UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO - s3.uninove.brs3.uninove.br/app/uploads/2016/08/01101401/1471272578-dissertacao... · Acidente ofídico ou ofidismo é o quadro de envenenamento decorrente

UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO - UNINOVE

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO STRICTU SENSU

ANA TEREZA BARUFI FRANCO

EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS

ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA

SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA.

SÃO PAULO

2013

EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA

UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO - UNINOVE

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO STRICTU SENSU

ANA TEREZA BARUFI FRANCO

EFEITO DO LASER DE BAIXA POTÊNCIA SOBRE CÉLULAS ENDOTELIAIS

tEND SUBMETIDAS À LESÃO POR VENENO DA SERPENTE

BOTHROPOIDES JARARACA.

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Medicina da

Universidade Nove de Julho, como requisito

para obtenção do título de Mestre em Medicina.

Orientador: Prof. Dra. Stella Regina Zamuner.

SÃO PAULO

2013




“Se enxerguei mais longe, foi porque estava sobre os ombros de gigantes.”

(Isaac Newton).

“Por que o homem quer subir a montanha mais alta do mundo? Ora, a resposta é a mais simples possível, porque ela está lá.”

O desafio é uma virtude inerente ao ser humano. Foi assim que me senti diante da proposta de realizar este trabalho.

Como algo totalmente novo, abracei esse repto, com o doce sabor de aventura e de fascinação, diante às novas sendas abertas por essa jornada através das

fronteiras do conhecimento e da habilidade humana.


DEDICATÓRIA

À Deus, pela minha vida e pela paz e força nos momentos

em que me encontrei incapaz de prosseguir.

Dedico esta tese às pessoas mais importantes para mim,

minha amada mãe Maria Teresinha, e ao meu amado pai Walter,

principais responsáveis pela minha vida e a quem devo meu

caráter e disciplina ao trabalho; e ao meu querido namorado

Eduardo, sempre paciente e generoso em meus momentos de muito

estudo e ausência.

Ofereço este trabalho em memória do meu avô Antonio, que

sempre me guiou ao sucesso e sempre confiou em minha

capacidade e que agora se encontra junto a Deus.

Esta dedicatória se estende também a minha amiga,

professora e orientadora Drª. Stella Regina Zamuner. A esta devo

a confiança em minha capacidade como pesquisadora, além da

paciência e tranquilidade para me transmitir os ensinamentos da

pesquisa.


AGRADECIMENTOS

À Universidade Nove de Julho, que aceitou me receber no

programa de Mestrado e acreditou no meu profissionalismo;

À PROSUP/CAPES, pela bolsa de estudos;

À professora Silvia Fernanda Zamuner, que muito me auxiliou

nos experimentos e na melhor compreensão de nossos questionamentos;

Às minhas queridas alunas Luciana e Aline, que muito me

ajudaram desde o início e me ensinaram toda a base científica que hoje

eu possuo. E também pelos momentos alegres, de compreensão e

amizade.

Às minhas irmãs, Carolina, Ana Olívia e Malu pelo apoio.

Aos meus sobrinhos, Maria Eduarda e Antonio, pelos momentos

alegres e de distração.

Aos demais familiares que sempre me incentivaram e torceram

pela minha vitória.

Aos amigos de Mestrado, de modo especial Vera, Elis, Beatriz,

Fernanda, Gabriela e Vinícius pelo apoio sincero e pela agradável

companhia.

E a todas as pessoas que direta ou indiretamente colaboraram

para o sucesso deste trabalho.


RESUMO

As serpentes do gênero Bothrops e Bothropoides são as responsáveis

pelo maior número de acidentes ofídicos no Brasil, apresentando efeitos

sistêmicos graves, além de induzirem um quadro fisiopatológico caracterizado

por reações locais como edema, mionecrose, dor e hemorragia. A utilização do

soro antibotrópico desempenha a função de neutralizar a maior quantidade

possível do veneno circulante, minimizando assim seus efeitos sistêmicos,

porém sua ação não se estende as manifestações locais. A laserterapia de

baixa potência é uma alternativa de tratamento em situações de lesão local,

devido a seus efeitos biológicos, sendo considerado um recurso bioestimulante

em tecidos. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do laser de baixa

potência vermelho- comprimento de onda de 660 nm; e o laser infravermelho-

comprimento de onda 780 nm, em monocamada de células endoteliais

submetidos à lesão por veneno de Bothropoides jararaca. Os resultados

obtidos mostraram que o veneno, afetou a integridade das monocamadas de

células endoteliais em todas as concentrações analisada (5, 10, 12,5, 25 e

50L/mL) em todos os períodos de tempo analisados. Para avaliação do efeito

protetor do laser, a dose usada de 4 J/cm2 reduziu o descolamento de células

endoteliais melhorando assim a integridade celular. Esse efeito foi observado

nos comprimentos de onda de 660 nm nos tempos de 60 e 120 min, o mesmo

efeito não foi observado com o comprimento de onda 780 nm. Desta forma,

este estudo permitiu entender melhor os efeitos fisiopatológicos do

envenenamento botrópico, bem como contribuiu para a melhor compreensão

dos efeitos do laser de baixa potência e, eventualmente, favorecer medidas

terapêuticas mais eficientes e/ou complementares.

Palavras chaves: endotélio, Bothropoides jararaca, laser de baixa potência.


ABSTRACT

The Bothropoides and Bothrops gender are responsible for the largest

number of snakebites in Brazil, presenting serious systemic effects that induce

pathophysiological alterations characterized by local reactions such as edema ,

myonecrosis, pain and hemohrrage. The antivenom is used to neutralize the

greatest possible amount of circulating venom, minimizing its systemic effects.

But its action does not extend to local manifestations. The low level laser

therapy is an alternative treatment in situations of local lesions due to its

biological effects, and is considered a biostimulate resource to the tissues . The

aim of this study was to analyze the effect of low power laser -red wavelength of

660 nm, and the infrared laser- wavelength 780 nm, in endothelial cells

submitted to injury by Bothropoides jararaca venom. The results showed that

the snake venom affected the integrity of endothelial, in all concentrations (1, 5,

10, 12,5, 25 and 50 µg/mL); and affected the viability of endothelial cell in 10

µg/ mL at all time periods analyzed . To evaluate the protective effect of the

laser, the dose of 4 J/cm2 reduced the detachment of endothelial cells by

improving cellular integrity . This effect was observed in a wavelength of 660 nm

at 60 and 120 minutes. The same effect was not observed with the wavelength

of 780 nm. So, the present study allowed us to better understand the

pathophysiological effects of Bothropoides venom, and contributed to a better

understanding of the effects of low power laser and eventually facilitate

therapeutic measures more efficient and / or complementary.

Keywords : endothelium , Bothropoides jararaca, low level laser


ÍNDICE

Conteúdo Página

Resumo

1.Introdução 06

1.1.Acidentes ofídicos e epidemiologia 06

1.2.Mecanismos de ação do veneno botrópico 08

1.3.A serpente Bothropoides jararaca 09

2.Considerações gerais sobre o endotélio vascular 14

2.1.O veneno botrópico e as células endoteliais 16

3.Soroterapia 17

4. Terapia com laser de baixa potência 20

4.1. LBP e acidentes ofídicos 21

4.2. Laser e células em cultura 22

5. Objetivos

5.1. Geral

5.2. Específicos

24

24

24

6. Material e Métodos

6.1. Veneno de serpente Bothropoides jararaca (VBj)

6.2. Células endoteliais (CE)

6.3. Cultivo Celular

6.4. Irradiação laser de baixa potência

6.5. Ensaio de viabilidade celular (MTT)

6.6. Ensaio para a avaliação da integridade da monocamada de células

endoteliais – Descolamento Celular

6.7. Análise da liberação da lactato desidrogenase (LDH)

25

25

25

25

26

28

29

29

7. Análise estatística 31

8. Resultados e Discussão

8.1. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na integridade de células

endoteliais tEND

8.2. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na viabilidade de células

endoteliais tEND

8.3. Efeito da exposição do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa Potência

na integridade das células endoteliais tEND.

8.4. Efeito da exposição do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa Potência

na viabilidade das células endoteliais tEND.

32

32

34

36

38


8.5. Efeito do Laser de Baixa Potência 660 nm na integridade de células

endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.

8.6. Efeito do Laser de Baixa Potência 780 nm na integridade de células


40

42

8.7. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 660 nm na viabilidade de células


44

8.8. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 780 nm na viabilidade de células


46

8.9. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 660 nm na liberação da enzima

Lactato Desidrogenase (LDH) de células endoteliais submetidas à lesão por

veneno B. jararaca.

48

8. 10. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 780 nm na liberação da enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.

50

9.Discussão 52

10. Considerações Finais 59

11. Referências Bibliográficas 60



6

1. INTRODUÇÃO

1.1. Acidentes ofídicos e epidemiologia

Acidente ofídico ou ofidismo é o quadro de envenenamento decorrente

da inoculação de toxinas através do aparelho inoculador de serpentes. Devido

ao grande número de casos, os acidentes causados por serpentes

peçonhentas constituem, ainda, um problema de Saúde Pública em regiões

tropicais do mundo (Chippaux, 1998; Moura da Silva, 2012).

