UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO … · A asma é considerada uma doença inflamatória crônica caracterizada por ... be involved with the NO/GCs/GMPc/PKG signal transduction

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO

PEDRO MODESTO NASCIMENTO MENEZES

ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E ANTITUSSÍGENA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia origanoides (VERBENACEAE)

PETROLINA - PE

2017


ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E ANTITUSSÍGENA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia origanoides (VERBENACEAE)

Trabalho apresentado ao Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do Semiárido – PPGRNSA da Universidade Federal do Vale do São Francisco – UNIVASF, Campus Centro, como requisito final para obtenção do título de Mestre em Recursos Naturais do Semiárido, Subárea de Fisiologia e Farmacologia. Orientador: Prof. Dr. Fabrício Souza Silva Co-orientador: Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro

Petrolina - PE

2017

Menezes, Pedro Modesto Nascimento M543a Atividade espasmolítica e antitussígena do óleo essencial de

Lippia origanoides (Verbenaceae) / Pedro Modesto Nascimento Menezes. -- Petrolina, 2017.

xix, 149 f. : il. ; 29 cm. Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) –

Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina, Petrolina-PE, 2017.

Orientadora: Prof. Dr. Fabrício Souza Silva. Coorientador: Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro.

Referências. 1. Asma - Tratamento. 2. Farmacologia. 3. Óleo essencial. 4.

Plantas medicinais. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.

CDD 616.238 Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Biblioteca SIBI/UNIVASF

Bibliotecária: Luciana Souza Oliveira CRB5/1731

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO

FOLHA DE APROVAÇÃO


ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E ANTITUSSÍGENA DO ÓLEO

ESSENCIAL DE Lippia origanoides (VERBENACEAE)

Dissertação apresentada como requisito final

para obtenção do título de Mestre em

Recursos Naturais do Semiárido, pela

Universidade Federal do Vale do São

Francisco.

Aprovada em: ____ de ____________ de ______.

Banca examinadora

_______________________________________________

Fabrício Souza Silva, Doutor, UNIVASF

_______________________________________________

Julianeli Tolentino de Lima, Doutor, UNIVASF

_______________________________________________

Darizy Flávia Silva Amorim de Vasconcelos, Doutora, UFBA

Aos meus pais e meus irmãos.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todas as forças do universo.

Ao meu pai, Adriano Menezes e minha mãe, Lucy Modesto pelo apoio nessa

jornada.

Aos meus irmãos, Luciano e Clarice, pela parceria e amizade.

À minha família por proporcionar momentos de felicidade.

Ao meu orientador, Fabrício Souza Silva e co-orientador Luciano Ribeiro pela

paciência e ajuda no desenvolvimento dos experimentos, discussões acadêmicas e

não-acadêmicas, além da amizade.

À professora Larissa Rolim por seu entusiasmo que contagia qualquer pesquisador,

no auxílio do desenvolvimento e discussão de protocolos experimentais.

Aos professores Julianeli Tolentino e Edilson Beserra pelas contribuições ao

trabalho no momento da qualificação.

À equipe do Laboratório de Farmacologia Experimental, Gabriela Olinda,

Bismarques Augusto, Pablo Dantas, Rafael Menezes, Marcos Moura, Luiz Antônio,

Willian Brito, Gerson Araújo, Deisy Azevedo, Ayla Ribeiro, Alice Bezerra e, em

especial, a Mariana Brito, pelo auxilio nos experimentos, produção de artigos e ótima

companhia quase que diária.

Ao professor Jackson Guedes e a Érica Lavor por disponibilidade dos equipamentos,

ajudarem nos testes farmacológicos que envolveram o Sistema Nervoso Central,

além das análises dos dados.

Aos colegas da turma do mestrado 2015.1, em especial, Pedrita Sampaio, Wilton

Calvalcanti, Morganna Thinnesca e Mariana Gama pela parceria desde a graduação.

A Pedro Guilherme por ajudar nas discussões do desenvolvimento analítico de

protocolos experimentais.

Ao pessoal da Central Analítica de Fármacos, Medicamentos e Alimentos por me

acolherem amigavelmente para realização de experimentos.

Ao Biotério Central da UNIVASF pela disponibilidade dos animais.

A todos meus amigos, que permitiram discussões a qualquer momento, sobre

qualquer aspecto, agregando conhecimento de mundo.

Á todos envolvidos direta e indiretamente na finalização da dissertação.

Segundo Albert Einstein [1879 - 1955], físico teórico e matemático

alemão, “Se, a princípio, a ideia não é absurda, então não há

esperança para ela”.

RESUMO

A asma é considerada uma doença inflamatória crônica caracterizada por hiperresponsividade brônquica e hipersecreção de muco. A terapêutica principal se baseia na utilização de agonistas β2-adrenérgicos, corticosteroides, antagonistas muscarínicos e dos leucotrienos, dentre outros. Esses fármacos, por vezes, não conseguem estabelecer uma melhora clínica nos pacientes e novos tratamentos estão em evidência. Os produtos naturais possuem importância terapêutica de diversas afecções, tendo nos estudos etnofarmacológicos uma importante fonte de dados. Nesse sentido, existem diversos relatos da literatura sobre a utilização da Lippia origanoides Kunth para tratamento de problemas respiratórios, inclusive asma. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a composição química do óleo essencial de L. origanoides (LOO) e, após isso, observar sua atividade farmacológica através do potencial relaxante e mecanismo de ação em traqueia isolada de cobaia (in vitro); a atividade antitussígena a partir do desafio com ácido cítrico (0,4 M), em camundongos; atividade motora e ansiolítica/sedativa em teste de roda Rod e campo aberto (in vivo), em camundongos; além da otimização do protocolo experimental de atividade expectorante através da detecção do indicador vermelho de fenol no lavado broncoalveolar (LBA). Os resultados obtidos demonstraram que o LOO promoveu relaxamento da traqueia isolada de cobaia quando a contração era promovida por carbacol, CE50 = 52,21 (46,03-59,42) µg/mL, e histamina, CE50 = 9,92 (7,52-11,57) µg/mL, mostrando-se mais potente para as contrações histaminérgicas. Além disso, o mecanismo de ação de LOO pode estar envolvido com a via de transdução de sinal NO/GCs/GMPc/PKG com ativação da GCs e posterior regulação de PKG que fosforila os canais para potássio sensíveis a voltagem (Kv) e os modulados por cálcio (KCa) promovendo o relaxamento. Vale ressaltar que, na presença de atropina e dexametasona houve um potencial relaxamento, mostrando que LOO pode estar influenciando na transmissão colinérgicar e/ou estimula um aumento GMPc em conjunto ao corticosteróide, que pode reduzir os níveis de TNF-α (responsável por inibir a via NO/GCs/GMPc/PKG), bem como reduzir os níveis de prostanóides contracturantes, tal como LTD4. O LOO nas doses de 100 e 300 mg/kg conseguiram reduzir a frequência de tosse, sendo na dose de 300 mg/kg capaz de aumentar a latência. No teste do rota-rod e campo aberto o LOO 300 mg/kg apresentou atividade miorrelaxante, ansiolítica/sedativa evidenciado por um aumento no número de quedas da barra e redução no tempo de permanência, para o rota-rod e aumento dos rearings, redução do número de cruzamentos e aumento do tempo de imobilidade para o campo aberto, o que sugere uma atividade sobre o sistema nervoso central (SNC). A otimização do protocolo experimental e método analítico para avaliação da atividade expectorante foi validado para se obter avaliações precisas e exatas do vermelho de fenol no LBA. Portanto, LOO apresenta atividade espasmolítica, antitussígena e uma possível ação sobre o SNC. Além disso, o LOO agora pode ser utilizado frente ao protocolo de atividade expectorante com um método validado e preciso. Palavras-chave: atividade ansiolítica/sedativa, atividade antitussígena, atividade espasmolítica, Lippia origanoides Kunth, óleo essencial.

ABSTRACT

Asthma is considered a chronic inflammatory disease characterized by bronchial hyperresponsiveness and mucus hypersecretion. The primary therapy is based on the use of β2-adrenergic agonists, corticosteroids, muscarinic and leukotriene antagonists, among others. These drugs sometimes fail to establish a clinical improvement in patients and new treatments are in evidence. The natural products have therapeutic importance in various affections, being the ethnopharmacological studies an important source of new compounds. In this sense, there are several literature reports on the use of Lippia origanoides Kunth for the treatment of respiratory problems, including asthma. Therefore, the aim of this study was to evaluate the chemical composition of the essential oil of L. origanoides (LOO) and, after that, to observe pharmacological activity through the relaxing potential and mechanism of action in isolated trachea of guinea pig (in vitro); the antitussive activity by challenge with citric acid (0.4 M) in mice; motor and anxiolytic/sedative activities byrota-rod and open field test (in vivo), in mice; and the optimization of the experimental protocol of expectorant activity through detection of red phenol indicator in bronchoalveolar lavage (BAL). Results showed that LOO caused a relaxation on guinea pig tracheal contractions induced by carbachol, EC50 = 52.21 (46.03-59.42) µg/mL or histamine, EC50 = 9.92 (7.52-11.57) µg/mL, being more potent for histaminergic contractions. In addition, the LOO mechanism of action may be involved with the NO/GCs/GMPc/PKG signal transduction pathway with GCs activation and subsequent PKG uptake that phosphorylates the voltage-sensitive K+ channel (Kv) and calcium activated K+ channels (KCa) promoting relaxation. It is noteworthy that in the presence of atropine and dexamethasone there was a potential relaxation, showing that LOO may be influencing cholinergic transmission and/or stimulating cGMP increase in conjunction with corticosteroid, which may reduce TNF-α levels (responsible for inhibiting NO/GCs/GMPc/PKG pathway), as well as reducing levels of contracting prostanoids, such as LTD4. The LOO at doses of 100 and 300 mg/kg was able to reduce the frequency of coughing, and at a dose of 300 mg/kg increaseditslatency. In the rota-rod and open-field tests, the LOO 300 mg/kg presented a myorelaxant and anxiolytic/sedative activity evidenced by an increase in the number of bar drops and reduction in the dwell time in the bar, for the rota-rod, and increase of rearings, reduction in the number of crosses and increased immobility time, for the open field, suggesting an central nervous system (CNS)activity.The optimization of the experimental protocol and analytical method for evaluation of expectorant activity has been validated to obtain precise and accurate evaluations of phenol red in the BAL. LOO showed spasmolytic and antitussive activities and possible action on the CNS. Furthermore, LOO can now be used though the expectorant activity protocol with a valid and accurate method. Keywords: anxiolytic/sedative activity, antitussive activity, spasmolytic activity,

Lippia origanoides Kunth, essential oil.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Diferença histológica e imunológica entre asma e DPOC.

Figura 2 - Atividade relaxante e contracturante de prostanoides sobre o músculo liso

das vias aéreas.

Figura 3 - Efeito relaxante de LOO em músculo liso traqueal em contrações

induzidas por histamina ou carbacol.


induzidas por histamina na presença ou ausência de bloqueadores de canais para

potássio (K+).


induzidas por histamina na presença e ausência de bloqueador β-adrenérgico e

inibidores da via dos eicosanóides.


induzidas por histamina na presença e ausência de bloqueador ganglionar e

muscarínicos.


induzidas por histamina na presença e ausência de bloqueadores da via do

NO/GCs/GMPc.

Figura 8 – Valores de CE50 de LOO na ausência e presença dos bloqueadores.

Figura 9 – Análise da contração por CCh na ausência e presença de LOO e/ou

aminofilina.

Figura 10 - Análise da contração por CCh na ausência e presença de LOO,

nitroprussiato de sódio e/ou azul de metileno.

Figura 11 - Análise de frequência de tosse e latência, obtidos na presença de LOO.

Figura 12 - Número de quedas e tempo de permanência dos camundongos no

aparelho rota-rod.

Figura 13 - Análise de LOO na dose de 300 mg/kg, em relação ao tempo.

Figura 14 - Principais parâmetros de avaliação no campo aberto.

Figura 15 - Distribuição das espécies iônicas de vermelho de fenol de acordo com a

variação do pH.

Figura 16 - Varredura em espectrofotômetro da solução de vermelho de fenol em

pHs diferentes.

Figura 17 - Varredura em espectrofotômetro da solução de vermelho de fenol em

condições básicas obtidas por NaOH e NaHCO3.

Figura 18 - Varredura espectrofotométrica das amostras de LBA na presença e

ausência de vermelho de fenol.

Figura 19 - Regressão linear das soluções de vermelho de fenol.

Figura 20 - Quantificação de vermelho de fenol a partir de dose fixa e concentrações

variáveis.

Figura 21 - Possível mecanismo tussígeno do ácido crítrico.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica.

Tabela 2 - Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides.

Tabela 3 - Informações sobre o protocolo de atividade expectorante disponível na

literatura.

Tabela 4 - Composição do óleo essencial de L. origanoides por CG-EM.

Tabela 5 - Dados numéricos dos parâmetros analisados no campo aberto.

Tabela 6 - Resultado da relação absorbância média de pH da amostra de LBA.

Tabela 7 - Verificação na altura do sedimento das partículas do vermelho de fenol.

Tabela 8 - Dados observados nos protocolos experimentais da literatura.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

4-AP 4-aminopiridina

AA Ácido araquidônico

AC Adenililciclase

AMN Aminofilina

AMPc Adenosina monofosfato cíclico

anti-TNF Anti-fator de necrose tumoral

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

APC´s Células apresentadoras de antígeno

ATP Adenosina trifosfato

ATR Atropina

AZM Azul de metileno

BKca Canais para K+ de grande condutância ativados por cálcio

CCh Carbacol

CE50 Concentração efetiva que causa 50% do efeito máximo

CEUA-UNIVASF Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal

do Vale do São Francisco

CG-EM Cromaografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

CN Controle negativo

COX Cicloxigenase

CP Controle positivo

CsCl Cloreto de césio

CXCL10 ou IP-10 Proteína 10 induzida por INF-

CXCL12 ou I-TAC Célula T quimioatrativa induzida por interferon

CXCL9 ou MIG Monoquina induzida por INF-

DAG Diacilglicerol

DEX Dexametasona

DPOC Doença pulmonar obstrutiva crônica

DPR% Desvio padrão relativo

DT50 Dose tóxica que afetaria 50% dos animais

FcƐRI Receptor de IgE

FEV1 Volume de expiração forçada em 1 segundo

GCp Guanilil ciclase particulada

GCs Guanilil ciclase solúvel

GLIB Glibenclamida

GMPc Guanilil monofosfato clíclico

ICH International Conference of Harmonization

IFN- Interferon gama

IgE Imunoglobulina E

IL-13 Interleucina 13

IL-4 Interleucina 4

IL-5 Interleucina 5

IL-9 Interleucina 9

IND Indometacina

IP3 Inositol 1,4,5-trisfosfato

iPDE4 Inibidores da fosfodiesterase 4

ISAAC International Study for Asthma and Allergies in Childhood

KATP Canal para K+ sensível ao ATP

KCa Canais para K+ abertos pelo Ca2+

Kir Canais para K+ retificadores de entrada

KV Canais para K+ operados por voltagem

LABA’s Agonistas β2-adrenérgicos de longa duração

LAMA Antagonista muscarínico de longa duração

LAPRON Laboratório de Química de Produtos Naturais e Bioativos

LBA Lavado broncoalveolar

LD Limite de detecção

L-NAME Nω-nitro-L-arginina metil éster

LOO Óleo essencial de L. origanoides

LOX Lipoxigenase

LQ Limite de quantificação

LT’s Leucotrienos

LTB4 Leucotrieno B4

LTD4 Leucotrieno D4

LTRA Antagonistas do receptor de leucotrieno

MLCK Cinase da cadeia leve de miosina

MLCP Fosfatase da cadeia leve de miosina

NaCl Cloreto de sódio

NaHCO3 Bicarbonato de sódio

NaOH Hidróxido de sódio

NF-kB Fator de transcrição nuclear kb

NH4Cl Cloreto de amônio

NO Óxido nítrico

NPS Nitroprussiato de sódio

OVA Ovalbumina

ODQ 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3,-a]quinoxalina-1-ona

PAF Fator ativador de plaquetas

PG’s Prostaglandinas

PGD Prostaglandina D

PGD2 Prostaglandina D2

PGE Prostaglandina E

PGF Prostaglandina F

PGI Prostaglandina I

PIP2 Inositol 4,5-bifosfato

PK Proteína cinase

PKA Proteína cinase ativada por AMPc

PKC Proteína cinase ativada por cálcio

PKG Proteína cinase ativada por GMPc

PLA2 Fosfolipase A2

PROP Propranolol

RPM Rotações por minuto

SABA’s Agonistas β2-adrenérgicos de curta duração

SHR Ratos espontaneamente hipertensos

SUS Sistema Único de Saúde

TEA Tetraetilamônio

TH2 T-helper tipo 2

TLSP Linfopoetina do estroma tímico

TNF Fator de necrose tumoral

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

TRP Transient receptor potential channel

TRPA Transient receptor potential channel ankyrin

TRPC Transient receptor potential channel canonical

TRPM Transient receptor potential channel melastin

TRPV Transient receptor potential channel vanilloid

TX Tromboxano

TXA2 Tombroxano A2

UEFS Universidade Estadual de Feira de Santana

UNIVASF Universidade federal do vale do São Francisco

YC-1 (3-(5'-hidroximetil-2'-furil)-1-benzilindazol)

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 17

2 REFERENCIAL TEÓRICO 20

2.1 ASPECTOS GERAIS SOBRE A ASMA 20

2.1.1 Abordagem terapêutica da asma 26

2.2 ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E ANTIASMÁTICA DE

ÓLEOS ESSENCIAIS 30

2.3 GÊNERO Lippia e Lippia origanoides Kunth. 41

3 OBJETIVOS 59

3.1 OBJETIVO GERAL 59

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 59

4 MATERIAIS E MÉTODOS 60

4.1 MATERIAIS 60

4.2 PROCESSAMENTO DO MATERIAL VEGETAL 61

4.3 ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO

ESSENCIAL 62

4.4 ANIMAIS 62

4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E

MECANISMO DE AÇÃO EM MÚSCULO LISO DE TRAQUEIA

ISOLADA DE COBAIA

62

4.5.1 Investigação da participação de canais para K+

no relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída

com histamina

63

4.5.2 Investigação da participação de receptores

β-adrenérgicos no relaxamento induzido por LOO em traqueia

pré-contraída com histamina

63

4.5.3 Investigação da participação das

prostaglandinas no relaxamento induzido por LOO em traqueia

pré-contraída com histamina

64

4.5.4 Investigação da participação da via colinérgica

no relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída 64

com histamina

4.5.5 Investigação da participação da via do óxido

nítrico (NO) no relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-

contraída com histamina

65

4.5.6 Investigação da participação da via da guanilil

ciclase solúvel (GCs) no relaxamento induzido por LOO em

traqueia pré-contraída com CCh

65

4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUSSÍGENA EM

CAMUNDONGOS 66

4.7 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA (TESTE DO

ROTA-ROD) 67

4.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MOTORA ANSIOLÍTICA

ATRAVÉS DO MÉTODO DE CAMPO ABERTO 67

4.9 APERFEIÇOAMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE EXPECTORANTE A PARTIR DA

QUANTIFICAÇÃO DO MARCADOR VERMELHO DE FENOL

68

4.9.1 Influência do pH da quantificação de vermelho de

fenol em LBA 69

4.9.2 Perfil de absorção no UV do vermelho de fenol no

LBA 69

4.9.3 Validação da metodologia analítica 70

4.9.4 Determinação da solubilidade do vermelho de

fenol em salina e LBA 72

4.9.5 Desenvolvimento de suspensão de vermelho de

fenol estável 72

4.9.6 Aplicação da metodologia analítica para

avaliação de atividade expectorante em camundongos 72

4.10 ANÁLISE DOS DADOS 73

5 RESULTADOS 74

5.1 ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO

ESSENCIAL 74

5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E

MECANISMO DE AÇÃO EM MÚSCULO LISO DE TRAQUEIA 75

ISOLADA DE COBAIA

5.2.1 Investigação da participação de canais para K+


com histamina

77

5.5.2 Investigação da participação de receptores

β-adrenérgicos e das prostaglandinas no relaxamento induzido

por LOO em traqueia pré-contraída com histamina

78

5.5.3 Investigação da participação da via colinérgica


com histamina

80

5.5.4 Investigação da participação da via do óxido

nítrico (NO) no relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-

contraída com histamina

81

5.5.5 Investigação da participação da via da guanilil

ciclase solúvel (GCs) no relaxamento induzido por LOO em

traqueia pré-contraída com CCh

83

5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUSSÍGENA EM

CAMUNDONGOS 86

5.4 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA (TESTE DO

ROTA-ROD) 88

5.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MOTORA E ANSIOLÍTICA

ATRAVÉS DO MÉTODO DE CAMPO ABERTO 92

5.6 OTIMIZAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE EXPECTORANTE A PARTIR DA

QUANTIFICAÇÃO DO MARCADOR VERMELHO DE FENOL

94

5.6.1 Influência do pH da quantificação de vermelho de

fenol por espectrometria de absorção no UV-VIS 94

5.6.2 Quantidade de agente basificante adicionada as

amostras de LBA 96

5.6.3 Validação da metodologia analítica 98

5.6.4 Determinação da solubilidade do vermelho de

fenol em salina e em LBA 100

5.6.5 Desenvolvimento de suspensão extemporânea 100

estável de vermelho de fenol

5.6.6 Aplicação da metodologia analítica para

avaliação de atividade expectorante in vivo 101

6 DISCUSSÕES 107

7 CONCLUSÕES 124

REFERÊNCIAS 125

ANEXO - A 145

ANEXO - B 146

17

1 INTRODUÇÃO

A asma é uma doença crônica caracterizada pela instauração de uma

inflamação das vias aéreas inferiores, associada a uma hiperresponsividade

brônquica que leva a recorrentes episódios de sibilância, aperto no peito, dispneia

e tosse. Tem sido descrita como uma enfermidade que apresenta elevada

prevalência e potencialmente danosa, causando limitações de atividades cotidianas

e ataques agudos, estes algumas vezes requerendo cuidados de emergência e

podendo ser fatais (GINA, 2016; POSTMA et al., 2014).

De maneira geral, a patogênese da asma está relacionada a uma resposta

celular mediada por linfócitos T-helper tipo 2 (TH2) e imunoglobulina E (IgE), após o

contato do indivíduo predisponente com um alérgeno. A partir disso, há hiperplasia

das células caliciformes e formação de infiltrado inflamatório. A resolução envolve

metaplasia da mucosa, espessamento da membrana basal sub-epitelial, hipertrofia

e hiperplasiado músculo liso das vias aéreas inferiores, além de fibrose e aumento

da deposição de tecido conjuntivo, por causa da proliferação de fibroblastos e

miofibroblastos (MARTINEZ; VERCELLI, 2013).

A abordagem medicamentosa tem como objetivo o controle da inflamação,

redução da secreção mucosa e relaxamento das vias aéreas, sendo os

corticosteroides e agonistas β2-adrenérgicos os fármacos mais utilizados na

terapêutica (BARNES, 2012). Porém, algumas abordagens são alternativas ao

tratamento convencional no controle da asma, podendo-se destacar os óleos

essenciais obtidos de plantas aromáticas. Como exemplo destas plantas

aromáticas, o gênero Lippia tem uma grande importância para a flora brasileira e

neotropical, devido a sua representatividade como condimento ou pelas suas

propriedades medicinais. Este gênero reúne cerca de 200 táxons, distribuídos nos

trópicos e subtrópicos das Américas e África, sendo comuns nos cerrados e

campos rupestres brasileiros (ADORJAN; BUCHBAUER, 2010; VELASCO-

NEGEUREULA et al., 1993 apud VILJOEN et al., 2005; SOUZA; LORENZI, 2005).

Segundo dados do Index Kewensis, no Brasil, existem cerca de 111 espécies,

no México, 44 e na África, 33 espécies (SALIMENA, 2000), sendo os estudos

voltados à fitoquímica desse gênero, dedicados à composição química dos óleos

18

essenciais com relatos de variação entre indivíduos da mesma espécie, mas de

diferentes origens geográficas (CATALAN; LAMPASONA, 2002).

Há mais de uma década, Pascual e colaboradores (2001) destacaram que os

estudos farmacológicos das espécies de Lippia são focados, principalmente, na

identificação de atividade antimicrobiana, antifúngica, larvicida e repelente, com

preferência dada aos óleos essenciais. Considerando o que aparece atualmente

nas principais bases de dados (Web of Science e Pubmed), pouco foi acrescentado

à farmacologia do gênero desde 2001, em relação relaxamento do músculo liso,

com um agravante da concentração dos estudos em poucas espécies.

A espécie L. origanoides, conhecida popularmente como alecrim de tabuleiro,

alecrim pimenta, alecrim-d’angola, orégano ou salva-do-marajó, é um arbusto

aromático bastante ramificado, encontrado em campos e cerrados de solos

pedregosos e compactos, em altitudes entre 900 e 1100 metros acima do nível do

mar. A ocorrência desta espécie abrange Guiana Francesa, Brasil (desde o estado

do maranhão ao estado do Rio de Janeiro), Colômbia, Venezuela e Guiana, sendo

comum no semiárido brasileiro (SALIMENA-PIRES; GIULIETTI, 1998). As folhas

desta planta são usadas popularmente na forma de decoto ou macerado em álcool

no tratamento de doenças do trato respiratório, incluindo asma, bronquite, gripe,

resfriado e tosse, bem como em distúrbios gastrintestinais, como dores de

estômago e indigestão, além de infecções microbianas (AGRA et al., 2007;

PASCUAL et al., 2001).

