validação_metodologia_foco em espectrometria de massas.pdf

111111

Validação de métodos com abordagem em espectrometria de massas

Heliara Nascimento Laboratório ThoMSon

[email protected]

22

ApresentaçãoPalestrante

Profa. Heliara Lopes Nascimento

• Formada em Farmácia Industrial e Bioquímica , é também bacharel em Biologia pela Universidade de São Paulo. Possui mestrado em Química Orgânica e é PHD em Química Analítica voltada a área ambiental.

Auditora líder há 15 anos nas normas ISO 9001:2000;TS 16949; ISO 14001 . Experiência de 11 anos em Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IPT) onde atuou no desenvolvimento de metodologias e novos processos e 20 anos em Indústria (Oxiteno), onde coordenou a implantação do sistema de qualidade em P&D e validação de cerca de 1300 métodos . Atuou por 13 anos no gerenciamento de laboratórios e atua como especialista na área de química analítica.

Participa do Programa Brasileiro de Metrologia através da Coordenação da Comissão de metrologia química do Sinproquim. ( Sindicato Patronal das Industrias Químicas do Estado de SP).

Professora convidada da UNESP Araraquara no curso de pós graduação de metrologia em química.

Diretora técnica do laboratório da USP – United States Pharmacopeia. 2008

Pesquisadora Colaboradora na UNICAMP – Instituto de Quimica – Laboratório Thomson.

33

Quais são as suas expectativas para

este curso?

Levantamento de Expectativas

• Seu nome

• Histórico da Carreira

4

Porque validar?

Conhecer seu processo significa ... ....conhecer sua variação

Qualquer PROCESSO, instrumento , aparelho ou padrão por mais perfeito que pareça ser, estará sempre sujeito a variações.

Se fizermos uma série de repetições os resultados das medições nem sempre são iguais em todos os casos. Portanto estima-se uma INCERTEZA para todo e qualquer instrumento/equipamento de medição.

5

As medidas não confiáveis podem induzir a conclusões errôneas

PRECISÃO = REPETITIVIDADE E REPRODUTIBILIDADE

66

Validação

• Ato documentado que atesta que qualquer procedimento, processo, equipamento, material, operação ou sistema realmente conduza aos resultados esperados (RDC 17).

77

Método quando aplicado pela primeira vez ouquando for utilizado para determinar um novo analito na mesma condição analítica.

Validação Total

Validações parciais são modificações do método já validado. Uma validação parcial pode

compreender desde uma pequena determinação de precisão/exatidão a até quase uma validação total.

Validação Parcial

8

Conhecimento das técnicas utilizadas, suas vantagens e limitações

Adequação do Sistema Analitico ou System suitability (IQ, OQ,PQ)

Amostragem –planejar – estou com as amostras adequadas ??

Planejamento experimental

Utilização das ferramentas Estatisticas adequadas

Qual a pergunta que

se quer responder ??

Qual a LEGISLAÇÃO???

O que pode causar a variação?

E ... por onde começo??

99

Conhecimento das técnicas

utilizadas, suas vantagens e limitações Componentes do Espectrômetro

de Massas

Ionização da amostra“Fonte”

Analisadores de MassasMS e MS/MS

Introduçãode amostra

Vácuo

Detector

GC/LC MSTécnicas de ionização sob alto vácuo: EI, CITécnicas de ionização sob Pressão Atmosférica: ESI, APCI, APPI.

1010

Fatores a serem considerados nodesenvolvimento de método de LC/MS

Modo de Ionização.

Coluna.

•Diâmetro e Fluxo

•Bombeamento

Fase Móvel. Pode afetar tanto a cromatografia como o processo de ionização.

1111

ESI x APCI x APPI

1212

Considerações sobrea fase móvel

• pH

• Solventes e aditivos

• Composição: Compromisso entre uma boa ionização e uma boa separação cromatográfica.

1313

Consideraçõessobre pH

• Modo de ionização Positivo- Análise de compostos básicosBaixos valores de pH com adição de um ácido. EX: Ácido Fórmico ou acético

• Modo de ionização Negativo- Análise de compostos ácidos Aumento de pH com adição de base. EX: Hidróxido de amônio/solução de amônia.

1414

Solventes e aditivosutilizados

Solventes

Água

Acetonitrila

Metanol

Isopropanol

Aditivos

Ácido Acético

Ácido Fórmico

Hidróxido de Amônia

Acetato de Amônia*

Formato de amônia*

(* = Podem ser utilizados como tampão. As concentrações não devem exceder

10 mM.)

1515

Solventes & Aditivos quepodem ser utilizados com cuidado

• TFA - Usado para análise de proteínas e peptídeos. – Causa supressão em ESI(+) em concentrações maiores que 0.1%.– Causa muita supressão em ESI(-).

• TEA– Aumento de sensibilidade do sinal de compostos pouco básicos em

ESI(-).– Ioniza rapidamente com geração da molécula protonada

[M + H]+ em m/z 102.– Supressão de sinais de compostos menos básicos em ESI(+).

• THF– 100% THF = explosivo!!– Não deve ser usado com APCI quando se utiliza ar como gás de

nebulização.

1616

6.00 7.00 8.00 9.00Time6

100

%

3652.19e6

7.52

6.00 7.00 8.00 9.00Time0

100

%

3652.30e6

7.56

Sem aditivosSomente águae acetonitrila

0.03%Ácido

fórmicoAdição de ácidofórmico causa a

diminuição do pH dafase móvel e aumento

do sinal [M+H]+ emeletrospray positivo.

Efeito do Ácido Fórmico e TFA

1717

6.00 7.00 8.00 9.00Time0

100

%

Raylo_1_004 Sm (Mn, 2x3) F1365

2.30e6

7.56

8.00 10.00Time0

100

%

3652.30e6

9.24

0.03%TFA

6.00 7.00 8.00 9.00Time6

100

%

3652.19e6

7.52

Sem aditivosSomente águae acetonitrila

0.03%Ácido

fórmico

Efeito do Ácido Fórmico e TFA

1818

Solventes e tampõesnão utilizados

Solventes e tampõesnão utilizados

Sais não voláteis (fosfatos, boratos, citratos, etc.)

Detergentes (supressão iônica)

Ácidos inorgânicos (Sulfúrico, fosfórico, etc.)

Sais não voláteis (fosfatos, boratos, citratos, etc.)

Detergentes (supressão iônica)

Ácidos inorgânicos (Sulfúrico, fosfórico, etc.)

1919

Solventes não compatíveiscom tubulação de PEEK

Ataca o PEEK

HNO3 conc.

H2SO4 conc.

Dilata o PEEK(polyetheretherketone)

DMSO

THF

CH2Cl2

2020

Cone de extração 5V

Cone de amostra 70V

Hexapolo

In-Source CID: V no ConeIn-Source CID: V no Cone

Dissociação induzida por colisão ocorre antes da entrada no MS

2121

Etalon 550 pg/ul, ES , FS positif , CV variables

90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340m/z0

100

%

0

100

%

0

100

%

Etalon 10 220 (12.126) 3: Scan ES+ 2.81e4214.36

96.03

89.34

174.16103.44 131.73

110.23 125.55 145.55 163.16 205.39196.16186.21

241.40

279.43263.34 304.36 327.08 337.74 348.20

Etalon 10 221 (12.162) 2: Scan ES+ 4.19e4241.39

214.33

205.30155.4798.15 138.52113.54 174.02 196.20 223.16 282.41264.53249.44 291.95 303.39 330.71312.82 343.97

Etalon 10 221 (12.144) 1: Scan ES+ 3.82e4241.39

130.8197.28 108.28 151.06 223.14171.00 195.59183.04 205.32 234.36 282.41264.47253.29 292.58 310.62 325.69 345.85

20 V20 V

40 V40 V

60 V60 V

CianazinaCianazina

2222

Espectrometria de massassequencial

80 90 100 110 120 130 140 150 160m/z0

100

%

080_METHAMIDOPHOS 41 (0.752) Daughters of 142ES+ 6.37e594

125

112

110

142143

Quantificação

Confirmação 1

Confirmação 2

2323

Integração da Validação aos Sistemasde Qualidade;

2424

Integração da Validação aos Sistemas de Qualidade;

2525

Integração da Validação aos Sistemas de Qualidade

2626

AplicaçãoAplicação

Controle de QualidadeAlimentos, ambiental, hormolômica:

Matéria prima;ProcessoProduto finalResiduosContaminantes

Farmacêutica:Drug discoveryClinical trialsDrug production.