No Brasil, o primeiro estudo epidemiológico de acidentes ofídicos foi

realizado por Vital Brasil em 1901, quando levantou o número de óbitos por

picadas de serpentes peçonhentas no Estado de São Paulo, registrando um

número considerável de óbitos por acidentes ofídicos desde 1900 (Bochner et

al, 2003), devido ao agravamento do quadro após o envenenamento, conforme

Tabela 1.

As serpentes responsáveis pelo maior número de acidentes ofídicos na

América Latina pertencem ao gênero Bothrops e Bothopoides, da família

Viperidae (Moura da Silva, 2012), e por esse motivo, esse gênero constitui o

grupo mais importante, com mais de 60 espécies em todo o território e pode

ser encontrada em ambientes diversos. Segundo registros das ocorrências

anuais, as serpentes do gênero Bothrops e Bothropoides são responsáveis por

mais de 90% dos acidentes ofídicos no Brasil (Chippaux, 1998; Moura da Silva,

2012), sendo que a maior frequência desses acidentes envolve a serpente

Bothropoides jararaca (Nishijima et al, 2009).


7

Tabela 1. Acidentes ofídicos e suas respectivas gravidade

Extraído de: Extraído de: Ministério da Saúde- Acidentes ofídicos

http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/gve_7ed_web_atual_aap.pdf

Com relação ao gênero Bothrops e Botropoides, os acidentes

causados por essas serpentes não apresentam alta letalidade (0,31 %), porém

devido à alta incidência, são consideradas de grande importância

epidemiológica no país (Manual de diagnóstico e tratamentos de acidentes por

animais peçonhentos, 1999), conforme exemplificado na figura.

http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/gve_7ed_web_atual_aap.pdf


8

Figura 1 – Acidentes ofídicos ocorridos no Brasil.

1.2. Mecanismo de ação do envenenamento botrópico

Os venenos ofídicos constituem uma mistura complexa de proteínas e

outros compostos, com as mais diversas propriedades biológicas. Acredita-se

que os seus efeitos resultem da somatória dos efeitos isolados dos vários

componentes, com atividades biológicas distintas ou sinérgicas (Takeya et al.,

1990; Zychar et al., 2010; Bruserund, 2013).

O envenenamento pela espécie Bothrops e Bothropoides leva a

manifestações sistêmicas e locais, as quais incluem desde dor e edema à

insuficiência renal e choque hipovolêmico (Warrell, 1996; Doin-Silva, et al.,

2009; Milani Junior, et al., 1997; Carneiro, et al., 2002; Zychar et al., 2010;

Bruserund, 2013).

Dentre as manifestações após o envenenamento, aquelas locais se

evidenciam nas primeiras horas após a picada com a presença de edema, dor

e equimose na região da picada, que progride ao longo do membro acometido.


9

Além disso, as marcas nem sempre são visíveis no momento da picada, assim

como o sangramento nos pontos de inoculação das presas. Bolhas com

conteúdo seroso ou serohemorrágico podem surgir na evolução e dar origem à

necrose cutânea. As principais complicações locais são decorrentes da

necrose e da infecção secundária que podem levar à amputação e/ou déficit

funcional do membro (Chippaux, 1998; Warrell, 1996).

As manifestações sistêmicas são evidenciadas por sangramentos em

pele e mucosas (gengivorragia, equimoses à distância do local da picada);

hematúria, hematêmese e hemorragia em outras cavidades podem determinar

risco ao paciente. A hipotensão, também presente, pode ser decorrente de

sequestro de líquido no membro picado ou hipovolemia consequente a

sangramentos, que podem contribuir para a instalação de insuficiência renal

aguda (Chippaux, 1998; Warrell, 1996).

1.3 A serpente Bothropoides jararaca (B. jararaca)

A serpente Botropoides jararaca anteriormente classificada como

Botrhops jararaca apresenta porte médio, podendo atingir até 1,5 m, com

presença de escamas superiores fortemente quilhadas. As espécies desse

gênero são encontradas em todo o Brasil e também nas regiões adjacentes ao

Paraguai e Argentina (Barraviera, 1993), conforme figura 2 abaixo:


10

Figura 2 – Distribuição geográfica da B. jararaca

extraída de:www.cobrasbrasileiras.com.br

O veneno da serpente B. jararaca consiste de uma mistura complexa

de várias classes de toxinas, sendo que a maior parte consititui-se de

metaloproteinases (Moura-da-Silva, et al., 2012). Diferentemente de outros

venenos botrópicos, o veneno de B. jararaca apresenta concentrações muito

baixas de fosfolipase A2 e/ou miotoxinas; outra classe de protease presente no

veneno de B. jararaca são as serinoproteases, as quais são capazes de induzir

a liberação de bradidinina (Moura da Silva et al, 2012).

Nesse sentido, o gênero B.jararaca possui veneno com maior atividade

proteolítica em comparação aos demais venenos, sendo demonstrado por

estudos que a hemorragia consiste na maior atividade tóxica do veneno de

jararaca (Nishijima et al., 2009; Teixeira et al., 2005; Baldo et al., 2010; Moura-

da-Silva, et al., 2012).

Maior prevalência B. jararaca

http://www.cobras/


11

A literatura sugere que metaloproteinases do veneno da serpente

(SVMPs) são responsáveis pela hemorragia local no envenenamento ofídico

(Baramova et al., 1989; Kamiguti, 1996; Nishijima et al., 2009; Teixeira et al.,

2005; Baldo et al., 2010; Moura-da-Silva, et al., 2012). Ainda, as SVMPs

possuem efeito citotóxico sobre as células endoteliais, atuando principalmente

no sistema homeostático (Nishijima et al, 2009).

Assim, a patogenicidade envolvida no envenenamento por B. jararaca

inclui a lesão de vasos da microcirculação, através da ação das

metaloproteinases do veneno ofídico, as quais pertencem à uma subfamília de

enzimas Zn2+-dependentes (Teixeira et al, 2005; Nishijima et al, 2009; Brenes

et al., 2010; Domingos et al, 2013). A lesão dos vasos ocorre quando há

inoculação do veneno, que contém dentre outros componentes, SVMPs,

astacinas e serralisinas, classficadas conforme a figura 03, e que agem na

matriz celular por possuírem elevada afinidade com a mesma (Teixeira et al,

2005; Baldo et al, 2010), desencadeando os efeitos miotóxicos


12

Figura 3: Classificação das Metaloproteinases de venenos.

Extraído de Fox et al., 2008

Dados da literatura indicam que as SVMPs atuam sobre proteínas da

matriz extracelular, com diferentes especifidades. Considerando que as

proteínas presentes na matriz são importantes para manter a integridade

estrutural e funcional do endotélio, foi proposto que a degradação dos seus

componentes pelas metaloproteinases de venenos poderia ser o principal

mecanismo envolvido na produção de hemorragia, através da proteólise da

membrana basal, permitindo a formação de fendas intercelulares, culminando

com a saída de hemácias (Baramova et al,1989; Teixeira et al, 2005; Nishijima

et al, 2009; Baldo et al, 2010).

Ainda, a literatura demonstra que as SVMPs hemorrágicas, com

elevado peso molecular, que são constituídas por domínios semelhantes de

disintegrina e domínios ricos de cisteína, são mais ativas na indução

hemorragia em comparação à enzimas que abrangem apenas o domínio de

metaloproteinases (Teixeira et al, 2005; Brenes et al., 2010). Ademais, a


13

atividade hemorrágica tem sido associada, também, com a atividade

proteolítica (Teixeira et al, 2005), as quais promovem degradação estrutural e

funcional presente na mionecrose (Baldo et al, 2010).

Diante disso, as células endoteliais têm sido estudadas como

potenciais alvos das toxinas hemorrágicas (Baldo et al, 2010) sendo que o

principal mecanismo de adesão de células endoteliais pode ser interrompido

pela presença de SVMPs, utilizando de mecanismos dependentes ou

independentes de sua atividade proteolítica. Tanto as SVMPs hemorrágicas

quanto as não hemorrágicas demonstraram interferir nos componentes

envolvidos na adesão entre as células endoteliais e as proteínas presentes na

matriz extracelular, culminando na morte celular por apoptose (Teixeira et al,

2005). Em estudos experimentais, as SVMPs hemorrágicas e não-

hemorrágicas são capazes de induzir comparável taxas de apoptose em

células endoteliais, e o aparecimento da hemorragia induzida pelas SVMPs

ocorre muito mais cedo do que a indução de apoptose de células endoteliais in

vitro. (Baldo et al, 2010).

Dentre as SVMPs presentes no veneno de B. jararaca, entre as

isoladas, a jararagina é a que tem sido melhor estudada e pertence ao grupo P-

IIIb, uma MMP hemorrágica, e atua promovendo o influxo leucocitário e pode

estimular diretamente a expressão de mRNA dos genes TNF, IL-1 e IL-6, por

macrófagos licitados (Teixeira et al, 2005), o que sugere que os macrófagos

constituem de alvos importante do mecanismo envolvido na ação decorrente

das SVMPs no processo inflamatório (Teixeira et al, 2005; Baldo et al, 2010).

A jararagina foi a primeira SVMPs isolada do veneno da B. jararaca e

foi caracterizada por completo sua estrutura primária, mostrando que atua


14

diretamente nos vasos sanguíneos endoteliais e sub-endoteliais, na matriz

proteica, plaquetas, coagulação, fatores como Fator de von Willebrand (vWF) e

fibrinogênio. Ainda, atua sobre os receptores da superfície das células e sobre

os fibroblastos, células epiteliais e inflamatórias, sendo capaz de promover a

degradação da fibrina e aumento da fibrinólise devido ao aumento da atividade

ativadora do plasminogênio tecidual e inativação do inibidor de α2 plasmina,

além de interferir na função plaquetária através da inibição de colágeno e na

agregação de plaquetas induzida por ristocetina (Moura-da-Silva et al., 2012).

