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UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
REGIANE DOS SANTOS FELICIANO
AÇÃO DA LASERTERAPIA NO INFARTO DO MIOCÁRDIO INDUZIDO POR
OCLUSÃO DA ARTÉRIA CORONÁRIA EM RATAS: ANÁLISE DO PERFIL DE
EXPRESSÃO GÊNICA.
São Paulo
2015
2
REGIANE DOS SANTOS FELICIANO
AÇÃO DA LASERTERAPIA NO INFARTO DO MIOCÁRDIO INDUZIDO POR
OCLUSÃO DA ARTÉRIA CORONÁRIA EM RATAS: ANÁLISE DO PERFIL DE
EXPRESSÃO GÊNICA.
Dissertação apresentada à Universidade
Nove de Julho, para obtenção do título de
Mestre em Medicina.
Orientador: Prof. Dr. José Antônio Silva Júnior
São Paulo
2015
3
Feliciano, Regiane dos Santos.
Ação da laserterapia no infarto do
miocárdio induzido por oclusão da artéria
coronária em ratas: Análise do perfil de
expressão gênica. / Regiane dos Santos
Feliciano. 2015.
105 f.
Dissertação (mestrado) – Universidade
Nove de Julho - UNINOVE, São Paulo, 2015.
Orientador (a): Prof. Dr. José Antonio
Silva Júnior.
1. Infarto do miocárdio. 2. Laserterapia. 3.
Laser de baixa potência.
I. Silva Júnior, Antonio. II.
Titulo
CDU 616
CDU 616
4
5
Dedico este trabalho ao meu filho
Vitor e ao meu esposo Sérgio, que
são os amores de minha alma,
estrelas lindas e brilhantes, anjos
incríveis e fascinantes, razões
desse meu viver...
6
AGRADECIMENTOS
A Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para
superar as dificuldades, mostrar os caminho nas horas incertas e me suprir em todas
as minhas necessidades.
Ao Prof. Dr. Andrey Serra por sempre me incentivar na busca do conhecimento,
sendo exemplo de competência, garra, determinação e disciplina.
Ao meu filho Vitor, que foi a surpresa mais linda que aconteceu na minha vida
e que é a luz que ilumina meu caminho todos os dias.
Ao meu esposo Sérgio, com amor, admiração e gratidão por sua compreensão,
carinho, presença e incansável apoio ao longo do período de elaboração deste
trabalho.
A minha mãe Neide, as minhas irmãs Renata e Adriana e aos meus amigos,
Luciana, Fábio, Thiago, Marcelo e Juliana, que ao longo deste trabalho me apoiaram
com carinho e incentivos freqüentes.
A todos meus amigos do Anexo C, Adriano, Adilson, Fábio, Gabriela, José
Antonio, Mozânia, Lucas e Otávio, por tanta dedicação, pelos ensinamentos
profissionais e pessoais e pelo carinho e paciência com o qual me trataram desde o
início do Programa.
Aos colegas Martha Manchini, Eduardo Santana, Juliana Pires, Camila Malta,
Eduardo Brigídio, Ana Carolina Vergueiro e demais alunos de Iniciação Científica,
meus sinceros agradecimentos, pela disposição, atenção e amizade.
A todo corpo docente do programa de Mestrado em Medicina da Universidade
Nove de Julho.
7
Ao Prof Paulo J.F.Tucci, pelo apoio e uso de seu laboratório na Universidade
Federal de São Paulo para aquisição dos modelos de infarto e a todos seus alunos
pela convivência.
Aos técnicos de laboratório da UNINOVE: Ângela, Luciana e Samara pelo apoio
e incentivo!
Em especial à CAPES por ter concedido a bolsa de Mestrado. Agradeço
também o financiamento de parte desta pesquisa pela FAPESP (2009/54225-8).
Obrigada por permitirem que meu sonho se tornasse realidade!
Não poderia deixar de agradecer a Drª Elisabeth de los Santos Fortuna, que
me iniciou na carreira científica em 2007 e foi um anjo da guarda que Deus colocou
no meu caminho para me guiar nos momentos mais difíceis. Uma pessoa da qual
nunca me esquecerei. Hoje este anjo está pertinho de Deus! Descanse em paz!
A todos que nos cercam, nos orientam e nos iluminam, fazendo-nos pessoas
“especiais. Que Deus os abençoe e a todos Nós.
8
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Prof. Dr. José Antonio Silva Junior, que além de meu orientador, é meu
espelho como profissional competente. O apoio dispensado para que este trabalho
pudesse ser desenvolvido da melhor maneira possível, assim como todo o suporte
científico e emocional foram fundamentais para o meu desenvolvimento pessoal e
profissional e para a finalização deste trabalho.
“Para os crentes, Deus está no princípio das coisas. Para os
cientistas, no final de toda reflexão”
(Max Planck – Pai da Mecânica Quântica)”
9
RESUMO
Ação da laserterapia no infarto do miocárdio induzido por oclusão da artéria
coronária em ratas: análise do perfil de expressão gênica.
O infarto do miocárdio (IM) promovido no rato por oclusão da artéria coronária
descendente anterior esquerda é o modelo experimental mais empregado em
pesquisas que visa elucidar as modificações funcionais, estruturais e moleculares
associadas à doença cardíaca isquêmica. Recentemente, o laser de baixa intensidade
(LBI) tem se tornado uma alternativa terapêutica por modular vários processos
biológicos e, dependendo do comprimento de onda, dose e condição do tecido
irradiado, possui efeito anti-inflamatório, reduz a dor e acelera a proliferação celular.
Assim, avaliamos em modelo experimental em ratas, que foram submetidos à oclusão
da artéria coronária após irradiação com laser terapêutico a função miocárdica por
ecocardiograma. Além disso, realizamos uma análise “in silico”, utilizando ferramentas
de Bioinformática para verificar genes envolvidos em vias metabólicas relacionadas
ao IM em ratos. Após busca nos bancos de dados, 47 genes de 9 vias metabólicas
(Angiogênese e sobrevida celular, Hipertrofia, Estresse oxidativo, Apoptose, Matriz
Extracelular, Cinética do Cálcio, Metabolismo celular e Inflamação) foram associados
ao IM. As modificações da expressão gênica que possam ocorrer no miocárdio foram
analisadas por PCR “ARRAY em Tempo Real”. O Grupo Infarto do Miocárdio (IM), e
o Grupo Infarto + Laser (IM+Laser), quando comparados ao grupo controle (Sham),
apresentaram 22 (44,60%) e 12 (25,53%) de genes diferencialmente expressos
respectivamente. Os resultados encontrados neste trabalho sugerem que a
laserterapia foi capaz de modular vários processos pós-infarto, entre eles a apoptose,
processos inflamatórios, a hipertrofia cardíaca, o metabolismo celular e especialmente
a composição da MEC no remodelamento cardíaco. Os dados aqui obtidos, embora
complexos, sinalizam genes de interesse e certamente permitem análises mais
aprofundadas de potenciais genes chaves na resposta celular. Assim, esse
“screening” inicial dos perfis de expressão garante outros estudos mais aprofundados
para confirmar e explicar o papel de cada gene ou grupo de genes envolvidos no
Infarto agudo do Miocárdio.
Palavras-chave: Infarto do miocárdio, laserterapia, laser de baixa potência,
expressão gênica.
10
ABSTRACT
Laser therapy of action in myocardial infarction induced coronary artery
occlusion in rats: analysis of gene expression profile.
Myocardial infarction (MI) in rats promoted by occlusion of the anterior descending
coronary artery is the most widely used experimental model in research that seeks to
elucidate the functional, structural and molecular changes associated with ischemic
heart disease. Recently, low-level laser therapy (LLLT) has become an alternative
therapy to modulate various biological processes and depending on the wavelength,
dosage and condition of the irradiated tissue, has anti-inflammatory effect, reduces
pain and accelerate cell proliferation. Thus, we evaluated in experimental rats that
underwent coronary artery occlusion after irradiation with therapeutic laser myocardial
function by echocardiography. Also an analysis was carried out "in-silico", using
bioinformatics tools to verify genes involved in metabolic pathways related to MI in rats.
After searching the databases, 47 genes of 9 metabolic pathways (Angiogenesis and
cell survival, hypertrophy, oxidative stress, apoptosis, extracellular matrix, the Cálcio
kinetics, cell metabolism and inflammation) were associated with MI. The changes in
gene expression that occur in the myocardium were analyzed by PCR array Real Time.
The Group Myocardial Infarction (MI), and the Group Infarction + Laser (MI + Laser)
when compared to the control group (Sham), showed 22 (44.60%) and 12 (25.53%) of
differentially expressed genes respectively. The results of this study suggest that laser
therapy was able to modulate various post-infarction processes, including apoptosis,
inflammation, cardiac hypertrophy, cell metabolism and especially the ECM
composition in cardiac remodeling. The data obtained here, although complex, indicate
genes of interest and certainly allow further analysis of potential key genes in cellular
response. Thus, this screening of the initial expression profiles ensures more in-depth
studies to confirm and explain the role of each gene or group of genes involved in
acute myocardial infarction.
Keywords: myocardial infarction, laser therapy, low level laser therapy, gene
expression.
11
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 18
1.1 INFARTO DO MIOCÁRDIO ................................................................................... 18
1.1.1 Fisiopatologia do Infarto do Miocárdio ............................................................ 19
1.1.2 Modelo de Infarto do Miocárdio em Animais ................................................... 21
1.2 LASER DE BAIXA INTENSIDADE (LBI) ................................................................ 21
1.3 TRANSCRIPTOMA E CARDIOLOGIA ................................................................... 23
1.4 BIOINFORMÁTICA E ANÁLISE “IN SILICO” ......................................................... 24
1.4.1 A Bioinformática na descoberta de marcadores em cardiologia. ..................... 26
1.5 OBJETO DE ESTUDO, PROBLEMATIZAÇÃO E FORMULAÇÃO DA HIPÓTESE ........... 28
2. OBJETIVOS ................................................................................................................. 30
2.1 GERAL .................................................................................................................. 30
2.2 ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 30
3. MATERAIS E MÉTODO ............................................................................................... 31
3.3 MODELO ANIMAL E PROCEDIMENTO CIRÚRGICO .......................................... 31
3.4 IRRADIAÇÃO DO LASER ..................................................................................... 32
3.5 ESTUDO MORFOFUNCIONAL POR ECOCARDIOGRAMA TRANSTORÁCICO .. 33
3.6 ANÁLISE “IN SILICO” ............................................................................................ 34
3.6.1 Busca para seleção de genes e vias metabólicas ........................................... 34
3.7 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA .................................................................... 35
3.7.1 Coleta de material biológico – Tecido ............................................................. 35
3.7.2 Procedimentos – PCR “ARRAY” ..................................................................... 35
3.8 ANÁLISE ESTATISTICA........................................................................................ 40
4 RESULTADOS ............................................................................................................. 41
4.1 ESTUDO MORFOFUNCIONAL POR ECOCARDIOGRAMA TRANSTORÁCICO .. 41
4.2 ANÁLISE “IN SILICO” ............................................................................................ 42
4.2.1 Busca para seleção de genes em vias metabólicas ........................................ 42
4.3 ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA .................................................................... 44
5. DISCUSSÃO ................................................................................................................ 61
6. CONCLUSÃO .............................................................................................................. 69
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 70
8. APENDICE ................................................................................................................... 83
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Biometria e ecocardiografia. Dados após 72 horas da oclusão coronária e
laserterapia………………………………………………………………………………….40
Tabela 2 – Quantificação de RNA extraído das amostras de tecidos cardíacos dos
animais submetidos à Oclusão da Artéria Coronária após 3 dias………..…………….43
Tabela 3 – Alterações na expressão gênica de mRNA 3 dias após a cirurgia da
Oclusão da Artéria Coronária comparada com a Cirurgia Sham...……………………44
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Interação entre ambientes clínicos, laboratoriais e de pesquisa
computacionais………………………………………………………………..……………27
Figura 2 – Fluxograma da análise da expressão gênica por PCR Array e as fases
que ocorreram desde a obtenção do RNA até a análise dos
resultados……………...….38
Figura 3 – Vias metabólicas e genes alvos relacionados com o infarto do
miocárdio…………………………………………………………………………………….42
Figura 4 – Expressão gênica dos 47 genes nos grupos experimentais IM e IM+Laser
comparados ao grupo Controle (Sham)…………………………………………….……45
Figura 5 – Quantidade de genes diferencialmente expressos nos grupos IM e
IM+Laser quando comparados ao grupo Sham………………………………….……..46
Figura 6 – Perfil de expressão dos 47 genes analisados por PCR em tempo Real. A
– Grupo IM X Sham, B – Grupo IM+Laser x grupo Sham, C – Grupo IM X Grupo
IM+Laser………………………………………………………………………………….....47
Figura 7 - Níveis de expressão do RNAm de Vegfa e Akt1 no miocárdio após
laserterapia por ensaio de PCR em tempo real…………………………..…………..…48
Figura 8 – Expressão de mRNA de Tp53, Map3K2, Bax, Mapk14 e Fas no miocárdio
após laserterapia por ensaio de PCR em Tempo Real……….…………………………49
Figura 9 – Expressão de mRNA de Atp2a2, Ryr2, Pln, Casq2 e Slc8a1 no miocárdio
após laserterapia por ensaio de PCR em Tempo Real. …….…………………………..50
Figura 10 – Expressão de mRNA de Cat, Hspa1a, Sod1 e Gpx4, no miocárdio após
laserterapia por ensaio de PCR em Tempo Real…………………………………..……51
14
Figura 11 – Expressão de mRNA de Igf1, Edn1, Ace, Nppa, Agtr1a, Prkca, Myh6 e
Myh7 no miocárdio após laserterapia por ensaio de PCR em Tempo
Real………………………………………………………………………………………..…53
Figura 12 – Expressão de mRNA de Cabin1, Chp2, Nfatc3, Map3k2, N.p., Prkcb,
Prkcg, Ace2, no miocárdio após laserterapia por ensaio de PCR em Tempo
Real…………………………………………………………………………………….…….54
Figura 13 – Expressão de mRNA de Hk1, Ucp-2, Pfkm, Ndufa3, Taz, Slc2a1 e Gapdh
no miocárdio após laserterapia por ensaio de PCR em Tempo
Real……………………………………………………………………………………….….56
.
