Validação de Métodos Bioanalíticos

Curso de Farmacologia Clínica

Universidade Mogi das Cruzes

Março 2004

Introdução

Nas últimas décadas, houve um aumento de métodos bio-analíticos aplicados à cromatografia para a determinação

qualita-tiva e quantitativa de fármacos, produtos acabados, matérias

pri-mas e amostras biológicas, em todas as fases do

desenvolvimen-to do fármaco desde a pesquisa até a realização de estudos

de bioequivalência. Assim, devido este aumento e a globalização

da economia, a adoção de um sistema de qualidade reconhecido universalmente aceito, é requisito fundamental.

Portanto, o entendimento do que constituí uma validação

de métodos cromatográficos, possibilita a garantia de um nível

satisfatório de qualidade na validação metodológica (Massart et

al., 1998; Swartz & Krull, 1998).

Desde o final dos anos 80, a importância da validação de métodos bioanalíticos e suas influências na avaliação e in- terpretação dos resultados, transformou-se em alvo de amplas discussões presentes em diversas Conferências tanto nos EUA quanto na Europa (Shan et al., 1991 e 1992; Dadgar, 1995; Cart-wright et al., 1991 e Arnoux & Morrison, 1992), e consequente-mente através destas, ter melhor direcionamento dos princípiosutilizados em bioanálises, tendo com base, principalmente o re-latório da Conferência de Washington de 1992, fornecendo ade-quadas diretrizes em relação aos parâmetros exigidos na valida-ção analítica.

Para se obter conclusões precisas em Estudos Biofarma-cêuticos, estas devem ser extraídas a partir de ensaios

bioanalíti-cos, onde as concentrações da droga ou seus metabólitos a ser investigados, devem ser exatos, precisos e seletivos (Jackson, J.A 1994), portanto, a correta avaliação dos Ensaios Biofarma-cêuticos só pode ser alcançada se a exatidão dos dados analíti-cos forem obtidos (Pachla et al.,1986). Além disso, essa

exatidão depende de critérios fundamentais empregados, não só em rela-ção à adequada interpretação desses resultados, como também na aplicação da confiabilidade e na totalidade do desempenho

do método bioanalitico.

Assim, pode-se destacar como principais critérios* :

Avaliação da droga e estabilidade do analito .

Seletividade/Especificidade.

Linearidade e modelo de calibração.

Precisão e Exatidão.

Sensibilidade, Limite de Quantificação e Detecção

Recuperação

* Pachla et al., 1986; Buick et al., 1990; MacDouglas e Crummett, 1980; Taylor, 1983;

Brooks e Weinfeld,1985; Dadgar e Smith, 1986; Inman et al., 1987 e Shan et al., 1987.

Para uma correta interpretação dos resultados, atualmente

têm-se proposto uma adequação no planejamento e na realiza-ção das fases clínica e analítica compreendidas em Estudos Bio-farmacêuticos. Protocolos clínicos normalmente são desenvolvi-dos utilizando elevado número de dados de informações pré-clínicas e clínicas, a fim de minimizar riscos que os pacientes poderão sofrer. Da mesma maneira, métodos analíticos são utilizados na quantificação de drogas e seus metabólitos em matrizes bioló-gicas, os quais deverão ser cuidadosamente desenvolvidos paraotimizar sua precisão e exatidão.

Modernos métodos bioanalíticos são fundamentados em

relação a uma variedade de técnicas físico-químicas e biológicas

a saber:

Métodos Químicos: Cromatografia (CG, HPLC) e uma variedade de processos utilizando métodos de espectrometria de massa (MS) tais como MS-MS e combinações de técnicas tais como CG-MS,LC-MS.

Métodos Biológicos: baseados em procedimentos de imunoensaios; em particular o Radioimunoensaio (RIA), imunoensaio de múltiplas enzimas (EMIT) e ensaio de imunoabsorção de enzimas ligadas (ELISA).

Métodos microbiológicos

“São capazes de fornecer precisão e exatidão em relação

aos resultados obtidos (Jackson, J.A 1994)”.

Tais métodos analíticos devem ser cuidadosamente pré-validados na fase de desenvolvimento e também validados du- rante o ensaio analítico, para garantir que os mesmos sejam

sa-tisfatoriamente realizados e que a confirmação das especifica-ções pré-determinadas seja encontrada; além disso, gerar

confia-bilidade nos resultados obtidos (Buick et al., 1990; Jackson, J.

A 1994; Shan et al., 1992). Para tanto, os mesmos envolvem procedimentos de de-terminação e quantificação de moléculas orgânicas com

amplaspropriedades físico-químicas, onde cada composto deve ser avaliado de acordo com as suas propriedades individuais e

tam-

bém levando em consideração a complexidade analítica e as

concentrações almejadas (Jackson, J. A 1994). A dimensão de como o método é validado, depende da

sua aplicação, número de amostras a ser investigadas e como se-

rá o seu desempenho em relação aos dados obtidos (Pachla et

al., 1986; Buick et al., 1990).

Diversos métodos analíticos podem ser necessários duran-

te o desenvolvimento de fármacos. Cada método deve ser vali-

dado quando é aplicado em diferentes estudos. Neste caso, quando possível, o número de

métodos aplica-dos deve ser mínimo para que as informações

sejam estatistica- mente avaliadas, quando compiladas em relação

às já existentes (Pachla et al., 1986).

Parte das técnicas analíticas podem exigir validação

adicional como:

Investigação das características do

complexo antígeno-anticorpo.

Determinação do pico de pureza

Avaliação do efeito de matrizes ou

conformação estrutural do composto.