Ademais, Baldo et al. (2010), buscou comparar os efeitos hemorrágicos

imediatos entre a SVMPs BnP1, extraída da B. neuwiedi, pertencente ao grupo

P-Ia e, portanto, considerada de baixo potencial hemorrágico, e a jararagina, na

pele de camundongos. Esse estudo teve por objetivo avaliar as alterações

provocadas entre as SVMPs. A jararagina foi capaz de produzir um efeito

hemorrágico intenso, enquanto que mesmo as doses mais elevadas de BnP1

não foi capaz de produzir efeito comparável. Ainda, este trabalho mostrou que

a jararagina causa lesão hemorrágica na hipoderme dos animais, indicando

degradação massiva de colágeno fibrilar e que a jararagina foi localizada

próximo aos pequenos vasos sanguíneos. (Baldo et al, 2010).

2. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O ENDOTÉLIO VASCULAR

O endotélio vascular é constituído por uma camada contínua de células

– células endoteliais - que revestem o lúmen dos vasos e separam o sangue

dos tecidos. A sua integridade funcional e estrutural é fundamental para a

manutenção da homeostasia e da função circulatória (Carvalho, 1996).


15

As células endoteliais de um modo geral são alongadas, poligonais e

dotadas de ampla superfície. A parte luminal está continuamente exposta às

células circulantes e aos componentes plasmáticos. A porção oposta,

abluminal, está em contato com a matriz extracelular e tecidos adjacentes, que

por meio de integrinas, liga-se a lamina basal. Esta é constituída por vários

tipos de colágenos (tipo IV, V e VII), laminina, sulfato de heparan e de

condroitina, proteoglicanos, entactina, nidogênio e sialoglicoproteínas,

associados à fribonectina. Dado o alto teor de colágeno, a lâmina basal pode

ser digerida por colagenases (Carvalho et al., 1996).

O endotélio além da sua função como membrana semipermeável, é

considerado um tecido metabolicamente ativo. Por sua capacidade de sintetizar

e secretar inúmeras substâncias exerce várias funções fisiológicas: a) no

metabolismo de substâncias vasoativas, por conter enzimas que transformam a

angiotensina I em angiotensina II e inativam a noradrenalina, serotonina e

bradicinina; b) na hemostasia, por meio da produção de substâncias

coagulantes (fator de Von Willebrand; inibidor de plaminogênio) e

anticoagulantes, como a prostaciclina (PGI2) c) na produção de antígenos dos

grupos A e B, fibronectina, colágenos d) na modulação do tônus vascular, por

sua capacidade de produzir e liberar fatores relaxantes da musculatura lisa dos

vasos, como o óxido nítrico (NO) (Moncada, et al., 1988; Moncada et al., 1991).

Por outro lado as células endoteliais sofrem alterações de estrutura,

função e propriedades metabólicas, em resposta a fatores de crescimento,

substâncias vasoativas e citocinas, que variam de acordo com o tecido em que

se localizam (Thuillez, 2005). Desse modo, o endotélio ativado afeta o


16

crescimento do músculo liso, por sua capacidade de gerar diversos fatores de

crescimento que induzem espessamento da parede dos vasos e favorecem o

desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Carvalho et al., 1996).

Em síntese, o endotélio, em condições fisiológicas, desempenham papel

protetor do sistema cardiovascular, liberando substâncias que modulam a

contração do músculo liso vascular, a sua proliferação, a adesão e agregação

plaquetária e controlam a hemostasia. Portanto, em condições de disfunção ou

lesão desse tecido, há repercussão sobre a estrutura vascular, tecido adjacente

e, por fim, sobre o sistema cardiovascular.

2.1. O veneno botrópico e as células endoteliais

Os venenos e as toxinas hemorrágicas isoladas afetam,

principalmente, a integridade de vasos de pequeno calibre (Ownby, 1990;

Borkow et al., 1993). Lomonte et al. (1994) demonstraram que os vasos da

microcirculação perdem a sua integridade em 4 a 6 minutos após exposição ao

veneno de Bothrops asper. Este efeito foi atribuído, em parte, à proteólise da

membrana basal dos vasos pelo veneno, levando à saída de eritrócitos por

processo ainda não esclarecido. Adicionalmente, os venenos hemorrágicos, de

modo geral, causam uma série de alterações morfológicas e degenerativas em

células endoteliais, que progridem até a formação de fendas intercelulares,

permitindo a saída de hemácias (Ownby, 1990; Lomonte et al, 1994). Estes

dados sugerem uma ação direta principalmente das SVMPS, importante para o

desenvolvimento da hemorragia.


17

Ainda, a mionecrose local é uma consequência comum nos

envenenamentos causados pelas serpentes do gênero Bothropoides. Há

evidências de que a mionecrose é causada por uma família de proteínas

denominadas miotoxinas, componentes dos venenos botrópicos, as quais

possuem características de fosfolipases A2 (PLA2) e atuam diretamente sobre a

membrana da célula muscular, por se ligarem e alterarem a membrana

plasmática (Gutierréz et al., 1984; Brenes et al., 1987). Essas miotoxinas

induzem dano tecidual proeminente, de forma que, as alterações morfológicas

são observadas a partir de 15 minutos de sua injeção (Gutierréz & Lomonte,

1995). A miotoxicidade pode, ainda, ser consequência da isquemia dos vasos

da microcirculação e de artérias intramusculares (Gutierréz et al., 1984;

Queiróz & Petta, 1984). Neste sentido, um mecanismo adicional envolvido na

atividade das SVMPs hemorrágicas poderia estar relacionado com o acúmulo

dessas SVMPs próximo de vasos capilares, através das propriedades adesivas

de domínios não catalíticos promovendo a hidrólise dos componentes da

membrana basal e o rompimento dos vasos sanguíneos. Este mecanismo tem

sido sugerido, mas até o momento não há evidências experimentais de que

isso ocorre in vivo (Baldo et al, 2010). Ainda, foi demonstrado que a BaP1, uma

SVMP isolada do veneno de B. asper, causa morte celular por apoptose em

célula endotelial mas que aparentemente as células endoteliais sofrem outros

tipos de morte celular, o que gera efeitos citotóxicos (Brenes et al., 2010).

3. SOROTERAPIA

Devido à eficiência dos antivenenos, os coeficientes de letalidade,

decorrentes do envenenamento botrópico, têm revelado tendência decrescente


18

ao longo do tempo. No entanto, a eficiência do tratamento do envenenamento

botrópico é baseada no tempo de adminstração do antiveneno específico

(Hansson et al., 2013). Estudos experimentais têm sugerido que existe uma

significante, embora parcial, neutralização da hemorragia, edema e mionecrose

apenas quando o antiveneno é administrado rapidamente após o

envenenamento (Battelino et al., 2003; Domingos et al, 2013). Neste sentido,

Camey et al (2002), estudaram o efeito farmacológico do veneno de cinco

espécies botrópicas brasileiras: B. atrox, B. leucurus, B. erythromelas, B.

jararaca e B. jararacussu, e verificaram que o antiveneno foi efetivo na

neutralização sistêmica da atividade tóxica de todos os venenos testados.

Porém, os efeitos locais não são neutralizados pelo uso de antiveneno e os

mecanismos envolvidos nesta falta de proteção, até o momento, não foi

esclarecido.

Assim, a neutralização dos efeitos tóxicos sistêmicos é obtida, mas a

neutralização dos danos no tecido local, normalmente não ocorre. Portanto, a

busca de inibidores e/ou neutralizadores complementares à soroterapia para

redução dos efeitos locais causados pelo veneno se reveste de importância

(Nishijima et al, 2009).

No Brasil, tem sido crescente o interesse em investigar terapias

coadjuvantes à soroterapia já existente, embora ainda que insipientes, já

existem estudos que combinam o uso da soroterapia à aplicação de extratos de

plantas medicinais e substâncias sintéticas (Biondo et al., 2003; Cavalcante et

al., 2007).

Nesse sentido, Domingos et al (2013) tem descrito o composto de 1,2,3-

triazóis como uma classe com destaque e presente no sistema heterocíclico de


19

azoto de cinco membros, que apresenta diferentes perfis farmacológicos, tais

como atividade antiplaquetária, anticoagulante, antiviral, antimicrobiana, entre

outras funções e, foi demonstrado que tal composto foi capaz de inibir a

hemólise causada por veneno de B. jararaca (50 ug/ml) e L. Muta (15 ug/ml). A

inibição foi superior a 50% contra ambos os venenos.

Igualmente, Faioli et al (2013), concluiu que os extratos de esponjas

marinhas são capazes de inibir os efeitos in vivo, como hemorragia e edema e

os efeitos in vitro, como a coagulação, atividade proteolítica e hemolítica,

desencadeados pela inoculação dos venenos de serpentes de B. jararaca e L.

muta. Também verificaram que a administração de veneno de B. jararaca foi

letal para camundongos após duas horas e apenas extratos das esponjas

marinhas, como A. fulva , A. viridis , ou P. citrina, foram capazes de aumentar

as taxas de sobrevivência dos animais (Faioli et al, 2013), provavelmente pela

capacidade de neutralização dos efeitos sistêmicos. Isso ocorreu devido ao fato

de que os extratos de esponja foram capazes de inibir a hemólise induzida

pelos venenos (Domingos et al, 2013; Faioli et al, 2013; Zychar et al, 2010).

