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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR E GENÔMICA
CURSO DE BIOMEDICINA
Relação entre APE1 e NFE2L2 na regulação de genes ligados à
resposta ao estresse oxidativo
Lucas Oliveira Guerra
Natal-RN Nov/2018
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Relação entre APE1 e NFE2L2 na regulação de genes ligados à
resposta ao estresse oxidativo
Por
Lucas Oliveira Guerra
Orientadora: Prof. Dra. Lucymara Fassarella Agnez Lima
Natal
Nov/2018
Monografia Apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como Requisito Parcial à Obtenção do Título de Bacharel em Biomedicina.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
A Monografia relação entre APE1 e NFE2L2 na regulação de genes ligados a
resposta ao estresse oxidativo
elaborado por Lucas Oliveira Guerra
e aprovada por todos os membros da Banca examinadora foi aceita pelo Curso de Biomedicina e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial à obtenção do título de
BACHAREL EM BIOMEDICINA
Natal, 23 de Novembro de 2018
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________
Dra. Lucymara Fassarella Agnez Lima (Departamento de Biologia celular e
Genética)
_________________________________________
Dra. Fabiana Lima Bezerra (Departamento de Microbiologia e Parasitologia)
_________________________________________
Dra. Julliane Tamara Araújo de Melo Campos (FACISA/UFRN)
5
Agradecimentos
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq,
instituição financiadora do projeto.
Ao grupo da “meningite”, especialmente a Fabrícia, Daniele, Ana Helena e Thaís
por todo o suporte e paciência para me ajudar desde que comecei no laboratório.
A professora Dra. Lucymara Fassarella Agnez-Lima pela oportunidade no LBMG
e todo incentivo nos projetos.
Agradeço, por fim, a minha família, aos professores do curso e aos meus amigos
que fiz na instituição, principalmente Letícia, Lukas, Brunna e Maria Eduarda, por
todo apoio durante esta jornada, por todo carinho e atenção durante os piores
momentos, e por estarem sempre presentes na minha vida.
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Resumo
Organismos aeróbios enfrentam um dilema quanto aos benefícios gerados
pela respiração dependente de O2 e aos danos oxidados gerados pela formação
de espécies reativas de oxigênio (ERO), que oxidam biomoléculas e por isso são
importantes na resposta a agentes infecciosos. No entanto, essas moléculas
bioreativas geradas a partir do O2 também causam danos às células do
organismo, levando a complicações principalmente no DNA, lipídeos e proteínas,
por isso é imprescindível para a célula ter um mecanismo de proteção contra
estes danos gerados por ERO, como enzimas responsáveis pela eliminação dos
ERO e de reparo de DNA. Tendo em vista esses mecanismos, há APE1/Ref-1
como uma proteína multifuncional tendo função de reduzir fatores
transcricionais, muitas vezes facilitando a ligação do mesmo com o DNA, e ainda
função na via de reparo por excisão de bases (BER, do inglês: base excision
repair) e NFE2L2, um regulador chave na resposta celular ao estresse oxidativo,
responsável por promover a transcrição de inúmeras moléculas reguladoras da
homeostase redox, como o HMOX-1. O presente estudo procurou elucidar de
que maneira ambas as proteínas podem estar se relacionando intracelularmente
e se há diferença nessa relação ao bloquear porções distintas de APE1/Ref-1,
uma vez que em trabalhos prévios do nosso grupo foi possível observar uma
interação entre ambas as proteínas por meio de co-imunopreciptação e
sobreposição de genes em listas de transcriptomas obtidos a partir da utilização
de inibidores das diferentes funções de APE1/Ref-1. Para isso, foi proposto um
modelo de estudo baseado na cultura celular de monócitos (U937), na qual a
inflamação foi estimulada adicionando lipopolissacarídeo (LPS) à cultura por
tempo de 24 h. Posteriormente algumas culturas foram tratadas com um inibidor
indireto da função de reparo de DNA de APE1, a metoxiamina (MTX), e um
inibidor de sua função redox, ativador de fatores transcricionais, o E3330, por
mais 4 h, após o tempo com LPS. Resultados de qPCR nos mostraram que
houve um aumento na expressão gênica de NFE2L2 e de seu alvo downstream
HMOX-1 quando a cultura celular foi submetida ao tratamento com LPS+E3330
e apenas com E3330 o que nos leva a concluir que houve uma possível
regulação negativa da porção redox de APE1/Ref-1 sobre NFE2L2, e
7
consequentemente sobre seu gene-alvo HMOX-1. Resultados preliminares de
western blot foram obtidos, porém faz-se necessário a continuidade dos
experimentos a fim de obter reprodutibilidade e maior confiabilidade nos
resultados.
Palavras-chave: Inflamação. Espécie reativa de oxigênio. LPS. APE1. NFE2L2
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Abstract
Aerobic organisms faces a quandary as to the benefits acquired by the
aerobic respiration (which requires oxygen) and the damage caused by
generation of reactive oxygen species (ROS), which cause oxidation of
biomolecules. That propriety makes it important to eliminate infectious agents.
However, this bioreactive molecules generated by O2 also leads to damage to
organism it-self, especially in DNA, lipids and proteins, that’s why is
indispensable to the cell to have a defense mechanism against those damage
caused by ROS, as enzymes responsible for maintain redox status and DNA
repair enzymes. Aiming to observe the function of APE1, an enzyme the acts in
DNA repair pathway, and its function as a transcription factor reducer, along the
action of NFE2L2 as a transcription factor responsible to increase intracellular
levels of bioprotector molecules, like heme oxygenase 1(HMOX-1), these work
proposes to elucidated how both of these proteins interacts in the living cell and
whether exists a difference in that interaction when we use inhibitors for DNA
repair function and redox function of APE1/Ref-1. Once previous works of our
group showed up an interaction of APE1/Ref-1 with NFE2L2 in co-
immunoprecipitation and similarity of the gens observed in transcriptomes using
different APE1/Ref-1 inhibitors. Our group comes up with a cellular model of
inflammation using monocytes (U937), which an inflammatory model was
induced using LPS in cell culture for 24h; the negative control group did not
receive LPS. After that, both receive an indirect inhibitor of DNA repair function of
APE1, metoxyamine (MTX) or an inhibitor of redox function of APE1, E3330, both
were used for 4h in cellular culture after the 24h with LPS. Results of qPCR
showed that the levels of mRNA of NFE2L2 and its downstream target was
increased in cellular model containing just E3330 and the one that contains
LPS+E3330. These data may indicate that APE1 may control NFE2L2 in a
negative way. Preliminary results with western blot were obtained, but it needs
further experiments to get more reliable data.