Normalmente, cada ensaio deve possuir validação

cruzada empregando técnicas com detectores de alta especificidade,

por exemplo, o espectrômetro de absorção de massa (Buick et al., 1990). Em uso, o método analítico validado, o seu desempenho deve ser monitorado por padrões de controle de qualidade,

para garantir sua aplicabilidade. No caso de um método analítico

ser realizado em outro laboratório, o seu desempenho deve ser

mo-nitorado através de padrões de controle de qualidade

enviadospelo laboratório de origem.

Seleção e Desenvolvimento

Pode-se considerar que a etapa crítica no Estudo Biofarma-

cêutico é o desenvolvimento e validação de ensaios bioanalíti-cos, que consistem de experimentos realizados para encontrar condições necessárias para a quantificação do analito em ques-tão. Isto requer conhecimentos das propriedades físico-quími-cas da droga para que o processo de desenvolvimento seja ra- cional e individualizado. Assim, todos os critérios envolvidos no desenvolvimento analítico deverão ser registrados em

relató- rios de acompanhamento analítico (Snyder, 1988; Jackson, J.A 1994).

A realização de uma pesquisa bibliográfica é a primeira

etapa para a busca do método bioanalítico. Uma vez existindo o método, ele deverá ser testado quanto a sua

reprodutibilidade. Na inexistênciade um método bioanalítico para um deter-

minado fármaco, o centro analítico deve desenvolver um méto-do que responda satisfatóriamente ao estudo desejado.

A realização prévia das etapas necessárias no desenvolvi-mento do método analítico para os estudos de bioequivalência assegura ao centro analítico e ao seu contratante que os

serviços contratados serão realizados no tempo previsto e com a confia-bilidade necessária dos resultados, os quais serão avaliados

para fins de registro do medicamento em estudo.

Neste contexto pode-se afirmar que contrato e contratan-

te não perderão tempo e nem recursos financeiros adicionais se

por acaso os estudos realizados forem rejeitados no seu término

em função da inadequabilidade do método utilizado e das con-

dições de armazenamento não determinadas.

Para a aplicação deste fato, consideram-se os seguintes tipos de validação:

Validação TotalValidação total é de importância no

desenvolvimento e implementação de um método quando aplicado pela primeira vez ou quando for utilizado para determinar um novo analito nesta mesma condição analítica. Validação Parcial

Validações parciais são modificações do método já va-

lidado. Uma validação parcial pode compreender desde umapequena determinação de precisão/exatidão a até quase uma validação total.

Algumas mudanças típicas no método se enquadram

nesta categoria, mas não são limitadas a:

Transferências de método bioanalítico entre

laborató -

rios ou analistas;

Mudança na metodologia analítica (ex. mudança

no sistema de detecção);

Mudança no anticoagulante na coleta do fluido

bioló-

gico;

Mudança no processamento das amostras;

Mudança relevante na faixa de concentração;

Mudanças nos instrumentos e/ou software;

Volume de amostra limitado (ex. estudo

pediátrico)

Demonstração seletiva de um analito na

presença de medicações concomitantes.

No desenvolvimento de um método é necessário verifi-

car toda a metodologia de preparação da amostra, a qual envol-

ve os processos de extração, separação, purificação, identifica-

ção e quantificação do fármaco na matriz biológica. Para tanto,

podemos dizer que nesta fase, temos duas etapas distintas a sa-

ber:

1. Pré-Validação

Nesta fase consiste na realização de alguns ensaios preli-

minares visando à determinação dos seguintes parâmetros:

Exatidão, precisão e recuperação;

Linearidade e limites de quantificação;

seletividade.

2. Validação do Método

É a fase propriamente dita do desenvolvimento e estabe-

lecimento da metodologia com o objetivo de definir o ensaio

bioanalítico. Neste caso, a padronização de um método bio-

analítico típico inclui a determinação dos seguintes parâmetros

fundamentais a saber:

Especificidade e Seletividade;

Linearidade;

Precisão e Exatidão;

Sensibilidade, Limite de quantificação e

detecção;

Recuperação;

Estabilidade .

Robustez

3. Considerações – Materiais e Reagentes

O uso de substâncias químicas de elevado grau de pureza é

fundamental para assegurar a qualidade dos dados analíticos (GARFIELD, 1997; CROSBY et al., 1997). Assim como os rea- gentes químicos utilizados, o uso de SQR é determinante

para uma correta quantificação dos fármacos e/ou seus

metabólitos. Para uma melhor compreensão deste material, algumas

de-finições* são importantes:

* Publicações do National Institute of Standards and Technology(NIST) e a Farmacopéia

Americana (USP 25) e aceitos pela AOAC (Association of Officials AnalyticalChemists), conforme resumidas por GARFIELD (1997):

• Padrão primário: de acordo com SKOOG & WEST

(1979), uma substância deve apresentar as seguintes caracterís-

cas:

• deve apresentar elevado grau de pureza,

que deve ser determinado;

• deve ser estável;

• não deve ser higroscópico ou eflorescente;

• deve ser de fácil obtenção e

preferencialmente de baixo custo;

• deve apresentar um peso molecular

relativamente elevado.

• Material de referência certificado (MRC): material com

uma ou mais propriedades certificadas por procedimentos téc-

nicos válidos, acompanhados por ou rastreáveis a um certifica-

do ou outro tipo de documentação emitida por um órgão certi-

ficador.

• Material de referência padrão (MRP): material produzi-

do pelo NIST. MRPs são certificados em relação a propriedades

físico-químicas específicas e acompanhados de certificados que

reportam os resultados e indicam o uso do material.

• Padrões de referência USP (USP Reference Standards):

são fármacos purificados ou em elevado grau de pureza, distri-

buídos pela USP após recomendação do USP Reference Stan-

dards Committee. A seleção dos lotes de matérias-primas utili-

zada na preparação destes padrões estão baseadas nas caracterís-

ticas críticas de cada fármaco, analisados por três ou mais labo-

ratórios, entre os laboratórios da USP, FDA, acadêmicos ou

privados (USP 25).

