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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
Polyanna Silva Moreira
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS OBTIDOS DA FOLHA E
FRUTO DE Morinda citrifolia CONTRA O VÍRUS DENGUE
Natal-RN
2017
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POLYANNA SILVA MOREIRA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS OBTIDOS DA FOLHA E
FRUTO DE Morinda citrifolia CONTRA O VÍRUS DENGUE
Dissertação de Mestrado do Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, para obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária na área da Epidemiologia e Controle de Doenças Infecciosas e Parasitárias.
Orientador: Profa. Dra. Paula Renata Lima Machado Co-orientador: Dr. Kleber Juvenal Silva Farias
Natal-RN
2017
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS OBTIDOS DA FOLHA E
FRUTO DE Morinda citrifolia CONTRA O VÍRUS DENGUE
Polyanna Silva Moreira
Natal, 23 de fevereiro de 2017
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Profª. Drª. Paula Renata Lima Machado (DACT UFRN)
_____________________________________________ Profª. Drª. Nalu Teixeira de Aguiar Peres
(DMO UFS)
_____________________________________________ Profª. Drª. Vânia Sousa Andrade
(DMP UFRN)
3
4
AGRADECIMENTOS
A Deus primeiramente que me concedeu chegar até aqui, me fortalecendo para
superar todas as barreiras surgidas ao longo desse percurso.
A minha família por todo apoio e compreensão durante esse período.
Ao meu namorado Gustavo Kleber por todo amor, auxílio e paciência.
A minha orientadora professora Paula Renata e co-orientador Kleber Juvenal pelos
seus ensinamentos, orientação e paciência durante todo o desenvolvimento da
pesquisa.
A professora Raquel Brant Giordani e a Msc. Gabriele Pereira do Laboratório de
Farmacognosia por toda contribuição durante a preparação dos extratos.
Ao Msc. Renato Ferreira de Almeida Junior pela sua orientação e companheirismo
durante a execução do meu projeto de pesquisa.
A todos meus colegas do Laboratório de Imunologia Clínica, em especial a Kercia
Monaline e Luanda Canário, por todo aprendizado e auxílio nas minhas atividades
de pesquisa.
Por fim, agradeço a todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste
trabalho.
5
RESUMO A dengue é uma arbovirose que afeta o homem, gerando uma problemática na saúde pública do mundo, especialmente em países tropicais os quais apresentam condições que favorecem a disseminação do mosquito Aedes aegypti. Atualmente, dentre as várias estratégias para controle da doença, ainda não se tem uma vacina eficaz ou um antiviral capaz de combater essa infecção. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antiviral de extratos obtidos da folha e frutos da planta Morinda citrifolia L. em cultura de células Vero infectadas com vírus dengue-2 (DENV-2). Inicialmente foram obtidos os extratos brutos (hidroetanólico) e as respectivas frações: hexano, clorofórmio e acetato de etila, analisados por cromatografia. O teste de citotoxicidade do extrato bruto, resíduo aquoso e frações foram realizados em cultura de células Vero pelo método MTT, nas concentrações de 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,2 μg/mL. O ensaio antiviral foi conduzido através das seguintes estratégias: células infectadas com DENV-2 (controle positivo); células mantidas com meio de cultura (controle negativo); células infectadas com DENV-2 e tratadas com o extrato ou frações. Após cinco dias de infecção a viabilidade celular foi avaliada pelo método de MTT e o sobrenadante da cultura foi utilizado para quantificação viral por unidade formadora de placa (PFU). Os resultados demonstraram que a análise cromatográfica dos extratos e frações revelou bandas distintas e sugestivas de saponinas, terpenos e flavonoides. Tais extratos e frações não foram tóxicos para as culturas de células, com exceção do tratamento das células com a fração clorofórmio obtido da folha e as frações hexano e acetato de etila do fruto verde, levando a uma viabilidade próxima de 65%. No ensaio antiviral o controle positivo apresentou viabilidade celular em torno de 60% após cinco dias de infecção. No tratamento com os compostos obtidos da folha observou-se que ao adicionar a fração de acetato de etila às células infectadas, estas mantiveram uma viabilidade celular próximo a 100% na concentração de 1000μg/mL e a 85% nas concentrações de 500 e 250μg/mL. O tratamento com a fração hexano apresentou uma viabilidade superior ao controle positivo em todas as concentrações. No entanto, na fração clorofórmio, a viabilidade manteve-se elevada apenas nas concentrações de 500 e 250μg/mL. O extrato bruto e a fração residual aquosa não demonstraram atividade antiviral. As células tratadas com o extrato e as diferentes frações obtidas dos frutos maduro e verde, apresentaram de um modo geral uma viabilidade celular próxima de 100% nas concentrações de 500 e 1000 μg/mL no fruto maduro e apenas 1000 μg/mL no fruto verde, com exceção das células que foram tratadas com a fração clorofórmio, na qual não foi possível observar nenhuma diferença significativa quando comparado ao controle positivo. Na quantificação viral observou-se que as células tratadas com as frações hexano e clorofórmio obtidos da folha e também os extratos brutos obtidos dos frutos maduro e verde tiveram ação antiviral, resultando na diminuição total da carga viral. Finalmente, a partir desse estudo podemos identificar uma possível atividade antiviral dos compostos obtidos de Morinda citrifolia contra o vírus dengue. Palavras-chave: vírus dengue, Morinda citrifolia L., viabilidade celular, células Vero, antiviral, análise cromatográfica.
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ABSTRACT
Dengue is an arbovirosis which affects mankind, causing problems in the public health worldwide, especially in tropical countries which present conditions that favor the spread of the mosquito Aedes aegypti. Currently, among the various strategies to control the disease, there is no effective vaccine or antiviral capable of combating this infection. Thus, the aim of the present study was to evaluate the antiviral activity of leaf and fruit extracts of the plant Morinda citrifolia L. in Vero cells culture infected with dengue-2 virus (DENV-2). Initially, the crude extracts (hydroethanolic) and their fractions were obtained: hexane, chloroform and ethyl acetate, followed by chromatographic analysis. The cytotoxicity test of the crude extract, the aqueous residue and its fractions were performed in culture of Vero cells by the MTT method, at concentrations of 1000; 500; 250; 125; 62.5; 31.2 μg/mL. The antiviral assay results were conducted through the following strategies: cells infected with DENV-2 (positive control); cells maintained with culture medium (negative control); cells infected with DENV-2 and treated with the extract or fractions. After five days of infection, cell viability was evaluated by the MTT method and culture supernatant was used for viral quantification by plaque forming unit (PFU) assay. The results showed that the chromatographic analysis of extracts and fractions present distinct bands, which could be suggestive of saponins, terpenes and flavonoids. Such extracts and fractions were not toxic to cell cultures, except for the cells treated with the chloroform fraction obtained from leaf, hexane and ethyl acetate fractions of the green fruit, leading to a near 65% viability. In the antiviral assay the positive control had 60% of cell viability after five days of infection. Among the leaf extract treatments, it was observed that infected cells treated with ethyl acetate fraction, maintained their cell viability around 100% in the concentration of 1000μg/mL and up to 85% in the concentrations of 500 and 250μg/mL. The hexane fraction treatment showed higher viability in comparison to the positive control at all concentrations. However, in the chloroform fraction, viability remained high only at concentrations of 500 and 250 μg/mL. Crude extract and residual aqueous fraction did not show any antiviral activity. Cells treated with the extract and different fractions obtained from the mature and green fruits, presented an overall cell viability close to 100% in 500 and 1000 μg/mL in the mature fruit and only 1000 μg/mL in the green fruit. However, for the cells treated with the chloroform fraction, it was not possible to observe any significant difference when compared to the positive control. In the viral quantification it was observed that cells treated with hexane and chloroform fractions obtained from leaf, as well as crude extracts obtained from mature and green fruits had antiviral effect, resulting in a total viral load decrease. Finally, identified from this study, a possible antiviral activity of the compounds obtained from Morinda citrifolia against dengue virus.
Keywords: dengue virus, Morinda citrifolia L., cell viability, Vero cells, antiviral, chromatographic analysis.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ensaio de imunofluorescência indireta para detecção de DENV-2
em cultura de células C6/36...............................................................................
34
Figura 2 – Avaliação da citotoxicidade do extrato bruto e frações obtidas da
folha e frutos de Morinda citrifolia em cultura de células
Vero.....................................................................................................................
36
Figura 3 – Ação antiviral do extrato bruto e frações obtidas da folha de
Morinda citrifolia sobre a replicação do vírus dengue-2 em cultura de células
Vero....................................................................................................................
37
Figura 4 – Ação antiviral do extrato bruto e frações obtidas do fruto maduro de
Morinda citrifolia sobre a replicação do vírus dengue-2 em cultura de células
Vero......................................................................................................................
38
Figura 5 – Ação antiviral do extrato bruto e frações obtidas do fruto verde de
Morinda citrifolia sobre a replicação do vírus dengue-2 em cultura de células
Vero......................................................................................................................
39
Figura 6 – Análise de PFU da ação do extrato bruto e frações da folha e frutos
de Morinda citrifolia sobre a replicação do vírus dengue-2 em cultura de
células Vero.........................................................................................................
41
Figura 7 – Cromatografia em camada delgada e os respectivos fatores de
retenção das bandas...........................................................................................
