Avaliação da prevalência do rotavirus bovino em rebanhos ...€¦ · Rotavirus was assayed in fecal samples of calves with and without diarrhea collected during 2007. These animals

Mariela Alves e Silva

Avaliaccedilatildeo da prevalecircncia do rotavirus bovino em rebanhos dos

assentamentos rurais de CorumbaacuteMS

Belo Horizonte

2009

Mariela Alves e Silva

2

Avaliaccedilatildeo da soroprevalecircncia do rotavirus bovino em rebanhos dos assentamentos rurais de CorumbaacuteMS

Belo Horizonte

Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas

2009

Monografia apresentada ao curso de Poacutes- Graduaccedilatildeo em Microbiologia do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenccedilatildeo do grau de Especialista em Microbiologia Orientadora Dra Edel Figueiredo Barbosa Stancioli Co-orientadora MSc Camila Pacheco Silveira Martins

3

AGRADECIMENTOS

Em especial agrave meu pai (in memorian) e agrave minha querida Victoacuteria (in memorian)

que mesmo na distacircncia fiacutesica e apesar da imensa saudade estatildeo sempre

norteando e iluminando meus pensamentos

Agrave minha matildee exemplo forte de luta que sempre foi meu esteio em todos os

momentos Ao Marcelo irmatildeo querido pela cumplicidade forccedila e carinho Ao

meu eterno amor Gutenberg que suportou juntamente comigo momentos muito

difiacuteceis e que me propiciou conhecer o verdadeiro amor (nos gestos na amizade

na cumplicidade) e pra mim eacute exemplo de virtudes e caraacuteter

Agrave professora Edel por me creditar confianccedila (pela oportunidade) e me impulsionar

a lugares nunca antes sonhados por mim Pelo desprendimento dedicaccedilatildeo

carinho e conforto Por provocar em mim a vontade de crescimento profissional e

pessoal enfim por tudo

Agrave Camila a qual natildeo tenho como mensurar minha gratidatildeo por tudo que me

ensinou me confortou e pelos momentos de grande grande crescimento que

passamos juntas

Agrave Ludmila pela paciecircncia de me ensinar os protocolos desde os mais simples

passos e pelo tempo dedicado ao meu projeto Agrave Andreacuteia pelo sorriso sempre

pela calma e pela ajuda na confecccedilatildeo do trabalho

Agrave todos do laboratoacuterio que me auxiliaram com boa vontade e me ensinaram

durante este tempo o quanto um colega pode ser importante

As palavras de amizade e conforto podem ser curtas e sucintas mas o seu eco eacute

infindaacutevel (Madre Teresa de Calcutaacute)

4

RESUMO

A presenccedila de rotavirus foi pesquisada em amostras fecais provenientes de

bezerros de 5 dias ateacute o sexto mecircs de vida com e sem diarreacuteia Estes animais se

encontravam na regiatildeo de Corumbaacute (MS) e estavam distribuiacutedos entre trecircs

assentamentos rurais da regiatildeo ndash Tamarineiro Taquaral e Paiolzinho sendo as

coletas realizadas no ano de 2007 O objetivo deste trabalho foi verificar a

presenccedila do rotavirus nestes assentamentos e correlacionaacute-la com a ocorrecircncia

ou natildeo de diarreacuteia Oitenta e trecircs amostras fecais foram submetidas agrave anaacutelise por

eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) Destas amostras nenhuma

apresentou positividade para o viacuterus estudado Este estudo mostrou que natildeo haacute

prevalecircncia nos 03 assentamentos estudados com a metodologia utilizada

embora este agente seja descrito em outros rebanhos do Estado do Mato Grosso

A teacutecnica aqui abordada eacute mundialmente utilizada com sucesso tendo grande

sensibilidade na detecccedilatildeo do rotavirus uma vez que durante a excreccedilatildeo viral as

fezes do animal ou humano infectado podem conter ateacute 1000 partiacuteculas grama

de fezes

5

ABSTRACT

Rotavirus was assayed in fecal samples of calves with and without diarrhea

collected during 2007 These animals were located at Corumbaacute (MS Brazil) e were

distributed into three settlements named Tamarineiro Taquaral and Paiolzinho

This work has the objective of verify the occurrence of Rotavirus and to find

correlation with diarrhea Eighty three samples were test using Polyacrylamide Gel

Electrophoresis (PAGE) All of samples tested were negative to Rotavirus Overall

this study have shown no prevalence of rotavirus in the geographical region

studied using PAGE methodology and for the 03 settlements evaluated although

Rotavirus is reported in the Mato Grosso State PAGE is used around the world

with success having great sensitivity once that during the virus excretion feces of

infected animal and human can have around 1000 particles by gram and the test

is proved to be suitable for rotavirus detection

6

LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES

Figura 1 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da partiacutecula viral do rotavirus 15

Figura 2 - Estrutura esquemaacutetica do Rotavirus evidenciando os 11 segmentos genocircmicos

com as respectivas proteiacutenas codificadas e a estrutura proteacuteica da partiacutecula viral

17

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica do padratildeo de migraccedilatildeo em Eletroforese em Gel

de Poliacrilamida do RNAdf relativo aos eletroferogrupos A B C D e E de Rotavirus

19

Figura 4 - Esquema simplificado das principais etapas de replicaccedilatildeo intracelular dos

rotavirus 24

Figura 5 ndash Corte histoloacutegico das vilosidades intestinais A ndash intestino normal B ndash intestino infectado por rotavirus 26

Figura 6 Administraccedilatildeo de soluccedilatildeo hidroeletroliacutetica em bezerro com diarreacuteia 31

Figura 7 - Partiacuteculas de rotavirus visualizadas em microscoacutepio eletrocircnico 32

Figura 8 Distribuiccedilatildeo espacial do rebanho de bovinos com destaque para os dez principais municiacutepios Brasil 37

Figura 9 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) ndash gel corado pela prata1 Rotavirus padratildeo bovino ndash amostra ATCC VR 542 ndash amostra Lincoln 2 e 3 ndash amostras cliacutenicas testadas ndash negativas S de 1-11 = segmento gecircnico 44

7

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

bd - bidestilada

DNA - aacutecido desoxiribonucleico

dNTP - deoxinucleotiacutedeo trifosfatado

EDTA - Aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

EIARA - Ensaio imunoenzimaacutetico para rotavirus e adenoviacuterus

ELISA= enzyme-linked immunosorbent assay

et al= e colaboradores

gp - glicoproteiacutena

mM - milimolar

N-PCR ndash Nested PCR

NSP - proteiacutena natildeo estrutural (Non-Structural Protein)

ORF - Regiatildeo aberta de leitura (Open Reading Frame)

PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida (Polyacrylamide Gel

Electrophoresis)

pb - pares de base (base pairs)

PBS - tampatildeo salina - fosfato

PCR - Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction)

pmol - picomol

pH - potencial hidrogeniocircnico

qsp ndash quantidade suficiente para

RNA - aacutecido ribonucleico

RNAfd - aacutecido ribonucleico fita dupla

RT - Transcriccedilatildeo Reversa (Reverse Transcription)

RV gp A - rotavirus grupo A

VP - proteiacutena viral (Viral Protein)

SDS - dodecil sulfato de soacutedio

TBE - tampatildeo Tris-Borato-EDTA

TERV ndash tampatildeo de estabilizaccedilatildeo de rotavirus

8

TRIS - hidroximetil aminometano

μL= microlitro (10-6 litro)

μM - Micromolar (10-6 Molar)

μg ndash Micrograma (10-6 grama)

= por cento

degC= graus Celsius


Kg= quilograma

M= molar

mg= miligrama

mL= mililitro

pv= pesovolume

vv= volumevolume

reg= marca registrada

9

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO E JUSTIFICATIVA 11

2 HISTOacuteRICO 12

3 CARACTERIacuteSTICAS DOS ROTAVIRUS 14

31 Estrutura morfoloacutegica 14

32 Estrutura genocircmica 17

33 Classificaccedilatildeo 19

34 Sorotipos 20

35 Ciclo de replicaccedilatildeo viral 21

36 Quadro cliacutenico da gastroenterite bovina 23

37 Forma de transmissatildeo 26

38 Resposta Imune do hospedeiro 27

39 Tratamento 28

310 Diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo rotavirus bovino 30

3101 Microscopia eletrocircnica 30

3102 Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 31

3103 Ensaio Imunoenzimaacutetico 32

3104 Aglutinaccedilatildeo com partiacuteculas de laacutetex 33

311 Profilaxia 33

312 Vacinas 34

313 Assentamentos rurais no Municiacutepio de Corumbaacute 36

10

4 OBJETIVOS 37

41 OBJETIVO GERAL 37

42 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 37

5 MATERIAL E MEacuteTODOS 38

51 Amostras fecais bovinas 38

52 Extraccedilatildeo de RNA 38

53 Caracterizaccedilatildeo das amostras (PAGE) 39

54 Coloraccedilatildeo do RNA pela prata 40

55 Interpretaccedilatildeo dos resultados 40

6 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 40

7 CONCLUSAtildeO 43

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 44

11

1 INTRODUCcedilAtildeO E JUSTIFICATIVA

As gastroenterites em bovinos apresentam distribuiccedilatildeo mundial e acarretam

prejuiacutezos agrave pecuaacuteria pela mortalidade morbidade custos com tratamentos

profilaxia e aumento da suscetibilidade a outras infecccedilotildees (PAUL AND LYOO

1993 KANEENE HURD 1990) A diarreacuteia eacute um complexo de etiologia multifatorial

relacionado agrave infecccedilatildeo fatores nutricionais ambientais e a praacutetica de manejo