Keywords: Inflammation. Reactive oxygen species. LPS. APE1. NFE2L2
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ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS ...........................................................................10
LISTA DE FIGURAS.........................................................................................11
LISTA DE TABELAS ........................................................................................12
INTRODUÇÃO...................................................................................................13
Espécies reativas de oxigênio............................................................13
Inflamação............................................................................................16
Mecanismos de reparo de dano oxidados e APE1............................16
Inibidores de APE1...............................................................................22
Análises de dados dos transcriptomas..............................................22
NFE2L2 e seu papel chave a resposta ao estresse oxidativo..............23
OBJETIVOS .....................................................................................................27
Objetivo geral........................................................................................27
Objetivo específico..............................................................................27
METODOLOGIA ...............................................................................................28
Análise da vias enriquecidas nas listas de transcritos ....................28
Indução da inflamação e tratamento com inibidor. ..........................28
Extração de RNA e proteínas.................................................................29
q-PCR .....................................................................................................29
Western Blot..........................................................................................30
RESULTADOS .................................................................................................32
DISCUSSÃO .....................................................................................................42
CONCLUSÕES ................................................................................................. 47
REFERÊNCIAS ................................................................................................48
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LISTA DE ABREVIATURAS
ERO – Espécies reativas de oxigênio
ERNs – Espécies reativas de nitrogênio
BER – Reparo por excisão de base
APE1 – Apurina/apirimidina (AP) endonuclease 1
UDG – Uracil DNA Glicosilase
MPG – N-Metilpurina DNA Glicosilase
OGG1 – 8-Oxoguanine DNA Glicosilase
NF-kB – Fator Nuclear kappa B
AP-1 – Activator Protein 1
TNF-α –Fator de Necrose Tumoral alfa
LPS – Lipopolissacarídeo
HIF-1 – Fator indutor de hipóxia 1
Erg-1 – Early Growth Response 1
E3330 – E) - 3 - (5, 6 - dimetoxi - 3 - metil - 1, 4 - dioxociclohexa - 2, 5 - dienil) - 2 - ácido
nonilpropenóico
MTX – Metoxiamina
NRF1 – Fator respitatório nuclear 1
SOD – Superóxido Dismutase
CAT – Catalase
GTPx – Glutationa Peroxidase
TRX – Tioredoxina
PRX – Peroxiredoxina
GST – Glutationa Transferase
HMOX-1 – Hemeoxigenase 1
NFE2L2 – Fator nuclear (eritróide)-like 2
Keap1 - Proteína associada a Kelch like 1
11
LISTA DE FIGURAS
Figura1. Redução O2 em H2O
Figura 2. Modificações de bases induzidas por espécies reativas de oxigênio
Figura 3. Via de reparo por excisão de bases
Figura 4. Atividades de APE1
Figura 5. Interseção transcriptoma down regulado de E3330 x alvos de NFE2L2
Figura 6. Interseção transcriptoma down regulado MTX x alvos NFE2L2
Figura 7. Interseção transcriptoma up regulado E3330 x alvos NFE2L2
Figura 8. Interseçãao transcriptoma up regulado MTX x alvos NFE2L2
Figura 9. Alteração da expressão de APE1 em células U937
Figura 10. Alteração da expressão de NFE2L2 em células U937
Figura 11. Alteração da expressão de HMOX-1 em células U937
Figura 12. Western blot para NFE2L2 e o controle endógeno b-actina.
Figura 13. Porcentagem relativa ao controle da expressão proteica de NFE2L2.
Figura 14. Western blot para APE1 e o controle endógeno b-catenina.
Figura 15. Mecanismo teórico da interação APE1 e NFE2L2 em resposta ao
estresse oxidativo
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Sequências dos primers utilizados para qPCR.
13
1. Introdução
1.1 Espécies reativas de oxigênio
A utilização de oxigênio (O2) no metabolismo energético de organismos
aeróbios é fundamental para oxidação completa da molécula de glicose, o que
garante uma produção elevada de ATP quando comparado à oxidação da
mesma em condições anaeróbias. Do total de oxigênio captado pela célula em
condições de aerobiose, 90% é utilizado na cadeia transportadora de elétrons,
sendo reduzido a água pelo complexo IV da mesma. O restante é reduzido a
radical ânion superóxido (O2‾) por meio da adição de um elétron, em seguida há
a adição de mais um elétron formando peróxido de hidrogênio (H2O2) e mais um
elétron em seguida é adicionado para formar o radical hidroxila (OH‾). As
espécies reativas de oxigênio (ERO) são átomos, moléculas ou íons derivados
do oxigênio, possuindo alta reatividade e instabilidade. Sendo produzidas como
resultado do metabolismo normal do organismo aeróbio como mostrado na
figura 1. A geração de radicais livres ocorre, em sua maioria, nas mitocôndrias,
membranas celulares e no citoplasma. Sendo a mitocôndria a principal fonte
geradora de radicais livres que se da por meio da cadeia transportadora de
elétrons durante a produção aeróbia de energia a partir de glicose e oxigênio. As
enzimas NADPH oxidases (NOX) são proteínas de membrana que tem a função
de transferir elétrons através das membranas celulares, podendo atuar na
geração de ERO no combate a patógenos (BARBOSA et al., 2010). Estas
moléculas, quando produzidas de maneira moderada, estão envolvidas na
eliminação de organismos patogênicos durante a inflamação, fagocitose,
produção de energia, sinalização intracelular e síntese de substâncias biológicas
(FELIPE MARTELLI et al., 1972), mas em altas concentrações elas produzem
modificações importantes em componentes celulares como proteínas, lipídeos e
ácidos nucléicos. Desta forma se mostra necessário haver um balanço entre a
sua produção e a sua depleção a fim de evitar a manifestação dos efeitos
deletérios à célula (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; DE OLIVEIRA;
SCHOFFEN, 2010).
As ERO podem ser divididas em 2 grupos: radicais livres e não-radicais. Os
radicais livres são aquelas moléculas contendo um ou mais elétrons
desemparelhados (ex. ânion superóxido e radical hidroxil), o que confere a alta
14
reatividade a molécula. Os não-radicais são resultado do compartilhamento dos
elétrons desemparelhados de dois radicais livres, e um exemplo deste tipo de
ERO é o peroxido de hidrogênio (H2O2) e o gás ozônio (O3) (BIRBEN et al.,
2012).
Figura 1. Mecanismo de produção de ERO e sua posterior conversão em 2 moléculas de água (H2O).
Os seres vivos que dependem dos processos oxidativos para manutenção de
suas funções metabólicas possuem mecanismos antioxidantes capazes de
regular estes processos e evitar que haja a produção elevada de ERO e com
isso sua ação deletéria sobre biomoléculas. Os antioxidantes são divididos em 2
grupos: antioxidantes enzimáticos: superóxido desmutase (SOD), catalase
(CAT), glutationa peroxidades (GTPx), tioredoxina (TRX), peroxiredoxina (PRX),
glutationa transferase (GST) e hemeoxigenase-1 (HMOX-1); e antioxidantes não
enzimáticos: retinol (Vitamina A), tocoferol (Vitamina E), ácidos ascórbico
(vitamina C), beta caroteno e gluatationa (GSH) (BIRBEN et al., 2012).
O estresse oxidativo é caracterizado pela superprodução de ERO como
ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxil sem que haja uma
eficiente depleção destas ou ainda devido à disfunção dos compostos
antioxidantes (HALLIWELL, 1994). Sob condições normais o balanço entre a
produção endógena de ERO e a capacidade de remoção dos mesmos por
mecanismos antioxidantes garante a sobrevivência do organismo (LIU et al.,
2018). O estresse oxidativo é capaz de gerar danos as principais biomoléculas
do organismo, levando a lipoperoxidação, danos oxidados no DNA e oxidação
de proteínas.
A lipoperoxidação leva à desorganização da bicamada lipídica que compõe a
membrana celular o que leva a inativação de receptores ligados a membrana e
aumenta a permeabilidade da mesma (GIROTTI, 1985). Produtos de
lipoperoxidação como aldeídos insaturados são capazes de formar cross-links
com proteínas celulares levando a sua inativação (ESTERBAUER et al., 1986).
15
Já em proteínas, as ERO podem levar a quebra da cadeia peptídica, alteração
da carga da proteína, formação de cross-links de proteínas e oxidar
determinados aminoácidos aumentando a susceptibilidade de haver proteólise
(KELLY; MUDWAY, 2003). No DNA, as ERO podem levar a diversas
modificações como: a degradação de bases, quebras simples ou duplas da fita
de DNA, modificações nas bases nitrogenadas, deleções e translocações.
Dentre estas o dano principal gerado pela oxidação na molécula de DNA é a
formação de 8-oxoguanina (revisado em Agnez-Lima et al., 2012). Danos
oxidados no DNA levam a processos de carcinogênese, envelhecimento
precoce, doenças autoimunes e neurodegenerativas caso não sejam reparados
pelos mecanismos de reparo de DNA intrínsecos às células. As principais
modificações causadas pelo estresse oxidativo na molécula de DNA são
mostradas na Figura 2.
Figura 2. Modificações de bases induzidas por ERO. (Retirado de BIRBEN et al.,
2012)
16
1.2 Inflamação
A inflamação uma resposta protetora do hospedeiro a microrganismos
invasores, podendo ela mesma levar a lesões teciduais. A resposta imune se da
pelo reconhecimento de padrões moleculares conservados em microrganismos
por meio de receptores Toll-like (TLRs) (ABBAS et al., 2012), culminando da
ativação de genes como NF-kB e AP-1, os quais são alvos transcricionais de
APE1. Além de promover a elevação da expressão de citocinas pro-
inflamatórias, a ativação destes receptores resulta na produção de ERO
resultante da ativação de NADPH oxidase (NOX) (OGIER-DENIS; MKADDEM;
VANDEWALLE, 2008). Células fagocíticas como macrófagos e neutrófilos
dependem da ativação de NOX para produção de ERO, sendo a elevação das
espécies reativas o mecanismo pelo qual estas células conseguem eliminar
eficientemente patógenos fagocitados (LAMBETH, 2004).