42
8
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
a.C. Antes de Cristo CCD Cromatografia em camada delgada DENV Vírus dengue DENV-Ag Antígeno do vírus dengue DMSO Dimetilsulfóxido HCV Vírus da hepatite C HIV-1 Vírus da imunodeficiência humana tipo 1 HSV-2 Herpesvírus simples 2 L-15 Meio de cultura Leibovitz-15 MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide NS Proteína não estrutural ORF Open reading frame PBS Tampão fosfato salino Rf Fator de retenção RNA Ácido ribonucléico SBF Soro bovino fetal
9
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 11
1.1 Dengue ................................................................................................................................ 11
1.1.1 Vírus dengue e sua estrutura .............................................................................. 12
1.1.2 Replicação do vírus dengue ................................................................................. 13
1.1.3 Epidemiologia ........................................................................................................... 14
1.1.4 Transmissão .............................................................................................................. 15
1.1.5 Manifestações clínicas ........................................................................................... 16
1.1.6 Tratamento e profilaxia .......................................................................................... 18
1.1.7 Antivirais para dengue ........................................................................................... 18
1.2 Plantas medicinais no Brasil ......................................................................................... 20
1.2.1 Morinda citrifolia ..................................................................................... 21
1.2.1.1 Aspectos farmacobotânicos ................................................................ 22
1.2.1.2 Composição química .......................................................................... 23
2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 24
2.1 Objetivo geral .................................................................................................................... 25
2.2 Objetivos específicos ...................................................................................................... 25
3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................... 26
3.1 Delineamento experimental .......................................................................................... 26
3.2 Cultura de células............................................................................................................. 27
3.3 Linhagem viral ................................................................................................................... 27
3.4 Ensaio de imunofluorescência indireta ...................................................................... 27
3.5 Extração de RNA viral ..................................................................................................... 28
3.6 Transcrição reversa pela Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) ....... 28
3.7 Quantificação viral por PFU (Unidade Formadora de Placa) ............................. 29
3.8 Obtenção do extrato bruto e frações da folha e frutos de Morinda citrifolia .. 30
3.8.1 Preparação da amostra vegetal ............................................................... 30
3.8.2 Extração ................................................................................................... 30
3.8.3 Partição líquido-líquido ............................................................................ 31
3.8.4 Análise cromatográfica ............................................................................ 31
3.9 Ensaio da citotoxicidade e atividade antiviral do extrato bruto e frações obtidas
da folha e frutos de Morinda citrifolia ................................................................................ 31
10
3.9.1 Preparação das diluições dos extratos e frações..................................... 31
3.9.2 Determinação da citotoxicidade do extrato bruto e frações obtidas da folha
e frutos da planta .............................................................................................. 32
3.9.3 Atividade antiviral dos extratos e frações obtidas da folha e frutos da planta
.......................................................................................................................... 33
3.10 Análise estatística .......................................................................................................... 33
4. RESULTADOS .................................................................................................... 34
4.1 Titulação do estoque viral e confirmação da infecção .......................................... 34
4.2. Citotoxidade de extratos e frações obtidos da folha e fruto da planta...........34
4.3 Atividade antiviral do extrato e frações obtidos da folha de Morinda citrifolia 36
4.4 Atividade antiviral dos extratos obtidos dos frutos (maduro e verde) de
Morinda citrifolia ....................................................................................................37
4.5 Quantificação do vírus dengue-2 no ensaio antiviral......................................40
4.6 Identificação dos metabólitos secundários presentes nos extratos e frações
obtidos da Morinda citrifolia ................................................................................ 41
5. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 43
6. CONCLUSÕES .................................................................................................. 50
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 51
11
1. INTRODUÇÃO
1.1 Dengue
O primeiro caso registrado de uma doença semelhante a dengue foi em uma
enciclopédia chinesa entre os anos de 256 a 420 a.C., denominada de veneno de
água pelo fato de que essa doença estava associada a insetos. Desse modo,
mesmo havendo divergências entre os autores sobre a primeira epidemia de dengue
no mundo, afirma-se que nos anos de 1779 e 1780 ocorreram na Ilha de Java e nos
Estados Unidos, respectivamente, as primeiras epidemias (ANDRIES, 2006).
Segundo Costa (2001) inúmeras epidemias ocorreram no século passado, como na
Austrália (1904 a 1905), África Oriental (1925), Grécia (1927 a 1928) e África do Sul
no ano de 1960.
Em relação à América essa doença foi registrada há mais de 200 anos,
identificada, principalmente no Caribe e na Costa Atlântica dos Estados Unidos em
1827, como também em Cuba, Venezuela e Porto Rico. Sabe-se que o primeiro
caso registrado em laboratório nas Américas ocorreu na Venezuela e também na
região do Caribe entre os anos de 1963 e 1964 em que o sorotipo associado foi
vírus dengue 3 (DENV-3) (TEIXEIRA, 2000).
O vírus dengue foi introduzido nas Ilhas do Pacífico no ano de 1964 e também
reintroduzido nas Américas em 1971, com os sorotipos DENV-3 e DENV-4,
respectivamente. O sorotipo DENV-2 causou muitos casos graves em algumas ilhas.
Com o passar dos anos, os quatro sorotipos foram introduzidos na Ásia, causando
várias epidemias (BARNES, 1974; GUBLER et al.,1978; 2011).
O século XXI vem apresentando muitas epidemias da dengue, tornando-se
uma séria problemática na saúde pública em todas as regiões tropicais e
subtropicais do planeta, com disseminação para regiões que nunca haviam sido
afetadas por essa infecção (NUNES, 2011).
No Brasil, o aumento da incidência desta doença foi consequência das
dificuldades no controle das epidemias, como também da necessidade de melhoria
no atendimento às pessoas afetadas pelas formas da doença (BARRETO e
TEIXEIRA, 2008).
12
Uma das primeiras epidemias de dengue documentadas em laboratório no
país ocorreu nos anos de 1981 e 1982 na cidade de Boa Vista, localizada no Estado
de Roraima, na qual foram confirmados os seguintes sorotipos: DENV-1 e DENV-4
(TEIXEIRA, 2009).
No Estado do Rio Grande do Norte (RN) os primeiros casos foram registrados
em 1994. A partir desse ano, observaram-se muitas epidemias recorrentes, com
grandes surtos, o que provocou alta demanda na saúde pública, juntamente com um
alto custo financeiro e social (SESAP, 2010).
1.1.1 Vírus dengue e sua estrutura
O vírus dengue pertence à família Flaviviridae, do gênero Flavivirus, medindo
cerca de 40 a 50 nm de diâmetro e tendo como genoma viral o RNA de fita simples,
polaridade positiva. São vírus de formato esférico e envelopado, cujo envelope
apresenta natureza lipídica, pois tem sua origem das membranas celulares
hospedeiras. Seu genoma viral codifica três proteínas estruturais (capsídeo [C];
proteína da membrana [M]; glicoproteína do envelope [E]) e sete proteínas não
estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) (SINGHI et al, 2007).
O RNA genômico possui de 10,5 a 11 quilobases (kb) de comprimento e
também contém uma ORF (open reading frame) com aproximadamente 10.200
nucleotídeos. O RNA é traduzido em uma poliproteína, processada por proteases
virais e celulares, resultando nas proteínas estruturais que constituem o vírus
maduro e as proteínas não estruturais, importantes para o processo de replicação
viral e processamento do polipeptídeo (CHAMBERS et al., 1990; FALGOUT et al.,
1995; NOGUEIRA et al., 2000).
Dentre as proteínas estruturais, a proteína C ou do capsídeo têm a função de
manter o formato esférico do vírus. Já a glicoproteína precursora da proteína de
membrana M (prM) sofre clivagem durante o processo de replicação viral por uma
protease chamada furina, convertendo-se em proteína estrutural M, que têm a
função de auxiliar a proteína E no revestimento externo da partícula viral. A proteína
E é considerada o principal constituinte de superfície do vírus. Além disso, participa
de importantes atividades biológicas, como a fusão do envelope com a membrana
do endossomo e montagem da partícula viral (CHAMBERS et al., 1990;
LINDENBACH et al., 2007).
13
As proteínas estruturais E e M são consideradas alvos de drogas. No caso da
proteína E esta apresenta função dupla, pois ela interage com o receptor celular e
participa do mecanismo de fusão do envelope viral com a membrana do endossomo,
assim essa proteína pode ser um alvo interessante para uma molécula antiviral com
ação antes que o vírus provoque a infecção na célula hospedeira (PEVEAR et
al.,1999).
Em relação às proteínas não estruturais, a proteína NS1 se localiza no
retículo endoplasmático, mas também pode ser observada livre no meio extracelular
ou em associação com a membrana celular. Essa forma livre no meio extracelular
pode ser alvo da resposta imunológica do hospedeiro, uma vez que nas primeiras 48
horas de infecção são produzidas grandes quantidades dessa proteína (CLYDE et
al., 2006; LINDENBACH et al., 2007). As proteínas NS2A, NS2B, NS4A e NS4B são
pequenas e de caráter hidrofóbico. A NS2A tem a função de processar a NS1 e a
NS2B está associada à membrana. Pouco se sabe sobre a função das proteínas
NS4A e NS4B, mas pode-se considerar que ambas estão relacionadas ao complexo
de replicação, podendo funcionar como co-fatores (LINDENBACH et al., 2007). A
proteína NS3 é conservada entre os Flavivirus e está associada à replicação e
processamento da poliproteína. Por fim, a proteína NS5 é que tem maior peso
molecular entre as proteínas dos Flavivirus e apresenta a função de RNA polimerase
(CHAMBERS et al., 1990; LINDENBACH et al., 2007; WEAVER; VASILAKIS, 2009).
1.1.2 Replicação do vírus dengue
O processo de replicação do vírus dengue tem início após sua entrada por
endocitose na célula hospedeira. Este processo apresenta várias etapas, que são
descritas como: adsorção, penetração, desnudamento, tradução, replicação,
montagem e brotamento (CLYDE et al., 2006).
O vírus é adsorvido à célula alvo por meio da interação entre os receptores
presentes na membrana celular e a glicoproteína E, iniciando sua replicação no
citoplasma da célula, depois de um período de 12 a 16 horas de infecção. A partir da
internalização do vírus na célula, ocorre a formação de uma vesícula endocítica que
contém várias partículas virais. Essa vesícula irá sofrer uma acidificação, fazendo
com que ocorra a trimerização irreversível da proteína E, expondo o domínio de
fusão, isto é, haverá a fusão da membrana do endossomo com a do envelope viral,
14
promovendo a entrada do nucleocapsídeo no citoplasma da célula seguido do
desnudamento da partícula viral no qual o seu material genético será exposto no
citoplasma (CLYDE et al., 2006).
O RNA viral de polaridade positiva servirá como RNA mensageiro (RNAm)
para que ocorra o processo de tradução em um única poliproteína que será
processada por meio de proteases celulares e virais em três proteínas estruturais: C,
prM, E e sete não estruturais: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5
(RODENHUIS-ZYBERT et al., 2010). O genoma viral também será utilizado para a
formação da fita complementar de polaridade negativa que funcionará como molde
para que ocorra a produção de múltiplas cópias de RNA viral de cadeia positiva que
serão utilizadas no processo de montagem de outras partículas virais
(LINDENBACH; RICE, 1997; MUYLAERT et al., 1996).
As partículas virais serão montadas em associação com o retículo
endoplasmático rugoso (RER) e logo após liberadas para a superfície desta mesma
organela, garantindo assim uma membrana lipídica, que em conjunto com a proteína
E formarão o envelope viral e assim resultando em partículas virais imaturas. Os
virions imaturos são transportados até o complexo de Golgi, onde acontecerá a
clivagem proteolítica pela protease celular furina da proteína prM em M, resultando
em partículas virais infecciosas que serão liberadas para o meio extracelular por
exocitose (CHAMBERS et al., 1990; MUKHOPADHYAY et al., 2005).
1.1.3 Epidemiologia
A dengue é uma arbovirose considerada uma das mais importantes no
mundo, causando endemias que se expandem em todos os continentes, com
exceção da Europa, mas principalmente nos países em desenvolvimento. Assim,
quase 2,5 bilhões das pessoas se encontram em regiões consideradas de risco de
infecção, que são influenciadas pelas várias mudanças climáticas e do ambiente,
favorecendo desse modo a adaptação do mosquito vetor e, consequentemente a
transmissão viral (BARRETO; TEIXEIRA, 2008; GIBBONS; VAUGHN, 2002; LOPES
et al., 2014).
Os dados epidemiológicos da dengue tiveram uma mudança impactante no
sudeste da Ásia devido à Segunda Guerra Mundial. Esta questão teve como
consequência também a mudança na ecologia, o que fez com que ocorresse uma
15
expansão na distribuição geográfica, e, além disso, um aumento na densidade do
mosquito vetor Aedes aegypti. Esse fato fez com que vários países, cuja
transferência era altamente permissiva, apresentassem alta transmissão epidêmica
(GUBLER, 2002).