Estudos apontam que esta entidade cliacutenica pode ser desencadeada por bacteacuterias

Escherichia coli enterotoxigecircnica Salmonella sp viacuterus rotavirus coronavirus

protozoaacuterio Cryptosporidium sp toxinas fatores ambientaismanejo como

qualidade da nutriccedilatildeo baixa temperatura pobre higienizaccedilatildeo privaccedilatildeo do colostro

e suscetibilidade do animal (SNODGRASS et al1986 TAKIUCHI et al 2006)

Em relaccedilatildeo aos agentes virais o rotavirus apresenta maior incidecircncia em

mamiacuteferos nos casos de adoecimento enteacuterico no mundo (BARREIROS et al

2003 TAMEHIRO et al 2003) No Brasil jaacute foi detectado em muitas propriedades

de criaccedilatildeo de bovinos e suiacutenos (SAN JUAN et al 1986 BITTENCOURT e RAacuteCZ

1992 BRITO 1998) De modo geral a rotavirose bovina eacute prevalente em animais

jovens (idade inferior a trecircs semanas) poreacutem a doenccedila pode ocorrer em todas as

faixas etaacuterias incluindo bovinos adultos (LUCCHELLI et al 1992)

Os agentes correlacionados com o quadro de gastroenterite sendo que cada

agente ou a combinaccedilatildeo de diferentes podem ser responsaacuteveis por grandes

surtos aleacutem de caracterizar-se como zoonose em alguns casos (SNODGRASS et

al1986 TAKIUCHI et al 2006) Assim para o controle das gastroenterites eacute

essencial o diagnoacutestico inserido num contexto epidemioloacutegico O diagnoacutestico da

rotavirose fundamenta-se na detecccedilatildeo do viacuterus no material fecal Atualmente haacute

diferentes teacutecnicas disponiacuteveis para a identificaccedilatildeo viral sendo que nesta

12

infecccedilatildeo rotineiramente satildeo utilizadas a imunomicroscopia eletrocircnica

caracterizaccedilatildeo em gel de poliacrilamida e ELISA pois apresentam alta

especificidade (LINHARES et al 2005) Desta forma o objetivo deste trabalho foi

avaliar a soroprevalecircncia do rotavirus em amostras fecais de bovinos nos

assentamentos rurais Tamarineiro Taquaral e Paiolzinho situados no municiacutepio de

Corumbaacute MS

2 HISTOacuteRICO

O Rotavirus bovino (RVB) foi associado a quadros diarreacuteicos pela demonstraccedilatildeo

experimental Mebus e colaboradores (1969) inocularam em bezerros sadios

filtrado de material fecal de animais com diarreacuteia sendo reproduzido o quadro

diarreacuteico nesses animais aleacutem da identificaccedilatildeo pela microscopia eletrocircnica das

partiacuteculas virais Essas partiacuteculas foram denominadas Nebraska Calf Diarrhea

Virus (NCDV) Posteriormente diferentes autores isolaram esses viacuterus sendo

considerado um importante agente causador de diarreacuteia (WHITE et al 1970)

Na deacutecada de 70 foi demonstrada a semelhanccedila entre as partiacuteculas virais do

rotavirus com as dos Reovirus logo sendo entatildeo denominado Neonatal Calf

Diarrhea Reovirus-like (NCDR) (FERNELIUS et al 1972) Em seguida Woode

Jones e Bridger (1975) relataram a presenccedila de rotavirus em fezes diarreacuteicas de

leitotildees Desde entatildeo inuacutemeros trabalhos tecircm sido publicados relacionando os RV

a gastroenterites em diversas espeacutecies de mamiacuteferos e de aves

O RVB foi detectado no gado brasileiro por pesquisadores em bezerros que

variam de 1 a 120 dias de idade em diferentes propriedades rurais (BRITO1994

BUZINARO et AL2000 JEREZ et AL1987) com prevalecircncia que variam de 53

2812 e 22 (Reinhardt et al1991 Shah Jhala 1992)

13

Na espeacutecie humana os rotavirus foram descritos pela primeira vez em 1973 na

Austraacutelia por Bishop e colaboradores (1973) pela identificaccedilatildeo de partiacuteculas virais

em cortes histoloacutegicos de mucosa duodenal de crianccedilas com diarreacuteia aguda por

meio de microscopia eletrocircnica No ano seguinte viacuterus com caracteriacutesticas

semelhantes foram detectados em amostras fecais de crianccedilas com gastroenterite

aguda (BISHOP et al 1974)

No Brasil a primeira descriccedilatildeo de RV em humanos ocorreu em 1976 a partir de

material fecal proveniente de crianccedilas admitidas em um hospital puacuteblico de Beleacutem

PA (LINHARES et al 1977) Desde entatildeo foram realizadas inuacutemeras

investigaccedilotildees em crianccedilas no paiacutes demonstrando a ocorrecircncia de surtos de

diarreacuteia associados ao RV (RACZ et al 1988 PEREIRA et al 1993

MASCARENHAS et al 1999) Inicialmente esses viacuterus foram denominados

orbivirus e reovirus-like por apresentarem semelhanccedila morfoloacutegica aos membros

da famiacutelia Reoviridae (FLEWETT BRYDEN DAVIES 1973)

No ano de 1974 Flewett e colaboradores evidenciaram a semelhanccedila das

partiacuteculas virais presentes nas fezes de crianccedilas com gastroenterites agudas e de

bezerros com quadro de diarreacuteia as mesmas eram morfologicamente

indistinguiacuteveis agrave microscopia eletrocircnica Ademais fundamentados na identidade

antigecircnica da partiacutecula viral em ensaios de imunofluorescecircncia e

imunomicroscopia eletrocircnica e a semelhanccedila morfoloacutegica desses viacuterus a uma roda

(em latim rota) foi proposta a denominaccedilatildeo rotavirus para agrupaacute-los Em

seguida no ano de 1978 o International Commitee on Taxonomy of Viruses

(ICTV) propocircs a formaccedilatildeo do Gecircnero Rotavirus dentro da Famiacutelia Reoviridae

(MATTHEWS 1979)

14

3 CARACTERIacuteSTICAS DOS ROTAVIRUS

31 Estrutura morfoloacutegica

Os rotaviacuterus pertencem agrave famiacutelia Reoviridae e ao gecircnero Rotavirus A partiacutecula

viral completa apresenta morfologia esfeacuterica com diacircmetro de 75nm capsiacutedeo

icosaeacutedrico com 3 camadas proteacuteicas concecircntricas capsiacutedeo externo

intermediaacuterio e interno e natildeo satildeo envelopados (ESTES 1996 PRASAD CHIU

1994) No interior do capsiacutedeo encontra-se o genoma constituiacutedo por aacutecido

ribonucleacuteico de fita dupla (RNAfd) com 11 segmentos (KAPIKIAN e CHANOCK

1996) sendo que cada segmento regula a siacutentese de uma proteiacutena viral Esses

genes codificam polipeptiacutedeos estruturais e natildeo-estruturais (DESSELBERGER

1989) Estudos com a linhagem siacutemia SA11 de RV identificaram uma sexta

proteiacutena natildeo-estrutural codificada pelo segmento 11 do genoma viral sendo esse

o uacutenico segmento de RV que codificaria mais de uma proteiacutena (MATTION et al

1991) (Figura 1)

15

Figura 1 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica da partiacutecula viral do rotavirus Fonte

httpeducationexpasyorgimagesRotavirus_maturationjpg

As proteiacutenas estruturais satildeo designadas Viral Protein (VP) seguidas por nuacutemero

sequencial na ordem decrescente da massa molecular No core estatildeo presentes

as proteiacutenas VP1 (125KDa) VP2 (94KDa) e VP3 (88KDa) codificadas pelos

segmentos de RNA 1 2 e 3 respectivamente O capsiacutedeo intermediaacuterio eacute formado

pela proteiacutena VP6 (41KDa) codificada pelo segmento 6 por sua vez a camada

externa eacute produzida a partir dos segmentos gecircnicos 4 e 9 que codificam as

proteiacutenas VP4 (88KDa) e VP7 (37KDa) respectivamente (ESTES COHEN 1989

ESTES 2001) (Figura 2)

16

As proteiacutenas natildeo-estruturais encontradas nas partiacuteculas virais maduras recebem

a denominaccedilatildeo Non-Structural Protein (NSP) e satildeo transcritas a partir dos

segmentos 5 7 8 10 e 11 designadas NSP1 a NPS6 (ESTES COHEN 1989)

(Figura 2)

No cerne viral as proteiacutenas VP1 (Pol) e VP3 (Cap) estatildeo diretamente associadas

ao genoma sendo que a proteiacutena VP1 atua como RNA polimerase RNA-

dependente e a proteiacutena VP3 possui atividade de guanililtransferase estando

envolvida na adiccedilatildeo da estrutura 5acute-cap presente nos RNAs mensageiros A

proteiacutena VP2 constitui a estrutura do capsiacutedeo interno sendo a mais abundante do

core viral com 120 moleacuteculas por viacuterion A camada intermediaacuteria do capsiacutedeo eacute

composta inteiramente pela proteiacutena estrutural VP6 totalizando 780 proteiacutenas

organizadas em 260 unidades trimeacutericas a qual circunda o cerne e onde se

encontram os epiacutetopos grupo-especiacuteficos (A-G) comuns a diversas espeacutecies

animais propensas agrave infecccedilatildeo (ESTES 2001 GREENBERG et al 1983) As

proteiacutenas VP7 e VP4 formam a camada externa do viacuterion sendo responsaacuteveis

pelas interaccedilotildees iniciais do viacuterus com a ceacutelula hospedeira aleacutem de serem base

para o sistema de classificaccedilatildeo binaacuteria definido pela presenccedila de glicoproteiacutenas