1.3 Mecanismos de reparo de danos oxidados e APE1
As lesões causadas por ERO no DNA são, em sua maioria, reparadas pela
via de reparo por excisão de bases (BER, base excision repair). BER é um
mecanismo celular de reparo de DNA, sendo responsável principalmente por
remover pequenas lesões que não distorcem a dupla fita, como bases
danificadas que se não forem reparadas podem levar a mutações e quebras da
fita de DNA durante a replicação caso permaneçam. Exemplos de danos nas
bases reparados por BER são bases oxidadas como 8-oxoguanina, bases
alquiladas como 7-metilguanina e bases desaminadas como hipoxantinas
formadas pela desaminação de adenina. Além disto, a via BER é o principal
mecanismo de reparo no DNAmt, sendo responsável pela integridade
mitocondrial devido a extensa produção de ERO no interior da mesma, levando
a processos de senescência celular quando não esta atuando de maneira efetiva
(SAS; SZABÓ; VÉCSEI, 2018).
A endonuclease apurínica/apirimidínica 1 (APE1) é uma proteína de extrema
importância nesta via, fazendo parte da família das exonucleases III que agem
por meio da retirada de sítios abásicos no DNA gerando assim uma extremidade
3’-OH livre para ação de uma DNA polimerase e posteriormente da DNA ligase,
finalizando o reparo. (AGNEZ-LIMA et al., 2012). O início da via BER se dá com
17
o reconhecimento da base danificada por uma DNA glicosilase, que podem ser
de dois tipos, as monofuncionais como UDG e MPG, e as bifuncionais como 8-
oxo-guanina glicosilase (OGG1). As monofuncionais são aquelas capazes
apenas de remover o base danificada, o que resulta em um sitio AP, que por sua
vez é clivado por uma AP endonuclease como APE1 produzindo uma ponta
3’OH e uma 5’dRP a qual é processada pela DNA pol β produzindo um terminal
5’P. As glicosilases bifuncionais além de clivarem a base danificada, também
são capazes de atuar como endonucleases, gerando pontas 3’dRP e 5’P
(OGG1) ou 3’P e 5’P (NEILs) (WALLACE; MURPHY; SWEASY, 2012). Estas
pontas 3’ necessitam ser processadas para gerar 3’OH e 5’P (HEGDE et al.,
2012) (SKARPENGLAND et al., 2016). Assim, por meio da ação de DNA
polimerases (polimerase β ou polimerase δ/ε com PCNA) há a inserção de um
novo nucleotídeo neste local e o reparo é finalizado com a atividade da DNA-
ligase que sela a ligação entre os nucleotídeos (THAPAR; DEMPLE, 2017).
Mais especificamente existem dois caminhos pelos quais a via BER pode
seguir a partir do sitio AP gerado pela DNA glicosilase, a polimerase β pode
inserir um nucleotídeo no sitio AP seguida da ação da DNA ligase 3 (Lig3) e
XRCC1, selando a fita e finalizando o reparo (short pacth BER, ou SP-BER). O
outro caminho que a via pode percorrer é a do Long Pacth BER, no qual as
polimerases δ e ε fazem a remoção de alguns nucleotídeos adjacentes ao sitio
AP e em seguida promovem o reparo através de FEN-1 e PCNA, esta última
ainda atua como proteína auxiliar para a polimerase δ e Lig 1, as quais selam a
fita e finalizam o reparo. (Figura 3).
18
Figura 3. O reparo por BER pode ocorrer por 2 maneiras diferentes: via curta
(short patch) na qual é removido apenas um nucleotídeo; e a via longa (long patch) na qual são removidos de 2 ou mais nucleotídeos (ROBERTSON et al., 2009).
As proteínas da via BER podem desempenhar funções além daquelas já
citadas de reparo de bases oxidadas no DNA, elas também têm sido descritas
como responsáveis por desempenhar outros mecanismos celulares. Dentre
estas, pode-se citar a APE1, proteína que exibe atividade de reparo na via BER,
mas também é responsável pela redução de diversos fatores transcricionais,
ativando-os. Estas duas atividades são mediadas por duas regiões distintas da
proteína, a região N-terminal desempenha a função redox, capaz de reduzir
fatores transcricionais (FTs), enquanto a região C-terminal desempenha a
função de reparo.
O gene humano de APE1 (APEX1) esta localizado no cromossomo 14 e
possui cerca de 3 kb de tamanho e codifica uma proteína com cerca de 37 kDa
(revisado por Thakur et al. 2014). A atividade de reparo de APE1 é restrita a
região C-terminal, o qual contém 3 resíduos em seu domínio que formam um
bolso hidrofóbico que reconhece e se liga a sítios AP, promovendo quebra de
19
ligação fosfodiéster 5’ gerando um 3’OH e 5’dRP para ação da DNA polimerase
(THAKUR et al., 2014).
APE1/Ref-1 ativa fatores de transcrição como AP-1 (Fos e Jun), NF-kB, Egr-
1, P53 e HIF-1, os quais estão envolvidos em processos de sobrevivência
celular, sinalização de crescimento e processos inflamatórios, aumentando a
atividade de ligação destes com o DNA (FISHEL et al., 2015). A ativação destes
FTs por APE1/Ref-1 se dá pela redução de sítios específicos de cisteína (Cys)
localizados no domínio de ligação ao DNA destes FTs, o que controla a
atividade transcricional do próprio FT. O mecanismo pelo qual APE1/Ref-1 ativa
os FTs se dá pela troca de um próton (H+) proveniente de um dos sítios ativos
de Cys na região N-terminal de APE1 (Cys65, Cys93, Cys99 or Cys138)
reduzindo os FTs (THAKUR et al., 2014). Ao reduzir outras proteínas, APE1
adquire um estado oxidado o que a impossibilita de realizar novas reduções.
Para manutenção do estado reduzido de FTs, APE1 necessita ser reduzida
novamente e isto é feito pela tiorredoxina (TRX) (QIN et al., 1996) (Figura 4).
Durante o processo inflamatório, alguns dos fatores reduzidos por APE1,
como NF-kB e AP-1, são necessários para promover a expressão de citocinas e
quimiocinas pró-inflamatórias. Observou-se que a utilização de um inibidor da
atividade redox de APE1 (E3330) reduz a expressão de TNF-α, IL-6, IL-12 e de
mediadores inflamatórios como oxido nítrico (NO) e prostaglandina E2 (PGE2)
em macrófagos tratados com LPS (JEDINAK et al., 2011). Nosso grupo, em
trabalhos anteriores, também observou estes mesmos efeitos ocorrendo em
monócitos U937.
A regulação transcricional promovida por APE1 também se deve por sua
função de endonuclease. Estudos recentes demonstram que genes alvo da
desmetilase LSD1 necessitam da atividade endonucleásica de APE1 para sua
transcrição. A ativação transcricional de genes é associada à metilação da lisina
4 (H3K4), da lisina 6 (H3K6) e da lisina 79 (H3K79), enquanto a metilação da
lisina 9 (H3K9) está ligada a inativação transcricional (KOUZARIDES, 2007).
LSD1 é uma enzima que contem flavina adenina dinucleotideo (FAD) e, ao
promover a desmetilação de histonas, ela gera H2O2, causando danos oxidados
ao DNA que necessitam de reparo efetivado pela OGG1 e APE1 (AMENTE et al.,
2010). Ao utilizar um inibidor indireto da função de reparo de APE1, como a MTX,
20
é provável que ocorra uma falha na progressão da expressão dos genes alvo de
LSD1, uma vez que o promotor contendo o sítio AP está ocupado pelo inibidor
indireto do reparo de DNA, mostrando que a função de endonuclease da APE1
pode estar ligada à promoção da expressão gênica.
Figura 4. APE1: proteína multifuncional, atuando no reparo de DNA e na ativação de fatores de transcrição responsáveis pela ativação de genes ligados à sobrevivência celular. (Figura retirada e traduzida de Tell et al., 2009).