• Padrão de trabalho ou padrão secundário: preparado a

partir da análise de um lote de material de pureza adequada con-

tra um do padrão ou SQR certificado, utilizando metodologia

oficial e mantendo o registro das análises. Quando este padrão

de trabalho é utilizado na análise de uma amostra, a SQR à par-

tir da qual ele foi preparado deve ser mencionada.

Além da USP, várias outras farmacopéias, como a Euro-

péia e a Britânica, produzem seus padrões. Estas instituições

chamam seus padrões de substâncias químicas dereferência (do inglês chemical referece substance,

ousimplesmente CRS).

Além destas, padrões químicos e biológicos de vários fármacostambém são distribuídos pela Organização

Mundial da Saúde (OMS).

Procedimento semelhante foi adotado, recentemente,

pelaFarmacopéia Brasileira (F.Bras.) no ano de 2000, o qual foi

no-meada a Comissão de Material de Referência (Port. 733,

DOU 201-E, de 18/10/00), que iniciou a produção das primeiras substâncias químicas de referência (SQR) da Farmacopéia

Brasi-leira. Conforme Resolução RDC nº 56, de 26 de fevereiro de2002, D.O. de 27/02/2002, após disponí-veis, as SQR da F. Bras. são as SQR oficiais em território nacional e devem ser

uti-lizadas obrigatóriamente em relação às demais

anteriormentecitadas.

I. Substâncias químicas de referência (SQR)

O grau de pureza das substâncias químicas utilizadas co-

mo referência nos estudos analíticos pode afetar a qualidade dos

resultados. O termo SQR refere-se aos padrões do fármaco em

estudo e seu(s) metabólito(s), quando for o caso. São substân-

cias de elevado grau de pureza, devidamente certificadas. Po-

dem ser de dois tipos:

• SQR disponível comercialmente: sempre que disponíveis,deverão ser utilizadas SQRs da Farmacopéia Brasileira ou

aque-las fornecidas por outras instituições/empresas reconhecidasnacional ou internacionalmente, desde que possibilitem seu rastreamento.

• SQR não disponível comercialmente: deve ser obtida a partir de substâncias de grau farmacêutico, acompanhado dorespectivo certificado de análise do lote e em quantidade sufi-ciente para a produção de um padrão de trabalho que será

uti-lizado nos estudos como referência. Este padrão de trabalho somente poderá ser produzido por um Laboratório Analítico Autorizado (LAA), que deverá manter os registros analíticos.

Existem aqui duas possibilidades para desenvolver o roteiro

de análises para quantificar a matéria-prima como padrão de

trabalho:

Existência de monografia farmacopéica disponível: nes-

te caso o LAA deverá realizar todos os ensaios previstos na mo

nografia e emitir um certificado de análise, sendo o teor obtido

no ensaio de doseamento o valor de pureza adotado para o

padrão de trabalho;

Obs.: Caso a monografia não esteja disponível na última edição

da Farmacopéia Brasileira, utilizar preferencialmente as edições

mais recentes das farmacopéias Européia, Britânica, Americana

ou Portarias do INMETRO.

Não existência de monografia farmacopéica: serão admi-

tidos estudos com substâncias químicas desde que comprovado

sua certificação.

• Laboratório analítico autorizado (LAA): LAA são os labo-

ratórios REBLAS e Centros Analíticos de Bioequivalência, des-

de que apresentem capacidade técnica comprovada para o de-

senvolvimento da metodologia analítica indicada.

II. Metabólitos

No caso de metabólitos, o centro analítico deverá com-provar, através de certificado de análise do fornecedor ou

en-saios realizados no próprio centro, que estes apresentam

um grau de pureza definido e adequado para ser utilizado como padrão de trabalho.

III. Padrão Interno

Os padrões internos utilizados devem apresentar grau analítico (p.a.) ou superior, de maneira que não interfiram

na análise.

Recomendações:

As SQRs, bem como os metabólitos e padrão interno devem ser armazenados conforme instruções do

distribuidor. Normalmente, devem ser armazenados em local fresco,

ao abrigo da luz e com baixa umidade, sempre em frascos bemvedados.

No ato do recebimento deve ser aberta uma cadeia de cus-

tódia para cada frasco recebido, na qual se controla o uso da

SQR por meio de registro de massa utilizada para cada finali-

dade, com visto de quem utilizou. Junto à cadeia de custódiadevem ser guardados os certificados de análise das

substâncias Deve ser registrado também o fim dado à massa que so-brou da SQR após o vencimento do prazo de validade.

IV. Reagentes e solventes

Os reagentes e os solventes utilizados nos estudos não devem interferir nos resultados. Isto deve ser verificado

através de procedimentos adequados. Devem ser estabelecidos

proce-dimentos de controle de fornecedores de maneira a

assegurarque solventes e reagentes adquiridos tenham a qualidade

dese- jada. Recomenda-se que os fornecedores apresentem

certifica-dos analíticos, assim como evidências documentadas para as-segurar a confiabilidade dos mesmos.

As áreas de estocagem de substâncias, reagentes, solven-

tes e soluções devem ser adequadas.

• Água grau cromatográfico: deve ter qualidade compatível

com o uso em HPLC. Pode ser:

• Deionizada

• Destilada

• Bi-destilada

• Ultra-pura

A pureza da água deve ser comprovada através de testes

adequados.

V. Vidraria

A medida precisa de volume é tão importante em muitos métodos analíticos como é a medida de massa. Para tanto, é preciso considerar alguns pontos imprescindíveis para a

medi-ção exata de um determinado volume como manutenção dosinstrumentos de medição, qualidade dos instrumentos e

calibra-ção periódica. As marcas de volume são feitas pelos fabrican- tes com os equipamentos volumétricos bem limpos.

