VANDA LUCIA DOS SANTOS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA,

ANTIDIARRÉICA E ANTIESPASMÓDICA DO EXTRATO

ETANÓLICO BRUTO E FASE ACETATO DE ETILA OBTIDOS DA

ENTRECASCA DO CAULE DE Maytenus rigida Mart.

(CELASTRACEAE) EM MODELOS ANIMAIS

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA

“PROF. DELBY FERNANDES DE MEDEIROS”

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS

E SINTÉTICOS BIOATIVOS

João Pessoa - PB

2008

Livros Grátis

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VANDA LUCIA DOS SANTOS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA,

ANTIDIARRÉICA E ANTIESPASMÓDICA DO EXTRATO

ETANÓLICO BRUTO E FASE ACETATO DE ETILA OBTIDOS DA

ENTRECASCA DO CAULE DE Maytenus rigida Mart.

(CELASTRACEAE) EM MODELOS ANIMAIS

ORIENTADORA: Profa. Dra. Leônia Maria Batista CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Bagnólia Araújo da Silva

João Pessoa – PB 2008

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica “Prof. Delby Fernandes de Medeiros” da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para a obtenção do título de DOUTOR EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de concentração: FARMACOLOGIA

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F ICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL – UEPB

S237a Santos, Vanda Lucia dos. Avaliação da atividade antiulcerogênica,

antidiarréica e antiespasmódica do extrato etanólico bruto e fase acetato de etila obtidos da entrecasca do caule de Maytenus rigida Mart. (Celastraceae) em modelos animais / Vanda Lucia dos Santos. – 2008.

118 f. : il. color.

Digitado. Tese (Doutorado) – Universidade Federal da

Paraíba, Centro de Ciências da Saúde, 2008. “Orientação: Profa. Dra. Leônia Maria Batista, Departamento de Ciências Farmacêuticas”. “Co-Orientação: Profa. Dra. Magnólia Araújo da Silva, Departamento de Ciências Farmacêuticas”.

1. Úlcera Gástrica. I. Título.

21. ed. CDD 616.334

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VANDA LUCIA DOS SANTOS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA, ANTIDIARRÉICA E

ANTIESPASMÓDICA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO E FASE

ACETATO DE ETILA OBTIDOS DA ENTRECASCA DO CAULE DE

Maytenus rigida Mart. (CELASTRACEAE) EM MODELOS ANIMAIS

Aprovada em ______ / ______ /______

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________ Profa. Dra. Leônia Maria Batista

Orientadora

_______________________________________________ Profa. Dra. Bagnólia Araújo da Silva

Co-orientador

_______________________________________________ Profa. Dra. Ana Beatriz A. de Almeida

(Universidade de Campinas) Examinadora Externa

_______________________________________________ Profa. Dra. Terezinha Gonçalves da Silva (Universidade Federal de Pernambuco)

Examinadora Externa

_______________________________________________ Profa. Dra. Márcia Regina Piuvezan (Universidade Federal da Paraíba)

Examinadora Interna

_______________________________________________ Profa. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz

(Universidade Federal da Paraíba) Examinadora Interna

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Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo,

qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim.

(Chico Xavier)

5

Ao meu filho Matheus Albino, a maior razão de lutar por meus ideais; Ao meu esposo Robério, por ser presença constante na minha vida; Aos meus pais José Albino (in memoriam) e Eunice, por terem me ensinado a amar o que faço; Aos meus irmãos e irmãs por não terem medido esforços desde o início de minha vida universitária.

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AGRADECIMENTOS

A DEUS, por sempre ter me guiado, protegido e iluminado meus caminhos na busca de momentos de sabedoria; Ao meu amado filho Matheus Albino por ser o meu presente de Deus e ao meu esposo Robério por ter suportado a distância e dado o apoio necessário; Aos meus pais José Albino (in memoriam) e Eunice por terem acreditado em mim. A minha família, pelo amor, incentivo e por estar presente, mesmo que à distância no decorrer de toda esta caminhada; A minha irmã Goretti e seus filhos Michaelle e Philipe por terem me acolhido e serem presença constante nesta caminhada; A Profa. Leônia Maria Batista pela constante presença como orientadora, pelo exemplo de dedicação à ciência e acima de tudo pela amizade e confiança; A Profa. Bagnólia Araújo da Silva por ter me aceitado como orientanda, acreditando que eu seria capaz e pela amizade; A Profa. Dra. Alba Lígia M. Souza Brito e seus pupilos Anderson e Elisângela pela realização dos experimentos de muco e prostaglandina; A UNICAMP por ter cedido o laboratório e os animais para os experimentos de muco e prostaglandina; Ao Prof. José Maria Barbosa-Filho por ter cedido os resultados da pesquisa no NAPRALERT de Maytenus rigida Mart. e o laboratório para a preparação do extrato; Ao técnico Nonato pela preparação do extrato etanólico de Maytenus rigida Mart.; A Profa. Maria de Fátima Vanderlei de Souza e seus alunos pelo fracionamento do extrato e fornecimento da fase acetato de etila de Maytenus rigida Mart.; A Juliana da Nóbrega Carreiro (IC) e Rosimeire Ferreira dos Santos (Doutoranda) pela realização dos experimentos de investigação da atividade antiespasmódica; A amiga-irmã Dilma Trovão pela amizade, carinho e por ter cedido as fotos da planta; A amizade dos companheiros do Grupo de Úlcera: Heloína, Igara, Juliana, Jaqueline, Sabrina, Kelly e Guilherme pelo interesse e incansável auxílio nos experimentos e padronização dos novos modelos;