A regulação de APE1 ocorre a nível transcricional e pós-traducional. A
presença de ERO, assim como alguns hormônios, pode estimular a síntese
proteica de APE1 e sua translocação para o núcleo (HSIEH et al., 2001).
Modificações pos-traducionais como acetilação, fosforilação e ubiquitinação
regulam a atividade de APE1 na célula, a estabilidade da proteína, sua interação
com outras proteínas e a distribuição celular(HEGDE; IZUMI; MITRA, 2012). Sua
atividade é de extrema importância para manutenção da estabilidade genômica
celular devido sua multifuncionalidade. Estudos prévios demonstram que a
ausência de APE1 é letal ainda no estágio embrionário, assim como seu
21
silenciamento em células tumorais pode ser uma perspectiva de terapia, uma
vez que sem ela há redução de atividade proliferativa e apoptose nestas células
(ZOU; MAITRA, 2008; JIANG et al., 2010). A desregulação de APE1 é associada
ainda ao aparecimento de doenças neurodegenerativas (NDs) (DAVYDOV;
HANSEN; SHACKELFORD, 2003), doenças cardiovasculares (CVDs) (CHOI;
KYOUNG JOO; HWA JEON, 2016) e progressão tumoral. Devido o alto
metabolismo e alta taxa de consumo de O2 neuronal, uma disfunção em APE1
prejudicaria BER neste tipo celular o que causa efeitos pronunciados e a
progressão acelerada da doença. Estudos baseados no aumento de fatores
antioxidantes ou no próprio aumento da expressão de APE1 em neurônios se
mostra neuroprotetora (MANTHA et al., 2012).
Os trabalhos disponíveis na literatura até o presente momento indicam que as
funções de APE1 como ativador de fatores de transcrição e de reparo de DNA
são completamente independentes, atuando de maneira separada. Luo et al.
(2008) demonstraram por meio de mutações na Cys65 do sitio ativo de APE1
inibiu sua função de redox sem alterar sua função de reparo, ao passo que
mutações em sítios críticos para a função de reparo de APE1, como a His39,
cessou sua atividade de reparo sem comprometer a função redox.
Tendo em vista sua dupla atividade, atuando tanto na via de reparo BER
quanto como um importante redutor de fatores de transcrição, é possível estudar
como estas atividades atuam separadamente, utilizando inibidores da função de
reparo indiretos (Metoxiamina) e inibidores da função redox (E3330).
22
1.4 Inibidores de APE1
A metoxiamina (MTX) é uma pequena molécula que age se ligando
diretamente aos sítios AP gerados após a ação da DNA glicosilase, impedindo
desta forma que APE1 consiga se ligar a estes e realizar a sua atividade, sendo
assim a Metoxiamina um inibidor indireto da atividade de reparo de APE1 (LAEV;
SALAKHUTDINOV; LAVRIK, 2017). A ação de MTX sobre o reparo de DNA por
APE1 pode levar a alterações na expressão gênica, mostrando, mesmo que
indiretamente, que ambas as funções podem ter pontos semelhantes em que
atuam de modo conjunto.
(E)-3-(5,6-dimetoxi-3-metil-1,4-dioxociclohexa-2,5-dienil)-2-ácido
nonilpropenóico (E3330) é um derivado quinino capaz de bloquear diretamente a
atividade redox de APE1, sua atividade consiste em se ligar a uma região
específica na porção N-terminal de APE1 aumentando a formação de pontes
disulfeto envolvendo os resíduos Cys65 e/ou Cys 93, de forma que diminui a
capacidade redox destes resíduos na molécula de APE1, tornando-a incapaz de
ativar fatores transcricionais (GROSS; GEORGIADIS, 2012).
1.5 Análises de danos dos transcriptomas
Análises de transcriptomas feitos anteriormente para linhagem de monócitos
U937 induzidos à inflamação com LPS na presença de Metoxiamina e E3330
revelaram diversos genes estando up ou down regulados. Utilizando o iRegulon
(ferramenta plugin do Cytoscape, que detecta regiões consenso enriquecidas
para fatores de transcrição e o seu conjunto de alvos), foi possível estabelecer
quais eram os principais fatores de transcrição envolvidos com a expressão
destes genes, revelando três fatores transcricionais que estavam diretamente
ligados à expressão da maioria dos genes de ambas as redes (E3330 e MX)
down, Elk1, nuclear respiratory fator 1 (NRF1) e GA-binding protein A (GABPA).
Da mesma forma, resultados anteriores de estudos realizados pelo nosso grupo
demonstrou a interação entre APE1 e NFE2L2 por meio de Co-imunopreciptação
em fibroblastos MRC-5. Tendo em vista que NRF1, GABPA e Elk1 são alvos
trancricionais de NFE2L2 segundo o ChipAtlas, é interessante avaliar de que
23
maneira a inibição das diferentes porções de APE1 pode influenciar em NFE2L2
e nos seus gene-alvo, como HMOX-1. A sobreposição dos fatores transcricionais
em ambas as redes down reguladas pode indicar uma possível sobreposição das
funções de APE1, ou seja, talvez elas não sejam tão independentes quanto é
exposto na literatura atualmente. Os genes encontrados na rede down de E3330
estão envolvidos primariamente na biogênese ribossomal, processos
mitocondriais, expressão gênica e resposta imune, enquanto os genes
encontrados na rede down de MTX possuem funções ligadas a processamento
metabólico de RNAr, processamento metabólico de coenzimas, e processamento
metabólico de RNA.
1.6 NFE2L2 e seu papel chave na resposta ao estresse oxidativo
Ao serem expostos a eventos oxidativos, mecanismos celulares conseguem
responder rapidamente ativando genes e enzimas responsáveis por eliminar tais
estressores, mantendo a homeostase redox. O NFE2L2, do inglês nuclear factor,
erythroid 2 like 2, é um regulador chave na defesa celular contra o estresse
oxidativo (HIGGINS; HAYES, 2011). O gene para esta proteína se localiza no
cromossomo humano 2, possui 605 aminoácidos e apresenta massa de 67,8
kDa. Sob condições celulares normais, NFE2L2 encontra-se na forma de um
heterodímero com Keap1, um potente repressor da atividade de NFE2L2 que a
ancora no citoplasma inibindo sua atividade e levando-a rapidamente para
degradação por mecanismos de ubiquitina-proteassoma (PIANTADOSI;
SULIMAN, 2012). NFE2L2 tem ação direta sobre a homeostase de ERO e ERNs
ao promover ativação do sistema de defesa antioxidante por meio de diversos
mecanismos, entre eles: indução do catabolismo de superóxidos e peróxidos por
SOD e gluationa peroxidase (GPx); regeneração de cofatores e proteínas que
foram oxidados, como glutationa oxidada (GSSG) sendo reduzida por glutationa
redutase (GSR) e TRX oxidada sendo reduzida por Txnrd1; síntese de glutationa
reduzida (GSH) por intermédio de GCLC e GCLM; aumento da expressão de
TRX e inibição do inibidor de TRX (TXNIP); e aumento da expressão de HMOX-1
(MA, 2013).
24
Keap1 é uma proteína rica em sítios de cisteína, atuando como um sensor de
estresse redox. A presença de estresse oxidativo pode desencadear a ativação
de indutores que desfazem o complexo Keap1-NFE2L2 ao modificar 2 resíduos
de cisteína em Keap1(C273 e C288) dentre os 25 resíduos deste aminoácido
presente na proteína. Desta forma, com a dissociação deste complexo, NFE2L2
é translocada para o núcleo onde pode atuar como fator transcricional para
proteínas de estresse oxidativo (WAKABAYASHI et al., 2004). A presença de
Keap1 como um repressor de NFE2L2 é indispensável para a viabilidade celular.
O knockout do gene de Keap1 induz uma ativação constitutiva de NFE2L2 que
leva a morte pós-natal em camundongos, mostrando que o balanço entre os
compostos oxidantes e antioxidantes deve ser precisamente regulado a fim de
manter a homeostase celular (WAKABAYASHI et al., 2003). Quando
desassociada de Keap1, NFE2L2 é translocada para o núcleo, onde se liga a
AREs (elementos de resposta antioxidante) promovendo a transcrição de genes
relacionados à atividade antioxidante, como HMOX-1, glutationa-S-transferase
(GSTM1), multidrug-resistance associetaed efflux pumps, NADPH
desidrogensase quinona (NQO-1), Gadd45a, Tiorredoxina redutase 1 (Txnrd1),
GCLM, GCLC e Tiorredoxina (TRX) (KOBAYASHI; YAMAMOTO, 2005; LI;
KONG, 2010).