Figura 14 – Expressão de mRNA de Col1a1, Col3a1, Tgfb1,Mmp9 e Tnc no miocárdio
após laserterapia por ensaio de PCR em Tempo Real…………………………… ……58
Figura 15 – Expressão de mRNA de IL-6, Tnfrsf1a e Tnf no miocárdio após
laserterapia por ensaio de PCR em Tempo Real………………………………….……59
15
LISTA DE SIGLAS, ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS
%FEAT - Fração de Encurtamento da Área Transversal
°C - Graus Celsius
µg - Microgramas
µL- Microlitro
Ace - Angiotensin I converting enzyme (peptidyl-dipeptidase A) 1
Ace 2 - Angiotensin I converting enzyme (peptidyl-dipeptidase A) 2
Agtr1a - Angiotensin II receptor type 1a
Akt1 -v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1
ANOVA – Análise de variância
Atp2a2 - ATPase, Ca++ transporting, cardiac muscle
Bax -Bcl2-associated X protein
Cabin1 - Calcineurin A binding protein
Casq2 - Calsequestrin
Cat - Catalase
cDNA –Ácido desoxirribonucleico complementar
Chp2 - Calcineurin B
cm – centimetro
Col1a1 - Collagen, type I
Col3a1 - Collagen, type III
DE – Densidade de energia
DEPC - Dietilpirocarbonato
DNA – Ácido desoxirribonucleico
DP - Densidade de potência
Edn1 - Endothelin 1
Fas - TNF receptor superfamily, member 6
FEVE - Fração de Ejeção do Ventrículo Esquerdo
Gapdh - Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
Gpx4 - Gutathione peroxidase
Hk1 - Hexokinase 1
Hspa1a, Hspa1b -Heat shock 70kD protein
16
i.p. – intraperitonial
IC - Insuficiência Cardíaca
Igf1 -Insulin-like growth factor 1
IL-6 - Interleukin 6
IM- Infarto do Miocárdio
Kg - kilograma
LBI – Laserterapia de Baixa Intensidade
Map3k2 - MAP kinase kinase kinase-2
Mapk1- Mitogen activated protein kinase 1
Mapk14 - Mitogen activated protein kinase 14
mg - Miligrama
mL - Mililitro
mm -milimetro
Mmp9 - Matrix Metalloproteinase 9
Myh6 - Myosin heavy chain, alpha
Myh7 - Myosin heavy chain, beta
Ndufa3 - NADH dehydrogenase (ubiquinose) 1 alpha subcomplex, 3
Nfatc3 - Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent
nm - Nanômetro
Nppa - Natriuretic peptide A
Nppb - Natriuretic peptide B
OAC – Oclusão da artéria coronária
pb - Pares de bases
Pfkm - Phosphofructokinase
Pln -Phospholamban
Prkca - Protein kinase C, alfa
Prkcb - Protein kinase C, beta I
Prkcg - Protein kinase C, gamma
qRT-PCR - Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa
ReyR -Ryanodine receptor 2, cardiac
RNA – Ácido ribonucleico
RNAm - Ácido ribonucleico mensageiro
rpm - rotações por minuto
17
RT – Transcrição reversa
Slc2a1 - Facilitated glucose transporter
Slc8a1 - Sarcolemal NA-Ca exchanger
Sod1 - Superoxide dismutase
Taz - Tafazzin
Tgfb1 - Transforming growth factor, beta 1
Tnc - Tenascin C
Tnfrsf1a - Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1a
TNF-α - Tumor necrosis factor
Tp53 - Tumor protein p53
Ucp-2 - Mitochondrial uncoupling protein 2
VE -Ventrículo Esquerdo
Vegfa - Vascular endothelial growth factor
18
1. INTRODUÇÃO
1.1 INFARTO DO MIOCÁRDIO
As doenças cardiovasculares prevalecem como a principal causa de
mortalidade no Brasil e no mundo (ROSAMOND et al., 2007). Segundo dados da
Organização Mundial da Saúde (OMS), em 2011 ocorreram 17 milhões de óbitos, dos
quais 7,2 milhões foram por doença arterial coronáriana. Mesmo com o avanço dos
métodos de diagnóstico e tratamento da insuficiência cardíaca congestiva, ela tem
sido uma das doenças cardiovasculares com maior incidência, prevalência e alta
mortalidade em nosso meio, sendo o infarto agudo do miocárdio como sua principal
etiologia (FRANCIS, 2001).
O infarto do Miocárdio persiste como importante causa de mortalidade,
acarretando grandes custos aos sistemas de saúde. As doenças isquêmicas do
coração representam 30% do total das mortes por doenças cardiovasculares nos
países ocidentais (ROSAMOND et al., 2007). Seu crescimento acelerado em países
em desenvolvimento representa uma das questões de saúde pública mais relevantes
do momento. De acordo com dados do DATASUS, no Brasil, no período de 2001 a
2011, ocorreram 2.189.679 internações em hospitais do SUS por doenças isquêmicas
do coração e um total de 994.679 óbitos, caracterizando um aumento de 44,04% no
número de internações (de 160.613 para 231.361) e 30,28% no número de óbitos (de
79.428 para 103.486), (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
Por isso, o infarto do miocárdio (IM) e a insuficiência cardíaca (IC) são
considerados como doenças de significantes implicações sociais, sendo alvo
constante de investigações para melhor conhecimento da fisiopatologia e para o
desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes (KANNEL, 2000; LEE et
al., 2004).
Sabe-se que o IM causa a perda, prejuízo da contratilidade e hipertrofia dos
cardiomiócitos, além da diminuição da espessura da parede do ventrículo,
modificação da matriz extracelular e alterações metabólicas. Essas alterações
promovem um rearranjo compensatório no miocárdio ao atingir três regiões
morfológicas e molecularmente distintas: região infartada, região da borda do IM e
região remota do IM, (JACKSON et al., 2005). Diante disso, diferentes estratégias
19
terapêuticas almejam modular vários processos cardíacos como contratilidade,
metabolismo, apoptose, angiogênese, formação de fibrose e controle da hipertrofia,
com o objetivo de reverter ou prevenir danos nas diferentes regiões do coração
infartado (DONAHUE, 2004; PALANIYANDI et al., 2011).
Apesar dos avanços consideráveis tanto no diagnóstico e prevenção, quanto
no tratamento da doença cardíaca isquêmica, a disfunção contrátil e IC consequentes
ao infarto continuam sendo problemas de saúde mundial e com grande ônus
econômico principalmente porque, com o envelhecimento gradual da população, vêm
atingindo atualmente a faixa etária economicamente produtiva (KANNEL, 2000; LEE
et al., 2004). A fim de restabelecer o fluxo sanguíneo para região miocárdica
acometida pela isquemia, o tratamento do infarto agudo do miocárdio é basicamente
suportado pela desobstrução coronariana (farmacológica ou cirúrgica) ou composição
de anastomoses arteriais. Todavia, em uma parcela considerável dos casos, essas
técnicas podem apresentar menor grau de eficiência, cursando muitas vezes com
reestenoses e outras complicações (ABBATE et al., 2007).
1.1.1 Fisiopatologia do Infarto do Miocárdio
O IM é um dano irreversível resultante de isquemia prolongada, consequente à
oclusão total ou parcial de uma ou mais artérias coronárias. A interrupção do fluxo
sanguíneo para o tecido cardíaco dá início a uma série de eventos que culminam na
morte dos cardiomiócitos que, gradualmente, são substituídos por fibrose de
reparação (FISHBEIN et al., 1978; PFEFFER et al., 1979). Com a perda de miocárdio
contrátil, se inicia um ciclo vicioso de sobrecarga no ventrículo esquerdo (VE) com
deterioração da função de bomba e consequente progressão para IC (FRANCIS et al.,
2001). A oclusão cirúrgica da artéria coronária em animais de experimentação como
o rato é um modelo bastante útil e muito frequente em estudos de fisiopatologia e
terapêutica, pois sua evolução para IC se assemelha em muitos aspectos a do infarto
observado no homem (FISHBEIN et al., 1978; HASENFUSS, 1998; FRANCIS et al.,
2001). Ademais, os ratos apresentam a vantagem de não apresentarem numerosa
circulação colateral, o que permite a ocorrência de amplos infartos transmurais pela
oclusão de um ramo coronário epicárdico (JOHNS & OLSON, 1954; SPADARO et al.,
1980).
20
Devido à necrose isquêmica, na fase aguda do IM, tanto no homem quanto no
animal de experimentação, ocorre uma resposta inflamatória aguda com infiltração
leucocitária, fagocitose das células necróticas e reabsorção dos componentes
celulares e da matriz extracelular comprometida, configurando o início do processo de
reparação tecidual (FRANGOGIANNIS et al., 2002). A partir desse período, incide a
deposição dos componentes da nova matriz extracelular, principalmente o colágeno,
no tecido infartado e na zona de transição para o tecido viável culminando na formação
da cicatriz do infarto (ANVERSA et al., 1993; Sun et al., 2000).
Com a sobrecarga do tecido remanescente, o processo inflamatório crônico e
a participação de fatores neuro-humorais presentes no pós-IM, dá-se início ao
remodelamento cardíaco. Este é definido como o conjunto de modificações gênicas,
moleculares, celulares e intersticiais que ocorrem nos tecidos cardíacos e podem se
expressar clinicamente por alterações do tamanho, forma e função deste órgão
(MITTMANN et al., 1998; SWYNGHEDAUW, 1999). No que se refere ao
remodelamento do miocárdico sobrevivente, ocorrem alterações na estrutura, forma e
função dos cardiomiócitos (hipertrofia e depressão da contração e do relaxamento),
da matriz extracelular (fibrose intersticial e perivascular) e dos vasos sanguíneos
(redução da capilaridade, hipertrofia da musculatura lisa, disfunção vascular). Essas
alterações, embora sejam algumas vezes consideradas como mecanismos
compensatórios, na sua progressão tornam-se substrato da disfunção ventricular, dos
sintomas de IC e das mortes relacionadas a essa doença (MITTMANN et al., 1998;
SWYNGHEDAUW,1999).
Inúmeras abordagens terapêuticas foram desenvolvidas para modular ou
interferir nas diversas fases e aspectos que envolvem o remodelamento e disfunção
ventricular, com sucessos consideráveis na melhora da função cardíaca, redução dos
sintomas, melhora da qualidade de vida e aumento da sobrevida. Entretanto, por não
existirem medicamentos ou procedimentos capazes de reparar ou substituir a cicatriz
fibrótica por tecido contrátil, esforços vêm ocorrendo nos últimos anos para se
determinar tratamentos que atuem no campo da reparação e regeneração cardíacas.
Desde a década de 90 estão sendo apontadas novas estratégias em nível
celular e gênico para o reparo tecidual do coração acometido (CHIEN, 1993; DZAU et
al., 1993; LI et al., 1998, AD & ORON, 2001). No presente estudo tomaremos como
objeto de estudo a laserterapia de baixa intensidade.
21
1.1.2 Modelo de Infarto do Miocárdio em Animais
O emprego de modelo experimental do IM em animais foi descrito há décadas
por Johns e Olson (1954). Entre as várias espécies estudadas, há preferência pela
utilização de ratos devido à facilidade para realizar a cirurgia de oclusão da artéria
coronária (OAC), além do baixo custo na aquisição e manutenção dos animais
(JOHNS; OLSON, 1954; FISHBEIN et al., 1978b). A caracterização e a sequência de
eventos histológicos obtidos após a produção cirúrgica do IM em ratos já foram
descritas (FISHBEIN et al., 1978b; SPADARO et al., 1980). O comportamento
hemodinâmico na fase crônica do IM, tanto em condição basal, como em ratos
submetidos à sobrecarga de pressão ou de volume foi relatado por Fishbein et al.
(1978a). A oclusão da artéria coronária interventricular anterior é a estratégia mais
frequentemente aplicada para a produção do IM (JOHNS; OLSON, 1954; GAUDRON
et al., 1994; TUCCI, 2010). A grande variabilidade no que se refere à mortalidade
nas primeiras 24 horas após a oclusão da coronária chama atenção neste modelo. Os
limites de mortalidade descritos na literatura na fase imediata à oclusão coronária
variam do valor mais baixo de 13% até o máximo de 65%. Além disso, a variação no
tamanho do IM resultante, também pode ou não evoluir com aumento da pressão
diastólica final do VE e insuficiência cardíaca congestiva, dependendo da extensão da
lesão miocárdica secundária à oclusão coronariana (GAUDRON, et al., 1994; TUCCI,
2010).
O eletrocardiograma e o ecocardiograma são métodos não invasivos capazes
de identificar a área de necrose ou cicatricial em coração de ratos submetidos a
oclusão da artéria coronária. O ecocardiograma possibilita caracterizar a presença e
o tamanho do IM com muito boa sensibilidade, mesmo em períodos precoces como
dois dias após promover a necrose, além de informar sobre a função ventricular
(SANTOS et al., 2009).
1.2 LASER DE BAIXA INTENSIDADE (LBI)
Recentemente, a laserterapia de baixa intensidade (LBI) tem se tornado uma
alternativa terapêutica por modular vários processos biológicos e, dependendo do
22
comprimento de onda, dose e condição do tecido irradiado, pode contribuir com um
efeito anti-inflamatório, reduzir a dor e acelerar a proliferação celular (LOPES-
MARTINS et al., 2006; ALBERTINI et al., 2007; AIMBIRE et al., 2008; ALBERTINI, et
al., 2008; BORTONE et al., 2008; LIMA et al., 2009; XAVIER et al., 2010; SILVA et
al.,2011; PIRES et al, 2011; HUANG et al., 2011; MESQUITA-FERRARI et al., 2011;
PEPLOW et al., 2012). Assim, ao atuar em nível celular, pode provocar modificações
bioquímicas, bioelétricas e bioenergéticas, promovendo aumento do metabolismo,
proliferação e maturação celular, quantidade de tecido de granulação e na diminuição
dos mediadores inflamatórios, induzindo
o processo de cicatrização (LOPES-MARTINS et al., 2006; ALBERTINI et al., 2007;
AIMBIRE et al., 2008; ALBERTINI, et al., 2008; BORTONE et al., 2008; LIMA et al.,
2009; XAVIER et al., 2010; SILVA et al.,2011; PIRES et al, 2011; HUANG et al., 2011;
MESQUITA-FERRARI et al., 2011; PEPLOW et al., 2012).
