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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA
SAÚDE E BIOLÓGICAS
Talyta Torres Vianez
VIABILIDADE DOS RAIOS X NO DESENVOLVIMENTO DA TÉCNICA
DO INSETO ESTÉRIL PARA ESTERILIZAÇÃO DO Aedes aegypti
(LINNAEUS, 1762) (DIPTERA: CULICIDAE)
PETROLINA - PE
2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE E
BIOLÓGICAS
Talyta Torres Vianez
VIABILIDADE DOS RAIOS X NO DESENVOLVIMENTO DA TÉCNICA
DO INSETO ESTÉRIL PARA ESTERILIZAÇÃO DO Aedes aegypti
(LINNAEUS, 1762) (DIPTERA: CULICIDAE)
Dissertação apresentada à Universidade Federal do
Vale do São Francisco – UNIVASF, Campus Petrolina,
como requisito da obtenção do título de Mestre em
Ciências, na linha de pesquisa em Biodiversidade,
Tecnologia e Recursos Naturais.
Orientadora: Profa. Dra. Márcia Bento Moreira
Co-orientador: Eduard Montgomery Costa
PETROLINA - PE
2018
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da UNIVASF. Bibliotecário: Fabio Oliveira Lima CRB-4/2097.
Vianez, Talyta Torres.
V615v Viabilidade dos raios x no desenvolvimento da técnica do inseto estéril para esterilização do Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) / Talyta Torres Vianez. – Petrolina, 2018. xv, 68 f.: il.: 29 cm.
Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde e Biológicas) –
Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina, Petrolina – PE, 2018.
Orientador: Profª. Drª. Márcia Bento Moreira. 1. Aedes aegypti. 2. Controle vetorial. 3. Radiação Ionizante. 4. Esterilização. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.
CDD 614.4323
DEDICATÓRIA
Agradecimento mais que especial só poderia ser dedicado ao meu amigo,
companheiro, cúmplice, amor, meu marido Augusto Bentinho, por acreditar em mim,
muitas vezes quando nem eu mais acreditava, por segurar a minha mão em todos
os momentos, pela paciência e compreensão. Sou grata por todo gesto de carinho e
sorriso.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Aos meus pais, José Vianez e Romilda Torres, pelo amor, cuidado, educação
e compreensão da minha ausência em muitos momentos. É incomensurável o amor
e admiração que sinto por vocês.
A minha irmã, Renata Vianez, pelo incentivo diário, sempre querendo o meu
melhor e pelo grandioso presente, minha sobrinha, Raíssa Vianez.
Agradeço a minha amável, serelepe e companheira fiel, Paçoca. Infelizmente
ela não sabe ler, mas quero que todos saibam da sua importância na minha vida,
principalmente durante o período do mestrado. Ela foi o melhor presente que o
mestrado me deu, é um amor recíproco inexplicável.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal do Vale do São Francisco – UNIVASF por ter
permitido a criação do Programa de Pós-Graduação Ciências da Saúde e Biológicas
(PPGCSB) do qual fiz parte.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes),
por ter recomendado o PPGCSB e pelo auxílio financeiro no desenvolvimento desta
pesquisa concedendo a mim uma bolsa de nível mestrado.
Ao Programa Pós-Graduação Ciências da Saúde e Biológicas, pelo apoio e
suporte.
À Dra. Márcia Bento Moreira, por aceitar mais um desafio como orientadora,
pelo estímulo e alegria.
Meus afetuosos agradecimentos à família Biofábrica Moscamed Brasil,
principalmente ao Dr. Jair Virgínio, pela confiança e concessão para o
desenvolvimento do trabalho. Agradecimentos especiais para quatro incríveis
pesquisadores que tenho admiração e afeto: Michelle Pedrosa, tudo que aprendi foi
graças a sua motivação, conhecimento partilhado de vida e de pesquisa desde a
iniciação científica, serei eternamente grata; a Maylen Gómez pela colaboração e de
ensinamentos de estatística, fundamentais para que eu conseguisse finalizar o
trabalho; a Luiza Garzieira pelo apoio, colaboração e risadas contagiantes; ao Danilo
Carvalho, também pela colaboração e ensinamentos, grande mestre e grande
coração. Aos meus companheiros de laboratório, histórias e muitas risadas: Aline
Taiane, pela sua dedicação em poder me ajudar no decorrer dos experimentos,
grata por toda o auxílio e companhia; Miriam Brito, por sempre me socorrer com
materiais, lote, etc.; Suenny Tupiná, sempre disposta a ajudar, risonha e com muito
assunto pra conversar ; Amanda Cunha e Aline Campos, mais conhecida como rica,
pela amizade, conselhos, colaboração e companhia, Nilton de Souza, por toda
disponibilidade e paciência para a efetuação das irradiações, Profa. Dra. Margareth
Capurro; Joseph Soeiro, Pedro Barros, Seu Luiz, Anna Souza, Carla Raquel, Dona
Sandra enfim, os integrantes do setor de operações, administração e demais que
fazem essa empresa de sucesso.
Aos meus amigos, irmãos que a vida me deu, que me alegram, brincam me
incentivam, me dão forças e que confia em mim, um abraço carinhoso em Rui
Alencar, Tarcísio Dourado, Ruana Sandes, Anette Viana, Uêdija Dias, Luiz Dantas,
Vitória Jacó, Juciara Lima. A Dairan Santos e Thaís Leal pela minha afilhada Cecília
Leal, Michele Costa, pelo incentivo de ir à biblioteca todos os dias, Dieggo Lenno,
Ana Carla Santos, Camila Siqueira, Amanda Guimarães, Ilka Mendes, Hellen Silva
entre tantos outros que irão me perdoar caso não tenha lembrado nesse momento,
mas todos estão presentes no meu coração.
“A alegria não chega apenas no encontro do achado, mas faz parte do processo da
busca. E ensinar e aprender não pode dar-se fora da procura, fora da boniteza e da
alegria.”
Paulo Freire.
RESUMO
No Brasil o Aedes aegypti é a principal espécie implicada nos ciclos de transmissão
dos vírus Dengue, Febre Amarela (urbana), Chikungunya e Zika e seu controle ainda
é desafiador. Os métodos tradicionais de controle do vetor têm sido considerados
pouco efetivos e a Técnica do Inseto Estéril (TIE), comprovadamente eficaz no
controle de pragas agrícolas, tem sido apontada como alternativa para
complementar o controle integrado. A TIE baseia-se na criação massiva da espécie-
alvo, na esterilização através de radiação (Gama ou X), com posterior liberação na
área a ser tratada. O intuito é que os mosquitos irradiados inviabilizem a formação
da prole. O objetivo do presente estudo foi avaliar o uso de raios X no controle
reprodutivo do Ae. aegypti. Pupas macho de Ae. aegypti foram irradiadas com as
doses: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 65 e 70 Grays (Gy) sendo mantido um grupo controle
para cada processo. Parâmetros melhor idade para irradiação, mortalidade de
pupas, taxa de emergência, longevidade dos adultos, fecundidade e esterilidade
foram avaliados. Os resultados evidenciaram que a idade ideal para a esterilização é
com pupas entre 30 e 36 horas. A sobrevivência média de 96,1% dos machos
adultos irradiados nas doses entre 10 e 65 Gy foi no 10° dia, mas a mesma
porcentagem de sobrevivência de indivíduos irradiados com 70 (Gy) só foi 6°dia. A
irradiação não influenciou a fecundidade de fêmeas que copularam com machos
irradiados. Machos irradiados com 60, 65 e 70 Gy foram capazes de reduzir a zero a
fecundidade de fêmeas selvagens. Fêmeas irradiadas com 60, 65 e 70 Gy não
foram capazes de produzir ovos. Os resultados obtidos neste trabalho
demonstraram que é possível atingir a esterilidade em machos de A. aegypti
utilizando raios-X, sem comprometer a qualidade dos insetos.
Palavras-chave: Aedes aegypti. Radiação Ionizante. Esterilização. Controle
Vetorial.
ABSTRACT
In Brazil the Aedes aegypti is the main species implicated in the transmission cycles
of Dengue, Yellow Fever (urban), Chikungunya and Zika viruses and its control is still
challenging. The traditional methods of vector control have been considered
ineffective, and the Sterile Insect Technique (SIT), proven to be effective in the
control of agricultural pests, has been suggested as an alternative method to
complement the integrated control. The SIT is based on the massive creation of
target species, sterilization by radiation (Gamma or X), with subsequent release of
sterilized species in the area to be treated. The intention is that irradiated mosquitoes
will not be able to produce offspring. The objective of the present study was to
evaluate the use of X - rays in the reproductive control of Ae. aegypti. Male Ae.
aegypti pupae were irradiated with the doses: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 65 and 70
Grays (Gy) and a control group was maintained for each process. Parameters such
as of the best age for irradiation, pupae mortality, emergency rate, adult longevity,
fecundity and sterility were evaluated. The results showed that the ideal age for
sterilization is between 30 and 36 hours after the pupae emergence. The mea
(average)survival rate of 96.1% of adult males irradiated at the in between 10 and 65
Gy doses was on the 10th day, but the same survival percentage of individuals
irradiated with 70 (Gy) was on the 6th day. Irradiation did not influence the fecundity
of females that copulated with irradiated males. Males irradiated with 60, 65 and 70
Gy were able to reduce the fecundity of wild females to zero. Females irradiated with
60, 65 and 70 Gy were not able to produce eggs. The results obtained in this work
demonstrated that it is possible to achieve sterility in males of A. aegypti using X-rays
without compromising insect quality.
Keywords: Ionizing radiation. Sterilization. Vector Control.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fases do ciclo biológico de Aedes aegypti. Em sentido anti-horário: Fêmea
adulta; Ovo; Larva (L4); Pupas (macho e fêmea); Macho adulto. Fonte: elaborado
pela autora. ............................................................................................................... 21
Figura 2. Gaiola de PVC para colônia bissexual de Ae. aegypti. .............................. 30
Figura 3. Sistema de alimentação artificial sanguínea: (A) sangue ovino ou caprino;
(B) Parafilm®; (C) placa de alumínio; (D) placa de alumínio revestida com Parafilm®
e preenchida com sangue; (E) bolsa térmica de trigo sobre a placa de alumínio; (F)
Gaiola de PVC. Fotos: da autora. .............................................................................. 31
Figura 4. Sistema para oviposição das fêmeas: (A) papel filtro; (B) recipiente plástico
com água filtrada e (C) unidade de oviposição (UO). Foto: da autora. ..................... 32
Figura 5. Materiais para eclosão das larvas: (A) Ovos; (B) Pode de vidro com água;
(C) momento da eclosão das larvas; (D) larvas (L1) em bandeja. Fotos: da autora. . 33
Figura 6. Criação larval: (A) carrinho com bandejas para criação e (B) bandeja com
larvas e alimentação larval. Fotos: da autora. ........................................................... 33
Figura 7. (a) Separador de pupas e larvas Hock's Machine. (b) Gradiente trifásico
formado durante a separação. .................................................................................. 34
Figura 8. Acondicionamento para irradiação. (A) Placa de cultura; (B) Placa com
pupas ao centro; (C, D e E) Protótipo de isopor; (F, G e H) Posicionamento do
protótipo no recipiente de irradiação; (I) Posicionamento das placas para a
esterilização; (G, H, I, J, K, L e M) Disposição das placas de cultura na parte central
do protótipo de isopor e (N) Caníster de irradiação fechado. Fotos: da autora. ........ 35
Figura 9. Máquina de raios – x , modelo RadSource-2400. ...................................... 36
Figura 10. (A) recipiente plástico com amostras de pupas; (B) gaiola BugDorm®; (C)
Disposição das gaiolas dos tratamentos e controle. Fotos: da autora. ..................... 36
Figura 11. Emergência e alimentação sanguínea. (A) Pote para emergência dos
adultos; (B) Gaiola com fêmeas e alimentação artificial; (C) fêmeas no momento da
alimentação. Fotos: da autora. .................................................................................. 38
Figura 12. Passos da preparação dos tubos de oviposição: (A) tubo vazio; (B)
chumaço de algodão com água filtrada; (C e D) inserção do substrato de oviposição;
(E) inserção da fêmea; (F) individualização de fêmeas. Fotos: da autora. ................ 39
Figura 13. Despigmentação do córion: (A) Ovo fechado; (B) Ovo despigmentado
com embrião e (C) ovo despigmentado sem embrião. Fotos: da autora. .................. 40
Figura 14. (A) Pote para emergência e avaliação da sobrevivência; (B) Sugador. ... 41
Figura 15. Peso médio de pupas de Aedes aegypti não irradiadas (controle) e
irradiadas com 65 Gy com 12, 24 e 36 horas de formação do pupário. T=27±1°C,
UR=60±10%, fotofase 14 h. As colunas representam a média dos tratamentos ± erro
padrão. ...................................................................................................................... 43
Figura 16. Taxa de emergência (%) de mosquitos irradiados na fase de pupa com
12, 24 e 36 horas de formação do pupário. T= 27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h.
