Pesquisador(es) ano contribuio

J. J. Thompson 1912 Primeiro espectrmetro de Massas

Dempster 1918 Desenvolvimento de ionizao

eletrnica e focalizao magntica

Aston 1919 Massa atmica usando MS

Stephens 1946 anlise por Tempo de vo

Nier-Johnson 1952 Instrumentos de duplo-foco

Paul, Steinwedel, Raether, 1953- Analisadores quadrupolo

Reinhard, von Zahn 1958

Willey e McLaren 1955 Desenvolvimento de analisador

tempo de vo avanado

Gohlke e McLafferty 1956 Cromatografia gasosa acoplado a

Espectrometria de Massas (CG-EM)

Beynon 1956 Espectro de Massas alta resoluo

Biemann, Seibl e Gapp 1959 Sequenciamento de Peptdeos

Hipple, Sommer e Wabschall 1965 ressonncia ciclotrnica de ons

Investigador(es) Ano contribuio

Munson 1966 Ionizao Qumica

McLafferty 1967 Espectrometria de Massas

Tandem

Dole, Mack, Hines e

Alice 1968 Ionizao Eletrospray

McLafferty 1973 Cromatografia Lquida acoplada a

espectrometria de Massas (LC-MS)

Yamashita e Fenn,

Aleksandrov. 1984 Aplicao de Ionizao Eletrospray

Gall, Krasnov, Dokl, Baram, a anlise de macromolculas

Pavlenko, Nikolaev,

Sckurov, e Garacher

Karas, Tanaka, Bachmann 1987-

Matriz assistida por Dessoro de

laser

Hillenkamp, Waki, Ido, 1988 MALDI-MS

e Yoshida

Espectrometria de Massas

Ilustrao do processo de anlise de massa e do espectro de massas

de cis- 9, lO-octadecenoamida.

A espcie original tem massa m = 281. A Ionizao adiciona um prton, formando

um on positivo com razo massa/carga m/z = 282, o qual aparece como o pico

principal do espectro. Os outros ons so fragmentos do on original.

Espectrmetro de massas

Um espectrmetro de massas um equipamento analtico que determina a massa molecular de compostos qumicos, e de seus fragmentos, separando os ons moleculares de acordo com suas razes massa-carga (m/z). Os ons so gerados por induo seja por ganho ou perda de carga (e.x., ejeo do eltron, protonao ou desprotonao).

Figura 1.2 Analogia entre anlise de massa e disperso da luz.

Fonte de ons

Fonte luminosa

Analisador de massas

Prisma

Detector de luz

Detector de massas

Figura 1.3 Componentes de um espectrmetro de

massas.

Sistema de dados (computador)

Detector

Analisador de massa Fonte de ionizao

Introduo da amostra

Fontes de on e insero de

amostra A injetor de amostras a interface

entre a amostra e o espectrmetro de massas (Figura 1.1). Para se analisar por espectrometria de massas, uma amostra a presso atmosfrica deve ser injetada no instrumento ao qual se encontra sob vcuo. Uma amostra pode ser injetada de muitas maneiras, as mais comuns so a insero direta , ou por infuso atravs de uma coluna capilar (cromatografia gasosa ou cromatografia lquida).

Ionizao da amostra

Insero direta

Coluna capilar

LC-MS cromatografia lquida acoplada a

espectrometria de massas

Ionizao de eltrons (EI) foi a primeira fonte de ionizao para anlises de massa at 1980, limitando a qumica a molculas pequenas bem abaixo das massas de compostos bioorgnicos comuns. Esta limitao motivou cientistas como John B. Fenn, Franz Hillenkamp, Michael Karas e Michael Barber a desenvolver tcnicas para anlise de biomolculas que so comumente conhecidas como bombardeamento de tomos rpidos (FAB), Ionizao por dessoro a Laser assistida por matriz (MALDI), e Ionizao por eletrospray (ESI).

Mtodos de ionizao para compostos bioinorgnicos

Tcnica de ionizao Sigla Modo de Ionizao

Ionizao de Eltron

EI Transferncia de eltron

Bombardeamento de tomos rpidos

FAB Transferncia de prton

Desoro a laser assistida por matriz

MALDI Transferncia de prton

Eletrospray ESI Evaporao de partculas carregadas

Tabela 1

Ionizao de eltrons (Electron

Ionization- EI )

Importante na rotina de anlise de

molculas pequenas.

Bases de dados contendo espectro de massas de mais de 100.000 compostos so usadas e consultadas por milhares de qumicos.