A absorção molecular do laser causa um aumento do metabolismo celular,
caracterizado pela estimulação de fotorreceptores na cadeia respiratória mitocondrial,
alterações nos níveis de ATP celular, na liberação de fatores de crescimento e na
síntese de colágeno (TUBY et al., 2006; HUANG et al., 2011; PEPLOW et al., 2012).
A modulação celular, ou seja, a ativação ou inibição de processos celulares de
expressão gênica ou proteica, ainda é pouco estudada. Em trabalhos de nosso grupo
(BORTONE et al., 2008 e SILVA et al.,2011) e em colaboração como outros grupos
de pesquisa (ALBERTINI et al., 2007; AIMBIRE et al., 2008; ALBERTINI et al., 2008;
LIMA et al., 2009; XAVIER et al., 2010; PIRES et al., 2011; MESQUITA-FERRARI et
al., 2011) têm sido observada uma diminuição da expressão de mediadores
inflamatórios pela ação da laserterapia, levando a uma redução do processo
inflamatório.
Entretanto, a ação do laser no IM ainda está para ser esclarecida e pouco se
sabe sobre o comportamento do miocárdio remanescente ao infarto frente a esta
terapia. ORON et al. (2001) analisaram o efeito da irradiação laser diodo (=810 nm)
em modelos experimentais de oclusão da artéria coronária anterior para a produção
do infarto do miocárdio em ratos e cães e observaram atenuação do tamanho do
infarto. O laser terapêutico irradiado em coração de ratos pós-IM poderia reduzir a
perda de tecido do miocárdio e esse fenômeno poderia ter um importante efeito
benéfico em pacientes após infarto do miocárdio (IM) ou isquemia cardíaca (AD &
23
ORON et al., 2001).
Analisando o miocárdio de ratos infartados tratados com o laser de baixa
intensidade (= 804 nm), Tuby et al., em 2006, conseguiram demonstrar o aumento
significativo na expressão de VEGF (fator de crescimento vascular endotelial) e da
enzima sintetase de óxido nítrico induzível (iNOS) em tecidos de animais irradiados.
1.3 TRANSCRIPTOMA E CARDIOLOGIA
Em analogia ao termo genoma o qual se refere ao conjunto de genes de uma
determinada espécie, criou-se o termo transcriptoma para se referir ao conjunto de
RNAs, ou seja, os transcritos de uma célula num dado momento de seu ciclo. Como
são os RNAs mensageiros (mRNA) os responsáveis pela codificação da síntese de
proteínas e, portanto, os mais importantes no estudo da expressão do genoma,
geralmente entende-se que o transcriptoma é o conjunto destes RNAs. Mas é
oportuno lembrar que tanto os RNAs transportadores (tRNAs) e os RNAs
ribossômicos (rRNAs) devem ser incluídos no conceito do transcriptoma apesar de
não serem codificadores de proteínas. Durante todo o processo de diferenciação
celular e tecidual, um conjunto diversificado de proteínas é mobilizado como resultado
da expressão diferencial dos respectivos genes. Portanto, pode-se dizer que durante
o desenvolvimento o primeiro ponto de controle molecular é a expressão gênica ao
nível do conjunto de mRNA. Hoje, sabe-se que o transcriptoma das células e tecidos
é reflexo da razão entre a biossíntese de mRNA (transcrição) e seu silenciamento,
muitas vezes causado pelos microRNAs (DONATE-YABUTA, 2012). Além disso, o
transcriptoma é variável entre os diferentes tipos de células, tecidos e órgãos de um
dado indivíduo, sendo que as próprias condições fisiológicas normais, como as
diferentes fases do ciclo celular, ou patológica, como por exemplo, infecções ou
neoplasias, influenciam no chamado perfil do transcriptoma (PASSOS et al., 2000).
O rastreamento dos “genes do coração” tem envolvido, além da identificação
de variantes no código de genes específicos, a análise do padrão de expressão
gênica, a partir da extração do RNA e conseguinte quantificação da proteína e/ou
atividade enzimática em tecidos específicos (CHARCHAR et al., 2008). Alterações na
quantificação do transcrito ou elementos pós-transcrional de um único gene ou de um
conjunto deles, reflete a exposição a um determinado fator ambiental. Além disso, tais
24
genes podem encontrar-se mais ou menos expressos como consequência de
variantes genéticas com potencial em alterar sua responsividade a fatores nucleares
transcricionais. A análise do transcriptoma e a consequente determinação das
alterações no padrão de expressão em um conjunto de genes se traduzem em
conhecimento necessário uma vez que, a combinação de múltiplas alterações
moleculares é responsável em determinar o grau das respostas adaptativas dos
diferentes sistemas cardiovasculares.
1.4 BIOINFORMÁTICA E ANÁLISE “IN SILICO”
Com o início do Projeto Genoma Humano em 1990 e subsequente
disponibilização de sequenciadores automáticos de DNA capazes de gerar dados
genômicos em grande escala, os bancos de dados e ferramentas de análise tiveram
de se adaptar a este volume crescente de informações (BUTLER, et al., 2006). Dados
biológicos advindos do conhecimento genômico são relativamente complexos em
comparação aos provenientes de outras áreas científicas, dada a sua diversidade e
ao seu inter-relacionamento. A partir do conhecimento fundamental do genoma
objetiva-se compreender o conjunto de peças que atuam no funcionamento complexo
de todo o organismo. Porém, no momento, isso somente é possível por partes. Busca-
se entender as estruturas moleculares das proteínas, as interações entre várias
proteínas, bem como destas com as demais moléculas biológicas (DNA, carboidratos,
lipídios, etc.), as diversas vias metabólicas celulares e o papel da variabilidade
genética representada pelas várias formas de cada proteína (ALBERTS, et al., 2005).
Toda essa informação disponibilizada pela ciência genômica só é possível de ser
organizada, analisada e Interpretada com o apoio da informática.
O genoma humano é fundamentalmente informação e computadores foram
essenciais tanto para a determinação das sequencias quanto para a aplicações em
biologia e medicina que já estão fluindo a partir destes dados. A computação contribuiu
não somente com a sua capacidade natural para processamento e armazenamento
de dados, mas também com métodos matematicamente sofisticados, necessários
para se obter os resultados. A união entre biologia e ciência da computação criou um
novo campo na ciência chamado bioinformática (LESK, 2008).
25
A bioinformática associa conhecimentos em distintas áreas do conhecimento a
fim de decifrar o código genético contido nas biomoléculas pelo estabelecimento de
modelos lógico-matemáticos e estatísticos. Tais estratégias têm assegurado a
interpretação e elucidação de eventos biológicos gerados a partir do sequenciamento
de genes e proteínas(LESK, 2008). Bancos de dados de informações biológicas cada
vez mais crescentes, o desenvolvimento de novas abordagens para análise e
apresentação desses dados e a investigação de novas e complexas perguntas são as
forças motrizes da bioinformática (ARAUJO et al., 2008). A partir do advento dos
projetos genomas, biologistas moleculares passaram a empregar ferramentas
computacionais capazes de analisar grandes quantidades de dados biológicos, a
predizer funções dos genes e a demonstrar relações entre genes e proteínas. A
internet e sua capacidade de compartilhar dados, além do desenvolvimento de
processadores mais rápidos e com maior memória, desempenharam um papel
decisivo para a consolidação da bioinformática como potencial campo do
conhecimento científico (ARAUJO, et al., 2008)
O uso da bioinformática pela Medicina se caracteriza pelo gerenciamento de
dados em laboratório, a automação de experimentos, a montagem de sequências
contíguas, a previsão de domínios funcionais em sequências de genes, o alinhamento
das sequências, as pesquisas em bases de dados de estruturas, a determinação da
estrutura e previsão de macromoléculas, a evolução molecular, busca de genes alvos
de microRNAs e as árvores filogenéticas. A identificação de alvos proteicos com
potencial para serem modificados diretamente pela interação com fármacos ou
Biomarcadores, poderá minimizar os sintomas ou acelerar o diagnóstico de diversas
doenças.
“In silico” é uma expressão usada no âmbito da computação e áreas correlatas
para indicar algo ocorrido por uma simulação computacional. Representa uma
abordagem moderna para a pesquisa, com base no uso de poder de computação para
executar uma análise matemática de uma grande quantidade de dados e a para a
criação de bases de dados complexas. Foi cunhada a partir das expressões latinas ”in
vivo” e “in vitro”.
Vários softwares disponíveis na internet que realizam análise da interação com
bancos de dados de grande escala tem sido uma das abordagens computacionais
mais promissoras para integrar os dados experimentais no nível molecular e celular
26
(BRUN, et al, 2004; KRITIKOS, et al, 2011). Devido à crescente disponibilidade de
dados, esses softwares foram aplicados para analisar numerosas doenças humanas,
incluindo câncer de pulmão, câncer de mama e do infarto do miocárdio. Os dados
reportados que tenham sido obtidos em grande parte com diferentes condições
experimentais, os protocolos, as espécies e pesquisa são incorporados na literatura e
distribuídos em bancos de dados. A capacidade de integrar dados nos permite extrair
informações relevantes e identificar lacunas de conhecimento para orientar futuros
esforços de investigação (NGUYEN, 2014).
Esforços na pesquisa têm fornecido a identificação de marcadores de
diagnóstico clínico para o infarto do miocárdio. Os métodos computacionais auxiliam
a estabelecer o primeiro mapa do conhecimento relacionados com a resposta pós-IM,
proporcionando um passo importante para melhorar a nossa compreensão das
interações moleculares específicas para MI e ligando a interação molecular, respostas
celulares, e os processos biológicos para avaliar a reprogramação gênica ocorrida no
Infarto agudo do miocárdio (NGUYEN, 2014)
1.4.1 A Bioinformática na descoberta de marcadores em cardiologia.
Um biomarcador pode ser definido como "uma característica que seja
objetivamente medida e avaliada como um indicador de processos biológicos normais,
processos patogénicos, ou respostas farmacológicas à uma intervenção terapêutica
".
A descoberta de novos biomarcadores usando diferentes tipos de dados
“OMICS” (Genômica, Transcriptomica, Proteômica e Metabolômica) tornou-se um
objetivo crucial na pesquisa translacional. Isso foi motivado, em parte, por seu
potencial para estimar estados de doença, e também por seu potencial para ajudar na
compreensão do mau funcionamento fisiológico e na orientação dos estudos em
desenvolvimento terapêutico.
No centro do processo de descoberta de biomarcadores é a comparação de
estados fisiológicos ou alterações através de controle de doenças (VASAN, 2006). Tal
diferenças se refletem na atividade diferencial molecular do gene ou expressão de
proteína, perfis de metabolismo e padrões de sinalização. Assim, em geral, essas
27
espécies moleculares (isto é, genes, proteínas, SNPs, microRNAs, etc.), que
representam as mudanças mais significativas observadas podem ser definidas como
"marcadores" potenciais de doença. A abordagem tradicional de biomarcadores
aplicadas ao rastreio, diagnóstico ou prognóstico tem envolvido a utilização de um
único biomarcador e a identificação de seus valores "anormais".
A bioinformática facilita a integração preditiva da informação: a construção de
modelos de predição de doença ou resposta ao tratamento utilizando dados
quantitativos extraídos de diferentes fontes de dados. Todas estas tarefas são agora
possíveis graças a grandes avanços computacionais acumulados ao longo dos
últimos 15 anos no que diz respeito aos padronização da informação (AZUAJE et al.,
2009).
A disponibilidade de novas fontes de dados provenientes de abordagens
“omics”, tais como a variação genética e expressão de mRNA, estão permitindo uma
sistemática e menos tendenciosa descoberta de novos biomarcadores
cardiovasculares.
Biomarcadores obtidos a partir de dados da transcrição incluem diferentes
assinaturas de diagnóstico ou de prognóstico usando dados de expressão gênica em
larga escala para classificação de pacientes e estimativas de respostas ao tratamento
(AZUAJE et al., 2009).
Biologia computacional não é apenas um importante força motriz, mas
também é o ponte de ligação entre a clínica e básica ciências biológicas . Isto é
tipicamente conseguido através a implementação de infraestruturas computacionais e
análise de dados em larga escala. Mas, talvez o mais importante, a biologia
computacional oferece possibilidades para refinar hipóteses geradas na bancada,
como também gerar novos conhecimentos que vão além de uma única hipótese de
tomada como paradigma. A Figura 1 ilustra a interação entre ambientes clínicos,
laboratoriais e ambientes de pesquisa computacional.
28
Figura 1 - Interação entre ambientes clínicos, laboratoriais e de pesquisa computacionais. (Fonte:
Arquivo pessoal)
1.5 OBJETO DE ESTUDO, PROBLEMATIZAÇÃO E FORMULAÇÃO DA
HIPÓTESE
Independente da condição fisiopatológica, os benefícios da laserterapia
abrangem a redução do processo inflamatório com redução de seus mediadores
químicos. São demonstrados resultados de melhora da inflamação e edema de pata
induzida por carragenina [redução de RNA mensageiro de Cox-2 (ALBERTINI et al.,
2007); redução da expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias (Albertini et al.,
2008); menor expressão de receptores de cininas (BORTONE et al., 2008); diminuição
da expressão gênica de calicreínas (SILVA et al.,2011)]. Também foram observadas
ações anti-inflamatórias na inflamação de vias aéreas induzida por lipopolissacarídeo
[diminuição da expressão de interleucina (AIMBIRE et al., 2008; LIMA et al., 2009)],
na tendinite [diminuição da expressão de citocinas (Xavier et al., 2010)]; diminuição
da expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias e aumento da expressão de
29
citocinas anti-inflamatória (PIRES et al, 2011), na cicatrização (PEPLOW et al., 2012)
e na reparação muscular [redução da expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias
(MESQUITA-FERRARI et al., 2011)] entre outros. Todavia, os dados acerca das
repercussões desta terapia sobre o miocárdio e, sobretudo no miocárdio
remanescente à área de infarto, são incipientes, sendo necessários mais estudos
sobre a ação da laserterapia de baixa intensidade sobre o infarto e o processo de
remodelamento.