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A Elise e Vivian pela grande ajuda, apoio e incentivo no início deste trabalho e pela amizade firmada; A Alessandra, Josimar, Raissa, Thúlio e Rossana pelo companheirismo nas viagens Campina-João Pessoa, João Pessoa-Campina; Aos funcionários do Biotério do LTF em especial ao técnico e amigo Crispim pelo fornecimento dos animais, apoio técnico e competência; Aos docentes do curso de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos pelo respeito, amizade e conhecimentos transmitidos; A todos os colegas do curso de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos pelo respeito e amizade; A Tânia Maria Alves de Araújo, secretária da Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos da UFPB, pela eficiência e amizade incondicional. À Universidade Estadual da Paraíba (UEPB) em especial ao Departamento de Farmácia, pelo incentivo e investimento na qualificação e aperfeiçoamento do seu corpo docente, proporcionando minha liberação para a capacitação docente; Ao Programa de Qualificação Institucional da CAPES através do convênio firmado entre a UFPB/UEPB, que me deu esta oportunidade; A CAPES pelo apoio financeiro e pelo suporte técnico-científico através do Portal Periódicos A todos que direta ou indiretamente participaram da produção deste trabalho;

O meu muito obrigada!

Vanda Lucia dos Santos

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RESUMO

O gênero Maytenus (Celastraceae), comumente utilizado no tratamento de úlceras gástricas e dispepsia, é quimicamente caracterizado pela presença de metabólitos fenólicos como taninos, triterpenos e flavonóides. A espécie Maytenus rigida Mart., popularmente conhecida como “bom-nome”, “chapéu de couro” ou “pau-de-colher”, ocupa áreas da caatinga e agreste de Sergipe, Pernambuco e Paraíba, sendo utilizada na medicina tradicional como analgésica, antiinflamatória e para distúrbios gastrintestinais. Este estudo teve como objetivo investigar a atividade antiulcerogênica, antidiarréica e espasmolítica do extrato etanólico (EEOH) e a fase acetato de etila (AcOEt) obtidos da entrecasca do caule de M. rigida. Os testes antiulcerogênicos foram realizados usando os agentes lesivos HCl/etanol, estresse e antiinflamatório não esteroidal (AINE) em camundongos e etanol em ratos. No modelo HCl/etanol o EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) reduziu o índice de lesão ulcerativa (ILU) em 44, 70 e 78 %, respectivamente. O EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou a F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg) no modelo de etanol, inibiram o ILU em 52, 87, 95 % e 47, 81, 87 %, respectivamente. Resultados similares foram observados em modelo de úlcera induzida por estresse, em que a inibição do ILU foi 65, 86, 89 % e 60, 80, 87 % para EEOH e F. AcOEt, respectivamente, ou por AINE com inibição de 55, 81, 94 % e 41, 69, 80 % para EEOH e fase respectivamente. Em ratos com ligadura do piloro, o EEOH e a F. AcOEt não alteraram os parâmetros bioquímicos do suco gástrico. No modelo de úlcera induzida por ácido acético 30 %, o tratamento crônico com a fase promoveu cicatrização da úlcera (52 % de cicatrização). Na pespectiva de elucidação do mecanismo de ação envolvido no efeito citoprotetor, os dados mostram que a F. AcOEt induziu aumento da produção de muco gástrico dependente do óxido nítrico (NO); que envolve a participação dos compostos sulfidrilas; porém, o aumento da produção de muco independe da via das prostaglandinas uma vez que M. rigida não elevou os níveis de PGE2. Na avaliação da atividade antidiarréica, o EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) e a fase (125, 250 ou 500 mg/kg) inibiram em 32, 68, 80 e 40, 55, 73 %, respectivamente, a diarréia induzida por óleo de rícino e o trânsito intestinal normal em 24, 35, 37 % e 23, 33, 37 %, respectivamente, e o trânsito induzido por óleo de rícino em 43 e 42 % para EEOH (500 mg/kg) e fase (250 mg/kg), respectivamente. Na avaliação do efeito antiespasmódico, tanto o EEOH quanto a fase relaxaram o íleo de cobaia pré-contraído com KCl com valores de CE50=39,4±12,6 e 22,0±5,3 µg/mL, respectivamente, ou com carbacol com valores de CE50=11,6±2,5 e 16,6±4,4 µg/mL, para EEOH e fase, respectivamente. Estes dados indicam uma ação citoprotetora gástrica de M. rigida dependente da liberação de muco, da via do NO e com participação dos grupamentos sulfidrila, além de atividade antidiarréica e antiespasmódica, dando suporte a utilização desta espécie pela população nos transtornos gastrintestinais. Palavras-chave: Úlcera gástrica, Maytenus rigida, gastroproteção, atividade antidiarréica, atividade antiespasmódica

Avaliação da atividade antiulcerogênica, antidiarréica e antiespasmódica do extrato etanólico bruto e fase acetato de etila obtidos da entrecasca do caule de Maytenus rigida Mart. (Celastraceae) em modelos animais

SANTOS, V.L. Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,

Tese de Doutorado, LTF/CCS/UFPB (2008)