(Tipo G) e pela sensibilidade a protease (Tipo P) respectivamente A glicoproteiacutena

VP7 forma a matriz do capsiacutedeo externo e estar associada com a produccedilatildeo de

anticorpos neutralizantes incluindo aqueles sorotipo-especiacuteficos A VP4

estruturalmente possui projeccedilotildees que se projetam da matriz proteacuteica e

desempenham importante papel no mecanismo da penetraccedilatildeo viral na ceacutelula e

estaacute associada aos genoacutetipos P (Estes 2001)

As proteiacutenas natildeo-estruturais estatildeo envolvidas na replicaccedilatildeo (NSP1-NSP3 NPS5

e NSP6) e na morfogecircneses (NSP4) e com exceccedilatildeo da NSP4 todas interagem

com o aacutecido ribonucleacuteico (ESTES amp KAPIKIAN 2007) A proteiacutena NSP4

especialmente funciona como receptor intracelular para as partiacuteculas virais

imaturas e satildeo consideradas como enterotoxinas induzindo diarreacuteia no

hospedeiro (MORI et al 2002)

17

Figura 2 - Estrutura esquemaacutetica do Rotavirus evidenciando os 11 segmentos genocircmicos com as

respectivas proteiacutenas codificadas e a estrutura proteacuteica da partiacutecula viral Fonte Peter et al 2000

32 Estrutura genocircmica

A estrutura genocircmica dos rotavirus eacute formada por 11 segmentos de dsRNA

inseridos no capsiacutedeo viral sendo esta organizaccedilatildeo gecircnica uacutenica entre os viacuterus

que infectam aves e mamiacuteferos O genoma completo desses viacuterus apresenta

aproximadamente 18600 pb Cada gene por sua vez eacute constituiacutedo por

segmentos que variam de 600 a 3000 pb (ESTES 2001)

18

Devido ao fato dos rotavirus apresentarem o material geneacutetico segmentado e com

tamanho molecular diferente possibilita a visualizaccedilatildeo dos 11 segmentos quando

submetidos agrave eletroforese em gel de poliacrilamida apresentando um perfil de

migraccedilatildeo caracteriacutesticos e uacutenico para os rotavirus Os segmentos satildeo distribuiacutedos

em quatro classes as quais satildeo numerados pela ordem de migraccedilatildeo no gel classe

I (segmentos 1 2 3 e 4) II (5 e 6) III (7 8 e 9) e IV (10 e 11) ou 4232 A

velocidade de migraccedilatildeo dos segmentos ldquo10rdquo e ldquo11rdquo determina o perfil longo

(migraccedilatildeo raacutepida) ou curto (lenta) havendo ainda o padratildeo ldquosuper curtordquo (Estes

2001 Kapikian et al 2001) Ocasionalmente os RVs pertencentes ao grupo A

exibem a configuraccedilatildeo do perfil aviaacuterio com a tiacutepica distribuiccedilatildeo 5132 Os

integrantes dos grupos B e D denotam padratildeo 4223 e o C por sua vez 4322

(figura 3)

Figura 3 ndash Representaccedilatildeo esquemaacutetica do padratildeo de migraccedilatildeo em Eletroforese em Gel de

Poliacrilamida do RNAdf relativo aos eletroferogrupos A B C D e E de Rotavirus Fonte Instituto

Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)

19

Em relaccedilatildeo agraves moleacuteculas de dsRNA essas natildeo possuem caraacuteter infeccioso pelo

fato das partiacuteculas virais apresentarem suas proacuteprias RNA polimerases (RNA-

dependente viral) para codificar os segmentos individuais de RNA em RNA

mensageiros (mRNA) A transcriccedilatildeo eacute realizada de maneira assimeacutetrica sendo

que cada segmento de RNA possui polaridade positiva sendo sintetizado a partir

da fita negativa do RNA genocircmico (ESTES 2001) A extremidade 5rsquo das fitas de

RNA possuem uma estrutura cap semelhante agrave encontrada no mRNA celular

entretanto natildeo apresentam a extremidade 3rsquo poliadeniladas Todos os genes satildeo

flanqueados por regiotildees traduzidas de extensatildeo variaacutevel junto as extremidades 5rsquo

e 3rsquo sendo que essas apresentam sequecircncias comuns conservadas

denominadas consensuais A maioria dos mRNA terminam com uma sequumlecircncia de

consenso 5rsquo -UGUGACC-3rsquo contendo importantes sequumlecircncias sinalizadoras que

desencadeiam a expressatildeo dos genes (Estes 2001)

33 CLASSIFICACcedilAtildeO

O rotaviacuterus apresenta trecircs importantes especificidades antigecircnicas grupo

subgrupo e sorotipo sendo estas diretamente relacionadas agrave presenccedila de

proteiacutenas no capsiacutedeo viral Este criteacuterio permite a classificaccedilatildeo de muacuteltiplos

grupos ou sorogrupos e a existecircncia de muacuteltiplos sorotipos dentro de cada grupo

(KAPIKIAN e CHANOCK 1996) Atualmente foram caracterizados sete

sorogrupos (A-G) que apresentam um antiacutegeno comum e um padratildeo distinto de

migraccedilatildeo eletroforeacutetica dos 11 segmentos do RNAfd (KAPIKIAN HOSHINO

CHANOCK 2001) estando associados agrave infecccedilatildeo no homem outros mamiacuteferos e

mesmo entre aves (figura 3)

Os grupos A B e C estatildeo associados agrave gastroenterite humana mas podem

infectar animais jaacute os pertencentes aos grupos D E F e G estatildeo relacionados

com a gastroenterite em mamiacuteferos e aves Dos sete sorogrupos dos RV somente

os grupos (gp) A B e C determinam infecccedilotildees que por sua frequumlecircncia podem

ser consideradas de importacircncia epidemioloacutegica para humanos e animais (SAIF

20

1990) O RV grupo A eacute o principal causador de diarreacuteia infantil grave nos humanos

e em muitas espeacutecies animais sendo encontrado mundialmente e estando

relacionado com mais de 500 mil mortes anuais de crianccedilas menores de cinco

anos (PARASCHAR et al 2003) Esse grupo contem como antiacutegeno comum a

VP6 detectado pela maioria das teacutecnicas soroloacutegicas rotineiramente utilizadas

como recurso diagnoacutestico (Kapikian et al 2001) Adicionalmente o RV grupos B

C e G compreendem em sua maioria amostras que infectam animais com a

proteiacutena VP6 diferente daquela comum aos RVs integrantes do grupo A Tais

amostras natildeo satildeo detectadas por teacutecnicas soroloacutegicas convencionais sendo sua

identificaccedilatildeo em geral efetuada por imunomicroscopia eletrocircnica eletroforese do

dsRNA em gel de poliacrilamida (PAGE) e metodologias moleculares (Kapikian et

al 2001) Estudos epidemioloacutegicos demonstram que a rotavirose causada pelo

grupo A de RV eacute mais frequentemente relatada seguida por infecccedilotildees pelo grupo

C tanto no homem quanto em animais (SAIF 1990)

34 Sorotipos

Os sorotipos ou genoacutetipos do rotavirus podem ser caracterizados pela capacidade

de induccedilatildeo de anticorpos neutralizantes e de segregaccedilatildeo durante o processo de

replicaccedilatildeo atraveacutes das proteiacutenas do capsiacutedeo externo VP4 e VP7 e tambeacutem

segmentos genocircmicos que codificam tais proteiacutenas (KAPIKIAN CHANOCK

1990) Atraveacutes da anaacutelise da sequecircncia de nucleotiacutedeos do gene correspondente

agrave glicoproteiacutena VP7 e por meio de teacutecnicas soroloacutegicas satildeo descritos atualmente

14 sorotipos e 15 genotipos G de rotavirus do grupo A denominados assim de G1

a G15 (HOSHINO KAPIKIAN 2000)

A determinaccedilatildeo de sorotipos P natildeo eacute bem definida existindo 11 sorotipos

tentativamente designados sendo que quatro deles possuem subtipos mas natildeo

possuem correlaccedilatildeo com os genoacutetipos P (KAPIKIAN 14 HOSHINO CHANOCK

2001) O sequumlenciamento de nucleotiacutedeos do gene que codifica a proteiacutena VP4

define 21 genoacutetipos P de rotavirus humanos e animais determinados de P (1) a P

21

(21) Logo a identificaccedilatildeo dos sorotipos P e G de rotavirus com o uso de meacutetodos

soroloacutegicos apresenta limitaccedilotildees como 1) alta taxa de amostras natildeo-sorotipadas

nos levantamentos epidemioloacutegicos 2) grande nuacutemero de infecccedilotildees mistas ou

variantes antigecircnicas 3) natildeo caracterizaccedilatildeo de sorotipos P por meio de ensaios

imunoenzimaacuteticos comerciais (ALFIERI 1999)

Os genoacutetipos P e G podem se combinar de diversas maneiras possiacuteveis sendo

que algumas combinaccedilotildees aparecem com maior frequumlecircncia de acordo com a

espeacutecie hospedeira aparentando predomiacutenio na frequumlecircncia destas associaccedilotildees

Pesquisas mostram que quatro combinaccedilotildees P-G P[8]G1 P[4]G2 P[8]G3 e

P[8]G4 satildeo amplamente distribuiacutedas mundialmente em frequumlecircncias variaacuteveis

aleacutem dos genoacutetipos emergentes P[8]G9 e P[6]G9 (SANTOS HOSHINO 2005)