O estudo do miocárdio remanescente ao infarto é importante para o
entendimento dos processos de remodelamento e disfunção cardíaca. Assim como
no homem, o remodelamento ocorrido no miocárdio remanescente ao IM em ratos
implica em disfunção contrátil que consequentemente exacerba a disfunção
ventricular e a IC, renovando o ciclo vicioso desta cardiopatia (FRANCIS et al., 2001).
Frente à hipótese de que a laserterapia poderia interferir positivamente sobre o
processo de remodelamento deste tecido remanescente e, dessa maneira, contribuir
com a preservação da função cardíaca, este trabalho consiste da análise dos efeitos
da laserterapia sobre o IM em ratos e sobre o desempenho ventricular global, em
associação com dados que informassem sobre a estrutura e a função contrátil do
miocárdio não acometido pelo insulto isquêmico e não envolvido diretamente na
injeção das células.
O potencial do mapeamento da expressão gênica ainda merece ser explorado
para melhor entendimento dos mecanismos envolvidos no estabelecimento,
progressão e remodelamento do IM combinado ao uso do laser. Dessa forma, uma
melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na doença contribuirá para o
estabelecimento de abordagens terapêuticas mais específicas e potencialmente mais
previsíveis.
Assim, pretende-se avaliar em modelo de oclusão e laser de baixa intensidade
a função miocárdica por ecocardiograma. Especialmente, pretende-se avaliar as
modificações da expressão gênica que ocorrem no miocárdio tratado com laser
terapêutico induzido por oclusão coronária.
30
2. OBJETIVOS
2.1 GERAL
Analisar o efeito do laser de baixa intensidade (LBI) após três dias de infarto do
miocárdio em animais submetidos à oclusão da artéria coronária descendente anterior
esquerda.
2.2 ESPECÍFICOS
1) Realizar uma análise “in silico”, utilizando ferramentas de Bioinformática para
verificar genes envolvidos em vias metabólicas relacionadas ao IM em ratas;
2) Avaliar, em modelo de oclusão da artéria coronária descendente a função
cardíaca de ratas após irradiação miocárdica com laser de baixa intensidade.
3) Avaliar a expressão gênica em diferentes vias metabólicas envolvidas no infarto
do miocárdio em animais submetidos à Oclusão da Artéria Coronária, após
tratamento com o laser de baixa intensidade.
31
3. MATERAIS E MÉTODO
3.3 MODELO ANIMAL E PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
Os procedimentos cirúrgicos foram conduzidos no Laboratório de Fisiologia e
Fisiopatologia Cardíacas da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP-EPM). As
análises moleculares foram conduzidas no Laboratório de Pesquisa da Universidade
Nove de Julho (UNINOVE).
Foram utilizadas 15 ratas Wistar fêmeas, pesando entre 250 e 280 gramas,
provenientes do Biotério Central da UNINOVE. Os animais foram confinados em
caixas plásticas em ambiente com temperatura controlada (22º C) e ciclo claro/escuro
de 12 horas, alimentados com água e ração ad libitum (Nuvilab). O uso de ratas, ao
invés de ratos, mostrou-se viável em experimento prévio, além de maior
disponibilidade no biotério. Todo processo experimental foi conduzido em acordo com
o “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH, Pub 85-23, revisado em
1985)”. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
UNINOVE (parecer 0015/2012).
O estudo foi composto por três grupos experimentais:
Grupo infarto (IM): ratas que foram submetidos à oclusão da coronária sem
irradiação laser, n=5;
Grupo infarto + laser irradiado (IM+Laser): ratas que foram submetidos à
oclusão coronária seguido da irradiação laser de baixa intensidade, n=5;
Grupo Sham (Controle): ratas foram submetidos ao mesmo procedimento,
porém sem infarto e irradiação laser de baixa intensidade, n=5.
No grupo de animais infartados, independente se por oclusão coronária,
somente foram incluídos no estudo corações que apresentarem área de infarto igual
ou superior a 40% do ventrículo esquerdo. A noção que o IM de grande dimensão está
associado com severo remodelamento ventricular esquerdo e piora no prognóstico da
doença (GABALLA et al., 2002; dos SANTOS et al., 2009) constitui a razão pela qual
foram incluídos no estudo somente animais com IM ≥ 40%. Animais submetidos ao
32
procedimento cirúrgico de oclusão coronária que não apresentarem IM também foram
excluídos da amostra. O uso de ratas, ao invés de ratos, deu-se pela maior
disponibilidade de animais no biotério. Não há relatos de alterações da ação do laser
de acordo com o gênero. Estudos em machos e fêmeas apresentaram resultados
semelhantes.
Produção da técnica de oclusão coronária
Os animais foram anestesiados com mistura intraperitoneal de cetamina (50
mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), entubados e ventilados com pressão positiva em
ventilador para roedores (modelo Harvard 683). Após tricotomia do hemitórax
esquerdo, foi realizada toracotomia lateral no local onde o coração causa impacto à
palpação. Com o animal na posição supina, foi feita incisão da pele e divulsão dos
músculos peitorais e intercostais, com auxílio de pinça Kelly curva. Após divulsão do
músculo intercostal, as costelas foram afastadas com auxílio da pinça Kelly e de
afastador Stevenson modificado. A pericardiotomia foi produzida por meio de pinça
anatômica e a artéria coronária descente anterior visualizada.
Para a produção do infarto do miocárdio por oclusão da artéria coronária foi
ligada a, aproximadamente, três milímetros de sua origem na aorta, por meio de fio
de sutura nylon 5,0. Após serem checados os resultados da sutura, o afastador foi
retirado, para a promoção da hiperinsuflação pulmonar e o tórax foi fechado por sutura
em bolsa previamente preparada em torno das bordas da incisão. Em seguida, o
animal foi mantido em ventilação artificial enriquecida com oxigênio até que
ocorressem movimentos ventilatórios espontâneos. Os animais foram colocados em
caixas e mantidos aquecidos durante o período pós-operatório, até que recuperem
completamente da anestesia. O grupo controle foi composto por animais submetidos
à cirurgia fictícia da oclusão coronariana, sendo denominado grupo Sham.
3.4 IRRADIAÇÃO DO LASER
O laser de baixa intensidade de Alumínio Gálio Índio Fósforo – AlGaInP -com
comprimento de onda de 660 nm, 15mW de potência, densidade de energia 22,5
J/cm2
, 60 segundos de aplicação, área irradiada 0,785 cm2
, dose 1,1 J
(Twin Laser –
33
M M Optics ®) foi utilizado no estudo. Esta dose foi usada previamente por ORON et
al. (2001) e em estudo piloto. Após a oclusão, como descrito acima, o coração foi
reposicionado na caixa torácica por 60 segundos para sua estabilização e após esse
período, o coração foi exteriorizado e randomizado para receber a irradiação laser
com os parâmetros descritos acima.
A caneta laser foi posicionada em um dispositivo com aproximadamente 3 cm
de distância da área do ventrículo esquerdo. No entanto, o grupo não laser irradiado
(NLI), foram submetidos ao mesmo procedimento, porém o laser estará desligado; e
no grupo Sham não foi infartado e nem irradiado. Depois de realizado o procedimento,
os ratos foram mantidos em ventilação artificial até a sua normalização.
3.5 ESTUDO MORFOFUNCIONAL POR ECOCARDIOGRAMA
TRANSTORÁCICO
O estudo ecocardiográfico transtorácico (ECO) foi realizado para estimativa do
tamanho do infarto do miocárdio, morfologia cardíaca e função ventricular. Todos os
animais foram submetidos ao ecocardiograma no 3º dia após a oclusão da artéria
coronária (OAC). Após anestesia (mistura: cetamina, 50 mg/kg; xilazina, 10 mg/kg,
i.p.) e tricotomia da face anterior do tórax, os animais foram posicionados em decúbito
lateral esquerdo e três eletrodos colocados nas patas para obtenção do traçado
eletrocardiográfico simultâneo à imagem ecocardiográfica. O exame foi realizado
segundo técnica já consolidada em nosso laboratório (NANNI et al., 2006; MOISÉS et
al., 2000; BONILHA et al., 2005), com aparelho SONOS 5500®
, que permite obtenção
de imagens cardíacas em tempo real nos modos mono e bidimensional. As imagens
em cortes transversais do ventrículo esquerdo foram gravadas em fitas de vídeo para
posterior análise. Foram utilizadas as janelas paraesternal esquerda (corte
longitudinal e transversal) e apical (quatro câmaras e duas câmaras). No modo
bidimensional, foram analisadas as áreas do VE ao final da diástole (AdVE) e ao final
da sístole (AsVE).
Foram determinadas, também, a presença de infarto e sua extensão, e a função
sistólica e diastólica do VE. O tamanho do infarto foi estimado pela medida do
comprimento das regiões acinética e/ou hipocinéticas (RAH) das paredes
34
ventriculares, representando-o como percentagem do perímetro total do contorno
endocárdico (PE) em três cortes transversais do VE (nível das bordas das cúspides
da valva mitral, dos músculos papilares e da região apical). Este método foi
previamente validado (MOISÉS et al., 2000) com a seguinte equação [24]: TI = (RAH
/ PE) * 100.
A função sistólica foi avaliada pela fração de encurtamento da área transversa
(FEAT) segundo a fórmula: FEAT= [(AdVE – AsVE / AdVE)] x 100%, sendo AdVE =
área diastólica e AsVE = área sistólica do VE. O valor final foi obtido pela média das
FEAT calculadas nos três planos basal, médio e apical do VE. A função diastólica foi
avaliada utilizando-se os índices derivados da curva de velocidade do fluxo diastólico
mitral obtido pela técnica de Doppler pulsátil. A curva de velocidade do fluxo diastólico
foi obtida a partir da imagem apical quatro câmaras, posicionando-se a amostragem
de volume próximo à face ventricular da valva mitral. Foram determinadas: a) Onda
E: maior valor da velocidade de fluxo inicial do enchimento ventricular; b) Onda A:
maior valor da velocidade de fluxo telediastólico mitral; c) Relação E/A: razão entre a
velocidade máxima da onda E e a velocidade máxima da onda A.
3.6 ANÁLISE “IN SILICO”
3.6.1 Busca para seleção de genes e vias metabólicas
Os genes foram investigados quanto a sua participação em vias metabólicas e
sinalizatórias conhecidas, utilizando o banco de dados da Enciclopédia KEGG de
Genes e Genomas. (KEGG - http://www.genome.jp/kegg) como referência. A
seqüência nucleotídica dos genes diferenciais foi submetida ao serviço de anotação
automática do KEGG (http://www.genome.jp/kegg/kaas/), que gera automaticamente
os mapas das vias metabólicas e de sinalização nas quais os genes estão inseridos.
Genes que não estavam presentes no banco de dados do KEGG foram manualmente
investigados quanto a sua função e inserção nos metabolismos, através de intensivas
consultas ao NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), e dados obtidos na literatura. A
partir destes mapas e da complementação com os dados obtidos na literatura e em
outros bancos, foi montado quadro para representar as principais vias metabólicas
35
envolvidas no Infarto Agudo do miocárdio, compreendendo: Angiogênese e sobrevida
celular, hipertrofia, Estresse oxidativo, Apoptose, Matriz Extracelular, Cinética do
Cálcio, Metabolismo celular e Inflamação.
3.7 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA
3.7.1 Coleta de material biológico – Tecido
Os animais foram mortos por exposição do coração sob o efeito dos
anestésicos citados para estudos de hemodinâmica, seguido de injeção de dose letal
de anestésicos. Para coleta de material biológico para análise de biologia molecular,
os animais foram mortos por decapitação. Tal método de eutanásia se faz necessário
em função das demais técnicas induzirem aumento de estresse oxidativo (por
exemplo, pela ação de anestésicos). Imediatamente após a excisão do coração e
determinação da massa miocárdica, a área infartada do ventrículo esquerdo foi
rapidamente retirada e desprezada e o miocárdio remoto ao infarto foi lavado em
solução fisiológica para remoção do excesso de sangue. Em seguida, as amostras de
tecido foram colocadas em tubos de 1,5 mL para congelamento em nitrogênio líquido.
O material biológico foi armazenado em temperatura de -80ºC até a data de
processamento para avaliação da expressão gênica.
3.7.2 Procedimentos – PCR “ARRAY”
Utilizamos a técnica de PCR em tempo real combinada com “array” para
quantificar a expressão de múltiplos genes simultaneamente (Custom TaqMan® Array
Plates – Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). A vantagem desta técnica quando
comparada com o PCR em tempo real convencional é a possibilidade de
determinação simultânea em larga escala da expressão gênica, o que diminui o custo
do estudo e o tempo despendido com a experimentação. As placas são customizadas
comercialmente de acordo com uma lista de genes selecionados pelo pesquisador.
36
Extração de RNA
Amostras do miocárdio ventricular esquerdo remoto ao IM, pesando entre 0,2
e 0,5 g, foram homogeneizadas em Trizol®
Reagent (Life Technologies, Carlsbad, CA,
EUA) para extração do RNA total conforme instruções do fabricante. Em seguida, 200
ul de clorofórmio foram adicionados ao homogenato, e a mistura foi agitada
vigorosamente por 15 seg. Em seguida, a mistura foi mantida em temperatura
ambiente por 5min. As amostras foram centrifugadas por 15min, 12000xg a 4°C. A
fase aquosa resultante de cada amostra foi transferida para um tubo Eppendorf de
1,5ml estéril, e foram adicionados 500 ul de isopropanol para a precipitação do RNA.