Devido a grande utilização de L. origanoides pelas comunidades da Região

Nordeste e o potencial dessa espécie em produzir óleo essencial em larga escala,

estudos sobre as condições de cultivo tem sido realizado por uma equipe de

colaboradores do Horto Florestal da Universidade Estadual de Feira de Santana

(UEFS). Os óleos produzidos contêm como constituinte majoritário o carvacrol,

havendo variação entre os demais componentes (TELES et al., 2014).

Por se considerar a escassez de estudos farmacológicos da espécie

L. origanoides, estre trabalho buscou realizar uma investigação da composição

química do óleo essencial e da atividade farmacológica in vitro e in vivo em

modelos experimentais de distúrbio do trato respiratório, relacionados com o uso

popular dessa espécie, além da observação de neurotoxicidade ou influência na

função motora.

19

A identificação de produtos vegetais que atuem amenizando o processo

inflamatório desencadeado, reduzindo o excesso e produção anormal de muco

e/ou contribuindo para o relaxamento e diminuição da sensibilidade do músculo liso

das vias aéreas aos mediadores inflamatórios presentes, pode representar uma

alternativa terapêutica para o tratamento da asma.

20

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 ASPECTOS GERAIS SOBRE A ASMA

A asma é uma das doenças crônicas mais comuns em todo o mundo,

afetando mais de 300 milhões de pessoas, e sua prevalência está aumentando,

particularmente em países em desenvolvimento, com projeção para 2025 de cerca

de 400 milhões. Aproximadamente 250.000 mortes são atribuíveis à asma ocorrem

anualmente em nível mundial, sendo a maioria desses óbitos preveníveis

(BARNES, 2010; BRASIL, 2010; KUSCHNIR et al. 2016).

Tratando-se de Brasil, anualmente ocorrem cerca de 350.000 internações

por asma, constituindo-se na quarta causa de hospitalização pelo Sistema Único

de Saúde (SUS) (2,3% do total) e sendo a terceira causa entre crianças e adultos

jovens. Há registro de aumento desse número de internações entre 1993 e 1999 e

indícios de que a prevalência da asma esteja aumentando em todo o mundo,

inclusive no Brasil. Em 1996, os custos do SUS com internação por asma foram de

76 milhões de reais, 2,8% do gasto total anual e o terceiro maior valor gasto com

uma doença e em 2007 foi responsável por cerca de 273 mil internações, gerando,

para o SUS, custo aproximado de R$ 98,6 milhões. Um estudo multicêntrico

(International Study for Asthma and Allergies in Childhood – ISAAC) realizado em

56 países mostrou uma variabilidade de asma ativa de 1,6% a 36,8%, estando o

Brasil em 8º lugar, com uma prevalência média de 20% (BRASIL, 2010;

CONSENSO BRASILEIRO DA ASMA, 2002; SILVA, 2008).

Em estudo realizado em 2016 no Brasil, com adolescentes de todas as

regiões, foi observada uma prevalência média de asma ativa de 13,1% em

adolescentes de 12-17 anos, oscilando entre 6,3% em Teresina (capital do Piauí) e

16,7% em Campo Grande (capital do Mato Grosso do Sul), e com predominância

entre o sexo feminino em todos os estratos geográficos, variando 9,7% na região

Norte e 14,5% na Sudeste. Além disso, a prevalência média de asma

diagnosticada nos municípios de mais de 100 mil habitantes no Brasil foi 8,7%,

com variação de 6,9% na região Centro-Oeste até 13,5% na região Norte. Essa

diferença foi ainda mais acentuada entre as capitais, de 4,8% em Cuiabá a 19,8%

em Porto Alegre, porém sem diferença entre os sexos (KUSCHNIR et al. 2016).

21

A asma é uma doença inflamatória crônica dos pulmões e, de forma

gradativa, tem sido mais observada nos países desenvolvidos. É caracterizada por

episódios recorrentes de sibilo, falta de ar, aperto no peito e tosse, sendo condição

multifatorial determinada pela interação de fatores genéticos e ambientais. Em

indivíduos geneticamente susceptíveis, a exposição a uma grande variedade de

estímulos ambientais, tais como alérgenos (ácaros do pó, fungos, pólen de plantas

e pelos de animais), infecção (particularmente vírus), poluentes aerotransportados

(fumo do tabaco e partículas de diesel), estímulos físicos (exercício e ar frio) e

drogas (aspirina) podem induzir ou agravar a doença (BRASIL, 2010; HAMMAD,

LAMBRECHT, 2008).

A inflamação asmática é caracterizada por eosinofilia, infiltração de

mastócitos e ativação de células TH2 que produzem as interleucinas 4, 5 e 13 (IL-4,

IL-5 e IL-13). As mudanças estruturais, tais como hiperplasia de células

caliciformes das vias aéreas, hipertrofia e hiperplasia do músculo liso, juntamente

com fibrose subepitelial também estão presentes, mesmo na doença leve, embora

seja proeminente na doença grave (ADCOCK, CARAMORI, CHUNG, 2008).

Em homeostase, as células caliciformes produzem uma classe diferente de

mucinas, um gel-polimérico, denominadas MUC5AC e MUC5B. Além disso,

produzem mucinas e as armazenam no meio intracelular que podem ser facilmente

visualizadas em grânulos, ao passo que outras células produzem e secretam

imediatamente as mucinas (especialmente MUC5B), mas não têm grânulos

proeminentes. Sugere-se que no processo asmático há uma disfunção na

produção MUC5B e isso influencie na gravidade da asma. A produção de MUC5AC

está associada à mediação inflamatória e tem papel importante na asma, por

influenciar a metaplasia da mucosa sob estímulo de algumas citocinas,

principalmente IL-13 (ERLE, SHEPPARD, 2014; SONG et al., 2015).

Em alguns modelos experimentais de asma, pode-se demonstrar que as

células TH2 desempenham um papel predominante no curso da doença através da

indução de hiperplasia das células caliciformes e por causar hiperreatividade

brônquica. As células TH2 causam hiperreatividade brônquica por alterar a

excitabilidade das células da musculatura lisa, via liberação de IL-9 e IL-13,

induzindo broncoconstrição em resposta a vários estímulos não específicos

(HAMMAD, LAMBRECHT, 2008). Além disso, deve-se ressaltar o papel da IL-4 na

diferenciação de TH2, onde os estudos identificaram a linfopoetina do estroma

22

tímico (TSLP, sigla em inglês) como responsável pela imunidade mediada por TH2,

principalmente no que diz respeito ao desenvolvimento dos linfócitos. No entanto,

pode também ser produzida pelas células epiteliais em locais de inflamação

alérgica crônica (SOKOL et al., 2008).

Outro importante mediador na asma é a IgE que está envolvida,

principalmente, na hipersensibilidade. A IgE e mastócitos estão concentrados nos

tecidos da mucosa e isso permite que a IgE seja uma das primeiras moléculas de

defesa para o combate a um patógeno invasor. A característica de uma resposta

alérgica, mediada pelo complexo IgE-FcƐRI (receptor de IgE) em mastócitos, é de

hipersensibilidade imediata. A ativação desse complexo na superfície dos

mastócitos por alérgenos conduz, em minutos, para a chamada "fase precoce" da

reação alérgica que envolve a degranulação dos mastócitos e a síntese de

mediadores lipídicos. Ainda na “fase precoce” há liberação de citocinas e

quimiocinas que iniciam a "fase tardia", permitindo em algumas horas o

recrutamento e ativação de células inflamatórias em locais sensíveis ao alérgeno.

De forma semelhante, mas sem sintomas evidentes, alérgenos ativam as células

apresentadoras de antígenos (APC’s) sensibilizadas por IgE, o que promove a

produção de IgE pelas células B para a reposição da IgE consumida na reação

alérgica, mantendo os mastócitos e APC’s sensibilizadas (GOULD, SUTTON,

2008).

Existem divergências na literatura científica sobre a classificação da asma.

Alguns cientistas a classificam como uma doença pulmonar obstrutiva crônica

(DPOC), enquanto outros tratam a asma como uma enfermidade diferenciada. Isso

pode ser explicado, em parte, por características de mobilização das células

inflamatórias e mediadores secretados, como mostrado na Figura 1, mesmo que

exista uma correlação estrita com o fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) e a

amplificação da inflamação das vias aéreas (BARNES, 2008; BRASIL, 2010).

Pacientes que apresentam asma tem um aumento no número de células

T CD4+ nas vias aéreas com predominância para TH2, enquanto que em indivíduos

normais são encontradas TH1. Células TH2 promovem sua função no estímulo a

secreção das citocinas IL-4 e IL-13 que impulsionam a produção de IgE por células

B, além de IL-5 e IL-9, sendo a primeira responsável pela diferenciação de

eosinófilos na medula óssea e IL-9, atraindo e direcionando a diferenciação de

mastócitos. Por outro lado, na DPOC as células T CD4+ que se acumulam nas vias

23

respiratórias e pulmões são, principalmente, células TH1. As células TH1 expressam

o receptor de quimiocina CXCR3 e pode ser atraído para os pulmões através da

liberação de interferon gama (IFN-) induzida pelos ligantes CXCL9 (conhecido

como monoquina induzida por INF- ou MIG), CXCL10 (conhecido como proteína

10 induzida por INF- ou IP-10) e CXCL12 (conhecido como célula T

quimioatrativa induzida por interferon ou I-TAC) que se apresentam em níveis

elevados nas vias aéreas desses pacientes (BARNES, 2008).

Figura 1. Diferença histológica e imunológica entre asma e DPOC.

Evento Asma DPOC

Inflamação +++ +++

Músculo liso das vias aéreas

+++ +

Membrana basal ++ -

Fibrose + (subepitelial) +++ (peribronquial)

Rompimento alveolar - +++

Vasos das vias aéreas ++ Sem modificação

Mastócitos ++ Normal

Células dendríticas ++ Normal

Eosinófilos ++ Normal

Neutrófilos Normal ++

Linfócitos TH2 TH1

Epitélio Frequentemente

descamado Pseudoestratificado

Células caliciformes ++ ++ (+) representa intensidade da resposta e (-) representa a ausência da resposta.

Fonte: adaptada de BARNES, 2008.

Atualmente, existe o reconhecimento de que a asma represente uma

síndrome reversível, associada à inflamação das vias aéreas com várias

anormalidades pulmonares bioquímicas diferentes, sendo que os pacientes

24

apresentam diferenças específicas. Isso amplia os alvos moleculares para busca

de fármacos, para que haja tratamento eficaz e personalizado de acordo com os

marcadores apresentados (GASTON, 2011).

A asma, apesar de a literatura tentar ajustar seu conceito para uma

síndrome, tornou-se uma das doenças crônicas mais comuns nos países

industrializados e sua frequência deverá aumentar em todo o mundo durante a

próxima década, particularmente em países em desenvolvimento. Décadas atrás, a

asma foi vista como uma doença de broncoespasmo e tratada predominantemente

com broncodilatadores. No entanto, atualmente, é considerada como uma doença

inflamatória das vias aéreas, e o pilar de um tratamento moderno é a utilização de

fármacos como corticosteroides inalados (DIAMANT, BOOT, VIRCHOW, 2007;

BARNES, 2006, 2010).

A asma é uma doença altamente complexa, portanto, é pouco provável que

fármacos destinados a um único receptor ou mediador será eficaz. Os

corticosteroides são eficazes por inibirem os mecanismos inflamatórios. É possível

que um alvo chave no complexo processo inflamatório possa ser eficaz, tal como a

terapia anti-fator de necrose tumoral (anti-TNF) na artrite reumatóide. No entanto,

estes alvos são, geralmente, apenas identificáveis na clínica por prescrições

medicamentosas baseadas na tentativa e erro. Uma classificação seletiva de

medicamentos para pacientes com subtipos específicos de asma pode ser possível

no futuro com o desenvolvimento de biomarcadores e perfis genéticos observados

(BARNES, 2006).

Pesquisadores observaram no decorrer do tempo a existência de

componentes que alteravam a contractilidade do músculo liso das vias aéreas. Isso

permitiu surgir à hipótese do envolvimento de fatores derivados do epitélio na

mediação de eventos relaxantes ou contracturantes. Para as últimas décadas,

várias moléculas têm sido reconhecidas como fatores relaxantes/contráteis

derivados do epitélio, incluindo prostanoides, óxido nítrico (NO), adenosina

trifosfato (ATP) e endotelinas (RUAN, ZHOU, CHAN, 2011).

Os prostanoides podem atuar em diversos receptores específicos,

identificados a partir da ligação da substância endógena que promove atividade.

Por exemplo, prostaglandina D (PGD), E (PGE), F (PGF), I (PGI) e tromboxano

(TX), atuam nos receptores DP, EP, FP, IP e TP, respectivamente, sendo

25

responsáveis pelos efeitos relaxantes ou contracturantes, identificados a partir do

acoplamento da proteína G, como mostra a Figura 2 (RUAN, ZHOU, CHAN, 2011).

Figura 2. Atividade relaxante e contracturante de prostanoides sobre o músculo

liso das vias aéreas.

PLA2 = fosfolipase A2; COX = cicloxigenase; PG = prostaglandina; TX = tromboxano; DP = receptor

para prostaglandina D; IP = receptor para prostaglandina I; EP = receptor para prostaglandina E; FP

= receptor para prostaglandina F; TP = receptor para tromboxano; cAMP = monofosfato de

adenosina cíclico; Ca2+

= íon cálcio.

Fonte: adaptado de RUAN, ZHOU, CHAN, 2011.

A atuação nos receptores específicos podem promover a contração a partir

da ativação dos receptores acoplados a proteína Gq que permitem a atividade da

Célula epitelial

Fosfolipídeos

Ácido araquidônico

Relaxamento Contração

Célula do músculo

liso

26

fosfolipase C, metabolismo de fosfolipídios de membrana (inositol 4,5-

bifosfato-PIP2), com formação do inositol trisfosfato (inositol 1,4,5-trisfosfato-IP3) e

diacilglicerol (DAG) que permitirão um aumento nos níveis do cálcio intracelular e

ativação do mecanismo de contração. Por outro lado, a atuação em receptores

acoplados a proteína Gs permitem a atividade da adenilil ciclase (AC) que

metaboliza o ATP em adenosina monofosfato cíclico (AMPC), esse, por sua vez,

tem a capacidade de ativar uma proteína cinase (PK). A proteína cinase ativada

por AMPC(PKA) promove efeitos relacionados a redução do tônus da musculatura

lisa e relaxamento (BARNES, 2011; BRUTON, CHABNER, KNOLLMANN, 2012;

RUAN, ZHOU, CHAN, 2011).

2.1.1 Abordagem terapêutica da asma

A abordagem medicamentosa da asma se baseia, principalmente, na

utilização de corticosteróides inalados e agonistas β2-adrenérgicos de curta

(SABAS’s) e de longa duração (LABA’s), tal como preconizado pelas diretrizes para

atenção à doenças. No caso da rinite, agonistas α-adrenérgicos são usados para

aliviar congestão nasal, anti-histamínicos (H1) não-sedativos e corticosteróides

tópicos são as terapias de controle bem estabelecidas. Além disso, para tratar a

asma, existe a utilização de anticolinérgicos (antagonistas dos receptores

muscarínicos subtipo 3 - M3), inibidores da fosfodiesterase 4 (iPDE4), antagonistas

ou inibidores da produção de leucotrienos e diversos estudos estão sendo

conduzidos para regulação de mediadores e também da IgE que são importantes

no estabelecimento da fisiopatologia da asma (ADCOCK, CARAMORI, CHUNG,

2008; BARNES, 2010, 2011, 2012; GINA, 2016; HOLGATE, POLOSA, 2008).

Vários corticosteroides inalados estão disponíveis para uso clínico e todos

têm a eficácia clínica semelhante, porém existem diferenças do ponto de vista

farmacodinâmico, de modo que a exposição sistêmica pode ser diferente. Como os

pacientes com asma severa podem requerer doses mais elevadas de

corticosteroides inalados, existe uma vantagem no desenvolvimento de

corticosteroides sistêmicos que permitam uma menor probabilidade e possibilidade

de efeitos secundários, apesar de sua existência como sangramento nasal, dor de

cabeça e irritação local (HOSSNY et al., 2016; METERAN, BACKER, 2016). A

27

ciclesonida é um corticosteroide inalado, recentemente desenvolvido, e parece ter

menos efeitos secundários sistêmicos e efeitos locais, porque é um pró-fármaco

ativado nos pulmões em des-ciclesonida por esterases, sugerindo sua utilidade em

asma grave (BARNES, 2012).

Os broncodilatadores (agonistas 2-adrenérgicos) também são utilizados na

terapêutica, isolados ou em associação aos corticosteroides inalados. São

essenciais no tratamento da asma, pois aliviam e previnem a broncoconstrição.Os

SABA’s são comumente usados em crises agudas da asma e tem grande

influência sobre a terapêutica.Os LABA’s, salmeterol e formoterol, são

considerados um grande avanço no tratamento da asma grave e geralmente são

administrados através de inaladores em combinação com corticosteroides. No

entanto, existem estudos com fármacos agonistas 2-adrenérgicos com posologia

de uma vez ao dia, chamados “ultra-LABA’s” (indacaterol, usado em alguns países

para DPOC, carmoterol, vilanterol e olodaterol). Isso pode ser importante, pois a

dose do corticosteroide permanece fixa, reduzindo alguns efeitos

adversos/secundários (BARNES, 2010, 2011, 2012; GINA, 2016).

Ainda se tratando de broncodilatação, os antagonistas muscarínicos podem

ser utilizados, porém apresentam baixa eficácia, já que inibem uma parte da

broncoconstrição, enquanto que os agonistas 2-adrenérgicos regulam os diversos

mecanismos contracturantes, inclusive os que envolvem a histamina, leucotrienos

D4 (LTD4) e prostaglandinas D2 (PGD2). Apesar dessas evidências, estudos

realizados em animais demonstraram um papel importante dos mecanismos

colinérgicos na resposta ao alérgeno inalado em cobaias sensibilizadas,

demonstrando que o antagonista muscarínico de longa duração (LAMA), conhecido

como brometo de tiotrópio (dissocia rapidamente dos receptores M2, enquanto se

dissocia lentamente dos receptores M3), bloqueia completamente a resposta tardia

em animais não anestesiados (BARNES, 2010, 2011, 2012; BEFEKADU,

ONOFREI, COLICE, 2014; BULKHI, TABATABAIAN, CASALE, 2016). Essa

resposta é também bloqueada por drogas que são antagonistas do transient

receptor potential channel ankyrin 1 (TRPA1), um canal iônico que pode ser

encontrado nos nervos sensoriais localizados nas vias aéreas, sugerindo que os

alérgenos induzem a liberação de um mediador (ainda não identificado) que ativa

TRPA1, levando à broncoconstrição colinérgica reflexa (BARNES, 2012). Além

28

disso, existem achados que mostram a ativação dos receptores muscarínicos por

acetilcolina liberada a partir de células não neuronais, tais como células epiteliais e

inflamatórias, sendo que o brometo de tiotrópio também consegue regular esse

mecanismo (BARNES, 2010, 2011; BEFEKADU, ONOFREI, COLICE, 2014;

BULKHI, TABATABAIAN, CASALE, 2016).

Os iPDE4, como roflumilaste e cilomilaste, previnem a inflamação

eosinofílica em sensibilizados com ovalbumina de forma semelhante a budesonida

(corticosteroide). Além disso, os iPDE4 são capazes de suprimir a inflamação

neutrofílica e exercer efeitos anti-inflamatórios distintos em comparação com os

observados com corticosteroides, sugerindo que os inibidores de PDE4 podem ser

úteis no tratamento da asma grave. A atividade imunossupressora dos iPDE4 na

asma envolve a inibição da produção de citocinas, mediadores pró-inflamatórios,

redução ou inibição da migração de eosinófilos, e a mitigação da degranulação. Os

compostos também podem modificar a capacidade de remodelação das vias

aéreas e reduzir a hiperplasia da musculatura lisa, a atividade pró-inflamatória das

células epiteliais e exsudação de plasma que pode levar aoedema (ADCOCK,

CARAMORI, CHUNG, 2008; BARNES, 2010).

Em estudo com humanos, cilomilaste causou pequenas melhorias no

volume de expiração forçada em 1 segundo (FEV1) em 6 semanas, embora este

efeito fosse perdido em 12 meses.De forma diferente, o roflumilaste (500 µg por

dia) produziu grandes efeitos e melhorias no FEV1, fluxo de pico pela manhã e à

noite e os sintomas da asma durante 12 semanas semelhantes, quando

comparados aos observados com beclometasona 400 μg (ADCOCK, CARAMORI,

CHUNG, 2008). Além disso, recentemente o roflumilaste promoveu redução da

hiperresponsividade das vias aéreas, inflamação, reduziu a hiperplasia das células

caliciformes e a fibrose pulmonar, sendo os dois últimos parâmetros de

remodelamento das vias aéreas, em protocolo experimental de asma crônica (KIM

et al., 2016). Interessante ressaltar que em estudos envolvendo seres humanos,

mostra-se uma possibilidade de efeitos adversos com baixa gravidade e incidência,

porém isso não afeta os benefícios para pacientes com asma e, principalmente, os

com DPOCs (CHERVINSKY et al., 2015).

Os antagonistas do receptor de leucotrieno (LTRA), por exemplo,

montelucaste, melhoram a função pulmonar e sintomas de asma em pacientes com

asma leve a moderada, mas são menos eficazes do que corticosteróides inalados.

29

Além disso, esses agentes são menos eficientes na asma severa, embora um

estudo recente sugira que eles podem ser benéficos em pacientes asmáticos

fumantes, mostrando-se mais efetivos do que os corticosteroides quando

comparados a pacientes não fumantes (PRICE et al., 2013). O inibidor da

5-lipoxigenase, zileutona, bloqueia a síntese de leucotrienos e leucotrieno B4

(LTB4) que atua nos receptores BLT1 e tem efeito quimioatraente para neutrófilos,

eosinófilos, monócitos e macrófagos, fornecendo uma eficácia semelhante ao

montelucaste na asma. A inibição dos receptores BLT2 mostrou-se interessante,

pois estão em excesso nos mastócitos, em pacientes asmáticos, e podem mediar a

produção de células TH2. Estudos relatam que a combinação de LTRA com

corticosteroides inalatorios permite uma melhora clínica aos pacientes asmáticos,

porém em menor proporção do que LABAs e corticosteróides (ADCOCK,

CARAMORI, CHUNG, 2008; BARNES, 2011; DUCHARME, LASSERSON, CATES,

2011).

Observando que a asma tem uma condução por células TH2 e que algumas

citocinas mediam essa resposta, foram desenvolvidos fármacos que inibem,

principalmente, IL-4, IL-5 e IL-13. O desenvolvimento de um inibidor da IL-5 não

apresentou benefícios para pacientes asmáticos, visto que houve efeito apenas na

regulação eosinofílica, o que pode ser benéfico para pacientes que tenham níveis

elevados dessa citocina, como observado na síndrome hipereosinofílica. Já os

estudos com um receptor solúvel recombinante humano da IL-4 (altrakincept) em

pacientes com asma leve a moderada mostraram alguma eficácia em manter o

controle da doençaquando corticosteroides inalados foram retirados, mas este

efeito não foi posteriormente confirmadoe a continuidade dos estudos de

desenvolvimento desse fármaco foram interrompidos.Os estudos envolvendo a IL-

13 são promissores, no entanto, promovem resistência aos corticosteroides, sendo

apropriados para asma severa (ADCOCK, CARAMORI, CHUNG, 2008; BARNES,

2010, 2012; BORISH et al., 2001).

Estudos clínicos sugerem que a utilização de um inibidor do receptor da IgE,

conhecido como omalizumabe, reduz a dose de manutenção dos corticosteroides

utilizados no tratamento, principalmente em asma severa. O omalizumabe pode

causar apoptose de células B que foi exposta ao complexo de IgE na membrana,

sendo improvável, no entanto, afetar outras células do plasma que expressam

pouco IgE na membrana. Além disso, ensaios clínicos já mostraram, de forma

30

consistente, uma redução de 50% no número de exacerbações asmáticas e quase

eliminação das exacerbações sazonais, em crianças. Enquanto a tendência de

indivíduos alérgicos expressarem respostas de células TH2 nos seus órgãos-alvo

persiste, há também o risco de recaída se o tratamento com o anticorpo (ou um

inibidor de molécula pequena) é interrompido ou suspenso. Os ensaios clínicos

combinando imunoterapia para alcançar o desvio imune de tipo TH2 para as

respostas do tipo TH1, com omalizumabe, representam um desenvolvimento

interessante (BARNES, 2012; DUNICAN, FAHY, 2015; GOULD, SUTTON, 2008).

Sabendo da importância da asma para uma extensa parcela da população

mundial, Shakeri e Boskabady (2015) revisaram na literatura plantas medicinais

que promoveriam efeito relaxante em músculo liso de traqueia, observando o

mecanismo de ação, eficácia e potência, parâmetros pré-clínicos importantes

naprospecção de plantas medicinais que possam ser utilizadas no tratamento da

asma ou mapeamento de substâncias químicas com relevância terapêutica.

Os estudos mostram que plantas medicinais ou seus derivados tem efeito

sobre a musculatura lisa traqueal, podendo mimetizar algum problema respiratório,

dada as devidas proporções, pois são testadas em roedores e participam da fase

pré-clínicas dos estudos envolvendo a obtenção de medicamentos, porém são

indicativos de atividade.

2.2 ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E ANTIASMÁTICA DE ÓLEOS ESSENCIAS

As propriedades farmacêuticas de plantas aromáticas são parcialmente

atribuídas aos óleos essenciais, termo que foi usado pela primeira vez no século 16

por Philippus Aureolus Theophrastus Bombastus von Hohenheim ou Paracelso,

nomeando o componente efetivo de uma droga com o nome de “Quinta essencial".

Em meados do século 20, o papel dos óleos essenciais tinha se reduzido ao uso em

perfumaria, cosméticos e aromas alimentares, enquanto a utilização em preparações

farmacêuticas tinha declinado (EDRIS, 2007).