A epidemiologia da dengue observada nas Américas apresenta duas
diferenças importantes quando comparada à epidemiologia do sudeste Asiático.
Primeiro, pode-se observar que os casos de dengue hemorrágica nas Américas
aconteceram em menor proporção do que no Sudeste da Ásia. A segunda diferença
que merece destaque é a faixa etária de maior risco, em que no Sudeste Asiático, a
doença é predominante em crianças (HALSTEAD, 2006; SIQUEIRA-JÚNIOR, 2005;
TEIXEIRA et al., 2005). Já no Brasil, um aumento do registro de casos graves em
crianças foi observado a partir de 2009 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).
O Brasil é um país que a cada ano vem apresentando o aumento do número
de casos de dengue. Tendo em vista que a circulação concomitante dos quatro
sorotipos entre os estados faz com que aumente cada vez mais a taxa de
transmissão e, consequentemente, a incidência de casos graves ao longo dos anos
(SIQUEIRA-JÚNIOR et al., 2005).
Em 2016, um total de 1.438.624 casos prováveis de dengue foram registrados
no Brasil até a semana epidemiológica número 37, que aconteceu entre os meses
de janeiro a setembro. A maioria dos casos foram na região Sudeste (842.741
casos; 58,6%), seguido pelo Nordeste (317.483 casos; 22,1%), Centro-Oeste
(168.498 casos; 11,7%), Sul (72.048 casos; 5,0%) e Norte (37.854; 2,6%)
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2016).
Realizou-se também uma avaliação da incidência desses casos prováveis e
foi observado que as regiões Sudeste e Centro-Oeste representaram maior
incidência, onde se manteve a tendência do ano de 2015. Além disso, pode-se
destacar entre as Unidades Federativas que tiveram maior incidência: Minas Gerais,
Goiás, Mato Grosso do Sul e Rio Grande do Norte (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2016).
O Rio Grande do Norte no ano de 2016 apresentou 61.778 notificações de
casos suspeitos de dengue até a semana epidemiológica número 36 que aconteceu
no mês de setembro, o que representa uma incidência acumulada de
1.794,74/100.000 habitantes, mostrando um aumento importante desses casos em
relação ao ano de 2015. Desse modo, dos 61.778 casos notificados, 8.948 (14,48%)
16
foram confirmados, sendo 8.862 para dengue, 75 para dengue com os sinais de
alarme e 11 casos de dengue grave (SESAP, 2016).
1.1.4 Transmissão
A dengue é uma arbovirose transmitida pela picada do mosquito Aedes
aegypti (DIAS et al., 2010), como também pelo Aedes albopictus, que foi
responsável por alguns surtos da doença em países do continente asiático. Ambos
os vetores apresentam morfologia e capacidade proliferativa semelhante
(HALSTEAD, 2007; SINGHI et al., 2007).
Inicialmente, logo após o repasto sanguíneo da fêmea hematófaga em um
indivíduo infectado, durante a fase aguda da doença, o vírus passa a infectar as
células epiteliais que revestem o intestino médio, chegando até as glândulas
salivares do vetor. Essa fase em que o vírus se encontra dentro do mosquito
corresponde ao período de incubação extrínseco com duração de 8 a 12 dias. Após
este período, o mosquito infectado poderá transmitir o vírus no momento da picada,
quando injeta sua saliva em um indivíduo susceptível. A fêmea infectada do
mosquito é capaz de transmitir o vírus da dengue a gerações seguintes (transmissão
transovariana), esse fato é importante para a manutenção do vírus (BRASIL, 2002;
McBRIDE; OHMANN, 2000; SINGHI et al., 2007).
Logo após a alimentação do mosquito, o vírus entra no organismo do
hospedeiro por meio da corrente sanguínea e durante 5 a 7 dias se mantém no
período intrínseco até que apareçam os primeiros sintomas da doença. Na fase de
viremia o vírus se espalhará por todo organismo podendo infectar pulmões, fígado e
células da linhagem monocítica-macrofágica de órgãos linfóides (DIAS et al., 2010;
GUBLER, 1998).
1.1.5 Manifestações clínicas
As infecções pelo vírus dengue podem apresentar uma variabilidade no
quadro clínico passando por formas assintomáticas e sintomáticas (NUNES, 2011).
Quando sintomática, apresenta um amplo espectro clínico que pode variar de formas
oligossintomáticas, ou evoluir para quadros graves que podem levar a óbito. Com
17
isso, as fases clínicas se dividem em: febril, crítica e de recuperação (MINISTÉRIO
DA SAÚDE, 2016).
A fase febril tem como primeira manifestação a febre que pode durar de dois
a setes dias e apresentar altas temperaturas (39ºC a 40ºC). A febre tem início
abrupto, e pode estar associada à cefaleia, mialgias e dor retroorbitária. O exantema
surge em 50% dos casos, podendo atingir predominantemente a face, o tronco e os
membros. Além disso, também podem estar presentes sintomas, como: anorexia,
náuseas, vômitos e diarreia (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2016). Depois que passa um
período de 5 a 7 dias, há o fim da etapa infecciosa, fazendo com que o indivíduo
apresente uma melhora do seu estado geral e ao mesmo ficará imunizado contra o
sorotipo que o infectou (BRASIL, 2007; GUBLER, 1998).
Na fase crítica, alguns dos pacientes podem ter evolução do quadro clínico
para as formas mais graves. De início, há o declínio da febre, entre o terceiro e
sétimo dia do início da doença, seguido do aparecimento dos sinais de alarme, os
quais exigem mais atenção dos pacientes e da assistência médica. Dentre os sinais
de alarme, podemos destacar: dor abdominal intensa, vômitos persistentes, acúmulo
de líquidos (ascite, derrame pleural, derrame pericárdico), sangramento da mucosa,
aumento progressivo do hematócrito (MINSTÉRIO DA SAÚDE, 2016). Esses sinais
são decorrentes do aumento da permeabilidade vascular, que pode gerar o choque
por conta do extravasamento de plasma (MALAVIGE et al., 2004).
A ocorrência do choque na dengue tem curta duração e rápida instalação, o
paciente pode vir a óbito no período de 12 a 24 horas, ou então se recuperar
rapidamente, logo após uma terapia antichoque. Quando o choque ocorre de uma
maneira prolongada, há também o comprometimento de órgãos devido a
hipoperfusão desses órgãos, acidose metabólica e coagulação intravascular
disseminada. Como consequência disso, podem ocorrer hemorragias graves,
seguida de diminuição do hematócrito (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2016).
Aproximadamente 9,3% dos casos de choque pode levar à morte do paciente,
aumentando para 47% nas situações mais graves (MALAVIGE et al., 2004).
A fase de recuperação corresponde à reabsorção gradual do plasma que foi
extravasado e assim, ocorrendo a melhoria no estado clínico. Aqui o déficit urinário
irá normalizar ou aumentar, podendo ocorrer bradicardia e alterações no
eletrocardiograma. Alguns pacientes podem apresentar exantema, acompanhado ou
não de prurido generalizado e também podem surgir infecções provocadas por
18
bactérias que dependendo da gravidade do quadro clínico, contribuem para o óbito
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2016).
1.1.6 Tratamento e profilaxia
Ainda não há tratamento específico para a dengue, a medicação é utilizada
apenas como suporte para amenizar os sintomas (DIAS, 2010). As condutas
terapêuticas são realizadas para o combate da febre, manutenção do equilíbrio de
fluidos e os parâmetros de coagulação sanguínea (WHO, 2009).
Dentre os medicamentos utilizados, aqueles que apresentam em sua
composição o ácido acetil salicílico não devem ser administrados aos pacientes,
pelo fato desses ocasionarem efeito anticoagulante, o que pode levar ao aumento do
risco de hemorragias (OISHI et al., 2007).
Diante disso, sabe-se que são muitos os desafios para se obter uma terapia
específica para a dengue na prática clínica, evitando assim as complicações da
doença que são observadas entre o quarto e sexto dia. Assim, desenvolver um
tratamento que permita uma ação precoce no curso da doença é alvo de várias
pesquisas (WHITEHORN e SIMMONS, 2011) .
Uma forma de prevenção da doença existente é o controle do vetor, no
entanto, acaba sendo uma medida que requer gasto, e difícil de ser mantida, pelo
fato que são necessários grandes investimentos com inseticidas e campanhas para
a mobilização das pessoas (GUBLER e CLARK,1994).
Outro método de prevenção contra a dengue seria o uso de uma vacina eficaz
contra os quatro sorotipos. Muitas vacinas são alvos de estudos e se encontram em
fase de testes, dentre essas tendo como base o vírus atenuado, inativado,
quiméricos, de subunidades proteicas, DNA e também de vetores recombinantes
(YAUCH e SHRESTA, 2014).
1.1.7 Antivirais para dengue
A busca por antivirais para dengue vem se tornando cada vez mais
importante devido à ocorrência de várias epidemias, o que causa uma ameaça na
saúde da população mundial (NOBLE et al., 2010).
19
As etapas do ciclo de vida do vírus que consistem na entrada do vírus, fusão
da membrana, replicação do genoma, montagem e saída da célula podem ser alvos
de algumas moléculas (KELLER et al., 2006; NOBLE et al., 2010).
Algumas proteínas virais essenciais para o ciclo de replicação são potenciais
alvos para o desenvolvimento de antivirais (NOBLE et al., 2010). A proteína E
medeia a ligação do vírus aos receptores da superfície celular. A interrupção da
interação da proteína E com esses receptores seria uma alternativa, semelhante ao
desenvolvimento recente de antagonistas para o co-receptor de HIV-1 (CCR5), que
resultou em um fármaco anti-HIV (KURITZKES, 2009; NAVARRO-SANCHEZ et al.,
2003; TASSANEETRITHEP et al., 2003).
Outra abordagem alternativa é a utilização de anticorpos monoclonais
neutralizantes. Estes anticorpos reconhecem e se ligam a uma região específica do
domínio ED3 da proteína E responsável por apresentar os determinantes críticos de
neutralização. Os mecanismos de neutralização são realizados nos estágios iniciais
de infecção, bloqueando a endocitose e também a fusão direta ou indireta com a
membrana do endossomo. Atualmente, está disponível no mercado para uso, o
Palivizumab que consiste em um anticorpo monoclonal recombinante humanizado
específico para o vírus sincicial respiratório. No entanto, alguns estudos
demonstraram avanços promissores para a utilização de anticorpos monoclonais
para outros vírus (GROMOWSKI et al., 2008; LOK et al., 2008; OLIPHANT et al.,
2005).
Outros alvos estão sendo explorados como as proteínas não estruturais (NS3
e NS5), ambas apresentam atividades enzimáticas conhecidas e são essenciais
para a replicação viral. O domínio N-terminal de NS3, em conjunto com NS2B,
contém uma atividade serina protease e o domínio C-terminal funciona como uma
helicase de RNA. Já a NS5 funciona como metiltransferase e RNA polimerase
dependente de RNA (RdRp) (KHROMYKH et al., 1998; RAWLINSON et al., 2006;
YAP et al., 2007).