As colunas representam a média dos tratamentos ± erro padrão. Colunas com letras
diferentes diferem entre si (Teste de Tukey; p˂ 0,05). .............................................. 44
Figura 17. Taxa de sobrevivência (%) dos mosquitos irradiados no terceiro, quinto e
sétimo dia de avaliação. T=27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h. As colunas
representam a média dos tratamentos ± erro padrão para um mesmo dia de
avaliação após a emergência. Colunas seguidas por letras diferentes diferem entre
si (Teste de Tukey; p˂ 0,05). ..................................................................................... 45
Figura 18. Taxa de emergência de adultos de Aedes aegypti expostos a diferentes
doses de radiação X. T=27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h. As colunas
representam a média dos tratamentos ± erro padrão. .............................................. 46
Figura 19. Taxa de sobrevivência (%) dos mosquitos irradiados no décimo dia de
avaliação. T=27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h. As colunas representam a média
dos tratamentos ± erro padrão. Colunas com letras diferentes diferem entre si (Teste
de Tukey; p˂ 0,05). ................................................................................................... 47
Figura 20. Taxa de sobrevivência diária de Ae. aegypti do grupo controle e irradiados
após emergência. ...................................................................................................... 48
Figura 21. Curva de esterilidade de raios X para Ae. aegypti. (A) Taxa média de
eclosão de ovos em função da dose; (B) Percentual de esterilidade em função das
doses. Os pontos contendo letras distintas são estatisticamente diferentes (p<0,05).
.................................................................................................................................. 51
Figura 22. Representação gráfica da relação Probit / dose de radiação X obtida do
cruzamento entre fêmeas selvagens e machos de Ae. aegypti expostos a diferentes
doses de radiação X. Limites de confiança de 95% para dose de raios X. ............... 51
Figura 23. Taxa de emergência de fêmeas expostas à diferentes doses de
irradiação. T=27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h. .................................................. 52
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Fecundidade média das fêmeas que copularam com machos dos grupos
controle e tratamentos. T=27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h................................ 49
Tabela 2. Taxa de eclosão de ovos provenientes da cópula de machos da colônia e
não irradiados; número de ovos sem eclosão das larvas (ovos fechados) e
porcentagem de ovos com presença de larvas. T=27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14
h. ............................................................................................................................... 50
Tabela 3. Equação de Probit para as irradiações. ..................................................... 52
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 16
2. REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................. 19
2.1. Anatomia, ecologia, distribuição e reprodução de Aedes aegypti ................ 19
2.2. Estratégias de controle de Ae. aegypti ......................................................... 21
2.3. Inovações para o controle vetorial ............................................................... 23
2.4. A importância da irradiação na TIE .............................................................. 25
2.5. Adequação e efeitos da Técnica do Inseto Estéril em mosquitos ................ 26
3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 28
3.1. Objetivo Geral .............................................................................................. 28
3.2. Objetivos Específicos ................................................................................... 28
4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 29
4.1. Local de Estudo ........................................................................................... 29
4.2. Material Biológico ......................................................................................... 29
4.2.1. Origem dos insetos ................................................................................ 29
4.2.2. Criação e manutenção das colônias de Ae. aegypti .............................. 29
4.2.3. Separação de pupas .............................................................................. 33
4.3. Determinação da idade adequada da pupa de Ae. aegypti para esterilização
35
4.4. Determinação da dose esterilizante para Ae. aegypti .................................. 37
4.4.1. Indução de esterilidade de fêmeas selvagens de Ae. aegypti ............... 37
4.4.2. Avaliação da Sobrevivência ................................................................... 40
4.4.3. Efeitos da irradiação em fêmeas ........................................................... 41
4.5. Análises Estatísticas .................................................................................... 42
5. RESULTADOS ................................................................................................... 43
5.1. Determinação da idade de pupas de Ae. aegypti para esterilização ............ 43
5.1.1. Peso do pupário ..................................................................................... 43
5.1.2. Mortalidade de pupas durante a irradiação ........................................... 43
5.1.3. Taxa de Emergência .............................................................................. 43
5.1.4. Taxa de Sobrevivência .......................................................................... 44
5.2. Determinação da dose esterilizante para Ae. aegypti .................................. 45
5.2.1. Mortalidade de pupas durante a irradiação ........................................... 45
5.2.2. Emergência de adultos .......................................................................... 45
5.2.3. Sobrevivência dos insetos ..................................................................... 46
5.2.4. Avaliação de Fecundidade e esterilidade .............................................. 49
5.2.5. Efeitos da irradiação em fêmeas de Ae. aegypti ................................... 52
5.3. Taxa de emergência..................................................................................... 52
5.4. Fecundidade e fertilidade ............................................................................. 53
6. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 54
7. CONCLUSÕES .................................................................................................. 60
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 61
16
1. INTRODUÇÃO
Existem cerca de 140 arbovírus que causam doenças em humanos, as
infecções causadas por eles podem ser fatal assintomática ou fulminante. Pessoas
infectadas apresentam sintomas que se caracterizam como uma doença febril e
sistêmica, febre hemorrágica e doença neurológica invasiva. As doenças
emergentes causadas por arbovírus foram consideradas controladas ou de pouca
importância. Porém, nas últimas décadas, houve aumento significante do número de
doenças causadas por infecções por arbovírus (VASILAKIS; GUBLER, 2016).
Arbovírus (de “Arthropod Borne Viruses”) é o termo utilizado para definir vírus
que realizam parte do seu ciclo de replicação no interior de artrópodes. Os arbovírus
podem ser transmitidos ao homem por diversas espécies de artrópodes, como por
exemplo, mosquitos dos géneros: Aedes (Aedes aegypti, e Aedes albopictus) e
Culex (Culex quinquefasciatus ou outros insetos que possuam o hábito
hematofágico) (LOPES; NOZAWA; LONHARES et al., 2014.
Dengue, chikungunya e Zika são atualmente, as arboviroses de maior
repercussão em saúde pública no Brasil, destacando a zika que no ano de 2015,
causou numerosos casos de microcefalia, principalmente no estado de Pernambuco
(MS, 2017). As arboviroses atingem principalmente populações que habitam regiões
tropicais, onde condições ambientais como temperatura, umidade e condições
socioeconômicas favorecem a proliferação do vetor (TAUIL, 2002; RIVERA;
RODRÍGUEZ; MELÉNDREZ, 2012; HONORIO, 2015).
Aedes aegypti é a principal espécie implicada nos ciclos de transmissão dos
vírus Dengue, Febre Amarela (urbana), Chikungunya e Zika (TAUIL, 2001; WHO,
2016). Esta espécie tem origem africana e pertence à família Culicidae. Este
mosquito está bem adaptado ao ambiente urbano e possui hábitos diurnos e
comportamento antropofílico. Somente a fêmea na fase adulta em seus ciclos
reprodutivos é hematófaga e é neste momento que pode ocorrer a transmissão do
vírus ao homem. A alimentação sanguínea está relacionada à produção e maturação
dos ovos, os quais podem ser depositados em criadouros naturais (ocos de árvores,
folhas e cascas de plantas) ou artificiais (vasos de plantas, potes, caixa d’água) que
contenham água parada e baixo teor de matéria orgânica, para o desenvolvimento
de suas formas jovens (larvas e pupas) (FORATTINI, 2002).
17
As ações de controle vetorial têm como finalidade reduzir a densidade
populacional da espécie-alvo e minimizar, ou mesmo interromper seu contato com o
homem (MS, 2009). Dois métodos de controle são amplamente empregados contra
o mosquito: o mecânico, dirigido à eliminação de criadouros temporários reais e
potenciais e o químico, que utiliza tanto inseticidas voltados ao tratamento focal dos
criadouros mais estáveis (frequentemente representados pelos grandes
reservatórios de água potável), como produtos de ação larvicida e adulticidas, de
efeito residual, voltados para o tratamento perifocal em pontos estratégicos para a
reprodução do mosquito (e.g. ferro-velho, cemitério, borracharia, etc.) (MANRIQUE-
SAIDE et al.,2015; ZARA et al., 2016).
Diante dos desafios de controle vetorial e do cenário de surtos e epidemias
destas arboviroses, agravado pela expansão destes arbovírus em todo o mundo, é
inevitável o estudo e a adoção de estratégias específicas, com investimentos em
métodos adequados, que acarretem em ações efetivas e sustentáveis das redes de
vigilância (ZARA et al., 20016).
Várias tecnologias diferentes mecanismos de ação têm sido desenvolvidas e
apontadas como opções para complementar o controle do Ae. aegypti. Uma
alternativa considerada promissora é a Técnica do Inseto Estéril -TIE (Sterile Insect
Technique- SIT (KNIPLING, 1955) (ZARA et al., 20016). A TIE é uma técnica de
controle genético, espécie-específica, baseada na liberação em massa de machos
estéreis da espécie-alvo, em uma área preestabelecida. O objetivo central da técnica
é favorecer a cópula destes machos estéreis com as fêmeas selvagens, para
inviabilizar suas progênies e desta forma controlar o crescimento populacional do
mosquito, através do controle reprodutivo (KNIPLING, 1955; ROBINSON, 2002;
WILKE et al., 2009). A esterilização é obtida a partir da exposição de indivíduos
machos às radiações gama ou X ou aos agentes quimioesterilizantes (HELINSKI,
2009).
A TIE tem sido comprovadamente eficaz no controle de pragas agrícolas,
como a mosca-das-frutas (Ceratitis capitata), atuando como alternativa à aplicação
de inseticida (FERREIRA; CHIARAVALLOTI NETO, 2007), e seu sucesso tem
levado a criação de biofábricas de machos estéreis em outros países como EUA,
México, Brasil e Inglaterra (PARANHOS, 2005). Nas últimas décadas, seu potencial
para o controle de insetos vetores tem sido avaliado com resultados promissórios
(CURTIS et al., 1982; PETERSEN et al., 1977; BENEDICT; ROBINSON, 2003;
18
DYCK 2005; BELLINI, et al. 2013). Técnicas inovadoras relacionadas à esterilização
por meio de irradiação tem se mostrado como uma alternativa eficaz para a redução
da população de mosquitos em centros urbanos (BALESTRINO et al., 2010).