Um nível de limpeza análogo deve ser mantido no labo-ratório se estas marcas forem usadas com confiança.

Somente superfícies de vidro limpas sustentam um filme uniforme de líquido. Poeira ou óleo rompe este filme. Portanto, a

existência de rupturas no filme é uma indicação de uma

superfície .suja..

O volume ocupado por dada massa de líquido varia com a temperatura, assim como varia também o recipiente no qual

está colocado o líquido, durante a medida. Entretanto, a maioria

dos equipamentos de medida de volume é feita de vidro, o qual fe-lizmente tem pequeno coeficiente de expansão.

Conseqüentemente, as variações no volume em função da temperatura de um recipiente de vidro não precisam ser consi-deradas em trabalhos em química analítica. As medidas

volumé-tricas devem tomar como referência alguma temperatura pa-drão; este ponto de referência é geralmente 20°C. O

coeficiente de expansão para líquidos orgânicos pode requerer correções para diferenças de temperatura de 1°C ou até menos, o que

tor-na extremamente importante o controle de temperatura am-ambiente dos laboratórios.

De uma maneira geral, os procedimentos analíticos são con-duzidos a uma temperatura que varia entre 15 e 25oC. (British Pharmacopoeia, 2000).

A vidraria volumétrica pode ser calibrada individualmente pelo INMETRO, ou laboratório certificado pelo INMETRO.

Porém, vidraria .Classe A. satisfaz os padrões internacionais estabelecidos pela International Organisation for Standardiza-tion (British Pharmacopoeia, 2000; GARFIELD,1997;USP 25).

O laboratório deve verificar periodicamente os volumes dis- pensados pela vidraria volumétrica, utilizando para isso a

massada água. Para as pipetas, deve também utilizar a massa da

águaprocedendo cinco amostragem para cada volume dispensado (USP2002).

A exatidão da vidraria .Classe A. é a seguinte:

V. Balanças

• Balanças (de acordo com Port. 236, de

22 de dez de 1994, do Inmetro)

• Pesos padrão (de acordo com Port. 233,

de 22 de dez de 1994, do Inmetro)

As balanças analíticas devem estar instaladas em local

adequado, niveladas, livres de correntes de ar, em bancada ex-

clusiva para as mesmas e estável. Sempre que possível em sala

com temperatura controlada.

A balança deve ser imediatamente limpa após cada uso. Deve

haver um programa de manutenção e conservação da balança, que inclua calibrações periódicas (no mínimo, anualmente),

com todas as informações registradas em um livro de registros.

Para as balanças analíticas utilizadas em laboratório (Classe I), o valor da divisão real de verificação (d) deve ser de 0,1 mg ou inferior. (Port. 236, de 22 de dez de 1994, do Inmetro).

A carga mínima (min) da balança não deve ser inferior a 100

x d.Ex.: Balança analítica com capacidade para 200 g e

sensibilidade de 0,1 mg.

min = 100 x 0,1 = 10,0 mg

Porém, de acordo com a USP 25 (2002), a incerteza da pesa-

gem (erro sistemático + randômico) não deve ser superior a

0,1% da massa pesada.No caso de balanças eletrônicas que não possuam sistema de

auto-calibração, a aferição deve ser feita diariamente, no início

do trabalho, e os registros adequadamente armazenados. Os

Pesos utilizados devem ser re-certificados anualmente.

VI. Equipamentos com temperatura controlada

Refrigerador e freezer deverão ter suas temperaturas veri-

ficadas diariamente e registradas no livro de uso. Deve haver um termômetro de máxima e mínima, sendo que a temperatura máxima e mínima do período deverá ser anotada. O local mais adequado para colocar os termômetros é na parte central inter-na do equipamento. Caso a leitura da temperatura seja feita

por pares térmicos, estes devem ser calibrados anualmente junto aRBC. Deve haver um POP para refrigerador/freezer descreven-do o uso, manutenção, limpeza e descontaminação.

Em caso de equipamentos que façam registros automáti-cos de temperatura, estes devem permitir uma verificação

diária da temperatura e os dados impressos ou anotados serão

armaze-nados para controle.

VII. Tubos de amostragem e análise

Podem ser de polipropileno ou polietileno de alta densi-

dade e não devem ser reaproveitados. Deve se evitar o uso de

tubos de vidro, que podem quebrar durante o armazenamento

ou transporte. Ao trocar fornecedor e/ou tipo de material, rea-

lizar teste de recuperação e branco para verificar se não existe

interferência do material no resultado das análises.

Protocolo do Ensaio Bioanalítico

Uma vez que o método bioanalítico foi desenvolvido e total-mente validado, um manual de procedimentos operacionais pa-dronizados (POPs) para o mesmo deve ser documentado.

Portanto, todas as análises do método em questão devem ser submetidas conforme procedimentos do respectivo POP.

Alterações podem afetar significativamente resultados finais como por exemplo, a substituição por um outro tipo de coluna, uma mudança significativa no comprimento de onda durante asanálises e ou mudança no procedimento de extração, requer,

no mínimo, revalidação parcial do método analítico.

“A dimensão da revalidação do método depende de

fatores que podem influenciar nos resultados e, portanto,

cabe ao bioanalista avaliar a melhor conduta para a sua

realização (Buick et al., 1990)”.

As amostras biológicas dos voluntários a serem investigadas são processadas e totalmente “randomizadas” e pode estar com- preendidas em uma única lista ou em série de listas analíticas, conforme a necessidade do fluxo de trabalho. Assim, desde que o objetivo do estudo seja comparar concentrações das amostras analíticas da droga teste em relação a droga referência, é

impor-tante que a análise de amostra biológica de um voluntário

esteja compreendida em uma única corrida analítica com a finalidadede minimizar efeitos da variabilidade do inter-ensaio (Dighe e Adams, 1991). Geralmente, amostras biológicas são processadas individualmente ou em duplicata, sendo esta última, a maneira mais correta durante a realização dos ensaios por

cromatografia.