As teacutecnicas usadas com maior eficaacutecia para a caracterizaccedilatildeo dos rotavirus satildeo as

teacutecnicas moleculares como a hibridizaccedilatildeo de aacutecidos nucleacuteicos a reaccedilatildeo em

cadeia da polimerase precedida de transcriccedilatildeo reversa (RT-PCR) e com maior

destaque a genotipagem Esta uacuteltima passou a ser usada como teacutecnica de maior

eficiecircncia pois possui boa relaccedilatildeo com a especificidade antigecircnica e garante a

anaacutelise de um maior nuacutemero de amostras em menor tempo (GENTSCH et al

1996)

35 CICLO DE REPLICACcedilAtildeO VIRAL

O rotavirus penetra o organismo pela via fecal-oral assim apoacutes a ingestatildeo as

partiacuteculas virais entram em contato com a mucosa intestinal O viacuterus apresenta

tropismo pelas ceacutelulas do intestino delgado infectando os enteroacutecitos maduros da

regiatildeo apical das vilosidades intestinais Diferentes estudos in vitro e in vivo

sugerem a presenccedila de um ou mais receptores especiacuteficos nessas ceacutelulas Logo

a infectividade pode estar associada com a presenccedila de moleacuteculas de aacutecido

siaacutelico (AS) na superfiacutecie celular Entretanto jaacute foi descrito que algumas linhagens

satildeo independentes de AS ou seja resistentes a neuraminidase Dessa forma

22

vem sendo proposta a existecircncia de dois receptores para o rotavirus AS-

dependentes (gangliosiacutedeos) e os AS-independentes (integrinas) Em relaccedilatildeo agraves

linhagens que infectam animais e humanos a maioria eacute identificada como AS-

independente (ALFIERI ET AL2007)

A adsorccedilatildeo viral eacute promovida pela proteiacutena VP4 ou pelo seu produto de clivagem

a proteiacutena VP5 Aleacutem dessas proteiacutenas autores apontam a participaccedilatildeo da

proteiacutena VP7 nesse processo sendo os resultados ainda incipientes

Provavelmente o viacuterus penetra na ceacutelula de maneira direta pela membrana

plasmaacutetica apoacutes a clivagem da proteiacutena VP4 e exposiccedilatildeo do peptiacutedeo de fusatildeo

VP5 ou pelo processo de endocitose O processamento da partiacutecula via

mecanismos endociacuteticos ocorre pela accedilatildeo de enzimas lisossomais presentes nas

vesiacuteculas endociacuteticas sendo esse processo dependente de caacutelcio (ALFIERI ET AL

2007)

Apoacutes essa etapa inicia-se o ciclo de multiplicaccedilatildeo no citoplasma dos enteroacutecitos

resultando na lise celular saiacuteda das partiacuteculas virais completas ou seja com as

trecircs camadas de proteiacutena e consequentemente descamaccedilatildeo tecidual (ALFIERI ET

AL2007)

Os dsRNAs satildeo pareados do iniacutecio ao fim e a fita de polaridade positiva conteacutem

uma sequumlecircncia 5rsquo cap m7GpppG(m)gpY (IMAI et al 1983) Os RVs replicam e

ldquoempacotamrdquo coordenadamente os 11 segmentos do RNA viral e os 11 mRNA

compartilham sinais que satildeo comuns em virtude de todos eles replicarem a partir

da mesma polimerase Aleacutem disso cada RNAm ldquosinalizardquo que eacute uacutenico em razatildeo

dos 11 mRNA serem diferenciados uns dos outros durante o processo de

ldquoempacotamentordquo As regiotildees terminais conservadas nos segmentos do genoma

contecircm sequumlecircncias especiacuteficas importantes que desencadeiam o processo para o

iniacutecio da transcriccedilatildeo traduccedilatildeo do RNA transporte do RNA replicaccedilatildeo montagem

conformaccedilatildeo do capsiacutedeo e ldquoempacotamentordquo dos segmentos no genoma viral

(PATTON amp SPENCER 2000)

23

Figura 4 - Esquema simplificado das principais etapas de replicaccedilatildeo intracelular dos rotavirus

Fonte Adaptado de Linhares et al 2005

36 QUADRO CLIacuteNICO DA GASTROENTERITE BOVINA

A gastroenterite eacute uma doenccedila diarreacuteica conhecida pelo seu raacutepido iniacutecio e com

sintomas que podem ou natildeo incluir naacuteuseas vocircmitos febre ou dor abdominal

(American Academy of Pediatrics -9697) A etiologia das diarreacuteias eacute bastante

complexa e pode estar associada a diferentes agentes etioloacutegicos como viacuterus

bacteacuterias parasitas e toxinas sendo que a distribuiccedilatildeo sazonal dos agentes

etioloacutegicos estaacute intimamente relacionada com as condiccedilotildees higiecircnicasanitaacuteria de

cada regiatildeo (BERN GLASS 1994 CICIRELLO GLASS 1994) condiccedilotildees

24

ambientais manejo fatores nutricionais e fisioloacutegicos o que provoca agravamento

do quadro geral do animal diarreacuteico (SNODGRASS et al1986)

Em bovinos a gastroenterite eacute associada a diversos patoacutegenos principalmente

rotavirus coronavirus Escherichia coli enterotoxigecircnica Salmonella sp e o

protozoaacuterio Cryptosporidium sp (SNODGRASS et al1986) De forma geral a

rotavirose bovina acomete com maior frequumlecircncia animais jovens (idade inferior a

trecircs semanas) poreacutem a siacutendrome pode ocorrer em todas as idades incluindo

bovinos adultos (LUCCHELLI et al 1992)

Rotavirus satildeo apontados como um dos principais agentes etioloacutegicos de diarreacuteia

em bezerros com idade inferior a trecircs semanas resultando em grandes perdas

econocircmicas agrave pecuaacuteria de leite e corte (Tzipori 1981 Snodgrass et al 1986

Lucchelli et al 1992)

Em animais neonatos a diarreacuteia eacute resultado da multiplicidade de agentes

etioloacutegicos e por isso deve ser analisada como siacutendrome (CHARLES FURLONG

1992) sendo considerada uma das principais causas de mortalidade neste

periacuteodo (SCHUDEL et al 1985)

O periacuteodo mais criacutetico para a ocorrecircncia das rotaviroses eacute o primeiro mecircs de vida

devido agrave reposiccedilatildeo lenta do epiteacutelio apical das vilosidades tornando assim mais

faacutecil o desenvolvimento completo do ciclo replicativo Entretanto os animais

adultos apresentam resistecircncia agrave doenccedila pois a reposiccedilatildeo de seus enteroacutecitos eacute

mais raacutepida e compete com a replicaccedilatildeo do viacuterus sendo que somente amostras

muito virulentas podem provocar quadro diarreacuteico em bezerros com idade superior

agrave seis semanas O quadro cliacutenico de rotavirose tambeacutem natildeo eacute frequumlente em

animais com ateacute uma semana de vida provavelmente devido agrave ingestatildeo de

colostro contendo anticorpos maternos seguida da neutralizaccedilatildeo do viacuterus por tais

anticorpos (ALFIERI ET AL2007) ndash (Figura 5)

25

Figura 5 ndash Corte histoloacutegico das vilosidades intestinais A ndash intestino normal B ndash intestino infectado

por rotavirus

Fonte

httpwwwmsdcomarmsdarhcpespecialidadespediatria_commonhcpdiseasesrotavirusrotavirus_02ht

ml

Dentre os agentes virais o gecircnero Rotavirus eacute considerado o maior gecircnero

presente na etiologia das gastroenterites infecciosas em crianccedilas e animais

neonatos (ESTES 1996) com ampla distribuiccedilatildeo geograacutefica mundial (ACHA

SZYFRES 1986)

O quadro cliacutenico apresentado por bovinos infectados por rotavirus pode incluir

diarreacuteia prostaccedilatildeo anorexia febre e desidrataccedilatildeoO periacuteodo de incubaccedilatildeo da

doenccedila varia de 18 a 96 horas (MEBUS 1990) sendo que a morte dos animais

pode ocorrer de acordo com o grau de desidrataccedilatildeo e o quadro diarreacuteico do

animal (MEBUS 1990) em um periacuteodo de 3 a 7 dias apoacutes o iniacutecio da diarreacuteia

(COLUCHI KROEFF 2000)

26

Em crianccedilas a rotavirose eacute precedida por um periacuteodo de incubaccedilatildeo que pode

variar de 24 a 48 horas (WARD et al1986) e caracteriza-se pelo aumento do

nuacutemero de evacuaccedilotildees com fezes aquosas ou de pouca consistecircncia por cinco a

oito dias acompanhada de vocircmito febre por dois ou trecircs dias e dor abdominal

desidrataccedilatildeo (LINHARES BRESEE 2000)

37 FORMAS DE TRANSMISSAtildeO

A principal via de transmissatildeo desta virose eacute fecal-oral sendo desta forma de

difiacutecil controle pois estaacute intimamente relacionada a fatores como saneamento

baacutesico nutriccedilatildeo e suporte meacutedico-hospitalar (KAPIKIAN et al 2001)

Em ambientes com pouco ou nenhum saneamento baacutesico os dejetos humanos e

de animais vazamento de esgotos e enchentes se tornam poluidores e

contaminantes da aacutegua utilizada pela populaccedilatildeo local e para a manutenccedilatildeo dos

animais Esta mesma aacutegua pode ser usada na agricultura causando assim

contaminaccedilatildeo de alimentos na irrigaccedilatildeo de pastos na lavagem das instalaccedilotildees e

na nutriccedilatildeo dos animais Desta forma poderaacute provocar surtos de rotavirose assim

sendo a aacutegua contaminada com o viacuterus um meio eficaz de propagaccedilatildeo da doenccedila

