eficiência das reações que

ajudam as proteínas a atingirem as respectivas conformações funcionais. O grupo de

chaperoninas no qual está incluída a subunidade CCT3 possui papel especializado in

vivo na dobra da actina, da tubulina, e de outras proteínas essenciais, incluindo as

reguladores da divisão celular e da formação do citoesqueleto (Revisado por Nadler-

Holly et al., 2012). Uma das doenças envolvidas com a proteína em questão inclui a

Ataxia espinocerebelar.

A proteína gargalo DECR1 é uma enzima chave envolvida na via auxiliar da

oxidação de ácidos graxos. DECR 1 catalisa a etapa que limita a velocidade em um

processo que prepara os ácidos graxos poli-insaturados para serem utilizados como

substratos para a beta oxidação. A deficiência de DECR1 em seres humanos é letal,

devido ao acúmulo de intermediários de ácidos graxos por causa da beta oxidação

incompleta (Revisado por Ursini-Siegel et al., 2007).

Por fim, a proteína UBC foi constatada como a proteína gargalo da rede de

interações das proteínas down reguladas das células com CI. Trabalhos da literatura

indicam que o gene UBC é o principal contribuinte na produção de ubiquitina extra

durante situações de estresse celular e que a perda da sua função não pode ser

36

compensada pela indução dos outros genes Ub. A indução da transcrição do gene da

ubiquitina durante o estresse ocorre para proporcionar uma fonte extra de ubiquitina

necessária para remover as proteínas danificadas (Revisado por Crinelli et al., 2015).

A diminuição de ubiquitina leva a consequente diminuição da destruição de proteínas

que não exercem mais função ou que são defeituosas ou que são codificadas por

vírus, por exemplo, pelas proteases.

Recentes estudos relataram aberrações cromossômicas, imortalização e

transformação maligna de CTM frescas isoladas de humanos e ratos, por exemplo,

após um período considerável de expansão in vitro (Revisado por Duarte et al., 2012).

37

6 – CONCLUSÃO

Os resultados mostraram que a inversão paracêntrica induziu algum tipo de

estresse nas CTMH, devido a quantidade de proteínas up reguladas nas células com

CI relacionadas a resposta ao estresse. Somando-se a isso, há a presença do

antígeno 1 do carcinoma de células escamosas (SCC1) produzido apenas nesse tipo

de célula. Portanto, há indícios de que a inversão ocasionou uma instabilidade

genética, fazendo com que as células que a possuem produzam proteínas

necessárias para que sobrevivam ao estresse gerado pela instabilidade, além disso,

essa instabilidade talvez aumente a possibilidade dessas células de se tornarem

cancerígenas. Outro ponto relevante, é a diminuição da quantidade da proteína que

leva a marcação de proteínas defeituosas, isso pode ser um indicativo de dano nas

atividades das células com a inversão.

Esses dados podem auxiliar futuros estudos que tenham como objetivo a

análise da estabilidade genética de CTMH tendo como referência o perfil proteico

dessas células.

38

7 – REFERÊNCIAS

A., Vieira, S. R., & Ferrari, L. P. (2011). Investigação De Alterações Citogenéticas Em

Abortos Espontâneos : Um Retrospecto De 2006 a 2011 Investigation of Alterations in

Spontaneous Miscarriages : a Retrospect From 2006 To 2011, 1–20.

Ashburner et al. Gene ontology: tool for the unification of biology (2000) Nat

Genet 25(1):25-9.

Barabasi AL, Gulbahce N, Loscalzo J. Network medicine: a network-based approach

to human disease. Nat Rev Genet. 2011;12(1):56-68

Bryukhovetskiy, A., Shevchenko, V., Kovalev, S., Chekhonin, V., Baklaushev, V.,

Bryukhovetskiy, I., & Zhukova, M. (2014). To the Novel Paradigm of Proteome-Based

Cell Therapy of Tumors: Through Comparative Proteome Mapping of Tumor Stem

Cells and Tissue-Specific Stem Cells of Humans. Cell Transplantation, 23(1), S151–

S170. https://doi.org/10.3727/096368914X684907.