Normalmente, uma lista analítica é constituída por lote de amostras de padrões de calibração, amostras analíticas a

serem determinadas e amostras de padrões de controle de qualidade, onde estes devem estar dispostos adequadamente em

intervalos com o objetivo de monitorar o desempenho do ensaio. De cin-co a oito pontos de calibração, não incluindo amostras zero, em duplicata têm sido recomendado (Shan et al., 1992;

Jackson, J.A 1994) para Estudos Biofarmacêuticos. Além disso, o in-tervalo de concentrações deve ser bem amplo, e apresente umadistribuição homogênea para as diferentes concentrações

nomi-nais com intuito de caracterizar adequadamente curva de cali-bração.

Os critérios de aceitabilidade de lista analítica tendo em

base resultados obtidos a partir da curva de calibração e amostras dos diferentes controles de qualidade, devem ser previamente estabelecidos. Sugere-se que quatro dos seis pontos da curva de calibração estejam em torno de 20% em relação aos seus valores de concentração nominal, e que dois pontos não satisfatórios tenham concentrações diferentes de suas concentrações reais para que a lista seja considerada aceitável (Buick et al., 1990). Entretanto, têm sido propostos outros critérios de aceitabilidade que empregam diferentes tratamentos estatísticos para a precisão e exatidão como por exemplo, realização de one-way ANOVA (Karnes et al., 1991; Causey et al,. 1990).

Parâmetros da Validação Bioanalítica

1. Especificidade/Seletividade

Os termos especificidade e seletividade são muitas vezes

permutáveis quando empregados. A especificidade de um método é definida quando o mesmo produz uma única resposta analítica para um

único analito.

Já a seletividade é definida como a habilidade de uma

técnica analítica em distinguir e quantificar, ou não, uma droga

em relação a outras resposta de diferentes componentes presen-

tes nos fluidos biológicos.

Assim, uma vez que as técnicas cromatográficas produ- zam respostas que possam ser distinguidas das demais

resultan-tes dos diferentes interferentes presentes na matriz biológica; otermo seletivo pode ser amplamente empregado como parâme-tro, na avaliação da validação dos métodos bioanalíticos

(Karnes et al., 1991; Dadgar e Brunett, 1995).

Diversos interferentes podem surgir durante o desen-volvimento de um método analítico, sendo de duas origens dis-tintas:• Endógenos: compreende um amplo número de compostos orgânicos de alto e baixo peso molecular (hormônios, lipídeos, proteínas, etc.), metabólitos de fármacos, precursores, produtos de degradação do analito, co-administração de fármacos e vita-minas.

• Exógenos: impurezas presentes nos reagentes empregados no processamento das amostras analíticas, componentes utiliza-dos na manufatura dos recipientes de acondicionamento e ou uma incompleta lavagem dos mesmos (Buick et al., 1990;Dadgar et al., 1995).

Para a avaliação do teste de especificidade/seletividade, recomenda-se a utilização de no mínimo seis fontes de amostras de matriz biológica branco obtida sob controladas condições em relação ao tempo de coleta, ingestão de alimentos e outros fatores intrínsecos presentes nos protocolos dos Estudos Bio-farmacêuticos. Contudo, não deverá apresentar nenhuma inter-ferência significativa nos tempos de retenção tanto do analitoquanto do seu padrão interno (Shan et al., 1992; ISO/DIS 5725-1 - 5725-3, 1994).

Critérios de aceitabilidade para o teste de interferência

são amplamente empregados em análises cromatográficas. Es-

tudos sugerem que qualquer interferente deverá possuir um pi-

co ou uma área cromatografada menor que 20% em relação à

concentração nominal do LOQ (Causey et al., 1995; Doing et al.,

1990 e Dadgar et al., 1995).

2. Linearidade

O relatório final da International Conference of Har-

monization – ICH (Guideline for Validation of Analytical Pro-

cedure Methodology, 1996) determina que a linearidade de um

procedimento analítico é considerada como a habilidade de se

obter resultados diretamente proporcionais à concentração do

analito na amostra (Comission of European Communities –

Comittee for Proprietary Medicinal Products 111/5626/94 final

draft, 1994; Buick et al., 1990).

A avaliação da curva de calibração, requer o emprego de no

mínimo quatro níveis de concentrações nominais, porém, estu-

dos (Massart et al., 1998) recomendam o uso de 5 a 8 determina-

ções que correspondem ao intervalo entre o valor superior e in-

ferior da substância em exame, que atendam aos requisitos de

precisão, exatidão e linearidade (Pennickx et al., 1996; Shan et al.,

1992; Hill et al., 1992; Metha, 1898 e Hartmann et al., 1998). Quatro fatores devem ser empregados no desenvolvimento

da curva de calibração:

• Precisão e exatidão menor ou igual a 15% nas determinações

nominais da curva de calibração, exceto para as concentrações

do LOQ

• Precisão e exatidão menor ou igual a 20% nas determinações

nominais do LOQ

• Pelo menos quatro das seis concentrações nominais devem

estar de acordo com critérios acima mencionados, incluindo os

pontos do LOQ e os pontos de calibração de menor concentra-

ção

• Valor de coeficiente de correlação linear ou igual ou maior

que 0.95

3. Precisão

É definida como o grau de repetibilidade ou de concordân-cia entre os resultados de análises individuais, quando o

proce-dimento analítico é aplicado em diversas vezes em uma mesma amostra analítica, em idênticas condições experimentais