Bases de dados possuem algorrtmos que permitem a rpida comparao com espectros de massas conhecidos, facilitando a determinao estrutural de molculas pequenas.

EI Tcnica simples. A amostra deve chegar na forma de gs - um

processo normalmente realizado por dessoro trmica da amostra da sonda. O alto vcuo do espectrmetro de massas e o aquecimento, pode facilitar este processo. Uma vez na fase gasosa, a substncia passa para uma regio de ionizao de eltrons (Figura 1,4), onde ele interage com uma nuvem de eltrons resultando na ejeo de eltrons e algum grau de fragmentao.

Aplicabilidade da EI: diminui significativamente para os compostos acima da massa molecular de 400 Da.

Dificuldades: exige dessoro trmica da amostra na fonte, muitas vezes leva ionizao e decomposio antes da vaporizao. No volatilizao da amostra de grandes molculas e da decomposio trmica, e em muitos casos ocorre fragmentao excessiva.

Vantagens e desvantagens da Ionizao de eltrons

Vantagens Desvantagens

Sensibilidade elevada (picomols (1X10-12)

Limitado a compostos com Massa molecular baixa devido

baixa volatilizao Uso das fragmentaes para comparao com base de dados de compostos obtendo informaes estruturais

Possvel decomposio da amostra por dessoro trmica.

Uso das fragmentaes para comparao com base de dados de compostos

Excesso de fragmentaes resultando na perda de informao do on molecular.

Ionizao Qumica (CI)

Tcnica mais branda em relao a EI

Formao de espcies radicalares a partir de gases

Obteno de dados do on molecular

Ionizao Qumica

Molculas da amostra misturadas com um fluxo de gs reagente ionizado.

Gases utilizados: metano, amnia, isobutano e metanol.

Reaes : Caderno

Grau de fragmentao : observar Afinidade protnica.

:Ionizao Qumica

afinidade protnica Resultado

(kcal.mol-1)

H2 101 frag. significativa

CH4 132 menos frag. que H2

CH3OH 182 Branda, pequena frag.

Frag. : Fragmentao

Observar espectros do caderno

Bombardeamento de tomos rpidos (FAB) tcnica de ionizao (Figura 1,5) normalmente requer o uso de uma sonda de insero direta para a introduo da amostra

feixe de alta energia de tomos de Xe, para chocar-se com a amostra e com a matriz.

A matriz : um solvente voltil no qual a amostra dissolvida. A matriz FAB reabastece constantemente a superfcie com uma nova amostra, como o feixe de ons incidente bombardeia essa superfcie.

A matriz tambm serve para

minimizar os danos amostra do feixe

de partculas de alta energia,

absorvendo a maior parte da energia

facilitando o processo de ionizao.

Matrizes para FAB so lcool m-

nitrobenzlico e glicerol

lcool meta-nitrobenzlico glicerol

Parte da Figura 1.5

Sequncia de aminocidos

Feixe de ons csio

Vantagens e desvantagens da ionizao FAB

Vantagens Desvantagens

Prtico ampla massa de at 20.000 Da.

Queda da sensibilidade com altas massas

As anlises podem ser executadas rapidamente.

Resoluo baixa em relao a MALDI e Eletrosplay

A "ionizao suave". O on molecular obtido facilmente com

pouca fragmentao.

Pouca fragmentao portanto, apenas uma quantidade limitada de informaes podem ser obtidas.

Facilidade de adio de ctions na matriz levando ao on molecular com ctions (metais alcalinos adventcios) (por exemplo: (M+Na)+, (M+K)+ .

Anlise confusa, requer grande experincia com a tcnica e com os ons de fundo.

Facilidade de adaptao a instrumentao de alta resoluo, permitindo a medio da massa exata.

Requer solubilidade da amostra da matriz

Impacto com de glicerol, permite multiplicar ons carregados,mais adequada para biopolmeros de alta Massa Molecular.

Pouca utilidade para amostras apolares que no formam cargas

MALDI

Permite a anlise de compostos de alto peso molecular com alta sensibilidade. um mtodo

que permite a ionizao e a transferncia de uma amostra de uma fase outra de uma forma similar a

FAB. A principal diferena entre MALDI e FAB que enquanto a FAB usa uma matriz lquida,

MALDI utiliza uma matriz slida, e o feixe de luz laser ionizante. A formao de ons em MALDI realizada por um feixe de laser pulsado em uma amostra suspensa ou dissolvida em uma matriz,

que absorve a energia e carrega a amostra. Matrizes: cidos nicotnico, picolnico, e cinmico.