Contudo, diversos requisitos precisam ser preenchidos até que uma técnica
seja considerada eficiente no controle vetorial. É necessário, por exemplo, que a
tecnologia seja eficaz, segura, aplicável em larga escala e em tempo hábil, seja
compatível com as estratégias já utilizadas, e que apresente risco mínimo de
consequências negativas para o meio ambiente e para a população (ZARA et al.,
2016).
Apesar de existirem trabalhos que demonstrem o uso de machos esterilizados
por raios X para o controle de vetores (YAMADA et al., 2014), ainda não estão
disponíveis informações que demonstrem sua utilização para o controle de Ae.
aegypti. Diante deste contexto, são necessários estudos que revelem se a radiação
X na TIE agrega vantagens sobre o ponto de vista de produção dos indivíduos
estéreis e se a técnica, como um todo, é efetiva para o controle de Ae. aegypti.
19
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. Anatomia, ecologia, distribuição e reprodução de Aedes aegypti
Pertencente à família Culicidae, o Aedes aegypti é conhecido popularmente
como mosquito da dengue. No ano de 1762, Linneaus descreveu a primeira
ocorrência de Ae. aegypti no Egito. Apesar de ter sido originalmente encontrado na
África, esta espécie tem distribuição cosmopolita e sua dispersão pelo mundo está
associada ao homem. Acredita-se que o ingresso do mosquito no Brasil ocorreu
durante o transporte de escravos, no interior de grandes navegações, no período da
colonização do país (CONSOLI; LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994; FORATTINI,
1996; ZARA et al., 2016).
Os mosquitos Ae. aegypti são mais facilmente encontrados em regiões
tropicais e subtropicais, onde encontram condições climáticas ideais . No entanto, há
registro de ocorrências desta espécie em regiões de alta latitude, como no México e
Índia (OPS; 2004).
A sobrevivência da espécie está associada à ocorrência de condições
favoráveis para sua multiplicação, causada pelo crescimento populacional e
territorial acelerado e desordenado das cidades concomitantemente com a baixa
infraestrutura urbana e educacional. Diante desse cenário, o mosquito, ao longo dos
anos desenvolveu comportamentos característicos que permitem a sua reprodução
em ambientes urbanos, tais qual o sinantropismo e a antropofilia (NATAL, 2002;
COELHO, 2008; CRISTOPHERS, 1960; ZARA et al., 2016).
Os criadouros naturais do mosquito correspondem a flores ornamentais como
bromélias, cavidade de árvores, buracos em rochas e internódios de bambu e os
principais criadouros artificiais são recipientes a céu aberto com capacidade de reter
água. Estes recipientes podem ser oriundos de descarte inadequado (garrafas pet,
pneus usados, etc) ou são utilizados para o armazenamento de água para
abastecimento humano (tanques, caixas d‘agua, dentre outros) (CONSOLI;
OLIVEIRA, 1994; FORATTINI, 2002).
Durante um ciclo gonadotrófico, as fêmeas de Ae. aegypti conseguem se
alimentar de sangue por diversas vezes, o que leva a uma alta capacidade de
disseminação de vírus na população (CONSOLI; LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994;
FORATTINI, 1996; NATAL, 2002).
20
O período de desenvolvimento desde a fase de ovo até a emergência do
mosquito adulto varia entre 5 e 13 dias. Porém, essa duração é influenciada pelas
condições ambientais, como umidade relativa do ar e temperatura, ou por
indisponibilidade de alimento. As fases imaturas (larvas e pupas) se desenvolvem
exclusivamente na água e os ovos, em sua maioria, não são colocados diretamente
na superfície da água, mas sim na superfície da parede do criadouro (CONSOLI;
LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994; NATAL, 2002).
Os ovos de Ae. aegypti são caracterizados pelo seu formato alongado com
aproximadamente 1 mm de comprimento. São colocados individualmente pelas
fêmeas em um ou mais criadouros, as fêmeas não ovipositam toda sua reserva de
ovos em apenas um lugar, elas escolhem locais diferentes para garantir maior
distribuição de progênies e reduzir a competição entre as larvas (HARRINGTON;
EDMAN, 2001). Além disso, os ovos de espécies do gênero Aedes possuem uma
particularidade conhecida como “quiescência”, que corresponde à resistência à
dissecação, podendo permanecer viáveis por mais de 300 dias em locais com
ausência de água. Nesta condição, as larvas somente irão eclodir após o contato
dos ovos com a água. Essa condição permite o transporte de ovos para outros
locais, bem como dificulta a execução das estratégias de controle do mosquito
(CONSOLI; LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994; FORATTINI, 2002).
Durante a fase larval, o inseto passa por quatro estádios de desenvolvimento
(L1 a L4). O período de cada fase está intimamente ligado às condições ambientais,
disponibilidade de alimento e densidade de larvas no criadouro. Completado o
quarto estádio de desenvolvimento, tem início o estágio de pupa, fase na qual
acontece a metamorfose do estágio larval para o adulto (Figura 1). A fase de pupa
dura entre dois e três dias, mas há a possibilidade de variação, de acordo com
fatores bióticos e abióticos (CONSOLI; LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994;
FORATTINI, 1996).
21
Figura 1. Fases do ciclo biológico de Aedes aegypti. Em sentido anti-horário: Fêmea adulta; Ovo; Larva (L4); Pupas (macho e fêmea); Macho adulto. Fonte: elaborado pela autora.
A fase alada ou terrestre corresponde ao mosquito adulto, ou imago, capaz de
se reproduzir, garantindo-se dessa forma a perpetuação da espécie. Os mosquitos
adultos são relativamente pequenos, em média com 0,5 cm de comprimento, e
apresentam coloração enegrecida com listras brancas distribuídas pelo corpo.
Fêmeas e machos possuem a mesma coloração e pigmentação branca na forma de
listras, no entanto se diferenciam pelo tamanho corporal, palpos maxilares e tipo de
antenas. O macho se diferencia da fêmea por apresentar antenas plumosas e
palpos longos (CONSOLI; LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994; FORATTINI, 1996).
2.2. Estratégias de controle de Ae. aegypti
O direcionamento do controle do Ae. aegypti consiste na avaliação dos
fatores que influenciam o crescimento da população do mosquito, como condições
climáticas, estrutura do saneamento urbano, comportamentos socioculturais da
comunidade que reside nos centros urbanos, lixo e desmatamento (DONALISIO;
GLASSER, 2002; COELHO, 2008).
O A. aegypti foi considerado erradicado no Brasil na década de 50, porém foi
reintroduzido nos anos 60. Após nova erradicação da espécie em 1973, a espécie foi
novamente introduzida (1976) (CATÃO; GUIMARÃES, 2009).
22
A partir de 1996, foi colocado em prática o primeiro programa para a
erradicação do mosquito no Brasil, conhecido como Plano de Erradicação do Ae
aegypti (PEAe), proposto pelo Ministério da Saúde. O PEAe tinha como objetivo
reduzir a incidência da dengue no país. Apesar do esforço empregado pelas
entidades governamentais de saúde, o objetivo do programa não foi alcançado e a
dengue se tornou ainda mais preocupante, pois o número de casos e a infestação
do mosquito continuaram aumentando (BRAGA; VALLE, 2007; ZARA et al., 2016).
Cinco anos mais tarde, o Plano de Intensificação de Ações de Controle de Dengue
(PIACD) foi implantado com o mesmo objetivo do PEAe, porém, em um cenário
caracterizado pelo surgimento das formas graves e a disseminação acelerada da
dengue com sorotipo 3. Em 2001, mais um plano foi elaborado: Plano Nacional de
Controle da Dengue (PNCD) e desde então, tem sido realizado em parceria com a
comunidade e estado, ambos responsáveis para por em prática o controle integrado
do vetor (MS, 2002; BRAGA; VALLE, 2007; MS, 2009; FIGUEIRÓ, 2010; ZARA et
al., 2016).
O controle integrado do vetor consiste em ações em conjunto aplicadas contra
mosquitos vetores. Este controle é empregado como um sistema que engloba todos
os métodos convencionais para a redução populacional do inseto, vinculando
conhecimento de manejo para o sucesso na supressão do vetor. Os vários tipos de
controle desenvolvidos, de acordo com o PNCD, podem ser categorizados em
mecânicos, biológicos e químicos (LHOSTE, 1966).
A ação mecânica ou física consiste em reduzir ao máximo o contato do
mosquito com a população humana, e está relacionada com a eliminação dos
possíveis criadouros, retirada de água ou limpeza regular em reservatórios de água
como caixa d’água, tonéis. A utilização de redes ou telas em portas e janelas pode
impedir o aparecimento do mosquito em área intradomiciliar (DONALISIO;
GLASSER, 2002; MS, 2009).
A utilização de inseticidas que exterminam mosquitos na fase adulta
(adulticidas) e larval (larvicidas) é a principal forma de controle químico. São
utilizados produtos químicos com ação neurotóxica, inibidores de crescimento e
síntese protéica (BRAGA; VALLE, 2007). A utilização de produtos químicos no
controle do mosquito possibilita a seleção de indivíduos resistentes à inseticidas,
podendo influenciar negativamente o controle do vetor e os ecossistemas, já que o
23
controle químico não é específico apenas para o Ae. aegypti (WHO, 1996; ZARA et
al (2016).
Por fim, o controle biológico compreende o uso de peixes larvófagos a
utilização Bacillus turigiensis israelenses (BTI). O BTI é conhecido como um
inseticida biológico que tem como principal agente a bactéria Bacillus turigiensis
israelenses, essa bactéria é inofensiva para humanos e animais, mas é letal para o
mosquito. São encontradas diversas formulações do BTI, como comprimidos
grânulos ou líquido. O produto é adicionado à água parada ou a recipientes que não
podem ser esvaziados ou cobertos (DONALISIO; GLASSER, 2002).
2.3. Inovações para o controle vetorial
Apesar da existência das mais variadas e distintas formas de controle do
mosquito, a maioria dos resultados são considerados insatisfatórios. Assim, novas
técnicas têm sido avaliadas para contribuir com a diminuição da população dos
mosquitos, dentre elas: controles naturais (como óleos essenciais de plantas),
genético ou autocida (DONALÍSIO; GLASSER, 2002; WILKE et al., 2009;
BALESTRINO et al., 2010; PEREIRIA, 2014).
Estudos de novos métodos complementares ao manejo integrado do vetor
vêm crescendo ao longo dos anos. A busca por extratos vegetais ou componentes
naturais, eficazes no controle de pragas, tem aumentado, como uma alternativa de
controle químico. Já se sabe que combinações de compostos químicos em algumas
espécies vegetais podem gerar a redução no desenvolvimento da larva, sem ser
prejudicial ao ambiente. Por exemplo, estudos recentes indicaram que extratos das
cascas de limão e laranja apresentaram potencial larvicida (BENJAMIN et al, 2005;
BOYCE et al., 2013; SANTOS et al., 2011; ZARA et al., 2016).
2.3.1. Técnica do Inseto Estéril (TIE)
Em meados de 1930, o entomologista Edward Knipling idealizou a Técnica do
Inseto Estéril - TIE (em inglês, Sterile Insect Technique – SIT) para o controle da
mosca-varejeira, Cochiliomyia hominivorax. Na época, a espécie era reconhecida
como um grande problema para a bovinocultura nos Estados Unidos.