Investigações com diferentes compostos também são realizadas no intuito de
desenvolver um antiviral eficiente. Os fucoidanos são um grupo de polissacarídeos
que tem como constituintes L-fucose e éster sulfato. Esses compostos são derivados
de algas marinhas (Cladosiphon okamuranus) e já foram descritos, como
responsáveis por várias atividades biológicas, inclusive antivirais. Em um ensaio in
vitro realizado com cultura de células BHK-21, observou-se que este polissacarídeo
20
inibiu a infecção das células pelo vírus dengue-2 (HIDARI et al., 2008; LI et al.,
2008).
Nesse contexto, foi realizado um estudo com a cloroquina conhecida por
afetar as vias exócrinas intracelulares por meio do pH endossômico. O ensaio foi
conduzido em cultura de células Vero e C6/36, as quais foram infectadas com vírus
dengue-2 e tratadas com o composto. Os resultados mostraram que a partir de uma
dose de cloroquina (50μg/mL), não considerada tóxica às células, levou à inibição da
replicação do vírus apenas na cultura de células Vero. Estes dados sugerem que a
inibição da infecção viral induzida por cloroquina é devido à interferência com
vesículas ácidas em células de mamíferos (FARIAS et al., 2013).
Em suma, vários esforços são realizados pelos pesquisadores para que se
encontrem inibidores específicos do vírus dengue e novas ferramentas para que se
avalie a eficácia de novos medicamentos.
1.2 Plantas medicinais no Brasil
Há milhares de anos as populações têm adotado como maneira de combater
as diversas patologias a utilização de produtos naturais, ou seja, uma forma
alternativa que complementava a medicação sintética. As plantas medicinais tem
uma relevante função na saúde mundial, em que aproximadamente 30% das drogas
avaliadas com efeitos terapêuticos são obtidos de produtos naturais (CALIXTO,
2005; VEIGA-JÚNIOR e MELLO, 2008).
Diante das observações populares sobre o uso e eficácia dessas plantas é
possível identificar as virtudes terapêuticas dos vegetais, que são descritos com
frequência pelos seus efeitos medicinais, mesmo sem o conhecimento total de seus
constituintes químicos. Este fato, desperta o interesse de pesquisadores em
desenvolver diversos estudos que podem envolver áreas como a botânica,
farmacologia e fitoquímica (MACIEL et al., 2002).
No Brasil, o uso de plantas medicinais foi disseminado devido à cultura
indígena. Trata-se de um país que apresenta uma enorme diversidade na flora,
resultando em uma fonte rica de produtos terapêuticos. Entretanto, o potencial para
a descoberta de plantas para o desenvolvimento de drogas é ainda uma questão
pouca explorada ou regulamentada, isto é, cerca de menos de 10% dessas plantas
já foram analisadas devido a suas características biológicas e menos de 5% já foram
21
submetidos a estudos fitoquímicos (CALIXTO, 2000; LUNA, et al., 2005; RATES,
2001).
O Nordeste brasileiro consiste em uma região com aproximadamente
1.539.000 km2, de clima quente e seco e vegetação seca denominada de Caatinga
que apresenta cerca de 1000 espécies de plantas (LEMOS e RODAL, 2002;
SAMPAIO, 2002; SANTOS et al., 2008). Entretanto, apesar desta grande
diversidade, esta região apresenta plantas que são relativamente subexploradas em
relação às descobertas de substâncias ativas (LUNA et al., 2005).
Vários são os fatores que influenciam nos efeitos terapêuticos proporcionados
por essas plantas. Entre esses fatores, variações temporais e espaciais, além disso,
as proporções relativas de metabólitos secundários que ocorrem de acordo com
níveis sazonais e diários. Tais metabólitos representam conexão química entre as
plantas e o ambiente a qual esta se encontra. Com isso, as principais condições que
podem interferir na alteração e produção de metabólitos secundários são: a
sazonalidade, o índice pluviométrico, temperatura, altitude, como também a época
da coleta, pelo fato de que a natureza dos compostos ativos não se mantém
constante durante todo o ano (GOBBO-NETO e LOPES, 2007).
Sabe-se que alguns desses fatores descritos acima, podem se correlacionar
entre si e assim não podendo atuar isoladamente, isto é, acarretando uma influência
em conjunto no metabolismo secundário (HENDRICKS et al., 1997).
1.2.1 Morinda citrifolia L.
A Morinda citrifolia conhecida popularmente como Noni, pertence à família
Rubiaceae. Esta família apresenta uma ampla distribuição, estando presente nos
mais diversos ambientes (MABBERLEY, 1997). O Noni é uma planta oriunda do
sudeste da Ásia, e seu cultivo se dá na Polinésia, Índia, Caribe, América do Sul e
Central, isto é, há uma distribuição pantropical. (WANG et al., 2002). Esta planta
também foi distribuída por vários viajantes colonizadores e por meio do oceano e
animais como pássaros que chegam até as ilhas (McCLATHEY, 2002).
As regiões tropicais apresentam uma maior quantidade de arbustos e árvores
de pequeno porte desta planta. Já em regiões subtropicais essa quantidade é bem
menor, visto que nas zonas temperadas são predominantes as herbáceas. O noni é
uma planta que tem seu crescimento bastante amplo em todo o pacífico e
22
representa uma das fontes mais tradicionais de medicamentos entre as ilhas do
pacífico, assim como possui ampla resistência a ambientes toleráveis, como: solos
secos, inférteis, ácidos e alcalinos (OLIVEIRA, 2009).
Segundo relatos da população e da literatura, algumas partes do Noni são
utilizadas na medicina tradicional são elas: os frutos, raízes e folhas. As folhas e os
frutos são utilizados na forma de comprimidos e chás, entretanto grande parte do
consumo dessa planta se dá por meio do suco dos frutos (PAWLUS et al., 2007).
Esta planta ganhou destaque como uma importante planta medicinal pelo uso
popular pelo fato de que começou a ser usada como remédio por mais de 2000 anos
pelos Polinésios, os quais acreditavam em uma ampla gama de efeitos terapêuticos,
podendo-se incluir ação antibacterianas, antivirais, antifúngicas, analgésica e como
“intensificadoras” do sistema imune. Desse modo, tradicionalmente sabe-se que a
folha, o fruto e a raiz são usados na prevenção e cura de várias doenças (WANG et
al., 2000).
1.2.1.1 Aspectos farmacobotânicos
A planta Morinda citrifolia é um arbusto que apresenta uma altura que varia de
3 a 10 metros e pode ser encontrada em ambientes ao nível do mar e também em
áreas de florestais de aproximadamente 1300 metros acima do nível do mar (WANG
et al., 2002).
Suas folhas são largas, de forma elíptica e abundantes, variando de 5 a 17
cm de comprimento e de 10 a 40 cm de largura. Suas flores apresentam uma
coloração branca com forma tubular e se dispõem de maneira agrupada e inseridas
no pedúnculo. Já os frutos, contêm muitas sementes e podem chegar entre 3 a 10
cm de comprimento e 3 a 6 cm de largura. Apresentam-se na forma oval e também
são denominados de frutos carnosos, nos quais após a coleta exibem um odor forte
e desagradável (CHAN-BLANCO et al., 2006).
Tais frutos podem resultar em uma cor amarelada ou esbranquiçada no
momento do amadurecimento, e, além disso, apresentar uma superfície grumosa
com formas poligonais (McCLATHEY, 2002). As sementes possuem um formato de
triângulo e uma coloração marrom, como também uma extremidade que as tornam
flutuantes, motivo pelo qual explica a ampla distribuição desta planta (WANG et al.,
2002).
23
Esta planta é considerada uma espécie precoce, pois há o início da produção
de seus frutos aproximadamente no primeiro ano de cultivo. Ademais, a partir do
momento em que está inicia a fase de produção dos frutos, esta se torna constante,
pois há produção durante todo o ano. Este fato nos faz observar que em uma
mesma planta há diferentes estádios de maturação dos frutos (CHAN-BLANCO et
al., 2006).
1.2.1.2 Composição química
A composição química da Morinda citrifolia engloba cerca de 200 fitoquímicos
os quais já foram isolados e identificados com distribuição nas diferentes partes da
planta. A quantidade de cada composto químico não tem apenas relação com cada
parte da planta, mas também do país o qual se originou. Seus compostos não
apresentam análise fitoquímica completa (DENG, et al., 2010; SINGH, 2012).
Existe a descrição de algumas classes de metabólitos incluindo as
antraquinonas que foram um dos principais compostos identificados, e, além disso,
os ácidos, glicosídeos, álcoois, flavonoides, cetonas e lignanas. Os glicosídeos e
álcoois apresentam propriedades anfipáticas e foram encontrados nos frutos
maduros, sendo responsáveis pelo sabor dos mesmos (BOWIE e COOKE, 1962;
WANG et al., 1999, 2000).
Aproximadamente 51 compostos voláteis foram encontrados também nos
frutos maduros, entre esses podemos destacar os ácidos orgânicos (ácido
hexanóico), cetonas, como também, a presença de um alcalóide denominado de
xeronina. Sabe-se que os frutos apresentam uma composição de 90% de água,
aminoácidos (ácido aspártico, ácido glutâmico, isoleucina) e componentes da
matéria seca que podem ser sólidos, fibras dietéticas e proteínas (FARINE, et
al.,1996; HEINICKE, 1985; SANG, et al., 2002). Já nas folhas foi possível isolar um
iridóide denominado de citrifolinina A-1, responsável pela inibição significativa da
proteína ativadora 1 (AP-1) que tem como função induzir a transcrição de vários
genes envolvidos na proliferação celular, metástase e metabolismo (LIU, et al.,
2001).
Vários estudos foram realizados envolvendo essa planta com o intuito de
avaliar sua ação terapêutica, de acordo com sua composição química, descrita
anteriormente. Dentre esses, um experimento foi realizado por Umezawa (1992) o
24
qual foi possível isolar um composto presente nas raízes do Noni, denominado de 1-
metoxi-2-formil-3-hidroxiantraquinona, que inibe o efeito citopático associado à
infecção pelo HIV nas células MT-4, sem haver o bloqueio do crescimento celular.
Ao se observar o destaque que tem alcançado as pesquisas sobre os
benefícios medicinais da Morinda citrifolia, são de extrema importância os estudos
que avaliem os seus reais benefícios. Como compostos obtidos dessa planta
apresentam vários efeitos terapêuticos promissores em relação às atividades
biológicas, como exemplo, a atividade antiviral (WANG et al., 2002).
25
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a ação antiviral do extrato bruto e frações obtidas da folha e dos frutos
(verde e maduro) da planta Morinda citrifolia L. na replicação do vírus dengue-
2 em cultura de células Vero.