Sendo assim, a desregulação de NFE2L2 e dos seus genes regulados estão
ligadas a diversas patologias humanas, principalmente aquelas ligadas ao
processo de envelhecimento, no qual há um aumento do ambiente oxidativo no
organismo, como: câncer, doenças cardiovasculares, doenças autoimunes e
neurodegenerativas (HYBERTSON et al., 2011). A ativação de NFE2L2 tem se
mostrado como neuroprotetora, levando a melhorias fenotípicas em
camundongos modelo de Alzheimer e aumentando sua expectativa de vida (CUI
et al., 2017). Islam et al. (2015) mostraram a associação entre a redução da
atividade de NFE2L2 em pacientes com isquemia de membros, observando que
no músculo esquelético destes pacientes havia uma menor quantidade de
proteínas antioxidantes e um aumento nos biomarcadores de estresse oxidativo.
Tendo em vista o papel da mitocôndria no metabolismo aeróbio, a elevada
produção de ERO é balanceada por mecanismos antioxidantes e NFE2L2 tem
papel central na regulação da homeostase redox mitocondrial.
25
Células knockout para NFE2L2 exibem apoptose espontânea com maior
frequência e são mais sensíveis a exposição à toxicantes que induzem dano
mitocondrial, além de desenvolverem doenças autoimunes e inflamatórias
comumente associadas ao envelhecimento (MA, 2013). Além da função protetora
na mitocôndria, foi visto que NFE2L2 estimula a biogênese mitocondrial em
cardiomiócitos através de up regulation de HMOX-1 e NRF1, e este último induz
a expressão de TFAM, fator de transcrição mitocondrial A, o que leva a
transcrição do genoma mitocondrial (PIANTADOSI et al., 2008).
A biogênese mitocondrial é um processo indispensável para manutenção dos
processos celulares dependentes de energia que ocorrem em larga escala
durante um evento de estresse oxidativo pronunciado, privação calórica, hipóxia
ou exercícios extenuantes. Alterações na função mitocondrial contribuem para o
aparecimento de doenças e processos ligados ao envelhecimento (PIANTADOSI
et al., 2008)
A manutenção das funções mitocondriais, assim como sua biogênese,
depende de uma sincronia entre a interação de genes nucleares e genes
mitocondriais, tal sincronia se dá pela presença de domínios conservados em
genes nucleares que codificam proteínas mitocondriais, sendo NRF1 e GABPA
os principais reguladores transcricionais que atuam nestes domínios, o que leva
a crer, juntamente com os dados da literatura, que estes são genes chave para o
processo de biogênese mitocondrial (SCARPULLA, 2008).
Diversos estudos demostram que o bloqueio de NFE2L2 aumenta a
susceptibilidade celular a apoptose por estresse oxidativo. Utilizando RNAsh para
fazer um knockdown da expressão de NFE2L2, FISHEL et al (2015), utilizando
uma linhagem celular derivada de um adenocarcinoma de ducto pancreático,
sugere que a atividade redox de APE1 pode estar regulando negativamente a
atividade de NFE2L2. Utilizando um inibidor da função redox de APE1, o (E3330)
observou-se um aumento da atividade transcricional de NFE2L2 quantificando a
expressão de três genes alvos clássicos HMOX-1, GCLC e GCLM, assim como a
inibição de APE1 por E3330 aumentou os níveis proteicos de NFE2L2.
Shan et al., (2015) utilizando cultura de células derivadas de tumor de
pulmão, realizou o knockdown de APE1 por meio de RNAsh, assim como um
mutante de APE1 sem atividade redox (APE1C65A) e observou que os níveis
26
dos alvos de NFE2L2 como HMOX-1, Gstm1 e Txnrd1 estavam
significativamente mais baixos que quando comparados com as células APE1
tipo selvagem. Além disso, foi feito Co-imunopreciptação para avaliar a interação
entre APE1 e NFE2L2 e foi observado que ocorre uma ligação entre estas
proteínas quando a cultura celular é submetida ao tratamento com peróxido de
hidrogênio, sugerindo que a atividade transcricional de NFE2L2 depende de uma
interação com APE1, que só é detectada quando a cultura é induzida ao
estresse.
O presente estudo procurou elucidar de que maneira ambas as proteínas
podem estar se relacionando intracelularmente e se há diferença nessa relação
ao bloquear porções distintas de APE1/Ref-1. Uma vez que se houve diferença
na expressão de NFE2L2 ao utilizar inibidores da função de APE1, então existe
alguma função celular pela qual APE1 se relaciona com NFE2L2. A utilização de
monócitos U937, induzidos à inflamação por LPS, para esta avaliação é nova e
com isso pretende-se trazer contribuições para a compreensão da função celular
pela qual APE1 age em NFE2L2 e como a utilização de inibidores das funções
de APE1 pode resultar em diferenças na expressão de NFE2L2 e seus alvo
downstream HMOX-1.
27
2. Objetivos
2.1 Objetivo geral
O presente estudo teve como objetivo entender a relação entre a enzima de
reparo APE1 com NFE2L2 na resposta ao estresse oxidativo, quando na
presença de diferentes inibidores das funções redox e de reparo de APE1.
2.2 Objetivo específico
Verificar genes-alvo de NRF2 com sua expressão up ou down regulada nos
transcriptomas de U937 tratados com MTX ou E3330;
Verificar os efeitos de E3330 e MTX sobre a transcrição de APE1, NRF2 e
HMOX-1 durante o estresse oxidativo;
Verificar os efeitos de E3330 e MTX sobre a expressão proteica de APE1 e
NRF2 durante o estresse oxidativo.
28
3. Materiais e Métodos
3.1 Análise das redes Up e Down reguladas x alvos de NFE2L2
Os trancriptomas obtidos pelos tratamentos com metoxiamina e E3330,
incluindo apenas os genes com fold chance ≥2,00 ou ≤-2,00, foram cruzados
com a lista de genes alvo de NFR2 obtidas por meio do ChipAtlas utilizando os
critérios: Distance from TSS: ± 1 kb na espécie Homo sapiens.
3.2 Análise das vias enriquecidas na lista de genes comuns entre o
transcriptoma e os alvos de NFE2L2
Utilizando os genes em comum obtidos por meio do cruzamento entre os
trascriptomas e os alvos de NFE2L2 do ChipAtlas, foi feito o enriquecimento das
vias utilizando Panther Gene Ontology, que é capaz de identificar vias
metabólicas enriquecidas nas listas de transcritos, disponibilizado dados de
vários bancos de dados. Os critérios utilizados foram: Homo sapiens; Statistical
overrepresentation test. Ao final foram selecionados os cinco ou seis processos
os quais apareciam com maior relevância na rede enriquecida.
3.3 Cultura de células U937 e tratamento com LPS
As células em suspensão U937, linhagem de monócitos, foram cultivadas em
meio RPMI (Gibco) enriquecido com 10% de soro fetal bovino (SBF) (Gibco) e
1% de solução de antibiótico (Sigma) e incubadas a 37 ºC e 5% CO2. 2,5x106
células foram cultivdas em uma placa de 6 poços contendo 3mL de meio por
poço. O plaqueamento foi feito mantendo um grupo de células controle (com
apenas meio de cultura), células tratadas apenas com os inibidores de APE1,
E3330 (100 µM) e Metoxiamina (6mM), células induzidas a um modelo de
inflamação com lipopolisacarídeo bacteriano (LPS) 1ug/mL apenas e células
induzidas ao LPS juntamente com os inibidores de APE1. As células
permaneceram por 24h na presença de LPS e por 4h na presença dos
inibidores.
29
3.4 Extração de RNA e proteínas
O RNA total e as proteínas foram extraídos utilizando o kit comercial Illustra
triplePrep (GE Healthcare) para extração rápida de DNA, RNA e Proteínas
partindo de uma mesma amostra, usando colunas de purificação com formato
mini spin e reagentes específicos. Cada coluna do kit retém um tipo de
macromolécula da célula de modo que, o DNA é extraído primeiro, depois,
através de uma segunda coluna o RNA é extraído e por último as proteínas. A
extração seguiu as instruções do fabricante.