(KAPIKIAN et al 2001 ESTES 2001)

Alguns fatores contribuem para a ampla disseminaccedilatildeo do viacuterus como por

exemplo as altas taxas de excreccedilatildeo viral o periacuteodo de excreccedilatildeo a existecircncia de

portadores e a alta resistecircncia dos viacuterions no ambiente A Rotavirose pode ser

considerada uma zooantroponose e ao mesmo tempo uma antropozoonose uma

vez que haacute ocorrecircncias de sorotipos tipicamente de animais que infectam

humanos e vice-versa A diversidade de rotavirus circulantes encontrada em

paiacuteses tropicais em desenvolvimento se deve ao fato de ocorrer uma transmissatildeo

natural entre espeacutecies distintas dos mesmos (GOUVEA E SANTOS1997)

27

38 RESPOSTA IMUNE DO HOSPEDEIRO

Os estudos que se referem a resposta imune do hospedeiro apoacutes a infecccedilatildeo pelo

rotavirus ainda satildeo incipientes e natildeo esclarecem de forma completa os

mecanismos imunoloacutegicos envolvidos (ALFIERI et AL 2007)

A imunidade humoral mediada por imunoglobulinas da classe A (IgA secretora)

aparenta ser a principal defesa orgacircnica contra a infecccedilatildeo sintomaacutetica pelo

rotavirus Estudos realizados na Austraacutelia e nos Estados Unidos associaram niacuteveis

detectaacuteveis de IgA fecal contra rotavirus agrave sensiacutevel reduccedilatildeo na taxa de infecccedilotildees

sintomaacuteticas causadas por esses enteropatoacutegenos (COULSON et al 1992

MATSON et al 1993)

A formaccedilatildeo de anticorpos neutralizantes principalmente IgG eacute induzida atraveacutes

das proteiacutenas do capsiacutedeo externo (VP4 e VP7) intermediaacuterio (VP6) e da proteiacutena

natildeo estrutural NSP4 Segundo estudos o papel destas imunoglobulinas ainda natildeo

foi elucidado Em experimentos realizados com cordeiros neonatos gnotobioacuteticos

os determinantes primaacuterios da resistecircncia agrave infecccedilatildeo pelo rotavirus foi hipotetizada

a participaccedilatildeo de anticorpos presentes na luz intestinal jaacute os anticorpos

circulantes natildeo apresentaram funccedilatildeo de resistecircncia (ALFIERI et AL2007)

Observou-se tambeacutem a proteccedilatildeo de animais neonatos contra a rotavirose atraveacutes

do mecanismo de accedilatildeo das IgGs neutralizantes de origem materna atraveacutes do

processo de neutralizaccedilatildeo viral via fenocircmeno de transcitose antes que o processo

infeccioso se estabeleccedila no enteroacutecito (WARD 1996)

Na imunizaccedilatildeo passiva de bezerros a imunoglubulina IgG eacute considerada a mais

importante (Menanteau-Horta et al 1985) desta forma associa-se proteccedilatildeo contra

diarreacuteia e presenccedila de alta quantidade de IgG1 (Saif et al 1983 Fernandez et al

1998) uma vez que nesta espeacutecie animal a IgG1 possui papel importante na

imunidade de mucosa intestinal Em estudo de infecccedilatildeo experimental por rotavirus

28

em bezerros os que apresentavam alto niacuteveis seacutericos de IgG1 apresentavam

quadro mais brando e periacuteodo mais curto de diarreacuteia (Parrentildeo et al 2004)

Observou-se aumento nos tiacutetulos de IgA e IgM em animais com niacuteveis baixos de

IgG1 apoacutes desafio com rotavirus (Fernandez et al 1998 Parrentildeo et al 2004)

A imunidade celular na infecccedilatildeo pelo rotavirus tem sido amplamente estudada em

camundongos (modelos experimentais) sendo observadas as seguintes

caracteriacutesticas

1- anticorpos especiacuteficos satildeo de importacircncia primaacuteria na proteccedilatildeo contra recidiva

2- amostras homoacutelogas de rotavirus desempenham resposta humoral muito mais

potentes do que amostras heteroacutelogas

3- Os linfoacutecitos T CD8+ tecircm papel importante na resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo e de forma

menos efetiva observa-se a participaccedilatildeo tambeacutem de linfoacutecitos CD4+

4- As citocinas e ceacutelulas Natural Killer (NK) tambeacutem participam da eliminaccedilatildeo do

viacuterus

Em suma a imunidade celular estaacute fortemente relacionada agrave melhora do quadro

cliacutenico e fracamente relacionada com a recidiva da infecccedilatildeo (ALFIERI et AL

2007)

39 TRATAMENTO

O tratamento eacute apenas sintomaacutetico desta forma o animal deve ser colocado em

ambiente ventilado aquecido sendo importante a fluidoterapia e antibioticoterapia

contra infecccedilotildees secundaacuterias (httpwwwsaudeanimalcombrartig131htm)

O objetivo primaacuterio no tratamento da gastroenterite eacute a reposiccedilatildeo dos fluiacutedos e

eletroacutelitos cuja acentuada perda se processa via episoacutedios de vocircmitos e diarreacuteia

Aliaacutes compreende-se que na quase totalidade das situaccedilotildees de diarreacuteia

independente da etiologia a reidrataccedilatildeo representa tratamento baacutesico mesmo na

vigecircncia de vocircmitos (BLACKLOW amp GREENBERG 1991 BEZERRA et al 1992)

29

A soluccedilatildeo hidroeletroliacutetica administrada de forma lenta em geral minimiza a

frequumlecircncia dos vocircmitos tendendo corrigir satisfatoriamente o desequiliacutebrio de

fluidos e eletroacutelitos no curso das primeiras 4 horas de tratamento (BASS 2003)

Alguns antivirais possuem a propriedade de inibir a replicaccedilatildeo dos rotavirus

destacando-se ribavirina isoflavinas e anaacutelogos da adenosina (DE et aI 1984

KITAOKA et al 1986) As investigaccedilotildees envolvendo o uso desses produtos em

animais oferecem resultados inexpressivos em termos de eficaacutecia daiacute a ampla

reserva que ainda prevalece quanto agrave sua utilizaccedilatildeo em seres humanos

(STEINHOFF 1980 SMEE 1982 KITAOKA et al 1986) Estudos sobre a

atividade antiviral dos interferons (tipo 1 e 2) alcanccedilaram resultados satisfatoacuterios

em bovinos (SCHWERS et aI 1985) no entanto para o tratamento de

camundongos diarreacuteicos caracterizou-se como ineficaz (Angel et aI 1999) Alguns

pesquisadores sustentam que o uso de corticosteroacuteides em murinos e bovinos

com diarreacuteia causada pelos rotavirus minimiza a sintomatologia (WOLF et aI

1981 RHOADS et al 1988)

30

Figura 6 Administraccedilatildeo de soluccedilatildeo hidroeletroliacutetica em bezerro com diarreacuteia Fonte homepageusaskcaAshleyrotavirushtml

310 DIAGNOacuteSTICO DE ROTAVIROSE

O diagnoacutestico das infecccedilotildees por Rotavirus eacute baseado na identificaccedilatildeo de

partiacuteculas antiacutegenos ou RNA viral em amostras fecais As teacutecnicas mais utilizadas

satildeo a imunomicroscopia eletrocircnica eletroforese em gel de poliacrilamida e ELISA

(LINHARES et AL 2005)

3101 Microscopia Eletrocircnica

A microscopia eletrocircnica consiste na visualizaccedilatildeo das partiacuteculas virais

encontradas nas fezes O material a ser examinado deve ser corado com

31

fosfotungstato de potaacutessio ou outro corante usado para tal fim A partiacutecula viral

pode ser observada sob um aumento de 30000 a 50000 vezes O diagnoacutestico eacute

positivo em 80 a 90 das amostras contendo rotavirus uma vez que a

morfologia da partiacutecula viral eacute caracteriacutestica e a excreccedilatildeo do viacuterion para sua

viabilidade no ambiente eacute aproxidamente de 100000 partiacuteculas por mililitro de

fezes Esta teacutecnica necessita de equipamento sofisticado e portanto apresenta

alto custo aleacutem disso natildeo eacute recomendada para diagnoacutestico em larga escala

Geralmente esta teacutecnica eacute utilizada para dirimir duacutevidas referentes a outro

diagnoacutestico realizado (ALFIERI et AL 2007 LINHARES et AL 2005)

Figura 7 - Partiacuteculas de rotavirus visualizadas em microscoacutepio eletrocircnico (Kapikian AZ HW

Kim RG Wyatt et al Reovirus-como agente nas fezes associaccedilatildeo com diarreacuteia infantil e

desenvolvimento de testes soroloacutegicos Ciecircncia 151049 1974)

3102 Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)

Esta teacutecnica consiste na visualizaccedilatildeo do RNA viral que possui 11 fragmentos em

um gel de poliacrilamida apoacutes sua corrida eletroforeacutetica O processo se inicia com

a retirada da parte proteacuteica da suspensatildeo fecal atraveacutes da adiccedilatildeo de dodecil-

32

sulfato de soacutedio e fenol posteriormente precipita-se o RNA viral pela adiccedilatildeo de

95 de etanol Apoacutes a ressuspensatildeo do sedimento a eletroforese das amostras eacute

realizada em gel de poliacrilamida afim de observar apoacutes a coloraccedilatildeo do aacutecido

nucleacuteico pela prata a separaccedilatildeo niacutetida dos 11 segmentos de RNA viral

(LINHARES et al 2005)