Nishijima et al (2009) descreveu que os extratos vegetais contêm uma

grande diversidade de compostos químicos contendo uma grande variedade de

atividades farmacológicas e buscou avaliar o potencial efeito anti-hemorrágico

de extratos vegetais e flavonóides obtidas a partir de vegetais como Mouriri

pusa, Byrsonima crassa, Davilla elliptica e Quina do Cerrado. Os resultados

sugerem que os extratos metanólicos e flavonóides de Mouriri pusa e Davilla

elliptica exerceram grande capacidade de neutralizar totalmente veneno contra

a atividade hemorrágica do veneno de B. jararaca, provavelmente por conter

substâncias ricas em flavonóides, que serviram como quelantes das SVMPs


20

presente no veneno, sugerindo modelos para a concepção de novas moléculas

para melhorar o tratamento atual preconizado para o envenenamento.

Entretanto, qualquer que seja a abordagem terapêutica até hoje

disponível, esta tem se mostrado ineficaz na neutralização dos efeitos locais

produzidos pelo veneno botrópico, os quais são de evolução rápida e intensa.

Por esses motivos, a procura por abordagens alternativas às usualmente

empregadas tem sido motivo de interesse e se constituem em medidas

extremamente relevantes para neutralização e/ou diminuição dos efeitos

degenerativos, bem como a aceleração do processo regenerativo. Outra

possibilidade que começa a ser implementada é a utilização de laserterapia.

4. TERAPIA COM LASER DE BAIXA POTÊNCIA

A palavra laser é uma sigla que corresponde “Light Amplification by

Stimulated Emission of Radiation, a qual significa “Amplificação da Luz por

Emissão Estimulada por Radiação” (Maluf, et al., 2006; Lins et al., 2010).

A ação do laser consiste na absorção da luz pelos tecidos, resultando

em modificações no metabolismo celular. Quando o laser é aplicado nos

tecidos a luz é absorvida por fotorreceptores localizados nas células, sendo

capaz de modular as reações bioquímicas específicas dentro da célula e

estimular uma série de reações em cadeia mitocondrial, resultando em síntese

de ATP (Dortbudak, 2000; Stein, et al.,2005; Rénno et al.,2011).

A radiação laser, também denominada de terapia fotodinâmica pode

influenciar as células individualmente através da energia emitida pelo laser e

absorvida pelas células (Hawkins-Evans, 2008; Szymanskj et al., 2013.). As


21

estruturas celulares possivelmente envolvidas nesses mecanismos são as

mitocôndrias, as quais fornecem energia para as células, e que possuem uma

série de enzimas que participam nas reações redox que ocorrem na cadeia

respiratória, e que possivelmente constituem o principal mecanismo envolvido

nas reações metabólicas que ocorrem em uma célula (Szymanskj et al., 2013.).

Adicionalmente, a terapia a laser de baixa potência (LBP) é considerada

como um recurso bioestimulante em tecidos, por meio de seus efeitos

biológicos, tais como analgésicos, antiinflamatórios e cicatrizantes (Lins, et al.,

2010).

Irradiação por laser de baixa potência são amplamente utilizados no

tratamento de doenças crônicas e também como terapia de reabilitação

(Vladimirov, 2012). O laser vermelho e infravermelho pode ser usado in vitro

para estimular a função das células, por promover um aumento no número de

células, e estimular a síntese de RNA, promovendo também a diferenciação

das células (Firestone et al, 2012; Dortbudak, 2000).

Khanna et al (1999), examinaram a influência de radiação laser de He-

Ne (632,8 nm) sobre o proliferação celular e sobre fatores angiogênicos de

VEGF e secreção de TGF-β por cardiomiócitos. Os resultados desse estudo in

vitro mostram aumentos estatisticamente significativos na proliferação celular

com potência de 5 W/cm2 e tempo de radiação de 15 e 20 minutos em

comparação com o grupo de controle. A expressão de VEGF e TGF-β

aumentou significativamente quando expostos a 10, 15 e 20 minutos de

radiação com LBP.

Igualmente, o efeito estimulante do LBP tem sido amplamante estudado

sobre proliferação de células endoteliais humanas, além do aumento nos níveis


22

de VEGF e TGF-β de secreção (Arany et al, 2007; Hakki et al, 2012; Kipshidze

et al, 2001). As conclusões dos estudos demonstram claramente a capacidade

da irradiação com o LBP para modular a expressão do gene e a liberação de

fatores de crescimento e citocinas a partir de células em cultura (Khanna et al,

1999).

4.1. LBP e acidentes ofídicos

Até o momento, poucos trabalhos foram publicados utilizando o LBP

para a avaliação do efeito local causado por veneno ofídico. Dourado, et al.,

estudou o efeito da irradiação laser Ga-As (Arseneto de Galium), em

mionecrose, induzida pelo veneno de serpente Bothrops moojeni. Esses

autores observaram que o tratamento com esse laser diminuiu

consideravelmente a mionecrose, inibindo a habilidade do veneno de desfazer

a integridade da membrana plasmática (Dourado et al., 2003).

Ainda, Barbosa, et al., demonstraram a eficácia do LBP na resposta

inflamatória local após lesão por veneno de Bothrops jararacussu no músculo

gastrocnêmio de ratos, onde foram submetidos à laserterapia combinada com

antiveneno, resultando em diminuição de edema e redução do influxo

leucocitário após a lesão (Barbosa et al., 2008). Doin-Silva, et al. (2009),

utilizaram a aplicação do LBP, no músculo tibial anterior de ratos 60 minutos

após a administração do veneno de B. jararacussu, e observaram que houve

diminuição na concentração de creatina quinase e redução das áreas de

mionecrose do músculo.

Ademais, dados do nosso grupo também demonstram uma redução

significativa de mionecrose induzida por veneno de B. jararacussu e as


23

miotoxinas BThtx I e II, após tratamento utilizando LBP, (Barbosa, et al., 2009;

Barbosa, et al., 2010). Além disso, demonstramos que o LBP reduz a

hemorragia e dor induzidas pelo veneno de B. moojeni (Nadur-Andrade, 2012,

2013). Estes dados sugerem o LBP como uma ferramenta terapêutica eficaz

para o tratamento local em casos de envenenamento botrópico.

4.2. Laser e células em cultura

Ao correlacionar a utilização do LBP em células de cultura, Alghamdi, et

al., (2011), corrobora que o LBP foi capaz de causar aumento no número de

células, síntese de DNA e RNA e aumento na taxa de ATP em células-tronco e

em outras linhagens celular. Ainda, foi sugerido utilizar o valor da densidade de

energia entre 0.5 a 4.0 J/cm2 e um espectro visível entre 600 e 900 nm de LBP

demonstrando ser úteis para melhorar a proliferação celular (Alghamdi, et al.,

2011).

A aplicação do LBP Arseneto de Gálio Alumínio em osteoblastos

cultivados em disco de Titânio, utilizando o comprimento de onda de 780 nm e

dose de 3 J/cm2 , demonstrou estimular a diferenciação osteoblástica (Petri, et

a.,l 2010). O uso desta técnica terapêutica demonstrou ser também eficaz no

crescimento de células epiteliais de rim de macaco cultivado em situação de

carência nutricional (2% de SFB), quando aplicadas irradiações repetidas de

LBP (InGaAlP) (Eduardo, et al., 2007).

Por tais motivos, determinar parâmetros como comprimento de onda,

densidade de energia, potência e tempo de aplicação do laser é importante

para se obter uma resposta celular adequada ao tratamento. Hawkins et al.

(2006), também relataram que a aplicação do LBP apresentou um efeito


24

estimulante na resposta celular de fibroblastos alterados, resultando no

aumento de migração celular, viabilidade e proliferação celular e atividade de

ATP.


25

5. OBJETIVOS

5.1. Geral

Analisar a influência da laserterapia de baixa potência sobre células

endoteliais tEnd, após lesão com o veneno de Bothropoides jararaca.

5.2. Específicos

Através de ensaios in vitro, foram avaliados os efeitos da irradiação laser

de baixa potência sobre células endoteliais submetidas aos efeitos do veneno de

Bothropoides jararaca quanto a:

I- Viabilidade das células (MTT);

II- Integridade;

III- Liberação de marcador de lesão celular (LDH)


26

6. MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo foi realizado no laboratório de cultivo celular do curso de

Mestrado em Medicina da Universidade Nove de Julho (UNINOVE).

6.1. Veneno de serpente Bothropoides jararaca (VBj): Os venenos

utilizado foram extraídos de vários exemplares adultos de serpentes B.

jararaca, provenientes do Instituto Butantan. Os venenos foram reunidos em

um mesmo tubo, homogeneizados, submetidos à liofilização e mantidos a

- 20oC até o momento de sua utilização.

6.2. Células endoteliais (CE): Utilizou-se células endoteliais murinas

(hibridomas) da linhagem tEnd (thimic endothelium), gentilmente cedidas pelo

Dr. Bruno Lomonte, do Instituto Clodomiro Picado, da Universidade da Costa

Rica, Costa Rica.