Bydlowski S.P., Debes A. A., Maselli L. M. F., Janz F. L. Biological characteristics of

mesenchymal stem cells. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia.; 2009;

31(Supl. 1).

Costa, E. B. O.; Pacheco, C., Semina: Ciências Biológicas e da Saúde, Londrina, v.

34, n. 2, p. 125-136, jul./dez. 2013. DOI: 10.5433/1679-0367.2013v34n2p125.

Crinelli, R., Bianchi, M., Radici, L., Carloni, E., Giacomini, E., & Magnani, M. (2015).

Molecular dissection of the human ubiquitin C promoter reveals heat shock element

architectures with activating and repressive functions. PLoS ONE, 10(8), 1–18.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0136882.

Duarte, Denise M ; Cornélio, Déborah A ; Corado, Carolina ; Medeiros, Viviane KS ;

da Costa Xavier de Araújo, Luíza A ; Cavalvanti, Geraldo B ; de Medeiros, Silvia RB .

Chromosomal characterization of cryopreserved mesenchymal stem cells from the

human subendothelium umbilical cord vein. Regenerative Medicine (Print) , v. 7, p.

147-157, 2012.

El Kadmiri, N., Slassi, I., El Moutawakil, B., Nadifi, S., Tadevosyan, A., Hachem, A., &

http://lattes.cnpq.br/5882662534904226

39

Soukri, A. (2014). Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and

Alzheimer’s disease. Pathologie Biologie, 62(6), 333–336.

https://doi.org/10.1016/j.patbio.2014.08.002.

Fang L, Choudhary S, Zhao Y, et al. ATM regulates NF-κB-dependent immediate-early

genes via RelA Ser 276 phosphorylation coupled to CDK9 promoter

recruitment. Nucleic Acids Research. 2014;42(13):8416-8432.

doi:10.1093/nar/gku529.

Fernandes, A. G., & Mafra, D. (2005). Zinco e câncer: uma revisão. Revista

Saúde.Com, 1(2), 144–156.

Foster, L. J., Zeemann, P. a, Li, C., Mann, M., Jensen, O. N., & Kassem, M. (2005).

Differential expression profiling of membrane proteins by quantitative proteomics in a

human mesenchymal stem cell line undergoing osteoblast differentiation. Stem Cells,

23(9), 1367–1377. https://doi.org/10.1634/stemcells.2004-0372.

He, D., Zhang, Z., Lao, J., Meng, H., & Han, L. (2016). Proteomic Analysis of the Peri-

Infarct Area after Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Transplantation in

Experimental Stroke, 7(5), 623–634.

Kwon, S. C., Yi, H., Eichelbaum, K., Föhr, S., Fischer, B., You, K. T., … Kim, V. N.

(2013). The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural

& Molecular Biology, 20(9), 1122–30. https://doi.org/10.1038/nsmb.2638.

Lee, S. K., Kim, J. H., Kim, S.-S., Kang, T., Park, N. H., Kwon, K.-H., … Park, Y. M.

(2013). Profiling and semiquantitative analysis of the cell surface proteome in human

mesenchymal stem cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 405, 5501–17.

https://doi.org/10.1007/s00216-013-6969-z.

Lemischka IR. Stem cell biology: a view toward the future. Ann N Y Acad Sci.

2005;1044:132-8.

Li, Y., Chen, Y., & Xu, J. (2011). Factors influencing RhoA protein distribution in the

nucleus. Molecular Medicine Reports, 4(6), 1115–1119.

https://doi.org/10.3892/mmr.2011.556.

40

Liu, J., Gao, Y., Yang, B., Jia, X., Zhai, D., Li, S., … Wang, Y. (2015). Overexpression

of squamous cell carcinoma antigen 1 is associated with the onset and progression of

human hepatocellular carcinoma. Archives of Medical Research, 46(2), 133–141.

https://doi.org/10.1016/j.arcmed.2015.03.003.