2.2 Objetivos específicos
Preparar e caracterizar diferentes extratos e frações obtidas a partir da folha e
dos frutos (verde e maduro) de Morinda citrifolia L.;
Investigar a presença de metabólitos secundários nos extratos e frações
obtidas da folha e frutos pela CCD (Cromatografia em Camada Delgada);
Estabelecer a citotoxicidade de diferentes concentrações do extrato bruto,
resíduo aquoso e frações obtidos da folha e frutos de Morinda citrifolia em
cultura de células Vero pelo ensaio de MTT;
Avaliar a ação antiviral dos extratos bruto e frações hexano, acetato de etila,
clorofórmio e resíduo aquoso obtidas da folha e frutos de Morinda citrifolia L.
em culturas de células infectadas com vírus da dengue pelo ensaio de MTT e
PFU (Unidade formadora de placa).
26
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Delineamento experimental
Cultura de células
Infecção das células com
vírus dengue-2
(confirmação do estoque viral)
Extração do
RNA viral
RT-PCR para
vírus Dengue-2
Imunofluorescência
Indireta
Unidade
Formadora de
Placa (PFU)
Células
Vero
Células C6/36
(estoque viral)
Preparação das frações e extratos obtidos da folha e frutos
planta
Ensaio antiviral
27
3.2 Cultura de células
Para os experimentos foram utilizadas cultura de células Vero (linhagem
contínua proveniente de rim de macaco verde africano) e células C6/36 (linhagem
contínua proveniente do mosquito Aedes albopictus). Essas células foram cultivadas
em meio Leibovitz-15 (L-15) com L-glutamina (Invitrogen), suplementado com 10%
de soro bovino fetal inativado (SBF) (Invitrogen), 10% triptose fosfato (Sigma) e 1%
antibiótico e antimicótico (penicilina, estreptomicina, amfotericina) (Sigma). As
culturas de células Vero foram mantidas em estufa com 5% de CO2 a 37ºC e as
células C6/36 em estufa de 28ºC. Todos os procedimentos experimentais foram
realizados no Laboratório de Imunologia Clínica da UFRN.
3.3 Linhagem viral
O vírus utilizado nos experimentos foi o DENV-2 (New Guinea C). O estoque
viral foi obtido a partir da infecção de cultura de células C6/36 cultivadas em frascos
de cultura de 75 cm2 com monocamada de 90% de confluência. Após adicionar a
suspensão do vírus, as culturas foram mantidas sob agitação por 1 hora para que
ocorra a adsorção viral. Logo após a infecção viral, adicionou-se na cultura celular
15 mL de meio L-15 suplementado com 2% de SBF, 0,29g/L de L-glutamina, 1% de
antibiótico-antimicótico e 10% triptose fosfato e a mesma foi mantida a 28ºC por 7
dias para a replicação viral. Após esse período, o sobrenadante da cultura celular foi
transferido para um tubo e foram acrescentados 20% de SBF. Em seguida, alíquotas
de 2 mL foram armazenadas em criotubos à temperatura de -80ºC. A confirmação
da infecção foi realizada por imunofluorescência indireta utilizando a monocamada
de células C6/36 infectadas.
3.4 Ensaio de imunofluorescência indireta
A imunofluorescência indireta foi realizada para determinar a infecção viral
com DENV-2 na cultura de células C6/36. Inicialmente para a preparação das
lâminas, a suspensão celular foi centrifugada a 1000 rpm por 5 minutos, o sedimento
celular foi lavado três vezes com 1 mL de PBS (tampão fosfato-salino) pH 7,4 com
28
3% de SBF e com o auxílio do microscópio óptico a concentração de células foi
ajustada para aproximadamente 100 células por campo. A cada poço da lâmina de
imunofluorescência foram aplicados 10 μL da suspensão celular. As células foram
fixadas com acetona PA gelada durante 15 minutos. Depois que as lâminas ficaram
prontas, foram adicionados em cada demarcação 20μL de MIAF (fluído ascítico de
camundongos imunizados contra o DENV-2) diluído 1:100 em PBS contendo 3% de
SBF e depois as lâminas foram incubadas em câmara úmida a 37 ºC por 30 minutos.
Posteriormente, essas lâminas foram lavadas três vezes com PBS durante 5
minutos, secas à temperatura ambiente e incubadas com 20 μL do conjugado anti-
IgG de camundongo marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma),
diluído 1:100 em PBS com azul de Evans (1:20000), durante 30 minutos a 37 ºC em
câmara úmida. Após três lavagens com PBS, as lâminas foram montadas com
glicerina tamponada e observadas no microscópio de fluorescência para visualizar a
presença ou não da fluorescência nas células C6/36.
3.5 Extração de RNA viral
Para a extração do RNA viral foi utilizado o kit QIAamp ® Viral RNA
(QIAGEN). Inicialmente, 140μL do sobrenadante de cultura celular, 560μL solução
tampão AVL e RNA Carrier foram adicionados em tubo 1,5mL. Esta solução foi
homogeneizada em um vortex e incubada durante 10 minutos à temperatura
ambiente. Depois que ocorrer a lise, foram adicionados 560 μL de etanol absoluto, e
o material foi transferido para a coluna de sílica-gel que apresenta alta afinidade
para RNA e posteriormente centrifugado. Por fim, foram realizadas duas lavagens
com soluções AW1 e AW2, e o RNA que se ligou à coluna foi eluído mediante a
adição de 60 μL da solução AVE e em seguida foi estocado a -70ºC.
3.6 Transcrição Reversa pela Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR)
Para a confirmação da infecção viral pelo dengue-2 em cultura de células
C6/36 foi realizada a detecção do RNA viral por meio da utilização do kit Invitrogen-
OneStep RT-PCR na primeira etapa, já na segunda etapa foi utilizado o kit de Taq
DNA polimerase (Promega). A presença do material genético foi confirmada
utilizando a metodologia de Lanciotti et al., (1992) modificada.
29
A PCR foi realizada em duas etapas: na primeira foram utilizados 0,5 μL de
cada um dos iniciadores D1 e D2 (10μM) para os quatro sorotipos do vírus dengue
que são complementares a sequência do gene responsável por codificar as
proteínas C e prM. Para a transcrição foi utilizado um tubo de 0,2mL e adicionou-se:
5 μL do RNA extraído e 20 μL do mix para reação de RT-PCR. Em seguida foi
levado ao termociclador, seguindo os parâmetros: 55ºC por 30 minutos e 94ºC por 2
minutos, após isso as amostras foram submetidas a 35 ciclos subsequentes de
desnaturação (94ºC por 1 minuto), anelamento (55ºC por 1 minuto) e extensão (68ºC
por 1 minuto), seguido de 10 minutos de extensão final a 68ºC. Na segunda, foram
utilizados 1μL de cada um dos iniciadores (D1, TS1, TS2, TS3 e TS4) para os
sorotipos DENV1-4. Para reação em um tubo de 0,2mL e adicionou-se: 1 μL do
amplicon e 24 μL do mix para reação de PCR. Em seguida foi levado ao
termociclador, seguindo os parâmetros: 95ºC por 5 minutos, 40 ciclos de
desnaturação (94ºC por 1 minuto), anelamento (55ºC por 1 minuto) e extensão (72ºC
por 1 minuto), seguido de 10 minutos de extensão final a 72ºC. Para a visualização
dos amplicons, 10 µL do produto da segunda reação da PCR mais 2 µL de tampão
de corrida (6X DNA Loading Dye, Fermentas) foram submetidos à eletroforese
(110V/60 minutos) em gel de agarose a 2,0%, e tampão TBE 1% (Tris 0,089 M,
ácido bórico 0,089 M, EDTA 0,5 M pH 8,0) corado com SYBR® Safe DNA Gel stain
(Invitrogen, USA). Posteriormente, os géis foram visualizados através de um
transluminador com luz ultravioleta. O tamanho do fragmento produzido foi definido
por comparação com um marcador de peso molecular de 100pb (Fermentas).
3.7 Quantificação viral por PFU (Unidade formadora de placa)
A partir da propagação do vírus dengue nas células C6/36 foi realizada a
titulação viral. Inicialmente, as células Vero foram cultivadas em monocamada
confluente em frascos de cultivo celular de 75 cm2 (Corning). Quando foi atingida a
monocamada celular, as células Vero foram incubadas com 2mL de tripsina para a
transferência das células da garrafa, sendo em seguida ressuspensas em 23 mL de
meio L-15 suplementado. Logo após a homogeinização, 1 mL da suspensão de
células (1x104 células) foi transferida para cada poço da placa de 12 poços (Corning)
30
e foi incubada por 1 dia a 37ºC em 5% de CO2. Após esse período, o meio de cultura
foi removido da placa de 12 poços e, em seguida, adicionou-se 400 μL da diluição
seriada decimal de 10-1 a 10-5 do estoque viral em cada poço, em duplicata. Após
essa etapa, a placa foi incubada por 1 hora e 30 minutos a 37ºC, com suave
agitação de 15 em 15 minutos, para que ocorrer a adsorção viral. Passado este
tempo o inóculo viral foi removido e a cavidade foi lavada duas vezes com PBS 1X,
para que então ser adicionado 1 mL de “overlay” (meio L-15 2% SBF sem vermelho
fenol e carboximetilcelulose a 3% estéril, Sigma), e a placa foi incubada novamente
em estufa a 37ºC com 5% de CO2 por 7 dias. No fim do sétimo dia, o “overlay” foi
removido e a placa corada com preto de nafatleno (Sigma). O cálculo foi realizado
tendo como base a maior diluição do vírus a partir da contagem das placas que se
formaram, e também a diluição e o volume total do inóculo. Todos os valores foram
expressos em unidades formadoras de placa por mL (PFU/mL).
3.8 Obtenção do extrato bruto e frações da folha e frutos de Morinda citrifolia
3.8.1 Preparação da amostra vegetal
As folhas e os frutos (maduro e verde) da Morinda citrifolia L. foram coletados
no Horto Florestal da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, nos meses de
setembro e outubro de 2015. Desse modo, uma exsicata foi depositada como
documento taxonômico no Herbário da UFRN, sob número de registro UFRN 21013.
As folhas passaram pelo processo de secagem em estufa a 45ºC, com circulação de
ar, durante 48 horas e logo após foram trituradas em liquidificador. Já os frutos
foram lavados, suas sementes foram retiradas e os mesmos foram congelados para
posterior liofilização. Todo o processo de preparação dos extratos da Morinda
citrifolia L. foi realizado em colaboração com o Laboratório de Farmacognosia da
UFRN.
3.8.2 Extração Após a trituração das folhas e liofilização dos frutos de Morinda citrifolia L.,
iniciou-se o processo de extração. As extrações foram realizadas por meio do
processo de maceração dinâmica por 24 horas, sendo 4 horas de agitação e 20
31
horas de descanso durante três dias consecutivos, mais a troca diária do líquido
extrator, cuja constituição foi de etanol e água 95:5 (v/v), dentro de uma proporção
de 1:10 (p/v) de droga vegetal solvente. A partir deste procedimento foi obtido o
extrato bruto (hidroetanólico), que posteriormente foi seco sob pressão em
evaporador rotatório na temperatura de 45ºC.