6.3. Cultivo Celular: As CE obtidas foram cultivadas em frascos de

poliestireno de 25 cm² (COSTAR), contendo 5 mL de meio de cultura DMEM

(SIGMA), suplementado com soro fetal bovino (SFB) 10%, gentamicina (40

πg/mL) e L-glutamina (2 mM/L) e mantidas em incubadora, em atmosfera de

5% C02, a 37°C. O meio de cultura foi trocado a cada 24 horas e as células

foram, então, subcultivadas. Para tanto, o meio de cultura DMEM foi aspirado

com pipeta Pasteur e as células lavadas com 2 mL de uma solução salina

balanceada (PBS). Em seguida, 2 mL de uma solução de tripsina 0.05%/

EDTA 0.02% foram adicionados ao frasco de cultura, o qual retornou à estufa

de cultura (5% CO2), a 37°C, por um período de até 5 minutos. Decorrido esse


27

período, as células foram observadas ao microscópio de luz invertida (Carl

Zeiss), para a verificação do destacamento das mesmas. Em seguida, as

células, tripsinizadas e homogeneizadas, foram colocadas em um tubo de 50

mL (COSTAR) e centrifugadas a 1200 x g, por 5 minutos. O sobrenadante foi

descartado e as CE foram ressuspendidas em meio DMEM/SFB. A partir daí,

as células foram semeadas em frascos de cultura de 75 cm² com meio

DMEM/SFB, previamente ambientalizado na estufa de cultura.

6.4. Condições de tratamento: Os experimentos foram realizados em

um ambiente com obscuridade parcial para não sofrer interferência da luz

externa. A cultura de células endoteliais foram divididas em oito grupos,

conforme tabela abaixo:

Tabela 03- Grupos experimentais e aplicabilidade

NOME GRUPOS CELULARES TRATAMENTO

Grupo 1 Controle Células + meio de cultura

DMEM

Grupo 2 Células + LBP Células + 660nm

Grupo 3 Células + LBP Células + 780nm

Grupo 4 Veneno Células + Veneno Bj

Grupo 5 Veneno irradiado Veneno irradiado 660nm

+ células

Grupo 6 Veneno irradiado Veneno irradiado 780nm

+ células

Grupo 7 Células + Veneno

+ Laser

Células + veneno- tratadas

com laser 660nm

Grupo 8 Células + Veneno

+ Laser

Células + veneno- tratadas

com laser 780nm


28

Conforme supracitado, os grupos 1, 2 e 3 foram avaliados como

controle. Para avaliação do efeito do veneno sobre as células endoteliais

tEND, foram divididos os grupos 4, em que somente o veneno foi adicionado

às células; grupo 5 e 6, em que o veneno foi previamente irradiado a 660nm e

a 780nm, respectivamente, e posteriormente adicionado às células, sem

tratamento posterior; no grupo 7 e 8, o veneno sem irradiação foi adicionado

às células e as mesmas foram tratadas com o laser a 660nm e a 780nm,

respectivamente.

A cultura foi irradiada imediatamente após a adição do veneno na

cultura, e foi aplicada, no poço, de forma pontual inferior, de modo a atingir a

monocamada de células endoteliais, conforme a figura:

6.4. Irradiação com laser de baixa potência: Utilizou-se o Laser da

marca DMC® modelo Twin Laser, com comprimento de onda de λ 660 nm,

potência de 70 mW (densidade de potência de 105 W/cm2), área do feixe de

0,028cm2, e, comprimento de onda de λ 780 nm, potência de 40 mW

(densidade de potência de 0,60 W/cm2), área do feixe de 0,028cm2, em meio


29

ativo de Arseneto de Gálio e Alumínio (AsGaAI), com densidade de energia

de 4 joules/cm2 e tempo de 10 segundos, conforme resumo na tabela abaixo:

Tabela 2- Protocolo para aplicação do laser

vemelho e infra-vermelho

Equipamento: Twin Laser ®

Parâmetros Laser Vermelho Laser Infra-vermelho

Comprimento de onda (nm) 660 780

Densidade de energia(J/cm2) 4 5

Energia total (J) 1,3 2

Potência (mW) 70 20

Densidade de Potência

(W/cm2)

105 90

Área irradiada (cm2) 0,3 0,3

Área do feixe (cm2) 0,028 0,028

Modo de aplicação Pontual Pontual

Tempo de irradiação (s) 10 10

6.5. Ensaio de viabilidade celular (MTT): Após a incubação das células

(1X104cel/poço) com o veneno nas respectivas concentrações (5, 10, 12,5, 25

e 50 g/mL), em meio de cultura (controle), e posteriormente irradiadas e

incubadas por 30, 60 e 120 minutos, foram avaliadas a viabilidade celular pelo

método MTT. As células foram lavadas com 200 µl de PBS 1X. Em seguida,

foram adicionados 50 µl de MTT (0,5 ug/ml em tampão) (3-[4,5-Dimethylthiazol-

2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue –SIGMA) e incubadas por

3h a 37°C. Terminado o tempo de incubação, a solução foi removida

cuidadosamente e foram adicionados 100 µl de isopropanol para ressuspender

e solubilizar o precipitado. Por fim, será realizada a leitura da absorbância a


30

620nm com auxilio de um leitor de placas (2020, Anthos, Eugendorf, Áustria)

(Mosmann, 1983).

Após a determinação da curva dose-resposta, o repetiu-se o método de

viabilidade celular (MTT), utilizando-se a dose de 10µl/mL, em grupos divididos

conforme a Tabela 03.

6.6. Ensaio para a avaliação da integridade da monocamada de

células endoteliais – Descolamento Celular: As células endoteliais foram

plaqueadas 1x104 cel/poço em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas

para adesão celular. Após esse período as células receberam o veneno nas

concentrações supracitadas, em meio de cultura (controle) e imediatamente

foram irradiadas com laser, em seguida as células foram incubadas por 30, 60

e 120 minutos. Após cada período de incubação, os sobrenadantes das

culturas foram retirados e as monocamadas lavadas com 100 µl de PBS 1X.

Em seguida, foram adicionados 40µL de cristal violeta (0,5%) em ácido acético

(30%) por poço. Decorridos 15 minutos, as placas foram lavadas e colocadas

para secar. A seguir, 100µL de metanol absoluto (MERCK) foram adicionados

em cada poço e a leitura da densidade óptica (D.O.) foi realizada em leitor de

ELISA a 620 nm. A lesão causada foi definida como a porcentagem de

descolamento celular, observada na monocamada submetida à ação do

veneno em relação à monocamada endotelial não estimulada pelos mesmos.

6.7. Análise da liberação da lactato desidrogenase (LDH): A atividade

enzimática da LDH, presente no sobrenadante das culturas, foi tomada como

parâmetro de lesão celular (Thomas, et al., 1993; Yildiz, et al., 1999; Zhao et al,


31

2013; Wang et al, 2013). Após cada período de incubação, descritos no item

6.5, o sobrenadante foi retirado e centrifugado a 200 x g, por 6 minutos. A

seguir, 20 µL do sobrenadante foram adicionados a outras placas de cultura de

96 poços, acompanhados da adição de 130 µL do substrato/poço, em tampão

fosfato contendo: NaCl 200mM, NADH 0,2 mM, piruvato 1,6 mM/poço. Foi feita

então, a leitura da D.O., a 340 nm, no intervalo de tempo entre 0 e 10 minutos.

Os resultados foram expressos pelo decréscimo da D.O., resultante da

oxidação do NADH, na presença de piruvato, em relação ao tempo zero.


32

7. ANÁLISE ESTATÍSTICA:

Os resultados obtidos foram expressos como média ± desvio padrão da

média e analisados estatisticamente pelo teste “t” de Student ou Análise de

Variância (ANOVA), complementado por testes de significância apropriados.

Os dados foram analisados com auxílio do software “GraphPad Prism

5.0”, considerando que nos experimentos curva dose-resposta adesão,

viabilidade e descolamento celular foi utilizado o pós teste Dunnet e a

significância estatística aceitável quando p ≤ 0,05.

Foram realizados três experimentos independentes e todas as amostras

foram feitas em triplicata.


33

8. RESULTADOS

8.1. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na integridade de células

endoteliais tEND

A capacidade do VBj em afetar a integridade das monocamadas das

células endoteliais tEND, em cultura, foi avaliada pelo descolamento das

monocamadas, após sua incubação com a tEND, por 30, 60 e 120 minutos, em

diferentes concentrações (5, 10, 12,5, 25 e 50 µg/mL) em comparação às

monocamadas contendo apenas meio de cultura (controle). Na concentração

de 5 µg/mL, o veneno causou um descolamento da ordem de 32 %, aos 120

minutos; nos demais períodos de tempo, não houve alteração da integridade

das monocamadas. Nas concentrações de 10, 12,5, 25 e 50 µg/mL, o veneno

foi capaz de causar descolamento das monocamadas em todos os períodos de

tempo analisados. No tempo de 120 min as concentrações de 25 e 50 µg/mL

causaram um descolamento das monocamadas, que foi estatisticamente

significante, das concentrações 5, 10 e 12,5 µg/mL (Fig. 4).