Liu, R., Kain, M., & Wang, L. (2012). cancer, 463–481.

Lusis AJ, Weiss JN. Cardiovascular networks: systems-based approaches to

cardiovascular disease. Circulation. 2010;121(1):157-70.

Maclellan WR, Wang Y, Lusis, AJ.Systems-based approaches to cardiovascular

disease. Nat Rev Cardiol. 2012;9(3):172-84.

Mateos J., Pernas P. F., Labora J. F., Blanco F., Arufe M. D C. Proteomic Applications

in the Study of Human Mesenchymal Stem Cells. Proteomes 2014, 2, 53-71;

doi:10.3390/proteomes2010053.

Mesquita E. T., Jorge A. J. L., Junior C. V. S., Cassino J. P. P. Systems Biology Applied

to Heart Failure With Normal Ejection Fraction. Arq Bras Cardiol. 2014; 102(5):510-

517.

Mesquita, E. T., Jose, A., Jorge, L., Vale, C., Junior, D. S., Paulo, J., & Cassino, P.

(2013). Review Article Systems Biology Applied to Heart Failure With Normal Ejection

Fraction. Stroke, 510–517. https://doi.org/10.5935/abc.20140062.

Monteiro, B. S., Argolo Neto, N. M., & Del Carlo, R. J. (2010). Células-tronco

mesenquimais. Ciência Rural, 40(1), 238–245. https://doi.org/10.1590/S0103-

84782010000100040.

Nadler-Holly, M., Breker, M., Gruber, R., Azia, a., Gymrek, M., Eisenstein, M., …

Horovitz, a. (2012). Interactions of subunit CCT3 in the yeast chaperonin CCT/TRiC

with Q/N-rich proteins revealed by high-throughput microscopy analysis. Proceedings

of the National Academy of Sciences, 109(46), 18833–18838.

https://doi.org/10.1073/pnas.1209277109.

Palmfeldt, J., & Bross, P. (2016). Proteomics of human mitochondria. Mitochondrion.

https://doi.org/10.1016/j.mito.2016.07.006.

41

Rigbolt K.T. G., Prokhorova T. A., Akimov V., Henningsen J., Johansen P. T., Irina

Kratchmarova, Kassem M., Mann M., Olsen J. V., Blagoev B. System-Wide Temporal

Characterization of the Proteome and Phosphoproteome of Human Embryonic Stem

Cell Differentiation. Sci. Signal. 15 Mar 2011:

Vol. 4, Issue 164, pp. rs3

DOI: 10.1126/scisignal.2001570.

Rigola, M. A., Baena, N., Català, V., Lozano, I., Gabau, E., Guitart, M., & Fuster, C.

(2015). A 11.7-Mb paracentric inversion in chromosome 1q detected in prenatal

diagnosis associated with familial intellectual disability. Cytogenetic and Genome

Research, 146(2), 109–114. https://doi.org/10.1159/000437127.

Schwindt, T. T., Barnabé, G. F., & Mello, L. E. A. M. (2005). Proliferar ou diferenciar ?

Perspectivas de destino das. Jornal Brasileiro de Neurocirurgia, 16(1), 13–19.

The Gene Ontology Consortium. Gene Ontology Consortium: going forward.

(2015) Nucl Acids Res 43 Database issue D1049–D1056.

Tsai, E. M., Wang, Y. C., Lee, T. T. Y., Tsai, C. F., Chen, H. S., Lai, F. J., … Lee, J. N.

(2015). Dynamic trk and G protein signalings regulate dopaminergic

neurodifferentiation in human trophoblast stem cells. PLoS ONE, 10(11).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0143852.

Valledor L, Jorrin J. Back to the basics: maximizing the information obtained by

quantitative two dimensional gel electrophoresis analyses by an appropriate

experimental design and statistical analyses. J Proteomics. 2011;74(1):1-18.