Posteriormente, Knipling propôs a utilização de machos estéreis de C. hominivorax,
24
com a intenção de controlar a população do inseto. Em 1955, Knipling formalizou a
importância de liberação de inseto estéril para controlar populações de pragas com
importância agrícola. Esse tipo de controle passou a ser reconhecido como controle
genético ou autocida (WALDER, 2000; MALAVASI; ZUCCHI, 2000; IMPERATO;
RAGA, 2015). Segundo Robinson (2002), a TIE se baseia na criação em massa de
insetos machos e liberação desses na área a ser tratada, assim, fêmeas selvagens
estéreis que copulam com machos estéreis não terão prole viável.
Formas alternativas de controle genético, baseados na TIE, mas que evitem
ou reduzam o uso de radiação, têm sido desenvolvidas (ZARA et al., 2016). Thomas
et al. (2000) propuseram um mecanismo para liberação de indivíduos de
Dhrosophila melanogaster, que carregam um gene letal dominante (release of insect
carrying a dominant letal gene – RIDL). Este gene leva a uma expressão acentuada
da proteína tTA, que quando acumulada, acarreta na morte do indivíduo (ALPHEY,
2002).
Entretanto, a expressão do gene de letalidade é inibida quando o indivíduo
estiver na presença de tetraciclina, substância com poder antibacteriana (WILKER,
2009). O sistema foi adaptado para o mosquito Ae aegypti, sendo que podem ser
criados normalmente em laboratório na presença do antibiótico e (PHUC et al, 2007;
WILKER, 2009). Em campo, machos de Ae. aegypti transgênicos, ao copular com
fêmeas selvagens, transferem o gene letal para a progênies. As larvas eclodem,
mas na ausência da tetraciclina, morrem antes de atingirem a fase adulta
(BENEDICT; ROBINSON, 2003; MOÑOZ et al., 2004; CARVALHO, 2011). Usando
tecnologia transgênica, Carvalho et al. (2015) demonstrou em seu estudo que a
liberação de machos transgênicos no bairro mandacaru (Juazeiro-BA) foi capaz de
reduzir cerca de 70% da população de Ae. aegypti.
Outra estratégia capaz de inviabilizar a prole é infectar os mosquitos de Ae.
aegypti com a bactéria gram-negativa Wolbachia, , encontrada na maioria dos
invertebrados e que não é nociva para alguns animais e ao homem,. A bactéria pode
provocar feminização, partenogênese e incompatibilidade citoplasmática total, o que
causa a esterilização do mosquito (WERREN; BALDO; CLARK, 2008; McMENIMAN
et al, 2009; WALKER, 2011; OLIVEIRA; MOREIRA, 2012). Há relatos da capacidade
da bactéria em relação ao bloqueio na transmissão de arboviroses, isso ocorre pela
competição por aminoácidos entre o mosquito infectado e a bactéria. Estudos iniciais
em relação à liberação de mosquitos infectados com Wolbachia foram realizados na
25
Austrália em 2008. A eficiência dessa tecnologia está sendo avaliado no Brasil como
também no Vietnã (WU et al., 2004; SINKINS, 2013; ZARA et al, 2016). Com intuito
de minimizar o risco de substituição da população de mosquitos pelo uso da
Wolbachia, está sendo testada a combinação da técnica do inseto estéril e de
insetos incompatíveis. Essa combinação consiste em infectar os mosquitos com a
bactéria e posteriormente submetê-los a exposição à radiação, que pode ser
radiação gama ou X (ZHANG, 2015).
Alguns fatores são considerados importantes para o sucesso da TIE, como:
baixa densidade do vetor ou praga a ser tratada em alguma estação do ano; a
espécie tratada deve possibilitar a sua criação em condições de laboratório; é
preferível que as fêmeas dessa espécie copulem apenas uma vez e que os insetos
estéreis apresentem uma boa capacidade de dispersão e fitness reprodutivo
(KNIPLING, 1955; WALDER, 2000).
A TIE, comparada a outros métodos de controle, apresenta algumas
vantagens, tais como: ser considerada uma técnica ambientalmente segura (não se
faz o uso de resíduos tóxicos), ser espécie-específica, além de ser compatível com
outras metodologias de controle vetorial (DYCK; HENDRINCHS; ROBINSON, 2005).
Além disso, o processo de irradiação é considerado simples, uma vez já
definido a fase que o mosquito será irradiado, baseada de acordo com o tempo de
duração da maturação dos órgãos reprodutivos. Porém, a fase de pupa é mais
comumente utilizada para a técnica, pois nela, os indivíduos são de fácil manuseio e
acondicionamento (KLASSEN, 2005; HELINSK et al., 2009).
A TIE leva em consideração não só a esterilidade dos indivíduos machos,
mas também questões importantes como a dose de radiação a ser aplicada,
buscando não interferir no fitness dos machos liberados. Assim, é necessário
também avaliar se uma vez liberados nas áreas urbanas, se a indução dos raios vai
interferir na dispersão dos indivíduos e também a capacidade dos insetos estéreis
serem competitivos nas áreas em que serão distribuídos nos centros urbanos
(BELLINI, 2013).
2.4. A importância da irradiação na TIE
26
Insetos irradiados não apresentam risco à saúde humana e aos
ecossistemas, pois a radiação não deixa resíduos nocivos (BAKRI et al., 2005;
MASTRANGELO et al, 2009). Os primeiros testes de esterilização de insetos foram
realizados com a mosca varejeira com o auxílio de um equipamento de raios X
hospitalar. Os resultados desses testes foram considerados promissores, uma vez
que houve a confirmação por Muller (1950) da possibilidade de indução de
esterilidade através de mutação letal dominante em esperma de insetos (DARDEN
et al. 1954).
Os métodos que vem sendo utilizados para a esterilização de insetos é
através da radiação ionizante, procedente dos radioisótopos 137Cs e 60Co, raios
gama. Além dos raios gama, os raios X podem ser usados para a esterilização de
insetos (WALDER, 2000. HELINSKI et al., 2009). Os raios X, assim como os raios
gama, são ondas eletromagnéticas e o que difere uma da outra é a sua origem, pois
os raios gama provém do núcleo ou de aniquilação de partículas, enquanto os raios
X tem origem fora no núcleo, da excitação de elétrons (OKUNO, 1986). Os raios
gama tem energias fotônicas de 1,17 e 1,33 megaelétron-volt (MeV) são
encontrados no 60Co, e 0,66 MeV no 137Cs (WALDER, 1999; MASTRANGELO,
2009).
Os raios X são gerados a partir de feixes de elétrons de energia abaixo de
cinco (MeV), nessa faixa a radioatividade em materiais irradiados é evitada,
tornando segura a liberação. A liberação desses insetos pode ocorrer via terrestre
ou aérea (BAKRI et al., 2005; MASTRANGELO, 2009). O raio X é uma poderosa
onda curta de energia que foi descoberta em 1895 por Wilhelm Roentgen e há mais
de 20 anos começou o seu uso comercial. Por volta de 1920, se iniciaram estudos
relativos à aplicação de raios x para exame de corpos, diagnóstico de doenças,
esterilização de materiais, eletroterapia utilizada como tratamento de dor doenças
(PEREIRA, 2012).
Quando o material biológico é exposto à radioatividade, seu DNA sofre
alterações, como fragmentações cromossômicas ou mutações, desintegrando suas
ligações moleculares, e pode causar a apoptose das células germinativas e,
consequentemente, induzir a esterilidade em machos (HELINSKI; PARKER; KNOLS,
2009).
2.5. Adequação e efeitos da Técnica do Inseto Estéril em mosquitos
27
A eficácia da TIE foi comprovada utilizando organismos como a mosca-do-
mediterrâneo (Ceratitis capitata); mosca-do-melão (Bactrocera cucurbitae coquillett),
moscas tsé-tsé (Glossina species), além da mosca-da-varejeira (C. hominivorax).
Até a década de 1960, a técnica era utilizada somente no controle de pragas
agrícolas e, desde então, foi crescente o interesse da utilização da TIE para o
controle dos insetos vetores, principalmente mosquitos devido à alta capacidade
destes de transmitir vírus (ARTHUR; CACERES; WIENDL, 1993; BORGES, 2008;
WILKE et al, 2009).
Ainda na década de 1960, estudos realizados nos Estados Unidos com a
esterilização de Ae. aegypti utilizaram radiação gama, mas sem resultados
conclusivos (MORLAN et al, 1962). Em 1973, Hallinan e Rai apresentaram dados
que mostraram 100% de esterilidade em Ae. aegypti utilizando 70 Gy (Gray) de
radiação gama. Algumas pesquisas com a utilização de radiação ionizante em
relação ao controle de vetores foram realizadas por BALESTRINO et al. (2010) na
Itália, os resultados demonstraram que amostras de Ae. albopictus expostas a 40 Gy
de radiação gama houve índice de esterilidade de 99%. Testes com a irradiação de
pupas de Anopheles arabiensis relacionadas à marcação, liberação, recaptura foram
feitas no Sudão e demonstraram que o tempo de vida em campo os machos podem
sobreviver tempo suficiente para copular com as fêmeas selvagens (AGEEP et al.
2014).
28
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
Avaliar a eficiência de raios X na esterilização de Aedes aegypti para
aplicação na Técnica do Inseto Estéril.
3.2. Específicos
a) Identificar a idade da fase de pupa que apresentará os melhores
resultados de esterilidade após irradiação;
b) Estudar a sobrevivência dos mosquitos irradiados, em condições de
laboratório;
c) Avaliar a taxa de fecundidade e fertilidade os mosquitos irradiados ao
copularem com mosquitos selvagens.
d) Definir as melhores doses para esterilização de machos e fêmeas de
Ae. aegypti, para o uso da TIE.
29
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Local de Estudo
Os experimentos foram conduzidos na Biofábrica Moscamed Brasil (BMB),
localizada no município de Juazeiro/BA, em salas com condições ambientais
controladas [temperatura (T): 27±1°C), umidade relativa do ar (UR): 70±10%, e
fotofase: 14:10].
4.2. Material Biológico
4.2.1. Origem dos insetos
4.2.1.1. Linhagem MBR-0001 de Ae. aegypti
No presente estudo foi utilizada uma colônia de Ae. aegypti, linhagem MBR-
001, originária de ovos coletados no distrito de Carnaíba, município de Juazeiro/BA.
A coleta de material biológico (ovos) para a colonização e domesticação da
linhagem ocorreu em 2013 com a utilização de armadilhas (ovitrampas) instaladas
aleatoriamente em 40 pontos do distrito. As coletas foram realizadas semanalmente
(no primeiro trimestre de 2013). O material coletado foi mantido sob condições
ambientais controladas no insetário da BMB de acordo com o protocolo de criação
desenvolvido por CARVALHO et al. (2014).
4.2.1.2. Linhagem selvagem de Ae. aegypti
Os insetos selvagens utilizados na presente pesquisa foram oriundos de ovos
coletados em ovitrampas instaladas no distrito de Carnaíba/BA, instaladas
aleatoriamente em 226 pontos, dos quais 59 ovitrampas foram positivas (presença
de ovos). Os ovos coletados no período de duas semanas foram levados para a
colonização em laboratório de acordo com o protocolo de criação citado acima.
4.2.2. Criação e manutenção das colônias de Ae. aegypti
4.2.2.1. Colônia de adultos
Para o estabelecimento das colônias de adultos, pupas machos (N=500) e
fêmeas (N=1500) foram acondicionadas em gaiolas (Figura 2; armação de PVC com
30
30x30 cm de altura, teto e fundo com 28,8 cm de diâmetro e com 15,5 cm de
diâmetro na abertura na parte frontal de tecido voal para introdução das pupas e
manuseio dos insetos após emergência, Modelo Moscamed Brasil). A proporção de
insetos utilizada foi de 3 fêmeas:1 macho, respectivamente. Os adultos emergidos
foram alimentados com dieta artificial à base de sacarose (10%) ad libitum oferecida
com o auxílio de chumaços de algodão embebidos na solução.