As amostras foram mantidas em temperatura ambiente por 10min, e foram novamente
centrifugadas (12000xg/4°C/10 min). Os sobrenadantes foram retirados, e os pellets
de RNA foram lavados com 1ml de etanol 75% (preparado com água tratada com
dietilpirocarbonato, DEPC, 0,01%). As amostras foram novamente centrifugadas
(12000xg/4°C/10 min), e os sobrenadantes foram descartados. Os pellets secaram ao
ar livre, sendo então ressuspensos com 50 ul de água DEPC, e armazenado a -80 °
C até a realização da Transcrição Reversa.
Tratamento do RNA total e Integridade das amostras
As quantificações das amostras de RNA total foram feitas utilizando o aparelho
NanoDrop ND-2000 espectrofotômetro (NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA)
sendo que 1U A260 corresponde a 40ug de RNA/mL. Foram utilizadas apenas
amostras livre de contaminantes (A260/A230 ~1,8) e de proteínas (A260/A280 = 1,8-
2,0). A integridade do RNA total foi avaliada pela observação da proporção das bandas
referentes aos rRNA 18S e 28S em eletroforese em gel de agarose 1% corado com
SYBR® Safe (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Para eliminação da
contaminação de DNA genômico das amostras, 1ug de RNA total (8 ul) foi incubado
com 1 unidade (1 ul) de DNAse I/RNase Free – (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), na
presença 1 ul de solução contendo 20 mM Tris-HCl, pH 8.4 e 2 mM MgCl2 por 15 min
37
a 37 °C, seguido de incubação a 65ºC durante 10 minutos para inativação da DNAse
I.
Síntese de cDNA - Transcrição Reversa
Logo após o tratamento acima descrito, foi realizada a reação de transcrição
reversa (RTqPCR), para síntese do cDNA. Em 1 ug de RNA total tratado foram
adicionados 2 μl de tampão de incubação (KCl 50 mM, Tris-HCl pH 8,4, 20 mM e
MgCl2 2,5 mM), 1 unidade de transcriptase reversa (1ul) (Invitrogen, Carlsbad, CA,
EUA), 2μl de Randon Primer (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) 0,8 μl de
oligonucleotideos (DNTPs, 100 mM) e 4,2 ul de H2O ultra pura para uma reação final
de 20 μl. As amostras foram então submetidas às seguintes incubações: 25°C por 10
min, 37°C por 120 min, 85°C por 5 min. Após a reação, as amostras de cDNA foram
mantidas a -20°C para futura realização da PCR em tempo Real.
Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) em tempo real - qPCR
A reação de polimerização em cadeia em tempo real (Real-Time PCR) combina
a amplificação do PCR com detecção fluorescente automatizada, realizada como
auxílio do aparelho de detecção da sequência. A amplificação e aquisição dos dados
foram realizadas com a sonda Taqman em equipamento Abi Prism 7500 Fast (Applied
Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) como descrito previamente (NANNI et al, 2006).
Neste processo de excitação a captação de fluorescência é realizada em cada ciclo
de amplificação do PCR, fornecendo uma quantificação em tempo real das
sequencias dos genes de interesse. O protocolo utilizado para a reação de PCR em
tempo real foi o seguinte: em 1,0 μl de cDNA, foram adicionados 5 μl de Solução
Taqman Universal Fast Master Mix 2X (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) e
água suficiente para 10 μl de reação em cada poço da placa com 96 poços. As
amostras aplicadas em duplicata e então incubadas a 95°C por 20s, e passaram por
40 ciclos térmicos a 95°C por 3s, 60°C por 30s.
38
Segue abaixo o layout e disposição dos genes que foram analisados na placa
customizada:
Todas as reações foram submetidas às mesmas condições de análise e
normalizadas pelo sinal do corante de referência passiva ROX para correção de
flutuações na leitura decorrentes a variações de volume e evaporação ao longo da
reação. O resultado, expresso em valor de CT, se refere ao número de ciclos de PCR
necessários para que o sinal o fluorescente atinja o limiar de detecção.
Os genes diferencialmente expressos foram normalizados pelo nível de
expressão do gene housekeeping subunidade 18S do RNA ribossomal, cuja
expressão mostra-se inalterada nas condições experimentais. O “software” SDS 1.4
Software for the 7500 Fast System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) foi
utilizado para o processamento dos dados.
Os valores de ΔCt das amostras foram determinados pela subtração do valor
de Ct médio do mRNA do gene alvo a partir do valor médio de Ct do gene
housekeeping 18S rRNA. O parâmetro 2-ΔΔCt foi utilizado para expressar os dados
de expressão relativos.
A Figura 2 demonstra os passos realizados desde a obtenção do RNA até os
gráficos de análise dos resultados.
39
Figura 2 – Fluxograma da análise da expressão gênica por PCR Array e as fases que ocorreram
desde a obtenção do RNA até a análise dos resultados (Fonte: Arquivo pessoal).
40
3.8 ANÁLISE ESTATISTICA
Todos os dados foram apresentados como média ± desvio padrão. A
comparação dos resultados entre os diferentes grupos para cada período de tempo
pós-IM foi realizada com ANOVA uma via complementada pelo teste de Newman-
Keuls.Todas as avaliações foram realizadas com o software GraphPad Prism version
5.0 (San Diego, CA, EUA). Um valor de p 0,05 foi adotado como nível de
significância.
41
4 RESULTADOS
4.1 ESTUDO MORFOFUNCIONAL POR ECOCARDIOGRAMA
TRANSTORÁCICO
Em relação à ecocardiografia transtorácica, o IM induziu um aumento
significativo na área sistólica do ventrículo esquerdo; resultou na redução da variação
fracional da área (FAC) nos animais tratados com laser em comparação com o grupo
controle e o grupo não tratado. Nossos dados sugerem que a laserterapia atenuou a
disfunção sistólica provocada pelo IM, conforme dados descritos na Tabela 1.
Tabela 1 - Biometria e ecocardiografia. Dados após 72 horas da oclusão coronária e
laserterapia.
BW, peso corporal; FAC, variação fracional da área; LV, ventrículo esquerdo; LVDA, área ventricular esquerda diastólica, LVSA, área ventricular esquerda sistólica, E Wave (E), onda E, A Wave (A), onda A. ANOVA One way foi aplicada para comparação dos dados. Os dados estão apresentados em médias e desvio padrão. *Diferença significante vs. IM e IM Laser, # Diferença significante vs. IM
Variáveis Sham IM IM+Laser valor de p
(n=5) (n=5) (n=5)
Biometria
BW (g) 206±6 200±4 201±5 = 0.7
LV (mg) 681±39 693±47 751±28 = 0.3
LV/BW (mg/g) 3.6±0.2 3±0.4 3.8±0.2 = 0.5
Ecocardiografia
LVDA (mm2/BW) 0.01427±0.0007 0.01611±0.0011 0.01593±0.0007 = 0.3
LVSA (mm2/BW) 0.0038±0.0001* 0.0116±0.0008 0.0103±0.0003 <0.0001
FAC (%) 72±1* 27±2 35±1#
<0.0001
E Wave (cm2)
0.69±0.03 0.68±0.05 0.73±0.03 = 0.4
A Wave (cm2)
0.28±0.01 0.32±0.07 0.25±0.08 = 0.055
E/A 2.6±0.2* 4.5±0.9 5±0.7 = 0.02
Grupos experimentais
42
4.2 ANÁLISE “IN SILICO”
4.2.1 Busca para seleção de genes em vias metabólicas
Os genes induzidos após o infarto do miocárdio foram identificados no Banco
de dados KEGG e relacionados com sua via metabólica conforme descrito nos
materiais e métodos. Nove vias metabólicas foram associadas: angiogênese e
sobrevida celular, hipertrofia, estresse oxidativo, apoptose, matriz extracelular,
cinética do cálcio, metabolismo celular e inflamação, descritos na Figura 3.
43
Figura 3 – Vias metabólicas e genes alvos relacionados com o Infarto do Miocárdio.
Após a extração de RNA a partir de amostras de tecido cardíaco, estes foram
quantificados por espectrofotometria, conforme descrito na Tabela 2.
Vias Metabólicas Código do gene Nome do Gene
Akt1 v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1
Vegfa Vascular endothelial growth factor
Bax Bcl2-associated X protein
Mapk14 Mitogen activated protein kinase 14
Tp53 Tumor protein p53
Fas TNF receptor superfamily, member 6
Mapk1 Mitogen activated protein kinase 1
Pln Phospholamban
Atp2a2 ATPase, Ca++ transporting, cardiac muscle
ReyR Ryanodine receptor 2, cardiac
Slc8a1 Sarcolemal NA-Ca exchanger
Casq2 Calsequestrin
Gpx4 Gutathione peroxidase
Cat Catalase
Hspa1a, Hspa1b Heat shock 70kD protein
Sod1 Superoxide dismutase
Igf1 Insulin-like growth factor 1
Cabin1 Calcineurin A
Chp2 Calcineurin B
Nfatc3 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent
Map3k2 MAP kinase kinase kinase-2
Edn1 Endothelin 1
Ace Angiotensin I converting enzyme (peptidyl-dipeptidase A) 1
Nppa Natriuretic peptide A
Nppb Natriuretic peptide B
Agtr1a Angiotensin II receptor type 1a
Prkca Protein kinase C, alfa
Prkcb Protein kinase C, beta I
Prkcg protein kinase C, gamma
Ace 2 Angiotensin I converting enzyme (peptidyl-dipeptidase A) 2
Myh6 Myosin heavy chain, alpha
Myh7 Myosin heavy chain, beta
TNF-α Tumor necrosis factor
IL-6 Interleukin 6
Tnfrsf1a Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1a
Col3a1 Collagen, type III
Tgfb1 Transforming growth factor, beta 1
Col1a1 Collagen, type I
Mmp9 Matrix Metalloproteinase 9
Tnc Tenascin C
Hk1 Hexokinase 1
Ucp-2 Mitochondrial uncoupling protein 2
Pfkm Phosphofructokinase
Ndufa3 NADH dehydrogenase (ubiquinose) 1 alpha subcomplex, 3
Taz Tafazzin
Slc2a1 Facilitated glucose transporter
Gapdh Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
Matriz extracelular
Metabolismo celular
Angiogenese/sobrevida
celular
Apoptose
Cinética do cálcio
Estresse oxidativo
Hipertrofia
Inflamação
44
Tabela 2 – Quantificação de RNA extraído das amostras de tecidos cardíacos dos
animais submetidos a OAC após 3 dias.
Grupo Amostra Concentração ng/ul
Pureza 260/280 nm
68 896,90 2,01
72 898,80 1,98
SHAM 93 1067,20 1,94
94 1246,80 2,04
95 794,10 1,92
77 1352,50 1,96
79 1643,60 2,04
IM 89 847,60 1,95
90 1525,90 2,02
91 1936,00 1,98
67 810,60 1,91
80 749,00 1,87
IM+Laser 82 840,80 1,94
85 1296,70 2,01
88 1514,20 2,03
4.3 ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA
Para examinar possíveis mecanismos responsáveis pelas alterações
morfológicas encontradas pós Infarto Agudo do Miocárdio, medimos a expressão de
47 genes, utilizando PCR em tempo real. Os genes foram agrupados nas seguintes
vias metabólicas: Angiogênese e sobrevida celular, Hipertrofia, Estresse oxidativo,
Apoptose, Matriz Extracelular, Cinética do Cálcio, Metabolismo celular e
Inflamação. Os resultados da expressão gênica nos grupos experimentais (IM e
IM+Laser) foram dados pelo número de vezes (fold change) que apresentaram
expressão aumentada (up regulated) ou diminuida (down regulated) quando
comparados ao grupo Controle (Sham). Os resultados estão apresentados na Tabela
3 e Figura 4.
45
Tabela 3 – Alterações na expressão gênica de mRNA 3 dias após a cirurgia da oclusão da Artéria Coronária comparada com a Cirurgia Sham.
* p <0,05 versus grupo SHAM; #p <0,05 versus grupo IM. Os valores de P foram determinados por ANOVA.
Vias Metabólicas Código do gene Sham IM IM + Laser
Akt1 0,863 1,448 1,033
Vegfa 0,869 0,1718* 0,2733*
Bax 0,549 1,034 0,807
Mapk14 0,696 0,879 0,612
Tp53 0,545 1,583* 0,9093#
Fas 0,598 0,719 0,503
Mapk1 0,674 0,996 0,742
Pln 0,948 0,2177* 0,2906*
Atp2a2 0,794 0,229* 0,1815*
ReyR 0,915 0,373 0,730
Slc8a1 0,571 0,602 0,434
Casq2 0,612 0,246 0,348
Gpx4 0,643 0,694 0,496
Cat 0,674 0,573 0,619
Hspa1a, Hspa1b 0,626 0,509 0,515
Sod1 0,866 0,3896* 0,4017*
Igf1 0,481 2,164* 1,493*
Cabin1 0,497 0,587 0,545
Chp2 0,584 0,579 0,426
Nfatc3 0,632 1,184 0,712
Map3k2 0,558 0,594 0,501
Edn1 0,605 2,03* 0,958#
Ace 0,629 1,298* 0,6142#
Nppa 1,000 1,539 0,895
Nppb 0,982 1,893 1,962
Agtr1a 0,899 7,552* 5,315*#
Prkca 0,504 0,780 0,498
Prkcb 0,462 0,583 0,301
Prkcg 0,875 0,439 0,526
Ace 2 0,603 0,725 0,827
Myh6 1,234 0,2014* 0,4042*
Myh7 1,078 0,501 0,703
TNF-α 0,624 0,820 0,581
IL-6 0,435 7,104* 2,709#
Tnfrsf1a 0,638 2,292* 1,373#
Col3a1 0,770 8,621* 3,063#
Tgfb1 0,504 3,18* 1,653*#
Col1a1 0,852 13,83* 6,562*#
Mmp9 0,531 2,719* 0,9761#
Tnc 0,837 12,95* 8,448*#
Hk1 0,808 1,178 1,019
Ucp-2 0,465 1,245* 0,6819#
Pfkm 0,981 0,1724* 0,1635*
Ndufa3 1,039 0,976 1,224
Taz 0,783 0,527 0,436
Slc2a1 0,551 2,448* 1,262#
Gapdh 0,711 3,134* 1,493#
Inflamação
Matriz extracelular
Metabolismo celular
Angiogenese/sobrevida
celular
Apoptose
Cinética do cálcio
Estresse oxidativo
Hipertrofia
46
Figura 4 – Expressão gênica dos 47 genes nos grupos experimentais IM e IM+Laser comparados ao grupo Controle (Sham).