Ursini-Siegel, J., Rajput, A. B., Lu, H., Sanguin-Gendreau, V., Zuo, D., Papavasiliou,

V., … Muller, W. J. (2007). Elevated expression of DecR1 impairs ErbB2/Neu-induced

mammary tumor development. Molecular and Cellular Biology, 27(18), 6361–71.

https://doi.org/10.1128/MCB.00686-07.

Wyrick, J. J., & Roberts, S. A. (2015). Genomic approaches to DNA repair and

mutagenesis. DNA Repair, 36, 146–155.

https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2015.09.018.

Yun, J.-W., Ahn, J. H., Kwon, E., Kim, S.-H., Kim, H., Jang, J.-J., … Kang, B.-C. (2016).

42

Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in acute liver injury:

Hepatoprotective efficacy, subchronic toxicity, tumorigenicity, and biodistribution.

Regulatory toxicology and pharmacology : RTP. Elsevier Ltd.

https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2016.09.029.

Zemljic-Harpf, A. E., Godoy, J. C., Platoshyn, O., Asfaw, E. K., Busija, A. R.,

Domenighetti, A. a, & Ross, R. S. (2014). Vinculin directly binds zonula occludens-1

and is essential for stabilizing connexin-43-containing gap junctions in cardiac

myocytes. Journal of Cell Science, 127(Pt 5), 1104–16.

https://doi.org/10.1242/jcs.143743.

43

8 – APÊNDICE

Tabela 1: Proteínas exclusivas das células com cariótipo invertido.

Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change

retinal dehydrogenase 1 21361176 20 0 0

squamous cell carcinoma antigen-1 193792580 14 0 0

keratin 16 1195531 28 0 0

Keratin 14 12803709 24 0 0

FAM129B 32425737 2 0 0

desmoplakin I 1147813 8 0 0

heat shock 119582699 7 0 0

hPA28 1008915 1 0 0

threonine-protein 114576744 2 0 0

Ras-GTPase-activating protein 119582065 4 0 0

PRO2619 11493459 4 0 0

JUP protein 15080189 5 0 0

Calmodulin-Like Skin Protein C Terminal Domain 109157166 5 0 0

band-6-protein 535015 2 0 0

metalloproteinases-3 1304484 2 0 0

44

Tabela 2: Proteínas exclusivas das células com cariótipo normal.

Protein name Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change

NME1-NME2 protein 66392203 0 6 0

Procathepsin B At 3.2 157833437 0 6 0

plasminogen activator inhibitor 1 10835159 0 4 0

arginine 119624305 0 3 0

unnamed protein product 194388432 0 3 0

CAPNS1 protein 15080279 0 3 0

HYOU1 protein 116283339 0 2 0


ATP synthase 51479152 0 3 0

neprilysin 116256327 0 6 0

26S protease regulatory subunit 6B isoform 2 24430155 0 3 0

Pyrroline5-Carboxylate Reductase 114794869 0 5 0

reticulon 4 119620534 0 5 0

tat-associated protein 1096067 0 3 0

AHNAK 61743954 0 6 0

40S ribosomal protein S17 4506693 0 4 0

RecName 143811408 0 2 0

45


dihydrolipoamide S-acetyltransferase 119587578 0 3 0

Physiological Dimer Hpp Precursor 2098347 0 3 0

leucine 119579268 0 3 0

ribosomal protein L3 119580717 0 5 0

poly(rC)-binding protein 14141166 0 1 0


cytochrome b-c1 l 163644321 0 1 0

glycosyltransferase 119605027 0 1 0

cyclooxygenase2 181254 0 3 0

hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase 119621106 0 3 0

GDP dissociation inhibitor 2 119606836 0 1 0

guanine nucleotide-binding protein 11055998 0 2 0

hCG2016877 119594653 0 1 0


cysteine and glycine-rich protein 2 4503101 0 2 0

proteasome 195539356 0 1 0

hCG39912 119576757 0 1 0

glycoprotein 1 112380628 0 2 0

46


glutaminase 114582297 0 2 0

aconitase 2 123228108 0 3 0


RuvB 119599729 0 1 0

SUB1 homolog (S. cerevisiae) 16307067 0 1 0

ubiquinone 115387094 0 2 0

RNA binding protein 119626277 0 2 0

47

Tabela 3: Proteínas presentes nas células com cariótipo invertido e normal (interseção).