Adulteração: ForenseFalsificação ouDegradação

QUAIS OS LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DESEJADOS??

27

ISO 5725Commission

Decision 2002/657

Ciclo deCiclo de vida do vida do Método Analítico e requisitos de validação Método Analítico e requisitos de validação em cada etapa em cada etapa -- normas e normas e gguias aplicáveisuias aplicáveis

ASTM E 1488-96

Reportar Resultados

Estado da Arte X

AplicaçãoAMOSTRAGEM

NecessidadeDe Novo Método

LEGISLAÇÃO GUIAS DE VALIDAÇÃONiveis de açãoMRL

Testes Preliminares

PLANEJAMENTODescrição

do método ISO-78-2

Validação:FIGURAS DE

MERITOISO 11843Robustez

ASTM E 1169

CochranCochran

ACEITAÇÃO

ResultadosAceitos

CRITÉRIOSDE

ACEITAÇÃO

Comparar novas

Metodologias

ILS Proficiência

( E 1601 )

Comparaçãocom

Especificação

RequerOtimizaçãoMonitoramento

CorrelaçãoEntre situações/

Matriz

PesquisarCausas deVariação

Cartas de controle

Dixon

2828

Legislação para validaçãode metodologia

• Resolução Especifica - RE 899 – Guia para validação de métodos analiticos e

bioanaliticos

• FDA- 21 CFR PART 211 - CURRENT GOOD MANUFACTURING PRACTICE FOR

FINISHED PHARMACEUTICALS Subpart L-Validation 211.222

• Commission Decision 2002/657/EC – performance and interpretations of results

for analytical methods - veterinary residues

• European Directive 91/414/EEC – PLANT PROTECTION

• Food quality protection Act (FQPA) EUA

2929

Traçabilidade do métodoanalítico

OsOs MétodosMétodos dede análiseanálise devemdevem serser rastreáveisrastreáveis aa umum MétodoMétodoreferenciado,referenciado, nacionalnacional ouou internacionalmenteinternacionalmente..

FOODFOOD CODEXCODEX -- UnitedUnited StatesStates PharmacopeiaPharmacopeia

USPUSP –– UNITEDUNITED STATESSTATES PHARMACOPEIAPHARMACOPEIA

EPAEPA --

3030

Guias para Validação de Métodos• USP Chapter <1225>

– Validation of Compendial Methods

• ICH Guidelines

– Q2A, Text on Validation of Analytical procedures

(March 1995)

– Q2B, Validation of Analytical Procedures:

– Methodology (May 1997)

• FDA: 21 CFR PART 211 - CURRENT GOOD MANUFACTURING PRACTICE FOR

FINISHED PHARMACEUTICALS Subpart L-Validation 211.222 Method

validation

• EURACHEM - 1998 – guia para validação de métodos

EU: Guidelines for the validation of screening methods for residues of

veterinary medicines (initial validation and transfer)- Community reference

laboratories residues -2010

3131Fonte:http://www.saude.mg.gov.br/politicas_de_saude/visa/PAMVET.pdf

Legislação para validaçãode metodologia

32

ISO 5725Commission

Decision 2002/657


ASTM E 1488-96

Reportar Resultados

Estado da Arte X



LEGISLAÇÃOAPLICÁVEL

Niveis de açãoMRL

Testes Preliminares

PLANEJAMENTOGUIAS DE VALIDAÇÃO

Descriçãodo método ISO-78-2



ASTM E 1169

CochranCochran

ACEITAÇÃO

ResultadosAceitos

CRITÉRIOSDE

ACEITAÇÃO

Comparar novas

Metodologias

ILS Proficiência

( E 1601 )

Comparaçãocom

Especificação



Matriz


Cartas de controle

Dixon

3333

Técnicas de Amostragem

AMOSTRAGEMRetirada representativa de material para análise e

controle. É a primeira etapa do controle de qualidade e pode

representar uma grande parte do erro da análise, pois a amostra representará o lote.

O que deve ser amostrado?Como amostrar?Em que quantidade?

3434

Amostras legais- frequentemente a lei obriga o fabricante a amostrar produto acabado ou da matéria prima.

Normas- Boas práticas de Fabricação e Controle (RDC 17/2010) ou NBR ISO/IEC 17025/2005

Todo laboratório deve ter um plano e procedimento de amostragem.

(O que, como e quanto ?)

Legislação para casos específicos; ex Codex Alimentarius ,1993

3535

QUANTO?Existem várias fórmulas estatísticas

Observar o número de embalagens (N) antes de começar. Escolher as embalagens mais separadas, e limpar externamente.O número de volumes amostrados deve ser √N+1, se for menos que 5 volumes, amostrar todos. A quantidade de amostra deve ser suficiente para todos os testes a ser realizados e para guardar amostra de referência até 1 ano após o vencimento

3636

NÚMERO MINIMO DE AMOSTRAS

3737

Fatores interferentes no processo de amostragem:

– estratégia da amostragem: propriedades do material a ser analisado -ex: volatilidade, sensibilidade à luz, instabilidade térmica, reatividade química

– escolha do equipamento de amostragem - adequado

– embalagem para amostra - evitar contaminação cruzada.

– Amostras para fins legais, a amostra pode ser lacrada

– condição de armazenamento

Amostragem

3838

ISO 5725Commission

Decision 2002/657


ASTM E 1488-96

Reportar Resultados

Estado da Arte X




Niveis de açãoMRL

Testes Preliminares





ASTM E 1169

CochranCochran

ACEITAÇÃO

ResultadosAceitos

CRITÉRIOSDE

ACEITAÇÃO

Comparar novas

Metodologias

ILS Proficiência

( E 1601 )

Comparaçãocom

Especificação



Matriz


Cartas de controle

Dixon

3939

VALIDAÇÃO

Limite detecção

Limite de

decisão

Exatidãorecuperação

Precisão Seletividadeespecificidade

Aplicação/robustez

estabilidade

Métodos qualitativos

S + - - - + +

C + + - - + +

Métodos Quantitativos

S + - - + + +

C + + + + + +

S= screening methods C = confirmatory methods + = determinação obrigatória

Validação deve demonstrar que o método atende aos critérios aplicáveis para o uso pretendido.

Diferentes propósitos requerem diferentes categorias de métodos.

IMPORTANTE: REPLICATAS INDEPENDENTES E NÃO REPLICATAS DE LEITURAS OBJETIVO É CONHECER A VARIABILIDADE REAL E NÃO A VARIABILIDADE MINIMA EURACHEN;1998.