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ABSTRACT

The genus Maytenus (Celastraceae), commonly used for the treatment of gastric ulcers and dyspepsia, is chemically characterized by the presence of phenolic metabolites as condensed tannins, triterpenes and flavonoids. The species Maytenus rigida Mart., popularly known as “bom-nome, “chapéu de couro” or “pau de colher”, occupies areas of “caatinga” and “agreste” from Sergipe, Pernambuco and Paraíba, are used in traditional medicine as analgesic, gastrointestinal disorders and anti-inflammatory. This study aims to investigate the antiulcerogenic, antidiarrheal and antispasmodic activities from the ethanol extract (EEOH) and the ethyl acetate phase (AcOEt) obtained from the stem bark of M. rigida. The antiulcer assays were performed using the following protocols: HCl/ethanol, stress and nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) in mice, and ethanol in rats. In the HCl/ethanol-induced ulcer model, the EEOH (250, 500 or 750 mg/kg) significantly reduced the ulcerative lesion index (ULI) in 44, 70 and 78 % respectively. The EEOH (250, 500 or 750 mg/kg) or AcOEt phase (125, 250 or 500 mg / kg) in the ethanol-induced ulcer model, inhibited respectively the ULI in 52, 87, 95 % and 47, 81, 87 %. Similar results were observed in the stress-induced ulcer model, where the inhibition of ULI were 65, 86, 89 % and 60, 80, 87 % for EEOH and AcOEt phase respectively, or AINE with inhibition of 55, 81 94 % and 41, 69, 80 % for EEOH and phase respectively. In rats with pylorus ligation, neither the EEOH (500 mg / kg) nor the AcOEt phase (250 mg / kg) (id) changed biochemical parameters of gastric juice. In the model of ulcer induced by 30% acetic acid, chronic treatment with the phase promoted healing of the ulcer (healing of 52%). In the elucidation of the mechanisms of action involved in the cytoprotectant effect, the data show that the AcOEt phase (250 mg/kg) induced increased production of gastric mucus depending on the nitric oxide (NO); involving the participation of the sulphydryl compound; but the increased production of mucus independent of the via of prostaglandins since M. rigida was unable to raise the levels of PGE2. In assessing the antidiarrheal activity, the EEOH (250, 500 or 750 mg/kg) or phase (125, 250 or 500 mg/kg) inhibited in 32, 68, 80 and 40, 55, 73% respectively, the castor oil-induced diarrhea and normal intestinal transit in 24, 35, 37% and 23, 33 and 37% respectively, and castor oil-induced transit in 43 and 42% for EEOH (500 mg/kg) and phase (250 mg / kg) respectively. In assessing the antispasmodic activity, both the EEOH (0.1 - 500 µ g/ml) and AcOEt phase (0.1 - 500 µg/ml) concentration-dependently and significantly relaxed the guinea pig ileum pre-contracted with KCl 40 mM with values of EC50 = 39,4 ± 12,6 µg/mL and EC50 = 22,0 ± 5,3 µg/mL, for EEOH and phase respectively, or with carbachol 10-6 M with values of EC50 = 11,6 ± 2,5 µg/mL and EC50 = 16,6 ± 4,4 µg/ml, for EEOH and phase respectively. These data collectively suggest a cytoprotectant gastric action of M. rigida dependent on the release of mucus, on the NO path and with participation of non-protein sulphydryl groups, besides they indicate antidiarrheal and antispasmodic activities, supporting the use of this species by the population for gastrointestinal disorders. Key-words: gastric ulcer, Maytenus rigida, gastroprotetion, antidiarrheal activity, antispasmodic activity.

Evaluation of the antiulcerogenic, antidiarrheal and antispasmodic activities of crude extract ethanol and ethyl acetate phase obtained from the stem bark of Maytenus rigida Mart. (Celastraceae) in animals models

SANTOS, V.L. Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,

Tese de Doutorado, LTF/CCS/UFPB (2008)

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1-

Tabela 2-

Tabela 3-

Tabela 4-

Tabela 5-

Tabela 6-

Tabela 7-

Tabela 8-

Tabela 9-

Tabela 10-

Composição da solução de Krebs modificado.........................

Efeito da administração oral do EEOH de M. rigida ou

lansoprazol nas lesões gástricas induzidas por HCl/etanol

em camundongos ...................................................................

Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.

rigida ou lansoprazol nas lesões gástricas induzidas por

etanol em ratos........................................................................

Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.

rigida ou cimetidina nas lesões gástricas induzidas por

estresse em camundongos......................................................

Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.

rigida ou cimetidina nas lesões gástricas induzidas por

piroxicam em camundongos ...................................................

Efeito da administração intraduodenal do EEOH e F. AcOEt

de M. rigida ou cimetidina sobre os parâmetros bioquímicos

do suco gástrico no modelo de ligadura do piloro em ratos ...

Efeito da administração oral da F. AcOEt de M. rigida ou

cimetidina por 14 dias consecutivos sobre o peso corporal e

dos órgão de ratos com úlcera induzida por ácido acético......

Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.

rigida ou loperamida na diarréia induzida por óleo de rícino

em camundongos ...................................................................

Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.

rigida ou atropina no trânsito intestinal de ratos .....................

Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.

rigida ou atropina no trânsito intestinal induzido por óleo de

rícino em ratos ........................................................................

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1-

Figura 2-

Figura 3-

Figura 4-

Figura 5-

Figura 6-

Figura 7-

Figura 8-

Figura 9-

Figura 10-

Figura 11-

Úlcera péptica: (A) úlcera esofágica, (B) úlcera gástrica e (C)

úlcera duodenal .........................................................................

Secreção do ácido gástrico pelas células parietais, mediado

por mecanismos neurócrino (ACh), parácrino (Histamina) e

endócrino (Gastrina), e inibição da secreção por

somatostatina e prostaglandina ................................................