3.8.3 Partição líquido-líquido
Inicialmente foi retirada uma quantidade do extrato bruto (hidroetanólico), que
foi resultado da extração, para que fosse seco e em seguida testado. Logo após
seguiu-se com o processo de partição, o qual foi feito o uso de três solventes de
polaridades crescentes, são eles: hexano (3 x 50mL), clorofórmio (3 x 50mL) e
acetato de etila (3 x 50mL). Ao final da partição, foram obtidas quatro frações:
hexano, clorofórmio, acetato de etila e o resíduo aquoso, que se refere à parte
residual do processo de cada partição.
3.8.4 Análise Cromatográfica
A análise cromatográfica foi realizada pelo método de Cromatografia em
Camada Delgada (CCD); que teve como fase fixa a cromatoplaca de sílica em gel
GF254 e como fase móvel um sistema eluente composto por hexano, acetato de etila
e metanol na proporção de (4:12:4, v:v:v), utilizando como revelador a vanilina
sulfúrica que é conhecido como reagente universal. Os valores de fator de retenção
(Rf) das substâncias foram definidos e comparados entre as demais amostras.
3.9 Ensaio da citotoxicidade e atividade antiviral do extrato bruto e frações
obtidas da folha e frutos de Morinda citrifolia
3.9.1 Preparação das diluições dos extratos e frações
Os extratos e as frações foram preparados dentro da capela de fluxo laminar,
sendo utilizadas suas massas obtidas do processo de partição com DMSO
(dimetilsulfóxido) (diluição 1:40) e L-15 (2%) nas seguintes concentrações: fruto
maduro: acetato de etila (131,5mg/mL); hexano (177,5mg/mL); clorofórmio
32
(79,08mg/mL); extrato bruto (1914mg/mL); resíduo aquoso (83,86mg/mL); fruto
verde: acetato de etila (158,6mg/mL); hexano (69,8mg/mL) clorofórmio
(48,08mg/mL); extrato bruto (1108mg/mL); resíduo aquoso (66,02 mg/mL); folha:
acetato de etila (34,46 mg/mL); hexano (18,1mg/mL); clorofórmio (13,83 mg/mL);
extrato bruto (514mg/mL); resíduo aquoso (42,04mg/mL). Em seguida, foram
homogeneizadas em um agitador mecânico para completar sua diluição. Foram
utilizadas as seguintes concentrações nos experimentos: 1000, 500, 250, 125, 62,5
e 31,2 μg/mL. Essas concentrações foram obtidas por diluições seriadas.
3.9.2 Determinação da citotoxicidade do extrato bruto e frações obtidas da
folha e frutos da planta
Ao final do processo de extração vegetal foram obtidos o extrato bruto e
quatro frações: hexano, acetato de etila, clorofórmio e resíduo aquoso de cada parte
da planta, isto é, da folha e frutos (verde e maduro), que foram utilizados no ensaio
antiviral em cultura de células Vero.
O ensaio de citotoxicidade teve como objetivo avaliar se as diferentes
concentrações dos extratos e frações obtidas da Morinda citrifolia apresentavam
toxicidade para cultura de células Vero.
As células Vero foram semeadas em placa de 96 poços e incubadas a 37ºC,
durante 24 horas. Após a incubação, o sobrenadante foi removido e 200μL dos
extratos nas diferentes concentrações, descritas acima, foram adicionados e
incubados durante 5 dias à 37ºC.
Ao final desse período, foi realizada a análise da citotoxidade por meio da
técnica de MTT. Inicialmente, o sobrenadante foi removido e 50μL da solução de
MTT (1mg/mL) foram adicionados. As placas foram reincubadas por 4 horas e
posteriormente o MTT foi removido, sendo adicionado em seguida 100μL de DMSO
(dimetilsulfóxido) para solubilizar os cristais de formazan. As placas foram
homogeneizadas e, por fim, a leitura foi realizada em espectrofotômetro a 540nm. O
ensaio do MTT trata-se de uma técnica colorimétrica, sensível e quantitativa,
proposto por Mosmann (1983) e modificado por Sieuwerts et al. (1995), amplamente
utilizada para a avaliação da citotoxicidade e viabilidade celular in vitro. A análise é
realizada tendo como base uma reação biológica que acontece nas células vivas
33
que catalisam desidrogenases mitocondriais que o reduzem a sal de formazan. Este
sal fica armazenado no citoplasma e é solubilizado após a interação com o DMSO
gerando um composto colorido, cuja intensidade de cor é lida em espectrofotômetro
a 540 nm. Altos valores de absorbância significam elevada produção de formazan
(cor roxa), indicando um número maior de células viáveis e alta atividade enzimática.
3.9.3 Atividade antiviral dos extratos e frações obtidas da folha e frutos da
planta
A atividade antiviral dos extratos e frações da Morinda citrifolia foi avaliada por
dois métodos de análise, no qual foi mensurado o efeito citopático por MTT e a
quantificação da carga viral por PFU.
Ambos os ensaios foram realizados em cultura de células Vero e em
duplicata. O teste de MTT foi realizado em placa de 96 poços, e o ensaio de PFU em
placa de 12 poços.
Nos ensaios, as células foram infectadas com DENV-2 à MOI de 1, e
incubadas em estufa de CO2 a 37ºC por 1 hora e 30 minutos. Após esse período, as
monocamadas foram lavadas com PBS 1X e em seguida foram adicionadas as
concentrações testes de extratos e frações. No ensaio para avaliar o efeito
citopático; utilizamos as seguintes concentrações: 1000, 500, 250, 125, 62,5 e 31,2
μg/mL. Para avaliar a carga viral, utilizamos as concentrações de 1000 e 500 μg/mL.
Após o tratamento com os extratos e frações, as células Vero foram reincubadas por
5 dias e ao fim deste período realizamos os ensaios de MTT e PFU.
3.10 Análise estatística
A análise estatística foi realizada por meio do programa de computador
GraphPad Prism® (GraphPad Software Inc., EUA) versão 6.0. Foi utilizado o teste
estatístico Two-way seguido de teste de múltipla comparação de Tukey's para o
ensaio da citotoxicidade e atividade antiviral. Os resultados obtidos da análise do
PFU, foram submetidos ao teste estatístico one-way ANOVA (não-paramétrico),
seguido pelo teste de Bonferroni. Para as análises, os valores considerados foram
de p< 0,05 indicando que são estatisticamente significantes.
34
4. RESULTADOS
4.1 Titulação do estoque viral e confirmação da infecção
A infecção viral em cultura de células C6/36 foi confirmada por
imunofluorescência indireta (Figura 1), utilizando anticorpos específicos para DENV-
2, e no sobrenadante da cultura foi detectado o RNA viral por RT-PCR.
O título viral obtido a partir da infecção da cultura de células C6/36 foi de 2,5 x
106 PFU/mL, e este foi usado para a realização dos experimentos.
Figura 1 - Ensaio de imunofluorescência indireta para detecção de DENV-2 em cultura de células C6/36. Lâmina positiva com típica fluorescência verde no citoplasma de células C6/36 infectadas por DENV-2 (Aumento 400X).
4.2 Citotoxicidade do extrato e frações obtidos da folha e frutos da planta
A partir da avaliação da citotoxicidade dos extratos e frações obtidos das
folhas da Morinda citrifolia L., conseguiu-se observar que as culturas de células
tratadas com as frações acetato de etila e hexano não apresentaram alterações
diante das concentrações testadas e por isso mantiveram viabilidade celular acima
de 90%. No entanto, a fração clorofórmio apresentou alta toxicicidade em células
tratadas na concentração de 1000 μg/mL, apesar de que entre as concentrações de
500 a 31,2 μg/mL foi observada uma viabilidade celular próxima de 90%. Já as
células que foram tratadas com o extrato bruto e o resíduo aquoso apresentaram
35
viabilidade próxima de 100 e 80%, respectivamente, nas concentrações de 1000 a
31,2μg/mL (Figura 2A).
Na análise da citotoxicidade dos extratos e frações obtidos dos frutos
maduros observou-se que a viabilidade celular variou de 90 a 100% no tratamento
com as frações acetato e hexano. Já as culturas células tratadas com a fração
clorofórmio mantiveram em todas as concentrações uma viabilidade de 80% e no
tratamento com o extrato bruto ou resíduo aquoso a viabilidade variou de 80 a 90%
em todas as concentrações utilizadas (Figura 2B).
A avaliação da citotoxicidade no fruto verde demonstrou que a cultura de
células tratadas com as frações hexano e acetato de etila apresentaram toxicidade
semelhante na concentração de 1000 μg/mL com aproximadamente 65% de
viabilidade celular, diferente das demais concentrações, nos quais apresentou a
viabilidade próxima de 100%. Já o tratamento com a fração clorofórmio induziu uma
viabilidade próxima a 80%. Diferente do que foi exposto nos resultados da folha e
fruto maduro, o tratamento das células com o extrato bruto teve uma menor
toxicidade na concentração de 1000 μg/mL, resultando em 80% de células viáveis,
ao contrário do que se observou nas demais concentrações, que se mostraram com
elevada toxicidade, chegando até 65% de viabilidade celular. No tratamento das
células com o extrato aquoso pôde-se observar uma viabilidade variando de 75 a
80% entre as concentrações (Figura 2C).
36
Figura 2 - Avaliação da citotoxicidade do extrato bruto e frações obtidas da folha e frutos de Morinda citrifolia em cultura de células Vero. (A) Folha (B) Fruto maduro (C) Fruto verde.
4.3 Atividade antiviral do extrato e frações obtidos da folha de Morinda
citrifolia
Fazendo referência ao ensaio antiviral dos extratos foi observado que o
controle positivo, representado pelas células infectadas com o DENV-2, demonstrou
uma viabilidade celular próxima de 65%, ou seja, observou-se 35% de morte celular.
As células tratadas com a fração acetato, apresentou uma viabilidade que variou
entre 90 e 100%, nas concentrações de 1000, 500 e 250 μg/mL. Mesmo com a
presença do vírus, houve uma diferença significativa, levando em consideração o
que foi observado no controle positivo. O tratamento com a fração clorofórmio, nas
células infectadas, demonstrou um aumento de 20 e 10% em relação ao controle
37
nas concentrações de 500 e 250 μg/mL, respectivamente. Na cultura de células
tratadas com a fração hexano foi observado uma diferença significativa em todas as
concentrações testadas, comparando-se com o controle positivo. Assim, mostrando
que o tratamento com a respectiva fração induziu a redução da infecção viral, pelo
fato de não haver o desenvolvimento do efeito citopático demonstrado na cultura de
células não tratadas e infectadas pelo vírus. O ensaio realizado a partir do
tratamento das células com o extrato bruto e resíduo aquoso, não apresentaram
diferença significativa na viabilidade celular em relação ao controle positivo (Figura
3).
Figura 3 - Ação antiviral do extrato bruto e frações obtidas da folha de Morinda citrifolia sobre a replicação do vírus dengue-2 em cultura de células Vero. (A) Fração Acetato de etila (B) Clorofórmio (C) Fração Hexano (D) Resíduo aquoso (E) Extrato bruto.