4040

Modos de Aquisição - QqQModos de Aquisição - QqQ

Full scan MS mode Single ion recording (SIR) Product ion scan Precursor ion scan Neutral loss scanMultiple reaction monitoring (MRM)

Fonte Detector

Q1 q2 Q3

4141

PARAMETROS ESSENCIAIS PARA VALIDAÇÃO DE MÉTODOS BIOANALITICOS

SELETIVIDADE

LINEARIDADE

PRECISÃO

LIMITE DE DETECÇÃO

LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO

FIGURAS DE MÉRITO OU PARÂMETROS DE DESEMPENHO

EXATIDÃO

EFEITO MATRIZ

ESTABILIDADE

ROBUSTEZ

4242

ICH/USP Validation Requirements & Parameters

• Specificity

• Linearity

• Range

• Accuracy

• Precision

– Repeatability

– Intermediate Precision

– Reproducibility

• Limit of Detection

• Limit of Quantitation

ICH

SpecificitySpecificity

Linearity and RangeLinearity and Range

AccuracyAccuracy

Precision Precision

Limit of DetectionLimit of Detection

Limit of Limit of QuantitationQuantitation

RobustnessRobustness

USPComission Decision2002/657/EC

• Specificity/seletividade•recovery•CC Detection capability• CCα decision limit•MRPL- minimumrequired performance limit• Precision• Aplicabilidade• Robustez• Estabilidade• Linearity (calibrationcurves)

4343

Objetivo / aplicação

Especificação / limites desejados

Levantamento do estado da arte: STN; Dialog; Infodisk

Existência de padrões e materiais de referência

Custo / beneficio

Testar especificidade, linearidade, faixa, exatidão e precisãovalidação

Meio Ambiente

5.4 Métodos de Ensaio5.4 Métodos de EnsaioEscolha do MétodoEscolha do Método

Requisitos para escolha de um método analítico

4444

Especificidade/ Seletividade

Capacidade do método em determinar o analito na presença dos componentes da matriz sem interferência na análise.

Grande Vantagem do LC-MS/MS!!

INEQUIVOCA !!!

PARAMETRO DEPENDENTE DA TÉCNICA E TAMBÉM SUJEITO AS VARIAÇÕES DE MATRIZES

EC 2002: Analisar em n>20 brancos substancias que possam estar presentes e verificar presença de interferentes na região de eluição do analito

4545

MS/MS (MRM) versus SIM

Time2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

%

0

100

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

%

0

100

MatrixStd203 MRM of 4 Channels ES+ 582.3 > 263.2

3.03e3

MatrixSIR002 SIR of 2 Channels ES+ 582.3

1.13e5

MRM

SIM

Streptomycin in HoneyNH2 NH

NH

OH

NH

NH NH2

O

OH

OH

O

OOHCH3

O O

NH

CH3 OH

OH

OH

Alta seletividade e especificidadeAlta sensibilidade S/RRedução de clean upde amostras

4646

LinearidadeCapacidade do método em demonstrar que os

resultados são proporcionais à concentração do analito.

Y=ax+b Mínimo 5 pontos para a curva analítica –R e Método dos mínimos quadrados

4747

Limite de detecção e quantificação

LD=Menor concentração que pode ser detectadaLD = DPa x 3

a Dpa= desvio padrão do brancoN=20 - EC2002N=10 - EurachemN=7 - INMETRO

y=ax+b

• DPa: desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de 3 curvas de construídas com concentrações do fármaco próximas ao limite de quantificação; a é a inclinação da curva.

LQ=Menor concentração que pode ser quantificadaLD = DPa x 10

a

4848

Limite de detecção e quantificação

Comprovar com analise de 10 amostras brancas fortificadas ao nivel de LD e LQ

4949

CC e CC

LD = Nivel de conc permitido ± +/- 1,64*DP

• Limite de decisão : limite no qual e acima do qual se pode concluir que uma amostra é não conforme com uma probabilidade de erro alfa.

• Erro alfa: probabilidade da amostra ensaiada ser conforme, apesar de ter obtido um resultado não-conforme.(falsa decisão não conforme)

Dpa= desvio padrão de n=20 amostras brancas

Limite de decisão : • Exemplo Aflatoxina B1 – limite máximo permitido = 2.00ng/Kg

• Resultado = 1.97± 0.03 = Maximo 2.03 ACEITO OU REJEITO ??

2.00 ± 0.03* 1.64 = 2.0492ACEITO!!

5050

CC e CC

• Capacidade de detecção: menor quantidade de uma substância que pode ser detectada, numa amostra, com uma probabilidade de erro beta .

• Erro beta: probabilidade da amostra ensaiada ser não conforme, apesar de ter obtido um resultado conforme.

CD = Limite de decisão calculado +/- 1,64*DP

5151

• Descreve o quanto a resposta muda com mudanças na concentração do analito

• Depende da inclinação da curva de calibração.

0123456789

10

1 2 3 4 5 6

Concentração

Sina

l Método (a)

Método (b)

Sensibilidade

θ 45º

52

5353

Exatidão = Trueness

• Determinada após estabelecer a linearidade e seletividade do método com MRC

• No mínimo, 9 (nove) determinações entre o intervalo linear do procedimento, ou seja:

• 3 (três) concentrações, baixa, média e alta• 3 (três) réplicas cada.

Exatidão = trueness e não acurácia segundo ISO 3534-1 e o Eurachem

EC2002= SEIS (6) REPLICATAS NAS CONC: 0.5 ; 1 E 1.5 DO LIMITE MAXIMO PERMITIDO

5454

CONCENTRAÇÃO FAIXA

<= 1 µg/kg - 50% a +20%

> 1 µg/kg a 10 µg/kg

-30% a +10%

>= 10 µg/kg -20% a +10%

CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO PARA RECUPERAÇÃO

Fonte: Freitas, A. 2008

5555

SISTEMA DE IDENTIFICAÇÃO PARA CONFIRMAÇÃO POR PONTOS

Fonte: CD 2002/657/EC

5656

Espectro de Massas: abundância isotópica

Pico do Carbono 13Pico do Carbono 13

Pico monoisotópicoPico monoisotópico

5757


Para se estimar o número decarbonos em uma molécula: dividira intensidade de A+1 por 1.1(abundância do Carbono 13 nanatureza).

Para se estimar o número decarbonos em uma molécula: dividira intensidade de A+1 por 1.1(abundância do Carbono 13 nanatureza).25%25%

25 / 1.1 = 23,7~ 23 átomos de carbonona molécula

25 / 1.1 = 23,7~ 23 átomos de carbonona molécula

5858


Br - CH315 uma

79Br-CH3 = 9481Br-CH3 = 96

Informações:

• Relação m/z• Presença dos isótopos• Diferença de massa entre os sinais

5959

Espectro de Massas: abundância isotópicaCloro Peso atômico = 35,453Mistura de 35Cl (75,77%) e 37Cl (24,23%)

CH3Cl

6060

40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60mass0

100

%

50.0

52.0

Padrão isotópico: CloroCloro 35 (75,77%) e Cloro 37 (24,23%)

CH3Cl

74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96mass0

100

%

84.0

86.0

87.9

CH2Cl2

108 110 112 114 116 118 120 122 124 126 128 130 132mass0

100

%

117.9119.9

121.9

123.9

CHCl3

145 150 155 160 1650

100

%

153.9

151.9

155.9

157.9

CCl4

6161

Ferramentas para obtenção Ferramentas para obtenção -- ISO 5725:ISO 5725:

ANOVA: Repetibilidade; Reprodutibilidade

Cartas de Controle

PRECISÃO PRECISÃO

Requisitos para escolha de um método analítico

6262

Precisão ISO 5725 – ANOVA•Precisão: dispersão dos resultadosRepetitividade (r)• r= Mesmo analista e mesma instrumentação. • Verificada com 9 determinações do intervalo linear• 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três)

réplicas cada ou mínimo de 6 determinações a 100% da concentração do teste

• EC2002= 6 REPLICAS em 0.5,1 e 1.5 do Limite Máximo Estabelecido – X, DP E CV

e Precisão Intermediária (R)Varia pelo menos um dos fatores –recomendado dias e analistas

6363

Precisão – Repetitividade e Precisão Intermediária

Fonte: Freitas, A. 2008

6464Fonte: Commission decision 2002/657/EC

Precisão de métodos quantitativos

concentração Reprodutibilidade CV(%)

1µg/Kg 45 Horwitz10 µg/Kg 32 Horwitz100 µg/Kg 23

1000 µg/Kg 16

O CV intra-laboratoriais deve estar dentro de 1/3 a 2/3 dos valores da reprodutibilidade.

equação de Horwitz:CV= 2 (1-0.5logC)

onde C é expresso como expoente de 10 ex: 1mg/g=10-3 então C=-3

CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO EC2002/657

6565Fonte: Commission decision 2002/657/EC

Intensidade relativa (%do pico

base)

EI-GC-MS (relative)

%

CI-GC-MS , GC-MS, LC-MS, LC-MSn

(relative) %>50 % +/- 10 +/- 20

>20% a 50% +/- 15 +/- 25

>10% a 20% +/- 20 +/- 30

<= 10% +/- 50 +/- 50

Máxima tolerância permitida para variação dasintensidades relativas de íons para técnicas de

espectrometria de massas.

6666

ROBUSTEZ –Fatores que devem ser considerados na determinação da robustez do método.

Preparo das Amostras · Estabilidade das soluções analíticas · Tempo de extração

Cromatografia Líquida

· Variação do pH da fase móvel · Variação na composição da fase móvel · Diferentes lotes ou fabricantes de colunas · Temperatura · Fluxo da fase móvel

Cromatografia Gasosa · Diferentes lotes ou fabricantes de colunas · Temperatura · Velocidade do gás de arraste

Espectrometria de massas

potencial de saída da cela de colisão

Modo de ionizaçãp

Voltagem do potencial do orificio ou cone

Voltagem do capilar

Janela de tempo de retenção e dwell time (tempo do ciclo do massas)JTR=media 10 brancos +/- 3*dp

Energia de fragmentação

6767

Como são os interferentes analíticos?

-Componentes da formulação, corantes, revestimento, etc;-Solventes, sais, reagentes usados durante o teste;-Produtos de degradação do ativo; (estabilidade do ativo)-Produtos de degradação do placebo;-Substâncias relacionadas; (conformidade química) -Impurezas

IMPORTANTE IMPORTANTE

6868

Estabilidade

Curta duração

Média duração

Longa duraçãoIniciar o Estudo

Compatível tempo

Compatível tempo

Não compatível tempo



Redefinir tempo de Estudo de Estocagem

69

ISO 5725Commission

Decision 2002/657


ASTM E 1488-96

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Estado da Arte X




Niveis de açãoMRL

Testes Preliminares





ASTM E 1169

CochranCochran

ACEITAÇÃO

ResultadosAceitos

CRITÉRIOSDE

ACEITAÇÃO

Comparar novas

Metodologias

ILS Proficiência

( E 1601 )

Comparaçãocom

Especificação



Matriz


Cartas de controle

Dixon

7070

• Outlier » valor discrepante dos demais.• Afetam exatidão e precisão do método

Teste de Teste de DixonDixon (ou teste Q)(ou teste Q)• Popular devido à simplicidade

• Estatística do teste:valor suspeito - valor mais próximo

maior valor - menor valor=D

DETECÇÃO DE OUTLIERS

Teste de Teste de GrubbsGrubbs• Recomendado pela ISO• Estatística do teste

Teste de Teste de CochranCochran• Testa se a variância de um conjunto de valores é outlier em relação às

variâncias de outros conjuntos• Estatística: C= (maior variância)/(soma das variâncias)

valor suspeito - médiadesvio padrãoG =

7171

Expressão do Resultado Final Expressão do Resultado Final

Cálculo da Incerteza na média Cálculo da Incerteza na média Onde : Onde :

UxUx = Incerteza na média= Incerteza na médiaSSTT = Desvio Padrão total = Desvio Padrão total n = número total de determinaçõesn = número total de determinaçõest (nt (n--1;0,025) = Variável de t de 1;0,025) = Variável de t de StudentStudent

nStU T

nx .025,0;1

Expressão do Expressão do Resultado Final Resultado Final

X U xResultado =

Onde : Onde :

n

xX

n

ii

1

7272

CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO

Os critérios para a adequação da variabilidade depende da porcentagem em relação a variabilidade do processo de produção

REGRA GERAL

Variação menor que 10% - MÉTODO MUITO ADEQUADO

Variação entre 10 e 30% - MÉTODO ADEQUADO

Variação maior que 30% - MÉTODO REQUER MELHORIAS – CUSTO/BENEFICIO

A precisão determinada em cada concentração não deve exceder 10% do coeficiente de variação (CV) exceto para o LLOQ que não deve exceder 20% do CV. Commisision Decision 2002/657/ECOu 15% pela ANVISA

7373

ISO 5725Commission

Decision 2002/657


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CochranCochran

ACEITAÇÃO

ResultadosAceitos

CRITÉRIOSDE

ACEITAÇÃO

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Metodologias

ILS Proficiência

( E 1601 )

Comparaçãocom

Especificação



Matriz


Cartas de controle

Dixon

7474

CÁLCULO DOS LIMITES DECONTROLE

Cartas de Controle

LSCX= X + A2R

LICX = X - A2R

LSCR = D4R

LICR = 0 (n = 6)

Ref: IMAN Ref: IMAN --19951995

Monitoramento Monitoramento

75

Precisão e IncertezaPrecisão e IncertezaVisão PontualVisão Pontual

CEP CEP -- Controle Estatístico de ProcessoControle Estatístico de Processo

Visão ContínuaVisão Contínua

ANOVAANOVA

Ref:Ponzetto 1996Ref:Ponzetto 1996

7676

ISO 5725Commission

Decision 2002/657


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CochranCochran

ACEITAÇÃO

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CRITÉRIOSDE

ACEITAÇÃO

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Metodologias

ILS Proficiência

( E 1601 )

Comparaçãocom

Especificação



Matriz


Cartas de controle

Dixon

77

“Chamar o especialista em estatística depois que o experimento foi feito pode ser o mesmo que pedir a ele para fazer um exame post-mortem. Talvez ele consiga dizer de que foi que o experimento morreu”.

R. A. Fisher

Estatística

7878

7979

8080

• Um modo utilizado de cálculo é

comparado com t6=2,447 . Como t é maior do que t6, rejeitamos Ho.

Devido a disponibilidade dos computadores, calcula-se a probabilidade de encontrar um valor maior ou igual a t=2,81. Esse é chamado valor-p e é igual a 0,031 (ou 3,1%). Então, a probabilidade de encontrar t=2,81 é menor do que 5% e Ho é rejeitada

81,21322,0

4,0

7350,0

0,206,19

ns

mt

8181

8282

Variâncias homogêneas

GL= n1+n2 – 2

8383

Fazer os cálculos, usando as equações do slide anterior.