Mecanismo da injúria da mucosa gástrica causada pela

inibição da COX ........................................................................

Tratamento da úlcera péptica ....................................................

Árvore adulta de Maytenus rigida Mart. (A) e em detalhes

frutos e folhas (B) e caule (C) ...................................................

Marcha fitoquímica para obtenção do EEOH e a F. AcOEt de

Maytenus rigida Mart. ................................................................

Ilustração da indução da úlcera com ácido acético 30 % .........

Estômagos de ratos tratados com solução salina 0,9 %/

solução salina 0,9 % (A), solução salina 0,9 %/EEOH (B),

solução salina 0,9 %/F. AcOEt (C), L-NAME/solução salina

0,9 % (D), L-NAME /EEOH (E) e L-NAME /F. AcOEt (F)...........

Estômagos de ratos tratados com solução salina 0,9 %/

solução salina 0,9 % (A), solução salina 0,9 %/EEOH (B),

solução salina 0,9 %/F. AcOEt (C), NEM/ solução salina 0,9 %

(D), NEM/EEOH (E) e NEM/F. AcOEt (F) ................................

Registros originais do efeito relaxante do EEOH de M. rigida

sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (A)

e 10 mM de carbacol (B) em íleo isolado de cobaia .................

Registros originais do efeito relaxante da F. AcOEt de M.

rigida sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de

KCl (A) e 10 mM de carbacol (B) em íleo isolado de cobaia ....

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LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1-

Gráfico 2-

Gráfico 3-

Gráfico 4-

Gráfico 5-

Gráfico 6-

Gráfico 7-

Efeito da administração oral da F. AcOEt de M. rigida ou

cimetidina, durante 14 dias, no modelo de indução de úlcera

gástrica por ácido acético 30% em ratos ..................................

Efeito do tratamento agudo com F. AcOEt de M. rigida ou

carbenoxolona no conteúdo de muco aderido à mucosa

gástrica em ratos ......................................................................

Efeito do tratamento com a F. AcOEt de M. rigida nos níveis

de PGE2 em ratos .....................................................................

Efeito da administração oral do EEOH, F. AcOEt de M. rigida

ou carbenoxolona na úlcera gástrica induzida por etanol em

ratos pré-tratados com L-NAME .........................................

Efeito da administração oral do EEOH, F. AcOEt de M. rigida

ou carbenoxolona na úlcera gástrica induzida por etanol em

ratos pré-tratados com NEM .....................................................

Efeito do EEOH de M. rigida sobre as contrações tônicas

induzidas por 40 mM KCl (■) ou 10 - 6 M de carbacol (□) em

íleo isolado de cobaia................................................................

Efeito da F. AcOEt de M. rigida sobre as contrações tônicas

induzidas por 40 mM KCl (■) ou 10 - 6 M de carbacol (□) em

íleo isolado de cobaia................................................................

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µg/mL = micrograma por mililitro

ACh = Acetilcolina

AcOEt = Acetato de Etila

AINE = Antiinflamatório Não Esteroidal

ALU = Área de Lesão Ulcerativa

AMPc = Monofosfato cíclico de adenosina

ATP = Trifosfato de adenosina

bFGF = Fator de crescimento do fibroblasto b

Ca2+ = Íon cálcio

CaCl2.2H2O = Cloreto de cálcio di-hidratado

CCK = colecistocinina

CCK2 = receptor de colecistocinina 2

CEMIB = Centro de bioterismo da UNICAMP

CEPA = Comitê de Ética em Pesquisa Animal

CGRP = Peptídio relacionado ao gene da calcitonina

Cl- = Íon cloreto

cNOS = Sintase do óxido nítrico constitutiva

COX = Enzima cicloxigenase

COX-1 = Cicloxigenase 1

COX-2 = Cicloxigenase 2

d.p. = Desvio Padrão

DL50 = Dose letal 50 %

ECL = Células enterocromafins “like”

EEOH = Extrato etanólico

EGF = Fator de crescimento epidérmico

EROs = Espécies reativas de oxigênio

g = Grama

Gi = Proteína G inibidora da ciclase de adenilil

GMPc = Guanosina monofosfato cíclico

GPx = Glutationa peroxidase

GR = Glutationa redutase

Gs = Proteína G estimulatória da ciclase de adenilil

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GS = grupamento sulfidrila

GSH = Glutationa reduzida

GSSG = Glutationa oxidada

H. pylori = Helicobacter pylori

H+ = Próton

H+,K+-ATPase = Bomba de prótons

H2O2 = Peróxido de hidrogênio

HCl = Ácido clorídrico

HCO3- = Íon bicarbonato

HGF = Fator de crescimento do hepatócito

ICAM-1 = Molécula de adesão intercelular 1

i.p. = Intraperitoneal

ILU = Índice de Lesão Ulcerativa

IMCs = Contrações migratórias interdigestivas

iNOS = Sintase do óxido nítrico induzida

IP3 = 1,4,5-trifosfato de inositol

K+ = Íon potássio

kg = Quilograma

LABETOX = Laboratório de Ensaios Toxicológicos

L-NAME = NG-nitro-L-arginina metil-ester

LTC4 = Leucotrieno C4

LTF = Laboratório de Tecnologia Farmacêutica “Prof. Delby Fernandes de

Medeiros”

mg = Miligrama

mL = Mililitro

mM = Milimol

mm2 = Milímetro quadrado

NANC = Não adrenérgico não colinérgico

NaOH = Hidróxido de sódio

NAP = Peptídio natriurético atrial

NEM = N-ethyl–maleimide

NO = Óxido nítrico

NOS = Sintase óxido nítrico

O2••••- = Ânion superóxido

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OMS = Organização Mundial de Saúde