34

0

20

40

60

80

100

C 5 10 12,5 25 50

VBj (g/mL)

*

30 min

* *

*

Desco

lam

en

to c

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

C 5 10 12,5 25 50

60 min

VBj (g/mL)

* **

* #

Desco

lam

en

to c

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

C 5 10 12,5 25 50

120 min

VBj (g/mL)

* *

**# *#

Desco

lam

en

to c

elu

lar

(%)

Figura 4. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na integridade de células endoteliais tEND. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período, foi adicionado veneno nas concentrações de 5, 10, 25 e 50 µg/mL ou somente meio de cultura (controle) e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A integridade celular foi determinada pelo método Cristal Violeta. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes. Anova *p<0,05 vs controle;

#p<0,05 vs 5

µg/mL; p< 0,05 vs 10 µg/mL ; p< 0,5 vs 12,5 µg/mL .


35

8.2. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na viabilidade de células

endoteliais tEND

A viabilidade celular foi avaliada aos 30, 60 e 120 minutos após a

incubação das células tEND com o veneno, em diferentes concentrações (5,

10, 12,5, 25 e 50 µg/mL) ou meio de cultura (controle). Os resultados

demonstraram a diminuição estatisticamente significativa na integridade celular

em todas as concentrações (5, 10, 12,5, 25 e 50 µg/mL) e nos períodos de

tempo de 60 e 120 minutos, quando comparado com o grupo controle No

tempo de 30 min não houve alteração na viabilidade das células quando

incubadas com o veneno. Não houve diferença estatística da viabilidade celular

entre as concentrações estudadas, no tempo de 60 min. Aos 120 min, as

concentrações de 10, 12,5, 25 e 50 µg/mL causaram a diminuição na

viabilidade celular em comparação com a concentração de 5 µg/mL (Fig. 5).


36

0

20

40

60

80

100

120

C 5 10 12,5 25 50

VBj (g/mL)

30 min

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

120

*

C 5 10 12,5

60 min

25 50

VBj (g/mL)

* * *

*

Via

bilid

ad

e C

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

120

*

C 5 10 12,5

120 min

25 50

VBj (g/mL)

*

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)

# * ##* #*

Figura 5. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na viabilidade de células endoteliais tEND Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período, foi adicionado veneno nas concentrações de 5, 10, 25 e 50 µg/mL ou somente meio de cultura (controle) e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, Anova, *p<0,05 vs controle, # p<0,05 vs 5 µg/mL.


37

8.3. Efeito da exposição do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa

Potência na integridade das células endoteliais tEND.

Para o estudo da ação do laser de baixa potência, foi escolhida a dose

de 10 µg/mL de VBj. Esta foi a concentração o qual causou um efeito na

integridade e viabilidade das células sem ser máximo, sendo que um eventual

efeito do LBP pode ser verificado.

Para avaliar se a irradiação LBP seria capaz de modificar componentes

do veneno, o veneno foi irradiado antes de ser incubado com a tEND. Para

isso, também utilizou-se como grupo controle, células irradiadas a 660 e

780nm, sem receber inoculação de veneno.

Os experimentos demonstraram que não houve diferença estatística no

grupo incubado com o veneno e o grupo veneno irradiado, em ambos os

comprimentos de onda, sugerindo que a irradiação não afeta as moléculas do

veneno (Fig. 6).


38

0

20

40

60

80

100

VBj (10 g/mL)

* * *

30 min

Controle

laser 660 nmlaser 780 nm

--

+-

-+

--

+-

-+

Desco

lam

en

to c

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

* * *

VBj (10 g/mL)

60 min

Controle


--

+-

-+

--

+-

-+

Desco

lam

en

to c

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

* * *

VBj (10 g/mL)

120 min

Controle


--

+-

-+

--

+-

-+

Desco

lam

en

to c

elu

lar

(%)

Figura 6. Efeito do veneno B. jararaca (VBj) irradiado sobre a integridade de células

endoteliais. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e

incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período o veneno foi

previamente irradiado nos comprimentos de onda de 660 nm e 780 nm e,

posteriormente, foi adicionado à células tEND na concentração de 10 µg/mL ou somente

meio de cultura (controle) e células com meio de cultura irradiadas nos mesmo

comprimentos de onda e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. O descolamento celular foi

determinado pelo método Cristal Violeta. Cada valor representa a média ± EPM de três

experimentos independentes, Anova, *p<0,05 em relação ao controle.


39

8.4. Efeito da exposição do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa

Potência na viabilidade das células endoteliais tEND.

Da mesma maneira que avaliou-se a viabilidade das células com o

veneno irradiado antes de ser incubado com as mesmas, também avaliamos se

o veneno irradiado modificaria a viabilidade das células tEND. Para isso,

também utilizou-se como grupo controle, células irradiadas a 660 e 780nm,

sem receber inoculação de veneno.

Os resultados demonstraram a diminuição estatisticamente significativa

na viabilidade celular após exposição das células endoteliais tEND ao VBj

irradiado, em ambos os comprimentos de onda (660nm e 780nm), que não foi

diferente da viabilidade causada pelo veneno sem irradiação, mais uma vez

demonstrando que a irradiação não afeta as moléculas do veneno (Fig 7).


40

0

20

40

60

80

100

120

VBj (10 g/mL)

* * *

Laser 660 nmLaser 780 nm

--

+-

-+

--

+-

-+

Controle

30 min

Via

bili

dad

e c

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

120

* * *

VBj (10 g/mL)


--

+-

-+

--

+-

-+

Controle

60 min

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

120

* * *

VBj (10 g/mL)


--

+-

-+

--

+-

-+

Controle

120 min

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)

Figura 7. Efeito do veneno B. jararaca (VBj) irradiado na viabilidade de células endoteliais. Células

endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular.

Após esse período o veneno foi previamente irradiado nos comprimentos de onda de 660nm e 780nm e,

posteriormente, foi adicionado à células tEND na concentração de 10 µg/mL ou somente meio de cultura

(controle) e células com meio de cultura irradiadas nos mesmo comprimentos de onda incubadas por 30,

60 e 120 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. C: controle; L: laser de baixa

potência; V: veneno; VI: veneno irradiado. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos

independentes, Anova Dunnet *p<0,01.


41

8.5. Efeito do Laser de Baixa Potência 660 nm na integridade de

células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.

Para a avaliação do efeito de LBP na integridade das monocamadas de

células, o mesmo foi aplicado diretamente na tEND, no comprimento de onda

vermelho de 660 nm, imediatamente após a adição do veneno. Nos grupos

experimentais utilizando o LBP no comprimento de onda 660 nm, verificamos

que não houve diferença significativa na integridade celular no tempo de 30

min. No entanto, a aplicação do LBP causou uma redução no descolamento

celular na ordem de 20% e 18%, nos tempos de 60 e 120 min,

respectivamente, quando comparado com o grupo veneno (Fig 8).


42

0

20

40

60

80

100

30 min

**

C C + LBP V V + LBP

(10 g/mL)

De

sco

lam

en

to c

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

**

60 min

C C + LBP V V + LBP

(10 g/mL)

#

De

sco

lam

en

to c

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

*

120 min

C C + LBP V V + LBP

(10 g/mL)

* #

De

sco

lam

en

to c

elu

lar

(%)

Figura 8. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 660 nm na integridade de células

endoteliais submetidas à lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram

plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse

período foi adicionado o veneno (10 µg/mL), as células foram imediatamente irradiadas com

LBP usando densidade de energia (4 J/cm2) no comprimento de 660 nm e foram incubadas por

30, 60 e 120 minutos. A integridade celular foi determinada pelo método Cristal violeta. C:

controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potência. Cada valor representa a média ± EPM de

três experimentos independentes, Anova. * p< 0,05 VS controle; #P<0,05 vs veneno.


43

8.6. Efeito do Laser de Baixa Potência 780 nm na integridade de

células endoteliais submetidas à lesão por veneno B. jararaca.

Para a avaliação do efeito de LBP na integridade das monocamadas de

células, o mesmo foi aplicado diretamente nas células tEND, no comprimento

de onda infravermelho de 780 nm, imediatamente após a adição do veneno.

Nos grupos experimentais utilizando o LBP, verificamos que não houve

diferença significativa na integridade celular em nenhum dos tempos testados

após a aplicação do LBP 780 nm infravermelho, quando comparado com o

grupo veneno (Fig 9).


44

0

20

40

60

80

100

30 min

* *

C C + LBP V V + LBP

(10 g/mL)

Desco

lam

en

to c

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

**

60 min

C C + LBP V V + LBP

(10 g/mL)

De

sco

lam

en

to c

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

**

120 min

C C + LBP V V + LBP

(10 g/mL)

De

sco

lam

en

to c

elu

lar

(%)

Figura 9. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 780 nm na integridade de células

endoteliais submetidas à lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram

plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse

período foi adicionado o veneno (10 µg/mL), as células foram imediatamente irradiadas com

LBP no comprimento de 780 nm e foram incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A integridade

celular foi determinada pelo método Cristal violeta. C: controle; V: veneno; LBP: laser de baixa

potência. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, Anova. *

p< 0,05 comparado ao grupo controle.


45

8.7. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 660 nm na viabilidade

de células endoteliais submetidas à lesão por veneno

B. jararaca.

Para a avaliação do efeito de LBP na viabilidade das monocamadas de

células, o mesmo foi aplicado diretamente nas células tEND, imediatamente

após a adição do veneno. Nossos resultados demonstraram um aumento de

60 % na viabilidade celular no período de 60 minutos após a aplicação do LBP,

com comprimento de onda de 660 nm (luz vermelha). O mesmo efeito não foi

observado nos tempos de 30 e 120 min (fig. 10).