A teacutecnica de PAGE eacute sensiacutevel e possui a vantagem da classificaccedilatildeo das amostras

virais de acordo com seus eletroferotipos Eacute uma teacutecnica simples poreacutem haacute

impedimentos quanto agrave sua utilizaccedilatildeo rotineiramente em laboratoacuterios de pequeno

porte devido agrave necessidade de equipamentos especiacuteficos para realizaccedilatildeo da

teacutecnica (LINHARES et al 2005)

3103 Ensaio Imunoenzimaacutetico

O ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) tornou-se a teacutecnica mais

divulgada e praacutetica na identificaccedilatildeo do rotavirus sendo assim muito eficaz para o

diagnoacutestico de exames fecais em larga escala A eficaacutecia da teacutecnica se deve a

reagentes de alta pureza quiacutemica e tambeacutem reconhecida especificidade bioloacutegica

Nesta praacutetica os anticorpos (policlonais ou monoclonais) especiacuteficos para a

proteiacutena VP6 dos rotavirus do grupo A satildeo utilizados para a ligaccedilatildeo com os

antiacutegenos virais presentes na amostra Os kits imunoenzimaacuteticos encontrados no

mercado para detecccedilatildeo da rotavirose animal de forma geral possuem alta

sensibilidade satildeo executados facilmente e com rapidez aleacutem de apresentam

baixo custo (LINHARES et al 2005)

O kit denominado EIARA (Enzyme immunoassay for rotavirus and adenovirus) foi

desenvolvido pela fundaccedilatildeo Oswaldo Cruz e apoacutes estudos tem se mostrado muito

praacutetico e com ampla aceitaccedilatildeo no Brasil (PEREIRA et al1985 1993 in LINHARES

et al 2005)

33

3104 Aglutinaccedilatildeo com partiacuteculas de laacutetex (APL)

A aglutinaccedilatildeo com partiacuteculas de laacutetex (APL) consiste primeiramente na

sensibilizaccedilatildeo de microesferas de laacutetex com anticorpos monoclonais para a

proteiacutena VP6 que posteriormente seratildeo colocadas em contato com preparaccedilotildees

fecais e assim em amostras positivas ocorreraacute aglutinaccedilatildeo quando observadas

contra superfiacutecie escura (Pai et al 1985 Brandt et al 1987 in Linhares ET AL

2005) Esta teacutecnica tem se revelado muito praacutetica de baixo custo

(aproximadamente 3 vezes inferior ao preccedilo do ELISA) e muito eficaz quando se

refere agrave rapidez do resultado aproximadamente 5 minutos Possui sensibilidade

comparaacutevel agrave do ELISA e devido agrave rapidez de seu resultado eacute recomendado para

uso em hospitais No mercado jaacute estatildeo disponiacuteveis kits de alta qualidade


311 PROFILAXIA

Aleacutem da adoccedilatildeo de medidas higiecircnico-sanitaacuterias eacute importante tambeacutem incluir na

profilaxia medidas gerais como

Isolamento de animais infectados

Criaccedilatildeo de animais de faixa etaacuterias uniformes

Desinfecccedilatildeo de instalaccedilotildees

Rodiacutezio de piquetes de pariccedilotildees em rebanhos bovinos de criaccedilatildeo extensiva

Vazio sanitaacuterio (ALFIERI et al2007)

A identificaccedilatildeo de patoacutegenos eacute essencial para o controle das rotaviroses pois

desta forma as medidas profilaacuteticas seratildeo mais direcionadas e assertivas

34

312 VACINAS

A rotavirose bovina eacute responsaacutevel por grandes perdas econocircmicas natildeo somente

pela alta taxa de mortalidade mas tambeacutem pelo crescimento tardio dos animais e

gastos com medicamentos (LANGONI H 2004)

A vacinaccedilatildeo apresenta resultados positivos quando realizada em receacutem-nascidos

(oral) e em fecircmeas no terccedilo final de gestaccedilatildeo para proteccedilatildeo dos bezerros Estudos

evidenciam a reduccedilatildeo da gravidade do quadro cliacutenico e menor perda de peso

quando haacute uso das vacinas Cerca de seis a duas semanas antes do parto as

fecircmeas devem ser vacinadas o reforccedilo deve ser anual e deve ocorrer

preferencialmente quinze dias antes do parto (LANGONI H 2004)

Segundo estudos a vacinaccedilatildeo de vacas prenhes com vacinas de rotavirus vivo ou

inativado pode elevar os tiacutetulos de anticorpos seacutericos antirotavirus que seratildeo

transferidos para os bezerros atraveacutes do colostro e do leite protegendo-os assim

passivamente (CASTRUCCI et al 1988 TSUNEMITSU et al 1989) Segundo

estudos de campo os resultados quanto ao niacutevel de proteccedilatildeo dos bezerros em

exposiccedilatildeo ao viacuterus que tiveram matildees vacinadas eacute variaacutevel (BELLINZONI et al

1989 KOHARA et al 1997) De acordo com testes modelos murinos e bovinos

que receberam por via oral imunoglobulinas obtidas da gema dos ovos de galinhas

imunizadas com rotavirus tem o tempo da doenccedila reduzido (EBINA et al 1990

KUROKI et aI 1997)

Alguns fatores podem interferir na efetividade das vacinas contra rotavirus satildeo

eles passagem de anticorpos por via transplacentaacuteria ingestatildeo de colostro

condiccedilatildeo nutricional infecccedilotildees mistas por rotavirus associado a outros viacuterus e

bacteacuterias multiplicidade de sorotipos e subtipos capazes de produzir doenccedila

aparecimento de novas amostras com reagrupamentos geneacuteticos humanos ou

animais imunidade coletiva e cobertura vacinal (Kapikian 1990)

35

Atualmente eacute utilizada na vacinaccedilatildeo de bovinos uma vacina injetaacutevel a

ScourGuard3(K)Creg (Pfizer) que conteacutem em sua composiccedilatildeo culturas inativadas

de Coronaviacuterus bovino Rotavirus bovino (amostra NCDV-Lincoln-G6P[1]) uma

bacterina de E coli aleacutem de toxoacuteide de C perfringens tipo C Segundo a bula do

medicamento este objetiva a proteccedilatildeo dos animais contra a diarreacuteia neonatal

bovina causada por estes agentes etioloacutegicos ou combinaccedilatildeo deles Esta vacina eacute

destinada a vacas gestantes sadias que devem receber 2 doses da vacina com

duas semanas de intervalo entre elas sendo que a segunda dose deveraacute ser feita

15 dias antes da data prevista do parto (SILVA2008)

Em estudo recente realizado com a vacina citada acima obteve-se menor

incidecircncia de rotavirose em propriedade onde a vacinaccedilatildeo natildeo foi realizada do

que na propriedade onde houve vacinaccedilatildeo Entende-se que a circulaccedilatildeo do

agente viral entre os animais seria suficiente para estabelecer uma imunidade

natural contra ao rotavirus Ainda neste estudo os bezerros nascidos de vacas

imunizadas foram mais acometidos pela rotavirose apesar de apresentarem

tiacutetulos mais elevados de imunoglobulinas (SILVA2008)

Duas vacinas foram desenvolvidas para entrar no calendaacuterio de imunizaccedilatildeo

humano A Rotarixreg (GSK) que foi introduzida em 2006 no calendaacuterio de

vacinaccedilatildeo eacute uma vacina monovalente com rotavirus humano atenuado Jaacute a

Rotateqreg (Merck) que teve seu licenciamento em 2006 eacute uma vacina

pentavalente reagrupante bovino-humana As duas vacinas foram exaustivamente

testadas em mais de 60000 crianccedilas e natildeo provocaram intussuscepccedilatildeo A

primeira dose da vacina foi administrada em crianccedilas com menos de 3 meses e

apresentam-se seguras e eficazes contra o sorotipo G1 principalmente para

quadros diarreacuteicos moderados ou graves para outros sorotipos a eficaacutecia da

vacina foi testada insuficientemente (Bricks2005)

36

313 Assentamentos Rurais no municiacutepio de Corumbaacute

A regiatildeo centro ndashoeste em 2004 concentrava 3480 de todo o rebanho bovino

do Brasil seguida da Norte com 1945 Sudeste com 1926 Sul com 1379 e

Nordeste com 1270 Dos dez principais municiacutepios detentores de rebanhos de

bovinos no Brasil oito estavam na Regiatildeo Centro-Oeste do paiacutes cinco deles

estavam no Mato Grosso do Sul e trecircs no Mato Grosso (IBGE 2004) (Figura 6)

Figura 8 Distribuiccedilatildeo espacial do rebanho de bovinos com destaque para os dez principais

municiacutepios ndash Brasil Fonte IBGE 2004

37

A regiatildeo do Mato Grosso do Sul em especial a cidade de Corumbaacute possui um

nuacutemero efetivo de aproximadamente 2 milhotildees de cabeccedilas de gado (IBGE2004)

O municiacutepio de Corumbaacute localiza-se na regiatildeo centro-oeste do Brasil no estado do

Mato grosso do Sul Corumbaacute possui 956 (618 Km2) do seu territoacuterio inserido

na planiacutecie pantaneira Na cidade de Corumbaacute haacute presenccedila de assentamentos

rurais os quais fazem parte do projeto de reforma agraacuteria do governo federal

Destes assentamentos trecircs foram estudados neste projeto para a pesquisa de

rotavirus em bovinos Os assentamentos estudados denominam-se Tamarineiro II

Taquaral e Paiolzinho Estes assentamentos distam da cidade de Corumbaacute

aproximadamente 17 Km O assentamento Tamarineiro 2 encontra-se dividido em

duas glebas (norte e sul) A aacuterea dos assentamentos eacute a seguinte

a)assentamento Paiolzinho possui 119675 hectares distribuiacutedos em 50 lotes e

possui 400 cabeccedilas de gado b) assentamento Tamarineiro 2 (norte e sul) possui