NO

OH

N

O

OHcido

nicotnico

OH

O

OH

N

cido ciano 4- hidroxicinmico

cido picolnico

Matrizes para MALDI - (LASER)

MALDI

A matriz em fase gasosa facilita ionizao das molculas do analito.

Molculas carregadas so dirigidas por lentes eletrostticas da fonte de ionizao no analisador de massa. Molculas neutras muitas vezes reagem com as molculas de matriz ou de outras molculas produzindo espcies carregadas, sendo transferidas eletrostaticamente no analisador de massa.

Anlise: TOF (tempo de vo) Eficincia do processo permite a anlise de quantidades relativamente pequenas de amostra (faixa de picomol)

. A anlise de amostras heterogneas torna MALDI muito bom na anlise de massa de amostras biolgicas.

Amostras que podem ser analisadas por MALDI: oligonucleotdeos, oligossacardios, polipetdeos (maior que 30 aminocidos), anticorpos e pequenas protenas (peptdio com mais de 50 aminocidos).

Feixe de ftons

MALDI Vantagens

Prtico gama de massas de at 300.000 Da.

Espcie de massas muito maiores tm sido relatados.

Sensibilidade tpica da ordem menor que femtomol.

Ionizao branda com pouca ou nenhuma fragmentao observada.

Adequada para a anlise de misturas complexas.

MALDI desvantagens

Baixa resoluo MALDI Alguns instrumentos so capazes de maior resoluo, no entanto, esta conseguida em escala de massa relativamente baixa e custa de sensibilidade.

Matriz de fundo, que pode ser problema para os compostos abaixo de uma massa de 1000 Da.

Possibilidade de fotodegradao por laser.

Ionizao Eletrospray um mtodo que molculas ionizadas gasosas a partir de

uma soluo lquida. Isto feito atravs da criao de um fino spray de gotculas altamente carregadas na presena de um potencial de alta voltagem (4.000 V). So expulsas pequenas gotculas carregadas. Estas passam por um fluxo de nitrognio que evapora o solvente. A densidade de cargas aumentas e estas se dividem em menores partculas.

Ionizao eletrospray propcio para aumentar a formao de molculas carregadas. Esta uma caracterstica importante uma vez que o espectrmetro de massa mede a relao massa/carga, tornando possvel observar molculas muito grandes com um instrumento com uma faixa de massa relativamente pequena.

Eletrospray vantagens

Prtico gama de massas de at 200.000 Da.

Boa sensibilidade at fentomol (1x10-15).

Ionizao mais branda de todas com capacidade de observar interaes no covalentes de amostras biolgicas.

Facilmente adaptvel a Cromatografia lquida. Capaz de analisar diretamente eluentes de Cromatografia Lquida , com uma razo de um mL por minuto.

No h interferncia da matriz.

Mltiplas cargas com preciso melhor de massa atravs da mdia.

Eletrospray desvantagens

Dificuldade de limpeza instrumento, devido alta sensibilidade para determinados compostos.

Baixa tolerncia para misturas. A pureza da amostra importante.

ANALISADORES DE MASSA

Quadrupolo Analisador

Quadrupolos so quatro barras metlicas precisamente alinhadas sob uma voltagem direta (DC) e um potencial de radiofrequncia (RF) (Figura 2.4).

O campo nos quadrupolos determina quais ons so permitidos a chegar ao detector.

Figura 2.4 - Analisador quadrupolo

lon Trap = armadilha de ons

O analisador de massa ion trap foi desenvolvido na mesma poca do quadrupolo. A Fsica envolvida em ambos analisadores so muito similares; entretando, suas aplicabilidades para ionizao eletrospray ainda esto sendo desenvolvidas.

Analyzer Time of-Flight (TOF) Tempo de vo Analisador TOF um dos mais simples analisadores de

massa e comumente utilizado com a ionizao MALDI. A anlise por TOF baseada em acelerar um conjunto de ons para o detetor com a mesma quantidade de energia. Devido ao fato dos ons terem a mesma energia, embora com diferentes massas, faz com que os on cheguem ao detetor em tempos diferentes. O processo anlogo a jogar uma bola de golfe e uma bola de basquete com a mesma energia. A bola de golfe chegar primeiro, o mesmo ocorre com os ons.