A definição de um óleo essencial exclui outros produtos aromáticos ou

voláteis obtidos por diferentes técnicas extrativas, como a extração com solventes,

extração com fluido supercrítico, CO2 supercrítico e extração assistida por

microondas. Os óleos essenciais são extremamente complexos na composição

31

devido à presença de substâncias químicas altamente funcionalizadas que estão

classificados em duas classes químicas distintas: terpenoides e fenilpropanoides,

sendo isolados cerca de 55.000 isoprenoides ou terpenoides, com também são

conhecidos. Os terpenoides são extremamente variáveis, mostrando diferentes

esqueletos de carbono e uma grande variedade de derivados oxigenados, incluindo

álcoois, ésteres, aldeídos, cetonas, éteres, peróxidos e fenóis (MAFFEI, 2010;

REHMAN et al. 2016; TONGNUANCHAN, BENJAKUL, 2014; ZUZARTE,

SALGUEIRO, 2015).

Os óleos essenciais podem ser utilizados em inúmeros testes

farmacológicos, inclusive a sua volatilidade e lipofilicidade admitem a permeação

nos mais diversos sistemas, permitindo o uso para atividade espasmolítica e

antiasmática, por exemplo, o que pode influenciar na escolha desse produto natural

para o desenvolvimento de medicamentos. Na Tabela 1 estão elencados estudos

que envolvem a utilização de óleos essencias no tratamento de doenças

pulmonares (no período de 2001 até 2016), relacionando os aspectos

espasmolítico, sobre a inflamação pulmonar e expectoração.

32 Tabela 1. Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica.

Planta Parte

utilizada

Componentes

majoritários Modelo experimental

Dose e CE50

ou CI50 Referências

Angelicae sinensis Raiz - Asma induzida por OVA em ratos 40-160 mg/kg Wang et al.,

2015

Artemisia marítima -

1,8-Cineol (41,14%);

L-(-)-Canfora

(20,32%)

Atividade espasmolítica em

traqueia isolada de cobaia

410 µg/mL

(CCh)

520 µg/mL (K+)

Shah et al.,

2011

Aster tataricus Raízes e

Rizoma

(R)(-)-p-ment-1-en-4-

ol, 2-undecanona,

ácido undecanoido, (-

)-espatulenol,

hexahidroarnesil

acetona, ácido

hexadecanoico, cis-9,

cis-12-ácido

octaecadienoico e 1-

acetoxi-2-ene(E)-4,6-

decandiina

Atividade expectorante a partir da

secreção traqueal do vermelho

de fenol em camundongos

- Yang et al.,

2008

Atractylodes

macrocephala Rizoma

Atractilona (26,3%)

-panasiseno

(6,98%)

Atividade expectorante a partir da

secreção traqueal do vermelho

de fenol em camundongos

1,95 g/kg

(Intragástrica)

Wang et al.,

2016

33 Tabela 1. Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica (Continuação).

Planta Parte

utilizada

Componentes


Dose e CE50 ou

IC50 Referências

Boswellia carterii -

Acetato de octil

(35,1%)

1-octanol (21,5%)

-ocimeno (13,1%)

Tosse induzida por

ácido cítrico em ratos

0,004 e 0,008

cc/kg Taha et al., 2016

Boswellia sacra - -

Asma e

hiperresponsividade das

vias aéreas induzida por

OVA em camundongos

0,3 % (Inalação)

Lee, Yun, Kang,

2008

Lee, Kim, Kang,

2010

Carum copticum Sementes Carvacrol e Timol

Atividade espasmolítica

em traqueia isolada de

cobaia

0,1; 0,2 e 0,4 mL

(frações do óleo

essencial)

Boskabady,

Ramazani, Tabei,

2003

Conyza bonariensis Partes

aéreas

Limoneno (45%)

trans--ocimeno

(13%)

trans--farneseno

(6,6%)

Germacreno D

(6,4%)

Pleurisia induzida por

zymosan em

camundongos

100 mg/kg (via

oral) Souza et al., 2003


Planta Parte

utilizada

Componentes


Dose e CE50 ou

IC50 Referências

Croton

nepetaefolius -

1,8-cineol (25%)

Metileugenol (14,9%)

Biciclogermacreno

(11%)

Xantoxilina (10,1%)



cobaias sensibilizadas

ou não por OVA e

células musculares lisas

4,3 µg/mL (basal)

113,0 µg/mL e

128,8 µg/mL (K+)

123,9 µg/mL

(Hist)

102,5 µg/mL

(CCh)

300 e 600 µg/mL

(OVA)

Magalhães et al.,

2003

Croton sonderianus

(OE-13) Folhas

Biciclogermacreno

(16,29%)

-felandreno

(15,42%)

-cariofileno

(13,82%)

-pineno (9,87%)



ratos

62,3±10,7 µg/mL

(K+)

518,97±215,3

µg/mL (ACh)

Pinho-da-silva et

al., 2010


Planta Parte

utilizada

Componentes


Dose e CE50 ou

IC50 Referências

Croton sonderianus

(OE-21) Folhas

Espatulenol

(18,32%)

-cariofileno

(14,58%)

Óxido de cariofileno

(8,54%)

1,8-cineol (8,38%)



ratos

235,47±55,1

µg/mL (K+)

708,37±171,0

µg/mL (ACh)

Pinho-da-silva et

al., 2010

Eucalyptus

tereticornis -

1,8-cineol (74,6%)

-pineno (7,8%)

-pineno (7,4%)

Atividade

espasmolíticaem

traqueia isolada de ratos

260,5µg/mL (K+)

100 e 300

µg/mL(ACh)

Lima et al., 2010

Gerbera

piloselloides Raíz

6-acetil-2,2-dimetil-

8(3-metil-2-butenil)-

2H-cromene

(60.077%)

Óxido de cariofileno

(21,14%)

-cariofileno

(15,16%)

Atividade antitussígena

e expectorante

2g/kg

(Intragástrico) Tang et al., 2003


Planta Parte

utilizada Componentes majoritários

Modelo

experimental

Dose e CE50 ou

IC50 Referências

Lavandula

angustifólia Folha

Acetato de linalil (31,78%)

Linalol (25,56%)

Atividade

antiasmática e

resistência

pulmonar induzida

por OVA em

camundongos

5-20 µL (inalação) Ueno-iio et al.,

2014

Lippia dulcis Partes

aéreas

Cânfora (32,62±0,18%)

Hernandulcina

(10,1±0,88%)

Atividade

espasmolítica em

brônquios isolado

de porcos

100 µg/mL (CCh e

Hist)

50 µg/mL (Hist)

Görnemann et

al., 2008

Lippia thymoides Folhas

Outono: -cariofileno

(17,22%) e Cânfora (8,61%)

Inverno: -cariofileno

(26,27% e Germacreno

D(6,18%)

Primavera: -cariofileno

(21,20%) e Borneol (7,36%)

Verão: -cariofileno

(19,28%) e Borneol (6,46%)

Atividade

espasmolítica em

traqueia isolada de

cobaia

729 µg/mL (CCh)

Emáx = 60% de

relaxamento

Silva et al., 2016


Planta Parte

utilizada

Componentes


Dose e CE50 ou

IC50 Referências

Mentha piperita - Mentol (49,97%)

Mentona (19,08)



ratos

106,33 ± 15,46

µg/mL (CCh) Sousa et al., 2010

Mentha pulegium - Pulegona (70%)



ratos

40,5 ± 3,3 µg/mL

(K+)

96,2 ± 20,3 µg/mL

(ACh)

Soares et al.,

2012

Nepeta cataria -

1,8-cineol (21%)

-humuleno (14,4%)

-pineno (10,43%)

Acetato de geranil

(8,21%)

Atividade espasmolítca


cobaia

0,05 ± 0,14

mg/mL (CCh)

0,08 + 0,10

mg/mL (K+)

Gilani et al., 2009

Ocimum

micranthum -

E-metil cinamato

(33,6%)

Limoneno (12,9%)

Carvona (9,6%)

-cariofileno (8,03%)

Linalol (7,2%)



ratos sensibilizados, ou

não, com OVA

142,4 µg/mL(K+)

72,1 µg/mL(CCh)

30 e 100 µg/mL

(K+ e CCh) para

animais

sensibilizados ou

não com OVA

Pinho et al., 2012


Planta Parte

utilizada

Componentes


Dose e CE50 ou

IC50 Referências

Phellolophium

madagascariensis

Partes

aéreas

Limoneno (58,5%)

Sabineno (30,25%)



cobaias

100 µL Andriamanantoanina et

al., 2006

Piper betel Folha -


em traqueia isolada e

atividade

broncorelaxante em

cobaias

100 µg/mL (Hist)

100-200 mg/kg

(Broncoconstrição

induzida por Hist)

Hajare et al., 2011

Pistacia

integerrima Galhos

4-carvomentenol

(17,06%)

Acetato de levo-

bornil (13,99%)

L-terpinen-4-ol

(11,93%)

Cimeno (11,54%)

Tetrahidrocarvona

(10,27%)

Borneol (8,90%)

Inflamação bronquial

induzida por LPS em

ratos e

broncoconstrição

induzida por OVA em

cobaias

7,5, 15 e 30 mg/kg Shirole et al., 2014


Planta Parte

utilizada

Componentes


Dose e CE50 ou

IC50 Referências

Pterodon

polygalaeflorus Sementes

trans-cariofileno

(20,6%)

Espatulenol (16,6%)

-copaeno (10,4%)

-muroleno (8,1%)

-elemeno (8,0%)

-humuleno (7,7%)



ratos

750,5 µg/mL

(5-HT)

379,8 µg/mL(K+)

Evangelista et al.,

2007

Rosmarinus

officinalis Folhas

Mirceno (24,6%)

1,8-cineol (19,8%)

Ácido fenilacético

(10,3%)

2-etil-4,5-dimetilfenol

(6,5%)

Pleurisia induzida por

carragenina em ratos

500 mg/kg (via

oral)

Takaki et al.,

2008

Thymus vulgaris - Timol (51%)

1,8-cineol (8,4%)

Tosse induzida por

ácido cítrico em ratos 0,1 e 0,2 cc/kg Taha et al., 2016

40

Tabela 1. Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica (Continuação).

Planta Parte

utilizada

Componentes


Dose e CE50 ou

IC50 Referências

Xylopia

langsdorfiana Folhas

Germacreno D

(22,9%)

trans--guaieno

(22,6%)

-cariofileno (15,7%)

-pineno (7,3%)



cobaia

243 µg/mL (Emáx) Correia et al.,

2015

Zingiber officinale Rizomas Citral (62,4%)

Eucaliptol (6,9%)



ratos

120 ± 17 µg/mL

(CCh)

Mangprayool,

Kupittayanant,

Chudapongse,

2013

(-) representa ausência de informações sobre esse aspecto; OVA = ovalbumina; CE50 = concentração que promove 50% do efeito máximo; IC50 =

concentração que promove inibição em 50% do efeito máximo; CCh = Carbacol; ACh = Acetilcolina; K+ = excesso de potássio; Hist = Histamina; 5-HT =

Serotonina; Emáx = Efeito máximo.

Fonte: Próprio autor.

41

2.3 GÊNERO Lippia e Lippia origanoides Kunth.

O gênero Lippia é um dos mais importantes da família Verbenaceae,

compreendendo cerca de 200 espécies com ampla distribuição nos neotrópicos,

apresentando maior riqueza de espécies na América do Sul, com poucos

exemplares endêmicos da África, sendo que no Brasil pode ser encontrada nos

biomas Amazônia, Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica e Pampas (PASCUAL et al.,

2001; SALIMENA; MULGURA, 2015; SOUZA; LORENZI, 2005).

Do ponto de vista morfológico, se caracteriza por:

Apresentar plantas arbustivas ou subarbustivas, com folhas decussadas, geralmente com indumento glandular, florescências parciais capituliformes ou espiciformes, congestas, axilares, brácteas membranáceas ou cartáceas, verdes ou coloridas, amarelas, róseas ou vináceas, ultrapassando ou não o comprimento das flores; flores sésseis, cálice comprimido, 2-alado, induplicado, membranáceo, inconspícuo, persistente no fruto; corola hipocraterimorfa, alva, rósea, magenta, lilás ou amarelas, tubo reto ou curvo, limbo 4-5 lobado, lábio superior ou adaxial 2-lobado, lábio inferior ou abaxial único, 2 lobos laterais; estames 4; ovário monocarpelar, bilocular, 2-ovulado, estigma lateral. Fruto dividido na maturidade em dois mericarpos (TRONCOSO, 1974).

Várias espécies de Lippia são usadas pela medicina popular devido a suas

propriedades terapêuticas, principalmente para doenças do sistema respiratório,

como gripe, tosse, bronquite e asma. Entretanto, também são relatados usos como

analgésicos, antinflamatório, antipirético, antidiarreico, tratamento de doenças de

pele, do trato gastrintestinal e urinário, bem como ações sobre o sistema nervoso

central. As plantas desse gênero são caracteristicamente aromáticas,

apresentando os óleos essenciais ricos em limoneno, β-cariofileno, p-cimeno,

cânfora, linalol, α-pineno e timol (PASCUAL et al., 2001).

No nordeste brasileiro, as espécies de Lippia são usadas na medicina

popular para o tratamento de resfriados, gripes, bronquites e tosse. Na maioria das

vezes, as partes empregadas são as folhas e flores na forma de infusão ou decocto

administradas oralmente ou através de emplastos (MESA et al., 2009).

Os estudos sobre os efeitos farmacológicos das espécies de Lippia são

concentrados, principalmente, nos óleos essenciais de poucas espécies, como

42

L. alba, L. sidoides e L. gracilis. Assim, para L. alba foi descrito atividade

antimicrobiana (SENA FILHO et al., 2006), antiulcerogênica (PASCUAL et al.,

2001) e sedativa (ZÉTOLA et al., 2002); L. sidoides apresentou efeitos

antihelmíntico (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2007), antimicrobiano

(BOTELHO et al., 2007), antifúngico (FONTENELLE et al., 2007), anti-inflamatório,

gastroprotetor (MONTEIRO et al., 2007) e cicatrizante (PASCUAL et al., 2001),

L. gracilis apresentou efeitos antimicrobiano (ALBUQUERQUE et al., 2006;

PEDRO, 2008) e analgésico e anti-inflamatório (GUIMARÃES et al., 2012;

MENDES et al., 2010).

Uma das espécies do gênero Lippia com interesse farmacológico é a

Lippia origanoides Kunth que possui ampla distribuição, ocorrendo da Guiana até o

norte da Argentina na América do Sul e na América Central (O’LEARY et al. 2012).

Encontra-se como um arbusto aromático ou pequena árvore de 3 m de altura,

nativa da América Central e do norte da América do Sul, sendo conhecida,

popularmente, como “alecrim-d’angola”, “alecrim pimenta”, “orégano”, “salva-do-

marajó”, com utilização em temperos e na medicina tradicional para afecções

gastrointestinais, respiratórias, infecções da garganta, gastroentéricas, da pele e

couro cabeludo, além de ser usado como analgésico, sedativo e expectorante

(COSTA et al., 2001; COSTA, 2006; MARTINS et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2007;

VICUÑA, STASHENKO, FUENTES, 2010).

São utilizadas, normalmente, as partes aéreas de L. origanoides, com as

folhas apresentando cerca de 4% de óleo essencial, produto natural utilizado em

amplos testes farmacológicos (COSTA, 2006). A composição química do óleo tem

cerca de 60% de timol ou uma mistura de timol e carvacrol, ambos agentes

antimicrobianos, além de outros componentes químicos como flavonoides e

quinonas (LORENZI; MATOS, 2002).

A L. origanoides é alvo de extensos estudos na literatura científica,

principalmente, nas áreas de química e farmacologia, com os dados apresentados

no Quadro 2, onde mostra a parte da planta utilizada, a composição química,

atividade farmacológica e dose ou concentração utilizada no experimento, obtidos

a partir da análise de artigos obtidos nas principais bases de dados, indexados no

período de 2007 até 2016.

43 Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides.

Parte da planta/ Produto natural

Composição química Atividade

farmacológica Dose ou Concentração

Autores / ano de

publicação

Partes aéreas (óleo essencial) – 3 amostras

A1 – Carvacrol (27,36%), o-cimeno (26,73%) e

timolmetileter (12,77%) A2 - Carvacrol (33,02%) e

o-cimeno (19,00%) A3 - o-cimeno (30,96%),

Carvacrol (26,60%), e timolmetileter (12,61%)

Atividade antimicrobiana por difusão em disco e

microdiluição e toxicidade aguda e crônica em ratos

MIC = 120 µL/mL (Staphylococcus aureus,

Ehcerichia coli e Salmonella cholerasuis).

Possíveis alterações hepáticas a 60 mg/kg

(agudo). Possíveis alterações

eritrocitárias a 120 mg/kg (crônico)

Andrade et al., 2014

Folhas (oleo essencial)

Timol (73,7%), ϱ-cimeno (10,6%)

Atividade antioxidante a partir da captação do

DPPH e ensaio do ABTS

EC50 = 5,58 ± 0,035 mg AEO/mL DDPH

TEAC = 1,16 ± 0,5 mg/mL

Arango et al., 2012

Folhas (Extratos etanólico, hexânico, diclorometânico e acetato de etila)

F. Hexano – Timol (38,67%) e Carvacrol

(36,17%) F. Diclorometano –

Narigenina forma enólica (15,56%) e Narigenina forma cetona (10,4%)

F. Acetato - Isomaltulose (16,37%), Catequina

(11,61%) e Ácido protocatecuico (9,68%)

Atividade antibacteriana através de microdiluição

e modulação da atividade antibiótica

MIC 1024 µg/mL (S. aureus).

As frações hexânica e diclorometânica

apresentaram sinergia com neomicina e amicacina na

concentração de 128 µg/mL

Barreto et al., 2014

44

Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).


Composição química Atividade farmacológica Dose ou Concentração Autores / ano de

publicação

Folhas (extrato etanólico) – 4

frações

LODCM – Narigenina (15,56%);

Atividade antibacteriana contra S. aureus e E. coli com e sem exposição à luz UV-A (400-315 nm),

por difusão em disco

O diâmetro da zona de inibição para S. aureus

passou de 7 mm (no escuro) para 9.7 mm (na luz UV-A) com a fração diclorometano e de 6

para 7 mm com o extrato etanólico (10 µL por

disco)

Barreto et al., 2014

Partes aéreas (óleo essencial)

Carvacrol (37,3%), Timol

(22,4%) e -terpineno (10,9%)

Atividade antimicrobiana por ensaio de

microdiluição com cepas clínicas de S. aureaus meticilina resistentes

MIC 1024 μg/mL Barreto et al., 2014


Timol (78,7%)

Atividade antibacteriana por determinação da

concentração bactericida mínima

MBC = 0,098 mg/mL (S. enteriditis),

0,780 mg/mL (E. coli), 1,560 mg/mL

(S. typhimurium) e 3,125 mg/mL

(L. acidophillus)

Betancourt et al., 2012

45


Parte da planta/

Produto natural



Autores / ano de publicação

Folhas e caules (óleo essencial)

– 9 amostras

1A – Carvacrol (36,5%), ρ-cimeno (13,9%) e

-terpineno (13,2%) 2B - ρ-cimeno (15,7%)

e trans--cariofileno (9,4%)

3C – Timol (54,5%) e ρ-cimeno (10,0%)

4D - trans--cariofileno (11,3%) e ρ-cimeno

(11,2%) 5E – Carvacrol (46,2%)

e ρ-cimeno (12,0%) 6F – Timol (59,7%) e

Carvacrol (12,2%) 7G - Timol (43,8%), Carvacrol (17,3%) e ρ-cimeno (12,1%)

8H - Timol (53,6%) e ρ-cimeno (11,5%)

9I – Carvacrol (38,8%), Timol (15,1%),

-terpineno (12,6%) e ρ-cimeno (11,5%)

Teste de susceptibilidade

antifúngica (Candida albicans) e atividade

citotóxica em células de Cercopithecus aethiops

(Vero cell line ATCC CCL-81)

CC50 = 29.3±4.8 (5E) MIC = 157,5; 198,4 e

125,0 µg/mL(Candida parapsilosis, C. krusei e Aspergillus flavus) –

3C; MIC = 125,0 µg/mL (Aspergillus flavus) – 8H; MIC = 31,0 µg/mL (A. fumigatus) – 7G

Betancur-Galvis et al., 2011

46




publicação

Não informado (óleo essencial)

Carvacrol (37,3%), timol

(22,4%) e -terpineno (10,9%)

Atividade tripanocida in vitro nas formas

epimastigota, tripomastigota e

amastigota de T. cruzi e efeito citotóxico em

células de mamíferos (macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c)

O valor de CI50 contra epimastigotas e

amastigotas foi de 26,2 e 29,8 µg/mL,

respectivamente. Contra tripomastigotas a CL50

foi de 39,7 µg/mL. CC50 = 175,7 µg/mL

Borges et al., 2012.


-

Atividade antirrelepente frente à Ulomoides

dermestoides e inibidor Quorum sensing (QS)

25 µg/mL (4 horas de exposição)

Cervantes-Ceballos, Caballero-Gallardo, Olivero-Verbel, 2015

Folhas e inflorescências (óleo essencial)

Carvacrol (49,7%) e p-cimeno (13,3%)

Atividade antiparasitária contra

Rhipicephalus microplus (carrapato-de-boi) com avaliação da eficiência reprodutiva de fêmeas ingugitadas através de

teste de imersão e sensibilidade das larvas

no papel impregnado

Para a maior concentração testada (25 mg/mL), o valor da

eficiência reprodutiva foi de 49 e a eficácia foi

39% no teste de imersão. Os valores das

concentrações letais foram 3,08 mg/mL (CL50)

e 8,44 mg/mL (CL90) para larvas de

R. microplus no teste do papel impregnado

Chagas et al., 2016

47




publicação

Folhas (óleo essencial)

Timol (64,1%), m-cimeno

(9,1%) e -terpineno (7,3%)

Atividade antimicrobiana usando a técnica de disco de difusão e pelo método

da diluição

MIC e MFC = 250 µg/mL (A. niger), 2000 µg/mL (S. aureus,

E. coli, S. sonnei, Pseudomonas sp.) e

4000 µg/mL (E. faecalis, B. subtilis, S. thyphimurium)

Chataing et al., 2012

Partes aéreas (extrato

hidroalcoólico) Narigenina

Atividade hipotensora em ratos (intravenosa e oral) e toxicidade oral aguda

Redução da pressão arterial média e frequência cardíaca

50 mg/kg (intravenoso) e 100 e 200 mg/kg (oral)

DL50 2.000 mg/kg

Coelho et al., 2015


– 6 amostras

A1- Carvacrol (46,2%), p-

cimeno (12,0%) e -terpineno (9,5%); A2 – Carvacrol (36,5%), p-

cimeno (13,9%), -terpineno (13,2%) e timol (9,2%); A3 - p-cimeno (15,7%), trans-β-

cariofileno (9,4%) e limoneno (6,9%); A4 –

Timol (53,6%), p-cimeno

(11,5%) e -terpineno (6,3%); A5 – Carvacrol

(38,8%), timol (15,1%), -terpineno (12,6%) e p-

cimeno (11,5%); A6 - Trans-β-cariofileno (11,3%), p-

cimeno (11,2%) e α-felandreno (9,9%)

Atividade antiparasitária contra formas livres e

intracelulares de L. chagasi e T. cruzi e

citotoxicidade em células Vero e THP-1.

CI50 9,9 (A1), 19,2 (A2), 40,1 (A3), 10,7 (A4), 32,8 (A5) e 7,8

(A6) µg/mL para a forma epimastigota de T. cruzi. Para os amastigotas de T. cruzi os valores foram 50,5 (A1), 77,5 (A2), >100 (A3), >100 (A4), 53,0 (A5) e 94,4 (A6) µg/mL. Contra L. chagasi os valores foram 13,7 (A1), 63,2 (A2),

>100 (A3), 4,4 (A4), 16,0 (A5) e >100 (A6) µg/mL. Os óleos

não foram considerados citotóxicos

Escobar et al., 2010

48




publicação


Carvacrol (49,7%), p-

cimeno (13,3%) e -terpineno (4,5%)

Atividade antimicrobiana por microdiluição

O valor de MIC e MBC foi de 2500 µg/mL-1 contra Aeromonas

hydrophila para 100 μL de óleo essencial diluído

Majolo et al., 2016



(15,0%) e -terpineno (10,0%)

Efeito inibitório in vitro do óleo essencial na

replicação do vírus da febre amarela e

citotoxicidade em células Vero

O valor de CC50 foi de 98 ± 3,8 µg/mL nas

células Vero. Valor de MIC do óleo essencial para o vírus da febre

amarela foi 3,7 μg/mL. A razão CC50/MIC é de

26,4 μg/mL

Meneses et al., 2009

Caules e folhas (Óleo essencial)

Carvacrol (46,2%); Timol

(9,9%) e -terpineno (9,5%)

Atividade larvicida e adulticida frente à Aedes

aegypti

CL99 = 88,8 ppm (larvicida)

CL99 = 1.054 ppm (adulticida)

Muñoz, Staschenko, Ocampo, 2014



(14,3%), -terpineno (10,0%) e p-cimeno

(9,5%)

Atividade antioxidante ou antiradicalar in vitro por meio do método ABTS

modificado e da oxidação do ácido linoleico através

da quantificação do hexanal

O valor de TAA foi de 2040 ± 21 (6 minutos) e

4500 ± 337 (30 minutos). O efeito protetor foi de 77 ± 5% (inibição da

peroxidação)

Muñoz-Acevedo; Kouznetsov; Stashenko,

2009

49




publicação


Carvacrol (38,6%), timol (18,5%) e p-cimeno

(10,3%)

Atividade antimicrobiana pelo método de difusão

em ágar

Uma gota do óleo (10 μL) devidamente

diluído em água e Tween gerou halos de inibição de 27, 40, 35, 24, 30, 40, 25, 20 e 26

mm de diâmetro em culturas de C. albicans,

C. guilliermondii, C. parapsilosis, C. neoformans,

T. rubrum, F. pedrosoi, S. aureus, L. casei e S.

mutans, respectivamente

Oliveira et al., 2007

Partes aéreas (extrato etanólico)

-

Atividade nociceptiva em modelo experimental de contorções abdominais

induzidas por ácido acético, teste da formalina

e teste da placa quente em camundongos Swiss

machos

O pré-tratamento com a dose de 10mg/kg (menor testada) já resulta numa inibição significante das

contorções e da resposta induzida pela

formalina. Na placa quente são observados efeitos antinociceptivos intermediários com a

dose de 30mg/kg

Oliveira et al., 2014


- Atividade repelente contra

Tribolium castaneum

CR = 0,2 µL/cm2 (94±4% por 2h e 98±2% por 4h); CR50 = 0,001 (2 horas) e 0,0005 (4 horas) µL/cm2

Olivero-Verbel et al., 2009

50




publicação

Planta inteira (óleo essencial) –

9 amostras

Amostra (VEnaW02B): Timol (54,5%) e ρ-cimeno

(10,0%) Amostra (VEsaWCR-01): Timol (66,0%) e ρ-cimeno

(7,2%)

Avaliação de toxicidade aguda frente à Artemia

franciscana

CL50< 10 µg/mL (para as 9 amostras)

Olivero-Verbel, Güette-Fernandez, Stashenko,

2009


(E)-metil cinamato (40%) Atividade antimicrobiana

por ensaio de microdiluição

MIC = 78 μg/mL (C. neoformans),

312 μg/mL (A. niger e T. rubrum) e 625 μg/mL

(E. coli)

Perera et al., 2016

Folhas e caules (Extrato aquoso,

hexânico, diclorometânico e acetato de etila)

Triagem Fitoquímica: Folhas – Terpenoides,

esteroides, flavonoides e ácidos fenólicos.