Dados: t critico= 1,812 (NC 99%)

8484

8585

TESTES TESTES DE SIGNIFICÂNCIADE SIGNIFICÂNCIA

Cálculo de t Tipo 2, com variâncias diferentes:

2

22

1

21

21

ns

ns

xxtcalc

Ho :

= o menor entre n1-1 e n2-121 xx

8686

TESTES TESTES DE SIGNIFICÂNCIADE SIGNIFICÂNCIA

Cálculo de t Tipo 3:

dcalc s

ndt

= média das diferenças entre os pares de valores

sd = desvio padrão das diferenças entre os pares

d

Ho : = 0

= número de pares - 1

d

8787

Teste t pareado

Exemplo: Dois métodos A e B foram comparados para a determinação de concentrações de paracetamol de dez tabletes de lotes diferentes

A B d= diferença84,63 83,15 1,4884,38 83,72 0,6684,08 83,84 0,2484,41 84,2 0,2183,82 83,92 -0,183,55 84,16 -0,6183,92 84,02 -0,183,69 83,6 0,0984,06 84,13 -0,0784,03 84,24 -0,21

Média 84,06 83,9 0,16DP 0,338 0,338 0,57

Os métodos podem ser considerados iguais?

Calcule manualmente!!

8888

Teste t pareado

Exemplo: Dois métodos A e B foram comparados para a determinação de concentrações de paracetamol de dez tabletes de lotes diferentes

A B d= diferença84,63 83,15 1,4884,38 83,72 0,6684,08 83,84 0,2484,41 84,2 0,2183,82 83,92 -0,183,55 84,16 -0,6183,92 84,02 -0,183,69 83,6 0,0984,06 84,13 -0,0784,03 84,24 -0,21

Média 84,06 83,9 0,16DP 0,338 0,338 0,57

Teste-t: duas amostras em par para médias

A BMédia 84,06 83,90Variância 0,114 0,114Observações 10 10Correlação de Pearson -0,423Hipótese da diferença de média 0gl 9Stat t 0,882P(T<=t) uni-caudal 0,200t crítico uni-caudal 1,833P(T<=t) bi-caudal 0,401t crítico bi-caudal 2,262

8989

Precisão e IncertezaVisão Pontual

COMPARAÇÃO DE MAIS QUE 2 FATORES

ANOVAANOVA

Ref:Ponzetto 1996

9090

ANOVA

PARA QUE SERVE A ANOVA??

A Analise de variância ou ANOVA, embora exija o calculo de variâncias, na realidade compara médias de tratamento..

A comparação se faz por meio do teste F .

9191

ANOVA

PARA QUE SERVE A ANOVA??

A análise de variância é então uma extensão do teste t de Student que compara duas e só duas médias.No caso de apenas dois tratamentos pode-se usar tanto o teste t como a analise de variância.

O valor calculado de t é igual a raiz quadrada de F, calculado na análise de variância.

A ANOVA permite que o pesquisador compare qualquer numero de médias

9292

ANOVA

QUAL É A LÓGICA DA ANALISE DE VARIANCIA?? Ë mais fácil entender a lógica através de um exemplo:

Veja a tabela a seguir, onde as médias estão na última linha da tabela.

TRATAMENTOA B C D

25 31 22 3326 25 26 2920 28 28 3123 27 25 3421 24 29 2823 27 26 31

9393

ANOVA

QUAL É A LÓGICA DA ANALISE DE

VARIANCIA??

Dá para concluir observando os dados da tabela que os tratamentos A,B,C e D conduzem a medias diferentes?

Isto seria inferência , e para fazer inferência é preciso aplicar um teste estatístico.

A resposta das diferentes unidades a um mesmo tratamento varia ao acaso devido aos fatores, conhecidos e desconhecidos, que não foram controlados no experimentos.

9494

Procedimento para a análise de variância

(ANOVA)

Uma análise de variância só deve ser feita se forem satisfeitas algumas pressuposições :

os erros são variáveis aleatórias e independentes

A variância é constante

A distribuição dos erros é normal ou aproximadamente normal

Vamos aprender os cálculos da ANOVA ....

9595

Procedimento para a análise de variância (ANOVA)

As quantidades calculadas são apresentadas numa tabela de ANOVA:

Causa de variação

GL SQ QM F

Tratamentos

Resíduos

(k-1)

(n-k)

SQTr

SQR

QMTr

QMR

F

Total (n-1) SQT

Quando o valor calculado de F for maior que o valor critico, rejeite a hipótese das médias serem iguais.

9696

ANOVA – Exemplo da interpretação

Coeficiente de variação:

Para se ter idéia da dispersão( precisão) dos dados em relação a grandeza da média, o pesquisador deve dividir o desvio padrão pela média. Dados muito dispersos são pouco precisos, ou seja, quanto maior é a variância dos dados, menor é a precisão. Então, por definição, coeficiente de variação, que se indica por CV, é a razão entre o desvio padrão e a média geral

Na analise de variância, o desvio padrão é dado pela raiz quadrada do quadrado médio do resíduo, QMR.

Então CV = s/ Media no exemplo CV= RQ 4,693 /19,5 = 0,1087

Em geral se apresenta o CV em % CV= 10,9 %

9797

sr2= 4,693 e sR

2= (11,095-4,693)/5= 1,280

t(19)=2,093 ao nível de 5%

repê= 2,093 (2*4,693)= 6,412

repro= 2,093 [2.(4,693+ 1,280)]= 7,234

RESUMOGrupo Contagem Soma Média Variância

A 5 328,4 65,68 4,587B 5 326,4 65,28 2,607C 5 323,6 64,72 5,587D 5 340,5 68,10 5,990

ANOVAFonte da variação SQ gl MQ F valor-P F crítico

Entre grupos 33,29 3 11,095 2,364 0,109 3,24Dentro dos grupos 75,08 16 4,693

Total 108,37 19

9898

ANOVA Coeficiente de determinação:

Observe os resultados da tabela de análise de variância e entenda que:

• a soma de quadrados total (SQT) mede a “variação total”ou seja,a variação dos valores observados em torno da média geral.

•A soma de quadrados dos tratamentos mede “a variação devida aos tratamentos”

•A soma de quadrados de resíduo mede a “variação aleatória”.

9999

ANOVA Coeficiente de determinação:

Por definição, coeficiente de determinação, que se indica por R2 , é a razão entre a soma de quadrados de tratamentos e a soma de quadrados total.

R2= SQTr

SQT

Portanto R2 é uma medida da proporção da variação total explicada pela variação de tratamentos.

Como o valor de R2 varia entre 0 e 1, pode ser interpretado como uma porcentagem.

100100

ANOVA – Exemplo da interpretação

Causa de variação

GL SQ QM F P-valor

Tratamento 1 422,5 422,5 93,89 1,07E-05

Resíduo 8 36 4,5

Total 9 458,5

Tratamento

A B10 2511 2615 2813 2416 27

Ma= 13 Mb=26

R2=SQTr/SQT = 0,9215

Conclusão: 92,15% da variação é explicada pela variação de tratamento

101101

102

QuimiometriaQuimiometria : : PCAPCA

Ferramentas para estudo das Ferramentas para estudo das diferentes matrizes diferentes matrizes --

Caracterização das amostras e correlação com Caracterização das amostras e correlação com origemorigem

103103Campinas, 04 de novembro de 2011

Aplicações da Espectrometria de Massas em Aplicações da Espectrometria de Massas em Quantificação e Caracterização de Matrizes BiológicasQuantificação e Caracterização de Matrizes Biológicas

Aluna: Andréia de Melo PorcariOrientador: Marcos Nogueira Eberlin

Exame de QualificaçãoMestrado

EXEMPLOS DE APLICAÇÃO

Capítulo 1

Desenvolvimento e validação de métodos LC-MS/MS para determinação de cortisol em plasma e leite bovinos para estudo

de bem-estar animal

104104

Hipotálamo

CRH(corticotropin releasing hormone)

GlândulaPituitária

GlândulaAdrenal

ACTH(adrenocorticotropina)

Cortisol

-

-

+

+

Stress

Po r q u e C o r t i s o l ?