Equaes: Energia cintica (KE) igual a mv2 ou velocidade v = (2KE/m)1/2, ons que viajam a uma dada distncia, d, com tempo, t, onde t dependente de sua relao m/z.

O poder de resoluo do TOF baixo, mas tem a vantagem de no ter limitao de massa.

Detectores de massa

Detector de massas composto de um contador que produz uma corrente proporcional ao nmero de ons que o atingem.

O detector utiliza multiplicadores de eltrons, que geram uma corrente, esta pode ser medida com alta preciso. Quando o on bate na superfcie do multiplicador de eltrons( vidro dopado com Pb e com revestimento de PbO) dois eltrons so ejetados. Existe no sistema um potencial de 2kV que repetindo o processo gera um grande nmero de eltrons. O sinal do detector enviado para um registrador, que produz o espectro de massas.

Tcnicas de anlise

Regra do treze

Quando no se sabe a massa molecular.

1 passo gerar uma frmula base que contenha apena C e H. Para isto divide-se a massa molecular por 13.

Este clculo fornece um numerador (n) e um resto (r) .

A frmula torna-se CnHn+r

Tcnicas de anlise

Regra do treze

O IDH ndice de deficincia de hidrognio pode ser calculado por:

IDH: (n-r+2)/2

Para compostos que tem outros tomos , devemos subtrair a massa correspondente de tomos de C e H. Por exemplo para a adio de 1 tomo de O, subtrair 1 C e 4H da frmula correspondente. Ao IDH adicionar 1 unidade

Exemplos

Massa molecular (M.M) 94, 94/13=7 (n) com r=3 o que d frmula C7H10, para um composto com 1O subrair CH4 que d C6H6O adiciona-se ao IDH deste composto 1 unidade: 4

M.M 110, 110/13=8 (n) , r=6 , frmula C8H14 IDH=2. Para um composto com 2O C2H8 Fornecendo composto C6H6O2 com IDH =4

Mtodos de anlise

M.M 148 : C11H16 (IDH 4) para um O subtrair CH4 e acrescentar 1O: C10H12O (IDH 5).

M.M 196 : 196/13=15 (n=15) r=1 : C15H16 IDH=(15-1+2)/2= 8. Para um composto com 2 O subtrair C2H8 resultando em C13H8O2 somar 2 ao IDH: como o n de H insuficiente usa-se o artifcio de subtrair 1 C e somar 12 H resultando em C12H20O2 e subtraindo-se 7 do IDH resultando em IDH 3

Mtodos de Anlise

No caso de IDH der n fracionado deve-se suspeitar da presena de N.

Exemplo : M.M = 95 95/13 =7 r=4 C7H11 ( 7-4+2)/2= 5/2 (um composto improvvel) adicionar um N subtraindo CH2: C6H9N adicionar ao IDH=3.

IDH

FRMULA GERAL:

IDH= n de C - n de H/2 - n de halognios/2 + (n de N, P ou tomo trivalente)/2 + 1

Tcnicas de anlise Regra do nitrognio - Se um composto contm

um nmero par de tomos de nitrognio, o seu on molecular ter um nmero par de massa. Um composto com nmero mpar de N aparecer com um valor de massa mpar.

Neste caso, um composto neutro com um nmero par de nitrognios ter um nmero par de hidrognios. Um composto tendo nmero mpar de nitrognios normalmente ter um nmero mpar de hidrognios. Mesma regra para o Fsforo.

Halognios podem ser contados como hidrognios. Essa regra pode ser til para determinar a frmula molecular de um composto. Uma tabela com exemplos mostrada no prximo Slide.

Composto Frmula Massa Molecular

Regra do Nitrognio

metano

metilamina

metanol

anilina

tioglicerol

peptdeo

carboidrato

oligonucleotdeo

fosfolipdeo

Derivatizao

Alterao qumica de uma molcula para aumentar a volatilidade e estabilidade trmica, reduzindo as foras intermoleculares.

uma etapa preparatria para o processo de dessoro trmica de eltrons de ionizao, pois d a volatilidade e estabilidade trmica de molculas, facilitando a dessoro trmica.

Aumenta o peso molecular e reduz as foras intermoleculares, convertendo grupos polares em grupos de menor polaridade.

Exemplo de derivatizao

A reduco das foras intermoleculares, como a ligao hidrognio, acompanhada

pela remoo de tomos de hidrognio ativos. Por exemplo cidos, amidas, ou

polilcools podem se metilados,acetilados ou silanizados.