Figura 2. Gaiola de PVC para colônia bissexual de Ae. aegypti.
Os mosquitos foram mantidos na gaiola por um período mínimo de três dias,
tempo necessário para a ocorrência da cópula. Após esse período as fêmeas
receberam alimentação sanguínea artificial (sangue ovino e/ou caprino). Para tanto,
uma placa de alumínio (10x10 cm), revestida com Parafilm® e contendo
aproximadamente 9 ml de sangue foi posicionada na parte superior gaiola e, sobre
ela, colocou-se uma bolsa térmica aquecida simulando a temperatura do corpo
humano, aproximadamente 36°C (Figura 3). A cada 20 minutos a bolsa térmica foi
reaquecida em forno micro-ondas (~2 minutos) e colocada novamente sobre a gaiola
(procedimento adaptado de CARVALHO et al., 2014).
31
Figura 3. Sistema de alimentação artificial sanguínea: (A) sangue ovino ou caprino; (B) Parafilm®; (C) placa de alumínio; (D) placa de alumínio revestida com Parafilm® e preenchida com sangue; (E) bolsa térmica de trigo sobre a placa de alumínio; (F) Gaiola de PVC. Fotos: da autora.
No interior de cada gaiola, foi oferecida, três dias após a alimentação
sanguínea e, por três dias, uma unidade de oviposição (UO) (recipiente plástico de 8
cm de altura x 9,5 cm de diâmetro), revestida com uma tira de papel filtro (41x8 cm),
contendo cerca de 200 mL água filtrada (Figura 4). Posteriormente, as UO foram
retiradas, identificadas por data e em seguida as tiras de papel filtro contendo os
ovos foram acondicionadas em bandeja plástica (3,5 cm x 1,3 cm x 20,8 cm) para a
secagem, também durante três dias.
32
Figura 4. Sistema para oviposição das fêmeas: (A) papel filtro; (B) recipiente plástico com água filtrada e (C) unidade de oviposição (UO). Foto: da autora.
4.2.2.2. Criação larval
A criação larval iniciou-se com a eclosão das larvas. Para isso, ovos
previamente coletados, segundo a metodologia supracitada no item 4.2.1.1, foram
retirados do papel de filtro com auxílio de um pincel macio (modelo Condor Ref. 385)
e peneirados (modelo 9002) para separar resíduos de mosquitos que morreram na
água da UO. Potes de vidro contendo 250 ml água filtrada foram colocados em forno
micro-ondas em potência alta por cinco minutos, após esse tempo os potes foram
fechados e reservados para que a água estivesse na temperatura ambiente (27°C).
A água com baixo teor de oxigênio dissolvido favorece a eclosão sincronizada das
larvas. Os ovos foram colocados nos potes e, após 60 minutos (tempo suficiente
para que a maioria das larvas eclodissem), transferiu-se para bandejas (Figura 5) e,
após mais uma hora, foi feita a aliquotagem (adaptado de CARVALHO et al., 2014).
33
Figura 5. Materiais para eclosão das larvas: (A) Ovos; (B) Pode de vidro com água; (C) momento da eclosão das larvas; (D) larvas (L1) em bandeja. Fotos: da autora.
Após a eclosão, as larvas no estádio L1 foram transferidas para bandejas
plásticas de criação (9,7 cm de altura x 30,3 cm de largura x 51,0 cm de
comprimento) contendo 4 L de água filtrada (Figura 6). As larvas foram alimentadas
diariamente e durante sete dias com ração Sera Vipan®, seguindo a tabela de
alimentação proposta por CARVALHO et al., (2014).
Figura 6. Criação larval: (A) carrinho com bandejas para criação e (B) bandeja com larvas e alimentação larval. Fotos: da autora.
4.2.3. Separação de pupas
Antes da separação das pupas, as bandejas eram drenadas com o auxílio de
uma peneira (modelo 1062), para reter as pupas em quantidade mínima de água
para facilitar a separação. A coleta das pupas acontecia sempre nos dois primeiros
A B C D
A B
34
dias, período em que a coleta de pupas macho é maior. As pupas foram separadas
por sexo com o auxílio do separador Hock’s Machine (modelo Moscamed Brasil), em
função do dimorfismo sexual entre pupas machos e fêmeas. As pupas fêmeas
apresentam tamanho corporal superior ao das pupas machos e as larvas (4° instar)
são menores que ambas as pupas (adaptado de CARVALHO et al., 2014) (Figura 7).
O separador é composto por duas placas de vidro e quatro válvulas (duas
superiores e duas inferiores). Quando as válvulas são fechadas, elas pressionam as
placas de vidro (uma contra a outra) e estas por sua vez, passam a funcionar como
um “funil” com formato horizontal linear. Quando as válvulas estão fechadas, larvas,
pupas e água são colocadas na parte superior do aparelho e as válvulas inferiores
vão sendo abertas aos poucos. Assim, no “funil”, forma-se assim um gradiente
trifásico, onde na porção superior (primeira fase) são encontradas pupas fêmeas, na
porção central (segunda fase) encontram-se as pupas machos e na porção mais
inferior (terceira fase), as larvas (adaptado de BORGES, 2008; CARVALHO et al.,
2014).
Dessa maneira, quando se deseja recuperar larvas, abre-se a válvula até que
todas as larvas “caiam” do separador nas bandejas. Em seguida, troca-se a bandeja
e abre-se um pouco mais a válvula para que os machos caiam. E por fim, troca-se
novamente a bandeja e abre-se toda a válvula para que as fêmeas caíssem.
Figura 7. (a) Separador de pupas e larvas Hock's Machine. (b) Gradiente trifásico formado durante a separação.
35
4.3. Determinação da idade adequada da pupa de Ae. aegypti para
esterilização
Pupas machos (N=1080) divididas de acordo com a idade (12, 24 e 36 horas
de formação) foram expostas a uma dose de 65 Gy. A escolha dessa dose foi
baseada nos resultados encontrados nos estudos de Yamada et al (2014) e Vianez
(2015), que obtiveram maior esterilidade com a dose de 60 Gy e 65 Gy,
respectivamente. Para isso, 120 pupas foram acondicionadas, com o auxílio de uma
pipeta de Pasteur (3 mL), em poços de placa de meio de cultura de células (placa
com 12 poços; poço com 21,4mm de diâmetro e área de 3,66cm2) contendo uma
fina camada de água filtrada (1,5 mL). As placas foram fechadas, vedadas e inserida
dentro de protótipo de isopor previamente desenhado (16x11,7x17,4 cm) (Figura 8).
Na parte central (11,7 x 8,6 x 11 cm), o protótipo possuía capacidade para acomodar
cinco placas de cultura empilhadas. Esse protótipo foi desenvolvido para
acondicionar as placas de cultura contendo as pupas de mosquito em posição
horizontal na área central do recipiente de irradiação (15,4 x 17,8 x 18 cm), para
garantir uma variação mínima na distribuição de dose, ou seja, uma maior
uniformidade da dose absorvida pelo material biológico. A esterilização foi conduzida
numa máquina de raios X, modelo RadSource-2400 (Figura 9), operado com
voltagem de 125 kV, corrente de 18 mA, apresentando uma relação dose-energia:
0,0207 Gy.Kw-1.s-1.
Figura 8. Acondicionamento para irradiação. (A) Placa de cultura; (B) Placa com pupas ao centro; (C, D e E) Protótipo de isopor; (F, G e H) Posicionamento do protótipo no recipiente de irradiação; (I) Posicionamento das placas para a esterilização; (G, H, I, J, K, L e M) Disposição das placas de cultura na parte central do protótipo de isopor e (N) Caníster de irradiação fechado. Fotos: da autora.
A B D E F G C
I J K L M N H
36
Figura 9. Máquina de raios – x , modelo RadSource-2400.
As pupas do grupo controle foram acondicionadas da mesma forma e levadas
para a sala de irradiação, permanecendo no ambiente pelo mesmo período que os
grupos tratamento. Cada tratamento (idade da pupa) foi constituído por seis
repetições, contendo 120 pupas cada, para um total de 720 pupas/tratamento. Após
a irradiação, as pupas foram transferidas para recipientes plásticos (2,3 cm x 7,0 cm
x 10,3 cm) com 50 mL de água, que foram inseridos dentro de gaiolas BugDorm®
devidamente identificadas com as informações correspondentes a cada grupo
(tratamento) (Figura 9). Após a emergência dos adultos, os mosquitos foram
alimentados com solução de sacarose a 10% ad libitum. A mortalidade dos adultos
foi monitorada diariamente nas gaiolas durante sete dias. Os mosquitos mortos
foram retirados e contabilizados para estimar as taxas de mortalidade e de
sobrevivência diária e final.
Figura 10. (A) recipiente plástico com amostras de pupas; (B) gaiola BugDorm®; (C) Disposição das gaiolas dos tratamentos e controle. Fotos: da autora.
A B C
37
Os parâmetros biológicos avaliados no experimento foram: peso da pupa
(mg), mortalidade de pupas durante a irradiação, emergência de adultos (%) e
sobrevivência de adultos em três intervalos de tempo: 72h (3 dias), 120h (5 dias) e
168h (7 dias) após a emergência.
Para avaliação do peso do pupário, grupos de pupas (N=30) de cada idade
avaliada foram acondicionados em papel filtro para retirar o máximo de água
possível. Em seguida, as pupas foram transferidas para uma placa de Petri (60 x 15
mm) e verificado o peso com o auxílio de uma balança semianalítica de precisão
(Modelo AR3130, OHAUS Adventurer™, precisão de 0,0001 grama). Para calcular a
a emergência após 48h finalizada a fase de pupa, utilizou-se a fórmula: E= [(no de
adultos emergidos/ no de pupas expostas a irradiação) X 100].
4.4. Determinação da dose esterilizante para Ae. aegypti
Para determinar a dose de raios X que, quando aplicada em pupas de Ae.
aegypti, garantisse um 100% de esterilidade em fêmeas selvagens após cópula com
machos estéreis, pupas machos com idade entre 30 e 36 horas foram expostas às
doses de radiação X de: 10, 20, 30, 40, 50, 65 e 70 Gy. Para isso, pupas machos
(N=200) foram confinadas em poços de placa de cultura para células,
acondicionadas em caníster e esterilizadas como descrito no item (Figura 8C).
Posteriormente à exposição à radiação, as pupas e cada dose avaliada foram
subdividas em dois grupos: um para determinação da indução de esterilidade em
fêmeas selvagens após cópula com machos estéreis e outro grupo para avaliação
da longevidade de machos estéreis expostos às diferentes doses testadas dentro da
avaliação da longevidade parâmetros como: mortalidade de pupas durante a
irradiação, emergência de adultos (%) e sobrevivência de adultos no período de 10
dias (%). Como controle utilizou-se pupas da mesma idade, porém não expostas à
radiação ionizante.
4.4.1. Indução de esterilidade de fêmeas selvagens de Ae. aegypti
Pupas machos expostas as doses supracitadas no item 4.4 foram transferidas
para recipientes plásticos (2,3 cm de altura x 7,0 cm de largura x 10,3 de
comprimento) contendo 50 mL de água, com o auxílio de uma pipeta Pasteur (3 mL),
e inseridos em gaiolas BugDorm®, identificadas com as informações
38
correspondentes a cada grupo experimental (dose de radiação), até a emergência.
Em cada gaiola, foi acondicionado um recipiente contendo 35 pupas (Figura 9A). Em
quatro recipientes plásticos (Figura 10A), foram mantidas 100 pupas fêmeas
selvagens até a emergência.