Rev Endocr Metab Disord., 2007, 8, 365

105105105

– Po r q u e C o r t i s o l ?

MANEJO AMBIENTE

STRESS

BEM-ESTAR

106106

– C o m o c o r t i s o l é d o s a d o ?

Cortisol362,5 g mol-1

11-deoxicortisol346,5 g mol-1 Corticosterona

346,5 g mol-1

Saliva Humana = Leite de Vaca

??

MÉTODO REFERENCIA : ELISA DESENVOLVIDO PARA SALIVA HUMANA

107107

C o m o c o r t i s o l é d o s a d o ?Por outro lado:

Espectrometria de Massas (MSEspectrometria de Massas (MS)

- Seletividade / Especificidade- Sensibilidade- Análises Múltiplas (vários analitos)-Confiabilidade Analítica

CromatografiaLíquida

APPI(Atmospheric

Pressure Photo Ionization)

MRM

Clin. Biochem., 2008, 41, 736; J. Pharm. Biomed. Anal., 2008, 48, 1174.Steroids, 2008, 73, 1345.

108108

Detecção do cor t i sol : A P P I

Gás secante

Capilar

EntradaHPLC

Gás nebulizante Bloco

aquecido

Lâmpada

Entradade dopante

hn

Mecanismo I (quando PI < hn)M + hn = M+.+e-

M+.+ S → [M+H]+ + [S-H]-.

Mecanismo II (quando PI > hn)D + hn = D+.+e-

D+. + D = [D-H]. + [D+H]+

M + [D+H]+ →D +[M+H]+

Seletividade

Eficiência de ionização (esteróides)

Menor supressão iônica

Rapid Commun. Mass Spectrom., 2003, 17, 2763; Introduction to Mass Spectrometry. Instruments, applications and strategies for Data Interpretation. 4th Ed, 2008, England. John Wiley & Sons Ltda.

109109

– Perguntas

• Perguntas veterinárias:

1. Cortisol em plasma e leite bovinos se correlacionam?

2. Ordenha mecanizada aumenta o nível de cortisol nas vacas?

J. Dairy Sci., 2011, 94, 4406

6 vacas

Início da ordenhaPlasma

Leite

Final da ordenhaPlasma

Leite

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

110110

• Perguntas veterinárias:

1. ELISA (kit de saliva humana) usado para dosar leite bovino

fornece os mesmos resultados que LC-MS/MS?

2. Mastite subclínica altera o nível de cortisol no leite?Mastite subclínica: inflamação de glândula mamária causada por infecção bacteriana. Células de defesa migram para a glândula mamária para combater a infecção, aumentando a contagem de células somáticas no leite (CC)

J. Dairy Sci., 2011, 94, 4406

28 vacas

mastite subclínica

28 vacasCOM

mastite subclínica

Grupo (+)28 vacas

mastite subclínica

28 vacasSEM

mastite subclínica

Grupo (-)

Leite Leite

ELISAKit de saliva humana

ELISAKit de saliva humana

LCLC--MS/MSMS/MS

111111

E x p e r i m e nta l – S i s t e m a L C - M S

5500 Q5500 Q--TrapTrap®®-- AB AB SciexSciexFonte: APPI (criptônio –10 ev)Dopante: Tolueno (100 mLmin-1)Modo: Positivo (MRM)Voltagem fonte: 830 VTemperatura: 350oCCurtain gas: 15 psi (N2)Gás nebulizante: 20 psi(N2)Gás auxiliar: 20 psi (N2)Gás de colisão: 9 u.a. (N2)

Mecanismo II (quando PI > hn)D + hn= D+.+e-

D+. + D = (D-H) + DH+

M + DH+ →D + MH+

Cortisol: m/z 363→327 e 363 → 121

Cortisol-9,11,12,12-d4 (Padrão Interno): m/z 367 → 331 e 367 → 121

Analyst, 1998, 123, 2649

112112

S i s t e m a L C - M SPlasmaPlasma

Zorbax Eclipse XDB- C18, 4,6 x 150 mm, 3,5mm

40 mL de injeção

LeiteLeitePFP (2)

4,6 x 150 mm, 5 mm20 mL de injeçãoTempo

(min)Fluxo

(mL min-1)% (v/v)

H2O% (v/v)MeOH

0.00 800 5.0 95.02.00 800 5.0 95.02.50 800 0.0 100.02.51 1200 0.0 100.08.00 1200 0.0 100.08.10 1200 5.0 95.011.50 1200 5.0 95.0

Tempo(min)

Fluxo(mL min-1)

% (v/v)H2O

% (v/v)MeOH

0.00 800 60.0 40.02.00 800 30.0 70.04.00 800 15.0 85.04.10 800 0.0 100.07.00 800 0.0 100.07.01 1200 0.0 100.08.00 1200 0.0 100.08.10 1200 60.0 40.0

10.50 800 60.0 40.0

HPLC Agilent 1200 Series

Injetor: 4oCAcetona: lavagem da agulhaForno: 40oC

113113

E x p e r i m e nta l – C r o m a t o g r a m a s T í p i c o s

0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2 3.6

1.0e4

5.0e4

1.0e5

1.5e5

2.0e5

1.92

Inte

nsid

ade

/ cp

s

Tempo / min

D4-Cortisol(m/z 367>331)

D4-Cortisol (m/z 367>121)

Cortisol (m/z 363>327)

Cortisol (m/z 363>121)

Método PlasmaSolução Fisiológica 6% BSA,

dopada com Cortisol (1,6 ng mL-1 ) e D4-cortisol (5,0 ng mL-1)

114114

– P r e p a r o d e A m o s t r a - P L A S M A

200 mL de plasma

500 mL de MTBE

Vortex (1 min)Centrífuga

(5min, 10 mil rpm)

Banho de GeloSeco + Etanol(congela fase

aquosa)

Faseorgânicarecolhida

Fase aquosadescongelada

500 mL de MTBE

Vortex (30 s)Centrífuga

(5min, 10 mil rpm)

Banho de GeloSeco + Etanol(congela fase

aquosa)

Fase orgânicarecolhida

Fase aquosadescartada

Fase orgânicarecombinada, seca em N2

e re-suspensa em 200 mLde fase móvel

Clin. Biochem.,2004, 37, 357.