0,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000 14,000
Akt1
Vegfa
Bax
Mapk14
Tp53
Fas
Mapk1
Pln
Atp2a2
ReyR
Slc8a1
Casq2
Gpx4
Cat
Hspa1a
Sod1
Igf1
Cabin1
Chp2
Nfatc3
Map3k2
Edn1
Ace
Nppa
Nppb
Agtr1a
Prkca
Prkcb
Prkcg
Ace 2
Myh6
Myh7
TNF-α
IL-6
Tnfrsf1a
Col3a1
Tgfb1
Col1a1
Mmp9
Tnc
Hk1
Ucp-2
Pfkm
Ndufa3
Taz
Slc2a1
Gapdh
An
gio
gen
ese
Ap
op
tose
Cin
étic
a d
o c
álci
oEs
tre
sse
oxi
dat
ivo
Hip
ert
rofi
aIn
flam
açã
oM
atri
zex
trac
elu
lar
Met
abo
lism
o c
elu
lar
SHAM
IM X SHAM
IM+Laser x SHAM
47
O Grupo Infarto do Miocárdio (IM), e o Grupo Infarto + Laser (IM+Laser),
quando comparados ao grupo controle (Sham), apresentaram 22 (44,60%) e 12
(25,53%) de genes diferencialmente expressos respectivamente, como mostra a
figura 10 e 11. Desses, no grupo IM, 15 (71,42%) encontravam-se up regulated e 6
(28,57%) down regulated. No grupo IM+Laser, 6 (50%) encontravam-se up regulated
e 6 (50%) down regulated. O Grupo IM+Laser quando comparado ao Grupo IM
apresentou 14 genes diferencialmente expressos, destes 14 (100%), encontravam-se
down regulated (Figuras 5 e 6).
Figura 5 – Quantidade de genes diferencialmente expressos nos grupos IM e IM+Laser quando
comparados ao grupo Sham.
Gen
es
48
Figura 6 – Perfil de expressão dos 47 genes analisados por PCR em tempo Real. A – Grupo IM X
Sham, B – Grupo IM+Laser x grupo Sham, C – Grupo IM X Grupo IM+Laser.
Além dos perfis de expressão gênica entre os grupos IM e IM+Laser
comparados ao Sham, também comparamos os níveis de expressão entre os genes
dentro das vias metabólicas, conforme descrição abaixo:
ANGIOGÊNESE E SOBREVIVÊNCIA CELULAR
A angiogênese pós-IM também foi avaliada após a laserterapia. A Figura 7
mostra a expressão do mRNA dos genes envolvidos na Angiogênese e sobrevivência
celular. O grupo IM determinou uma redução significativa de 80,22 % na expressão
do gene Vegfa quando comparado com o grupo Sham. O grupo IM+Laser também
A B
C
49
apresentou uma redução na expressão do gene Vegfa, caracterizando a laserterapia,
nos parâmetros utilizados, como incapaz de aumentar a vascularização (Fig. 7 A).
Com relação à sobrevida celular, a expressão do Akt1 não sofreu alteração
significativa nos grupos IM e IM+Laser, quando comparados ao grupo controle (Fig 7
B).
Figura 7 - Níveis de expressão do RNAm de Vegfa e Akt1 sobre o tecido do miocárdio após laserterapia
por ensaio de PCR em tempo real. Todos os dados representam uma quantificação relativa para a
expressão do gene 18S (2-ΔΔCt). A - Houve uma redução na expressão do mRNA do gene Vegfa nos
Grupos IM e IM+Laser. B - Animais do grupo IM e IM+Laser não apresentaram diferenças significativas
na expressão do gene Akt1 quando comparados ao grupo Sham. Os dados foram descritos em médias
± E.P.M. * p <0,05 versus grupo controle; Os valores de P foram determinados por ANOVA.
APOPTOSE
A Figura 8 mostra a expressão do mRNA dos genes envolvidos na Apoptose.
O grupo IM determinou um aumento significativo de 190,29 % na expressão do gene
Tp53 quando comparado com o grupo Sham. A laserterapia reduziu significativamente
a expressão do gene Tp53 em 42,55% quando comparada com o grupo IM, sugerindo
uma menor ativação de processos apoptóticos após a laserterapia (Figura 8 A). Esta
evidência sugere que o laser pode estimular a sobrevivência celular após o infarto,
inibindo a apoptose da área viável do coração possivelmente para manter a
homeostase cardíaca após o infarto. A expressão dos genes Fas, Map3k2, Bax e
50
Mapk14 não sofreram alteração nos grupos IM e IM+Laser, quando comparados ao
grupo controle (Figuras 8 B).
Figura 8 –Expressão de mRNA de Tp53, Fas ,Map3K2, Bax e Mapk14 sobre o tecido do miocárdio
após laserterapia por ensaio de PCR em Tempo Real. Todos os dados representam uma quantificação
relativa para a expressão do gene 18S –(2-ΔΔCt). A - Houve um aumento na expressão do mRNA do
Tp53 no Grupo IM. Uma regulação negativa na expressão de mRNA foi detectada no grupo IM + laser,
sugerindo um efeito da laserterapia. B - Animais do grupo IM e IM+Laser não apresentaram diferenças
significativas nos genes Map3K2, Bax, Mapk14 e Fas quando comparados ao grupo Sham. Os dados
foram descritos em médias ± E.P.M. * p <0,05 versus grupo controle; #p <0,05 versus grupo IM. Os
valores de P foram determinados por ANOVA.
CINÉTICA DO CÁLCIO
51
A expressão de genes que regulam a cinética do cálcio, importante no
remodelamento miocárdico após o infarto foi avaliada. Houve uma redução
significativa de 71,14% e 77,13% na expressão do gene Atp2a2 nos grupos IM e
IM+Laser respectivamente, quando comparados ao grupo controle. O gene PLN
também mostrou-se significativamente reduzido tanto no grupo IM (77,03%) quanto
no grupo IM+Laser (69,34%). Ambos não caracterizaram a ação da laserterapia na
reversão desta diminuição da expressão gênica (Figuras 9 A). A expressão dos genes
Ryr2, Casq2 e Slc8a1 não sofreram alteração significativas nos grupos IM e IM+Laser,
quando comparados ao grupo controle (Figuras 9 B).
Cinética do Cálcio
Figura 9 – Expressão de mRNA de Atp2a2, Pln, Ryr2, Casq2 e Slc8a1, sobre o tecido do miocárdio
após laserterapia por ensaio de PCR em Tempo Real. Todos os dados representam uma quantificação
relativa para a expressão do gene 18S –(2-ΔΔCt). A - Houve uma redução na expressão do mRNA dos
genes Atp2a2 e Pln nos Grupo IM e IM+Laser. B - Animais do grupo IM e IM+Laser não apresentaram
diferenças significativas nos genes Ryr2, Casq2 e Slc8a1 quando comparados ao grupo Sham. Os
dados foram descritos em médias ± E.P.M. * p <0,05 versus grupo controle; #p <0,05 versus grupo
IM. Os valores de P foram determinados por ANOVA.
ESTRESSE OXIDATIVO
Sham IM IM+Laser0.0
0.5
1.0
1.5
**
Atp
2a2 m
RN
A e
xp
ressio
n
(fo
ld c
han
ge)
Sham IM IM+Laser0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Ryr2 m
RN
A e
xp
ressio
n
(fo
ld c
han
ge)
Sham IM IM+Laser0.0
0.5
1.0
1.5
Casq
2 m
RN
A e
xp
ressio
n
(fo
ld c
han
ge)
Sham IM IM+Laser0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
* *
Pln
mR
NA
exp
ressio
n
(fo
ld c
han
ge)
Sham IM IM+Laser0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Slc
8a1 m
RN
A e
xp
ressio
n
(fo
ld c
han
ge)
A A
B B B
52
O estresse oxidativo grave e prolongado pode desencadear a apoptose e
necrose. Diversas condições patológicas tem um componente de stress oxidativo,
incluindo doenças cardiovasculares, especialmente no infarto do miocárdio.
Avaliamos a expressão gênica dos genes Cat, Hspa1a, Sod1 e Gpx4 envolvidos no
estresse oxidativo. A expressão do gene Sod1, mostrou-se significativamente
reduzida tanto no grupo IM (55,01%) quanto no grupo IM+Laser (53,61%). A
laserterapia não foi capaz de aumentar a expressão deste gene, caracterizado como
importante antioxidante (Figura 10 A). A expressão dos genes, Cat, Hspa1a, e Gpx4
não sofreram alterações significativas nos grupos IM e IM+Laser, quando comparados
ao grupo controle (Figuras10 B).
Figura 10 – Expressão de mRNA de Sod1, Gpx4, Cat e Hspa1a sobre o tecido do miocárdio após
laserterapia por ensaio de PCR em Tempo Real. Todos os dados representam uma quantificação
relativa para a expressão do gene 18S –(2-ΔΔCt). Houve uma redução na expressão do mRNA do gene
Sod1 no Grupo IM e IM+Laser, evidenciando que a laserterapia não foi capaz reverter esta situação.
Animais do grupo IM e IM+Laser não apresentaram diferenças significativas nos genes Cat, Hspa1a e
Gpx4 quando comparados ao grupo Sham. Os dados foram descritos em médias ± E.P.M. * p <0,05
versus grupo controle; #p <0,05 versus grupo IM. Os valores de P foram determinados por ANOVA.
53
HIPERTROFIA
O processo de remodelação cardíaca se caracteriza por alterações da
geometria, volume, massa e constituição do coração em resposta a uma agressão. A
hipertrofia miocárdica é um importante componente da remodelação cardíaca, que
permite ao coração manter suas funções básicas em vigência do aumento das
condições de carga. Em longo prazo, entretanto, a hipertrofia representa fator de risco
dependente para morbidade e mortalidade das doenças cardíacas. Para avaliar a
hipertrofia pós IM, analisamos a expressão gênica de 16 genes (Igf1, Edn1, Ace,
Nppa, Agtr1a, Prkca, Myh6 , Myh7, Cabin1, Chp2, Nfatc3, Map3k2, Nppb, Prkcb,
Prkcg e Ace2). De acordo com a figura 11, o grupo IM determinou um aumento
significativo na expressão dos genes: Edn1 (235,48%), Ace (106,52%) e Agtr1a
(740,23%) quando comparados com o grupo Sham 3 dias após o infarto. A
laserterapia reduziu significativamente a expressão dos genes citados quando
comparados com o grupo IM: Edn1 (52,80%), Ace (52,68%%) e Agtr1a (29,62%)
quando comparada com o grupo IM, sugerindo uma redução nos processos
hipertróficos após a laserterapia (Fig 11 A). O gene Myh6, mostrou-se
significativamente reduzido tanto no grupo IM (83,67%) quanto no grupo IM+Laser
(67,24%). Ao contrário, o gene Igf1, mostrou-se significativamente aumentado tanto
no grupo IM (350,27%) quanto no grupo IM+Laser (210,65%). Em ambos os casos a
laserterapia não foi eficaz (Fig. 11 B). Nas Figuras 11 C e 12 C podemos observar que
a expressão dos genes Prkca, Myh7, Cabin1, Chp2, Nfatc3, Map3k2, Nppa, Nppb,
Prkcb, Prkcg e Ace2, não sofreram alterações nos grupos IM e IM+Laser, quando
comparados ao grupo controle.
54
Figura 11 – Expressão de mRNA de Ace, Agtr1a, Edn1, Myh6, Igf1, Nppa, Myh7 e Prkca sobre o
tecido do miocárdio após laserterapia por ensaio de PCR em Tempo Real. Todos os dados representam
uma quantificação relativa para a expressão do gene 18S –(2-ΔΔCt). A - Houve um aumento na
expressão do mRNA de Ace, Agtr1 e Edn1no Grupo IM. Uma regulação negativa na expressão de
mRNA dos mesmos genes foi detectada no grupo IM + laser, sugerindo um efeito da laserterapia. B -
Houve uma redução na expressão do mRNA Myh6 e um aumento na expressão Igf1 nos Grupos IM e
55
IM+Laser. C - Animais dos grupos IM e IM+Laser não apresentaram diferenças significativas nos genes
Cabin1, Chp2, Nfatc3, Map3k2, Nppa, Nppb, Prkca, Prkcb, Prkcg, Ace 2 e Myh7 quando comparados
ao grupo Sham. Os dados foram descritos em médias ± E.P.M. * p <0,05 versus grupo controle; #p
<0,05 versus grupo IM. Os valores de P foram determinados por ANOVA.
56
Figura 12 – Expressão de mRNA de Ace2, Nfatc3, Prkcb, Prkcg, Cabin1, Nppb, Map3k2 e Chp2 sobre
o tecido do miocárdio após laserterapia por ensaio de PCR em Tempo Real. Todos os dados
representam uma quantificação relativa para a expressão do gene 18S –(2-ΔΔCt). C - Animais do grupo
IM e IM+Laser não apresentaram diferenças significativas nos genes Cabin1, Chp2, Nfatc3, Map3k2,
Nppb, Prkcb, Prkcg, Ace2 quando comparados ao grupo Sham. Os dados foram descritos em médias
± E.P.M. * p <0,05 versus grupo controle; #p <0,05 versus grupo IM. Os valores de P foram
determinados por ANOVA.