ribonucleoprotein M 119589327 1 15 0,08

Procollagen-lysine 1 16741721 1 9 0,1

Superoxide Dismutase 110590806 2 16 0,1

Rab5C 41393545 1 8 0,2

glucosidase 119594451 5 30 0,2

plectin 1477646 1 7 0,2

unnamed protein product 158254970 1 7 0,2

cytochrome b5 119593674 1 7 0,2

proteasome 54696300 1 6 0,2

Rab11B 14249144 1 6 0,2



ribosomal protein L9 119613332 1 5 0,2

transmembrane emp24 119605373 1 5 0,2

Hmtssb 126030307 1 5 0,2

SYNCRIP protein 116283697 2 9 0,3


prohibitin 2 119609105 2 9 0,3

48


ribonucleoprotein M 119589327 1 15 0,08

Procollagen-lysine 1 16741721 1 9 0,1

Superoxide Dismutase 110590806 2 16 0,1

Rab5C 41393545 1 8 0,2

glucosidase 119594451 5 30 0,2

plectin 1477646 1 7 0,2


cytochrome b5 119593674 1 7 0,2

proteasome 54696300 1 6 0,2

Rab11B 14249144 1 6 0,2




transmembrane emp24 119605373 1 5 0,2

Hmtssb 126030307 1 5 0,2

SYNCRIP protein 116283697 2 9 0,3


prohibitin 2 119609105 2 9 0,3

49


fibronectin 1 119590943 64 224 0,3

Rab7 1174149 5 16 0,3

trifunctional enzyme 20127408 4 12 0,3

Chaperonin containing TCP1 14124984 4 12 0,3


splicing factor proline 119627830 2 8 0,3

ribosomal protein S19 16924231 4 11 0,3

Unknown 12804225 5 14 0,4

matrin-3 21626466 4 10 0,4

hCG1994130 119570641 4 10 0,4

electron transfer flavoprotein 189181759 2 7 0,4

ribonucleoproteins C1/C2-like 109082737 4 10 0,4

EPB72 119578798 1 3 0,4

Peroxiredoxin 4 149243259 1 3 0,4

2,4-dienoyl-CoA reductase 1575000 1 3 0,4

Proteasome 4506181 1 3 0,4

50


polypyrimidine 119581557 6 16 0,4

ribonucleoproteins B1 14043072 5 13 0,4

glycyl-tRNA synthetase 116805340 4 9 0,4

calreticulin 119604736 10 25 0,4

myosin-Ic 124494238 2 6 0,4

hCG2043289 119575627 2 6 0,4

hCG1640785 119569329 2 6 0,4




hCG1745306 119606268 2 5 0,5

proteasome 119567805 2 5 0,5

Nucleosome Structure 296863426 1 3 0,5

signal recognition particle 197099116 2 5 0,5

SH3 119628236 1 3 0,5

transferrin receptor 119574056 1 3 0,5

endoplasmin precursor 4507677 31 67 0,5

mitochondrial precursor 4502303 4 8 0,5

51


40S ribosomal protein S12 14277700 4 8 0,5


2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2 119599346 6 12 0,5

protein disulfide 20070125 23 45 0,5

lamin A 119573381 38 76 0,5

voltage-dependent anion channel 2 119574954 10 19 0,5

Human Galectin1 42542977 28 54 0,5

X-ray 169145200 4 7 0,5

3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2 119570566 4 7 0,5

T-plastin polypeptide 190028 10 18 0,5

heat shock protein 153792590 25 47 0,5

ribosomal protein 337518 6 11 0,5

histone H2A type 1-B/E 10645195 19 34 0,6


Chain B 157879202 5 9 0,6

hCG2013819 119603728 2 4 0,6


52

Protein

Accession Number

CI Specters

CN Specters

Fold Change

far upstream element 119626762 2 4 0,6


TapasinERP57 220702506 26 46 0,6

ubiquitin 23510338 11 19 0,6

mitochondrial F1 complex 127798841 11 19 0,6