115115

• Estudo da Faixa Linear 0,1 a 20,0 ng mL-1

Capacidade do método de fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração do analito

Va l i d a ç ã o d o s M é t o d o s

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Calibração para cortisol 363.1 > 327.3:y = 0.06104 x + 2.74607e-4(r = 0.99600) (ponderação: 1 / x2)

Concentração de cortisol / ng mL-1

Áre

a A

nalit

o /

Áre

a PI

Plasma

1161160.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2 3.6

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

1.92

1.742.60 2.77

2.871.67 2.913.08 3.28 3.55

Inte

nsid

ade

/ cp

s

Tempo / min

• Especificidade – Método PlasmaVa l i d a ç ã o d o s M é t o d o s

Critério: interferências branco < 20% LOQ

117117

• Limite Inferior de Quantificação (LIQ) –

Método PlasmaMenor quantidade de um analito numa amostra que pode ser determinada quantitativamente com precisão e exatidão aceitáveis

0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2 3.6

1.0e4

2.0e4

3.0e4

4.0e4

5.0e4

6.0e4

7.0e4

1.93

2.11

Inte

nsid

ade

/ cp

s

Tempo / min

Cortisol (0,1 ng mL-1) emsolução extraida (BSA 6%

em Soro fisiológico) e D4-cortisol (5 ng mL-1)

117

118118

• Limite Inferior de Quantificação (LIQ)Menor quantidade de um analito que, após dopagem, pudesse ser diferenciado da concentração endógena em uma amostra real, com precisão e exatidão aceitáveis


0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

1.0e4

2.0e4

3.0e4

3.8e4

Cortisol (0,15 ng mL-1 ) e D4-cortisol (5,0 ng mL-1 )

em MeOH

Inte

nsid

ade

/ cp

s

Tempo / min

6.0

S/N > 10

118

119119

• Faixa de Trabalho (concentração de cortisol)

• 0,1 ng mL-1

• 0,4 ng mL-1

• 0,8 ng mL-1

• 1,6 ng mL-1

• 3,2 ng mL-1

• 6,4 ng mL-1

• 12,8 ng mL-1


Plasma• 0,25 ng mL-1 -CQbaixo

• 4,8 ng mL-1-CQmédio

• 9,6 ng mL-1-CQalto

Padrão Interno:5 ng mL-1 deD4-cortisol

120120

• Efeito de MatrizVa l i d a ç ã o d o s M é t o d o s

Cortisol(ng mL-1)

Efeito de Matriz*(%)

Cortisol(ng mL-1)

Efeito de Matriz* (%)

0,25 9,1 + 0,50 0,15 2,2 + 0,18

4,8 5,4 + 0,13 1,0 -4,3 + 0,32

9,6 -5,5 + 0,18 5,0 4,8 + 0,41

Plasma Leite

100100

ABMatrizEfeito

* Média + I (N=5)

A= Área média do pico da solução padrão (N=5)B = Área média do pico da matriz não dopada reconstituída em solução padrão (N=5)

J. Liq. Chromatogr. & Rel. Tech., 2010, 33, 1067

121121

• Precisão intra- corrida e inter-corrida


Plasma

Cortisol(ng mL-1)(nominal)

Intra-corrida (N=5) Inter-corrida (N=10)Média + I(ng mL-1)

CV% (%)

Exatidão(%)

Média + I(ng mL-1)

CV% (%)

Exatidão (%)

0,10 0,09 + 0,011 9,9 100,0 0,12 + 0,012 16,9 114,5

0,20 0,20 + 0,021 9,6 111,0 0,21 + 0,021 10,5 106,3

4,80 4,37 + 0,064 2,3 91,4 4,34 + 0.096 2,0 90,3

9,60 10,00 + 0,277 2,2 107,5 10,23 + 0,320 2,9 106,6

122122

Cortisol - PLASMA

VacaMédia + I

(ng.mL-1)CV%

Iníc

io

1 2.34 + 0.351 7.44

2 11.6 + 2.64 11.04

3 4.42 + 0.289 3.16

4 7.09 + 1.858 12.68

5 5.23 + 1.301 12.14

6 11.27 + 1.548 6.65

Fina

l

1 1.84 + 0.578 14.96

2 11 + 2.93 12.87

3 3.72 + 0.991 12.84

4 13.98 + 4.310 14.94

5 14.21 + 3.489 11.86

6 4.68 + 1.239 1.37

Cortisol - LEITE

VacaMédia + I

(ng.mL-1)CV%

Iníc

io

1 0.34 + 0.021 3.04

2 1.28 + 0.103 3.61

3 0.65 +0.062 3.9

4 0.78 + 0.041 3.1

5 0.89 + 0.041 2.69

6 0.65 + 0.041 2.41

Fina

l1 0.23 + 0.021 6.17

2 1.21 + 0.021 0.91

3 0.41 + 0.021 3.25

4 1.08 +0.062 2.56

5 0.7+0.041 3.12

6 0.51+0.082 7.37

Faixa: 1.84 à 14.21 ng mL-1 Faixa: 0.23 à 1.28 ng mL-1

R e s u l t a d o s

• Experimento I – Efeito da ordenha / Comparação Plasma e Leite

123123

• Experimento I – Efeito da ordenhaR e s u l t a d o s

•[Cortisol]início = [Cortisol]final para plasma (P=0,616) e leite (P=0,385)

•[Cortisol]plasma > [Cortisol]leite

6.99 + 3.591

8.24+5.227

0.77+0.298 0.69+0.368

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Início (-1) Final (+10)

Plasma

Leite

Tempo

[cor

tisol

] / n

gm

L-1

Pergunta: que teste estatistico poderia ser usado para esta comparação??

124124

• Experimento IR e s u l t a d o s

•Há correlação linear entre plasma e leite

y = 9.442x - 0.5489R = 0.99, P<0.000

0

2

4

6

8

10

12

14

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

Leite

[cor

tiso

l] /

ng.m

L-1

Plasma[cortisol] / ng.mL-1

125125

• Experimento II – Efeito da Mastite Subclínica

R e s u l t a d o s

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 5 10 15 20

[cor

tiso

l] /

ng m

L-1

Amostra

Negativo

Positivo

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 5 10 15 20 25 30

[cor

tiso

l] /

ng m

L-1

Amostra

LC-MS/MS

Negativo

Positivo

ELISA

126126

• Experimento II – Efeito da Mastite Subclínica

R e s u l ta d o s

•[Cortisol]positivo< [Cortisol]Negativo para LC-MS/MS e para ELISA

0.32+0.072

0.56+0.162

0.46+0.047

0.87+0.131

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

LC-MS/MS ELISA

Positivo

Negativo

[cor

tisol

] / n

gm

L-1

Método

Saliva Humana = Leite de

Vaca?? ELISA superestimou em média 82% da

concentração obtida por LC-MS/MS

127127

• Analíticas• Desenvolvimento de dois métodos LC-MS/MS para dosagem de cortisol em

plasma e leite bovinos;

• Métodos que utilizam baixos volumes de amostra;

• O uso de matriz simulada (BSA para o plasma) e quantificação frente a curva não extraída possibilitaram bons resultados analíticos;

C o n c l u s õ e s

• Veterinárias• Não há diferença entre os níveis de cortisol do início e do final da ordenha;

• Plasma tem concentração de cortisol maior que leite;

• A concentração de cortisol em plasma correlaciona-se linearmente com a concentração de cortisol em leite;

• Animais com mastite subclínica apresentam menor nível de cortisol que animais sadios (tanto por LC-MS/MS quanto por ELISA)

• ELISA de saliva humana aplicado a leite bovino superestima em média 82% a concentração obtida por LC-MS/MS

128128

CloranfenicolCloranfenicol• Listado no Anexo IV da EU Council Regulation 2377/90

– Substância proibida para uso em produtos de origem animal desde 1994.

– Não exite MRL estabelecido para qualquer alimento.