(Swartz e Krull 1998; Buick et al., 1990; Causon, R. 1997e Brittain, 1998). Além disso, é expressa como a porcentagem do coefi-ciente de variação (C.V) ou o desvio padrão relativo da média geométrica dos valores das replicatas de cada determinação nominal, a saber: 

Precisão =% CV = (dp/média) x 100 dp = nc2- (c)2 : n (n-1)Onde:CV = coeficiente de variaçãodp = desvio padrãon = número de dadosc= concentração calculada

De acordo com a ICH de 1996 e o relatório final da ISO (International Organization for Standardization, 1990/1991), a precisão pode ser medida em três diferentes níveis (Swartz e Kull ,1998; Hartmann et al., 1994):• Repetibilidade (Precisão inter-ensaio): a qual avalia a pre-cisão da metodologia durante uma corrida analítica (Buick et al.,1990). Também é definida como a habilidade de repetições de uma metodologia empregada nas mesmas condições labora-toriais, por exemplo, da utilização do mesmo corpo de analistas,dos mesmos equipamentos e dos mesmos reagentes analíticos em um curto intervalo de tempo, considerando a realização do ensaio analítico em um único dia (Hartmann et al., 1994; Causon, R. 1997; Shan et al., 1992 e ISO/Dis 5725-1 – 5725-3 final draft ,1990/1991).

Neste caso, autores sugerem que esta precisão intra-ensaio poderá ser determinada através de no mínimo de 5 á

10 determinações em replicata para cada nível de concentrações nominais pré-estabelecidas das amostras de controle de

qualida-de. Assim, emprega-se três níveis de concentração: baixo,

quepode ser o LOQ; médio e alto, que estejam compreendidos nointervalo de limite especificado do procedimento analítico(Metha, 1989; Swartz e Krull 1998; Hartmann et al., 1998 e

FDA – Guideline for Industry / Bioanalytical Method Validation

final draft ,1998 e 2001).

• Reprodutibilidade (Precisão inter-ensaio): demonstra o grau de variabilidade da precisão do método analítico em dife- rentes intervalos de tempo da análise (Buick et al.,1990).

Também é definida como a habilidade de repetições da mesma metodologia analítica aplicada sob diferentes condições laboratoriais como, por exemplo, mudanças de analistas, reagen-tes e equipamentos em subsequentes ocasiões que podem com-preender várias semanas ou até meses (Shan et al., 1992; USPXX 1990; Brooks, 1985; Hartmann et al, 1994 e Buick et al., 1990).

Além disso, a precisão inter-ensaio é realizada de maneira similar que a precisão intra-ensaio, porém é determinada através da análises de no mínimo em 10 dias distintos (Metha, 1989), onde os resultados obtidos são interpretados através de um coe- ficiente de variação para cada nível de concentração nominal pré- estabelecidas das amostras de controle de qualidade.

Para a validação de metodologias bioanalíticas aplicadas em

Estudos Biofarmacêuticos, estudos determinam que os valores

de aceitabilidade para a precisão intra e inter-ensaio possuem

um coeficiente de variação menor ou igual a 15%, para todos os

níveis de concentração das amostras de controle de qualidade,

exceto para o LOQ , onde este não deve ser superior a 20% (FDA – Guideline for Industry / Bioanalytical Method

Valida-tion final draft 1998 e 2001; Shan et al., 1992 e 2000 e

Causon, R. 1997).

4. Exatidão

Organizações Internacionais, como a ISO aborda em suas definições tanto para precisão como para a exatidão, a

ocorrên-cia de diferentes erros experimentais tais como: os erros “ran-domizados” ou aleatórios (conforme descrito anteriormente nadefinição da precisão), e erros sistemáticos.

A sistematização de erros de um método analítico é a dife-rença entre o valor médio (obtido do resultado de um número (n) de diferentes experimentos) e o valor nominal aceito como referência. Portanto, a exatidão é considerada como uma

defini-ção de uma constante ou um índice de erros sistemáticos

deno-minada de bias (Hartmann et al., 1994).

Além disso, esta também pode ser definida como o grau de

concordância entre os valores individuais encontrados em rela-

ção aos valores reais ou nominais (Causon, R. 1997; Swartz e

Krull 1998; Buick et al., 1990; Brittain, 1998 e Mehta, 1989).A melhor maneira de reportar a exatidão de um ensaio ana-

lítico é através da porcentagem do bias , calculado a saber:

 % BIAS = (V. experimentais- V. nominais) / V.

nominais x 100

Contudo, esta exatidão é determinada pelas análises em re-

plicata das amostras de controle de qualidade contendo concen-

trações pré-estabelecidas. Dessa forma, empregam no mínimo

três níveis de concentração nominal (baixo que pode ser o LOQ

médio e alto) que estejam compreendidas dentro do intervalo de

calibração especificado pela metodologia analítica utilizada(Mehta, 1989; Swartz e Krull, 1998; FDA – Guideline for In-dustry / Bioanalytical Method Validation final draft, 1998 e 2001 e Shan et al., 1992 e 2000).

Para a documentação da exatidão de um ensaio analítico,

autores e determinações presentes nos guias de Validação de Metodologia Bioanalítica, estabelecem o emprego de no

mínimo cinco replicatas para cada concentração nominal das

amostras de controle de qualidade (Shan et al.,1992 e 2000; FDA – Guideline for Industry / Bioanalytical Method Validation final draft, 1998 e 2001; Causon, R 1997 e Jackson, A. J 1994).

Normalmente os ensaios para a exatidão poderão se realiza-

dos em um único dia (exatidão intra-ensaio) e também em dias

diferentes (exatidão inter-ensaio) (Buick et al., 1990 e Shan et al,.

1992 e 2000).