Cumarina e antraquinonas (hexânica e

diclorometânica) e saponinas (acetato de

etila e aquosa) Caule – Terpenoides e

esteroides. Cumarinas e antraquinonas (hexânica),

flavonoides e ácidos fenólicos

(diclorometânica, acetato de etila e aquosa) e

saponinas (acetato de etila e aquosa)

Atividade antimicrobiana em disco de difusão e

microdiluição

Halos de inibição (extrato da folha) = 13,0 ± 0,5 mm (S. aureus),

11,7 ± 0,4 mm (C. albicans) e 7,1±0,4 mm (C. parapsilosis)

MIC = 0,329 mg/mL(S.aureus –

frações Hexanica e acetato das folhas) e

0.658 mg/mL (E. coli e C. albicans – fração dlicorometânica e S. aureus – fração

Hexânica)

Pinto et al., 2013

51





Autores / ano de publicação


Timol (48,7%)


microdiluição

Halos = 8-12 mm (S. aureus de diferentes

isolados de 15-120 µL/mL)

MIC = 15-60 µL/mL a depender do isolado

Queiroz et al., 2014


10 amostras: 6amD – 1,8-cineol (19,4%) 6amR - 1,8-cineol (25,3%),

carvacrol (23,6%) 9amD - ρ-cimeno (26%),

carvacrol (11,8%) e

-terpineno (10,1%)

9amR - -pineno (18,7%) e 1,8-cineol (10%)

12amD – (E)-metil cinamato (26,6%), (E)-nerolidol

(16,9%) e 1,8-cineol (9,9%) 12amR – 1,8-cineol (19,2%),

carvacrol (15%), (E)-cariofileno (11,8%) 3pmD – (E)-nerolidol

(14,7%), 1,8-cineol (12,3%), (E)-metil cinamato (10,8%) e

ρ-cimeno (9,1%)

3pmR - -pineno (18,1%) e (E)-cariofileno (16,3%)

6pmD – 1,8–cineol (16,8%), (E)-metil cinamato (11,1%) e

ρ-cimeno (9,1%) 6pmR - (E)-nerolidol (46,7%)

Ribeiro et al., 2014

52




publicação

Partes aéreas (óleo essencial) –

3 amostras

OECAM – carvacrol (42,9%), p-cimeno

(15,8%), -terpineno (8,0%) e metil timol (7,0%); OECAB –

carvacrol (37,3%), p-

cimeno (12,1%), -terpineno (10,0%) e metil timol (8,7%); OEFRE – carvacrol (33,5%), p-

cimeno (11,9%), -terpineno (10,5%) e timol

(8,4%)

Atividade antibacteriana e antifúngica em disco de

difusão

Discos de filtro de papel impregnados com 10 μL das

amostras gera halo de inibição de15, 15, 21, 23 e 27 mm para OECAB; 15, 18, 25, 23 e 30 mm para OECAM e 15, 17, 24, 25 e 28 mm para

OEFRE contra E. coli, S. aureus, S. aureus MRSA, C. albicans e C. tropicalis,

respectivamente

Santos et al., 2004

Folhas e caules (óleo essencial)

Variação sazonal de janeiro-dezembro (2012):

Carvacrol (47,2% em junho), timol (12,8% em junho), p-cimeno (11,8%

em outubro) e p-metoxitimol (14,1% em

dezembro)

Atividade antimicrobiana por microdiluição

MIC = 0,15 μL/mL (E. coli) e 1,25 μL/mL (S. aureus)

Sarrazin et al., 2015

53




publicação

Folhas e caules finos (óleo essencial)

Carvacrol (47,2%), timol (12,8%), p-cimeno (9,7%)

e p-metoxitimol (7,4%)


microdiluição Atividade antioxidante pelo

método do sequestro do DPPH e auto-oxidação do

-caroteno Toxicidade aguda em camundongos (DL50)

MIC 1.25 μL/mL (Salmonella typhimurium e Bacillus

subtilis) e de 0.62 μL/mL (Bacillus cereus); Diâmetro

do halo 27,9 ± 0,4 mm (Salmonella typhimurium),

50,9±0,6 mm (Bacillus cereus),

35,8±0,3 mm (Bacillus subtilis).

CE50 para DPPH = 23,0±1,5 μg/mL; Inibição da auto-

oxidação do -caroteno = 85,2±6,8%.

DL50 = 1.673,84 mg/kg

Sarrazin et al., 2015

Folhas (Extrato etanólico)

- Toxicidade frente à

Tetranychus cinnabarinus

Extrato etanólico (20% v/v), promoveu 96,6% de

mortalidade e 100% na inibição da ovoposição

Sivira et al., 2011


- Atividade antimicrobiana

em disco de difusão e microdiluição

Halo = 10 mm (aproximadamente para

S. aureus e E. coli na concentração de 160 μL/mL) MIC = 160 μL/mL (S. aureus

e E. coli)

Souza et al. 2015


- Atividade antimicrobiana

em disco de difusão e microdiluição

Halo = 10 mm (aproximadamente para

S. aureus e E. coli na concentração de 160 μL/mL) MIC = 160 μL/mL (S. aureus

e E. coli)

Souza et al. 2015

54




publicação

Não informado (oleo essencial –

2 quimiotipos)

1º quimiotipo: Carvacrol (44,4-51,8%) e ρ-cymene

(8,8-10,1%) 2º quimiotipo: ρ -cymene

(11,3-15,7%) e 1,8-cineole (6,8-10,9%)

Atividade antioxidante - Stashenko et al.,

2008

Folhas e Caules (óleo essencial)

Carvacrol (43,8%) e Timol (17,3%) – amostra B

Teste de susceptibilidade antifúngica (Candida albicans) e atividade



MIC = 157,5 µg/mL e 198,4 µg/mL (isolados

clínicos). CI50 = 31,4±5,6 µg/mL

(amostra mais potente - B)

Tangarife-Castaño et al., 2011

Folhas e caule (óleo essencial)

5E – Carvacrol (46,2%), ρ-cimeno (12,0%), Timol

(9,9%) e -terpineno (9,5%)

1A – Carvacrol (36,5%),

ρ-cimeno (13,9%), -terpineno (13,2%) e Timol

(9,2%) 6F - Timol (59,7%), Carvacrol (12,2%) e

ρ-cimeno (8,8%)

Teste de susceptibilidade antifúngica e atividade



MIC = 500 µg/mL – amostras 5E e 6F (Fusarium

oxyporum, Trichophyton rubrum e Trichophyton mentagrophytes), 500 e

396,85 µg/mL – amostra 1A (F. oxyporum e

T. mentagrophytes, respectivamente)

CI50 = 29,3±4,8 µg/mL (5E), 52,3±11,5 µg/mL (1A) e

34,3±6,5 µg/mL (6F)

Tangarife-Castaño et al., 2012

55




publicação


4 amostras cultivadas sobre fertilização orgânica

e coletadas em dias diferentes

T150 – Carvacrol (56,53±8,04%)

T240 – Carvacrol (50,50±0,35%)

T330 – Carvacrol (43,83±4,16%), Linalol

(12,13±1,62%) e Biciclogermacreno

(8,50±2,10%) T420 – Carvacrol

(33,23±9,75%), Linalol (15,87±2,60%) e

-terpineno (8,03±3,17%)

Atividade antioxidante pelo método do sequestro do radical DPPH, ABTS e

ensaio de potência redutora

DPPH - CE50 = 0,71 ± 0,08 e 1,20 ± 0,17 mg/mL

(cultivo orgânico e mineral – T150)

ABTS – CE50 = 0,13 ± 0,00 e 0,25 ± 0,02 (cultivo

orgânico e mineral – T150) Potência redutora – CE50 = 1,99 ± 0,10 mg/mL (cultivo

orgânico – T330) e 1,87 ± 0,23 (cultivo mineral

– T150)

Teles et al., 2014


2 amostras cultivadas sobre fertilização orgânica

e mineral O – Carvacrol (56,53±8,04%) M – Carvacrol

(47,20±8,93%) e ρ-cimeno (11,07±5,56%)

Atividade antioxidante pelo método do sequestro do radical DPPH, ABTS e

ensaio de potência redutora

DPPH – CE50 = 0,71 mg/mL (orgânica) e

1,20 mg/mL (mineral) ABTS – CE50 = 0,13

mg/mL (orgânica) Potência redutora – CE50 =

1,87 mg/mL (mineral) e 2,05 mg/mL (orgânica)

Teles et al., 2014

56




publicação


Carvacrol (32,3%), p-cimeno (12,0%), β-mirceno (2,8%), β-

cariofileno (2,5%) e α-humuleno isopulegol

(1,4%)

Avalição da atividade inseticida do óleo

essencial isolado ou combinado com óleo

essencial de Lippia alba em larvas de

Aedes aegypti Rockefeller

Na maior concentração estudada (70 ppm), a

mortalidade das larvas de A. aegypti foi de 80 ±

13% após 24 horas (CL50 53,37 ppm) e 82 ±

13% após 48 horas (CL50 38,06 ppm). Na mistura com OE de

L. alba, a mortalidade foi de 70 ± 12% após 24

horas (CL50 40,13 ppm) e 70 ± 11% após 48

horas (CL50 37,55 ppm), numa concentração de

45 ppm.

Vera et al., 2014

Folhas e flores (óleo essencial)

COL519799 – Timol (59,6%) e ρ-cimeno

(8,4%) COL516290 – Timol (34,5%), Carvacrol

(25,8%), ρ-cimeno (9,3%)

e -terpineno (9,1%)

Atividade antigenotóxica frente a danos ao DNA

induzidos por bleomicina em cepas PQ37 de E. coli

Doses = 7,4 mg/mL (55% de inibição) e a partir de 118,7 mg/mL

(100% de inibição)

Vicuña, Stashenko, Fuentes, 2010

Planta completa (óleo essencial)

3 quimiotipos: trans--cariofileno (11,3%), p-

cimeno (11,2%); timol e carvacrol (46,2%)

Atividade citotóxica

CI50 = 9,1±1 µg/mL (células HeLa)

CI50 = 29,3 ± 4,8 µg/mL (células Vero)

Zapata et al., 2009

57

ABTS, ácido 2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6)-sulfônico; CC50, concentração citotóxica 50%; CE50, concentração efetiva que promove 50% do efeito

máximo; CI50, concentração inibitória que promove 50% do efeito máximo; CL99, concentração letal que promove 99% de mortes; CR, concentração

repelente; CR50, concentração repelente que promove 50% do efeito máximo; DL50, dose letal que promove 50% de mortes; DPPH, 2,2-difenil-1-picrilhidrazil;

CL50, concentração letal que promove 50% de mortes; CL90, concentração letal que promove 90% de mortes; MBC, concentração bactericida mínima; MFC,

concentração fungicida mínima; MIC, concentração inibitória mínima; TAA, atividade antioxidante total; TEAC, atividade antioxidante equivalente a Trolox.


58

É possível observar que os estudos referentes a L. origanoides são

concentrados sobre a atividade antimicrobiana, antifúngica, citotóxica, antioxidante,

repelente, antiviral e antiprotozoária. São poucos os dados referentes a estudos em

animais, com destaque para aqueles em que se utilizam modelos animais de

nocicepção, inflamação e hipertensão ou contratilidade vascular. Isso representa

uma maior possibilidade dos estudos envolvendo os aspectos etnofarmacológicos

no que tange, principalmente, a modelos experimentais de doenças do trato

respiratório.

Há de se observar que os estudos envolvem, em sua maioria, a utilização do

óleo essencial de L. origanoides em detrimento de outros produtos naturais.

Ressalta-se, no entanto, que os estudos desenvolvidos estão relacionados à

observação de atividade antimicrobiana, repelente, hipotensora, antioxidante,

genotóxica, toxicologia aguda e sub-aguda, citotóxica, antinociceptiva e

antiparasitária, ou seja, ainda são incipientes sobre os aspectos da farmacologia

gastrintestinal e respiratória, por exemplo, que tem ampla citação nos estudos

etnofarmacológicos.

59

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Investigar a atividade farmacológica do óleo essencial de Lippia origanoides

em modelos experimentais in vitro e in vivo visando a aplicação desse produto no

tratamento da asma.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar o possível efeito espasmolítico in vitro do óleo essencial de

L. origanoides em músculo liso de traqueia isolada de cobaia.

Investigar o provável mecanismo de ação pelo qual o óleo essencial de

L. origanoides esteja induzindo relaxamento.

Avaliar o efeito do óleo essencial de L. origanoidesem modelo de tosse

induzido por ácido cítrico em camundongos.

Avaliar o efeito do óleo essencial de L. origanoidessobre os modelos de

atividade motora em rota rod e campo aberto.

Aperfeiçoamento do método analítico para avaliação da atividade

expectorante a partir da análise do vermelho de fenol.

60

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 MATERIAIS

Os equipamentos e reagentes foram utilizados de acordo com os protocolos

experimentais propostos e podem ser observados na lista a seguir:

4-aminopiridina Sigma-Aldrich ® (St.Louis, Missouri, EUA)

Aminofilina Farmace® (Barbalha-CE, Brasil)

Amplificador modelo EFF-321A Insight® (Ribeirão Preto-SP, Brasil)

Aparelho de Campo aberto Insight® (Ribeirão Preto-SP, Brasil)

Aparelho de Rota Rod Insight® (Ribeirão Preto-SP, Brasil)

Atropina Sigma-Aldrich®(St.Louis, Missouri, EUA)

Azul de metileno Isofar® (Duque de Caxias-RJ, Brasil)

Balança analítica modelo ALC-210.4 Acculab®

Balança semi-analítica modelo B-17-BI Even®

Banho de órgãos modelo EFF-321 Insight® (Ribeirão Preto-SP, Brasil)

Banho Maria modelo NT236 Novatecnica®

Bicarbonato de sódio (NaHCO3) Isofar® (Rio de Janeiro-RJ, Brasil)

Carbacol Sigma-Aldrich ® (St. Louis, Missouri, EUA)

Cloreto de cálcio (CaCl2.2H2O) Isofar® (Rio de Janeiro-RJ, Brasil)

Cloreto de césio (CsCl) CRQ®

Cloreto de potássio (KCl) Dinâmica® (Diadema-SP, Brasil)

Cloreto de sódio (NaCl) 0,9% estéril Kabipac®

Cloreto de sódio (NaCl) Proquímios® (Rio de Janeiro-RJ, Brasil)

Computador HP Compaq Pro 6305 SFF®

Cremophor EL Fluka-Biochemika® (Alemanha)

Cuba de ultrassom Cristófoli® (Campo Mourão-PR, Brasil)

Dexametasona Riedel-de Haën® (Alemanha)

Espectrofotômetro modelo IL – 592 Even®

Fosfato de sódio (NaH2PO4.1H2O) Isofar® (Rio de Janeiro-RJ, Brasil)

61

Glibenclamida Sigma-Aldrich ®(St.Louis, Missouri, EUA)

Glicose (C6H12O6) Synth® (Diadema-SP, Brasil)

Hexametônio Sigma-Aldrich®(St.Louis, Missouri, EUA)

Hidróxido de sódio (NaOH) Proquímios® (Rio de Janeiro-RJ, Brasil)

Histamina Sigma-Aldrich®(St.Louis, Missouri, EUA)

Indometacina Sigma-Aldrich ®(St.Louis, Missouri, EUA)

Mistura Carbogênica White Martins®

Nω-nitro-L-arginina metil éster(St.Louis, Missouri, EUA)

Nitroprussiato de sódio NEON® (São Paulo –SP, Brasil)

pHmetro modelo PHS-30 Even®

Propranolol Sigma-Aldrich® (St. Louis, Missouri, EUA)

Softwares Windaq 32® (DATAQ Instruments, Inc., Akron, Ohio, EUA)

Sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) Proquímios® (Rio de Janeiro-RJ, Brasil)

Tetraetilamônio Sigma-Aldrich®(St.Louis, Missouri, EUA)

Transdutor de força isométrico modelo TRI201 Panlab®(Barcelona,

Espanha)

Vermelho de fenol Vetec ®

4.2 PROCESSAMENTO DO MATERIAL VEGETAL

A espécie Lippia origanoides foi coletada a partir do cultivo no Horto Florestal

da UEFS e fornecida por colaboradores da mesma instituição. O material vegetal foi

dessecado em estufa com ar circulante à temperatura média de 40o C até completa

estabilização, com posterior análise da umidade residual. Após a determinação da

umidade, as folhas e inflorescências foram utilizadas para a extração dos óleos

essenciais por hidrodestilação por arraste a vapor d’água, em aparelho tipo

Clevenger (durante 3 horas). O processamento para obtenção do produto natural foi

realizado pelos colaboradores do Laboratório de Química de Produtos Naturais e

Bioativos (LAPRON).

62

4.3 ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL

A análise da composição química do óleo essencial de L. origanoides (LOO) foi

realizada pela combinação de cromatografia gasosa acoplada a um detector de

ionização em chamas (CG/DIC) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria

de massas (CG/EM), ambas as análises foram realizadas em colaboração com

pesquisadores do LAPRON da UEFS.

4.4 ANIMAIS

Este trabalho foi submetido à Comissão de Ética no Uso de Animais da

Universidade Federal do Vale do São Francisco (CEUA-UNIVASF) e teve parecer

favorável sob o protocolo de nº 0006/021014 para o julgamento da utilização de

animais de laboratório nos modelos experimentais propostos. Foram utilizados os

seguintes animais nos modelos experimentais propostos: a) cobaias

(Cavia porcellus), de ambos os sexos com 300 a 500 g, para os ensaios de

avaliação atividade espasmolítica in vitro em músculo liso de traqueia; e b)

camundongos (Mus musculus) da linhagem Swiss, machos, com 4 a 8 semanas de

idade e peso variando de 30 a 50 g, no ensaio de atividade antitussígena,

expectorante e antiasmática. Todos os animais foram disponibilizados pelo Biotério

Central da UNIVASF, mantidos em caixas adequadas, com ciclo claro escuro de 12

horas e água e ração ad libitum, de acordo com cada procedimento experimental.

4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E MECANISMO DE AÇÃO EM

MÚSCULO LISO DE TRAQUEIA ISOLADA DE COBAIA

As cobaias (n = 5) foram eutanasiadas por deslocamento cervical, a traqueia

retirada e após limpeza de todo o tecido conjuntivo e adiposo, o órgão foi dividido

em segmentos contendo 4 a 5 anéis cartilaginosos, suspensos individualmente em

cubas de vidro com o auxílio hastes de aço inoxidável e conectadas a transdutores

de força através de linhas de algodão. Os tecidos foram deixados em repouso por 60

63

minutos, sob uma tensão de 1 gF a 37 ºC e aeração constante com mistura

carbogênica (95% O2 e 5% CO2), sendo a solução de Krebs substituída a cada 15

minutos. Após o período de estabilização uma contração foi induzida através da

adição de carbacol (CCh) ou histamina, na concentração de 1 µM, às cubas.

Durante o componente tônico da contração foi adicionado o LOO, individualmente,

de maneira cumulativa e em concentrações crescentes (1, 3, 9, 27, 81, 243 e

729 μg/mL).

4.5.1 Investigação da participação de canais para K+ no relaxamento induzido


A traqueia foi montada como descrito no item 4.5, sendo que 20 minutos

anteriormente à indução da segunda contração com histamina 1 µM, as preparações

foram expostas ao CsCl (inibidor não seletivo dos canais para K+), na concentração

de 5 mM (LATORRE et al., 1989); glibenclamida (inibidor do canal para K+ sensível

ao ATP (KATP)), na concentração de 3 µM (CUNHA et al., 2001); tetraetilamônio

(inibidor dos canais para K+ abertos pelo Ca2+ (KCa)) na concentração de 5 mM

(JANSSEN et al., 2001); e 4-aminopiridina (inibidor dos canais para K+operados por

voltagem (KV)), na concentração de 2 mM (LI et al., 1997). Após a estabilização da

segunda contração, durante a sua fase tônica, LOO foi adicionada às cubas, nas

diferentes preparações, de maneira cumulativa em concentrações crescentes (1 a

729 µg/mL), sendo os efeitos relaxantes registrados.

4.5.2 Investigação da participação de receptores β-adrenérgicos no

relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída com histamina



foram expostas ao propranolol (antagonistas β-adrenérgico), na concentração de

3 µM (SÁNCHEZ-MENDOZA et al., 2007). Após a estabilização da segunda

contração, durante a sua fase tônica, LOO foi adicionada às cubas, nas diferentes

64

preparações, de maneira cumulativa em concentrações crescentes (1 a 729 µg/mL),

sendo os efeitos relaxantes registrados.

4.5.3 Investigação da participação das prostaglandinas no relaxamento

induzido por LOO em traqueia pré-contraída com histamina



foram expostas a indometacina (inibidor não seletivo da ciclooxigenase), na

concentração de 10 µM e a dexametasona (corticosteroide), na concentração de

10 µM (SCHLEMPER et al., 2005). Após a estabilização da segunda contração,

durante a sua fase tônica, LOO foi adicionada às cubas, nas diferentes preparações,

de maneira cumulativa em concentrações crescentes (1 a 729 µg/mL), sendo os

efeitos relaxantes registrados.

4.5.4 Investigação da participação da via colinérgica no relaxamento induzido




foram expostas a atropina (antagonista muscarínico) na concentração de 1 µM

(TANAKA, GRUNSTEIN, 1986) e hexametônio (antagonista do receptor nicotínico

neuronal), na concentração 100 μM (CHÁVEZ et al., 2011). Após a estabilização da

segunda contração, durante a sua fase tônica, LOO foi adicionada às cubas, nas

diferentes preparações, de maneira cumulativa em concentrações crescentes (1 a

729 µg/mL), sendo os efeitos relaxantes registrados.

65

4.5.5 Investigação da participação da via do óxido nítrico (NO) no relaxamento




foram expostas a Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, inibidor da óxido nítrico

sintase), na concentração de 10 µM (ESTRADA-SOTO et al., 2012), azul de

metileno (inibidor da guanilil ciclase solúvel), na concentração de 25 μM (LIN; CHEN;

KO, 2007), e aminofilina (inibidor da fosfodiesterase) na concentração 1 µM (HIRSH

et al., 2004). Após a estabilização da segunda contração, durante a sua fase tônica,

LOO foi adicionada às cubas, nas diferentes preparações, de maneira cumulativa

em concentrações crescentes (1 a 729 µg/mL), sendo os efeitos relaxantes

registrados.

4.5.6 Investigação da participação da via da guanilil ciclase solúvel (GCs) no

relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída com CCh

Para investigar a via da GCs no relaxamento do músculo liso das vias aéreas,

a traqueia foi montada como descrito no item 4.5, e foi induzida uma contração com

CCh 1 µM. Após o componente tônico da contração as cubas eram lavadas durante

30 minutos para remoção do agonista e havia incubação de LOO, por 15 minutos,

nas concentrações de 9, 27 e 81 µg/mL. Passado esse tempo, foram adicionadas às

cubas aminofilina 0,3 µM (RODRÍGUEZ-RAMOS, GONZÁLEZ-ANDRADE,

NAVARRETE, 2011) por mais 15 minutos até a realização de uma nova contração

com CCh 1 µM que foi comparada a curva controle (primeira contração).

De modo semelhante os experimentos foram realizados com nitroprussiato de

sódio (SNP), um doador de NO, na concentração de 3 µM (HWANG, WU, TENG,

1999). Após a incubação do LOO por 15 minutos nas concentrações de 9, 27 e

81 µg/mL houve a adição de SNP (3 µM) às cubas. Passados mais 15 minutos uma

nova contração foi realizada CCh 1 µM para compração com a curva controle

(primeira contração).