129129

Coluna – Waters Symmetry C8, 4.6 x 50mm, 3.5µm

Fluxo – 1.0 ml/min, Split 2:1

Fase móvel

Solvente A – 0.1% de ácido Fórmico em H2O

Solvente B – 0.1% de ácido Fórmico em CH3CN

Volume de injeção – 50µl

Condições de LCCondições de LC

75% A, 25% B0.1min44% A, 56% B6 min

Tempo total = 12 min

100% A0 min

130130

Espectro de MSEspectro de MSMS

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400m/z0

100

%

30JULYCAP_04 13 (0.440) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (12:15) Scan ES- 1.46e5321

283257255

323

325

357 384

131131

Espectro de MS/MSEspectro de MS/MS

MS/MS CE = 12

120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z0

100

%

30JULYCAP_03 2 (0.068) Sm (Mn, 2x1.00); Cm (2:32) Daughters of 321ES- 6.50e5321

257152

194

176 249237

321 257

132132

MS/MS CE = 18

120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z0

100

%


148127

176257194

321

321 152


133133


MS/MS CE = 18

120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z0

100

%


151

148129

176

194257

249259 323

323 152

134134

Transições de MRMTransições de MRM

0.08s

0.08s

0.08s

0.08s

Dwell Time Collision EnergyCone VoltageMRM Transition

16eV80V326 157Internal Standard

16eV80V323 1522nd

Confirmation

10eV80V321 2571st Confirmation

16eV80V321 152Quantification

• Electrospray Negativo

• Monitoramento de 4 transições de MRM

135135

Cromatogramas de LC-MS/MSCromatogramas de LC-MS/MS

Standard 0.05 g/kg

2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60Time1

100

%

1

100

%

1

100

%

0

100

%

05Sep_05 Sm (Mn, 1x2) MRM of 4 Channels ES-326 > 157.1

7.74e33.17

05Sep_05 Sm (Mn, 1x2) MRM of 4 Channels ES-323 > 152

1.56e33.20


1.44e33.20


2.31e33.20

Transição de Quantificação

2a transição de confirmação

Padrão interno

1a transição de confirmação

136136

Matriz de camarão com adição de 1g/kg

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00Time0

100

%

1

100

%

02Sep_09 SIR of 2 Channels ES-323

5.50e4S/N:PtP=22.54

0.95

0.48

0.58

1.991.021.51

1.30

1.733.20

2.30 2.58 2.93 3.56 3.60 3.944.09

02Sep_09 SIR of 2 Channels ES-321

2.23e51.99

1.620.940.55

1.08 1.48

S/N:PtP=17.38

2.582.31

SIR (MS)

MRM versus SIR?

137137

02Sep_10 MRM of 3 Channels ES-323 > 152

4.33e3S/N:PtP=113.17

3.25

3.21

0.68 3.783.33

02Sep_10 MRM of 3 Channels ES-321 > 152

6.91e3

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00Time0

100

%

0

100

%

S/N:PtP=163.95

3.24

MRM (MS/MS) Analysis

Matriz de camarão com adição de 1g/kg

MRM versus SIR?

138138

Curva de Calibração em matriz de camarãoCurva de Calibração em matriz de camarãoCompound name: ChloramphenicolCorrelation coefficient: r = 0.999858, r^2 = 0.999715Calibration curve: 2.99162 * x + 0.0106534Response type: Internal Std ( Ref 2 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: Null, Axis trans: None

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800ug/Kg0.00

2.42

Response

139139

PROTOCOLO DE VALIDAÇÃO

O protocolo de validação e um documento que descreve o procedimento de validação a ser adotado, bem como seus critérios de aceitação, de acordo com as particularidades do método a ser testado.

Este documento deve ser aprovado antes do inicio dos testes. Seu uso e aprovação prévios constituem boas práticas de laboratório e devem ser adotados por todos os laboratórios que pretendem validar seus métodos analíticos.

ProtocoloProtocolo

DOCUMENTAÇÃO DA VALIDAÇÃODOCUMENTAÇÃO DA VALIDAÇÃO

140140

O PROTOCOLO DEVE CONTER

Método a ser testado e seu objetivo Parâmetros avaliados Critérios de aceitação Descrição do POP analítico Campos de elaboração, conferência e aprovação

ProtocoloProtocolo


141141

O RELATÓRIO DEVE CONTER

Método a ser testado e seu objetivo Parâmetros avaliados Critérios de aceitação Descrição do POP analítico Campos de elaboração, conferência e aprovação

RELATÓRIORELATÓRIO


EXEMPLO

RELATÓRIO DE VALIDAÇÃO

142142

RequisitosRequisitos mínimosmínimosRE899RE899Controle de Controle de QualidadeQualidade

ExatidãoExatidão

EspecificidadeEspecificidade

LinearidadeLinearidade

IntervaloIntervalo

RepetibilidadeRepetibilidadePrecisãoPrecisãoIntermadiáriaIntermadiária

LIQLIQ

PessoalPessoal

LiteraturaLiteratura disponíveldisponível

TreinamentoTreinamento

TempoTempo analíticoanalíticoMaterialMaterial dede consumoconsumo paraparaanálisesanálises

PadrõesPadrõesDocumentaçãoDocumentação –– protocolosprotocolos ee relatóriosrelatórios

LDLD

RobustezRobustez

Validação de Validação de metodologiasmetodologiasanalíticasanalíticas

Ref: Fernanda Bido, tese mestrado IPT- USP

143143

ESTATISTICA:

É a arte de torturar seus dados até eles confessarem o que você quer!!

144

Resumo das Resumo das Técnicas Estatísticas Técnicas Estatísticas AplicáveisAplicáveis

Objetivo Técnica UtilizadaPrecisão – repetitividade

reprodutibilidadeAnalise da Variância

Compatibilidade das médias entre si

Teste F de Snedecor

Comparação de médias com um valor ou entre si

Prova de significância t

Compatibilidade entre diferentes situações com diferentes amostras

Prova de emparelhamento

Verificar interferentes Planejamento ExperimentalExatidão Programa Interlaboratorial

Rejeição de valores Dixon, Grubbs, Cochran, Bartlet, Huber

Comparar com especificações Carta de controle

145145

CONCLUSÃOESPECTROMETRIA DE MASSAS PERMITE ALTO GRAU DE CONFIANÇA E ESPECIFICIDADE

IDENTIFICAÇÃO DE FORMA INEQUIVOCA

MÉTODO DE CONFIRMAÇÃO NOS PROCESSOS DE VALIDAÇÃOtriplos quadrupolos permitem a obtenção de menores LD, de forma que podem ser mais adequados em casos de compostos com menores LMR. distinção entre compostos isobáricos de interesse ou provenientes da matriz, quando estes produzem um espectro de massas com íons fragmentos distintos.

Equipamentos de alto custo? Problema ? Não!TRABALHOS EM COLABORAÇÃO!!

146146

BibliografiaBibliografia Miller ,JC; Miller JN ;Estadística para Química Analítica –Segunda

Edição Addison –Wesley Iberoamericana –1993 ASTM D3244-97 Standard Practice for Utilization of Test Data to

Determine Conformance with Specifications Guidelines for the validation of screening methods for residues of

veterinary medicines (initial validation and transfer)- Community reference laboratories residues -2010 disponivel em :

http://ec.europa.eu/food/food/chemicalsafety/residues/Guideline_Validation_Screening_en.pdf

ANTIGNAC,J.P. LE BIZEC B. MOMTEAU, F. Validation of analyticalmethods based on mass spectrometric detection accordingo to 2002/657/EC european decision guideline and application; Anal. Chim. Acta v 483, p325-334 2003

The fitness for purpose of analytical methods(1998) A laboratoryguide to method validation and related topics, Eurachem guide,1st English edn,1.0 LGC(Teddington)Ltda

147147

You are all invited to attend the 4th Brazilian MS Conference !!

148148

AGRADECIMENTOS

À equipe de quantificação do Laboratório Thomson: Rosy, Andréia ,Phellipe e ChristinaE ao Prof Marcos Eberlin.

A vocês pela presença!

O IV BrMASS AGRADECE A TODOS OS PATROCINADORES DOS CURSOS

Documents

validação_metodologia_foco em espectrometria de massas.pdf