Vacinas de nova geração para

Rotavirus

Ciência em Portugal – Ciência 2007

A5 – Biologia, Biotecnologia, Bioquímica Lisboa, 13/Abril/2007

Paula Alves

Laboratório de Tecnologia de Células Animais

RotavirusRotavirus Causa de ~ 40% das hospitalizações devidas a Gastroenterites agudas Aprox. 600.000 mortes/ano em 111 millhões de episódios de diarreia aguda

em crianças com idades inferiores a 5 anos)

Vacinas para ROTAVIRUS (no mercado desde 2006)

Virus atenuados em cultura

RotaTeqTM (aprovada pela FDA)

RotarixTM (aprovada pela EMEA)

VPVP22

VP4

VPVP66

VPVP77

VP3

VP1

98 nm

Reoviridae Family

VACINAS DE NOVA GERAÇÃOVACINAS DE NOVA GERAÇÃO

VLP (Virus Like Particles) – Partículas Semelhantes a Vírus

i. Eficazes - mimetizam particulas virais nativas (conformação e apresentação dos antigénios ao sistema imunitário)

ii. Seguras (não contêm material genético – ADN e ARN)

iii. Custos reduzidos (após optimização dos processos de produção)

VLP’s (VLP’s (VVirus irus LLike ike PParticles) – Partículas Semelhantes a Vírusarticles) – Partículas Semelhantes a Vírus

VLP’s já no mercado:VLP’s já no mercado:

Hepatite B (desde 1986)

2006 - Virus do Papiloma Humano (HPV) :

Gardasil® e Cervarix®

Primeira vacina no mercado contra o cancro cervicalPrimeira vacina no mercado contra o cancro cervical

VLP’s com VLP’s com UMA únicaUMA única proteína viral

VP6

(44.9 kDa)

VP2

(102.7 kDa)

60 dimers

780monomers

260trimers

~12000 kDa

~29000 kDa

~35000 kDa

2/6 VLP

(~47000 kDa)

2/6/7 VLP

(~76000 kDa)

~ 7

5 n

m~ 6

4nm

VP7

(37.2 kDa)

Rotavirus-Like Particles

VLP para PPV (irá ser comercializada pela Ingenasa Ingenasa (Espanha)

VLP candidata para HIV (utilizada em testes de diagnostico pela Innogenetics Innogenetics (Bélgica)

@ Lab TCA

VLP para ROTAVÍRUS

Desenvolvimento Desenvolvimento de Bioprocessos de Bioprocessos para produção de para produção de

Rota Rota VLPs VLPs

Formação das VLP’s

Estatisticada infecção

Expressãodas proteínas

“Re-desenhar” o genoma do Baculovirus(a nível dos

promotores dos genes das proteinas

recombinantes)

“Re-desenhar” estratégias de

infecção(MOI and TOI)

Monomeros das proteínas virais nas proporções e nos

tempos ideais(Estequiometria e termodinâmica)

OBJECTIVO

Membrana Nuclear

Membrana Celular

Infecção com 3 Baculovirus Recombinantes(transportam genes que codificam as

proteínas vp2, vp6 e vp7)

vp2 gene

vp6 gene

vp7 gene

1

H+ H+H+

H+

H+

H+

H+ H+

H+

H+

H+

H+

2

vDNA

3

4

VP2

VP7

VP6

mRNA

5

6

Monomers of VP7

Particulas duplas 2/6 VLP

Monomeros de VP7

Trimeros de VP6

Partículas 2/6/7 VLP (triplas)7

Infecção

Caracterização das cinéticas de infecção dos baculovirusTráfego viral na célula hospedeira

Purificação

VLPs Purificação

Montagem VLPs

Montagem em partículas formadas correctamente (três camadas)Estratégias de assembly/disasembly/reasembly

Replicação do transADN (vp2, vp6 and vp7)Transcrição - mARN (vp2, vp6 and vp7)Produção das proteínas recombinantes (VP2, VP6 and VP7)