Após a emergência dos machos, fêmeas selvagens adultas com 120h de vida
foram liberadas nas gaiolas para ocorrência de cópula durante 72h. A proporção
macho/fêmea utilizada para cópula foi de 1:1 (35 casais). Durante este período de
cópula, os mosquitos foram alimentados com sacarose ad libitum a 10%. Em
seguida, os machos foram retirados das gaiolas, e a sacarose foi suspensa durante
24 horas, previamente à realização de repasto sanguíneo pelas fêmeas (Figura
10B). As fêmeas realizaram alimentação sanguínea artificial, com sangue caprino,
até que todas as fêmeas estivessem ingurgitadas. Fêmeas não ingurgitadas foram
descartadas, não sendo consideradas para as avaliações de fecundidade e a
fertilidade.
Figura 11. Emergência e alimentação sanguínea. (A) Pote para emergência dos adultos; (B) Gaiola com fêmeas e alimentação artificial; (C) fêmeas no momento da alimentação. Fotos: da autora.
Concluído o tempo de alimentação sanguínea, 20 fêmeas ingurgitadas de
cada grupo experimental (dose) foram retiradas das gaiolas e acondicionadas
individualmente em tubos de oviposição adaptadas de tubos Falcon (50 mL). Na
A B
C
39
parte interna inferior de cada tubo, acondicionou-se um chumaço de algodão
umedecido com água filtrada. Este por sua vez, foi coberto com círculo de papel filtro
(substrato para a oviposição das fêmeas) (Figura 11). Após três dias, o substrato de
oviposição foi removido do tubo e os papéis contendo ovos foram reservados para
secagem durante três dias, para que se completasse o período da embriogênese.
Posteriormente, todos os ovos foram contabilizados sob estereoscópio
binocular (aumento de 40x) e em seguida, foram acondicionados em potes plásticos
(volume de 60 mL) com 6 mL de solução (0,6%) de levedura e Sera Vipan® durante
uma hora. Os ovos que permaneceram fechados após esse procedimento, foram
submetidos a um processo de despigmentação do córion para verificação da
presença de embriões no interior dos mesmos. Para tanto, foram acondicionados em
potes plásticos (volume de 60 mL) e submergidos em hipoclorito de sódio (NaClO
2,5%) em temperatura ambiente até que todos os ovos apresentassem
descoloração.
Durante esse processo, o córion passou da cor marrom escuro para amarelo
e em seguida, tornou-se completamente translúcido (Figura 12). Ao completar o
estágio de clareamento, os ovos foram levados ao microscópio estereoscópico Leica
M165 para avaliar presença/ausência do embrião no seu interior (adaptado de
TRPIS, 1970).
Figura 12. Passos da preparação dos tubos de oviposição: (A) tubo vazio; (B) chumaço de algodão com água filtrada; (C e D) inserção do substrato de oviposição; (E) inserção da fêmea; (F) individualização de fêmeas. Fotos: da autora.
A B C
D E F
40
Figura 13. Despigmentação do córion: (A) Ovo fechado; (B) Ovo despigmentado com embrião e (C) ovo despigmentado sem embrião. Fotos: da autora.
Os parâmetros avaliados para cada dose foram: fecundidade e
fertilidade/fêmea. A fecundidade foi determinada pelo número total de ovos
depositados/ fêmea. A esterilidade também foi avaliada de maneira individual, sendo
contabilizado o número de larvas eclodidas a partir do número de ovos coletados por
fêmeas copuladas com machos irradiados. Cada tratamento (dose e controle) foi
constituído por três repetições, contendo 20 casais cada, para um total de 60
casais/tratamento.
4.4.2. Avaliação da Sobrevivência
Para esta avaliação, 20 pupas machos irradiadas foram acondicionadas em
pote plástico (14,85 cm de altura x 15 cm de diâmetro), contendo 150 mL de água
filtrada e coberto com tampa de voal (Figura 13A). Após a emergência dos adultos, a
água foi drenada e a mortalidade de pupas foi avaliada, para determinação da taxa
de emergência. Os mosquitos adultos foram mantidos sob uma alimentação ad
libitum com solução de sacarose a 10%. A mortalidade foi monitorada diariamente
durante 10 dias consecutivos, Em cada dia de avaliação, os adultos mortos foram
retirados dos potes com o auxílio de um sugador (Figura 13B), sendo então,
contabilizados e em seguida, descartados. Para avaliação deste parâmetro
comportamental, foram utilizadas 30 repetições por dose, levando a um total de 300
mosquitos/tratamento.
A B C
41
Figura 14. (A) Pote para emergência e avaliação da sobrevivência; (B) Sugador.
4.4.3. Efeitos da irradiação em fêmeas
Na TIE para controle de vetores, a liberação deve ser somente de machos,
contudo, é sabido que durante o processo de separação de pupas, uma quantidade
ínfima de fêmeas passe pelo separador Hock’s Machine juntamente com os machos,
levando à uma contaminação do lote a ser liberado. Assim, é importante determinar
se “fêmeas contaminantes”, expostas à radiação e posteriormente liberadas
acidentalmente com o lote de machos estéreis, possuem 100% de esterilidade. Para
tanto, foi conduzido um bioensaio seguindo-se o mesmo procedimento supracitado
no item 4). Entretanto, baseado nos resultados obtidos nos testes biológicos
realizados com machos (itens 4.1), as pupas fêmeas foram expostas às doses de
60, 65 e 70 Gy.
Após a irradiação a montagem das gaiolas para a obtenção dos resultados
para da cópula seguiram os procedimentos supracitados no item 4.1. Para esta
avaliação foram utilizados machos não irradiados da colônia da linhagem MBR001,
seguindo a mesma proporção 1♂:1♀ (35 casais). Apenas 14,11 e 8 das fêmeas
irradiadas com 60 65 e 70 Gy, respectivamente, e 20 fêmeas do controle que se
alimentaram. Estas foram retiradas das gaiolas e acondicionadas individualmente
em tubos de oviposição. Os parâmetros avaliados correspondem aos mesmos
citados no item 4.4.1. Cada tratamento (dose e controle) foi constituído por uma
repetição.
A B
42
4.5. Análises Estatísticas
Em todos os experimentos, seguiu-se o desenho experimental inteiramente
casualizado. Previamente à análise estatística de cada uma das variáveis, foram
verificadas a normalidade e homocedasticidade, por meio dos testes de Kolmogorov-
Smirnov (p>0,05) e Cochran C, Hartley, Bartlett (p>0,05), respectivamente.
Os resultados das variáveis: mortalidade de pupas, emergência de adultos e
sobrevivência de adultos nos três intervalos de tempo avaliados foram
transformados em arco seno √x+0,5 e posteriormente submetidos à análise de
variância paramétrica simples (ANOVA - um fator) para verificação de significância
através do teste F. Quando detectada significância no teste F, as médias dos
tratamentos foram comparadas através do teste de Tukey (HSD).
Os resultados de fertilidade foram submetidos primeiramente à análise de
ANOVA para comprovação de significância através do teste F. Posteriormente, com
base nesses resultados, realizou-se uma análise de regressão Probit, sendo
verificada previamente a adequação dos dados às pressuposições do modelo.
As análises estatísticas foram realizadas com uso dos softwares estatísticos
Statistica (STASOFT), versão 10.0, e SPSS Statistic (IBM CORPORATION, 2011)
versão 20.0, com nível de significância α de 0,05.
43
5. RESULTADOS
5.1. Determinação da idade de pupas de Ae. aegypti para esterilização
5.1.1. Peso do pupário
Os resultados da avaliação do peso de pupas de Ae. aegypti expostas a 65
Gy com diferentes idades fisiológicas , ou seja, com 12, 24 e 36 horas após
formação, indicaram que a dose de radiação aplicada não afetou o peso corporal
dos pupários apesar da diferença na idade fisiológica dos insetos
[F(3,20)=1.91;p=0,1613] (Figura 14).
Figura 15. Peso médio de pupas de Aedes aegypti não irradiadas (controle) e irradiadas com 65 Gy com 12, 24 e 36 horas de formação do pupário. T=27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h. As colunas representam a média dos tratamentos ± erro padrão.
5.1.2. Mortalidade de pupas durante a irradiação
No que se refere a este parâmetro biológico, constatou-se que não houve
mortalidade durante a exposição de diferentes idades fisiológicas dos pupários à
dose de radiação X aplicada (65 Gy) em nenhum dos tratamentos testados.
5.1.3. Taxa de Emergência
A exposição à radiação X influenciou negativamente a taxa de emergência
dos mosquitos irradiados, sendo evidenciadas diferenças significativas entre os
tratamentos [ANOVA: F(3,20) = 28,659; p<0,05]. As menores taxas de emergência
foram verificadas em pupários de Ae. aegypti expostos a radiação com 12 (77%) e
24 horas (81%) de idade. Não houve diferenças entre as pupas irradiadas com 36
horas de idade e o grupo controle para esse parâmetro biológico (Figura 15).
0
1
2
3
4
5
Controle 12h 24h 36h
Peso
méd
io (
mg
)
Idade das pupas (horas)
44
Figura 16. Taxa de emergência (%) de mosquitos irradiados na fase de pupa com 12, 24 e 36 horas de formação do pupário. T= 27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h. As colunas representam a média dos tratamentos ± erro padrão. Colunas com letras diferentes diferem entre si (Teste de Tukey; p˂ 0,05).
5.1.4. Taxa de Sobrevivência
A sobrevivência foi analisada no terceiro, quinto e sétimo dia após a
emergência dos adultos. Nos três dias de avaliação, observou-se que a idade
fisiológica em que as pupas foram expostas a radiação influenciou a taxa de
sobrevivência. No terceiro dia, verificou-se que as taxas de sobrevivência dos
mosquitos irradiados com 12h (73%) e 24h (85%) foram significativamente menores
quando comparadas às taxas registradas para os insetos do grupo controle e os
irradiados com 36h [ANOVA: F(3,20) =23.631; p<0,05]. A sobrevivência dos mosquitos
irradiados com 36h foi semelhante à dos mosquitos controle.
Os resultados da avaliação no quinto dia foram semelhantes aos observados
no terceiro dia, sendo também constatada uma redução das taxas sobrevivência dos
mosquitos irradiados com 12h (62%) e 24 h (70%) comparados com os mosquitos
controle (98%) e os irradiados com 36h (95%) [ANOVA: F(3,20)=39,501; p<0.05]. No
sétimo dia após a emergência, as taxas de sobrevivência registradas em todos os
tratamentos diferiram do grupo controle [ANOVA: F(3,20)=57.742; p<0,05], sendo os
menores valores de sobrevivência observados para mosquitos oriundos de pupários
irradiados com 12 e 24 horas de formação do pupário (Figura 16).
a
b b
a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 12h 24h 36h
Em
erg
ên
cia
de a
du
lto
s (
%)
Idade das pupas
45
Figura 17. Taxa de sobrevivência (%) dos mosquitos irradiados no terceiro, quinto e sétimo dia de avaliação. T=27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h. As colunas representam a média dos tratamentos ± erro padrão para um mesmo dia de avaliação após a emergência. Colunas seguidas por letras diferentes diferem entre si (Teste de Tukey; p˂ 0,05).
5.2. Determinação da dose esterilizante para Ae. aegypti
5.2.1. Mortalidade de pupas durante a irradiação
Neste parâmetro biológico, constatou-se que não houve mortalidade de pupas
durante a exposição em diferentes doses de radiação X aplicada (10, 20, 30, 40, 50,
60, 65 e 70 Gy).