METABOLISMO CELULAR
Para avaliar a ação da laserterapia no metabolismo celular, analisamos os
genes Hk1, Ucp-2, Pfkm, Ndufa3, Taz, Slc2a1 e Gapdh no tecido do miocárdio 3 dias
após o IM. O grupo IM determinou um aumento significativo na expressão dos genes
Ucp-2 (167,68%), Slc2a (344,60%) e GAPDH (340,60%) quando comparado com o
grupo Sham. A laserterapia reduziu significativamente a expressão dos genes Ucp-2
(45,22%), Slc2a (48,44%) e GAPDH (52,36%) quando comparados com o grupo IM,
sugerindo a ação do laser no metabolismo celular (Fig 13 A). Houve uma redução
significativa de 82,43% e 83,34%% na expressão do gene Pfkm nos grupos IM e
IM+Laser respectivamente, quando comparados ao grupo controle (Fig 13 B). A
expressão dos genes Hk1, Ndufa3 e Taz, não sofreram alterações significativas nos
grupos IM e IM+Laser, quando comparados ao grupo controle (Fig 13 C).
57
Figura 13 – Expressão de mRNA de Gapdh, Slc2a1, Ucp-2, Pfkm, Taz, Ndufa3 e Hk1 sobre o tecido
do miocárdio após laserterapia por ensaio de PCR em Tempo Real. Todos os dados representam uma
quantificação relativa para a expressão do gene 18S –(2-ΔΔCt). A - Houve um aumento na expressão do
mRNA de , Ucp-2, Slc2a1 e Gapdh no Grupo IM. Uma regulação negativa na expressão de mRNA dos
mesmos genes foi detectada no grupo IM + laser, sugerindo um efeito da laserterapia. B - Houve uma
redução na expressão do mRNA Pfkm nos Grupos IM e IM+Laser, evidenciando que a laserterapia não
58
foi capaz reverter esta situação. C - Animais do grupo IM e IM+Laser não apresentaram diferenças
significativas nos genes Ndufa3, Hk1 e Taz , quando comparados ao grupo Sham. Os dados foram
descritos em médias ± E.P.M. * p <0,05 versus grupo controle; #p <0,05 versus grupo IM. Os valores
de P foram determinados por ANOVA.
MATRIZ EXTRACELULAR
Modificações da matriz extracelular estão envolvidas em uma série de
distúrbios estruturais e funcionais do coração. Dessa forma, o melhor conhecimento
da dinâmica da matriz extracelular cardíaca é importante para a melhor compreensão
da fisiopatologia de distúrbios da função da bomba cardíaca, como na insuficiência
cardíaca e no Infarto do Miocárdio. Para avaliar a ação da laserterapia na composição
e a dinâmica da matriz extracelular cardíaca pós IM, avaliamos a expressão gênica
de 5 genes (Col1a1,Col3a1, Tgfb1, Mmp9 e Tnc) após 3 dias da OAC. Houve um
aumento significativo em todos os genes analisados. A expressão do Col1a1 e Col3a1
foi aumenta em 1523,62% e 1019,61%, respectivamente, no grupo IM comparado com
o grupo SHAM. Em contraste, a expressão do Col1a1 e Col3a1 foi diminuida em
52,55%% e 64,47%), respectivamente, no grupo IM+Laser, quando comparado com
o grupo IM. O grupo IM também determinou um aumento significativo na expressão
gênica dos genes Tgfb1, Mmp9 e Tnc em 530,95% e 412,24%, e 1447,56%
respectivamente quando comparado com o grupo SHAM. A laserterapia foi capaz de
reduzir a expressão de todos os genes citados, em 48,01%, 64,10% e 34,76%,
respectivamente (Fig. 14 A).
59
Figura 14 – Expressão de mRNA de Tgfb1, Col1a1, Col3a1, Mmp9 e Tnc sobre o tecido do miocárdio
após laserterapia por ensaio de PCR em Tempo Real. Todos os dados representam uma quantificação
relativa para a expressão do gene 18S –(2-ΔΔCt). A - Houve um aumento na expressão do mRNA de
Col1a1, Col3a1, Tgfb1, Mmp9 e Tnc no Grupo IM. Uma regulação negativa na expressão de mRNA
dos mesmos genes foi detectada no grupo IM + laser, sugerindo um efeito da laserterapia. Os dados
foram descritos em médias ± E.P.M. * p <0,05 versus grupo controle; #p <0,05 versus grupo IM. Os
valores de P foram determinados por ANOVA.
INFLAMAÇÃO
Após as primeiras horas de infarto do miocárdio ocorre uma resposta
inflamatória com infiltração de leucócitos e marcada libertação de citocinas
60
inflamatórias, incluindo TNF-α, IL-6 e IL-1β (FRANGOGIANNIS et al., 2002).
Analisamos o perfil de expressão gênica dos genes IL-6, Tnfrsf1a e Tnf. A expressão
gênica de IL-6 e Tnfrsf1 apresentaram aumento significativo três dias após o IM em
1531,60% e 259,24%, respectivamente. A laserterapia após a oclusão coronária
reduziu significativamente a expressão do RNAm de citocinas em 61,86% e 40,09%,
respectivamente (Fig. 15 A). A expressão do gene Tnf não sofreu alteração
significativa nos grupos IM e IM+Laser, quando comparados ao grupo controle (Fig.
15 B).
Figura 15 – Expressão de mRNA de IL-6, Tnfrsf1a e Tnf sobre o tecido do miocárdio após laserterapia
por ensaio de PCR em Tempo Real. Todos os dados representam uma quantificação relativa para a
expressão do gene 18S –(2-ΔΔCt). A - Houve um aumento na expressão do mRNA deTnfrsf1a e IL-6 no
Grupo IM. Uma regulação negativa na expressão de mRNA dos mesmos genes foi detectada no grupo
IM + laser, sugerindo um efeito da laserterapia. B - Animais do grupo IM e IM+Laser não apresentaram
diferenças significativas no gene Tnf quando comparados ao grupo Sham. Os dados foram descritos
em médias ± E.P.M. * p <0,05 versus grupo controle; #p <0,05 versus grupo IM. Os valores de P foram
determinados por ANOVA.
61
5. DISCUSSÃO
O presente trabalho visou analisar a expressão gênica no miocárdio
remanescente de corações de ratas infartadas submetidos à irradiação com laser de
baixa intensidade. O estudo foi conduzido para caracterizar a função cardíaca e a
expressão gênica global em diferentes vias metabólicas potencialmente envolvidas no
infarto do miocárdio, e suas alterações após tratamento com irradiação laser.
Grande parte dos estudos (ALBERTINI et al., 2007; AIMBIRE et al., 2008;
ALBERTINI et al., 2008; LIMA et al., 2009; XAVIER et al., 2010; PIRES et al., 2011;
MESQUITA-FERRARI et al., 2011) com laserterapia utilizaram números limitados de
genes para um estudo mais detalhado e mais apropriado para análises aprofundadas
de certos mecanismos. Neste estudo, o PCR array nos oferece a oportunidade de uma
busca mais abrangente, já que é possível analisar ao mesmo tempo 47 genes
relacionados ao IM. Por meio dessa análise mais abrangente foi possível identificar
padrões distintos entre os Grupos controle e os grupos IM e IM+Laser, bem como
sinalizar potenciais genes diferencialmente expressos, de interesse para estudos mais
aprofundados e marcadores preditores de risco para IC.
De modo geral, nossos resultados demonstraram que o Grupo Infarto do
Miocárdio (IM), e o Grupo Infarto + Laser (IM+Laser), quando comparados ao grupo
controle (Sham), apresentaram 22 (44,60%) e 12 (25,53%) de genes diferencialmente
expressos respectivamente, como mostram as Figuras 10 e 11. Desses percentuais,
no grupo IM, 15 (71,42%) encontravam-se up regulated e 6 (28,57%) down regulated.
No grupo IM+Laser, 6 (50%) encontravam-se up regulated e 6 (50%) down regulated.
O Grupo IM+Laser quando comparado ao Grupo IM apresentou 14 genes
diferencialmente expressos, destes 14 (100%), encontravam-se down regulated.
O conhecimento da resposta inflamatória no miocárdio isquêmico e o papel das
citocinas após MI nos permite compreender a remodelação após o IM. Portanto, as
terapias imunomoduladoras como laser de baixa potência podem ser promissoras
para atenuar a resposta inflamatória, melhorar a remodelação cardíaca e,
possivelmente, melhorar a função cardíaca após o IM.
Analisamos o perfil de expressão gênica dos genes IL-6, Tnfrsf1a e Tnf. A
expressão gênica de IL-6 e Tnfrsf1 apresentaram grande aumento três dias após o IM
em 1531,60% e 259,24%, respectivamente. A laserterapia após oclusão coronária
reduziu significativamente a expressão do mRNA destas citocinas em 61,86% e
62
40,09%, respectivamente. Apesar de não verificarmos alterações significativas no
gene TNF, observamos um aumento de expressão no IM e redução pela LBI no seu
receptor, Tnfrsf1, indicando que, talvez mais tardiamente, estas alterações possam
ocorrer. Esses efeitos anti-inflamatórios da LBI através de diminuição da expressão
de mediadores inflamatórios foram relatados por diversos autores (LOPES-MARTINS
et al., 2006; XAVIER et al., 2010; MANCHINI et al., 2014).
Imediatamente após o infarto, a lesão tecidual e a morte de cardiomiócitos por
necrose e apoptose ativam uma resposta inflamatória aguda sincronizada que podem
durar horas, dias ou semanas. A modulação de fatores apoptóticos, gerados pela
oclusão coronariana e consequente morte celular, após a aplicação do laser de baixa
intensidade ainda pouco estudada. A indução de morte celular por apoptose foi
avaliada pela análise do mRNA de Tp53, Map3K2, Bax, Mapk14. O grupo IM
apresentou um aumento significativo de 190,29 % na expressão do gene Tp53 quando
comparado com o grupo Sham. A laserterapia reduziu significativamente a expressão
do gene Tp53 em 42,55% quando comparada com o grupo IM, sugerindo uma menor
ativação de processos apoptóticos após a laserterapia. Esta evidência sugere que o
laser pode estimular a sobrevivência celular após o infarto, inibindo a apoptose da
área viável do coração, possivelmente para manter a homeostase cardíaca após o
infarto. Como mostrado, não observamos diferenças estatísticas na expressão gênica
dos demais genes.
Uma das ações sugeridas pela LBI é a promoção da angiogênese. Analisando
o miocárdio de ratos infartados tratados com o laser de baixa potência (ƛ= 804 nm),
Tuby et al., em 2006, demonstraram o aumento significativo na expressão de VEGF
(fator de crescimento vascular endotelial) e da enzima sintetase de óxido nítrico
induzível (iNOS) em tecidos de animais irradiados. No entanto, os parâmetros de
irradiação de laser utilizados no nosso modelo IM+LASER não foram capazes de
aumentar a expressão do VEGF. Manchini et al. (2014) mostrou que não houve
aumento da expressão de VEGF ou da densidade de vasos capilares em miocárdio
pós-infarto irradiado. Publicações recentes têm mostrado um aumento da
angiogênese após LLLT em vários tecidos (CURY et al., 2013; SZYMANSKA et al.,
2013). Essa discrepância entre estes estudos e os nossos pode ser explicado pelo
fato de que estas investigações utilizarem diferentes comprimentos de onda e / ou
densidade de energia nos seus protocolos de irradiação. De fato, a mudança da
63
densidade de energia podem induzir diferentes efeitos biológicos por LBI (HUANG et
al., 2009). Assim, novos estudos devem ser realizados para alcançar uma dose
adequada para aumentar a angiogênese no miocárdio infartado / irradiado pós-IM.
O processo de remodelação cardíaca se caracteriza por alterações da
geometria, volume, massa e constituição do coração em resposta a uma agressão
tecidual. A hipertrofia miocárdica é um importante componente da remodelação
cardíaca, que permite ao coração manter suas funções básicas em vigência do
aumento das condições de carga. Em longo prazo, entretanto, a hipertrofia representa
fator de risco dependente para morbidade e mortalidade das doenças cardíacas
(PFEFFER et al., 1990; ZORNOFF et al., 2002)
O sistema Renina-Angiontensina possui papel importante na fisiopatologia do
infarto do miocárdio e hipertrofia cardíaca e contribui para progressão da insuficiência
cardíaca (JOHNSTON, 1994). Este sistema é composto pelo angiotensinogênio,
renina, enzima conversora de angiotensina (ECA ou Ace) e receptores de
angiotensina II (AT1 e AT2). O aumento da angiotensina II no tecido cardíaco pós-IM
está relacionado com o aumento do estresse oxidativo que ativaria as vias
inflamatórias (MARCHESI et al., 2008) e apoptóticas (DIMMELER et al., 2000).
Esses achados demonstram a prevenção ou atenuação da pressão sanguínea
elevada assim como a hipertrofia cardíaca associada e contribuiriam para a melhora
do remodelamento cardíaco (PFEFFER et al., 1990; SOLVD, 1991). Para avaliar a
hipertrofia pós IM, analisamos a expressão gênica de 16 genes (Igf1, Edn1, Ace,
Nppa, Agtr1a, Prkca, Myh6, Myh7, Cabin1, Chp2, Nfatc3, Map3k2, Nppb, Prkcb, Prkcg
e Ace2). Nossos estudos comprovaram ação do laser no miocárdio infartado através
da participação do sistema renina angiotensina. O aumento da expressão da ECA em
modelos experimentais de infarto são relacionados com insuficiência cardíaca.
Interessantemente os nossos resultados apresentaram diminuição desses valores no
grupo MI+Laser. Entre os estímulos envolvidos no processo de remodelação, destaca-
se a Angiotensina II, formada tanto in situ como sistemicamente, a partir da
angiotensina I, por meio da ECA. A angiotensina II, ao atuar em receptores AT1
(Agtr1a), estimula o crescimento celular e o acúmulo de colágeno tecidual (MILL, et
al., 1994; SHIEFFER et al., 1994).