Expressão dos genes

Gradientes de CsCl (ultracentrif.)Filtração GelChromatografiaUltrafiltração

Western blot, HPLC, Proteína totalELISAEspect. de massaMicroscopia

Q-PCRRT-Q-PCRWestern blot, HPLC, Proteína total

Técnicas analíticas

MODELAÇÃO DA PRODUÇÃO DE VLP’s PARA ROTAVIRUS

j

Colaboração com grupo Rui Oliveira

Cinéticas de Infecção do Baculovirus e tráfego viral

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 24 48 72 96 120 144

Time (hpi)

0

1,5

3,0

4,5

6,0

7,5

9,0

Ni(C

ell.m

l-1)

106

V(V

irus

.ml-1

)10

6

Sintese do mARN

0

2

4

6

8

10

12

RN

A7

(Cop

iesD

NA

.cel

l-1)

103

0 24 48 72 96 120 144

Time (hpi)

Protein ProductionProdução de Proteinas

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 24 48 72 96 120 144

Time (hpi)

VP 7

(AU

.ml-1

)10

3

Expressão dos genes

Replicação ADN

0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

DN

A6T

(Cop

iesD

NA

.cel

l-1)

104

0 24 48 72 96 120 144

Time (hpi)

Montagem dasVLPs

VL

P (

g.m

l-1)

0

100

200

300

400

500

600

700

bVP2+bVP6+bVP7 bVP2/6/7

Desenvolvimento de Desenvolvimento de Bioprocessos para Bioprocessos para produção de produção de Rota Rota

VLPs VLPs Re-

desenhar o genoma do Baculovirus

“Re-desenhar” estratégias de infecção

Formação das VLP’s

Estatisticada infecção

Expressãodas proteínas

Monomeros das proteínas virais nas

proporções e nos tempos ideais

(Estequiometria e termodinâmica)

1. Antonis AF, Bruschke CJ, Rueda P, Maranga L, Casal JI, Vela C, Hilgers LA, Belt PB, Weerdmeester K, Carrondo MJ, Langeveld JP., 2006. A novel recombinant virus-like particle vaccine for prevention of porcine parvovirus-induced reproductive failure. Vaccine, 24(26): 5481-90

2. Vieira, HLA, Estevão, C, Roldão, A, Peixoto, C, Sousa, M, Cruz, PE, Carrondo MJT, Alves, PM (2005) “Triple layered rotavirus VLP assembly: kinetics of vector replication, mRNA stability and recombinant protein production”, Journal of Biotechnology, 120: 72-82

3. Vieira, HLA, Pereira, ACP, Carrondo, MJT, Alves, PM (2006) “Catalase effect on apoptosis for the improvement of recombinant protein production in baculovirus-insect cell system”, Bioprocess Biosystems Engineering., 29, 409-414.

4. Peixoto, C, Sousa, MFQ, Silva, AC, Carrondo, MJT, Alves, PM (2007) “Downstream Processing of Triple-layered Rotavirus Like Particles”, Journal of Biotechnology, 127, 452-461

5. Roldão, A, Vieira HLA, Alves, PM, Oliveira, R, Carrondo, MJT (2007) Intracellular dynamics in Rotavirus-like particles production: Evaluation of multigene and monocistronic infection strategies. Process Biochemistry, 41, 2188-2199.

6. Roldão, A, Vieira, HLA, Charpilienne, A, Poncet, D, Roy, P, Carrondo, MJT, Alves, PM, Oliveira, R (2007) Modeling Rotavirus-Like Particles production: infection kinetics, baculovirus DNA replication, mRNA synthesis and protein production” J Biotechnology, 128(4): 875-894.

Financiamento European Commission (QLRT-2001-

01249)FCT (FCT/POCTI/BIO/55975/2004)SFRH/BPD/14575/2003SFRH/BD/21910/2005

Lab TCA (ITQB/IBET)Equipa RotavirusPaula Alves Manuel J. T. Carrondo Helena Vieira António RoldãoCristina C. Peixoto Claudia IstrateMarcos F.Q. Sousa Catarina EstêvãoRosário Clemente Candida Mellado

FCT-UNL (Portugal)Rui Oliveira

LSHTM (UK)Polly Roy

CNRS (France)Jean CohenDidier PoncetAnnie Charpilienne

Karolinska (Sweden)Lennart Svensson

Hopitaux de Paris (France)Nathalie Parez

RVC (UK)Janice Bridger

CIC Vaccinologie C Pasteur (France)Odile Launay