1062108 hectares distribuiacutedos em 319 lotes e possui 1500 cabeccedilas de gado c)

assentamento Taquaral com 1001324 hectares distribuiacutedos em 394 lotes com

4000 cabeccedilas de gado (TOMICH2007)

4 OBJETIVOS

41 OBJETIVO GERAL

Avaliar a prevalecircncia do rotavirus em amostras fecais de bezerros nos


Corumbaacute MS

42 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Extrair o RNA viral de amostras de fezes bovinas provenientes de 3

assentamentos rurais em Corumbaacute MS

38

Caracterizar por PAGE as amostras

Correlacionar a presenccedila do viacuterus com a sintomatologia da gastroenterite viral

Contribuir para o estudo da Rotavirose Bovina

5 MATERIAL E MEacuteTODOS

51 Amostras fecais bovinas

Para realizaccedilatildeo dos experimentos foram utilizadas 83 amostras fecais de bovinos

na faixa etaacuteria de 5 dias a 6 meses sendo 21 amostras provenientes de animais

com quadro cliacutenico de diarreacuteia e 62 amostras oriundas de bovinos sem sinais e

sintomas cliacutenicos Essas amostras foram coletadas em 3 assentamentos rurais no

municiacutepio de CorumbaacuteMS na regiatildeo pantaneira no ano de 2007 e enviadas sob

resfriamento ao Laboratoacuterio de Microrganismos Intracelulares Departamento de

Microbiologia UFMGICB para o diagnoacutestico laboratorial de rotavirose

52 Extraccedilatildeo de RNA

O RNA foi extraiacutedo do material fecal pelo meacutetodo fenolclorofoacutermio segundo

Herring et al (1982) com algumas modificaccedilotildees introduzidas por Pereira et al

(1985) Brevemente as amostras fecais foram pesadas e preparada uma

suspensatildeo agrave 20 (pv) em TERV (tampatildeo de estabilizaccedilatildeo de rotavirus - Tris-HCl

50 mM CaCl2 13 mM pH 74) sendo as mesmas adicionadas de pequenas

peacuterolas de vidro em tubos plaacutesticos cocircnicos e submetidas a trecircs ciclos de agitaccedilatildeo

em aparelho tipo vortex para melhor emulsificaccedilatildeo do material e liberaccedilatildeo de

eventuais partiacuteculas virais ao sobrenadante fecal Os tubos foram entatildeo

centrifugados por 10 minutos a baixa rotaccedilatildeo (900g) e apoacutes o sobrendamente foi

cuidadosamente vertido em novo tubo e estocados a- 20ordmC ateacute o momento do uso

Para a extraccedilatildeo do RNA propriamente dita uma aliacutequota de 500L foi adicionada

39

microtubo cocircnico plaacutestico e acrescida de 100 L de tampatildeo de lise (SDS 02 em

PBS) e incubada em banho maria por 15 minutos a 55ordmC Logo acresceu-se 500

L de soluccedilatildeo fenolclorofoacutermioaacutelcool isoamiacutelico (proporccedilatildeo 25241) e

procederam-se 3 ciclos de homogeneizaccedilatildeo por raacutepida centrifugaccedilatildeo seguida de

incubaccedilatildeo a 37ordm C por 10 minutos A soluccedilatildeo foi centrifugada a 10000g por 10

minutos para separaccedilatildeo da fase aquosa Esta foi retirada com micropipeta

cuidadosamente e transferida para um novo microtubo de polietileno tipo

eppendorf Posteriormente foi acrescentado na fase aquosa 500 L de

clorofoacutermio sendo estaacute submetida a centrifugaccedilatildeo a 10 000g por 5 minutos

Recolheu-se a fase superior da amostra e transferiu para um novo microtubo de

polietileno tipo eppendorf Logo adicionou-se 40 L de uma soluccedilatildeo 3M de

acetato de soacutedio (pH 52) e aacutelcool etiacutelico resfriado a 20 ordmC na proporccedilatildeo de 2x o

volume Finalmente a amostra foi submetida ao resfriamento a ndash 20ordmC por 16-18

h para a precipitaccedilatildeo do aacutecido nucleacuteico

53 Caracterizaccedilatildeo das amostras (PAGE)

As amostras foram entatildeo centrifugadas por 20 minutos a 10000g e sobre o

sedimento formado adicionou-se diretamente 50 μl de tampatildeo de amostra (TRISndash

HCL 625 mM pH 68 ureacuteia 5M β ndash mercaptoetanol 5 SDS 3 e 001 de

Azul de Bromofenol) sendo essas incubadas por 15 minutos a 56ordmC Os RNA

foram separados por fracionamento eletroforeacutetico em gel de poliacrilamida a 7

(acrilamidabisacrilamida na proporccedilatildeo 3008) utilizando um sistema descontiacutenuo

de pH (LAEMMLI 1970) em tampatildeo Tris-glicina (Tris base 25 mM pH 86 glicina

02 mM) por 4 hora a 100V Em todos os geacuteis de testagem foi utilizada uma

amostra padratildeo de rotavirus bovino (amostra Lincoln ndash ATCC VR452) Esta

amostra foi anteriormente expandida em monocamadas de ceacutelulas MA-104 e o

sobredante (apoacutes 03 ciclos de congelamentodescongelamento apoacutes visualizaccedilatildeo

40

de efeito citopaacutetico) foi estocado a -20oC ateacute o momento da extraccedilatildeo de RNA

como em 42

54 Coloraccedilatildeo do RNA pela prata

O processo de coloraccedilatildeo com nitrato de prata foi realizado de acordo com Herring

et al (1982) Brevemente o gel foi fixado por 1 hora em soluccedilatildeo fixadora A (10

etanol e 05 aacutecido aceacutetico) e tratado por 5 minutos em soluccedilatildeo fixadora B (10

etanol) Logo o gel foi transferido para uma cuba com soluccedilatildeo de prata por cinco

minutos em cacircmara escura Para a revelaccedilatildeo foi utilizado uma soluccedilatildeo a 3

NaOH e 05 formaldeiacutedo sendo esse processo interrompido com soluccedilatildeo

fixadora A apoacutes a visualizaccedilatildeo das bandas

55 Interpretaccedilatildeo dos resultados

Consideram-se positivas as amostras que apresentaram perfil eletroforeacutetico

semelhante ao padratildeo de rotaviacuterus bovino grupo A ndash amostra Lincoln

6 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

O Mato Grosso do Sul eacute o estado que concentra o maior nuacutemero de municiacutepios

criadores de gado do Brasil ao todo cinco municiacutepios Destaca-se em primeiro

lugar o municiacutepio de Corumbaacute com aproximadamente 2 milhotildees de cabeccedilas de

gado (IBGE2004) Neste municiacutepio a pecuaacuteria eacute desenvolvida de forma intensiva

extensiva e em assentamentos rurais os quais adotam principalmente a criaccedilatildeo

de gado como meio de subsistecircncia Os assentamentos apresentam um quadro

de grande precariedade nas instalaccedilotildees em geral logo neste ambiente haacute maior

possibilidade de disseminaccedilatildeo de doenccedilas advindas tambeacutem da proximidade

41

entre homem e animal Desta forma a veiculaccedilatildeo de infecccedilotildees como a rotavirose

pode ocorrer causando grandes danos agrave populaccedilatildeo local e aos animais (IBGE

2004)

A rotavirose bovina eacute uma doenccedila preocupante quando relacionada agrave criaccedilatildeo de

gado O quadro cliacutenico possui raacutepida evoluccedilatildeo debilitando o animal podendo levar

a morte Desta forma haacute grandes perdas econocircmicas que se referem a gastos

com medicamentos perda de peso do animal em crescimento profilaxia e ateacute

mesmo perda do animal (KANEENE HURD 1990)

Vista a importacircncia da entidade cliacutenica da gastroenterite o presente estudo

examinou a soroprevalecircncia do rotavirus em bovinos de diferentes assentamentos

rurais situados no municiacutepio de Corumbaacute MS

Embora o rotavirus bovino tenha ampla distribuiccedilatildeo descrita nos rebanhos

brasileiros nenhuma das 83 amostras testadas nos 03 assentamentos rurais

estudados apresentou positividade considerando-se ainda amostras provenientes

de animais com ou sem diarreacuteia

A figura abaixo eacute representativa de uma seacuterie de experimentos realizados

Ressalta-se que esta teacutecnica eacute de domiacutenio do Laboratoacuterio onde foi desenvolvido

este trabalho onde jaacute foram anteriormente desenvolvidos outros estudos com

rotavirus e outros membros da famiacutelia Reoviridae

42

Embora jaacute tenha sido relatada no Mato Grosso do Sul prevalecircncia para o rotavirus

esta eacute a primeira avaliaccedilatildeo descrita para rotavirus nestes assentamentos rurais

Alfieri e colaboradores realizaram um estudo longitudinal no rebanho de quatro

regiotildees geograacuteficas do Brasil sul sudeste centro-oeste e norte no ano de 1998-

2002 A partir da anaacutelise eletroforeacutetica em gel de poliacrilamida detectaram uma

prevalecircncia de 194 de rotavirus em animais com quadro cliacutenico de diarreacuteia e

22 em animais sadios sendo que a maior prevalecircncia da infecccedilatildeo foi detectada

em animais jovens No estado do Mato Grosso do Sul foi detectada alta

prevalecircncia da infecccedilatildeo pelos rotavirus 327 das amostras estudadas (ALFIERI

et al 2006)