5.2.2. Emergência de adultos
Os valores correspondentes às taxas de emergência registradas em todos os
tratamentos estão descritos na figura 18. A exposição dos insetos as doses testadas
não comprometeu a emergência de adultos [ANOVA: F(8,81)= 0,40; p>0,05], oscilando
este parâmetro entre 97,5% a 99%.
a a a
b
b
c
b
b
c
a a
b
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
3 5 7
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
Dias após emergência
Controle 12h 24h 36h
46
Figura 18. Taxa de emergência de adultos de Aedes aegypti expostos a diferentes doses de radiação X. T=27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h. As colunas representam a média dos tratamentos ± erro padrão.
5.2.3. Sobrevivência dos insetos
Os resultados da avaliação diária da sobrevivência estão apresentados na
Figura 19. A sobrevivência dos mosquitos machos oscilou entre 89.1% e 99,7% nas
diferentes doses testadas e foi influenciada pela dose de radiação X aplicada
[ANOVA: F(8,126)= 4,39; p<0,05] (Figura 18). Quando avaliado esse parâmetro
biológico ao longo do tempo para as diferentes doses testadas, observou-se que
95% dos machos sobreviveram até o sétimo dia de vida. Entre este momento e o 10o
dia, houve uma redução deste parâmetro para os insetos expostos as doses de 60,
65 e 70 Gy.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 10 GY 20 Gy 30 Gy 40 GY 50 GY 60 GY 65 GY 70 GY
Em
erg
ên
cia
(%
)
Dose (Gy)
47
Figura 19. Taxa de sobrevivência (%) dos mosquitos irradiados no décimo dia de avaliação. T=27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h. As colunas representam a média dos tratamentos ± erro padrão. Colunas com letras diferentes diferem entre si (Teste de Tukey; p˂ 0,05).
a a a a a
ab ab
ab
b
70
75
80
85
90
95
100
Controle 10 20 30 40 50 60 65 70
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
Doses (Gy)
48
Figura 20. Taxa de sobrevivência diária de Ae. aegypti do grupo controle e irradiados após emergência.
70
75
80
85
90
95
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
Tempo (dias)
Controle
70
75
80
85
90
95
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
Tempo (dias)
10Gy
70
75
80
85
90
95
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
Tempo (dias)
20Gy
70
75
80
85
90
95
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
Tempo (dias)
30Gy
70
75
80
85
90
95
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
Tempo (dias)
40Gy
70
75
80
85
90
95
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
Tempo (dias)
50Gy
70
75
80
85
90
95
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
Tempo (dias)
60Gy
70
75
80
85
90
95
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
Tempo (dias)
65Gy
49
5.2.4. Avaliação de Fecundidade e esterilidade
A fecundidade média foi obtida a partir do número de fêmeas ingurgitadas e o
número de ovos produzidos. A fecundidade para cada dose avaliada está
representada na Tabela 1.
Tabela 1. Fecundidade média das fêmeas que copularam com machos dos grupos controle e tratamentos. T=27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h.
Tratamentos Nº de fêmeas Nº total de ovos Fecundidade (média ± EP)
0 28 2469 88,2 ± 4,90
10 Gy 32 2491 77,8 ± 4,49
20 Gy 26 2169 83,4 ± 4,66
30 Gy 35 2554 73,0 ± 3,97
40 Gy 37 2451 66,2 ± 5,00
50 Gy 32 2404 75,1 ± 4,73
60 Gy 28 2308 82,4 ± 4,05
65 Gy 29 2140 73,8 ± 5,52
70 Gy 33 2183 66,2 ± 4,81
As fêmeas copuladas com machos irradiados com as doses de 40 e 70 Gy
apresentaram a menor fecundidade (66,2 ± 5,00 ovos/fêmea) dentre os demais
grupos, e maior valor para este parâmetro foi observado no grupo controle (88,2 ±
4,90ovos/fêmea). Houve diferença significativa na fecundidade de fêmeas copuladas
com machos estéreis [ANOVA: F(8,270)= 2,57; p<0,05].
Fêmeas selvagens copuladas por machos férteis tiveram 87,7% dos seus
ovos fertilizados. Assim, mortalidade embrionária natural de Ae. aegypti foi de 12,3
± 2,06 no grupo controle. No entanto, a taxa de eclosão de larvas obtidas de
cruzamentos entre fêmeas selvagens e machos estéreis foi influenciada
significativamente pela dose de raios-X aplicada nos machos (Tabela 2). Para
70
75
80
85
90
95
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
So
bre
viv
ên
cia
(%
)
Tempo (dias)
70Gy
50
fêmeas que copularam com machos estéreis expostos a 60, 65 e 70 Gy de radiação
X não foi verificada a eclosão das larvas. Além disso, quando analisada a presença
de embrião nos ovos fechados, através da despigmentação do corión, contatou-se
que doses a partir de 10 Gy comprometeram o desenvolvimento embrionário, uma
vez que apenas entre 4,7 e 0,1% destes ovos apresentaram embrião (Tabela 2,
Figura 20A).
Tabela 2. Taxa de eclosão de ovos provenientes da cópula de machos da colônia e não irradiados; número de ovos sem eclosão das larvas (ovos fechados) e porcentagem de ovos com presença de larvas. T=27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h.
Tratamentos Nº total de ovos Nº de ovos fechados Ovos embrionados (%)
0 2469 303 38,6
10 Gy 2491 1123 4,7
20 Gy 2169 1922 4,2
30 Gy 2554 2513 0,6
40 Gy 2451 2362 0,8
50 Gy 2404 2402 0,5
60 Gy 2308 2308 0,1
65 Gy 2140 2140 0,6
70 Gy 2183 2183 1,6
*Taxa de eclosão= (número de larvas eclodidas / número total de ovos)x100
Houve interação significativa entre a mortalidade embrionária e as doses de
raios X aplicadas (ANOVA: F (8,271) = 377,2; p<0,05). A exposição de machos de Ae.
aegypti as diferentes doses de radiação X avaliadas promoveu níveis de esterilidade
em fêmeas selvagens entre 45,1 e 100% após a cópula com os machos estéreis
(Figura 20B). Ou seja, houve um aumentou da radiossensibilidade de ovos de Ae.
aegypti com o incremento da dose de radiação aplicada em machos. Foi induzida
uma esterilidade de 98,2 quando aplicada a dose de 30 Gy. Já as doses de 60, 65 e
70 promoveram 100% de esterilidade (Figura 20B).
51
Figura 21. Curva de esterilidade de raios X para Ae. aegypti. (A) Taxa média de eclosão de ovos em função da dose; (B) Percentual de esterilidade em função das doses. Os pontos contendo letras distintas são estatisticamente diferentes (p<0,05).
Visando facilitar a comparação da eficiência da esterilização entre as doses
de raios X, foi adotada a análise de regressão Probit para estudar as curvas
estimadas em função das doses de radiação X aplicadas, sendo verificada
previamente a adequação dos dados aos pressupostos do modelo. Com base nesta
análise, as doses letais, DL 90 e DL 99,9968, para inibir a esterilidade de adultos foram
estimadas em 22,12 e 31,27 Gy, respectivamente (Figura 21).
Figura 22. Representação gráfica da relação Probit / dose de radiação X obtida do cruzamento entre fêmeas selvagens e machos de Ae. aegypti expostos a diferentes doses de radiação X. Limites de confiança de 95% para dose de raios X.
a
bc
b
c c c c c c
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70
Eclo
são
(%
)
Dose irradiação (Gy)
A
d
c
b a a a a a a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70
Este
rilid
ad
e (
%)
Doses de irradiação (Gy)
B
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
0 5 10 15 20 25 30 35
Pro
bit
Doses de irradiação (Gy)
52
Tabela 3. Equação de Probit para as irradiações.
Doses (Gy) Equação
DL50 DL90 DL99
10.9 22.07 31.17 y=0,115x - 1,251
(8,97_12,78) (19,50_25,73) (27,22_37,15)
5.2.5. Efeitos da irradiação em fêmeas de Ae. aegypti
Diante dos níveis de esterilidade promovidos quando aplicadas as doses 60,
65 e 70 Gy em machos de Ae. aegypti, pupas fêmeas com idade entre 30-36 horas
foram submetidas às mesmas faixas de doses de irradiação.
5.2.5.1. Mortalidade de pupas fêmeas durante a irradiação
Não foi constatada mortalidade de pupas fêmeas submetidas à irradiação
com as doses de 60, 65 e 70 Gy.
5.3. Taxa de emergência
De acordo com os dados obtidos, não houve diferença entre os tratamentos
em relação às taxas de emergência das fêmeas irradiadas (Figura 23), evidenciando
que a exposição à radiação não influenciou o comportamento deste parâmetro
biológico [ANOVA: F(3,16) = 2.49; p>0,05].
Figura 23. Taxa de emergência de fêmeas expostas à diferentes doses de irradiação. T=27±1°C, UR=60±10%, fotofase 14 h.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 60 65 70
Em
erg
ên
cia
(%
)
Doses de irradiação (Gy)
53
5.4. Fecundidade e fertilidade
A exposição das pupas fêmeas de Ae. aegypti às doses de 60, 65 e 70 Gy
comprometeu a fecundidade, não sendo observada a deposição de ovos após a
cópula destas fêmeas com machos selvagens, seguida de repasto sanguíneo. No
grupo controle, um total de 855 ovos foram ovipositados por 20 fêmeas, com uma
fecundidade média de 42,75 ± 2,56 ovos.
54
6. DISCUSSÃO
A TIE vem se mostrando como uma ferramenta promissora, segura e bem
sucedida para o controle de populações de insetos vetores. Neste sentido, o
presente estudo possibilitou definir relevantes elementos para aplicação desta
técnica no controle do mosquito Ae. aegypti. A exposição de pupas de 36h de idade
a radiação X se mostrou como um procedimento viável para induzir esterilidade em
machos de Ae. aegypti sem comprometer importantes parâmetros de qualidade tais
como: mortalidade de pupas durante a irradiação, taxa de emergência e
sobrevivência de adultos. Além disso, doses entre 50 e 70 Gy de raios X foram
eficientes garantindo níveis de esterilidade superiores a 99% em machos e fêmeas
desta espécie de mosquito.
Em Ae. albopictus, os efeitos da radiação ionizante gama sobre a
espermatogênese são maiores quando o indivíduo encontra-se na sua fase imatura
(pupas) (Bellini et al., 2013). Entretanto, a duração da pupação de Ae. aegypti é de
aproximadamente dois dias (FORATTINI, 2002) e a depender do seu estágio de
maturação, pode haver um melhor período para que elas sejam irradiadas. Nesse
sentido, o presente trabalho teve como objetivo avaliar pupas com diferentes idades
de formação com o propósito de verificar os efeitos da irradiação quando a pupa
está jovem ou próxima da emergência. Apesar da irradiação a 65 Gy não ter afetado
o peso do pupário em nenhuma das idades avaliadas, diferenças substanciais na
emergência e sobrevivência do adulto foram encontradas entre pupas de idades
distintas.
Os resultados evidenciaram que a taxa de emergência foi diretamente
relacionada à idade em que as pupas foram irradiadas. Pupas com 12 h de
formação apresentaram menor taxa de emergência (77%) em relação aos demais
grupos avaliados, e somente pupas irradiadas com 36 horas apresentaram taxa de
emergência (97%) similar ao grupo não irradiado (97%). Os resultados obtidos
corroboram com Curtis (1976), cujo estudo mostrou que em Anopheles gambiae, a
exposição de pupas (radiação gama) com idade inferior a 24 h reduziu
drasticamente a taxa de emergência dos adultos. Tal fato pode estar relacionado à
radiossensibilidade das células somáticas e à imaturidade das pupas com até 24
horas.