A quantificação de RNA foi realizada pelo NanoDrop™ (Thermo Scientific),
que quantifica DNA, RNA e proteínas a partir de poucos microlitros de amostra.
A quantificação de proteínas foi feita utilizando a tecnologia Quibit® 2.0
(Invitrogen).
3.5 qPCR
A análise por qPCR foi utilizada para quantificarmos a expressão de RNAm
de APE1, NFE2L2 e seu alvo HMOX-1. A qPCR foi normalizada com GAPDH.
A partir desta análise, poderemos inferir como a inibição de APE1, utilizando
E3330 para inibição de sua atividade redox e Metoxiamina para inibição da sua
função de reparo, interfere na relação entre estes genes. Foi extraído o RNAm
total da célula e utilizando o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription
(Applied Biosystem) foi obtido o cDNA para utilização na qPCR. O mix para
transcrição reversa contém: 10x RT Buffer, 25x dNTP Mix (100mM), 10x RT
Random Primers (200nM), 50U MultiscribeTM Reverse Transcriptase (50U/μL),
água livre de nucleases e o RNA. A solução foi incubada em termociclador
(Mastercycler® ep, EPPENDORF) a 25°C por 10 minutos, seguidos de 120
minutos a 37°C e 5 minutos a 85°C. As amostras foram armazenadas a -80°C.
Utilizando primers específicos para cada um dos genes de interesse, estes
vão se anelar ao cDNA servindo como iniciadores para a polimerase e durante a
amplificação, a quantificação é determinada pela quantidade de produto
amplificado durante cada ciclo, através da fluorescência emitida pela sonda
30
SYBR® Green. As sequências dos primers utilizados encontram-se na Tabela
1.
Tabela 1. Lista de primers utilizados nas qPCRs.
3.6 Western Blot
Os níveis proteicos das proteínas de interesse foram analisados por Western
Blotting (WB) após a sua extração e quantificação como já descrito
anteriormente pelo kit Illustra triplePrep (GE Healthcare). Em síntese, 20 μg de
cada extrato proteico foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida
(do inglês polyacrylamide gel electrophoresis - SDS-PAGE). Após a corrida, a
transferência ocorreu em membrana de difluoreto de polivinilideno (do inglês
polyvinylidene difluoride – PVDF). Em seguida as membranas foram incubadas
em tampão de bloqueio (5% leite desnatado, 0.5 Tween-20 em TBS 1 X) durante
1 h, passado esse tempo foram incubadas por 16 h a 4 0C com os anticorpos
primários contra NFE2L2 fosforilada S-40 (Ab76026) e APE1 (Sc-17774). Após o
período de incubação as membranas foram lavadas com TBST 3 X por 10 min
cada e incubadas com anticorpo secundário específico conjugado com HRP
GENE Primer Foward Primer Reverse Referência
GAPDH TGCACCACCAACTGCTTAGC GGCATGGACTGTGGTCATGA FRIZZELL et al.,
2009
HMOX-
1
CAG GCA GAG AAT GCT GAG
GGCCACATAGATGTGGTA HIRAMATSU et
al., 2016
NFE2L2 CTTTTGGCGCAGACATTC C AAGACTGGGCTCTCGATGTG RAN et al., 2017
APE1 CTGCCTGGACTCTCTCATCAATAC CCTCATCGCCTATGCCGTAAG DI MASO et al.,
2007
31
para Anti-Rabbit IgG (RD Systems – HAF008) e Anti-mouse IgG (RD Systems –
HAF018). Por fim as membranas foram reveladas após lavagens com TBST 3 X
por 10 min cada, com o reagente de detecção ECL Prime Western Blotting
Detection Reagent (Amersham) e as imagens foram capturadas pelo sistema
Chemidoc (Bio-Rad). O valor para normalização pela densitometria foi definido
como a razão entre as médias das intensidades de cada proteína de cada
tratamento pela intensidade da β-actina para a membrana de NFE2L2 e β-
catenina para membrana de APE1, através do software de análise de
densitometria do Chemidoc.
32
4. Resultados
4.1 Down E3330 x Alvos NFE2L2
Por meio de análises obtidas pelo digrama de Venn e pelo Panther, que
analisa o enriquecimento funcional dos genes, por meio de processos biológicos,
observamos 914 genes que têm sua expressão Down regulada por E3330.
Destes 428 (46,8%) são alvos de NFE2L2 descritos pelo ChipAtlas. Estes 428
genes que são alvos de NFE2L2 e tiveram sua expressão diminuída pelo
tratamento com E3330 possuem funções ligadas a processos metabólicos de
RNA, biogênese de componentes celulares, organização mitocondrial,
processamento metabólico de RNAr.
33
Figura 5. Diagrama de Venn demonstrando que dentre os 914 genes down
regulados por E3330 no trancriptoma de U937 induzidos a inflamação por LPS, 428 são genes-alvo de NFE2L2 por análises no ChipAtlas. Abaixo, têm-se os processos metabólicos enriquecidos estatisticamente para os 428 genes em comum.
4.2 Down MTX x Alvos NFE2L2
Para a rede down regulada sob tratamento com MX foi observado 1286
genes. Destes, 577 genes (44,8%) são alvos de NFE2L2 descritos pelo
ChipAtlas. Estes 577 genes que são alvos de NFE2L2 e tiveram sua expressão
diminuída pelo tratamento com metoxiamina possuem funções ligadas a
processamento metabólico de RNAr, processamento metabólico de coenzimas,
processamento metabólico de RNA e na transcrição DNA-dependente.
34
Figura 6. Diagrama de Venn demonstrando que dentre os 1286 genes down
regulados por MTX no trancriptoma de U937 induzidos a inflamação por LPS, 577 são genes-alvo de NFE2L2 por análises no ChipAtlas. Abaixo, têm-se os processos metabólicos enriquecidos estatisticamente para os 577 genes em comum.
4.3 Up E3330 x Alvos NFE2L2
Para a rede up regulada foram vistos 2221 genes. Destes, 979 são alvos de
NFE2L2 descritos pelo ChipAtlas. Estes 979 (44,0%) genes que são alvos de
NFE2L2 e tiveram sua expressão aumentada pelo tratamento com E3330
possuem funções ligadas a regulação traducional, iniciação transcricional e
reparo de DNA.
35
Figura 7. Diagrama de Venn demonstrando que dentre os 2221 genes up
regulados por E3330 no trancriptoma de U937 induzidos a inflamação por LPS, 979 são genes-alvo de NFE2L2 por análises no ChipAtlas. Abaixo, têm-se os processos metabólicos enriquecidos estatisticamente para os 979 genes em comum.
4.4 Up MTX x Alvos NFE2L2
Foram vistos 1360 genes que têm sua expressão up regulada por
metoxiamina. Destes, 612 (45,0%) são alvos de NFE2L2 descritos pelo
ChipAtlas. Estes 612 genes que são alvos de NFE2L2 e tiveram sua expressão
aumentada pelo tratamento com metoxiamina possuem funções ligadas a
regulação traducional, processamento metabólico de RNAt, splicing de RNAm
via spliceosomo e processamento de RNAm.
36
Figura 8. Diagrama de Venn demonstrando que dentre os 1360 genes up
regulados por MTX no trancriptoma de U937 induzidos a inflamação por LPS, 612 são genes-alvo de NFE2L2 por análises no ChipAtlas. Abaixo, têm-se os processos metabólicos enriquecidos estatisticamente para os 612 genes em comum.
4.5 Análises qPCR
4.5.1 APE1
A expressão de APE1 nos tratamentos com apenas E3330, LPS+Metoxiamina
e apenas metoxiamina não foi alterada com relevância significativa por teste T
quando comparados em relação ao controle. Nas mesmas condições houve uma
pequena redução da expressão da mesma quando a cultura foi induzida ao
tratamento com apenas LPS (P= 0,025) e LPS+E3330 (P= 0,017). Comparando
por teste T todos os grupos em relação ao LPS foi possível observar um
aumento na expressão gênica de APE1 significativa em LPS+MTX (P= 0,0256) e
no tratamento apenas com MTX (P= 0,0352).