PG = Prostaglandina

PKA = Proteína cinase dependente de AMPc

PPIs = Inibidores da bomba de prótons

r.p.m. = rotação por minuto

SH = grupamento sulfidrila

SNAP = Proteína associada a sinaptossoma

SNAREs = soluble NSF attachment receptor

SNC = Sistema Nervoso Central

SOD = Superóxido desmutase

TGFββββ = Fator de crescimento tumoral beta

TGI = Trato gastrintestinal

TRH = Hormônio leberador de tirotropina

TSH = Hormônio estimulante da tireóide

UFPB = Universidade Federal da Paraíba

UNICAMP = Universidade Estadual de Campinas

v.o. = Via oral

VAMP = Proteína de membrana associada à vesícula

VEGF = Fator de crescimento endotélio vascular

VIP = Peptídeo vasoativo intestinal

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.....................................................................................

1.1 Considerações Gerais.........................................................................

1.2 Úlcera péptica......................................................................................

1.2.1 Secreção gástrica.............................................................................

1.2.2 Controle da secreção gástrica..........................................................

1.2.3 Fatores Agressores..........................................................................

1.2.4 Fatores protetores............................................................................

1.2.5 Terapêutica da úlcera péptica..........................................................

1.3 Espécie vegetal selecionada para o estudo........................................

1.3.1 Maytenus rigida Mart........................................................................

2 OBJETIVOS.........................................................................................

2.1 Objetivo geral......................................................................................

2.2 Objetivos específicos..........................................................................

3 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................

3.1 Locais da pesquisa.............................................................................

3.2 Animais...............................................................................................

3.3 Espécie vegetal...................................................................................

3.4 Substâncias utilizadas.........................................................................

3.5 Solução nutritiva..................................................................................

3.6 Preparação da solução-estoque do EEOH e da F. AcOEt de

Maytenus rigida Mart., utilizada nos testes “in vitro”.................................

3.7 Aparelhagem.......................................................................................

3.8 Avaliação da atividade toxicológica de Maytenus rigida ....................

3.8.1 Triagem farmacológica comportamental e determinação da DL50 ..

3.9 Avaliação da atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida..............

3.9.1 Lesões gástricas induzidas por HCl/etanol......................................

3.9.2 Lesões gástricas induzidas por etanol.............................................

3.9.3 Lesões gástricas induzidas por estresse (imobilização e frio)........

3.9.4 Lesões gástricas induzidas por antiinflamatório não esteroidal

(piroxicam).................................................................................................

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3.9.5 Avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico no

modelo de ligadura do piloro.....................................................................

3.9.6 Lesão gástrica induzida por ácido acético 30 %..............................

3.10 Avaliação dos mecanismos de ação citoprotetores envolvidos na

atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida.........................................

3.10.1 Determinação de muco aderido à parede gástrica........................

3.10.2 Determinação da prostaglandina E2 (PGE2)..................................

3.10.3 Avaliação da participação do óxido nítrico ....................................

3.10.4 Avaliação da participação dos grupamentos sulfidrila..................

3.11 Avaliação da atividade antidiarréica e antimotilidade intestinal de

Maytenus rigida.........................................................................................

3.11.1 Diarréia induzida por óleo de rícino................................................

3.11.2 Trânsito intestinal normal...............................................................

3.11.3 Trânsito intestinal induzido por óleo de rícino...............................

3.12 Avaliação da atividade antiespasmódica de Maytenus rigida..........

3.12.1 Efeito do EEOH e da F. AcOEt sobre as contrações tônicas

induzidas por KCl ou carbacol em íleo isolado de cobaia.........................

3.13 Análise estatística.............................................................................

4 RESULTADOS....................................................................................

4.1 Avaliação da atividade toxicológica de Maytenus rigida.....................

4.1.1 Triagem farmacológica comportamental e determinação da DL50...

4.2 Avaliação da atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida..............

4.2.1 Lesões gástricas induzidas por HCl/etanol......................................

4.2.2 Lesões gástricas induzidas por etanol.............................................

4.2.3 Lesões gástricas induzidas por estresse (imobilização e frio).........

4.2.4 Lesões gástricas induzidas por antiinflamatório não esteroidal

(piroxicam).................................................................................................

4.2.5 Avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico no

modelo de ligadura do piloro.....................................................................

4.2.6 Lesão gástrica induzida por ácido acético 30 %..............................

4.3 Avaliação dos mecanismos de ação citoprotetores envolvidos na

atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida.........................................

4.3.1 Determinação do muco aderido à parede gástrica..........................

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4.3.2 Determinação da prostaglandina E2 (PGE2)....................................

4.3.3 Avaliação da participação do óxido nítrico (NO)..............................

4.3.4 Avaliação da participação dos grupamentos sulfidrila (SH).............

4.4 Avaliação da atividade antidiarréica de Maytenus rigida....................

4.4.1 Diarréia induzida por óleo de rícino.................................................

4.4.2 Trânsito intestinal normal.................................................................

4.4.3 Trânsito intestinal induzido por óleo de rícino..................................

4.5 Avaliação da atividade antiespasmódica de Maytenus rigida.............

4.5.1 Efeito do EEOH ou F. AcOEt sobre as contrações tônicas

induzidas por KCl ou por carbacol em íleo isolado de cobaia..................