Autores sugerem que os limites de aceitabilidade para exati-

dão intra e inter-ensaio devem possuir coeficiente de variação

menor ou igual a 15% para todos os níveis de concentração no-

minal, exceto para o LOQ, onde este não deve exceder a limite

maior que 20% ( USP XXII, 1990; Brooks, 1985; Causon, R.

1997; Shan et al., 1992 e 2000 e FDA – Guideline for Industry/

Bioanalytical Method Validation final draft, 1998 e 2001).

 

5. Sensibilidade, Limite de Detecção (LOD) e Limite de Quantificação (LOQ)

Sensibilidade e Limite de Detecção (LOD) são dois parâ-metros muito empregados na identificação da habilidade de

umatécnica analítica em detectar e quantificar traços de

compostos,das mais variadas propriedades químicas, em concentrações abaixo de 1mg/L em complexos químicos ou biológicos (Mehta, A.C 1989 e Miller, J.N 1982).

A metodologia analítica é dito sensível quando pequenas mudanças nos padrões de calibração podem gerar grandes va- riações na resposta do instrumento analítico. Dessa maneira, conclui-se que a sensibilidade do ensaio analítico é definida

pela inclinação (“slope”) da curva de calibração (IUPAC, 1976;Causon, 1997 e Mehta, 1989).

Por outro lado, o Limite de Detecção representa a mais baixa concentração do composto de investigação que pode ser detec-tada em relação à amostra biológica branco com certo limite

de confiabilidade (Swartz e Krull, 1998; Metha, 1989; Mehta, A.C 1987; Mehta A.C 1989; Brittain, 1998 e BuicK et al.,1990).

De acordo com a International Union of Pure and Applied Chemistry - IUPAC, o Limite de Detecção é estabelecido atra-vés de análises de soluções com concentrações conhecidas e

de-crescentes do analito até que o nível detectável seja 2 a 3

vezes superior ao ruído da linha de base cromatográfica (IUPAC, 1978; Rutledge e Garrick, 1989 e Bressolle , Bres J. e Moulin ,1990).

O Limite de Quantificação representa a mais baixa concen-tração de um composto de investigação que pode ser

mensura-do de acordo com os critérios de aceitabilidade para precisão

e exatidão através de um ensaio analítico (Swartz e Krull, 1998; Causon, R. 1997 e Buick et al., 1990).

Na avaliação da concentração do LOQ, pode-se utilizar a ra-

zão 5:1 entre o sinal e o ruído da linha de base cromatográfica

no tempo de retenção do analito, ou seja, deverá obter uma tí-pica resposta do instrumento que seja cinco vezes maior que qualquer interferência na amostra branco no tempo de

retenção do composto de interesse.

Para a determinação do LOQ, normalmente é utilizado uma

série de análises de amostras analíticas em replicata consideran-

do de 5 a 6 determinações para cada nível de concentração pré-

estabelecida das amostras de controle de qualidade do LOQ (Shan et al.,1992 e 2000; Jackson, A.J 1994 e Causon,

R.1997).Os critérios de aceitabilidade para a precisão e a exatidão do

LOQ recomendam que o coeficiente de variação não seja maior

que 20% em relação à concentração nominal (Shan et al., 1992 e

2000; Jackson, A.J 1994 e Dadgar et al., 1995).

6. Recuperação

Os testes para a avaliação da recuperação são particular-mente aplicados em diferentes etapas do ensaio da

metodologia analítica. Porém, são normalmente realizados durante a fase inicial do desenvolvimento analítico para determinar uma me-lhora da eficiência dos procedimentos de extração nas

amostras biológicas, além disso, podem ser considerados como um indi-cativo da robustez do método analítico (Mehta, 1989 e Buick et al., 1990). Contudo, têm por finalidade verificar possíveis

perdas durante o tratamento das amostras biológicas, como por exem-plo, da utilização de um líquido extrator (Mehta, 1989).

A recuperação pode ser definida como uma medida percen-tual da eficiência dos procedimentos extrativos de um método analítico dentro de um limite de variação de aceitabilidade

(FDA– Guideline for Industry / Bioanalytical Method Validation final draft,1998 e 2001).

Normalmente, os experimentos para a avaliação da recupera-ção são realizados através da contaminação de três níveis

(baixo, médio e alto) de concentração nominal do composto analíticonas amostras biológicas branco. Sugere-se no mínimo o empre-go de cinco replicatas para cada concentração, onde estas deve-rão estar compreendidas em intervalo de calibração

especificado pela metodologia analítica (Mehta, 1989; Causon, R. 1997 e FDA – Guideline for Industry / Bioanalytical Method Valida-tion final draft ,1998 e 2001).

Existem várias formas utilizadas na determinação da recupe-

ração do ensaio analítico. A maneira mais usual para a quantifi-

cação da recuperação é através da comparação da resposta da resultante do analito (pico ou área cromatografada) das amos-tras analíticas em replicata, previamente tratadas em relação

as mesmas em idênticas concentrações preparadas em fase

móvel, correspondendo 100% da recuperação (Jackson, J.A 1994; Taylor, J.K 1987; Causon, R. 1997; Buick et al., 1990; Mehta, 1989; Brooks, 1987 e Dadgar et al., 1995).

A recuperação de um analito não precisa ser 100%, mas a quantidade de analito recuperado e do padrão interno deve

ser consistente, precisa e reprodutível, ou seja ter valores dentrodo limite de aceitabilidade para precisão e exatidão..