37
Figura 9. Alteração da expressão de APE1 em células U937 tratadas com LPS, com
E3330, metoxiamina, LPS+E3330 e LPS+metoxiamina. Teste paramétrico T de Student não pareado. * P<0,05. Alteração na expressão de APE1 observada quando comparados controle vs. LPS; controle vs. LPS+E3330; LPS vs. LPS+MTX; LPS vs. MT.
4.5.2 NFE2L2
A expressão de NFE2L2 analisada por teste T mostrou-se aumentada
estatisticamente nos tratamentos com E3330 (P= 0,0274) e LPS+E3330 (P
<0,0001), enquanto nos tratamentos utilizando apenas LPS, apenas
metoxiamina e LPS+metoximina não houve alteração significativa
estatisticamente. Todos comparados ao controle negativo. Utilizando o mesmo
teste, porém fazendo a comparação entre os grupos de tratamento em relação
ao LPS observou-se que LPS+E3330 também teve um aumento significativo (P=
0,0031). Com esse resultado, foi possível induzir que o aumento da expressão
de NFE2L2 se deu devido a inibição da função redox de APE1, principalmente
quando houve indução da inflamação por meio do LPS.
.
38
Figura 10. Alteração da expressão de NFE2L2 em células U937 tratadas com LPS,
com E3330, metoxiamina, LPS+E3330 e LPS+metoxiamina. Teste paramétrico T de Student não pareado * P<0,05; ***P<0,005. Alteração na expressão de NFE2L2 observada quando comparados controle vs. E3330; controle vs. LPS+E3330; LPS vs. LPS+E3330.
4.5.3 HMOX-1
A expressão de HMOX-1 analisada por teste T esta aumentada nos
tratamentos feitos com apenas LPS (P= 0,025), apenas E3330 (P= 0,0031) e
LPS+E3330 (P= 0,0007), quando comparados ao controle. Sua expressão não
foi alterada nos tratamentos utilizando apenas metoxiamina e LPS+metoxiamina,
também em comparação ao controle. Utilizando o mesmo teste, porém fazendo
a comparação entre os grupos de tratamento em relação ao LPS, foi observado
que houve aumento na expressão de NFE2L2 no tratamento de LPS+E3330
(P=0,0112). Este resultado corrobora com o resultado da qPCR para NFE2L2, o
qual tem sua expressão aumentada nos tratamentos com E3330 e LPS+E3330,
uma vez que HMOX-1 é gene-alvo de NFE2L2.
39
Figura 11. Alteração da expressão de HMOX-1 em células U937 tratadas com LPS,
com E3330, metoxiamina, LPS+E3330 e LPS+metoxiamina. Teste paramétrico T de Student não pareado. * P<0,05. ***P<0,005. Alteração na expressão de HMOX-1observada quando comparados controles vs. LPS; controle vs. LPS+E3330; controle vs. E3330; LPS vs. LPS+E3330.
4.6 Western Blot
4.6.1 NFE2L2 (S-40)
Os resultados de western blot para NFE2L2 fosforilado não mostraram
significância estatística utilizando teste paramétrico T de Student não pareado
relacionando o controle ao tratamento apenas com E3330, apenas
metoxiamina, LPS+E3330 e LPS+metoxiamina. No entanto, houve uma
redução mínima na expressão proteica de NFE2L2 quando a cultura foi
submetida apenas ao LPS (P= 0,0009). Fazendo o mesmo teste comparando
os grupos de tratamento com o LPS não foi observada relevância estatística
significativa na expressão proteica de NFE2L2.
40
A)
B)
Figura 12. Análise da expressão proteica de NFE2L2 através de Western Blot. A) Membrana PVDF contendo NFE2L2 (90kDa) e o gene de controle endógeno beta-actina (42kDa). B) Representação gráfica da diferença na expressão de NFE2L2 para os diferentes tratamentos celulares, demonstrando a porcentagem relativa ao controle da expressão proteica de NFE2L2. *** P<0,005. Teste paramétrico T de Student não pareado.
4.6.2 APE1
Os dados obtidos a partir do western blot feito para APE1, analisados por teste
T em relação ao controle, mostrou que apenas no tratamento com E3330
houve diferença significativa estatisticamente na expressão da proteína,
41
havendo um aumento da mesma (P= 0,0036). Fazendo o mesmo teste
relacionando os grupos de tratamento com o LPS não foi observada mudança
significativa estatisticamente na expressão proteica de APE1.
Figura 13. Análise da expressão proteica de APE1 através de Western Blot.
A) Membrana PVDF contendo APE1 (37kDa) e o gene de controle endógeno beta-catenina (92kDa). B) Representação gráfica da diferença na expressão de APE1 para os diferentes tratamentos celulares, demonstrando a porcentagem relativa ao controle da expressão proteica de APE1.*** P<0,005. Teste paramétrico T de Student não pareado.
42
5. Discussão
Tendo em vista os mecanismos protetores celulares e a ação de APE1 e
NFE2L2 na promoção da viabilidade celular, o objetivo deste trabalho foi elucidar
uma possível relação de APE1 com NFE2L2 e seus efeitos downstream, podendo
ainda demonstrar se a utilização de E3330 e MTX podem atrapalhar, ou não, na
relação entre estas duas proteínas. O papel indispensável dessas proteínas para
a célula é mostrado em diversos estudos, entre eles tem-se que: embriões de
camundongo knockout para APE1 não se desenvolvem, sendo esta uma mutação
letal ao organismo (TELL et al., 2009). Enquanto o knockout de NFE2L2 em
camundongos os torna extremamente susceptíveis a um grande número de
patologias associadas ao estresse oxidativo (MA, 2013).
Conforme dito ao longo do trabalho, NFE2L2 é um importante fator
transcricional para uma rede de proteínas envolvidas na proteção celular contra
estressores ambientais e celulares. A desregulação de NFE2L2 e dos seus
genes-alvo estão ligadas a diversas patologias humanas, principalmente aquelas
ligadas ao processo de envelhecimento, no qual há um aumento do ambiente
oxidativo no organismo, como: câncer, doenças cardiovasculares, doenças
autoimunes e neurodegenerativas (Revisado por Hybertson, 2011).
APE1 também se mostra como um importante gene na proteção celular aos
ambientes estressores. Tanto durante a inflamação, quanto para proteção do
DNA contra os danos gerados durante o estresse oxidativo (JEDINAK et al.,
2011).
Utilizando os transcriptomas de monócitos U937, induzidos a inflamação por
LPS e tratados com E3330 ou metoxiamina, obtidos anteriormente pelo grupo e
cruzando os genes que tiveram sua expressão aumentada (Fold change ≥ 2,0) ou
que tiveram sua expressão diminuída (Fold change ≤ -2,0) com a lista de genes
alvo de NFE2L2 do ChipAtlas, observou-se que cerca de 45% dos genes de todos
os trancriptomas eram alvos para NFE2L2, o que nos leva a crer que existe uma
forte relação entre APE1 e NFE2L2. Ao analisar o transcriptoma de genes down
regulados por E3330, o qual contem 914 genes, observamos que 428 destes
(46,8%) são alvos de NFE2L2. Fazendo a análise destes 428 genes pelo Panther-
GO temos que as principais vias enriquecidas estatisticamente para este grupo de
genes são: processamento de RNAr, organização mitocondrial, processamento de
43
RNA e biogênese de componentes celulares. Da mesma forma, foi analisado o
transcriptoma de genes down regulados por metoxiamina, o qual possui 1286
genes, sendo 577 (44,8%) alvos de NFE2L2 que possuem vias enriquecidas
estatisticamente relacionadas a processamento de RNAr e processamento de
RNA. Ambas as vias que também aparecem enriquecidas no transcriptoma de
genes down regulados por E3330 que são alvos de NFE2L2.