5 DISCUSSÃO........................................................................................

6 CONCLUSÕES....................................................................................

7 PERSPECTIVAS..................................................................................

REFERÊNCIAS.........................................................................................

APÊNDICES.............................................................................................

Apêndice 1- Pharmacological studies of ethanolic extracts of Maytenus

rigida Mart (Celastraceae) in animal models………………………………..

Apêndice 2- Carta de submissão do artigo “Evaluation of the

antiulcerogenic activity obtained from the extract ethanolic of Maytenus

rigida Mart. in rodents”...............................................................................

ANEXOS...................................................................................................

Anexo 1- Protocolo experimental para triagem farmacológica

comportamental .......................................................................................

Anexo 2- Certidão de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa

Animal do LTF/UFPB................................................................................

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19

1 INTRODUÇÂO

1.1 Considerações gerais

Nos últimos 25 anos, poucas áreas de pesquisas têm progredido tão

rapidamente na América Latina quanto a de produtos naturais, em especial a

de plantas medicinais. Cerca de 30 % de todas as substâncias disponíveis

como agentes terapêuticos são produtos obtidos de naturais ou derivados

deles (CALIXTO, 2005).

O Brasil detém a maior biodiversidade do mundo, contando com uma

rica flora, a qual se estima existir aproximadamente 55 mil espécies vegetais,

que desperta grande interesse na comunidade científica de todo o mundo para

o estudo, conservação e utilização destes recursos, estando entre os

elementos favoráveis ao desenvolvimento de novos medicamentos (OMENA,

2007; NOLDIN ISAIAS; CECHINEL FILHO, 2006; SOUZA; FELFILI, 2006).

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), 65 a 80 % da

população, principalmente em países em desenvolvimento, usam como

medicamentos extratos ou porções oriundas de plantas para tratar suas

enfermidades, devido à falta de recursos e o difícil acesso à medicina moderna

(CALIXTO, 2005).

Nos últimos anos tem havido um movimento de retorno ao uso dos

produtos naturais para fins terapêutico, cosmético e alimentar, principalmente

pelos efeitos colaterais provocados pelos fármacos sintéticos; por serem a

única fonte de medicamento especialmente em lugares isolados; e por

apresentarem moléculas potencialmente ativas, uma vez que já são

conhecidos cerca de 50.000 metabólitos secundários isolados de plantas,

muitos deles ainda sem qualquer avaliação quanto ao seu potencial terapêutico

(MONTANARI; BOLZANI, 2001; OMENA, 2007). Outro fator de destaque na

utilização crescente de produtos à base de plantas medicinais é a vigente

carência de recursos dos serviços de saúde e os elevados preços dos

medicamentos industrializados. No entanto, pela facilidade de obtenção e pelo

despreparo de quem as utiliza, são facilmente observados casos de intoxicação

com plantas medicinais (PARENTE; ROSA, 2001).

20

O processo de seleção da planta é de grande importância para o

sucesso de um estudo farmacológico. Os três principais tipos de abordagens

para seleção das espécies vegetais a serem farmacologicamente pesquisadas

são: abordagem randônica – escolha realizada de forma aleatória, tendo como

fator determinante a disponibilidade da planta; abordagem quimiotaxonômica

ou filogenética – seleção pelo conhecimento de uma dada classe química de

substâncias em um gênero ou família; abordagem etnofarmacológica – seleção

de acordo com o uso terapêutico evidenciado por um determinado grupo

étnico, com maior probabilidade de descobrir novas substâncias bioativas

(MACIEL et al, 2002 SCHMEDA-HIRSCHMANN; YESILADA, 2005; AGRA et

al., 2007).

As plantas medicinais representam assim, um elo entre a comunidade

tradicional e a comunidade científica, ocorrendo o compartilhamento de

informações e interesses buscando o desenvolvimento e aprimoramento das

políticas de saúde (CALIXTO, 2000).

Tratar a sintomatologia da úlcera péptica ou gastrite com plantas

medicinais é uma prática comum na medicina tradicional em todo o mundo

(SCHMEDA-HIRSCHMANN; YESILADA, 2005) e seguindo esse princípio, esse

trabalho visa contribuir para o uso seguro de plantas medicinais, pela pesquisa

científica com metodologias padronizadas, para a validação das plantas com

atividade sobre o trato gastrintestinal.

1.2 Úlcera péptica

A úlcera péptica é caracterizada por lesões severas compostas de

pontos hemorrágicos e necrotizantes que se estende pela da camada muscular

até a mucosa (KONTUREK; KONTUREK; BRZOZOWSKI, 2005). É geralmente

considerada como resultado do desequilíbrio entre os mecanismos de defesa

da mucosa gastroduodenal como muco, íon bicarbonato (HCO3-),

prostaglandinas (PGs), e os fatores prejudiciais da mucosa como etanol,

antiinflamatório não esteroidal (AINE), ácido clorídrico (HCl), secreção de

pepsinogênio, sendo uma afecção crônica e recorrente considerada como a

mais predominante das doenças gastrintestinais (MILANI; CALABRO, 2001;

KONTUREK; KONTUREK; BRZOZOWSKI, 2005).

21

A lesão pode está localizada na mucosa esofágica (úlcera esofágica), no

estômago (úlcera gástrica) ou na primeira porção do intestino delgado (úlcera

duodenal) (Figura 1) (PRADOS; MIGUEL, 2004).