66

Ainda nesse sentido, foram realizados experimentos com o azul de metileno

(AZM) na concentração de 25 µM e/ou SNP 3 µM. Após a incubação do LOO por 15

minutos na concentração de 81 µg/mL houve a adição de AZM (25 µM) isolado ou

em conjunto com SNP (3 µM) às cubas. Passados mais 15 minutos uma noca

contração foi realizada com CCh 1 µM para comparação com a curva controle

(primeira contração).

Para todos os experimentos, foram montadas traqueias que seriam controles

experimentais. As cubas foram submetidas a duas curvas concentração-resposta

sucessivas de CCh 1 µM e em uma das cubas hoube incubação apenas de

LOO 81 µg/mL para observação do seu efeito individual sob a inibição da contração.

4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUSSÍGENA EM CAMUNDONGOS

O modelo experimental para avaliação da atividade antitussígena foi

realizado com camundongos machos (n = 25), colocados em câmara de vidro

(volume aproximado de 500 mL) e expostos, individualmente, a aeração por

nebulização de ácido cítrico 0,4 M durante 3 minutos para observação da tosse. Os

animais foram separados por grupos (n = 5). A tosse em camundongos é

caracterizada por contração abdominal e distinta abertura da boca, sendo contadas

quantas vezes houve esse comportamento durante a exposição. No entanto, para

critério de inclusão os animais deveriam apresentar um número superior a 3 (três) e

inferior a 20 (vinte) tosses. Os animais que apresentaram 3 tosses ou menos, foram

considerados insensíveis, enquanto os que apresentaram 20 tosses ou mais, foram

considerados hiperresponsivos (KAMEI et al. 2011, 2013; TANAKA, MARUYAMA,

2005).

Passadas 23 horas e 30 minutos houve o tratamento com NaCl 0,9% (CN),

LOO nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg ou morfina 5 mg/kg (CP) por via

intraperitoneal (i.p.) para que ao serem completadas as 24 horas da primeira

exposição, os animais fossem submetidos a uma nova nebulização de solução de

ácido cítrico 0,4 M. Foram observados os parâmetros de latência (período, em

segundos, do início da exposição ao agente tussígeno até o aparecimento da 1ª

tosse) e a frequência de tosse (quantas vezes o animal apresentou o

67

comportamento tussígeno durante 3 minutos) (KAMEI et al. 2011, 2013). Ao final do

experimento os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical.

4.7 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA (TESTE DO ROTA-ROD)

O protocolo experimental foi semelhante ao proposto por Dunham & Miya

(1957), com algumas modificações. O qual utiliza o aparelho do rota-rod que é

constituído de uma barra, subdividida em quatro compartimentos, permitindo avaliar

se os tratamentos promovem alteração motora nos animais por sedação e/ou

relaxamento muscular (LAPA et al., 2003).

Os animais foram pré-selecionados 24 horas antes do estabelecimento do

teste, sendo escolhidos aqueles que permaneceram na barra por 60 segundos em

pelo menos uma de três tentativas (ALMEIDA et al., 2006). Camundongos foram

divididos em grupos contendo 5 animais, sendo tratados por via i.p. com NaCl 0,9%

(CN), diazepam 2,5 mg/kg (CP) ou LOO nas doses de 30, 100 ou 300 mg/kg, Após

30 minutos da administração, os animais foram colocados individualmente na barra

giratória (sentido contrário ao movimento da barra) e houve o registro do tempo de

permanência do animal por 3 minutos (SANTOS-JUNIOR et al., 2005). Os animais

foram observados nos intervalos de tempo 30, 60 e 120 minutos após otratamento.

Além disso, os animais que receberam da maior dose do de LOO (300 mg/kg) foram

avaliados nos tempos de 240 e 480 minutos após a administração para avaliar a

relação tempo-resposta.

4.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MOTORA ANSIOLÍTICA ATRAVÉS DO MÉTODO

DE CAMPO ABERTO

O protocolo experimental fornece dados importantes sobre a atividade

locomotora e ansiolítica animal. Utiliza-se do aparelho de campo aberto para análise

comportamental dos animais colocados no centro do equipamento. Quando o animal

está na posição central do campo aberto é iniciada uma observação por cinco

minutos para análise dos seguintes parâmetros: locomoção horizontal (número de

cruzamentos com as quatro patas, entre as divisões do campo), o número de

68

comportamentos de auto-limpeza (grooming), de levantar (rearing), defecação

(número de bolos fecais), imobilidade (freezing) (CARLINI; MENDES, 2011).

Os camundongos foram divididos em 5 grupos (n = 5) tratados com solução

NaCl 0,9% (CN), LOO nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg e diazepam 2,5 mg/kg

(CP), via i.p. Aguardados 30 minutos após a administração, os animais foram

colocados individualmente na arena e os mesmos parâmetros foram observados

durante 5 minutos. Após a avaliação de cada animal, o aparelho foi limpo com álcool

a 5% (CARLINI; MENDES, 2011). Ao final do protocolo experimental todos os

animais foram eutanasiados por deslocamento cervical.

4.9 APERFEIÇOAMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA AVALIAÇÃO DA

ATIVIDADE EXPECTORANTE A PARTIR DA QUANTIFICAÇÃO DO MARCADOR

VERMELHO DE FENOL

A metodologia para avaliação de expectoração é variável na literatura,

principalmente no que diz respeito ao agente baseificante utilizado, o comprimento

de onda para análise, concentração do vermelho de fenol, dose asministrada, dentre

outros. Além disso, o procotolo se baseia na utilização do vermelho de fenol em

suspensão 30 minutos após administração de um fármaco padrão que tem efeito

expectorante comprovado. A partir da eutanaisa dos animais, após 30 minutos da

administração do vermelho de fenol, a traqueia dos animais são removidos por

técnica cirúrgica ou do lavado broncoalveolar (LBA) é recuperado para que seja

analisada a concentração do vermelho de fenol secretado.

A otimização da metodologia analítica em quantificar o vermelho de fenol

(C19H14O5S) no LBA para a avaliação da atividade expectorante, foram observadas a

influência do pH na quantificação de vermelho de fenol por espectrometria de

absorção no UV-VIS, a quantidade do agente basificante no preparo da amostra, o

comprimento de onda adequado para avaliação e a taxa de recuperação do

vermelho de fenol no LBA.

As determinações quantitativas foram realizadas em espectrofotômetro de

UV-Vis, utilizando-se cubetas de vidro com 1 cm de caminho óptico.

A utilização deste indicador para avaliação da atividade expectorante de

novos protótipos a fármacos expectorantes vem sendo descrita há algum tempo

69

desde Engler e Szelenyl (1984). No entanto, os estudos anteriores não detalham

esta metodologia analítica em fluidos biológicos, como o lavado broncoalveolar.

Para o aperfeiçoamento do protocolo de avaliação da atividade expectorante

em camundongos, foram utilizados os modelos propostos na literatura por Alves et

al. (2014), Engler e Szelenyl (1984), Gong et al. (2015), Lin et al. (2008), Liu, Wang,

Liu (2009) e Schickaneder, Engler, Szelenyl (1987), além de outras referências

expostas no Tabela 3.

4.9.1 Influência do pH na quantificação de vermelho de fenol em LBA

Para quantificação de vermelho de fenol de forma seletiva no LBA é

necessário a mudança de pH do meio. Sendo assim, foi realizada a basificação da

amostra de LBA com NaHCO3 e com NaOH a fim de verificar a influência de

absortividade e deslocamento batocrômico.

4.9.2 Perfil de absorção no UV do vermelho de fenol no LBA

Devido a discrepância dos comprimentos de onda relatados para

determinação de vermelho de fenol, como demonstrado no Tabela 3, avaliou-se a

absortividade do mesmo ao ser adicionado a LBA de camundongos, em

concentrações conhecidas, variando-se o comprimento de onda de 400 a 600 nm,

utilizando-se como solução de compensação apenas solução salina e sendo a

absorbância registrada de 5 em 5 nm.

70

Tabela 3. Informações sobre o protocolo de atividade expectorante disponível na

literatura.

Comprimento de

onda (nm)

Agente

basificante

Concentração do

vermelho de fenol Referência

535 NaOH 1% Alves et al., 2014

546 NaHCO3 5% Chakraborty et al.

2013

546 NaOH 5% Chand et al., 1993

558 NaHCO3 5% Dapaah et al., 2016

546 NaOH 5% Engler, Szelenyi,

1984

546 NaOH 1% Fernandez et al.,

2009

558 NaHCO3 5% Ge et al., 2015

558 NaHCO3 5% Ge, Liu, Su, 2009

570 NaOH 2,5% Guo et al., 2009

546 NaHCO3 5% Han et al., 2010

558 NaHCO3 - Jiang et al., 2014

558 NaHCO3 5% Koffuour et al. 2014

546 NaOH 5% Liu et al., 2015

546 NaOH 5% Liu, Wang, Liu, 2009

546 NaOH 5% Shang et al., 2010

546 NaOH 2,5% Song et al., 2015

558,5 NaHCO3 5% Wang et al., 2012

550 NaOH - Wong et al.,2015

546 NaHCO3 2,5% Yu et al., 2015

558 NaOH 5% Zhang et al., 2009

557 NaHCO3 5% Zhou et al., 2013

(-) representam os dados não informados nos estudos.


71

4.9.3 Validação da metodologia analítica

Na literatura a análise variava a partir do comprimento de onda utilizado por

cada pesquisador, sem análise do perfil de absorbância do vermelho de fenol.

Portanto, após verificação dos possíveis interferentes na quantificação precisa e

exata do vermelho de fenol em amostras de LBA, a metodologia definida consiste

em utilizar 500µL de LBA após centrifugação (2500 RPM por 10 min), adicionar 50

µL de solução de NaOH (0,001 M) e determinar absorbância em 565 nm em

espectrofotômetro utilizando cubetas de vidro.

Para a validação desse método analítico foram avaliados parâmetros quanto

à seletividade, linearidade, precisão (repetitividade), limites de detecção (LD), limite

de quantificação (LQ) e exatidão, tendo como finalidade atestar a eficiência do

método. Todas as análises foram realizadas em triplicata e a confiabilidade dos

parâmetros foi verificado pelo desvio padrão relativo (DPR%) (ANVISA, 2003).

A seletividade do método analítico foi demonstrada com a sobreposição dos

espectros de absorção obtidos com vermelho de fenol diluído em NaCl 0,9%, o LBA,

e da amostra de LBA com adição de vermelho de fenol ambos na concentração de

20 µg/mL, obtidos pela varredura na faixa de 400 a 600 nm.

A linearidade foi avaliada a partir da média das análises de três curvas, com

sete níveis de concentração (0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 µg/mL). As curvas foram obtidas

a partir das médias das absorbâncias em função da concentração. Os resultados

foram tratados estatisticamente através do cálculo de regressão linear, com o

objetivo de determinar a equação da reta e o coeficiente de determinação (r²), sendo

o valor mínimo aceitável r2> 0,99.

O LD e LQ foram calculados (em µg/mL) a partir das curvas, de acordo com

as equações, onde DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo Y, obtido da

média das três curvas de linearidade e IC é a inclinação da reta das respectivas

curvas de calibração. O LD e LQ podem ser calculados pelas Equações (1 e 2)

abaixo:

LD= DPa x 3 / IC (1)

LQ= DPa x 10 / IC (2)

72

A exatidão foi avaliada através da taxa de recuperação, a partir da adição de

uma quantidade conhecida de vermelho de fenol ao LBA de animais saudáveis sem

tratamento prévio. Foi adicionado 400 µL de LBA, 100 µL da solução de vermelho de

fenol (20 µg/mL) e 50 µL de NaOH (0,001 M) em cada cubeta em triplicata, enquanto

que na repetitividade foi avaliada a concordância dos resultados de quantificação da

concentração média de 1 µg/mL em sextuplicata tendo o desvio padrão relativo entre

as amostras determinado (ANVISA, 2003; ICH, 2005).

4.9.4 Determinação da solubilidade do vermelho de fenol em salina e LBA

Foi obtida a solução saturada do vermelho de fenol em 1 L de solução salina

a 25°C em triplicata, sendo esta quantificada a partir da metodologia analítica

desenvolvida.

4.9.5 Desenvolvimento de suspensão de vermelho de fenol estável

Para o desenvolvimento de uma suspensão extemporânea estável foram

testadas as concentraçõesde 1,25%, 2,5% e 5% dispersas em solução salina, além

de avaliadas quanto a altura do sedimento formado e, in vivo, na aplicação

intraperitoneal na avaliação da atividade expectorante descrita no item 4.7.6.

4.9.6 Aplicação da metodologia analítica para avaliação de atividade

expectorante em camundongos

Foram utilizados camundongos (Mus musculus) da linhagem Swiss, com 4 a 8

semanas de idade e peso variando de 30 a 50 g. Os animais (n = 5) foram tratados

com o cloreto de amônio (NH4Cl, controle positivo) na dose de 1.500 mg/kg (LIU et

al., 2015), por via oral, e após 30 minutos foi administrada solução salina (controle

negativo) ou suspensão da vermelho de fenol nas doses de 5, 25, 50, 250 ou

500 mg/kg, via i.p. Devido a baixa solubilidade do vermelho de fenol em solução

salina, avaliou-sea concentração da suspensão do indicador (1,25%, 2,5% ou 5%

73

em solução salina) que se obteve o volume a ser administrado. Com essa avaliação,

foi selecionadaa dose e a concentração da suspensão de vermelho de fenol

administrada mais eficaz para a aplicação no modelo experimental de atividade

expectorante.

4.10 ANÁLISE DOS DADOS

Os dados numéricos obtidos foram expressos como média ± erro padrão da

média (X ± e.p.m) ou média e intervalo de confiança (95%) e n representou o

número de animais utilizados ou experimentos realizados em um dado protocolo. Os

dados obtidos dos registros dos experimentos em traqueia isolada de cobaia foram

plotados em curvas concentração-resposta e estas ajustadas por regressão

não-linear no software Graphpad Prism 6 (GraphPad Software Inc.), para obtenção

do valor de CE50 (concentração do extrato ou fração em que é capaz de causar 50%

de seu efeito máximo) servindo como parâmetro de potência relativa de uma

amostra, e o Emáx (valor médio, em percentagem, do efeito máximo obtido pelo

extrato ou fração em relação ao maior valor possível num dado tecido) servindo

como parâmetro de eficácia relativa de duas amostras.

Diferenças entre as médias foram comparadas estatisticamente usando o teste

t de Student não-pareado, análise de variância uma via (ANOVA one-way) com

pós-teste de Tukey ou análise de variância duas vias (ANOVA two-way) com

medidas repetidas, seguido de pós-teste de Sidak, usando o Graphpad Prism 6,

sendo as diferenças consideradas significantes quando o valor calculado de p foi

menor que 0,05 (* p< 0,05).

Para o aperfeiçoamento do método expectorante, os softwares utilizados para

análise estatísticas dos resultados do desenvolvimento e validação da metodologia

analítica foram Microsoft Excel® e OriginPro 8® e os dados foram apresentados

comomédia ± desvio padrão (X ± SD), sendo todas as determinações realizadas em

triplicata. A análise estatística dos dados foi realizada por ANOVA one-way,

considerando significativamente diferentes quando p < 0,05.

74

5 RESULTADOS

5.1 ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL

O óleo essencial extraído de L. origanoides (LOO) foi caracterizado por

CG-EM para detecção dos metabólitos e determinação quali-quantitativa da sua

composição, como mostrado na Tabela 4.

Tabela 4. Composição do óleo essencial de L. origanoides por CG-EM.

Composição KIlit KIcalc % ± DP

-tujeno 930 930 0,16±0,03

-pineno 939 938 Traço

Canfeno 954 954 0,14±0,03 Mirceno 990 992 0,51±0,14

-terpineno 1020 1019 0,46±0,12

p-cimeno 1026 1028 4,03±1,03 Limoneno 1029 1032 0,15±0,02

γ-terpineno 1064 1063 3,50±0,95 linalool 1196 1100 5,84±2,15 Canfora 1146 1148 1,69±0,57 Borneol 1169 1169 0,82±0,23

terpinen-4-ol 1177 1180 0,63±0,05 Timol metil eter 1235 1238 2,87±0,15

Timol 1290 1296 4,00±0,04 Carvacrol 1299 1311 53,89±0,70

Acetato de carvacrol 1372 1376 0,26±0,05 E- cariofileno 1419 1423 5,86±0,57

α-bergamoteno 1434 1438 0,28±0,02 Aromadendreno 1441 1442 1,13±0,10

α-humuleno 1454 1457 1,80±0,18 Biciclogermacreno 1500 1500 4,16±0,22

7-epi--selineno 1522 1521 0,43±0,05

Spatulenol 1578 1581 1,59±0,53 Óxido de cariofileno 1583 1586 0,73±0,43

Viridiflorol 1592 1594 0,18±0,04 Monoterpenos 78,95

Sesquiterpenos 16,16 Total identificados 95,11

KIlit = índice de Kovats da literatura; KIcalc = índice de Kovats calculado; DP = desvio padrão. Fonte:

próprio autor.

75

A partir dos dados de Índice de Kovats que indica a retenção experimental

dos componentes do óleo essencial, foi possível identificar o monoterpeno carvacrol

como componente majoritário, representando 53,89 ± 0,7 % da amostra, seguido do

sesquiterpeno E-cariofileno com 5,86 ± 0,57% e linalool com 5,84±2,15%, estando

os demais constituintes com um percentual abaixo de 5% na composição do óleo

essencial. Esses compostos se apresentam como potenciais marcadores sobre os

possíveis efeitos do LOO em modelos farmacológicos.

5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E MECANISMO DE AÇÃO EM

MÚSCULO LISO DE TRAQUEIA ISOLADA DE COBAIA

O LOO foi utilizado para avaliar seu potencial efeito espasmolítico em traqueia

isolada de cobaia, a partir de contrações induzidas por carbacol ou histamina (1 µM),

dois agonistas que atuam, principalmente, nos receptores muscarínicos (M3) e

histamínicos (H1). Após estímulo contrátil foi realizada adição de LOO a cuba em

concentrações cumulativas (1 a 729 µg/mL) para observar o efeito relaxante do óleo

essencial frente a esses agonistas. Com isso, na Figura 3 tem-se que o efeito de

LOO sob essas contrações apresentaram efeito máximo (Emáx) igual a 100%, ou

seja, promoveram um relaxamento total da traqueia isolada de cobaia, com

diferença na concentração de LOO responsável por esse efeito. Nas contrações

induzidas por histamina o LOO na concentração de 27 µg/mL, enquanto nas

contrações induzidas por carbacol o LOO foi utilizado na concentração de

243 µg/mL, refletindo também na potência relativa do LOO frente a esses agonistas.

Os dados também foram expressos em potência relativa (CE50) do óleo, o que

demonstra uma maior potencia de LOO em relaxar a traqueia isolada de cobaias a

partir de contrações induzidas por histamina com CE50 = 9,92 (7,52-11,57) μg/mL

quando comparado a carbacol com CE50 = 52,21 (46,03-59,42) µg/mL. Os valores da

CE50 de LOO em contrações induzidas por histamina foram cerca de 6 vezes

menores do que as induzidas por carbacol, sendo estatisticamente diferentes, a

partir da análise estatística (teste-t), com o valor de p< 0,05.

76

Figura 3. Efeito relaxante de LOO em músculo liso traqueal em contrações

induzidas por histamina ou carbacol.

A, representa o gráfico concentração-resposta de LOO em contrações induzidas por histamina () e

carbacol (☐), com representação do efeito máximo obtido por LOO nessas condições. B,

representação dos valores de CE50 de LOO sobre contrações induzidas por histamina e carbacol.

n = 5; * p < 0,05 (teste t-student não pareado: histamina vs carbacol). Dados expressos em média e

intervalo de confiança (95%).

Fonte: próprio autor.

Então, a partir da observação da ausência de relatatos para o óleo essencial

de L. origanoides sobre o relaxamento da musculatura lisa, utilizou-se de

ferramentas farmacológicas para entender o mecanismo de ação pelo qual LOO

promove relaxamento na musculatura lisa traqueal. Com base nisso, buscou-se

identificar se o LOO estaria agindo como: 1) ativador de canais para potássio;

2) agonista β-adrenérgico; 3) modulador da produção de prostanoides e

leucotrienos; 4) através da participação na via colinérgica; 5) influência na via do

NO/GMPc ou AMPc; ou 6) influência da via da GCs/PKG.

77

5.2.1 Investigação da participação de canais para K+ no relaxamento induzido


A priori, os resultados foram obtidos a partir do bloqueio dos canais para

potássio (K+), evidenciados na Figura 4, os quais permitem inferir que existe uma

interferência de LOO em alguns desses alvos.


induzidas por histamina na presença ou ausência de bloqueadores de canais para

potássio (K+).

A, B, C e D, representam gráficos de concentração-resposta de LOO, na ausência e presença de

bloqueadores de canais para K+. A, na presença de 4-aminopiridina (4-AP) na concentração de 2

mM. B, na presença de Glibenclamida (GLI) na concentração de 3 µM. C, na presença de Cloreto de

césio (CsCl) na concentração de 5 mM. D, na presença de Tetraetilamônio (TEA) na concentração de

78

3 mM. n = 5; * p < 0,05 (teste t-student não pareado: controle vs presença dos bloqueadores). Dados

expressos em média ± E.P.M.


Na presença de GLIB e CsCl as CE50 de LOO ficaram por volta de

5,64 ± 2,11 µg/mL e 11,10 ± 4,92 µg/mL, respectivamente, não apresentando

diferença significante. Já na presença de 4-AP e TEA houve uma redução na

potênca do LOO, apresentando valores na CE50 de 20,12 ± 3,53 e

20,18 ± 2,99 µg/mL, respectivamente, o que conferiu diferença significante (p < 0,05;

teste t-student) quando comparado ao controle que apresentou CE50 = 9,92 (7,52-

11,57) μg/mL, indicando que a via dos canais para K+ operados por voltagem e por

Ca2+ (Kv e KCa, respectivamente) podem influenciar no efeito de LOO sobre a

musculatura lisa traqueal.

5.5.2 Investigação da participação de receptores β-adrenérgicos e das

prostaglandinas no relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída

com histamina

Por ter relaxamento influenciados pela via do AMPc/PKA e pelos

prostanóides, investigou-se a influência de LOO no relaxamento da musculatura lisa

das vias aéreas, a partir do bloqueio da trandução de sinal desses alvos. Como

podem ser observadas na Figura 5, algumas dessas vias influenciararam na

atividade relaxante do óleo essencial em traqueia isolada de cobaia.

O valor da CE50 de LOO na presença de propranolol (PROP) foi de

6,56 ± 1,82 µg/mL, mostrando que, provavelmente, não influencia nessa via, pois

não apresentou alteração na CE50 que proporcionasse diferença significante.

Na presença de indometacina (IND) a CE50 foi de 7,45 ± 2,13 µg/mL, não

apresentando diferença significante quando comparado a CE50 de LOO na ausência

desse bloqueador. A partir desses dados, pode-se sugerir que não há influência da

via dos prostanoides no mecanismo relaxante de LOO em músculo liso traqueal.

Porém, quando houve pré-incubação de dexametasona (DEX), houve uma redução

da CE50 de LOO em contrações induzidas por histamina. Na presença de DEX, o

79

óleo essencial se apresentou com maior potência, com valores de CE50 na ordem de

2,59 ± 0,60 µg/mL, conferindo diferença significante (p < 0,05; teste t-student).


induzidas por histamina na presença e ausência de bloqueador β-adrenérgico e

inibidores da via dos eicosanóides.

A, B e C, representam gráficos de concentração-resposta de LOO, na ausência e presença dos

bloqueadores. A, na presença de propranolol (PROP) na concentração de 3 μM. B, na presença de

indometacina (IND) na concentração de 10 μM. C, na presença de dexametasona (DEX) na

concentração de 10 µM. n = 5; * p < 0,05 (teste t-student não pareado: controle vs presença dos

bloqueadores). Dados expressos em média ± E.P.M.


80

5.5.3 Investigação da participação da via colinérgica no relaxamento induzido


A partir da observação do efeito relaxante de LOO sobre o músculo liso

traqueal, buscou-se analisar a influência ganglionar e muscarínica na atividade

relaxante do óleo essencial. Então foi utilizada atropina (ATR) e hexametônio (HEX)

para observar de que forma LOO promoveria seu efeito relaxante nas vias aéreas,

como mostra na Figura 6.

Os dados mostraram que LOO na presença de HEX apresentou uma

CE50 = 11,54 ± 2,88 µg/mL semelhante aos valores na ausência desse bloqueador,

não conferindo diferença significante. Por outro lado, o LOO na presença de ATR

apresentou-se com maior potência (CE50 = 3,95 ± 1,45 µg/mL) quando comparado o

efeito do óleo essencial na ausência desse bloqueador, o que representou uma

diferença significante (p<0,05; teste t-student).


induzidas por histamina na presença e ausência de bloqueador ganglionar e

muscarínicos.

A e B, representam gráficos de concentração-resposta de LOO, na ausência e presença dos

bloqueadores. A, na presença de hexametônio (HEX) na concentração de 10 μM. B, na presença de

atropina (ATR) na concentração de 1 μM. n = 5; * p < 0,05 (teste t-student não pareado: controle vs

presença dos bloqueadores). Dados expressos em média ± E.P.M.


81

5.5.4 Investigação da participação da via do óxido nítrico (NO) no relaxamento


A análise das informações obtidas na literatura e na tentativa de desvendar o

mecanismo de ação de LOO foi necessária à utilização de bloqueadores que

estivessem envolvidos na via do óxido nítrico (NO) e na via que aumenta a

concentração de nucleotídeos cíclicos no meio citosólico da musculatura lisa. Para

tanto, utilizou-se a aminofilina (AMN), L-NAME e azul de metileno (AZM), como

bloqueadores, como mostrado na Figura 7.


induzidas por histamina na presença e ausência de bloqueadores da via do

NO/GCs/GMPc.