4.4 Atividade antiviral dos extratos obtidos dos frutos (maduro e verde) de
Morinda citrifolia
Em relação à atividade antiviral das culturas de células tratadas com os
extratos obtidos fruto maduro e verde, de acordo com o que foi observado com os
38
extratos e frações obtidas da folha, observou-se uma viabilidade celular em torno de
65% no controle positivo, isto é, na cultura de células infectadas pelo vírus e não
tratadas com os respectivos extratos.
No fruto maduro, as células tratadas com a fração acetato nas concentrações
de 1000 e 500µg/mL demonstraram uma viabilidade celular próxima de 100%,
levando a uma diferença significativa em relação ao controle positivo. Quando se
tratou as células infectadas com a fração hexano, observou-se que apenas na
concentração de 1000 µg/mL obteve-se aproximadamente 85% de células viáveis.
Nas células infectadas e tratadas com a fração clorofórmio não foi possível observar
nenhuma diferença significativa desse tratamento quando comparado ao controle
positivo. Levando em consideração o tratamento das células infectadas com o
extrato bruto e o resíduo aquoso, apenas foi observado que o extrato bruto
apresentou resultado satisfatório em relação ao controle positivo na concentração de
1000 µg/mL, com viabilidade celular próxima a 80% (Figura 4).
Figura 4 - Ação antiviral do extrato bruto e frações obtidas do fruto maduro de Morinda citrifolia sobre a replicação do vírus dengue-2 em cultura de células Vero. (A) Fração Acetato de etila (B) Clorofórmio (C) Fração Hexano (D) Resíduo aquoso (E) Extrato bruto.
39
No tratamento das células infectadas com as frações e extratos obtidos do
fruto verde observou-se que as frações acetato e hexano apresentaram ação
antiviral, em que a viabilidade celular das culturas infectadas e tratadas foi superior
ao controle positivo. A fração acetato induziu uma viabilidade celular de 100% na
concentração de 1000 µg/mL e nas demais uma variação de 80 a 90% de células
viáveis, com exceção da concentração 31,2 µg/mL. Quando se tratou as células
infectadas com a fração hexano, observou-se que na concentração de 1000 µg/mL
se alcançou 85% de células viáveis e nas demais concentrações, a viabilidade
celular foi de aproximadamente 80%. Nas culturas de células infectadas e tratadas
com o extrato bruto e o resíduo aquoso não se observou diferença significativa das
células infectadas tratadas quando comparado ao controle positivo, com exceção da
concentração de 1000 µg/mL no tratamento com o extrato bruto. Na cultura de
células infectadas e tratadas com a fração clorofórmio não foi possível observar
diferença significativa na viabilidade celular em relação ao controle positivo (Figura
5).
Figura 5 - Ação antiviral do extrato bruto e frações obtidas do fruto verde de Morinda citrifolia sobre a replicação do vírus dengue-2 em cultura de células Vero. (A) Fração Acetato de etila (B) Clorofórmio (C) Fração Hexano (D) Resíduo aquoso (E) Extrato bruto.
40
4.5 Quantificação do vírus dengue-2 no ensaio antiviral
A partir do sobrenadante da cultura de células Vero foi realizado o ensaio
antiviral, no qual avaliamos os diferentes extratos e frações das folhas e frutos da
Morinda citrifolia. O controle positivo (células infectadas com o DENV-2 e não
tratadas) apresentou um título viral, de 2,5 x 104 PFU/mL.
O tratamento com o extrato e as frações obtidas da folha da Morinda citrifolia
apresentou os resultados mais interessantes no qual todas as frações utilizadas para
este ensaio apresentaram ação antiviral. A fração acetato de etila na concentração
de 1000µg/mL reduziu a carga viral em 10 vezes, em comparação com o controle.
Já as frações hexano e clorofórmio, reduziram por completo a carga viral quando
testados nas concentrações de 500 µg/mL (Figura 6A).
As frações acetato de etila e hexano obtidos do fruto maduro da planta
apresentaram ação antiviral significativa, demonstrando uma diminuição de 10 vezes
na concentração de 500 e 1000µg/mL, respectivamente. O extrato bruto apresentou
uma redução total da carga viral na concentração de 100µg/mL em relação ao
controle (Figura 6B).
Em relação ao extrato e frações obtidas do fruto verde houve ação antiviral
quando foi utilizado o extrato bruto na concentração de 1000µg/mL reduzindo por
completo a carga viral em relação ao controle, diferentemente do que apresentaram
as frações acetato de etila e hexano, as quais não demonstraram ação antiviral
(Figura 6C).
41
Figura 6 – Análise de PFU da ação do extrato bruto e frações da folha e frutos de Morinda citrifolia sobre a replicação do vírus dengue-2 em cultura de células Vero. (A) Folha (B) Fruto maduro (C) Fruto verde. 4.6 Identificação dos metabólitos secundários presentes nos extratos e frações
obtidos da Morinda citrifolia
A análise cromatográfica em CCD dos extratos e frações obtidas da folha e
frutos da planta revelou bandas distintas e sugestivas de saponinas, terpenos e
flavonoides. A utilização do revelador vanilina sulfúrica nos permitiu identificar sete
bandas com Rf 0,12; dois com Rf 0,75 e dois com Rf 0,82, todas entre as frações
clorofórmio, acetato de etila e hexano. Houve também duas bandas com Rf 0,19 nos
extratos brutos (hidroetanólico) obtidos dos frutos (maduro e verde) (Figura 7).
42
Figura 7 - Cromatografia em camada delgada e os respectivos fatores de retenção das bandas. (A) Folha (fração hexano), (B) Folha (fração clorofórmio), (C) Folha (fração acetato de etila), (D) Fruto maduro (extrato bruto), (E) Fruto maduro (fração acetato de etila), (F) Fruto maduro (fração hexano), (G) Fruto verde (extrato bruto), (H) Fruto verde (fração hexano), (I) Fruto verde (fração acetato de etila).
B C D E G H I F A
0,12 0,12 0,12 0,19 0,19
0,75
0,82
43
5. DISCUSSÃO
Atualmente, a dengue ainda representa um desafio à saúde pública, com isso
a busca por antivirais e o desenvolvimento de vacinas para combater a infecção pelo
vírus dengue tem sido objetivo de vários estudos. Dessa forma, uma nova
abordagem vem sendo instrumento dessas pesquisas que é a utilização de plantas
medicinais, juntamente com seus compostos que fazem parte de sua constituição
química. A importância de se usar a maioria dessas plantas inclui o fato de que
podem apresentar baixos efeitos colaterais e também representa uma alta
acessibilidade na natureza (KWON et al., 2010; ZANDI et al., 2009).
Dentre essas plantas, podemos destacar a Morinda citrifolia, popularmente
conhecida como Noni, que se trata de uma planta que foi bastante utilizada pelos
povos antigos da Polinésia, e que hoje já é bem conhecida pelas pessoas e na
medicina tradicional pelo fato de apresentar ação terapêutica, combatendo várias
enfermidades (MULLER, 2007).
Com base em nossos resultados, a análise da citotoxicidade realizada
demonstrou que o tratamento das células Vero com os extratos e frações obtidas da
folha e frutos verde e maduro de Morinda citrifolia não apresentaram citotoxicidade
para maioria das concentrações testadas, com exceção do extrato bruto obtido do
fruto verde.
Arpornsuwan e Punjanon (2006) realizaram a mesma análise de
citotoxicidade em diferentes culturas de células, entre elas duas linhagens normais
(BHK e Vero) e três linhagens de células cancerígenas (Hep2, MCF7, LAN5)
tratadas com o extrato metanólico (bruto) obtido dos frutos de Morinda citrifolia. Foi
demonstrado que as células Vero quando tratadas com o extrato também
apresentaram 100% de viabilidade, bem semelhante aos resultados obtidos nas
células BHK e Hep2, que se mantiveram com 94% e 87% de viabilidade,
respectivamente, a partir de uma concentração de 0,1mg/mL, considerada muito
tóxica em células LAN5 e MCF7.
Em outros estudos, extratos obtidos dos frutos dessa planta resultaram em
toxicidade em cultura de células. Dentre esses, Candida e colaboradores (2014)
observaram citotoxicidade do extrato etanólico (bruto) obtido dos frutos de Morinda
citrifolia em cultura de células de melanoma B16-F10. Os resultados demonstraram
44
que o extrato foi tóxico em todas as concentrações testadas havendo assim inibição
de 45% na taxa de proliferação celular.
Shalan (2016) avaliou a citotoxicidade de extratos brutos obtidos da folha e do
fruto de Morinda citrifolia em camundongos fêmeas. O estudo de seis meses
demonstrou que o extrato obtido do fruto ocasionou efeitos de toxicidade crônica na
concentração de 2 mg/mL, confirmada pela histologia do fígado com necrose,
redução do tamanho e aumento do marcador hepático AST (aspartato
aminotransferase). Em três meses de experimento, apenas 60% das células do
fígado se mantiveram viáveis.
Diante do que foi observado sobre a toxicidade, é possível destacar que esta
característica pode estar relacionada à concentração utilizada em cada experimento
e também seus constituintes presentes nas diversas partes da planta.
Segundo a literatura, são poucos os estudos que já foram realizados na
tentativa de identificar a ação antiviral de extratos obtidos da planta Morinda citrifolia.
No entanto, outras atividades biológicas foram descritas, como: atividade
antioxidante, anti-inflamatória, analgésica, imunomoduladora, antibacteriana,
antitumoral, mostrando que as diversas partes das plantas apresentam compostos
fitoquímicos responsáveis por essas respostas.
No ensaio antiviral realizado no presente estudo, observou-se que o
tratamento das células infectadas com as frações e extratos obtidos tanto da folha
como do fruto da Morinda citrifolia L. apresentaram uma ação antiviral nas diferentes
concentrações estudadas, demonstrando que quanto maior a concentração no
tratamento das células infectadas, maior a capacidade dos extratos de proteger a
célula do efeito citopático resultante da infecção viral.
Outro resultado importante foi a redução total da carga viral nas células
tratadas com as frações obtidas da folha (hexano e clorofórmio), ambas nas
concentrações de 500 µg/mL e também no tratamento com o extrato bruto obtido do
fruto maduro e verde, na concentração de 1000 µg/mL.
De acordo com Selvam e colaboradores (2009), a atividade antiviral e
citotoxicidade de frutos de Morinda citrifolia foram analisadas contra a replicação dos
vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) e da hepatite C (HCV) em células MT-4 e
Huh 5.2, respectivamente. Extratos de metanol e etanol foram obtidos dos frutos
pelo processo de percolação, demonstrando assim uma proteção máxima de 18%
do efeito citopático do HIV-1 em células MT-4, depois da infecção aguda. Além
45
disso, foi observada também a inibição do RNA viral do HCV na concentração de
0,98 ug/mL do extrato.
Em outro estudo realizado com HCV, observou-se que o extrato de metanol e
etanol obtidos dos frutos maduros da Morinda citrifolia apresentaram atividade anti-
HCV em cultura de células Huh7.5, mostrando assim a eficiência dessa planta no
combate ao HCV (RATNOGLIK et al., 2014).