(A) (B) (C)

Figura 1- Úlcera péptica: (A) úlcera esofágica, (B) úlcera gástrica e (C) úlcera duodenal. (www.gastroendo.com.br/gastroendo/index.php.op.; www.fluvium.org/imagenes/UlceraDuodeno.jpg.) acesso 12/12/2007

A úlcera gástrica acomete cerca de 5 % da população mundial, porém é

mais freqüente nos países orientais, especialmente no Japão, enquanto que a

úlcera duodenal é mais freqüente em populações ocidentais

(BANDYOPADHYAY et al., 2001; YUAN; PADOL; HUNT, 2006).

O sexo masculino é mais susceptível ao desenvolvimento das úlceras

pépticas, com uma proporção entre este sexo e o feminino para as duodenais

de cerca de 3:1, enquanto que para as gástricas é de 1,5:1 a 2:1. As mulheres,

são geralmente mais acometidas durante ou após a menopausa (CRAWFORD,

2000).

Os sinais e sintomas mais freqüentes associados à úlcera péptica são

sensação de mal estar, acidez estomacal, náusea e vômitos, podendo haver

complicações como hemorragia digestiva (rompimento dos vasos sanguíneos),

perfuração (rompimento da parede gastrintestinal) e a estenose (cicatriz

produzida em úlceras antigas provocando estreitamento do intestino)

(PRADOS; MIGUEL, 2004).

É consenso entre diferentes grupos de pesquisadores, que a presença

exacerbada de ácido é nocivo à mucosa gástrica, sendo este ácido o principal

agente responsável pela maioria dos processos patológicos que afetam o

estômago, o esôfago e o duodeno (PRADOS; MIGUEL, 2004).

22

1.2.1 Secreção gástrica

O suco gástrico é composto de muco fluido, eletrólitos, HCO3-, HCl,

pepsinogênio e fator intrínseco, sendo a secreção de HCl o principal

componente parietal do suco gástrico (HERSEY; SACHS, 1995; KONTUREK;

KONTUREK; OCHMANSKI, 2004).

O passo final na secreção ácida gástrica inclui a extrusão de prótons

(H+) e íons cloreto (Cl-) pela membrana apical da célula parietal. (GEIBEL,

2005; SCHUBERT, 2006). Nas células parietais em repouso, a bomba de

H+,K+-ATPase é armazenada em tubulovesículas citoplasmáticas na forma

inativa. Quando esta célula é estimulada, ocorre um aumento nos níveis de

segundos mensageiros, que aciona a translocação da bomba a partir destas

vesículas para invaginações na membrana apical da célula, ativando-a e

permitindo a troca de H+ por potássio (K+), utilizando energia proveniente da

hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP). Ao mesmo tempo, Cl- entram nos

canalículos secretórios a partir do citoplasma por transporte passivo (SACHS et

al, 1995; MÖSSNER; CACA, 2005).

A translocação da H+,K+-ATPase é regulada por proteínas como os

membros da família Rab (Rab 11 e Rab 25) e receptores de ligação ao fator

sensível à N-etilmaleimida solúvel (SNAREs): sintaxina, proteína associada a

sinaptossoma 25 (SNAP 25) e proteína de membrana associada à vesícula 2

(VAMP-2), que desempenham papel crucial no transporte e na fusão,

respectivamente, das vesículas (SCHUBERT, 2006).

O ácido gástrico auxilia na digestão (solubiliza alimentos e mantem o pH

ideal para a função da enzima pepsina), ajuda na absorção de íons ferro, cálcio

(Ca2+) e vitamina B12, além de impedir o crescimento de bactérias e as

infecções entéricas (HOU, SCHUBERT, 2006). Sua regulação é complexa e

envolve vias neural, hormonal, parácrina e endócrino (KONTUREK;

KONTUREK; OCHMANSKI, 2004; SCHUBERT, 2006).

1.2.2 Controle da secreção gástrica

As células oxínticas ou parietais, medeiam a secreção de HCl no

estômago, pela secreção de acetilcolina (ACh), gastrina, histamina (YAO;

23

FORTE, 2003), somatostatina, PGs, peptídeo natriurético atrial (NAP),

colecistocinina (CCK) e o peptídeo vasoativo intestinal (VIP) (WALDUM;

BRENNA; SANDVIK, 1998; SCHUBERT, 2003; YAO, FORTE, 2003). Estes

três últimos têm grande importância na liberação parácrina de somatostatina no

antro e no fundo do estômago (YAO, FORTE, 2003; HOU; SCHUBERT, 2006).

A ACh interage com receptores muscarínicos M3 expressos nas células

parietais, G e enterocromafins “like” (ECL). Estes receptores são acoplados a

proteína Gq/11 que quando ativados induzem a formação de inositol 1,4,5-

trifosfato e diacilglicerol via fosfolipase C, favorecendo aumento na

concentração de Ca2+ intracelular, fundamental na liberação de gastrina e

histamina pelas células G e ECL, respectivamente. Na célula parietal o

aumento do Ca2+ intracelular, ativa a proteína cinase C que promove a fusão da

H+,K+- ATPase com a membrana apical destas células, favorecendo a liberação

de H+ do interior da célula parietal para o lúmen gástrico (CAULFIELD;

BIRDSALL, 1998; AIHARA et al., 2005) (Figura 2).