A, B e C, representam gráficos de concentração-resposta de LOO, na ausência e presença dos

bloqueadores. A, na presença de aminofilina (AMN) na concentração de 1 µM. B, na presença de

82

Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) na concentração de 10 μM. C, na presença de azul de

metileno (AZM) na concentração de 25 μM. n = 5; * p < 0,05 (teste t-student não pareado: controle vs

presença dos bloqueadores). Dados expressos em média ± E.P.M.


Na presença de AMN a CE50 (8,71 ± 0,88 µg/mL) apresentada por LOO não

diferiu significantemente do valor obtido na sua ausência. Quando houve incubação

de L-NAME a CE50 (5,83 ± 1,83 µg/mL) também não proporcionou diferença

significante. No entanto, foi evidenciado que na presença de AZM, inibidor da guanilil

ciclase solúvel (GCs), a CE50 de LOO foi de 16,58 ± 1,85 µg/mL, apresentando

diferença significante, comparado a CE50 do óleo na ausência de bloqueadores

(p <0,05; teste t-student), sugerindo que pode existir uma contribuição da via do

NO/GCs no mecanismo de ação espasmolítica do óleo essencial.

Diante dos dados apresentados, pode-se observar na Figura 8, a

comparação entre a CE50 de LOO na ausência ou presença dos bloqueadores,

indicando que o óleo essencial de L. origanoides possui componentes que atuam

como relaxante do músculo liso das vias aéreas por diversas vias de transdução de

sinal.

Figura 8. Valores de CE50 de LOO na ausência e presença dos bloqueadores.

Valores de CE50 de LOO na ausência e presença de bloqueadores. LOO = óleo essencial de L.

origanoides; 4-AP = 4-aminopiridina; GLI = Glibenclamida; CsCl = Cloreto de césio; TEA =

83

Tetraetilamônio; ATR = Atropina, PROP = Propranolo; IND = Indometacina; DEX = Dexametasona; L-

NAME = Nω-nitro-L-arginina metil éster; AZM = Azul de metileno; AMN = Aminofilina; HEX =

Hexametônio. n = 5; * p < 0,05 (teste t-student não pareado: controle vs presença dos bloqueadores).

Dados expressos em média ± E.P.M.


5.5.5 Investigação da participação da via da guanilil ciclase solúvel (GCs) no

relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída com CCh

Para confirmar a importância da via GCs/GMPc/PKG sobre oefeito relaxante

de LOO no músculo liso traqueal, foram realizados experimentos envolvendo a

incubação de LOO nas concentrações de 9, 27 e 81 µg/mL, AMN na concentração

de 0,3 µM, nitroprussiato de sódio (NPS) na concentração de 3 µM e AZM na

concentração de 25 µM. Além disso, foi realizado o estudo com a incubação da

mistura desses bloqueadores e o LOO sobre contrações induzidas por CCh 1 µM.

Como mostrado na Figura 9, contrações sucessivas induzidas por CCh 1 µM

apresentaram uma resposta contrátil de 110,1 ± 9,85%. Quando havia a presença de

AMN 0,3 µM, as contrações obtiveram resposta de 115,9 ± 13,28%, não

proporcionando diferença significante. Na pré-incubação de AMN 0,3 µM em

conjunto com LOO nas concentrações de 9, 27 ou 81 µg/mL, pode-se perceber uma

redução na resposta contrátil, 96,83 ± 7,507% (LOO 9 µg/mL), 97,71 ± 9,904%

(LOO 27 µg/mL) e 47,44 ± 11,57% (LOO 81 µg/mL), sendo que nessa última

condição houve diferença significante (p < 0,05). No entanto esse valor não diferiu

daqueles em que o LOO 81 µg/mL foi incubado individualmente (61,92 ± 3,864%) e

testado frente à contração com CCh 1 µM. Essas informações confirmam que LOO

não atua na via da fosfodiesterase (Figura 7), no entanto, proporcionam um

aumento na inibição da contração em comparação a aminofilina na ordem de 15%

(LOO 81 µg/mL ≈ 60% e LOO 81 µg/mL com AMN 0,3 µM ≈ 45% de contração).

84

Figura 9. Análise da contração por CCh na ausência e presença de LOO e/ou

aminofilina.

Percentual de contração de CCh 1 µM na presença ou ausência de bloqueadores. AMN = aminofilina

(0,3 µM); LOO = óleo essencial de L. origanoides; H2O = água destilada. n = 5; * p < 0,05 (ANOVA

one-way com pós-teste de Tukey: AMN+H2O vs AMN+LOO 9, 27 ou 81 µg/mL ou LOO 81 µg/mL).



Essas informações permitem inferir que LOO não atua sobre a

fosfodiesterase, pois haveria um efeito aditivo ou potencializador na inibição da

contração na presença de AMN em conjunto com LOO 81 µg/mL, haja vista que o

inibidor de PDE isolado não garantiu uma proteção frente à ação do carbacol. Além

disso, provavelmente não há uma ativação direta de PKG, pois haveria uma

potencialização de sua atividade catalítica por aumento na concentração de GMPc

nas células musculares lisas das vias aéreas.

Como a inibição da fosfodiesterase não potencializou o efeito de LOO,

utilizou-se de ferramentas farmacológicas que ajudassem a identificar a importância

de outros componentes da via NO/GMPc/PKG. Para tanto, empregou-se na

metodologia o nitroprussiato de sódio (NPS) na concentração de 3 µM, como doador

de NO, com o objetivo de observar potencialização da via de transdução de sinal e

relaxante do músculo liso traqueal. Então, como exposto na Figura 10A, pode-se

perceber que a atividade do CCh 1 µM, na presença de NPS, mostrou

126,3 ± 14,7% de contração, não sendo observada diferença significante quando

havia incubação comcomitante com LOO 9 µg/mL (127,2 ± 8,358%) e

LOO 27 µg/mL (89,25 ± 7,915%). Porém quando houve a incubação de

LOO 81 µg/mL o nível de resposta contrátil foi de 23,68 ± 7,963%, apresentando

% C

on

tra

çã

o

0

5 0

1 0 0

1 5 0

A M N + C C h

L O O 9 g /m L + A M N + C C h

L O O 2 7 g /m L + A M N + C C h

L O O 8 1 g /m L + A M N + C C h

L O O 8 1 g /m L + C C h

**

C C h

85

diferença significante (p < 0,05). Além disso, observou-se que LOO 81 µg/mL

potencializou o efeito NPS de quando comparado com LOO 81 µg/mL pré-incubado

na ausência de NPS (teste t, p<0,05), indicando influência sobre a GCs,

corroborando com os dados obtidos com adição de LOO cumulativamente na

presença de azul de metileno em contrações induzidas por histamina.

No sentido de confirmar a participação da GCs para o mecanismo de

relaxamento do LOO sobre musculatura lisa traqueal, adicionais protocolos foram

realizados com LOO 81 µg/mL na presença ou ausência de AZM 25 µM e

NPS 3 µM. Foi observado, como consta na Figura 10B, que na presença de água

destilada, NPS ou AZM com NPS, não houve diferença significante em relação a

repsota contrátil obtida pelo carbacol. Quando houve incubação de LOO 81 µg/mL,

foi apresentada uma contração de 61,92 ± 3,864%, a qual se apresentou diferente

de forma significativa (p<0,05; teste t), daquelas obtidas na presença de

LOO 81 µg/mL e NPS (23,68 ± 7,963%); ou o conjunto formado pela incubação de

LOO 81 µg/mL, AZM e NPS (26,62 ± 10,3%). O efeito potencializador, de forma

significante (p < 0,05), demonstra que a via do NO/GCs/GMPc/PKG pode estar

envolvida no mecanismo relaxante da traquea isolada de cobaia.

86

Figura 10. Análise da contração por CCh na ausência e presença de LOO,

nitroprussiato de sódio e/ou azul de metileno.

Percentual de contração de CCh 1 µM na presença ou ausência de ferramentas farmacológicas. NPS

= nitroprussiato de sódio (3 µM); LOO = óleo essencial de L. origanoides; H2O = água destilada; AZM

= azul de metileno. n = 5, *p < 0,05 (ANOVA one-way com pós-teste de Tukey: NPS+H2O vs

NPS+LOO 9, 27 ou 81 µg/mL ou LOO 81 µg/mL), #p < 0,05 (ANOVA one-way com pós-teste de

Tukey: LOO 81 µg/mL vs NPS + LOO 81 µg/mL ou LOO 81 µg/mL vs AZM + NPS + LOO 81 µg/mL ).



5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUSSÍGENA EM CAMUNDONGOS

Um fármaco ou produto natural para ser considerado antiasmático, deve

controlar diversos parâmetros como modular a expectoração, reduzir o tônus

bronquial, regular a tosse, ter efeito anti-inflamatório, dentre outras atividades. Logo,

% C

on

tra

çã

o

0

5 0

1 0 0

1 5 0

L O O 9 g /m L + N P S + C C h

N P S + C C h

L O O 2 7 g /m L + N P S + C C h

L O O 8 1 g /m L + N P S + C C h

L O O 8 1 g /m L + C C h*

#

*

C C h

A

% C

on

tra

çã

o

0

5 0

1 0 0

1 5 0

C C h

H 2 O + A Z M + N P S + C C h

L O O 8 1 g /m L + A Z M + N P S + C C h

L O O 8 1 g /m L + N P S + C C h

H 2 O + N P S + C C h

L O O 8 1 g /m L + C C h

*

* *##

B

87

o controle da tosse se faz importante, pois é um dos sintomas que agridem o

paciente asmático. Para uma observação mais completa sobre a ação de LOO, foi

conduzida observaçãodo efeito antitussígenoem um modelo experimental de tosse,

em camundongos.

Os animais separados por grupo (n = 5) e ainda sem tratamentoforam

expostos à nebulização de ácido cítrico 0,4 M, diluída em solução salina, por 3

minutos em câmara de vidro e apresentaram média de tosse de 10,8 ± 0,663 (CN –

NaCl 0,9%); 7,8 ± 2,154 (LOO 30mg/kg); 8 ± 1,517 (LOO 100 mg/kg); 7,4 ± 0,979

(LOO 300 mg/kg); e 6,6 ± 1,077 (CP – morfina 5 mg/kg). Passadas 23 horas e 30

minutos a primeira exposição, os animais foram tratados nos respectivos grupos, por

via IP, e após 30 minutos, ou seja, 24 horas após a primeira exposição, os animais

foram submetidos novamente à solução de ácido cítrico 0,4 M em câmara de vidro.

Após o tratamento com os testes e os controles (CN e CP) os animais

apresentaram as seguintes médias do número de tosse 8,2 ± 1,158 (CN); 7,5 ± 2,25

(LOO 30 mg/kg); 3,2 ± 0,663 (LOO 100 mg/kg); e 1 ± 0,632 (LOO 300 mg/kg); e

3 ± 0,707 (CP), mostrando uma redução na frequência de tosses em todos os

grupos, no entanto houve diferença significativa (p<0,05; teste t) para CP, LOO100 e

300 mg/kg, quando comparados ao CN.

Na observação da latência, ou seja, o tempo (em segundos) para se notar o

reflexo de tosse nos camundongos, após nebulização de ácido cítrico 0,4 M, diluída

em solução salina, por 3 minutos em câmara de vidro, os animais sem tratamento

apresentaram media de latência de 11 ± 1,817 (CN); 17,60 ± 4,179 (LOO 30 mg/kg);

10,80 ± 1,158 (LOO 100 mg/kg); 21,8 ± 6,515 (LOO 300 mg/kg); e

19,20 ± 5,704 (CP). De modo semelhante à frequência de tosse, observou-se uma

mudança no tempo de latência quando houve o tratamento e exposição 24 horas

após a primeira nebulização com ácido cítrico 0,4 M, apresentando média de

latência de 12,4 ± 2,315 (CN); 15,5 ± 3,862 (LOO 30 mg/kg); 12 ± 1,265 (LOO 100

mg/kg); 123 ± 34,91 (LOO 300 mg/kg); e 16,40±2,249 (CP), demonstrando que

houve diferença significativa entre o LOO300mg/kg em comparação ao CN (p<0,05;

teste t), Figura 11.

88

Figura 11. Análise de frequência de tosse e latência, obtidos na presença de LOO.

A, frequência de tosse a partir da exposição do ácido cítrico (0,4 M) após administração dos

tratamentos. B, latência, em segundos, para obtenção da primeira tosse após exposição ao ácido

cítrico (0,4 M) e tratamento. n = 5; * p < 0,05 (ANOVA two-way com pós-teste de Sidak). Dados



5.4 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA (TESTE DO ROTA-ROD)

Durante os estudos envolvendo o ensaio de tosse, observou-se que o óleo

essencial de L. origanoides na dose de 300 mg/kg modificou o comportamento. Após

o tratamento os acamundongos se apresentavam letárgicos ou com uma ambulação

reduzida. Isso permitiu uma análise profunda sobre o óleo essencial ter produzido

um efeito ansiolítico, sedativo ou até neurotóxico. Existem na literatura, diversos

métodos que podem indicar esses efeitos sobre os animais, sendo os modelos

experimentais de atividade motora em rota rod e o campo aberto, dois dos métodos

mais utilizados.

No modelo de Rota Rod, os camundongos tiveram que permanecer por

1 minuto ininterrupto para estarem aptos ao prosseguimento do experimento. Após

89

isso, os mesmos foram separados por grupo de forma aleatória com administração

dos tratamentos 23 horas e 30 minutos depois, para que fosse dado prosseguimento

24 horas após o treinamento, sendo avaliados o número de quedas e o tempo de

permanência na barra (em segundos).

Os animais separados por grupo (n = 5) e tratamentos apresentaram média

de quedas de 0,4 ± 0,245 (CN –NaCl 0,9%); 0,6 ± 0,6 (LOO 30 mg/kg); 2,4 ± 1,503

(LOO 100 mg/kg); 3,2 ± 2,709 (LOO 300 mg/kg); e 13,25 ± 5,693 (CP – diazepam

2,5 mg/kg), após 30 minutos de administração dos tratamentos, por via

intraperitoneal. Passados 60 minutos da administração os animais apresentaram

0±0 (CN); 0,8±0,49 (LOO 30 mg/kg); 1 ± 0,6325 (LOO 100 mg/kg); e 0,2 ± 0,2

(LOO 300 mg/kg); 0,2 ± 0,2 (CP) no número de quedas. Após 120 minutos da

administração, os animais apresentaram 0,2 ± 0,2 (CN); 1,6 ± 1,364

(LOO 30 mg/kg); 1,4 ± 1,166 (LOO100 mg/kg); 8,8 ± 3,68 (LOO300 mg/kg); e 0 ± 0

(CP) quedas no aparelho de rota Rod, como mostrado na Figura 12.

Nessa última avaliação, tempo de 120 minutos, o LOO apresentou um

possível efeito sobre o sistema nervoso central que afetou a coordenação motora

dos camundongos, quando comparado com o CN e o CP (p<0,05).

Outra forma de avaliação foi o tempo de permanência na barra do aparelho

durante os 3 minutos de rotação. Dessa forma, os camundongos apresentaram um

tempo médio, em segundos, de permanência na barra na ordem de 178,2 ± 1,2

(CN); 177,4 ± 2,6 (LOO 30 mg/kg); 172 ± 4,658 (LOO 100 mg/kg); 156,6 ± 3,789

(LOO 300 mg/kg); e 137,3 ± 19,93 (CP – diazepam 2,5 mg/kg), após 30 minutos da

administração dos tratamentos. No tempo de 60 minutos da administração, a

permanência na barra foi de 180 segundos (CN); 176,6 ± 2,088 (LOO 30 mg/kg);

176,6 ± 2,135 (LOO 100 mg/kg); 179,4 ± 0,6 (LOO 300 mg/kg); e 179,4 ± 0,6 (CP).

Após 120 minutos da administração a média de tempo de permanência na barra foi

de 179,4 ± 0,6 (CN); 173±5,831 (LOO 30 mg/kg); 176 ± 3,098 (LOO 100 mg/kg);

136 ± 6,45 (LOO 300 mg/kg); e 180 segundos (CP), como mostrado na Figura 12.

No tempo de 120 minutos, o LOO apresentou uma redução no tempo de

permanência na barra do rota rod de forma significativa quando comparada ao CN

(p<0,05).

90

Figura 12. Número de quedas e tempo de permanência dos camundongos no aparelho rota-rod.

Os gráficos representam o número de quedas e tempo de permanência na barra dos animais na barra do Rota Rod. Em A, está representada o número de

quedas após 30 minutos; B, número de quedas após 60 minutos; C, número de quedas após 120 minutos da administração dos tratamentos; D, tempo de

permanência na barra após 30 minutos; E, tempo de permanência na barra após 60 minutos; F, tempo de permanência na barra após 120 minutos. n = 5,

* p<0,05 (ANOVA one-way com pós-teste de Tukey). Dados expressos em média ± E.P.M.


A

nº

de

qu

ed

as

CN

LO

O 3

0m

g/k

g

LO

O 1

00m

g/k

g

LO

O 3

00m

g/k

gC

P

0

5

1 0

1 5

2 0 *3 0 m in

B

nº

de

qu

ed

as

CN

LO

O 3

0m

g/k

g

LO

O 1

00m

g/k

g

LO

O 3

00m

g/k

gC

P

0

5

1 0

1 5

2 06 0 m in

C

nº

de

qu

ed

as

CN

LO

O 3

0m

g/k

g

LO

O 1

00m

g/k

g

LO

O 3

00m

g/k

gC

P

0

5

1 0

1 5

2 0

*

1 2 0 m in

D

Te

mp

o n

a b

arra

(s

)

CN

LO

O 3

0m

g/k

g

LO

O 1

00m

g/k

g

LO

O 3

00m

g/k

gC

P

0

4 0

8 0

1 2 0

1 6 0

2 0 0

*

3 0 m in

E

Te

mp

o n

a b

arra

(s

)

CN

LO

O 3

0m

g/k

g

LO

O 1

00m

g/k

g

LO

O 3

00m

g/k

gC

P

0

4 0

8 0

1 2 0

1 6 0

2 0 06 0 m in

F

Te

mp

o n

a b

arra

(s

)

CN

LO

O 3

0m

g/k

g

LO

O 1

00m

g/k

g

LO

O 3

00m

g/k

gC

P

0

4 0

8 0

1 2 0

1 6 0

2 0 0

*

1 2 0 m in

91

Além dessas análises, foi observada a correlação tempo resposta de

LOO 300 mg/kg, haja vista seu potencial em modular a fisiologia do sistema nervoso

central. Para tanto, os dados coletados foram estendidos com mais duas avaliações,

no tempo de 240 e 480 minutos após administração de LOO. Os dados mostraram

uma correlação tempo resposta significante do LOO 300 mg/kg no que tange o

número de quedas (r = 0,8204; p = 0,0342), porém não apresentou correlação

significante para tempo de permanência na barra (r = 0,7684; p = 0,0511), como

apresentados na Figura 13.

Percebe-se, a partir dos dados, a existência de uma relação tempo-resposta

farmacológica que influenciou diretamente nos dados apresentados. A média de

quedas dos animais nos tempos de 240 e 480 minutos foi de 20,5 ± 1,041 e

24,5 ± 1,19 com os tempos de permanência na barra, em segundos, de

105,5 ± 5,694 e 97,75 ± 3,351, respectivamente.

Figura 13. Análise de LOO na dose de 300 mg/kg, em relação ao tempo.

Em A, análise exponencial do número de quedas e, em B, tempo de permanência dos animais na

barra do rota-rod após administração de LOO 300 mg/kg, no decorrer do tempo. n = 5, *p < 0,05

(Correlação de Pearson). Dados expressos em média ± E.P.M.


Os dados apresentados após 30 minutos da administração comparados com

60 minutos, para quedas e tempo na barra, não apresentaram diferença estatística.

92

De modo semelhante, os dados de 240 e 480 minutos, partindo da administração

dos testes, também não apresentaram diferença. Por outro lado, a partir de 60

minutos os animais apresentaram um efeito proeminente de característica sedativa,

ansiolítica ou neurotóxica, até os 240 minutos (p<0,05), onde parece se estabelecer

um efeito constante de LOO, como observado na Figura 13.

5.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MOTORA E ANSIOLÍTICA ATRAVÉS DO

MÉTODO DE CAMPO ABERTO

As evidências de uma ação sobre o sistema nervoso central promovido por

LOO tornou necessária à realização do experimento com campo aberto para avaliar

além da atividade motora, mas também o efeito ansiolítico promovido pelo óleo

essencial.

Os animais submetidos aos tratamentos NaCl 0,9% (CN), LOO 30, 100 e

300 mg/kg e diazepam 2,5 mg/kg (CP) foram expostos a análise comportamental e

os dados numéricos foram apresentados na Tabela 5.

Tabela 5. Dados numéricos dos parâmetros analisados no campo aberto.

nº de

rearing

nº de

grooming

Latência

(s)

nº de

cruzamentos

Tempo de

imobilidade

(s)

nº de

bolos

fecais

CN 9,2±1,83 2,4±0,24 8,2±3,83 64,5±4,13 31,4±6,43 2,2±0,86

LOO

30 4,4±3,41 2,8±0,58 2,6±0,68 47,6±7,5 71,2±12,56 0,0±0,0

LOO

100 1,8±1,56 1,8±1,11 16±6,25 26,2±8,09 136,8±24,26* 0,6±0,6

LOO

300 0,0±0,0* 0,0±0,0 9,4±5,10 15,6±2,25* 200,6±13,53* 0,8±0,58

CP 0,25±0,25* 4,800±0,86 6,6±1,83 63,25±18,74 120,8±36,74* 1,4±0,93

CN = NaCl 0,9%; LOO30 = LOO 30 mg/kg; LOO100 = LOO 100 mg/kg; LOO300 = LOO 300 mg/kg;

CP = Diazepam 2,5 mg/kg. n = 5; *p < 0,05 (ANOVA one-way com pós-teste de Tukey). Dados



93

Nesse teste, o LOO na dose de 300 mg/kg apresentou diferença significante

(ANOVA-one way, p < 0,05) quando comparada ao grupo que foi tratado com

NaCl 0,9% nos parâmetros de número de rearings (0,0 ± 0,0 vs 9,2 ± 1,83), número

de cruzamentos (15,6 ± 2,25 vs 64,5 ± 4,13), e tempo de imobilidade (200,6 ± 13,53

vs 31,4 ± 6,43), como mostrados na Figura 14.

Figura 14. Principais parâmetros de avaliação no campo aberto.

A, nº de rearing; B, nº de cruzamentos; e C, tempo de imobilidade (s) dos camundongos após o

tratamento com NaCl 0,9% (CN), LOO nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg e diazepam 2,5 mg/kg

(CP). n = 5; *p < 0,05 (ANOVA one-way com pós teste de Tukey). Dados expressos em média ±

E.P.M.


A

nº

de

re

arin

g

CN

LO

O 3

0 m

g/k

g

LO

O 1

00 m

g/k

g

LO

O 3

00 m

g/k

gC

P

0

2

4

6

8

1 0

1 2

* *

B

nº

de

cru

za

me

nto

s

CN

LO

O 3

0 m

g/k

g

LO

O 1

00 m

g/k

g

LO

O 3

00 m

g/k

gC

P

0

1 5

3 0

4 5

6 0

7 5

9 0

*

C

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

CN

LO

O 3

0 m

g/k

g

LO

O 1

00 m

g/k

g

LO

O 3

00 m

g/k

gC

P

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

*

**

94

Isso demonstra que o óleo essencial de L. origanoides nessas doses

apresenta efeito na redução da locomoção e, de modo geral, tem atividade

ansiolítica. Os outros parâmetros não apresentaram diferenças significativas nesse

teste, porém isso não exclui a possibilidade de eventos em nível de SNC que

proporcionem efeito ansiolítico/sedativo.

5.6 APERFEIÇOAMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA AVALIAÇÃO DA

ATIVIDADE EXPECTORANTE A PARTIR DA QUANTIFICAÇÃO DO MARCADOR

VERMELHO DE FENOL

5.6.1 Influência do pH da quantificação de vermelho de fenol por

espectrometria de absorção no UV-VIS

O vermelho de fenol é um agente indicador amplamente utilizado em

titulações potenciométricas e determinações de pH (KRISTENSEN; LESTER;

JÜRGENS, 1925; ROBERT-BALDO; MORRIS; BYRNE, 1985). Sendo também

utilizado com indicador para determinação de algumas atividades biológicas e

análises microbiológicas (CHASIS et al., 1938; CONN, 2013; CSEKE et al., 2003;

RODKEY, 1961; VOGEL, 2008). A diversidade de usos para o indicador vermelho de

fenol advém da sua capacidade de mudança de coloração e consequente

absorbância a depender do pH da solução em que se encontra, como pode ser

observado na Figura 15.

Para utilização do vermelho de fenol na determinação da atividade

expectorante in vivo, a literatura cita a basificação do meio quantificando o vermelho

de fenol desprotonado nas duas hidroxilas fenólicas (em pHs superiores a 8,5) em

que apresenta uma coloração fúcsia.

95

Figura 15. Distribuição das espécies iônicas de vermelho de fenol de acordo com a

variação do pH.


Sendo assim, foi realizado a varredura, em espectrofotômetro, da amostra de

LBA com adição de vermelho de fenol com e sem agente basificante para

verificação do comprimento de onda de absorção máxima (λmáx), buscando maior

seletividade analítica. Como pode ser observado na Figura 16, a mudança de pH

acarreta um deslocamento do λmáx de 435 para 565 nm.