Carboidrato

no derivatizado

Carboidrato

acetilado

Interpretao dos espectros de

massa

Massa molecular : PM

Composio elementar: alta resoluo

Identificao do on molecular: o on de menor massa no conjunto de ons mais a direita do espectro

Fragmentaes lgicas

fragmentos

regio do on molecular

Intensidade

Fragmentaes lgicas

ons fragmentos na faixa de [M-3] - [M-14] e [M-21] - [M-25] no so perdas lgicas.

Nenhum on fragmento pode conter um nmero maior de tomos de qualquer elemento do que o on molecular

Observar a perda de 14 unidades como perdas de impurezas homlogas

Por exemplo o metilbenzeno e dimetilbenzeno: massas 92 e 106

Regio dos fragmentos

Mecanismos de fragmentao

Princpios gerais

A intensidade relativa dos fragmentos est relacionada a estabilidade dos ons.

CH3 CH2+ CH3

C+

CH3

CH3

mais estvel (ction tercirio)

CH2

CH2NH2

CH2+

NH2CH2

+

N+

H

H

CH2

maior n de estruturas estvel+

fragmentao

Intensidade dos fragmentos no espectro de massas

Aspectos gerais sobre os

mecanismos de fragmentao

CH3

CH2

CH2+

CH2

CH3

.

.

CH3

C

CH2

He-

CH3

C

CH2+

H

CH3

C+

CH2

Hou

Incio da reao

Promovido no stio radicalar ou de carga

Como localizar os stios

EI Impacto de eltron qual eltron retirado?

Sigma () saturada

Pi ()

No- ligante () NHH

e-N

+H

H

+ 2 e-

Facilidade em perder eltrons

No- ligante () > Pi () > Sigma ()

Tipos principais de fragmentao

Dissociao - sigma

Clivagem - alfa

Clivagem indutiva

Rearranjo de hidrognio

Dissociao sigma

CH3

CH2

OH+

CH3 CH2 O+

Hperda de 15 unidades m/z 31

m/z 46

CH3CH3.

.

CH3

CH2+

CH2 CH3

+e-

Clivagem alfa

movimento de um eltron

movimento de dois eltrons

Clivagem indutiva

CH3CH3

O

e

CH3CH3

O+

-

-CH3

CH3

C

O+

.

clivagem alfa

clivagem indutiva

-CO

CH3+

m/z 15

m/z 43

Processo de ionizao

Qual o tipo de fragmentao?

RESPOSTA: CLIVAGEM ALFA

Retro- Diels-Alder

Anis insaturados podem sofrer clivagem atrves de reao Retro-Diels-Alder

A carga pode ficar no dieno ou dienfilo, o mais comum no dieno

Rearranjos

Quais seriam os fragmentos principais

do paraclorobenzofenona?

Espectro de massas

Fragmentos principais

Istopos

Todo composto puro na realidade uma mistura de compostos isotopicamente diferentes

Abundncia relativa dos istopos

de elementos comuns

M + 1 , M+2 ...

S contribui com M+2 com aproximadamente 4,4 % , Si com 3,35 %, Cl com 33% e Br com 98%.

IDH

IDH = C - ( H + X)/2 + N/2 + 1

Para molculas de Si vale a mesma frmula, mudando-se C por Si.

N pode ser contado como tomo trivalente, como P por exemplo

Exerccios IDH

Interpretao dos resultados

Alta resoluo

Calcular as massas moleculares dos compostos : CO, N2 e C2H4

Qual a frmula molecular do composto abaixo?

Tentar chegar a sua estrutura , explicar fragmento.

Determinar estrutura do composto

com espectro de massa abaixo :

Qual a frmula molecular do composto abaixo?

Tentar chegar a sua estrutura , explicar fragmento.

3.1

Fragmentos comuns

Fragmentos comuns

Fragmentos comuns

Fragmentaes classes de compostos

Hidrocarbonetos

Tendncia a sofrer rearranjos ao acaso principalmente envolvendo Hs.

Principal sigma () fragmentos: m/z 15, 29 , 43 , 57....

C C

.

.

.

.

.

.

C C

.

.

.

.

.

.

e-+ C C

.

.

.

.

.

.

+ +

CH3 CH3

Ramificaes Forma radical ou carboction mais

estvel

HC Insaturaes

Fragmentao no permite localizar a dupla ligao ons 27 41, 55, 69... para dupla e

15 , 29, 43 , 57 para parte saturada

CH3

CH3

CH3