46

0

20

40

60

80

100

120

30 min

C C + LBP V V + LBP

(10 g/mL)

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

120

*

#

60 min

C C + LBP V V + LBP

(10 g/mL)

Via

bilid

ad

e C

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

120

**

120 min

C C + LBP V V + LBP

(10 g/mL)

Via

bilid

ad

e C

elu

lar

(%)

Figura 10. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 660 nm na viabilidade de células endoteliais

submetidas à lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em

placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o

VBj (10 µg/mL), as células foram imediatamente irradiadas com LBI no comprimento de 660 nm e

foram incubadas por 30, 60 e 120 min. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. C:

controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potência. Cada valor representa a média ± EPM de três

experimentos independentes, Anova. * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05 vs veneno.


47

8.8. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 780 nm na viabilidade

de células endoteliais submetidas à lesão por veneno B.

jararaca.

Para a avaliação do efeito de LBP na viabilidade das monocamadas de células,

o mesmo foi aplicado diretamente nas células tEND, imediatamente após a adição do

veneno. Nossos resultados demonstraram um aumento de 51 % na viabilidade celular

no período de 60 minutos após a aplicação do LBP, com comprimento de onda de

780 nm (luz infravermelho). O mesmo efeito não foi observado nos tempos de 30 e

120 min (fig.11).


48

0

20

40

60

80

100

120

C C + LBP V V + LBP

(10 g/mL)

30 min

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

120

*

#

C C + LBP V V + LBP

(10 g/mL)

60 min

Via

bilid

ad

e C

elu

lar

(%)

0

20

40

60

80

100

120

**

C C + LBP V V + LBP

(10 g/mL)

120 min

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

Figura 11. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 780 nm na viabilidade de células endoteliais

submetidas à lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram plaqueadas em

placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período foi adicionado o

veneno (10 µg/mL), as células foram imediatamente irradiadas com LBI no comprimento de 780 nm e

foram incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT. C:

controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potência. Cada valor representa a média ± EPM de três

experimentos independentes, Anova. * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05 vs ao veneno.


49

8.9. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 660 nm na liberação da

enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células endoteliais

submetidas à lesão por veneno B. jararaca.

A perda da integridade da membrana após incubação com veneno e

tratamento com laser foi monitorado pela análise da liberação no meio de cultura da

enzima citoplasmática LDH. As células que receberam o veneno apresentaram

aumento nos níveis de LDH no sobrenadante, nos tempos de 30 e 60 min, comparado

ao grupo que recebeu somente meio de cultura (controle). O LBP 660 nm (luz

vermelho) foi capaz de promover uma redução na liberação de LDH de 33% e 49 %

aos 60 e 120 min, respectivamente. O mesmo efeito significativo não foi observado no

tempo de 30 min neste comprimento de onda. (fig. 12).


50

0.0

0.5

1.0

1.5

C C + LBP V V + LBP

10 g/mL

30 min

LD

H (

D.O

.)

0.0

0.5

1.0

1.5

C C + LBP V V + LBP

10 g/mL

60 min

*

#*

LD

H (

D.O

.)

0.0

0.5

1.0

1.5

C C + LBP V V + LBP

10 g/mL

120 min

*

#

LD

H (

D.O

.)

Figura 12: Efeito do laser de baixa potência (LBP) 660 nm na liberação de LDH de células

endoteliais submetidas a lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram

plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período

o veneno foi adicionado na concentração de 10 µg/mL ou somente meio de cultura (controle) as células

foram imediatamente irradiadas com LBI no comprimento de 660 nm e foram incubadas por 30, 60 e

120 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberação de Lactato Desidrogensase (LDH) foi

determinada pela liberação de NADH. C: controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potência. Cada

valor representa a média ± EPM de três experimentos independentes, * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05

vs veneno.


51

8.10. Efeito do Laser de Baixa Potência (LBP) 780 nm na liberação da

enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de células endoteliais

submetidas à lesão por veneno B. jararaca.

Da mesma forma, avaliamos a perda da integridade da membrana após

incubação com veneno e tratamento com laser pela análise da liberação no

meio de cultura da enzima citoplasmática LDH. As células que receberam o

veneno apresentaram aumento nos níveis de LDH no sobrenadante, nos

tempos de 30 e 60 min, comparado ao grupo que recebeu somente meio de

cultura (controle). O LBP 780 nm (luz infravermelho) foi capaz de promover

uma redução na liberação de LDH de 28% e 54 % aos 60 e 120 min,

respectivamente (fig. 15). O mesmo efeito estatisticamente significativo não

foi observado no tempo de 30 min no comprimento de onda de 780 nm (fig.

13).


52

0.0

0.5

1.0

1.5

C C + LBI V V + LBI

10 g/mL

30 min

LD

H (

D.O

.)

0.0

0.5

1.0

1.5

C C + LBI V V + LBI

10 g/mL

60 min

*#

LD

H (

D.O

.)

0.0

0.5

1.0

1.5

C C + LBI V V + LBI

10 g/mL

120 min

*

#

LD

H (

D.O

.)

Figura 13. Efeito do laser de baixa potência (LBP) 780 nm na liberação de LDH de células

endoteliais submetidas a lesão por veneno de B. jararaca. Células endoteliais tEND foram

plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas por 48 horas para adesão celular. Após esse período

o veneno (10 µg/mL) foi adicionado à cultura de células e foram imediatamente irradiadas com o LBI

780 (infravermelho) e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberação

de Lactato Desidrogensase (LDH) foi determinada pela liberação de NADH. C: controle; V: veneno;

LBP: laser de baixa potência. Cada valor representa a média ± EPM de três experimentos

independentes, * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05 vs veneno.


53

9. DISCUSSÃO

Apesar da eficiência da soroterapia em neutralizar os efeitos sistêmicos

causados pelos venenos botrópicos, as reações locais causadas por esses

venenos são apenas parcialmente ou não são neutralizadas por esse

tratamento. Isso ocorre pelo fato das manifestações locais ocorrerem

rapidamente após a picada e o soro não ser capaz de reverter às lesões já

estabelecidas ou desencadeadas (Rosenfeld, 1971). O fato da soroterapia ser

pouco eficaz no tratamento das reações locais induzidas por venenos

botrópicos estimula a procura de tratamentos complementares que possibilitem

a melhora deste quadro. Assim, este trabalho visou o melhor entendimento da

aplicação do laser de baixa potência, em células endoteliais, após lesão pelo

veneno de Bothropoides jararaca.

Estudos sugerem que os venenos e toxinas hemorrágicas isoladas

afetam, principalmente, a integridade de vasos de pequeno calibre (Ohsaka,

1979; Ownby, 1990; Borkow et al., 1993). Este efeito foi atribuído à proteólise

da membrana basal dos vasos, levando a saída de eritrócitos. Considerando

que as SVMPs de veneno de serpente são responsáveis por hemorragia local,

pelo menos nove delas foram isoladas a partir do veneno B. jararaca

(Mandelbaum et al., 1976; Maruyama et al., 1992, Maruyama et al., 1993 e

Paine et al, 1992), e concluiu-se que as toxinas hemorrágicas causam uma

série de alterações morfológicas e degenerativas em células endoteliais que

progridem para formação de fendas intercelulares permitindo a saída de

hemácias (Ownby, 1990, Lomonte et al., 1994).

Ainda, estudos revelam uma diferença significativa na produção de

hemorragia pelas SVMPs in vivo, comparado aos estudos com cultura de


54

células endoteliais, uma vez que o descolamento foi observado somente in vitro

(Gutiérrez et al., 2005). Neste estudo buscou-se compreender, inicialmente, os

efeitos do veneno de B. jararaca sobre a integridade e viabilidade de células

endoteliais.

Os efeitos do veneno de B. jararaca na integridade e viabilidade de

células endoteliais tEND in vitro. Os resultados obtidos mostraram que o

veneno, afetou a integridade das monocamadas de células endoteliais nas

concentrações a partir de 10 L/mL em todos os períodos de tempo analisados.

O efeito máximo ocorreu aos 120 minutos de incubação. Resultados similares

foram demonstrados a capacidade do B. jararaca em causar descolamento de

células com concentrações maiores que 10 L/mL (Gallagher et al., 2003).

Também Nishijima et al. (2009), em um estudo in vivo, buscou

determinar a dose ideal capaz de induzir a hemorragia após administração do

veneno de B. jararaca e concluiu que dose de 8,1 µg foi ideal capaz de alterar a

homeostase dos vasos sanguíneos. Adicionalmente, a BaH-1, uma SVMPs

isolada do veneno de B. asper, com potente atividade hemorrágica, causa um

descolamento moderado de células endoteliais murinas (Lomonte et. al., 1994).

Ainda, investigou-se a capacidade do veneno em afetar a viabilidade

celular, para melhor compreender a ação do veneno sobre a integridade do

endotélio. Para tanto, avaliou-se a citotoxicidade pela atividade metabólica

mitocondrial (método MTT). Os resultados obtidos mostraram que o veneno

reduziu a viabilidade celular em todas as concentrações nos tempo de 60 e 120

min após a incubação com o veneno, alterando a viabilidade das células

endoteliais e sugerindo que o descolamento das monocamadas pode estar


55

relacionado à citotoxicidade do veneno, provavelmente por agir nas moléculas

de adesão.