Em relação à sobrevivência dos adultos, provenientes das pupas irradiadas
com diferentes idades, até o terceiro dia pós-emergência, a menor sobrevivência foi
55
obtida no grupo de pupas mais jovens irradiadas (12 h). Já a maior, e semelhante ao
controle, foi apresentada no grupo de pupas expostas à irradiação com 36h de
idade. A sobrevivência até o terceiro dia é de extrema importância, uma vez que a
cópula com as fêmeas selvagens só é possível após 24 horas de emergência do
adulto macho, devido à sua maturidade sexual só ser atingida após a rotação de sua
genitália em 180° (BELLINI et al. 2013). Além disso, quando se trata da aplicação da
TIE em campo, obter um número elevado de machos estéreis sobreviventes neste
período avaliado é fundamental para eficiência da técnica Bellini et al. (2013), uma
vez que os mosquitos são liberados por volta dos três dias de vida (Carvalho et al.,
2015).
Nesse sentido, foi observado que os indivíduos irradiados mais jovens (12 h e
24 h) apresentaram sobrevivência inferior a 75% até o quinto dia de avaliação,
enquanto os indivíduos irradiados tardiamente (36 h) revelaram taxas de
sobrevivência de 95% neste período. Além disso, o presente trabalho mostrou que
no sétimo e último dia de avaliação das amostras, houve uma diminuição do número
de sobreviventes para 45 %, 49 % e 84% nos grupos irradiados com idade de 12, 24
e 36 horas, respectivamente.
De acordo com Balestrino et al. (2010), a idade em que as pupas são
expostas à radiação pode influenciar na longevidade do adulto. De acordo com o
mesmo autor, uma vez pupas mais velhas forem utilizadas, menor será o dano
somático durante a irradiação pupal. Foram irradiadas pupas machos de Ae.
albopictus com 16-24h de formação, com doses de raio gama de 40, 60 e 80 Gy.
Nele, foi observada uma diminuição na longevidade quando comparada com o grupo
controle. Já pupas irradiadas com 40 Gy, com idade entre 24-40, 40-48 h não
apresentaram resultados diferentes do controle (Balestrino et al., 2010), resultados
similares aos obtidos no presente trabalho. Helinski et al. (2009) afirmaram que a
redução dos danos somáticos acontece quando o inseto está próximo da etapa final
de desenvolvimento do pupário. Nesse contexto, os resultados indicam que pupas
irradiadas com 36 h, possuem altas taxa de emergência e sobrevivência, o que pode
ser considerado satisfatório para aplicações da TIE.
Diante do melhor desempenho das pupas com 36h de formação, a faixa de
idade entre 30 h e 36 h foi estabelecida para subsidiar os testes de definição de
dose de esterilização. Nestes testes, não houve mortalidade de pupas durante o
processo de irradiação em nenhuma das doses avaliadas (10, 20, 30, 40, 50, 60, 65
56
e 70 Gy). Este resultado diferiu do obtido por Yamada et al., (2014) e Lima (2014)
que obtiveram 1,6% e 0,6% de mortalidade durante o processo, respectivamente.
Como sugerido por Yamada et al., 2014, um dos principais fatores que pode ter
contribuído para a baixa mortalidade pupal mesmo em doses mais altas, pode estar
relacionado ao dispositivo utilizado para acondicionar pupas durante a irradiação,
uma vez que as pupas permanecem na posição vertical durante todo o processo,
gerando menos estresse.
Com relação à emergência dos adultos, não houve diferença entre as taxas
obtidas em qualquer grupo irradiado. Os resultados da presente pesquisa são
similares aos constatados por Enawan et al. (2017) que constataram que a
exposição de pupas machos de Ae. aegypti a uma dose de 70 Gy de raios gama,
com taxas-doses que variaram entre 300 e 1500 Gy/h não comprometeu a
emergência dos mosquitos. A menor taxa de emergência registrada por esses
autores (cerca de 98%) foi verificada para pupas irradiadas com a taxa de 300Gy/h,
sendo que no controle obtiveram-se 100% de emergência.
Quando observada a fecundidade de fêmeas que copularam com machos
irradiados foi significativamente diferente entre os tratamentos, as fêmeas que
acasalaram com machos irradiados apresentaram uma menor fecundidade em
relação ao grupo controle. Estes resultados corroboram relatos feitos por Balestrino
et al. (2010), em que todas as fêmeas que acasalaram com machos estéreis
apresentaram taxas de fecundidade reduzidas quando comparado ao grupo
controle.
Em relação a esterilidade induzida em fêmeas acasaladas com machos
expostos às diferentes doses de raios X, observou-se que quanto maior a dose de
radiação aplicada, menor a porcentagem de ovos fertilizados. As doses acima de 30
Gy foram capazes de proporcionar índices de esterilidade acima de 98%, contudo,
doses de 60, 65 e 70 Gy promoverem 100% de esterilidade. Oliva et al. (2012),
relataram uma redução para 7% da fertilidade de fêmeas de Ae. albopictus após
cópula com machos expostos à dose de 35 Gy (raio gama). Balestrino et al. (2010)
induziram 99% de esterilidade em Ae. albopictus quando aplicada a dose de 40 Gy
(radiação gama) em pupas machos com idade superior a 24h. Yamada et al. (2014)
também verificaram altos níveis de esterilidade (99%) quando machos de Ae.
albopictus foram expostos a dose de 40 Gy. Os mesmos autores relataram 100% de
esterilidade induzida em fêmeas de Ae. albopictus, porém quando a dose de
57
radiação aplicada foi de 60 Gy, o que foi similar aos resultados obtidos no presente
trabalho com a dose de 60 Gy de radiação X. Lima (2014) quando avaliou diferentes
doses de radiação gama, constatou 100% de esterilidade em machos de Ae. aegypti
foi atingida quando aplicada uma dose de 50 Gy utilizando raios gama. Em estudo
recente de Ernawan et al. (2017), machos de Ae. aegypti irradiados com a dose de
70 Gy indicaram uma variação de esterilidade de 95% a 98,21%, de acordo com a
taxa-dose utilizada.
Segundo ANWAR et al. (1971), LECIS; FIGUS; SANTARINI, (1975) as
irradiações em estágios de desenvolvimento posteriores a ovos e larvas resultam em
mutações letais dominantes nos espermatozoides, que causam mortalidade
embrionária após a fertilização do ovo.
Em relação aos resultados obtidos na irradiação de fêmeas com as doses de
60, 65 e 70 Gy foram semelhantes aos testes realizados com machos, não
apresentando diferenças quanto à mortalidade de pupas durante a irradiação e
quanto à taxa de emergência dos adultos. Todavia, estas fêmeas, após cópula com
machos férteis da colônia, foram 100% estéreis, ou seja, não foram capazes de
depositar ovos. Esses resultados coincidem com os relatados por Yamada et al.
(2014) e Lima (2014), que encontraram 100% de esterilidade induzida em fêmeas de
Ae. albopictus quando expostas na fase de pupa às doses de 40 Gy de raios X e 40
Gy de raios gama, respectivamente. Contudo, segundo Balestrino et al. (2010) a
fecundidade pode ser totalmente inibida em fêmeas desta mesma espécie de Aedes
quando aplicada a dose de 20 Gy de radiação gama. Para a aplicação da TIE no
controle do vetor Ae. aegypti, ainda não está disponível uma linhagem GSS (Genetic
Sexing Strain) (GILLES et al., 2014). Assim, como a TIE se fundamenta na liberação
de machos estéreis, a separação dos machos para liberação ocorre de forma
mecânica. Portanto, é possível que uma pequena porcentagem de fêmeas
“contaminem” o lote a ser liberado (ROBINSON, 2005). A presença de fêmeas não
estéreis durante o processo de liberação poderia contribuir no aumento indesejado
da população selvagem interferindo na eficiência da TIE e por isso, os resultados
obtidos no presente trabalho são pertinentes, pois indicam que fêmeas
contaminantes, quando liberadas, não gerarão prole.
Em relação aos testes de sobrevivência dos grupos avaliados com diferentes
doses de irradiação, foram obtidos bons resultados, mesmo exposto a maior dose 70
Gy os mosquitos apresentaram sobrevida média de 89,1% enquanto todos os outros
58
tratamentos, incluindo controle, tiveram mais de 91% de sobrevivência. Balestrino et
al. (2010) relataram a redução de longevidade em machos de Ae. albopictus quando
foi aplicado altas doses de radiação gama (60 e 80 Gy). Yamada et al. (2014)
observaram que Ae. albopictus irradiados com a maior dose (60 Gy apresentaram
redução na sobrevivência de 50% em onze dias de avaliação. Resultado semelhante
foi encontrado no estudo de Ernawan et al. (2017), em que pupas machos de Ae.
aegypti expostas a uma dose de 70 Gy (taxa-dose de a 1500 Gy/h de raios gama)
promoveram uma longevidade média de 22,7 dias, enquanto para o controle foi de
34,17 dias. Lima (2014) relatou uma média de longevidade 23,4 dias para Ae.
aegypti irradiados com 50 Gy de radiação gama.
Para Proverbs (1969), a redução da longevidade pode estar relacionada com
a danificação das células somáticas, resultante da exposição à radiação ionizante.
Segundo Balestrino et al. (2010), a diminuição da sobrevivência pode estar
relacionada com o acometimento de órgãos e de suas funções fundamentais para
maior longevidade, causadas pelas doses elevadas de radiação.
Apesar da probabilidade de acasalamento ser maior nos primeiros dias de
vida do mosquito adulto, pois é quando os mosquitos estão mais aptos para localizar
a fêmea, competir por ela e copular, quanto mais machos sobreviver após a
liberação, maior a probabilidade de cópula com fêmeas selvagens férteis (Helinski et
al., 2009).
Nesse contexto, o presente trabalho revelou que a irradiação com raios X
acarretou em baixo custo biológico, com relação à sobrevivência, em comparação
com os trabalhos supracitados, uma vez que as doses de 60 e 65 Gy tiveram 94% e
91,6 % de sobrevivência até o 10° dia, respectivamente. Além disso, ainda que a
dose de 70 Gy tenha apresentado redução em relação ao controle, a taxa de
sobrevivência obtida pode ser considerada alta. Mesmo que os dados de
sobrevivência se refiram há 10 dias, este tempo seria suficiente para que os machos
atingissem sua maturação sexual, fossem liberados e realizassem a cópula com
fêmeas em campo.
Na TIE, a dose esterilizante deve ser definida de tal forma que não
comprometa importantes parâmetros biológicos dos insetos estéreis. Assim, os
resultados deste estudo indicam que todas as doses acima de 60 Gy são capazes
de induzir alto nível de esterilidade, sem grandes comprometimentos da
59
sobrevivência, o que demonstra o potencial da utilização de raios X como uma fonte
ionizante segura para aplicação da TIE no controle do vetor Ae. aegypti.
60
7. CONCLUSÕES
Diante dos experimentos realizados, considerou-se que a melhor idade de
pupa para processo de irradiação é de 36 horas.
A esterilidade completa das fêmeas foi obtida quando estas foram expostas a
doses a partir de 60 Gy. Esse efeito demostra minimizar riscos associados ao
aumento populacional do mosquito, em caso de liberação acidental.
Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que é possível atingir a
esterilidade em machos de A. aegypti utilizando 65 Gy de raios-X, sem comprometer
a qualidade dos insetos, sugerindo a viabilidade desta fonte ionizante no
desenvolvimento da Técnica do Inseto Estéril (TIE).
61
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