glucose-regulated protein 16507237 59 99 0,6

Initiation Factor Eif5a 183448388 4 6 0,6

Rab18 10880989 4 6 0,6

Heat shock 12653415 26 44 0,6

ATP-dependent RNA helicase DDX17 148613856 5 8 0,6

tropomyosin beta 47519616 30 48 0,6


protein L13 15431295 6 9 0,6

mitochondrial precursor 32189394 48 75 0,6

calnexin precursor 10716563 17 26 0,7

cytoskeleton-associated protein 4 19263767 38 57 0,7

tropomyosin alpha1 27597085 26 39 0,7

53

Protein

Accession Number

CI Specters

CN Specters

Fold Change

alpha1(E)-catenin 1172426 5 7 0,7

phosphoprotein P1 31979223 5 7 0,7

L18a 11415026 2 3 0,7

PSMA7 protein 116283481 4 5 0,7

myoferlin 119570458 2 3 0,7

fructose-bisphosphate 119600342 1 2 0,7

spectrin 112382250 2 3 0,7


Sec23A 109083408 2 3 0,7


protein 1 141797011 1 2 0,7


hCG2028724 119601423 8 12 0,7

hCG21078 119568094 6 9 0,7

drebrin 1 119605395 6 9 0,7

protein 5 1710248 29 40 0,7

54


ribosomal protein SA 119584991 8 10 0,8


heat shock protein 4504517 36 44 0,8

Cyclosporin 1310882 28 33 0,8

actin related protein 2/3 complex 119618319 4 4 0,8

hexokinase 1 119574708 7 9 0,8


glycoprotein 2 169790833 4 4 0,8

alpha-actinin4 12025678 108 128 0,8

Profilin I 157833469 20 24 0,9



malate dehydrogenase 21735621 19 22 0,9

major vault protein 19913410 25 29 0,9

alpha-actinin1 194097350 160 184 0,9

non-erythrocytic 1 119608213 6 7 0,9


55


unnamed protein product

158254664

122

137

0,9

RAB1A 119620329 19 21 0,9

heat shock cognate 5729877 88 95 0,9

histone 1 119575932 35 38 0,9

nucleophosmin 10835063 19 21 0,9

peroxiredoxin6 4758638 12 13 0,9



WD repeat domain 1 119613093 2 3 0,9

Strongylocentrotus purpuratus 119607750 2 3 0,9

EIF3A protein 116283747 2 3 0,9



Vdac1 198443050 17 18 0,9

60S acidic ribosomal protein P2 4506671 14 15 0,9


Dehydrogenase 13786847 7 8 0,9

MYL6 protein 113812151 23 24 1

56


60S ribosomal protein L12 4506597 13 14 1

serpin H1 precursor 32454741 53 54 1

40S ribosomal protein 114647215 8 9 1

hCG1983058 119619436 8 9 1

Rap-Rapgap 169791854 6 6 1

Rab2A 336391093 6 6 1

Triosephosphate isomerase 1 17389815 18 18 1

ribonucleoprotein A1 14043070 18 18 1

ribonucleoprotein K 119583080 16 15 1

ribosomal protein S10 119624187 10 9 1

pyruvate kinase 119598292 46 45 1

ADP-ribosylation factor 4 4502205 13 13 1

ribosomal protein S5 119592989 13 13 1

Hsp70 Atpase 166007012 13 13 1

actin 4501887 275 267 1

elongation factor 2 4503483 83 81 1

histone H2B 10800138 59 57 1

tubulin beta6 27754056 61 58 1,1

57


Protein-Disulfide 192987144 4 3 1,1

adaptor-related protein complex 1 119580203 4 3 1,1

histone H2B 10800140 60 57 1,1

Ran-like 109099257 8 8 1,1

tubulin 119608775 114 105 1,1

importin 119615215 18 16 1,1

beta-tubulin 1297274 88 79 1,1

phosphoglycerate mutase 1 297302419 5 4 1,1

filamin-B 105990514 30 27 1,1

keratin 8 119617057 108 93 1,2

Tubulin 18088719 140 121 1,2