96

Figura 16. Varredura em espectrofotômetro da solução de vermelho de fenol em

pHs diferentes


5.6.2 Quantidade de agente basificante adicionada as amostras de LBA

Na avaliação da quantidade do agente basificante para quantificação do

vermelho de fenol, inicialmente foi verificado se o comprimento de onda de absorção

máxima do indicador sofreria algum deslocamento batocrômico por influência do

agente basificante. Portanto, Figura 17, é possível evidenciar que independente do

agente basificante utilizado a absortividade do vermelho de fenol não altera,

permanecendo em 565 nm.

97

Figura 17. Varredura em espectrofotômetro da solução de vermelho de fenol em

condições básicas obtidas por NaOH e NaHCO3.


No que diz respeito à quantidade de agente basificante, foi evidenciado que

em já publicados, referenciados no Tabela 3, houve utilização de excesso de agente

basificante, como pode ser observado na Tabela 6 a partir dos dados obtidos em

relação ao pH do meio, o qual está inserido o vermelho de fenol e sua absorbância.

Tabela 6. Resultado da relação absorbância média de pH da amostra de LBA.

[NaOH] pH médio DP DPR (%) ABS média DP DPR (%)

1,0.10-5 8,01 0,09 1,11 0,011 0,01 10,78

5,00.10-5 7,49 0,11 1,43 0,054 0,02 45,25

5,00.10-4 9,74 0,51 5,26 0,854 0,02 2,34

1,00.10-3 10,44 0,41 3,92 0,856 0,02 1,80

0,05 12,69 0,01 0,12 0,876 0,01 1,08

0,1 12,97 0,01 0,12 0,877 0,01 0,69

0,2 13,25 0,02 0,15 0,856 0,01 0,67 [NaOH] – concentração de hidróxido de sódio adicionada a amostra de LBA; LBA – lavado bronco

alveolar; DP – desvio padrão; DPR – Desvio padrão relativo.


98

Logo, não há necessidade da adição de grandes concentrações de NaOH

para mudança do pH das amostras de LBA. Assim sendo, foi selecionada a adição

de alíquotas de 50 µL de NaOH na concentração de 0,001 M para a validação da

metodologia analítica.

5.6.3 Validação da metodologia analítica

A seletividade do método foi verificada com a sobreposição dos espectros de

absorção das amostras de LBA sem adição e com a adição de vermelho de fenol.

Como pode ser observado na Figura 18, o método demonstrou-se seletivo, pois a

absortividade do LBA não é considerável no comprimento de onda de 565 nm,

selecionado para desenvolvimento do método de quantificação do vermelho de fenol

no LBA.

Figura 18. Varredura espectrofotométrica das amostras de LBA na presença e

ausência de vermelho de fenol.


99

Para avaliar o parâmetro de linearidade da resposta espectrofotométrica do

vermelho de fenol, foi realizada a regressão linear a partir da média das três curvas,

sendo a equação obtida y=0,1741x + 0,0168em que y é a absorbância (UA) e x é a

concentração (µg/mL), como mostrada na Figura 19.

Figura 19. Regressão linear das soluções de vermelho de fenol.

Os pontos escuros representam as concentrações de 0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 µg/mL de vermelho de

fenol.


Os resultados da regressão para coeficiente de determinação (R2) foi de 0,99,

comprovando que mais de 99% do método apresentou linearidade satisfatória entre

o aumento da concentração do analito e a resposta espectrofotométrica. Com limites

de detecção (LD) de 0,76 µg/mL e quantificação (LQ) de 2,50 µg/mL, demonstrando

a acuracidade do método.

Quanto aos parâmetros de repetitividade os valores apresentaram DPR de

7,32% e os valores de taxa de recuperação, foi observada uma exatidão média de

106,36 % (DP = 2,03).

100

5.6.4 Determinação da solubilidade do vermelho de fenol em salina e em LBA

A determinação do coeficiente de solubilidade do vermelho de fenol em

solução salina foi de Cs = 0,0036 g/L, sendo esse resultado de extrema importância

para o desenvolvimento da suspensão extemporânea de administração in vivo.

5.6.5 Desenvolvimento de suspensão extemporânea estável de vermelho de

fenol

A avaliação da concentração da suspensão do indicador vermelho de fenol foi

necessária, haja vista sua baixa solubilidade em solução salina, produzindo

suspensões fisicamente instáveis. As suspensões fisicamente instáveis produzem

um sedimento defloculado, denso e de difícil redispersão. A utilização de sistemas

defloculados prejudicam a execução do protocolo farmacológico experimental por

apresentar problemas de não uniformidade de dose administrada aos animais,

interrupção da administração devido a obstrução de agulhas e irritabilidade local

pela presença de alta quantidade de partículas sólidas (AULTON, 2005).

Sendo assim, foi verificada pela altura do sedimento formado a estabilidade

em 24h após a obtenção de suspensões nas concentrações de 1,25%, 2,5% e 5%

dispersas em solução salina, com resultados expressos na Tabela 7, mostrando que

a suspensão na concentração de 1,25% de vermelho de fenol forma um sedimento

de maior altura e consequentemente de mais fácil redispersão que as demais.

101

Tabela 7. Verificação na altura do sedimento das partículas do vermelho de fenol.

% de vermelho de fenol

em suspensão

Média da altura do

sedimento formado

DP da altura do

sedimento formado

1,25 1,35 0,25

2,5 1,20 0,30

5 1,22 0,22

DP – desvio padrão.


5.6.6 Aplicação da metodologia analítica para avaliação de atividade

expectorante in vivo

Para avaliar a dose e concentração de vermelho de fenol em que ele seria

detectado com maior eficiência pelo espectrofotômetro, foram necessários testes

para unificar os dados e otimizar o processo. A partir disso, como mostrada na

Figura 20, foi observado que a dose de 500 mg/kg apresentou diferença significativa

no que diz respeito a dosagem de vermelho de fenol.

Figura 20. Quantificação de vermelho de fenol a partir de dose fixa e concentrações

variáveis.

A, teste de doses diferentes para secreção do vermelho de fenol. B, utilização de 3 concentrações de

vermelho de fenol na dose de 500 mg/kg para avaliar a que permite melhor secreção no LBA. n = 5, *

p<0,05 (ANOVA one-way com pós teste de Tukey). Dados expressos em média ± E.P.M.


102

Observa-se que na concentração de 1,25% ou 12,5 mg/mL a com maior

possibilidade de sua secreção nas vias aéreas, haja vista maior possibilidade de

partículas dispersas em suspensão.

Os dados obtidos no decorrer do aperfeiçoamento do método corroboram

com alguns dados da literatura e refuta outras informações, como mostrado na

Tabela 8. Nesse sentido, foi evidenciado o melhor comprimento de onda (565 nm),

agente basificante (NaOH), dose de vermelho de fenol (500 mg/kg) e concentração

da suspensão de vermelho de fenol (1,25% ou 12,5 mg/mL). Além disso, foi possível

observar que 0,001 M de NaOH é o suficiente para mudar a coloração do vermelho

de fenol (amarelo para fúcsia), sendo uma concentração 100 vezes menor do que a

observada na maioria dos estudos da literatura.

103

Tabela 8. Dados observados nos protocolos experimentais da literatura.

Fármacos Dose (mg/kg) Via de

administração

Comprimento

de onda (nm)

Agente

basificante

Dose de

vermelho de

fenol (mg/kg)

Concentração

do vermelho

de fenol

Referência

Ambroxol

1 V.O 535 NaOH 200 1% Alves et al.,

2014

143 V.O 546 NaOH 500 5% Lin et al., 2008

250 V.O 546 NaOH 200 µL 2,5% Song et al.,

2015

Carbacol 0,03; 0,06;

0,125 S.C 546 NaOH 500 5%

Engler,

Szelenyi, 1984

Cloreto de

Amônio

(NH4Cl)

250 V.O 546 NaHCO3 - 2,5% Yu et al., 2015

1000

V.O 546 NaOH 500 5% Engler,

Szelenyi, 1984

V.O 558 NaHCO3 500 - Jiang et al.,

2014

104

Tabela 8. Dados observados nos protocolos experimentais da literatura (Continuação).


administração

Comprimento

de onda (nm)

Agente

basificante

Dose de

vermelho de

fenol (mg/kg)

Concentração

do vermelho

de fenol

Referência

Cloreto de

Amônio

(NH4Cl)

1000

V.O 546 NaHCO3 - 5% Han et al.,

2010

V.O 558 NaHCO3 500 5% Ge, Liu, Su,

2009

V.O 546 NaOH 500 5% Liu, Wang,

Liu, 2009

V.O 546 NaHCO3 - 5% Chakraborty et

al. 2013

V.O 558 NaHCO3 500 5% Ge et al., 2015

V.O 570 NaOH 200 2,5% Guo et al.,

2009

V.O 558 NaHCO3 500 5% Koffuour et al.

2014

105



administração

Comprimento

de onda (nm)

Agente

basificante

Dose de

vermelho de

fenol (mg/kg)

Concentração

do vermelho

de fenol

Referência

Cloreto de

Amônio

(NH4Cl)

1000

V.O 550 NaOH 500 - Wong et

al.,2015

V.O 558 NaHCO3 500 5% Dapaah et al.,

2016

V.O 546 NaOH 500 5% Lin et al., 2008

1500

V.O 558,5 NaHCO3 500 5% Wang et al.,

2012

V.O 546 NaOH 500 5% Shang et al.,

2010

V.O 546 NaOH 500 5% Liu et al., 2015

2000 V.O 546 NaOH 500 5% Engler,

Szelenyi, 1984

106



administração

Comprimento

de onda (nm)

Agente

basificante

Dose de

vermelho de

fenol (mg/kg)

Concentração

do vermelho

de fenol

Referência

Emetina 50/100 V.O 546 NaOH 500 5% Engler,

Szelenyi, 1984

Guaifenesina 50

V.O 557 NaHCO3 500 5% Zhou et al.,

2013

V.O 558 NaOH 500 5% Zhang et al.,

2009

500/1000 S.C 546 NaOH 500 5% Engler,

Szelenyi, 1984 Iodeto de

potássio 4000/5000 V.O 546 NaOH 500 5%

Salbutamol

3/10 V.O 546 NaOH 500 5% Chand et al.,

1993

4/8 V.O 546 NaOH 500 5% Engler,

Szelenyi, 1984

2/4 V.O 546 NaOH 100 1% Fernandez et

al., 2009

(-) representam os dados não informados nos estudos. Fonte: Próprio autor.

107

6 DISCUSSÕES

O óleo essencial de L. origanoides (LOO) apresentou percentual maior

do que 50% da sua composição do monoterpeno alcoólico carvacrol que é

encontrado em concentrações elevadas também no óleo essencial de Thymus

vulgaris, uma planta amplamente distribuídana Europa, sendo utilizado como

um aditivo de sabor em alimentos e bebidas. Ressalta-se que outras espécies

e subtipos de plantas do gênero Thymus, como a Thymus spathulifolius,

Thymus serpylluse Thymus capitata, apresentam um alto percentual de

carvacrol no óleo essencial, cerca de 30%, 58% e 79%, respectivamente

(BUCHBAUER, 2010; JÄGER, 2010).

Diversas outras plantas apresentam carvacrol na sua composição. Em

relação a L. origanoides um estudo de Tangarife-Castaño e colaboradores

(2011) mostrou uma composição do óleo essencial de 17,3% de carvacrol.

Outros pesquisadores, como Escobar e colaboradores (2010), mostraram que

o local de coleta pode influenciar na composição química do óleo essencial de

L. origanoides. Foi demonstrado que da coleta de 6 amostras, em locais

diferentes da Colômbia, houve uma variação na concentração do carvacrol (0,5

a 46,2 %), influenciando, inclusive, na sua atividade antiparasitária e citotóxica.

Já Muños-Acevedo, Kouznetsov e Stashenko (2009) identificaram um

percentual de 44,4% de carvacrol no óleo essencial de L. origanoides em

cultivos experimentais na Colômbia.

Além de ser encontrado no óleo essencial de alguns subtipos de

L. origanoides, foi relatada a presença de carvacrol na fração hexânica do

extrato dessa espécie, por Barreto e colaboradores (2014), coletada no Piauí-

PI, apresentando um percentual de 36,17% na composição química e 1,77% na

fração diclorometânica.

Uma análise de extrema relevância em relação à espécie L. origanoides,

foi a identificação de quimiotipos dessa planta medicinal, realizada por Zapata

e colaboradores (2009) e Betancur-Galvis e Colaboradores (2011), a partir de

dados obtidos por Stashenko e colaboradores (2008), isso permitiu a

caracterização de 3 quimiotipos obtidos na Colômbia: carvacrol, timol e trans--

cariofileno/ρ-cimeno, sendo que algumas das amostras, nos estudos de Zapata

108

e colaboradores (2009), apresentaram cerca de 46,2% de carvacrol, entretanto

outras amostras das plantas nos estudos de Betancur-Galvis e colaboradores

(2011), apresentaram cerca de 36,5 ou 38,8 % de carvacrol.

Essas informações podem sugerir que o quimiotipo de L. origanoides

utilizado nesse estudo seja o carvacrol, visto que esse monoterpeno tem

concentraçãoa cima de 50% no óleo essencial. Além disso, podem indicar que

os dados referentes aos efeitos farmacológicos podem estar relacionados a

esse componente majoritário, porém não se descarta a atividade de outros

componentes ou até um efeito sinérgico entre os mesmos.

O estudo envolvendo a capacidade do LOO em relaxar a musculatura

lisa traqueal de cobaias foi avaliado frente a contrações induzidas por carbacol

ou histamina. O LOO promoveu relaxamento da musculatura lisa em ambos os

estímulos contracturantes. No entanto, houve diferença significante (p < 0,05)

em relação à potência de LOO frente às contrações induzidas por histamina em

comparação àquelas promovidas por carbacol.

Essa informação pode ser explicada, pois os receptores muscarínicos

são expressos em quase todos os tipos de células das vias aéreas e dos

pulmões, além da musculatura lisa vascular e do sistema respiratório, células

epiteliais glandulares, células endoteliais e várias células inflamatórias, sendo

que normalmente encontra-se o receptor muscarínico M2, acoplado a proteína

Gi e promove a inibição do AMPc-PKA, além de inibir a abertura dos canais

para potássio de forma não seletiva, e o M3 que é acoplado a proteína Gq-

PLC-IP3/DAG-PKC, promovendo efeitos contracturantes sobre a musculatura

lisa das vias aéreas em ambos (COULSON, FREYER, 2003; RACKÉ,

JUERGENS, MATTHIESEN, 2006).

Os receptores M2 são mais abundantes do que os M3 na musculatura lisa

das vias aéreas (proporção de 4:1), apesar disso, os receptores M3 são os

principais responsáveis pela contração brônquica e traqueal no músculo liso,

devido à importância da proteína Gq, o que foi evidenciado com estudo de

afinidade funcional de vários antagonistas seletivos em tecidos das vias aéreas

de diversas espécies, inclusive seres humanos. Os mecanismos envolvidos na

contração muscarínica são diversos, sendo relatado a ativação da CD38, uma

proteína que modula ação da ribose de adenosina difosfato cíclica (ADPRc) e

permite a ativação da quinase da cadeia leve de miosina (MLCK). Além disso,

109

Rho quinase também está envolvida inibindo a fosfatase da cadeia leve de

miosina (MLCP), promovendo uma exarcebação da contração (GOSENS et al.,

2006).

Por outro lado, a histamina exerce seus efeitos sobre a musculatura lisa

das vias aéreas, in vitro e in vivo, através dos receptores H1 (acoplados a

proteína Gq-PLC-IP3/DAG-PKC). Esses receptores podem ser bloqueados por

antagonistas clássicos dos receptores H1, como a clorfeniramina, mepiramina,

loratadina, dentre outros. Alguns estudos sugerem a presença de receptores H2

(acoplados a proteína Gs-AMPc-PKA) nas vias aéreas, sendo que níveis

elevados de AMPc-PKA estão ligados ao processo relaxante da musculatura

lisa, porém sua importância ainda permanece desconhecida (BARNES, 1989;

ESCH, LEURS, 2008; STARK, 2007).

Historicamente, os anti-histamínicos foram verificados por meio de

ensaios farmacológicos em íleo de cobaia ou músculo liso traqueal, sendo

observado que as substâncias que promoviam um deslocamento paralelo na

concentração-resposta de histamina poderiam ser classificadas como

antagonistas competitivos para receptores de histamina, principalmente H1

(CRIADO et al., 2010).

No intuito de observar a participação dos canais para potássio no

processo relaxante e observar outras vias de sinalização que pudessem

evidenciar o mecanismo de ação de LOO, os canais para potássio foram

bloqueados para análise. Neste protocolo, foi observado que LOO pode estar

envolvido na abertura dos canais para potássio operados por voltagem (Kv) e

também com os canais para potássio operados por cálcio (BKCa).

O desenvolvimento de fármacos que abrem os canais para K+ no

músculo liso despertou o interesse nesses canais iônicos, pois tais fármacos

podem relaxar o músculo liso das vias aéreas e reduzir a hiperreatividade em

pacientes asmáticos. Além disso, existe uma grande diversidade de canais

para K+ em diferentes tecidos, levantando a possibilidade de que fármacos

seletivos para esses canais também podem apresentar um benefício

terapêutico (BLACK, BARNES, 1990).

A contractilidade da musculatura lisa bronquial pode ser dependente de

um fluxo iônico através da membra plasmática que alteram a sensibilidade

desse tecido aos agentes agonistas. Isso permite crer que a modulação de

110

canais para potássio, por exemplo, seja de extrema importância no mecanismo

de relaxamento da musculatura lisa, principalmente porque na fisiologia

existem formas de controle desses canais para a contração e relaxamento nas

vias aéreas e fármacos que atuem nesses canais podem promover efeitos

terapêuticos (BLACK, BARNES, 1990; PELAIA et al., 2002).

Esses canais têm sido associados com a repolarização de células

excitáveis após despolarização, promovendo hiperpolarização, e os fármacos

que os bloqueiam, como 4-AP e TEA, causam um aumento da excitabilidade e

contratilidade, inclusive na musculatura lisa das vias aéreas (BLACK, BARNES,

1990; FUKUSHIMA et al., 1996; PELAIA et al., 2002).

Estudos concluíram que as vias aéreas de cobaias e humanos podem

ser moduladas pela aplicação de ativadores ou bloqueadores de canais para K+

operados por voltagem (KV7), sugerindo que esses canais tem o potencial de

regular o diâmetro e são responsáveis por manter o tônus basal nas vias

aéreas, podendo ser considerados broncodilatadores úteis (JEPPS, OLESEN,

GREENWOOD, 2013).

Os canais para potássio são de extrema importância para o tônus

muscular das vias aéreas, incluindo os Kir e KATP que também são bloqueados

por 4-AP e TEA de maneira inespecífica, por modular as concentrações de

Ca2+ no meio citosólico (LI et al., 1997; OONUMA et al., 2002)

Além disso, é relatado na literatura que os canais para potássio ativados

por cálcio (KCa) são de extrema importância no processo de regulação da

contratilidade da musculatura lisa das vias aéreas, sendo os de grande

condutância (BKCa) os mais relevantes nesse processo, haja vista que e a

atuação de ferramentas farmacológicas dependentem da composição das

subunidades formadoras desses canais, como é o caso da dependência da

ativação por 4-AP (LI et al., 2014). Poucos fármacos ou produtos naturais

atuam nesses canais para potássio, sendo importante ressaltar que a abertura

desses canais se dá por atuação de mecanismos independentes e

dependentes de AMPc, por exemplo, o efeito broncodilatador de agonistas 2-

adrenérgicos (PELAIA et a., 2002).

Testai e colaboradores (2016) identificaram que o carvacrol, componente

majoritário de LOO, promovia efeito relaxante na musculatura vascular, através

111

da ativação dos Kv, uma evidência importante para inferência do mecanismo de

ação de LOO sobre o músculo liso traqueal.

Na busca pelo mecanismo de ação pelo qual LOO promovia efeito

relaxante do músculo liso traqueal, foram observados novos alvos de fármacos.

Dentre eles, foi analisada a via dos prostanoides e atividade agonista -

adrenérgica. Evidenciando que o LOO, na presença de dexametasona,

promovia efeito relaxante traqueal potencializado.

Importante observar que o metabolismo do ácido araquidônico, a partir

de fosfolipídios de membrana, promovida pela fosfolipase A2 gera compostos

que podem atuar de forma parácrina e autócrina no organismo, dentre eles se

encontram os leucotrienos, prostaglandinas e tromboxanos que tem papel

crucial na patogênese da asma (ZASLONA, GOLDEN, 2015).

As prostaglandinas e tromboxanos são produzidos pelo metabolismo do

ácido araquidônico pelas isoenzimas da ciclooxigenase (COX), enquanto que

os leucotrienos são produzidos pela enzima lipoxigenase (LOX), sendo que

esses produtos são caracterizados, principalmente, em problemas

inflamatórios, como é o caso da asma, inclusive sendo alvo de fármacos por

regular toda a homeostasia da função das vias aéreas (MONTUSCHI et al.,

2007; ZASLONA, GOLDEN, 2015).

Essas informações da literatura ajudam a compreender os dados

obtidos, em que na presença de IND (inibidor não seletivo da COX) a CE50 =

7,452 ± 2,135 µg/mL não apresentou diferença significante com os valores na

ausência desse bloqueador (9,927 ± 1,888 µg/mL), sendo que de forma

diferente, houve diferença significante na presença de DEX (CE50 =

2,587 ± 0,599 µg/mL) que tem como um dos efeitos farmacológicos ser um

inibidor da fosfolipase A2 (PLA2) e síntese proteica. Isso pode mostrar uma

influência intensa dos prostanoides e leucotrienos nos mecanismos de

contração da musculatura lisa. Porém, quando a produção dos prostanoides é

interrompida, através da ação da indometacina, não há influência no

relaxamento das vias aéreas exercido por LOO. Entretanto, quando

dexametasona promoveu a redução na produção de prostanoides e

leucotrienos, a resposta relaxante de LOO foi potencializada, mostrando o

papel crucial da via da lipoxigenase e produção de leucotrienos no mecanismo

112

de ação contracturante e a influência do óleo essencial nessa via de

transdução de sinal.

Além do efeito da dexametasona na sobre a produção de mediadores

inflamatórios, estudos tem demonstrado que os glicocorticoides podem

promover um aumento na densidade de receptores β2-adrenérgicos ou

modulação direta da adenilil ciclase e produção de PKA que é uma molécula

conhecida por fosforilar alvos que promovem o relaxamento das vias aéreas,

tais como abertura dos canais para potássio, inibição da Ca2+-ATPase do

retículo sarcoplasmático (SERCA), inibição dos IP3R, dentre outras (HIRST,

LEE, 1998; ADCOCK, MANEECHOTESUWAN, USMANI, 2002).

A via colinérgica também faz parte do processo contrátil para a

musculatura lisa das vias aéreas e foram utilizadas ferramentas para observar

a influência dessas vias sobre o mecanismo de ação relaxante de LOO sobre a

traqueia de cobaia. Os dados da literatura sugerem que há liberação de

acetilcolina através de estímulos histaminérgicos (H1) no neurônio pré-

sináptico, auxiliando no processo contrátil (BARAK, RUBINSTEIN, COHEN,

1997). Porém, mesmo na presença de haxametônio não há diferença

significante no relaxamento promovido por LOO sobre a musculatura lisa.

Contudo, quando se tem a presença de ATR, a CE50 de LOO reduz,

promovendo um efeito relaxante potencializador. Isso pode significar que o

LOO pode estar atuando em alguma via de liberação de acetilcolina ou até

como antagonista muscarínico.

A condução muscarínica nas vias aéreas é de extrema importância no

papel da contração muscular lisa, pois pode se apresentar através dos

receptores M1 e M3 (acoplados a proteína Gq) ou M2 (acoplado a proteína Gi),

sendo alvo de fármacos para o tratamento de doenças pulmonares, apesar de

que isso pode gerar uma liberação maior de acetilcolina a partir do bloqueio M2,

localizado no neurônio pré-sináptico, considerado um autorreceptor (BUELS,

FRYER, 2012; RACKÉ, JUERGENS, MATTHIESEN, 2006). Além disso, as

densidades desses receptores nos tecidos são diferentes, os M1 se localizam

no nervo pós-ganglionar para permitir a condução nervosa e liberação de

acetilcolina na fenda sinaptica, os M2 estão localizados nos nervos e regulam a

liberação de acetilcolina e os M3 se localizam mais na musculatura lisa. O

bloqueio promovido pela atropina nos receptores muscarínicos permitiu que

113

houvesse redução de uma via importante pra contração da musculatura lisa

das vias aéreas, sugerindo o aumento da potência (3,949 ± 1,455 µg/mL) de

LOO na presença dessa antagonista muscarínico (BULKHI, TABATABAIAN,

CASALE, 2016).

Outra análise possível é a de que agentes anticolinérgicos podem atuar

como agonistas inversos nos receptores M2 e M3 e iniciar uma nova cascata de

sinalização que permite aos inibidores de PDE produzirem um relaxamento

substancial do músculo liso das vias aéreas através do aumento intracelular de

AMPc e GMPc (GONZÁLEZ, et al., 2004), fato que poderia explicar o efeito de

LOO sobre traqueia isolada de cobaia.

Então, foi necessária uma análise da via de sinalização envolvendo o

NO produzido pelo epitélio das vias aéreas que tem grande importância para o

relaxamento da musculatura lisa bronquial, pois ativa a guanilil ciclase soúvel

(GCs), aumenta a produção de GMPc e ativação de PKG para fosforilação de

proteínas alvo. Além disso, deve-se observar que há regulação do GMPc pelas

fosfodierases (PDEs), transformando-as em GMP. Outra forma de guanilil

ciclase é a particulada (GCp), uma proteína transmembrana com atuação como

receptora para alguns peptídeos com mecanismo intracelular semelhante a

GCs (DUPONT et al., 2014; HAMAD et al., 2003; RHO et al., 2002).