A endotelina-1 (Edn1) é um potente vasoconstritor derivados do endotélio.
Como ocorre com outras substâncias vasoconstritores, um aumento na expressão de
64
Edn1 está associado com a insuficiência cardíaca e um mal prognóstico. A
angiotensina - II pode também contribuir para um aumento na densidade de
receptores de Edn1 (QI et al., 2001). Apesar da forte interação entre a angiotensina
II e a endotelina - 1 terem importância reconhecidas na insuficiência cardíaca, poucos
dados existem a respeito de como esta interação ocorre molecularmente. Nossos
resultados sugerem esta interação, visto que houve um aumento na expressão de
ECA e Edn1 no grupo IM.
Outros processos bioquímicos são desencadeados na hipertrofia cardíaca e
contribuem para a perda de função após o IM. A diminuição na expressão da cadeia
pesada de miosina alfa (MHC-α) e o aumento na expressão da cadeia pesada de
miosina beta (MHC-β) prejudicam diretamente a capacidade contrátil do miocárdio
após o IM (PANTOS et al. 2007; PANTOS et al. 2009). Estas duas isoformas da
miosina são componentes contráteis do miócito. A MHC-α possui atividade ATPásica
mais alta, o que gera uma contração cardíaca mais eficiente. Por outro lado, a MHC-
β possui atividade ATPásica mais lenta, contribuindo para uma contração menos
eficiente (MORKIN 1993). O gene Myh6, mostrou-se significativamente reduzido tanto
no grupo IM (83,67%) quanto no grupo IM+Laser (67,24%). Ao contrário, o gene Igf1,
mostrou-se significativamente aumentado tanto no grupo IM (350,27%) quanto no
grupo IM+Laser (210,65%). Em ambos os casos a laserterapia não foi eficaz.
Da mesma forma, ocorre uma diminuição na expressão da proteína cálcio
ATPase do retículo sarcoplasmático (Serca2a) e da fosfolambam (Plb), envolvidos na
cinética de cálcio. Assim, a capacidade de recaptar cálcio do mioplasma fica
comprometida, contribuindo ainda mais para a disfunção contrátil, causando uma
alteração na cinética de cálcio (PANTOS et al. 2007; CALISE et al. 2009; BERNARDO
et al. 2010). Segundo nossos resultados, houve uma redução significativa de 71,14%
e 77,13% na expressão do gene Atp2a2 nos grupos IM e IM+Laser respectivamente,
quando comparados ao grupo controle. O gene PLN também mostrou-se
significativamente reduzido tanto no grupo IM (77,03%) quanto no grupo IM+Laser
(69,34%). A expressão dos genes Ryr2, Casq2 e Slc8a1 não sofreram alterações
significativas nos grupos IM e IM+Laser, quando comparados ao grupo controle.
Nossos resultados indicam que as ratas infartadas podem apresentar distúrbios
contráteis do miocárdio decorrentes do infarto diretamente relacionados à gravidade
do remodelamento ao reduzir os níveis de expressão de Serca2 no grupo IM. Porém,
65
a LBI não foi capaz de aumentar a expressão destes genes, evidenciando a
recuperação da cinética de cálcio normal.
Outro importante componente da remodelação é o tecido conjuntivo, formando
uma complexa e organizada rede de colágeno que circunda e interliga todas essas
estruturas e que têm como principais funções a regulação da apoptose, oferecer
resistência às deformações patológicas, manter o alinhamento das estruturas e
regular a transmissão de força durante o encurtamento da fibra cardíaca. Porém,
dependendo do estímulo ao qual o coração é submetido, pode ocorrer acúmulo de
colágeno, caracterizando a fibrose miocárdica (PFEFFER et al., 1990; ZORNOFF et
al., 2002). A Matriz Extracelular (MEC) é composta por uma rede de colágeno,
especificamente os colágenos tipo I e III, elastina, fibronectina e laminina (SPINALE,
2002; ADAIR-KIRK & SENIOR, 2008; CALVET et al., 2009). Por serem capazes de
degradar componentes proteicos da MEC, as MMPs participam de uma variedade de
processos fisiológicos como angiogênese, reparação tecidual, morfogênese,
mobilização de células tronco e cicatrização de feridas (LI et al., 2000;
VANHOUTTE et al., 2006; KUPAI et al., 2010; POLYAKOVA et al., 2010).
Na falência cardíaca, o colágeno é degradado por MMPs, que estão em níveis
aumentados, e é substituído por fibras de colágeno com uma fraca capacidade de
interação, promovendo a dilatação dos ventrículos (BROWER et al., 2006). Além
disso, a digestão da matriz extracelular libera moléculas com potente efeito na síntese
de matriz, tais como fatores de crescimento de ligação à matriz e as matriquinas, que
são peptídeos de matriz fragmentados com atividade biológica na regulação da
atividade das células do tecido conjuntivo. O resultado final é, muitas vezes, um
aumento das MMPs acompanhado de um aumento da fibrose (LI et al., 2000). Os
dados de Polyakova e colaboradores (2010) mostram que o aumento da expressão
das MMP, especialmente das MMPs 9, estão associados à maturação do colágeno I
e III em indivíduos com IC, indicando a importância dessas enzimas na configuração,
ativação e deposição do colágeno no processo de fibrose.
A tenascina-C (Tnc) é uma glicoproteína de MEC é frequentemente co-
expressa com MMPs. Além disso, demonstrou-se, em células de músculo liso
vascular, que a degradação de colágeno de tipo I por MMPs promove o aumento da
expressão de TNC (JONES et al., 1999). Por outro lado, também a TNC regula a
expressão de MMPs (TREMBLE et al., 1994). A maioria das células não expressam
66
constitutivamente TNC; no entanto, a sua expressão pode ser induzida por um número
de citocinas em outras circunstâncias, incluindo, Fgf1, Tgf1, IL-4 e TNF, (SMITH et
al., 1997; LATIJNHOUWERS et al., 1998).
Para avaliar a ação da laserterapia na composição e a dinâmica da matriz
extracelular cardíaca pós IM, avaliamos a expressão gênica de 5 genes
(Col1a1,Col3a1, Tgfb1, Mmp9 e Tnc) após 3 dias da OAC. Houve um aumento
significativo da expressão de todos os genes analisados. A expressão do Col1a1 e
Col3a1 foi aumenta em 1523,62% e 1019,61%, respectivamente, no grupo IM
comparado com o grupo SHAM. Em contraste, a expressão do Col1a1 e Col3a1 foi
diminuída em 52,55%% e 64,47%), respectivamente, no grupo IM+Laser, quando
comparado com o grupo IM. O grupo IM também apresentou um aumento significativo
na expressão gênica dos genes Tgfb1, Mmp9 e Tnc em 530,95%, 412,24% e
1447,56% respectivamente quando comparados com o grupo SHAM. A laserterapia
foi capaz de reduzir a expressão de todos os genes citados, em 48,01%, 64,10% e
34,76%, respectivamente.
Nossos dados corroboram com a literatura (TREMBLE et al., 1994;
LATIJNHOUWERS et al., 1998), onde observamos um aumento na expressão dos
genes Col1a1 e Col3a1, MMP-9, Tgfb1 e Tnc pós-IM. O tratamento com a LBI foi
capaz de reduzir os níveis de expressão, reduzindo o processo de degradação da
MEC e formação de fibrose miocárdica.
Um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e
desintoxicação de seus intermediários reativos causa estresse oxidativo. As células
devem responder a este desequilíbrio antes das moléculas altamente reativas
danificar estruturas celulares, particularmente o DNA. O estresse oxidativo grave e
prolongado pode desencadear a apoptose e necrose. Diversas condições patológicas
tem um componente de estresse oxidativo, incluindo doenças cardiovasculares,
doenças neurodegenerativas tais como a doença de Alzheimer e inflamação crônica.
Genes-alvo como Sod1, Gpx4, Cat e Hspa1a, incluem antioxidantes e genes
envolvidos no metabolismo de superóxido. Os produtos destes genes podem auxiliar
a reduzir o estresse oxidativo por quebrar ROS.
Após análises da expressão dos genes envolvidos no extresse oxidativo,
observamos que o gene Sod1 mostrou-se significativamente reduzido tanto no grupo
IM (55,01%) quanto no grupo IM+Laser (53,61%). A laserterapia não foi capaz de
67
aumentar a expressão deste gene, caracterizado como importante antioxidante. A
expressão dos genes, Cat, Hspa1a, e Gpx4 não sofreram alterações significativas nos
grupos IM e IM+Laser, quando comparados ao grupo controle. Assim como na
angiogênese, os parâmetros de irradiação utilizados no nosso modelo IM e LBI não
foram capazes de aumentar a expressão do Sod1.
Entre os mecanismos envolvidos no remodelamento cardíaco, podemos
destacar o déficit energético, com aumento da atividade da via glicolítica e diminuição
na utilização de ácidos graxos livres (SWYNGHEDAUW, 1999; ASHRAFIAN et al.,
2007). O coração é um órgão de alta demanda de ATP tanto para seu relaxamento
quanto para contração adequados. O ATP é proveniente, principalmente, da oxidação
de ácidos graxos de 60 a 90% e também de carboidratos. Após o IM, a resposta
humoral leva ao aumento de catecolaminas e cortisol, que dentre suas ações
aumentam a lipólise e a liberação de ácidos graxos livres para o coração (LOPASHUK
et al, 2010; WITTELES et al, 2008).
Para avaliar a ação da laserterapia no metabolismo celular, analisamos os
genes Hk1, Ucp-2, Pfkm, Ndufa3, Taz, Slc2a1 e GAPDH no tecido do miocárdio 3 dias
após o IM. Em processos isquêmicos, o substrato metabólico é dependente da
severidade da isquemia. Uma eliminação completa do fluxo de maneira rápida resulta
em depleção de fosfatos de alta energia e acúmulo de lactato, que posteriormente,
leva à necrose e ao infarto. Em corações normais há consumo de lactato em pequenas
quantidades, porém, em algumas condições como isquemia e hipóxia, pode haver
aumento dos receptores de glicose GLUT-1 (Slc2a) e então, o coração passa a formar
muito lactato, aumentando o metabolismo anaeróbico de carboidrato (STANLEY et al.,
2003).
A integridade da membrana mitocondrial também é fundamental para a
eficiência da geração de energia. As proteínas desacopladoras (UCPs) localizam-se
na membrana interna da mitocôndria e têm função de translocação dos prótons e
elétrons do espaço intermembranares para a matriz mitocondrial, gerando calor e
diminuindo a produção de ATPs (BRAND e ESTEVES, 2005). Embora só existam
estudos preliminares para o papel da Ucp-2 no tecido cardíaco, ela parece estar
desregulada na IC humana (MURRAY et al., 2006).
O grupo IM determinou um aumento significativo na expressão dos genes Ucp-
2 (167,68%), Slc2a (344,60%) e GAPDH (340,60%) quando comparado com o grupo
68
Sham, resultados que sugerem uma ação orquestrada para uma depleção de ATPs.
Porém, a laserterapia foi capaz de diminuir os níveis de expressão destes RNAm em
45,22%, 48,44% e 52,36% respectivamente, quando comparados com o grupo IM,
sugerindo uma reorganização da via, com um aumento da produção energética.
A expressão dos genes Hk1, Ndufa3 e Taz, não sofreram alterações
significativas nos grupos IM e IM+Laser, quando comparados ao grupo controle.
A fosfofrutoquinase (Pfkm), uma enzima extremamente importante na
modulação do metabolismo energético, é a responsável por catalisar a reação de
frutose-6- fosfato a frutose-1,6-bifosfato, a terceira reação da via glicolítica (KODDLE
et al., 2007; STANLEY et al., 2005). Em nossos resultados, encontramos redução da
Pfkm em 82,43% nos animais infartados, o que sugere uma redução na utilização do
substrato energético. Estas alterações sugerem que nesta fase, tanto a via glicolítica
quanto a via da beta-oxidação dos ácidos graxos possam estar prejudicadas,
configurando o IM com importante prejuízo da produção energética. Apesar da
laserterapia não ter sido capaz de recuperar a expressão de RNAm da
fosfofrutoquinase, evidenciamos um possível ganho energético com a alteração na
expressão dos genes Ucp-2 e Slc2a.
69
6. CONCLUSÃO
Os resultados encontrados neste trabalho sugerem que a laserterapia foi capaz
de modular alguns genes envolvidos em vários processos pós-infarto, entre eles a
apoptose, processos inflamatórios, a hipertrofia cardíaca, o metabolismo celular e
principalmente a composição da MEC, tão importante para o remodelamento
cardíaco.
Perspectivas e limitações
Os dados aqui obtidos são complexos, sinalizam genes de interesse e
certamente permitem análises mais aprofundadas de potenciais genes chaves na
resposta. Esses genes poderiam ser escolhidos para estudos futuros como, por
exemplo, de ações de microRNAs nas regulações destes genes, de preditores da
atividade da doença e determinantes de susceptibilidade. Assim, esse “screening”
inicial dos perfis de expressão garante outros estudos mais aprofundados para
confirmar e explicar o papel de cada gene ou grupo de genes envolvidos no infarto do
miocárdio.
Novas estratégias terapêuticas do laser de baixa intensidade podem ser
estudadas nesse modelo de oclusão coronária, tais como dose e comprimento de
onda. Embora muitos estudos demonstrem o efeito benéfico da laserterapia como
nova estratégia não farmacológica, se faz necessária uma análise a longo prazo dos
resultados para verificar os benefícios da irradiação com laser encontrados na fase
aguda do infarto se estende para estágios mais tardios da doença isquêmica
(progressão da insuficiência cardíaca).
70
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8. APENDICE
Artigos aceitos e publicados:
MANCHINI, MARTHA TRINDADE; SERRA, ANDREY JORGE; FELICIANO,
REGIANE DOS SANTOS; SANTANA, EDUARDO TADEU; ANTÔNIO, EDNEI LUIS;
DE TARSO CAMILLO DE CARVALHO, PAULO; MONTEMOR, JAIRO; CRAJOINAS,
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