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 31645 78 67 1,2

Vinculin 24657579 30 26 1,2

ribonucleoprotein U 14141161 12 10 1,2

T-complex protein 1 261399877 6 5 1,2

chaperonin 119620390 6 5 1,2

calelectrin 179976 49 41 1,2

myosin 15809016 26 21 1,2

58


Chain A 157831404 62 51 1,2

translocon-associated protein subunit delta isoform 1 precursor 325301072 11 9 1,3

keratin, type I cytoskeletal 19 24234699 23 18 1,3

Adp-Ribosylation Factor 1 1065361 12 9 1,3

G protein 119574079 36 28 1,3

moesin, 119625804 25 20 1,3

14-3-3 protein epsilon 114665591 42 33 1,3


cofilin1 5031635 44 33 1,3

KIAA1027 protein 20521736 68 51 1,3

Keratin 18 12653819 24 18 1,3

Glutathione Transferase P11 11514451 22 15 1,4

ribosomal protein L23a 119571516 11 8 1,4

ubiquitin thiolesterase 119613388 10 7 1,4

hCG37214 119622042 10 7 1,4

zyxin 119572233 7 5 1,4

cytoplasmic 1 119612225 5 3 1,4

59


hCG33299 119597983 2 2 1,4

hCG1985370 119610462 1 1 1,4



KH 119627980 1 1 1,4

C-type mannose receptor 2 110624774 4 3 1,4

Eukaryotic translation elongation factor 1 gamma 15530265 5 3 1,4

flavoprotein 119571367 2 2 1,4

coactosin-like protein 21624607 2 2 1,4

ATP synthase 16877071 4 3 1,4

protein B 181486 1 1 1,4

26S proteasome subunit p97 1060888 1 1 1,4

integrin beta 4 binding protein 119596626 1 1 1,4

ribonucleoprotein H1 119574194 8 6 1,4

pyrroline 5-carboxylate synthetase 1304314 6 4 1,4

Phosphorylation Independent Interactions Between 14-3-3 161172138 62 43 1,5

60




TSA 1617118 13 9 1,5

myosin-9 12667788 207 134 1,5

tyrosine 3-monooxygenase 54696890 38 25 1,5

chloride intracellular channel protein 1 14251209 12 8 1,6

tubulin alpha1A 6755901 84 54 1,6

14-3-3 protein beta/alpha 4507949 24 15 1,6

prohibitin 46360168 11 7 1,6

L-Lactate Dehydrogenase 13786849 10 6 1,6

Annexin A2 18645167 139 87 1,6

transgelin 119587704 136 81 1,7

clathrin 119614801 7 4 1,7


Calcium-Calmodulin 16974825 11 6 1,8


peroxiredoxin 1 119627382 25 14 1,8

keratin 9 119581148 14 8 1,9

61


filamin-C 116805322 50 26 2

transgelin2-like 297663020 64 32 2

hCG1783090 119582155 22 10 2,1



phosphatidylinositol binding clathrin assembly protein 119595524 4 2 2,1

annexin A1 119582950 56 25 2,3

Rhogdi K113a 14278162 6 3 2,3

Unknown 13097759 25 10 2,5

keratin 47132620 56 21 2,7


unknown 1531594 7 3 2,8

Similar to cysteine and glycine-rich protein 1 13279065 7 3 2,8

proteasome 8394076 2 1 2,8

HuR RNA binding protein 1022961 8 3 3,3

keratin 1 11935049 192 54 3,6


RecName 1703319 5 1 5,6

hCG1995701

Ed4f2hc

RAN binding protein 5

keratin 10

119584408

145579147

119629383

119581085

7

7

7

161

1

1

1

11

8,4

8,4

8,4

14

62

Documents

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO … · crescimento específicos. O cordão umbilical humano tem sido uma fonte interessante de obtenção deste tipo celular por