7. Estabilidade

A Resolução . RDC Nº 84 . de 19 de março de 2002, estabeleceu quais os tipos de estabilidade em fluidos

biológicos que devem ser realizados na fase pré-estudo de

bioequivalência visando a validação do método para fins do estudo

propriamen-te dito. Neste sentido, os estudos de estabilidade foram

classifi-cados em:

• curta duração;

• média duração;

• longa duração;

• de soluções-padrão;

I. Estabilidade de curta duração

• Congelamento e descongelamento

A estabilidade do analito deve ser determinada após 3 ci-clos de congelamento e descongelamento.No mínimo 3 alíquo-tas a cada concentração (alta e baixa) devendo ser estocado a cada temperatura pretendida por 24 horas e descongelada

sem auxílio a temperatura ambiente. Quando completamente des-congelada, as amostras devem ser re-congeladas por 12 a 24 horas sob as mesmas condições. Os ciclos de congelamento e descongelamento devem ser repetidos por 3 vezes e

analisados no terceiro ciclo. Se um fármaco é instável à temperatura ambiente, por exemplo, as amostras de estabilidade devem ser congeladas a . 20 ou . 70ºC durante 3 ciclos de congelamento

edescongelamento.

• Condições de análise

Três (03) alíquotas de cada concentração (alta e baixa) devem ser descongeladas a temperatura ambiente e deixadas nesta

tem-peratura durante o tempo máximo da análise do lote. A estabi-lidade das amostras processadas, incluindo o tempo de residên-cia no auto-injetor, deve ser determinada. Deve ser demonstra-do que os fármacos permanecem intactos se deixados por várias horas à temperatura ambiente na matriz biológica. Certos fár-macos, por exemplo, captopril, AAS, etc., sofrem mudanças imediatas, degradação em matrizes biológicas. Em tais casos, aditivos apropriados e/ou agentes derivatizantes podem ser adicionados.

II. Estabilidade de média duração

A estabilidade de média duração deve ser determinada pelo armazenamento de no mínimo cinco alíquotas de cada concentração ( alta, média e baixa) na temperatura de -20°C .

As amostras para este estudo devem ser analisadas nos tempo zero, um, dois quatro, oito e dezesseis dias de

armazena-mento. Os dados devem ser tratados com a utilização da

equa-ção de .Arrhenius. Para cálculo da constante de velocidade de reação e do tempo de armazenamento na temperatura

estudada. Com os dados de estabilidade obtida e viáveis com o

tempo analítico, pode-se iniciar a internação ou o estudo sobre

os indivíduos.

III. Estabilidade de longa duração

O tempo de estocagem num estudo de estabilidade de longa duração deve exceder o tempo entre a data da primeira coleta das amostras e a data da análise da última amostra. A es-tabilidade de longa duração deve ser determinada pela estoca-gem de no mínimo 3 alíquotas de cada concentração (alta, mé-dia e baixa) sob as mesmas condições das amostras de estudo.

Normalmente, é realizada em 03 temperaturas de estoca-gem,4, -20 e .70ºC. O volume das amostras deve ser suficiente para as análises no mínimo em 03 tempos diferentes (FDA, 1997). As concentrações médias das determinações de todas as concentrações utilizadas devem ser comparadas com as médias obtidas das análises das amostras recém-preparadas para os es-tudos de estabilidade de longa duração, ou seja, no tempo zero.

IV. Soluções-padrão

A estabilidade do fármaco e padrão interno devem serassegurados no tempo necessário para análise de todo o lote

das amostras, incluindo possíveis interrupções acidentais. Dados da literatura ou testes de laboratório devem ser conduzidos para determinar se o fármaco puro ou em mistura com metabólitos e padrão interno dissolvidos num sistema de solvente são estáveissob as condições de ensaios, especificamente em relação aos fa-tores físicos, tais como:calor, umidade, luz e exposição ao ar.

A estabilidade da solução estoque, contendo o fármaco e padrão interno, deve ser avaliada à temperatura ambiente por no mínimo 6 horas. Se a solução estoque e padrão interno são refrigeradas ou congeladas por um período relevante, a estabili-dade deve ser documentada.

Após completar o tempo de estocagem desejado, a estabili-

dade deve ser testada em comparação com a solução preparada

recentemente.

8. Robustez

A robustez é um parâmetro que refere se a reprodutibili-dade de uma metodologia analítica sob diferentes condições ex-perimentais (Shan et al., 1992; Jackson, A.J 1994; Swartz e

Krull, 1998). Normalmente, a robustez pode ser avaliada experimen-talmente através de alterações das condições experimentais do ensaio analítico (Youden & Steiner, 1975 ; Swartz e

Krull,1998).É desejável que um procedimento analítico seja capaz de

resistir frente às alterações das condições experimentais. Cons-tatando a suscetibilidade nos parâmetros analíticos (precisão, exatidão, linearidade, etc.), estes deverão ser adequadamente controlados ou será necessário à inclusão de novas precauções na metodologia (Shan et al., 1992; Swartz e Krull, 1998 e Jack-son A.J 1994).

Para minimizar os efeitos da variabilidade no método analí-

tico, é necessário investigar e documentar influências durante o

processo de validação analítica, as quais podemos citar (Dadgar

et al.,1995; Shan et al., 1992 ; Jackson, A.J 1994):

• Mudanças das condições da temperatura

ambiente

• Alterações do corpo de analista

• Mudanças de equipamentos

• Tempo de extração

• Variações típicas em cromatografia líquida como:

Influência da variação de pH da fase móvel;

Influência da variação da composição da

fase móvel;

Diferentes colunas cromatográficas;

Temperatura;

Velocidade de fluxo

Portanto, a avaliação destas influências acima citadas, forne-

cerá indicativo da habilidade da metodologia de se manter está-

vel frente às alterações das condições analíticas (Dadgar et al.,

1995).De acordo com a ICH, a robustez deve ser considerada na

fase de desenvolvimento e será convenientemente monitorada durante o ensaio analítico, observando possíveis mudanças na linearidade e nos resultados das amostras de controle de

quali-dade (Jackson, A.J 1994; Dadgar et al., 1995; Swartz e Krull, 1998 e Shan et al., 1992).