Essa planta também apresenta efeito sobre o mosquito transmissor da
dengue, o Aedes aegypti, demonstrando atividade larvicida e efeitos pupiciais. Isto
foi observado a partir do extrato bruto (metanólico) obtido das folhas. Tais efeitos se
deram após 24 e 48 horas de exposição ao extrato, mostrando uma mortalidade
considerada moderada dos estágios de larvas e pupas do mosquito vetor. É notável
que por meio destes resultados pôde-se confirmar que a Morinda citrifolia
demonstrou ser um promissor larvicida contra o Aedes (KOVENDAN et al., 2012).
Tang e colaboradores (2012) realizaram um ensaio bem semelhante ao
presente estudo, no entanto, analisou o potencial antiviral de extratos metanólicos
de quatro espécies de plantas de diversas famílias: Mormordia charantia,
Andrographis paniculata, Citrus limon, Cybopogon citratus, Pelargonium citroum e
Ocimum sanctum nas concentrações de 0,20; 0,050; 0,075; 0.001; 2,5 e 1,5 mg/mL
contra o DENV-1. Os resultados mostraram que tais extratos apresentavam um
grande teor de flavonoides e estes por sua vez apresentaram uma capacidade de
inibição do vírus, principalmente nas plantas A. paniculata e M. charantia.
Zandi e colaboradores (2013) também avaliaram a atividade antiviral contra o
vírus dengue em cultura de células Vero. No entanto, diferente do nosso estudo,
utilizaram o extrato aquoso (concentrações de 86,59 a 95,19 μg/mL) obtido das
raízes da planta Scutellaria baicalensis. Os resultados demonstaram que as células
tratadas com o extrato apresentaram valores de IC50 entre 56,02 e 77,41μg/mL.
Conforme os estudos decritos acima, também obtivemos resultados
significativos nas células infectadas e logo após tratadas com o extrato bruto obtido
dos frutos (maduro e verde), com aumento da viabilidade próxima a 25%.
É notável que diante dos ensaios antivirais, a maioria deles fazem uso do
extrato bruto obtido desta planta, com isso nosso estudo tem bastante relevância e
pode ser considerado pioneiro pelo fato de não fazer uso apenas do extrato bruto,
mas também de diferentes frações obtidas das folhas e frutos da M. citrifolia.
46
Em relação a outros estudos que utilizaram plantas da mesma família da
espécie estudada (Rubiaceae), foi possível encontrar atividade antiviral contra o
herpesvírus simples 2 (HSV-2) a partir do extrato bruto obtido das raízes da planta
Nauclea latifolia (DONALISIO, et al., 2013). Reis e colaboradores (2008) avaliaram
as atividades imunorreguladoras e antivirais de amostras de Uncaria tomentosa que
foram testadas em um modelo de infecção in vitro. Os monócitos humanos
infectados com DENV-2 foram incubados com o extrato bruto (hidroetanólico) de U.
tomentosa (obtido da casca de caule) ou com as suas frações pentacíclicas de
alcalóide. A atividade antiviral foi determinada por detecção de antígeno viral
(DENV-Ag) em monócitos por citometria de fluxo e diante disto foi demonstrando
atividade inibitória tanto pelo extrato quanto pela fração alcalóide, reduzindo
significativamente a detecção do antígeno viral (DENV-Ag) em monócitos. Mthethwa
e colaboradores (2014) também observaram que o extrato metanólico (bruto) obtido
das raízes da planta Vangueria infausta causou um efeito antiviral contra o vírus
HIV-1 em cultura de células MT-4, assim como, ação antibacteriana.
Como foi descrito anteriormente, a Morinda citrifolia também induz outras
ações biológicas. Desse modo, Candida e colaboradores (2014) observaram que o
extrato bruto etanólico obtido dos frutos desta planta apresentou atividade
antimicrobiana inibindo o crescimento de Staphylococcus aureus. Esta bactéria foi
menos resistente ao extrato etanólico de frutos de Morinda citrifolia L. do que a
Escherichia coli a partir das concentrações de 1 mg/mL e 10 mg/mL,
respectivamente.
Além da atividade antibacteriana, um estudo mostra que o extrato metanólico
(bruto) obtido dos frutos da Morinda citrifolia foi responsável por uma potente ação
anti-inflamatória na presença do composto 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate
(TPA), responsável por induzir a inflamação. O isolamento de metabólitos presentes
no extrato metanólico foi realizado e obteve-se: as antraquinonas, glicosídios e
flavonoides, responsáveis por essa resposta. Além disso, esses compostos foram
avaliados contra a ativação do antígeno precoce do vírus de Epstein-Barr (membro
da família do vírus Herpes) induzido por TPA, resultando assim em efeitos inibidores
moderados (AKIHISA, et al., 2007).
No tratamento de células H37Rv com o extrato bruto (etanólico) obtido das
folhas de Morinda citrifolia L. observou-se a atividade antituberculosa com 89% de
inibição. Além disso, também foi obtida a fração hexano mostrando um resultado
47
significativo com 95% de inibição no crescimento de Mycobacterium tuberculosis
(SALUDES, et al., 2002).
Além do extrato bruto etanólico, é possível também observar que o extrato
bruto de metanol que foram obtidos dos frutos e das folhas de M. citrifolia, induziu
uma atividade anti-angiogênica a partir de ensaios in vivo. Além desse extrato, a
fração clorofórmio do extrato metanólico apresentou os mesmo resultados (BEH,
2012).
Sabemos que a importância de se fazer uma caracterização dos extratos é
crucial pelo fato de se obter uma análise qualitativa dos compostos majoritários
presentes em cada fração ou extrato obtido das diversas partes da planta. Desse
modo, é necessária uma triagem dos extratos para que então possamos direcionar o
metabólito presente com a determinada atividade biológica. Compostos como
alcalóides, flavonoides e antraquinonas têm sido identificados (ASSI et al., 2015).
A análise cromatográfica realizada no respectivo trabalho possibilitou a
identificação de bandas sugestivas para saponinas, terpenos e flavonoides. Esses
resultados encontrados estão de acordo com a literatura pelo fato de ocorrer a
presença de terpenos e flavonoides nas folhas e frutos (POTTERAT e
HAMBURGUER, 2007; SASIKUMAR, et al., 2012). A presença de saponinas nos
frutos também foi relatada em estudo (SIDDIQUI et al; 2007).
Em outra análise fitoquímica realizada a partir do extrato etanólico (bruto)
obtido dos frutos maduros e verdes foi observado que nos testes para identificação
dos compostos presentes foram detectados além dos flavonoides, resultado bem
semelhante ao nosso estudo, também os alcalóides, glicosídeos cardiotônicos,
taninos, triperpenos e esteroides (LIMA, 2013).
Em um estudo que também se fez uso da fração clorofórmio a partir do
extrato bruto (hidroetanólico) obtido dos frutos de M. citrifolia resultaram após
triagem fitoquímica em compostos de diferentes classes, como: polissacarídeos,
antraquinonas e alcaloides (NAYAK e MENGI, 2010).
Os flavonoides participam das funções vitais da planta, como crescimento,
desenvolvimento e proteção contra ataque de patógenos. De acordo com alguns
relatos, vários flavonoides podem apresentar uma atividade contra o vírus dengue
(PARIDA et al., 2002). Os flavonoides também foram descritos como os
responsáveis pela atividade antiviral contra outros vírus, incluindo o citomegalovírus,
48
HSV-1, HSV-2 e alguns tipos de adenovírus humanos (CHIANG et al., 2003; EVERS
et al., 2005).
Zandi e colaboradores (2011) testaram quatro tipos diferentes de flavonoides
em cultura de células Vero contra o vírus dengue-2, são eles: quercetina,
hesperetina, naringina e daidzeína. Os efeitos de cada composto foram avaliados
em diferentes etapas da replicação do vírus da dengue, incluindo adsorção viral e
replicação. Os resultados demonstraram que a quercetina exibiu atividade
significativa contra o vírus dengue-2, afetando a replicação intracelular do vírus, e
não sua entrada na célula hospedeira.
Os terpenos são conhecidos como um dos principais compostos que podem
ser identificados em plantas naturais com a finalidade medicinal. Trata-se de um
hidrocarboneto insaturado, existente na forma de óleos essências, seguindo uma
classificação denominada de mono, di e triperpeno. Suas principais características
farmacológicas são anti-inflamatória e antisséptica (FIRN, 2010).
Em um estudo recente realizado por Bajpai e colaboradores (2016), foi
observado pela primeira vez a atividade antiviral promovida por um tipo de diterpeno
denominado sugiol isolado a partir de uma planta da espécie Metasequoia
glyptostroboides. Os resultados demonstraram a inibição da replicação do vírus da
gripe, H1N1, em cultura de células MDCK. Esses achados reforçam fortemente a
sugestão de que sugiol poderia ser um candidato a um futuro antiviral com uma
potente eficácia.
As saponinas são compostos não nitrogenados que se dissolvem em água,
dando origem assim a soluções espumantes. Suas prováveis ações terapêuticas
estão relacionadas às propriedades diuréticas, digestivas e também é uma fonte rica
de vitamina P (KAR, 2007). Um estudo semelhante ao descrito anteriormente,
demonstra também a saponina como um eficaz antiviral. De acordo com Xiuying e
colaboradores (2015), um tipo de saponina isolada da planta Paris polyphylla
também demonstrou ação antiviral contra o vírus da influenza A. Este estudo foi
realizado em cultura de células MDCK e também in vivo. Os resultados
demonstraram que a saponina apresentou notáveis efeitos de inativação no vírus, de
prevenção na adsorção e replicação viral. Além disso, causou uma redução da
mortalidade dos camundongos infectados com o vírus.
Finalmente, com base dados na literatura e nos resultados do presente
estudo observa-se o potencial antiviral de Morinda citrifolia, abrindo perspectivas para
49
estudos futuros, assim como, o isolamento dos compostos responsáveis pela
atividade, proporcionando a busca de candidatos a fármacos contra o vírus da
dengue.
50
6. CONCLUSÕES
Baseado nos resultados obtidos no presente estudo, conclui-se de acordo
com a cromatografia em camada delgada realizada sobre os extratos e frações
obtidas da planta percebeu-se que as bandas foram sugestivas para três classes de
metabólitos secundários diferentes.
Além disso, os extratos e as frações obtidas dos frutos e folha da planta
Morinda citrifolia L. não foram citotóxicos na maioria das concentrações testadas na
cultura de células Vero.
O tratamento das células infectadas com o vírus dengue-2 com as frações e
extratos obtidos dos frutos e folha da planta demonstrou atividade antiviral em
diferentes concentrações testadas, por meio da manutenção da viabilidade celular.
Como também, o tratamento com as frações obtidas da folha (clorofórmio e hexano)
propiciou a redução total da carga viral.
Por fim, este estudo cria perspectivas para futuras análises da atividade
antiviral com os outros sorotipos do vírus dengue, visando também o isolamento de
tais compostos na tentativa de buscar novos candidatos a fármacos, ampliando
assim o conhecimento terapêutico desta planta já existente.
51
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