Fazendo a análise do transcriptoma de genes up regulados por E3330, o qual
contem 2221 genes, observamos que 979 genes (44%) são alvos de NFE2L2 e
têm funções enriquecidas estatisticamente ligadas a: regulação traducional,
aminoacilação de RNAt, entre outras. Da mesma forma, foi analisado o
transcriptoma de genes up regulados por MTX, o qual possui 1360 genes, dos
quais 612 (45%) são alvos de NFE2L2 e tem funções enriquecidas
estatisticamente ligadas a: regulação traducional, aminoacilação de RNAt, entre
outras. As mesmas vias enriquecidas são observadas nos genes alvo de NFE2L2
para os trancriptomas up regulados e down regulados por E3330 ou MTX. Estes
resultados indicam uma relação entre APE1 e NFE2L2, de maneira que,
possivelmente ambas as atividades de APE1 tenham atuação dependente uma
da outra quando interage com NFE2L2, uma vez que ao inibir diferentes porções
da mesma proteína observamos que o mesmo grupo de genes encontram-se up
ou down regulados. O enriquecimento dos genes alvo de NFE2L2, que
apareceram Down regulados por MTX e por E3330, utilizando o PantherGO,
mostrou funções totalmente diferentes daqueles que não são alvos de NFE2L2.
Assim como os genes Up de MTX e E3330. Mostrando desta forma que o
conjunto de genes down regulados pelos tratamentos que são alvos de NFE2L2,
assim como os genes up regulados nestas mesmas condições, possuem funções
específicas (dados não mostrados).
Utilizando monócitos U937 induzidos à inflamação por LPS, observamos que,
durante o tratamento com E3330, houve um aumento discreto na expressão
gênica de NFE2L2 (P = 0,0274) e de HMOX-1 (P = 0,0031), no entanto ao utilizar
o indutor inflamatório LPS+E3330 foi possível observar um aumento significativo
na expressão de NFE2L2 (P < 0,0001) e HMOX-1 (P = 0,0007), utilizando teste T
em relação ao controle. Para a expressão gênica de APE1 foi observado que
durante o tratamento com LPS (P= 0,0256) e LPS+E3330 (P= 0,0172) houve uma
44
pequena redução estatística na expressão da mesma quando comparados ao
controle. Comparando todos os grupos em relação ao LPS foi possível observar
um aumento na expressão gênica de APE1 significativa em LPS+MTX (P=
0,0256) e no tratamento apenas com MTX (P= 0,0352). O aumento de APE1
observado comparando apenas LPS com os tratamentos de LPS+MTX e apenas
MTX necessita de maiores investigações para inferir o porquê disto está
ocorrendo.
O aumento na expressão destes genes ao utilizar o inibidor da função redox
de APE1 (E3330) indica um possível papel repressor desempenhado pela
atividade redox de APE1 sobre NFE2L2. Os tratamentos com apenas MTX e
LPS+MTX não resultaram em mudanças significativamente estatísticas para
NFE2L2 e HMOX-1.
Esses resultados sugere que o papel de APE1 como sendo um indutor da
atividade de fatores transcricionais deve ser revista para NFE2L2. A atividade
redox de APE1 foi demonstrada como sendo repressora da expressão de p21 em
associação ao fator AP4, quando estes se ligam a sítios específicos no promotor
de p21 (SENGUPTA; MITRA; BHAKAT, 2013). De maneira interessante
demonstrada por Fishel et al,. 2015, o promotor de NFE2L2 possui dois sítios
para ligação de AP4, os quais podem estar desempenhando um papel similar, em
conjunto com APE1, com aquele demonstrado para p21.
Fazem-se necessárias investigações mais aprofundadas para revelar por qual
mecanismo a função redox de APE1 estaria regulando negativamente a
expressão de NFE2L2 e por qual motivo isso estaria ocorrendo. Outro mecanismo
pelo qual a atividade redox de APE1 poderia estar atuando, seria como um
controlador da expressão de NFE2L2 durante o estresse oxidativo, condição na
qual a expressão de NFE2L2 se elevaria demais promovendo um desbalanço na
homeostase redox ou uma hiperativação de outros fatores downstream que
culminaria em danos celulares. É sabido que a super expressão de PGC-1 leva
uma biogênese mitocondrial elevada provocando cardiomiopatia em
camundongos (LEHMAN et al., 2000), também se tem na literatura que NFE2L2 é
um fator transcricional promotor da biogênese mitocondrial em cardiomiócitos de
camundongos (PIANTADOSI et al., 2008), então seria necessário haver um
regulador de NFE2L2 para impedir a sua superexpressão diante a estados
45
estressores onde sua expressão aumentada é necessária até determinado limiar.
Trabalhos futuros podem procurar a relação da função redox de APE1 como
sendo um freio molecular para a expressão de NFE2L2 e não um repressor
propriamente dito como foi exposto por Fishel et al., 2015. Uma vez que, a
proteína NFE2L2 ao ser expressa permanece no citoplasma ligada a Keap1 que
posteriormente a leva para degradação por mecanismos de ubiquitina-
proteassoma (PIANTADOSI; SULIMAN, 2012) quando não há estímulo para
desfazer o heterodímero NFE2L2/Keap1.
Ao utilizar E3330 a atividade redox de APE1 é inibida, assim esta proteína não
teria mais como atuar no promotor de NFE2L2 em conjunto com AP4, por isso foi
observado o aumento de RNAm de NFE2L2 no tratamento com somente E3330.
Ao induzir o estresse com LPS e utilizar E3330 a inibição da porção redox de
APE1 mais o estímulo estressor desencadeia uma alta expressão de NFE2L2 que
culmina no aumento da expressão de seu alvo downstream HMOX-1. Em
continuidade, o aumento do RNAm de HMOX-1 indica que houve aumento na
expressão proteica de NFE2L2 e posterior fosforilação da mesma para sair do
citoplasma e ir para núcleo, ao dissociar-se de Keap1. A possível elevação da
expressão proteica de NFE2L2 pode ser um fator que contribua para a sua
fosforilação, de modo que o ambiente celular ao detectar que está havendo
aumento na concentração de NFE2L2 promova um aumento de atividade
fosforilativa interna. Sendo assim, APE1 estaria então poupando ATP celular que
seria gasto com a fosforilação de NFE2L2 sem motivo.
Assim, a partir dos resultados obtidos, pode-se supor que a relação de APE1,
devido a sua função redox, com NFE2L2 em um ambiente de estresse oxidativo
seja de realizar uma regulação para manter a expressão de NFE2L2 em níveis
adequados. Não é provável que APE1 regule totalmente NFE2L2 de maneira
negativa, pois ambas as proteínas são necessárias para sobrevivência celular em
um ambiente em que a mesma esteja sofrendo danos oxidados extensos.
Os dados obtidos por meio de western blot para detectar a expressão proteica
de APE1 e NFE2L2 não foram conclusivos, houve divergências nas triplicatas nos
indicando que será necessário realizar novos experimentos a fim de extrair dados
mais confiáveis e que possam ser divulgados, enquanto isso não é possível inferir
46
nada em relação aos níveis de expressão proteica de ambas as proteínas quando
a cultura celular foi submetida aos tratamentos já citados.
47
6. Conclusões
Neste trabalho foi observado que ao utilizar o inibidor da função redox de
APE1, E3330, houve um aumento na expressão de RNAm de NFE2L2 e de seu
alvo downstream HMOX-1, mais notadamente quando o E3330 foi colocado na
cultura celular submetida ao modelo inflamatório por LPS. Já a resposta
observada ao tratamento com metoxiamina não se demonstrou significante
estatisticamente, necessitando de estudo mais aprofundados futuramente para
comprovar em outros modelos celulares.
Foi visto que nas listas de todos trancriptomas haviam diversos genes que são
alvos de NFE2L2, sendo estes atuantes em diferentes mecanismos celulares
quando foi feita a ontologia gênica. O aparecimento de genes-alvo de NFE2L2 em
todos os transcriptomas indica que pode estar havendo uma regulação de
NFE2L2 tanto pela função redox de APE1, como foi visto nos dados de qPCR,
quanto pela função de reparo de DNA que não foi possível observar neste
trabalho.
Nos transcriptomas down regulados houve sobreposição das funções
enriquecidas de processamento metabólico de RNAr e de RNA. Nos
transcriptomas up regulados houve sobreposição das funções enriquecidas de
regulação traducional e aminoacilação de RNAt.
A partir dos resultados obtidos, pode-se inferir que ao inibir as diferentes
porções de APE1 observamos grupos de genes-alvo de NFE2L2 com sua
expressão igualmente elevada ou diminuída. Da mesma forma, pode-se inferir
que, ao utilizar E3330 e bloquear a função redox de APE1 aumentamos a
expressão genica de NFE2L2 e HMOX-1.
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