A literatura tem sugerido que a terapia com LBP é uma alternativa eficaz

para o tratamento de acidentes causados por serpentes devido a sua

capacidade de diminuir a inflamação, hemorragia e mionecrose após

envenenamento botrópico experimental (Dourado et al., 2003; Barbosa et al.,

2009; Nadur- Andrade et al., 2012). No entanto, os mecanismos biológicos

envolvidos na proteção local pela irradiação laser contra a ação local do

veneno botrópico ainda não são compreendidos.

Neste estudo, investigou-se alguns mecanismos envolvidos na

capacidade da terapia LBP em proteger células endoteliais contra o veneno da

serpente B. jararaca. O efeito da terapia com LBP na citotoxicidade causada

pelo veneno foi avaliada usando o laser na densidade de energia de 4 J/cm2

em dois comprimentos de onda, um vermelho no comprimento de onda 660 nm

e infravermelho no comprimento 780 nm, após a adição do veneno nas células

endoteliais tEND.

A dose do laser escolhida foi baseada na literatura mostrando, em

cultura celular, um efeito benéfico do laser vermelho e infravermelho em doses

baixas 3 ou 5 J/cm2. Neste mesmo estudo, os autores demonstraram que em

doses altas (16 J/cm2) pode apresentar efeito prejudicial (Huang et al., 2009;

Kim et al, 2011).

Com o intuito de verificar se o laser seria capaz de alterar os

componentes do veneno e assim diminuir sua citotoxicidade, o veneno foi

irradiado usando os mesmos parâmetros do laser usado para irradiar as células

endoteliais tEnd. O veneno B. jararaca irradiado mostrou o mesmo efeito


56

citotóxico quando comparado ao veneno não irradiado. Este resultado indica

que a irradiação laser não modificou os componentes do veneno. Resultado

semelhante foi encontrado por Barbosa et al., (2008), usando um modelo in

vivo no qual o veneno irradiado causou o mesmo nível de edema muscular

quando comparado ao veneno não irradiado.

Os resultados obtidos em nosso estudo mostraram que a dose usada de

4 J/cm2 reduziu o descolamento de células endoteliais melhorando assim a

integridade celular. Esse efeito foi observado nos comprimentos de onda de

660 nm nos tempos de 60 e 120 min. Porém, o mesmo efeito não foi observado

com o comprimento de onda 780 nm, sugerindo atuação do laser na matriz

extracelular e assim, protegendo a célula contra os efeitos deletérios do

veneno.

Isso porque, conforme Szymanska et al, 2013, a radiação com LBP pode

influenciar as células através da absorção da energia emitida pelos

fotorreceptores localizados no interior das células. Sugere-se que, dentre tais

fotorreceptores, as mitocôndrias, que fornecem energia para as células, contém

uma série de enzimas que participam nas reações redox da cadeia respiratória,

tornando-se o principal mecanismo das reações metabólicas ocorridas em uma

célula, além do citocromo c oxidase e superóxido dismutase- NADH, que

demonstraram alteração após emissão de fótons, alterando o nível de oxidação

e alterando a fluência dos elétrons de uma molécula, capazes de aumentar a

síntese de DNA e RNA (Karu, 1999; Szymanska et al, 2013) .

Ainda, os resultados obtidos em nosso estudo mostraram que a

concentração usada de 4 J/cm2 reduziu a citotoxicidade, avaliada pelo método

MTT, em células endoteliais no período de 60 min após a adição do veneno,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Szymanska%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23959736

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Szymanska%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23959736


57

tanto com o laser vermelho como o infravermelho, não tendo efeito em outros

períodos avaliados. Essa diferença encontrada entre o laser vermelho e

infravermelho pode estar relacionada com a penetração da luz no tecido (El

Sayed et al., 1990; Tacon et al., 2011; Kim et al, 2011; Colombo et al, 2013)

uma vez que já foi demonstrado que o laser vermelho penetra mais no tecido

que o laser infravermelho.

Adicionalmente, investigou-se a capacidade do veneno em afetar a

viabilidade celular, pela liberação da lactato desidrogenase pelas células

endoteliais, uma enzima citoplasmática estável, utilizada como parâmetro de

lesão e/ou morte celular, quando presente no sobrenadante de culturas de

células (Thomas, et al., 1993; Yildiz, et al., 1999). Os resultados demonstraram

que o LBP causou uma redução da liberação de LDH nos tempos de 60 e 120

min pelas células endoteliais após a incubação com o veneno. Essa

discrepância nos testes avaliados para determinar a citotoxicidade poder estar

relacionada a maior sensibilidade do método LDH.

Convém ressaltar que, esta diferença é curiosa, pois estudos anteriores

de nosso laboratório demonstram um efeito protetor do LBP em células

musculares in vitro, avaliado tanto pelo método MTT como pela liberação de

LDH em todos os períodos de tempo avaliados (dados enviados a publicação).

A dose do laser utilizada foi a mesma utilizada para as células musculares, é

possível que a dose utilizada não seja a ideal para a proteção em células

endoteliais. No entanto, Szymanska et al (2013), avaliou células endoteliais in

vitro, utilizando LBP nos comprimentos de onda vermelho e infravermelho e

concluíram que a utilização do comprimento de onda de 635 nm (com

densidade de potência de 1,875 W/cm2) estava associado com um aumento


58

estatisticamente significativo na proliferação das células endoteliais. Ainda, a

utilização das densidade de energia de 2, 4 e 8 J/cm2 promoveram aumentos

significativos na proliferação, sendo que de 4 J/cm2 foi a que mais significativa

em relação a proliferação celular, sugerindo que a densitometria utilizada no

nosso trabalho é adequada para se utilizar em células endoteliais.

Além disso, os efeitos diretos ou indiretos da interferência do laser

visível vermelho e infravermelho com os componentes mitocondriais da cadeia

respiratória é parte do sinal de transdução (Tiphlova et al, 1989; Karu et al,

1993; Lubart et al, 1996; Kim et al, 2011). Nesse sentido, estudos de Kipshidze

et al, 2001; Agaiby et al, 2000, abordaram a possível indução de fatores pró-

angiogênicos pela exposição ao laser. Até o momento, tais fatores têm sido

detectados imediatamente após a irradiação do laser, e apenas em cultura de

outras linhagens celulares que não as células endoteliais.

Bouma et al. (1996), demonstraram melhora na regulação da secreção

espontânea de células endoteliais humanas, avaliada pela liberação de

citocinas, como interleucina (IL) -6 e IL-8 após a radiação pulsada de laser

infravermelho. sugerindo efeito direto na estimulação na proliferação das

células endoteliais (Schindl et al, 2003).

Em nosso estudo não avaliamos a proliferação celular, no entanto a

redução da hemorragia observada em estudo in vivo do nosso laboratório

(Nadur-Andrade et al, 2012) e proteção da mionecrose (Barbosa et al., 2008)

sugere que a proteção observada pelo LBP nas células endoteliais pode estar

relacionada a uma melhora da proliferação celular e consequente diminuição

da mionecrose.


59

10. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Em síntese, podemos concluir que o LBP λ 660nm e λ 780 nm reduziram

a citotoxicidade em células endoteliais; tornando-se capaz de exercer um

efeito protetor nas células endoteliais tEND, com redução estatisticamente

significativa na liberação de LDH e aumento na viabilidade celular,

sugerindo que os efeitos observados podem ser explicados pela possível

ação do LBP na proliferação celular, conforme tabela abaixo:

Ainda, podemos concluir que o veneno de B. jararaca é citotóxico para

células endoteliais e que o uso do laser de baixa potência, neste modelo

experimental, foi capaz de proteger a célula endotelial contra a ação do veneno

da serpente B. jararaca.

Também, as perspectivas futuras para a utilização em saúde do laser de

baixa potência sugerem a delimitação correta de parâmetros, tais como

densidade, energia, frequência, potência e área de aplicação. Com uma ampla

extensão de abordagem a, terapia com LBP, têm se tornado crescente no

cenário mundial e de modo mais importante, a combinação da utilização

apropriada do LBP, associado à um complemento com outras abordagens

terapêuticas, pode proporcionar melhores resultados clínicos e funcionais ao

paciente, e com menor período de tratamento.


60

11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Agaiby, A. D.; Ghali, L. R.; Wilson, R.; Dyson, M. Laser modulation of

angiogenic factor production by T-lymphocytes. Lasers Surg Med 2000; 26:

357–63.

Alghamdi, K.M.; Kumar, A.; Moussa, N.A. Low-level laser therapy: a useful

technique for enhancing the proliferation of various cultured cells. Lasers Med

Sci. 2011.

Arany, P. R.; Nayak, R. S.; Hallikerimath, S.; Limaye, A. M.; Kale, A. D.;

Kondaiah, P. Activation of latent TGF-β1 by low-power laser in vitro correlates

with increased TGF-β1 levels in laser-enhanced oral wound healing. Wound

Rep Reg 2007; 15: 866-874.

Baldo, C.; Jamora, C.; Yamanouye, N.; Zorn, T. M.; Moura-da-Silva, A. M.

Mechanisms of Vascular Damage by Hemorrhagic Snake Venom

Metalloproteinases: Tissue Distribution and In Situ Hydrolysis. PLoS Negl Trop

Dis. 2010; Jun 29;4(6).

Baramova E.N.; Shannon J.D.; Bjarnason J.B.; Fox J.W. Degradation of

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