1 2 3 3

Figura 9 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) ndash gel corado pela prata 1 Rotavirus padratildeo bovino ndash amostra ATCC VR 542 ndash amostra Lincoln 2 e 3 ndash amostras cliacutenicas testadas ndash negativas S de 1-11 = segmento gecircnico

S1

S2

S4 S3

S5

S11

S6

S7 S8 S9

S10

43

A teacutecnica de PAGE possui grande sensibilidade detectando pequenas

quantidades de rotaviacuterus nas amostras fecais possui ainda a vantagem de facilitar

o estudo da epidemiologia molecular de acordo com os eletroferotipos

(LINHARES et al 2005) e tendo ainda a capacidade de detectar quaisquer

amostras inclusive as do ldquogrupo natildeo Ardquo Embora tivesse sido de grande

importacircncia a testagem destas amostras por outro teste para comparaccedilatildeo (por

exemplo ELISA para rotavirus A o que pode ser ainda realizado num futuro

proacuteximo uma vez que as amostras encontram-se ainda adequadamente

estocadas) acreditamos que anaacutelise por PAGE poderia ter detectado o agente se

alguma das amostras estudadas estivesse realmente infectada inclusive porque

dentre as 83 amostras testadas 21 eram provenientes de animais com diarreacuteia e a

faixa etaacuteria coletada abrangeu animais de 5 dias a 6 meses com a maioria das

amostras coletadas com animais da idade em que mundialmente se descreve a

ocorrecircncia do Rotavirus

7 CONCLUSAtildeO

Nos assentamentos rurais do municiacutepio de Corumbaacute MS estudados nenhuma

amostra fecal testada foi positiva para Rotavirus mesmo nas fezes de animais

com diarreacuteia cliacutenica Visto que a prevalecircncia desta infecccedilatildeo eacute alta no Brasil e no

estado do Mato Grosso do Sul outras teacutecnicas deveratildeo ser realizadas para

confirmar a ausecircncia de rotavirose bovina nestes assentamentos

44

8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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2

Avaliaccedilatildeo da soroprevalecircncia do rotavirus bovino em rebanhos dos assentamentos rurais de CorumbaacuteMS

Belo Horizonte

Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas

2009

Monografia apresentada ao curso de Poacutes- Graduaccedilatildeo em Microbiologia do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenccedilatildeo do grau de Especialista em Microbiologia Orientadora Dra Edel Figueiredo Barbosa Stancioli Co-orientadora MSc Camila Pacheco Silveira Martins

3

AGRADECIMENTOS















passamos juntas








4

RESUMO















de fezes

5

ABSTRACT













6





17



19


rotavirus 24






7


bd - bidestilada








mM - milimolar





Electrophoresis)




pmol - picomol











8





= por cento

degC= graus Celsius


Kg= quilograma

M= molar

mg= miligrama

mL= mililitro

pv= pesovolume

vv= volumevolume


9

SUMAacuteRIO


2 HISTOacuteRICO 12





34 Sorotipos 20





39 Tratamento 28






311 Profilaxia 33

312 Vacinas 34


10

4 OBJETIVOS 37










7 CONCLUSAtildeO 43


11


























12






Corumbaacute MS

2 HISTOacuteRICO


















13
























(MATTHEWS 1979)

14














1991) (Figura 1)

15











16




(Figura 2)


























17









18












(figura 3)




19





























20















34 Sorotipos














21


















1996)










22













2007)




AL2007)












23











24



























25


por rotavirus

Fonte


ml




SZYFRES 1986)







26


























27










MATSON et al 1993)

















28














viacuterus



2007)

39 TRATAMENTO









29
















30










31

















32

























et al 2005)

33













311 PROFILAXIA










34

312 VACINAS



















KUROKI et aI 1997)







35



























36









37

















4 OBJETIVOS

41 OBJETIVO GERAL



Corumbaacute MS




38

























39



























40


como em 42





















41



2004)

















42










et al 2006)

1 2 3 3


S1

S2

S4 S3

S5

S11

S6

S7 S8 S9

S10

43















7 CONCLUSAtildeO






44



45


46



47


48


49




50


51


52


3

AGRADECIMENTOS















passamos juntas








4

RESUMO















de fezes

5

ABSTRACT













6





17



19


rotavirus 24






7


bd - bidestilada








mM - milimolar





Electrophoresis)




pmol - picomol











8





= por cento

degC= graus Celsius


Kg= quilograma

M= molar

mg= miligrama

mL= mililitro

pv= pesovolume

vv= volumevolume


9

SUMAacuteRIO


2 HISTOacuteRICO 12





34 Sorotipos 20





39 Tratamento 28






311 Profilaxia 33

312 Vacinas 34


10

4 OBJETIVOS 37










7 CONCLUSAtildeO 43


11


























12






Corumbaacute MS

2 HISTOacuteRICO


















13
























(MATTHEWS 1979)

14














1991) (Figura 1)

15











16




(Figura 2)


























17









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(figura 3)




19





























20















34 Sorotipos














21


















1996)










22













2007)




AL2007)












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24



























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por rotavirus

Fonte


ml




SZYFRES 1986)







26


























27










MATSON et al 1993)

















28














viacuterus



2007)

39 TRATAMENTO









29
















30










31

















32

























et al 2005)

33













311 PROFILAXIA










34

312 VACINAS



















KUROKI et aI 1997)







35



























36









37

















4 OBJETIVOS

41 OBJETIVO GERAL



Corumbaacute MS




38

























39



























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como em 42





















41



2004)

















42










et al 2006)

1 2 3 3


S1

S2

S4 S3

S5

S11

S6

S7 S8 S9

S10

43















7 CONCLUSAtildeO






44



45


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50


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4

RESUMO















de fezes

5

ABSTRACT













6





17



19


rotavirus 24






7


bd - bidestilada








mM - milimolar





Electrophoresis)




pmol - picomol











8





= por cento

degC= graus Celsius


Kg= quilograma

M= molar

mg= miligrama

mL= mililitro

pv= pesovolume

vv= volumevolume


9

SUMAacuteRIO


2 HISTOacuteRICO 12





34 Sorotipos 20





39 Tratamento 28






311 Profilaxia 33

312 Vacinas 34


10

4 OBJETIVOS 37










7 CONCLUSAtildeO 43


11


























12






Corumbaacute MS

2 HISTOacuteRICO


















13
























(MATTHEWS 1979)

14














1991) (Figura 1)

15











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(Figura 2)


























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19





























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34 Sorotipos














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1996)










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2007)




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por rotavirus

Fonte


ml




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26


























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MATSON et al 1993)

















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2007)

39 TRATAMENTO









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et al 2005)

33













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34

312 VACINAS



















KUROKI et aI 1997)







35



























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4 OBJETIVOS

41 OBJETIVO GERAL



Corumbaacute MS




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como em 42





















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42










et al 2006)

1 2 3 3


S1

S2

S4 S3

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7 CONCLUSAtildeO






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ABSTRACT













6





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rotavirus 24






7


bd - bidestilada








mM - milimolar





Electrophoresis)




pmol - picomol











8





= por cento

degC= graus Celsius


Kg= quilograma

M= molar

mg= miligrama

mL= mililitro

pv= pesovolume

vv= volumevolume


9

SUMAacuteRIO


2 HISTOacuteRICO 12





34 Sorotipos 20





39 Tratamento 28






311 Profilaxia 33

312 Vacinas 34


10

4 OBJETIVOS 37










7 CONCLUSAtildeO 43


11


























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Corumbaacute MS

2 HISTOacuteRICO


















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(MATTHEWS 1979)

14














1991) (Figura 1)

15











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(Figura 2)


























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34 Sorotipos














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2007)




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ml




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26


























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KUROKI et aI 1997)







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4 OBJETIVOS

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Corumbaacute MS




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como em 42





















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et al 2006)

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S4 S3

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7 CONCLUSAtildeO






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6





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rotavirus 24






7


bd - bidestilada








mM - milimolar





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pmol - picomol











8





= por cento

degC= graus Celsius


Kg= quilograma

M= molar

mg= miligrama

mL= mililitro

pv= pesovolume

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9

SUMAacuteRIO


2 HISTOacuteRICO 12





34 Sorotipos 20





39 Tratamento 28






311 Profilaxia 33

312 Vacinas 34


10

4 OBJETIVOS 37










7 CONCLUSAtildeO 43


11


























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Corumbaacute MS

2 HISTOacuteRICO


















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(MATTHEWS 1979)

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1991) (Figura 1)

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Corumbaacute MS




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7 CONCLUSAtildeO






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7


bd - bidestilada








mM - milimolar





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8





= por cento

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Kg= quilograma

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SUMAacuteRIO


2 HISTOacuteRICO 12





34 Sorotipos 20





39 Tratamento 28






311 Profilaxia 33

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4 OBJETIVOS 37










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Corumbaacute MS

2 HISTOacuteRICO


















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= por cento

degC= graus Celsius


Kg= quilograma

M= molar

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SUMAacuteRIO


2 HISTOacuteRICO 12





34 Sorotipos 20





39 Tratamento 28






311 Profilaxia 33

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4 OBJETIVOS 37










7 CONCLUSAtildeO 43


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Corumbaacute MS

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KUROKI et aI 1997)







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SUMAacuteRIO


2 HISTOacuteRICO 12





34 Sorotipos 20





39 Tratamento 28






311 Profilaxia 33

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Corumbaacute MS

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KUROKI et aI 1997)







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Avaliação da prevalência do rotavirus bovino em rebanhos ...€¦ · Rotavirus was assayed in fecal samples of calves with and without diarrhea collected during 2007. These animals