A formação de NO, para propagação da via de transdução de sinal, se

dá a partir da reação catalizada pela óxido nítrico sintase (NOS) que se

apresentam em trêes isoformas: neural (nNOS), endotelial (eNOS) e indutível

(iNOS). Essas isoformas da NOS catalizam a mesma reação de conversão da

L-arginina, em L-citrulia e NO, usando oxigênio, NADPH e outros cofatores

(MAYER, WERNER, 1995; ALDERSTON, COOPER, KNOWLES, 2001;

FÖRSTERMANN, SESSA, 2012). Um análogo da L-arginina, conhecido por L-

NAME, atua reduzindo a síntese de NO por inibir as isoformas de NOS

evitando a diminuição da ativação de GCs, produção de GMPc, ativação de

PKG e relaxamento da musculatura lisa (PFEIFFER et al., 1996). Nesse

sentido, a utilização de L-NAME compromete a via do NO, por não permitir a

sua produção e continuidade da transdução de sinal exercida por esse gás,

porém quando o L-NAME foi incubado não houve diferença significante

comparado ao LOO, em relação à resposta relaxante da traqueia de cobaia.

114

Alguns ativadores e inibidores da guanilil ciclase são utilizados na

farmacologia para rastrear o mecanismo de ação, sendo o azul de metileno um

dos mais importantes inibidores da guanilil ciclase solúvel, interrompendo a

transdução de sinal da via do óxido nítrico e formação do GMPc (EVORA,

2016). Sabe-se que o NO atua na GCs em dois sítios de ligação, um formando

o complexo Fe2+-NO de forma direta e o outro, em excesso de NO, promove

mudança conformacional do bolsão do grupo heme, aumentando a afinidade

do NO à região catalítica (DERBYSHIRE, MARLETTA, 2009).

Nos dados apresentados foi evidenciada uma redução na potência do

LOO em relaxar o músculo liso pré-contraído com histamina, na presença do

azul de metileno, inibidor da guanilil ciclase solúvel. Além disso, na presença

de L-NAME e aminofilina não houve diferença significante no relaxamento

traqueal, indicando a influência da GCs no mecanismo relaxante promovido

pelo óleo essencial.

Apesar de não ser possível identificar a participação dos nucleotídeos

cíclicos no mecanismo relaxante de LOO, sabe-se que os inibidores da

fosfodiesterase tem impacto na terapêutica de diversas doenças por aumentar

as concentrações intracelulares de AMPc e GMPc, segundos mensageiros que

promovem diversas modificações celulares, envolvendo todos os sistemas do

organismo de acordo com cada isoforma e suas particularidades no processo

de des-ciclizar esses nucleotídeos, removendo sua atividade de regulação das

proteínas cinases (MAURICE et al., 2014)

Para isso novos experimentos foram utilizados com a incubação de

aminofilina para inibir contrações com carbacol. A aminofilina é um inibidor

inespecífico (normalmente as isoformas 3,4,5,7 e 9) da fosfodiesterase,

regulador de nucleotídoes cíclicos como AMPc e GMPc, sendo composta por

teofilina e um sal etilenodiamina, o que proporciona maior solubilidade

(BARNES, 2013).

Apesar de ser um inibidor inespecífico, Ise e colaboradores (2003)

relataram que a teofilina promove sua ação relaxante, principalmente por

aumentar os níveis de AMPc e, a partir daí ativar os canais para potássio de

grande condutância ativados por cálcio (BKCa), promovendo hiperpolarização

da célula, no entanto, Rabe, Magnussen e Dent (1995) já descreviam que a

teofilina inibia de forma inespecífica as PDE’s e induziria um aumento na

115

produção de GMPc no interior de células musculares lisas. Novamente os

dados não apresentaram diferença significante, evidenciando que a ação

semelhante às xantinas, pode não ser o mecanismo relaxante do LOO sobre a

traqueia de cobaia.

Em geral, o relaxamento da musculatura lisa induzida por NO ou outros

mediadores acontecem por dois mecanismos principais: um mecanismo

dependente de GMPc no qual o NO se liga e ativa o GCs para gerar cGMP; ou

um mecanismo independente de NO, no qual uma alteração funcional de

GMPc (ativação) ocorre através da nitrosilação de grupos tióis, sendo que

ambos podem estar relacionados a musculatura lisa traqueal (GASTON et al.,

2006; PEREZ-ZOGHBI, BAI, SANDERSON, 2010).

Os dados apresentados por LOO na presença de um doador de NO

(NPS) são semelhantes, dadas às devidas proporções, aos obtidos por Hwang,

Wu e Teng (1999), com o YC-1, uma substância pura, onde demonstraram que

essa molécula tinha a capacidade de ativar a GCs para relaxar a musculatura

lisa das vias aéreas. Esse efeito foi demonstrado como potencializante nas

curvas concentrações-cumulativas entre o controle com NPS na presença de

YC-1. Para promover esse efeito ativador de GCs, YC-1 se liga a um sítio

alostérico da GCs, o que permite maior afinidade do NO ao grupo heme

(DERBYSHIRE, MARLETTA, 2009; DERBYSHIRE, MARLETTA, 2012;

MONFORT, WALES, WEISCHEL, 2017).

Além de YC-1, outro estimulador da GCs que pode se assemelhar ao

LOO, é o BAY 41-2272 que foi capaz de induzir relaxamento das vias aéreas

de ratos por mecanismo independente do grupo heme, apresentando efeito

sinérgico com NO na formação de GMPc e bloqueio dos canais para Ca2+ de

forma independente (TOQUE et al., 2010; MONFORT, WALES, WEISCHEL,

2017).

O azul de metileno tem sido alvo de diversos estudos sobre sua

atividade, por exemplo, Hamad e colaboradores (1997) demonstram a partir de

experimentos na presença de azul de metileno e hemoglobina a atividade de

ambos em reduzir os níveis de GMPc, o que indica a confirmação da atividade

do azul de metileno como inibidor da GCs. No entanto, outros pesquisadores

como Marczin, Ryan e Catravas (1992) mostraram que o mecanismo de ação

de azul de metileno em reduzir os níveis de GMPc estaria relacionado a

116

produção de ânios superóxido, sem relação com inibição de GCs, atividade que

foi revertida na presença de superóxido dismutase.

Estudos relataram que a GCs pode ser estimulada por duas formas

distintas, na primeira há ligação do NO em um sítio onde se localiza o grupo

heme da proteína, na segunda há um sítio alostérico que ativa a proteína por

modificação estrutural, inclusive melhorando a sua afinidade pelo NO (GOSH et

al., 2016). Por esse motivo, acredita-se que os componentes de LOO pode

também interagir com esse sítio alostérico e promover o relaxamento do

músculo liso das vias aéreas, a partir de estímulos histaminérgicos ou

colinérgicos.

A via de sinalização regulada pelo NO e GMPc, responsáveis pelo

relaxamento do músculo liso das vias aéreas, é mediada pela abertura dos

canais para K+, incluindo os canais KATP e canais para K+ ativados com Ca2+. A

ativação dos canais de K+ causa o efluxo dos íons potássio, hiperpolarização

da membrana plasmática, fechamento dos canais de cálcio operados por

voltagem (Cav) e uma diminuição dos níveis de cálcio intracelular nas células

do músculo liso (VIEIRA et al., 2013). Esses eventos podem acontecer,

principalmente, pela ativação da PKG por ação do GMPc, permitindo a

fosforilação de alguns alvos, incluindo os canais para potássio ou até ação

direta do nucleotídeo cíclico em relaxar a musculatura lisa. Adicionalmente,

dados sugerem que essa via tem influencia na [Ca2+]i por modular ação de IP3

nos IP3R no retículo sarcoplasmático (PEREZ-ZOGHBI, BAI, SANDERSON,

2010).

Os resultados indicam que o efeito de LOO sobre o musculo liso traqueal

é, provavelmente, mediado pela ativação da via NO/GCs/GMPc/PKG, levando

a um aumento do efluxo de K+ com subsequente atenuação da contratilidade

associada ao influxo de Ca2+. Além disso, dexametasona modulou a produção

de GMPc, em podócitos, de maneira tempo dependente, o que pode estar

relacionado à atividade de regulação da produção de proteínas e, de alguma

forma, pode explicar a resposta de LOO quando na presença de

corticosteroides, obtendo extensa potencialização no seu efeito relaxante da

musculatura lisa traqueal (LEWKO et al., 2015).

Outra informação relevante é que cosrticosteroides, tal qual

dexametasona, tem a capacidade de regular a produção de TNF-, um fator

117

pró-inflamatorio de extrema importância na produção de respostas celulares.

Isso permite inibir a atividade da TNF- sobre a via NO/GCs/GMPc/PKG que

promovem o relaxamento das vias, permitindo que haja aumento dos seus

níveis e melhora na atividade espasmolítica da susbstâncias teste, nesse caso,

os componentes do óleo essencial de L. origanoides (WU et al., 2006).

O estabelecimento dos efeitos farmacológicos de LOO foi avaliado sobre

o modelo de tosse induzido por ácido cítrico, sendo que sua inalação estimula

todo o trato respiratório, a partir da cavidade nasal até os brônquios e, por

conseguinte, não só induz tosse, mas também espirros. Essa substância tem a

capacidade de promovera tosse estimulando as fibras C ou Aδ, sendo

considerada uma metodologia efetiva para análise de tosse ou teste de

antitussígenos. Isso porque quando realizada análisecomparada à capsaicina

(estimulador de fibras C), foi descoberto o papel do ácido cítrico em ter um

mecanismo de ação duplo, sendo que as fibras Aδ são consideradas, em

cobaia, como “receptores da tosse” (TANAKA, MARUYAMA, 2005). Outro

estudo propõe o mecanismo tussígeno do ácido cítrico a partir da estimulação

de mastócitos ou ação direta sobre as fibas C (LAI et al., 2009), como mostrado

na Figura 21.

O controle positivo para avaliação da atividade antitussígena foi um

fármaco narcótico que tem importância na terapêutica, porém seu mecanismo

ainda não está completamente elucidado, apesar de evidências indicarem a

atividade sobre os receptores opioides. O “padrão ouro” para estudo

envolvendo atividade antitussígena é a codeína (morfina metilada no carbono

3), porém foi utilizada a morfina, visto que são envolvidos os receptores

opioide-µ e κ (acoplado a proteína Gi), principalmente o subtipo µ2, não sendo

considerados os efeitos adversos provocados pela morfina (KARLSSON,

LANNER, PERSSON, 1990; TAKAHAMA, SHIRASAKI, 2007).

Experimentos realizados por Karlsson, Lanner, Persson (1990)

demonstraram que a morfina a 5 mg/kg, administrada por via intramuscular,

permitiu uma redução de cerca de 50% no número de tosses, quando o

estímulo era promovido por ácido cítrico 0,4M em cobaias, sendo considerado

o fármaco de maior potência nesse método em comparação com a codeína e

mepiridina, apresentando valor de DI50 de 2,6 mg/kg, com intervalo de

confiança entre1,3 e 5,1 mg/kg.

118

Em estudo realizado através da metodologia duplo-cego cruzado com 27

pacientes que apresentavam tosse, foi utilizado 5 mg de sulfato de morfina

duas vezes ao dia, durante 1 mês, houve redução significativa na frequência de

tosse. Além disso, estudos relatam que 5 mg de sulfato de morfina são

suficientes, em humanos, para reduzir cerca de 40% a frequência de tosse

desses indivíduos (DICPINIGAITIS et al., 2014).

Figura 21. Possível mecanismo tussígeno do ácido crítrico.

As setas indicam ativação de mediadores para o estímulo tussígeno.

Fonte: adaptado de Lai et al., 2009.

Outros fármacos se inserem na terapêutica, a partir da descoberta de

novos alvos farmacológicos. Um dos alvos estudados são os receptores de

potencial transiente (TRP’s), sendo os mais importantes na tosse os da

anquirina (TRPA) e o vaniloide (TRPV) que são canais iônicos e permitem o

fluxo, principalmente de Ca2+, com destaque para o TRPA1 e TRPV1.Os

receptores TRPV1 são ativados por baixo pH, temperaturas acima de 43ºC e

mediadores pró-inflamatórios e antagonistas podem mediar o bloqueio da

tosse, apesar dos efeitos adversos já relatados como hiperalgesia inflamatória.

Já os TRPA1 são conhecidos por estarem relacionados à nocicepção, além de

119

promover inflamação e irritação das vias aéreas, sendo que alguns ácidos

fracos e cloreto (Cl-) podem promover sua atividade comcontrole por alguns

antagonistas (BROOKS, 2011; DICPINIGAITIS, 2006; DICPINIGAITIS et al.,

2014; GEPPETTI et al., 2010; MIHARA, SHIBAMOTO, 2015).

O TRPA1 é um receptor importante no processo de desenvolvimento da

tosse, pois sua ativação pode se dar através do estímulo da poluição do ar e

fumaça de cigarros. O carvacrol, componente majoritário de LOO, tem a

capacidade de ativá-los em culturas celulares HEK293 que foram induzidas a

expressar tal receptor. O carvacrol na concentração de 250 μM promove uma

robusta ativação na corrente do TRPA1 e rápida dessensibilização (em cerca

de 100 segundos), o que pode explicar seu efeito antitussígeno. Nesses

estudos também foi possível observar que o carvacrol (1mM) não foi capaz de

ativar os receptores TRPV1 (XU et al., 2006; MIHARA, SHIBAMOTO, 2015).

Ibarra e Blair (2013) também mostraram, em células HEK293

expressando receptores TRPA1 que o potencial do carvacrol em promover

ação agonista do receptor TRPA1 ocorre de forma não eletrofílica

(independente do resíduo de cisteína amino-terminal do receptor) e,

possivelmente, tem atuação em um local que não pertence ao sítio ativo para

promover seu efeito, mostrando também que na concentração de 300 μM

promoveu completa dessensibilização do receptor.

Em estudo realizado por Dantas e colaboradores (2015), foi utilizado

carvacrol sobre tecido vascular sem endotélio funcional provenientes de ratos

espontaneamente hipertensos (SHR) que após incubação de vermelho de

rutênio (antagonista não seletivo TRPV), o carvacrol reduziu sua atividade

sobre o relaxamento, sugerindo um efeito sobre os TRPV. A confirmação do

efeito foi realizada com a utilização de capsaicina, mostrando atenuação dos

efeitos do carvacrol, indicando ação sobre os TRPV1, haja vista que capsaicina

é um conhecido agonista desses receptores. Nos estudos in vivo, o carvacrol

apresentou atividade sobre os TRPV1 e TRPV4, levando a um efeito

bradicárdico e hipotensor. No entanto, esses efeitos não foram seletivos,

sugerindo-se atuação sobre TRPV1, TRPV4, TRPC1, TRPM7 e TRPM8 em ratos

SHR.

Desse modo, o LOO nas doses de 100 e 300 mg/kg podem estar

exercendo efeito sobre os receptores TRP de modo que a atividade

120

antitussígena é observada e amplificada quando avaliado a frequência e

latência de tosse, em que LOO300 mg/kg se apresentou de forma efetiva. Os

dados podem sugerir que os componentes do óleo essencial, bem como o

monoterpeno marjoritário, carvacrol, podem estar relacionados à atividade do

sobre os receptores TRPA1 e TRPV1, e apresentar tais propriedades

farmacológicas.

Os estudos envolvendo atividade antitussígena permitiram observar um

comportamento animal incomum, uma redução da ambulação e letargia. Para

observar atividade ansiolítica ou neurotóxica, foi realizado o método do rota-rod

que segundo Dunham e Miya (1957) tem o objetivo de estabelecer a

neurotoxicidade de anticonvulsivantes, visto que os estudos que envolviam

essa atividade poderiam apresentar falso positivos. Além disso, a proposta

poderia se expandir no teste de fármacos relaxantes musculares esqueléticos,

depressores do sistema nervoso central, dentre outros, com a possibilidade de

se calcular até a dose tóxica que afetaria 50% dos animais (DT50).

Um óleo essencial de L.origanoides, obtido no estado do Piauí, com

composição de 23,89% para presença de ρ-cimeno, 21,78% de timol e 18,87%

de carvacrol, foi testado frente ao teste de coordenação motora (rota rod) nas

doses de 300 e 2000 mg/kg, administradas por via oral. O teste evidenciou que

não houve diferença significativa comparada ao controle, no tempo de

permanência dos animais na barra (SANTOS, MEDEIROS, 2015).

Na literatura já existem estudos em relação à modificação da

coordenação motora do carvacrol (componente majoritário de LOO). Melo e

colaboradores (2010) demonstraram que as doses de 12,5; 25 e 50 mg/kg de

carvacrol, administradas por via oral, em camundongos, não alteraram a

coordenação motora ou apresentaram efeitos neurotóxicos e miorrelaxantes

quando os animais ficavam sobre a barra em 5, 15 e 40 rotações por minuto.

De modo semelhante, Melo e colaboradores (2012) demonstraram que as

doses de 50 e 100 mg/kg administrados por via oral, também não alteraram os

eventos no teste de rota rod, quando os animais ficavam sobre a barra em 5,

15 e 40 rotações por minuto.

A discordância dos resultados obtidos para o óleo essencial de

L. origanoides aos apresentados na literatura, podem estar relacionados ao

fato de que no LOO o carvacrol está em um percentual maior do que 50% da

121

composição química do óleo essencial, o que evidencia uma diferença dos

estudos anteriores. Além disso, a via de administração pode influenciar na

resposta do LOO, por isso as diferenças na resposta farmacológica.

Por outro lado, os estudos com carvacrol corroboram com os dados

obtidos para a dose de 100mg/kg de LOO que apresenta cerca de metade

desse valor de carvacrol, possibilitando um comparativo da dose de 50 mg/kg

do monoterpeno na literatura. O que explicaria o efeito de quedas e menor

tempo de barra, mas que não representou diferenças significativas.

Outro protocolo realizado, esse com caráter de determinar o efeito

ansiolítico ou sedativo de LOO, foi o do campo aberto que proporciona uma

avaliação sistematica à exploração de novos ambientes, a atividade locomotora

geral e fornece informações iniciais relacionados ao comportamento de

ansiedade ou sedação em roedores, sendo o isolamento social resultante da

separação física dos companheiros para o aparato e o estresse criado pelo

ambiente novo, iluminado e desprotegido (aberto) como dois fatores principais

para avaliação do comportamento animal (BAILEY, CRAWLEY, 2009; PRUNT,

BELZUNG, 2003).

O comportamento animal avaliado pelo teste do campo aberto apresenta

parâmetros podem possuir algumas interpretações. O gromming, por exemplo,

é descrito como uma resposta ao deslocamento para o ambiente novo e que

seria reduzido à exposição repetida ao aparelho (ESPEJO, 1997). O número de

bolos fecais e urina sãoreportados como avaliação para emocionalidade, a

partir de estímulo autonômico simpático (CRUZ, LANDEIRA-FERNANDEZ,

2012; HALL, 1934), no entanto, para ansiedade isso tem sido questionado, haja

vista que um ambiente novo pode estimular a defecação, mas não por medo ou

processos de ansiedade (BINDRA, THOMPSON, 1953; LISTER, 1990). Em

estudo de Royce (1977) ele relata que a medida de defecação é em

decorrencia de uma descarga autonômica e micção de marcação territorial,

sendo a latência para primeiro movimento, atividade locomotora e penetração

ao centro do campo aberto, os parâmetros que envolvem descarga motora.

A metodologia do campo aberto permite diversas possibilidades sobre a

ação no sistema nervoso central de substâncias. Alguns parâmetros como

número de cruzamentos, tempo de imobilidade e frequência de rearing são

122

tratadas como medidas de atividade locomotora, exploração e ansiedade

(PRUNT, BELZUNG, 2003; WALSH, CUMMINS, 1976).

Santos e Medeiros (2015) utilizaram óleo essencial de L. origanoides,

obtido no estado do Piauí, com composição diversa do LOO proveniente do

herbário da UEFS, no modelo de campo aberto. Foram utilizadas as doses de

300 e 2000 mg/kg, administradas por via oral e não foi evidenciada alteração

na locomoção, rearing e grooming, o que pode explicada pela composição dos

óleos essenciais testados e vias de administração.

Os dados conflitantes com a literatura podem estar relacionados a

variedade de compostos químicos presentes no LOO, quantidade de carvacrol

nas doses utilizadas de LOO (30, 100 e 300 mg/kg), considerando o carvacrol

com cerca de 50% da composição do óleo essencial, além da diferença na via

de administração.

Seguindo a observação das respostas farmacológicas de LOO, foi

observada a diferença nas metodologias que envolvem a atividade

expectorante a partir da avaliação do marcador vermelho de fenol. A

repetitividade e taxa de recuperação demonstraram concordância com o

preconizado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e

International Conference of Harmonization (ICH) (ANVISA, 2003; ICH, 2005). O

coeficiente de solubilidade observado para solução de NaCl 0,9% difere

substancialmente da solubilidade do vermelho de fenol em água descrita na

literatura, cerca de 0,77 g/L (MAYNARD, 1997). As outras informações obtidas

para o aperfeiçoamento do método promoveram uma utilização de menor

quantidade de agentes químicos, sendo importante para o meio ambiente e

estão de acordo com a preconização da química verde, definida como:

Invenção, planejamento e aplicação de produtos e processos químicos para reduzir ou eliminar o uso e a geração de substâncias perigosas (ANASTAS e WARNER, 1998).

Além disso, pensa na “prevenção da poluição” e não no sentido de

“poluição para posterior limpeza”, como é estabelecido pelo pensamento

industrial antigo, sendo o seu objetivo uma redução nos impactos ambientais e

econômicos causados por quaisquer ações humanas (DUA et al., 2012).

123

Desse modo, a utilização da ideia de prevenção a impactos, além de

melhorar a capacidade de um método farmacológico foi de extrema

importância, principalmente, quando os estudos se inserem no contexto da

asma que acomete uma parcela extensa da população mundial.

Nesse sentido, um agente expectorante pode ser definido como aquele

capaz de induzir a descarga ou a expulsão do muco através do trato

respiratório. Isto requer uma ação de tossir ou espirrar para soltar o muco dos

pulmões ou do trato respiratório superior. Estes eventos podem ser vistos como

benéficos se removerem o muco, melhorando a ventilação alveolar e

proporcionar alívio da irritação neuronal que é disparado por propriedades

mecânicas dos mucos ou efeitos de mediadores inflamatórios contidos nos

mesmos. Os expectorantes podem reduzir o esforço mecânico da respiração e

dispneia, sendo que o mecanismo preciso pelo qual expectorantes exercem a

sua ação ainda não está bem estabelecido, embora se sugira uma atuação

sobre os receptores vagais irritantes gástricos, além de recrutar reflexos

parassimpáticos eferentes que induzem exocitose glandular de uma mistura

mucosa menos viscosa (BALSAMO, LANATA, EGAN, 2010).

A condição de hipersecreção mucosa nas vias aéreas pode levar a uma

obstrução da respiração, limitação no fluxo de ar, desequilíbrio na ventilação e

problemas relacionados às trocas gasosas, sendo que o envolvimento de um

comprometimento na função mucociliar, com redução na remoção de muco,

pode incentivar a colonização bacteriana, levando a infecções pulmonares

repetidas e exacerbações. Além disso, a hipersecreção mucosa crônica está

relacionada ao reduzido controle da asma, o que pode levar a uma perda

acelerada da função pulmonar e aumento da mortalidade (ROGERS, 2007).

O processo asmático, a partir da inflamação das vias aéreas produz

modificações no metabolismo do tecido. Dessa forma, pode induzir uma

hipersecreção mucosa, disfunção ciliar, mudanças na composição e

propriedades biofísicas de secreções das vias aéreas (DHAR, 2013; ROGERS,

2007).

A partir disso, a otimização do estudo analítico envolvendo a secreção

do vermelho de fenol como indicador da expectoração se faz importante para o

mapeamento da atividade de tais fármacos de modo preciso e exato,

contribuindo para as pesquisas farmacológicas pré-clínicas.

124

7 CONCLUSÕES

Após a exposição dos dados, foi demonstrado que o LOO possui

atividade espasmolítica em traqueia isolada de cobaia, com maior potência

para contrações induzidas por histamina. Seu mecanismo de ação pode estar

envolvido com a ativação de guanilil ciclase solúvel (GCs) o que permitiria um

aumento nas concentrações de GMPc, regulação da atividade de PKG e

fosforilação dos canais para potássio sensíveis a voltagem (Kv) e os modulados

por cálcio (KCa).

O LOO também apresentou ação antitussígena, nas doses de 100 e 300

mg/kg, reduzindo a frequência de tosse, sendo a dose de 300 mg/kg capaz de

aumentar a latência (em segundos) para primeira tosse. No entanto, foi

observado que a dose de 300 mg/kg de LOO modificou a coordenação motora

do animal por uma atividade miorrelaxante devido a uma provável ação do óleo

sobre o sistema nervoso central, relacionada a uma atividade sedativa ou

neurotóxica.

A ação sobre a mobilidade foi confirmada na dose de LOO 300 mg/kg,

através do modelo experimental do rota-rod, enquanto que a atividade

ansiolítica foi confirmada na mesma dose para o modelo do campo aberto,

mostrando que os componentes de LOO promovem atividade miorrelaxante e

ansiolítica/sedativa.

O aperfeiçoamento do protocolo experimental para avaliação da

atividade expectorante utilizando o indicador vermelho de fenol, foi realizado e

validado de forma a utilizar o LOO com os melhores parâmetros analíticos,

sendo possível o prosseguimento dos testes farmacológicos que permitam uma

avaliação precisa e exata do vermelho de fenol no LBA.

125

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ANEXO A – Parecer do CEUA/UNIVASF

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ANEXO B – Atualização do parecer CEUA/UNIVASF

Documents

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO … · A asma é considerada uma doença inflamatória crônica caracterizada por ... be involved with the NO/GCs/GMPc/PKG signal transduction