Figura 2- Secreção do ácido gástrico pelas células parietais, mediado por

mecanismos neurócrino (ACh), parácrino (Histamina) e endócrino (Gastrina), e

inibição da secreção por somatostatina e prostaglandina (Modificado de

RAFFA; RAWLS; BEYZAROV, 2006),

A gastrina, liberada pelas células G da mucosa antral, estimula a

secreção gástrica por ação direta nos receptores CCK-2 presentes nas células

SSoommaattoossttaattiinnaa

PPrroossttaaggllaannddiinnaa

24

parietais, via proteína Gq/11, semelhante à ação da ACh. Indiretamente a

gastrina estimula a produção (ao aumentar a atividade da enzima histidina

descarboxilase), estocagem e liberação de histamina pelas células ECL ao

ativar receptores CCK-2 presentes nestas células (Figura 2). Esta última é a

principal via da estimulação da secreção ácida gástrica produzida pela gastrina.

A gastrina também aumenta indiretamente a secreção de pepsinogênio, fluxo

sanguíneo e a motilidade gástrica (HOU; SCHUBERT, 2006; CUI; WALDUM,

2007).

A histamina se difunde do seu local de liberação até a célula parietal

onde interage com receptores H2 presentes na membrana das células parietais

(Figura 2). Estes receptores acoplados a proteína estimulatória (Gs) ativam o

sistema adenilato ciclase- AMPc, levando a ativação da proteína cinase

dependente de AMPc (PKA) do tipo I, iniciando a cascata de eventos de

fosforilação. Estes eventos culminam com rearranjos na membrana e no

citoesqueleto da célula parietal e aumento na condutância elétrica através do

epitélio, promovendo ativação da H+,K+-ATPase. A histamina pode interagir

também com receptores H3 que “in vitro” estimula secreção de H+

possivelmente mediada pala inibição da somatostatina e “in vivo” por uma

possível ação nos receptores H3 no cérebro, exercendo efeito inibitório sobre a

secreção de H+ (YAO; FORTE, 2003; KONTUREK et al., 2004a).

A somatostaina produzida nas células D regula a secreção ácida por

ação direta sobre receptor SST2 acoplado à proteína inibitória (Gi), atenuando

a atividade da ciclase de adenilil. Indiretamente, a somatostatina impede a

formação do ácido por ação nas células G e ECL, suprimindo a liberação de

gastrina e histamina, respectivamente (LINDSTRÖM et al, 2001; SCHUBERT,

2003; YAO, FORTE, 2003; KONTUREK et al., 2004a; SCHUBERT, 2006).

Além do controle da secreção ácida, somatostatina pode também inibir o

peristaltismo gastintestinal, a secreção biliar, a proliferação celular e o fluxo

sanguíneo (SUN et al., 2002).

As PGs da série E são especialmente importantes na regulação da

secreção gástrica de ácido, pepsinogênio e muco (KATO et al., 2005).

25

1.2.3 Fatores agressores

O ácido gástrico não é o único responsável pelo aparecimento da lesão

na mucosa gástrica, outros irritantes chamados desestabilizadores da barreira

da mucosa gástrica agem pelo contato direto a exemplo do uso crônico de

AINEs, a bactéria Helicobacter pylori (H. pylori), o fumo, o álcool, e eventos

sistêmicos como estresse (GRACIOSO et al., 2002; KWIECIEN;

BRZOZOWSKI; KONTUREK, 2002 ).

Aproximadamente 15 – 30 % dos usuários regulares de AINEs

apresentam reações adversas, sendo o mais comum a úlcera gastroduodenal e

sangramento. A importância das PGs na defesa da mucosa é evidenciada pela

capacidade dos AINEs induzirem danos na mucosa gástrica, correlacionado

com a habilidade em suprimir a síntese de PGs gástricas (LICHTENBERGER,

2001; WALLACE, 2001).

A bactéria H. pylori é referida atualmente como responsável por 90 %

das úlceras duodenais e 80 % das úlceras gástricas. Em países desenvolvidos,

a infecção é menos comum do que nos países em desenvolvimento (LADEIRA;

SALVADOR; RODRIGUES, 2003; PRADOS; MIGUEL, 2004). Ela coloniza o

estômago de aproximadamente 50 % da população mundial, ao sintetizar

lipases e proteases que degradam a camada de muco (LADEIRA; SALVADOR;

RODRIGUES, 2003).

Os indivíduos com úlcera duodenal e infecção por H. pylori apresentam

diminuição da secreção de somatostatina e aumento na secreção de gastrina,

pela ação de citocinas como o interferon-γ liberado no infiltrado inflamatório

(SCHUBERT, 2006). Esta bactéria infecta o corpo do estômago resultando em

gastrite crônica, úlcera péptica e câncer gástrico, por promover alterações no

teor de vitamina C no suco gástrico, nos níveis de metabolitos reativos de

oxigênio nos tecidos e proliferação de células epiteliais, que são importantes na

patogênese do câncer gástrico (KARAMAN et al., 2008).

1.2.4 Fatores protetores

A mucosa gástrica é revestida por uma camada aderente e contínua de

muco viscoso, formado por 3 a 5 % de glicoproteínas como a mucina que lhe

26

confere a propriedade formadora de gel e viscosidade e 95 % de água com

pequenas quantidades de lipídeos, ácidos nucléicos e outras proteínas como

as imunoglobulinas (ALLEN; FLEMSTRÖM, 2005). O muco secretado pelas

células mucosas do colo, forma uma barreira física que separa a superfície das

células apicais do lúmem gástrico e junto com o HCO3- formam a primeira linha

de defesa contra o acesso de ácido luminal e pepsina (FLEMSTRÖM et al.,

1999; FLEMSTRÖM; ISENBERG, 2001; ALLEN; FLEMSTRÖM, 2005;

BRZOZOWSKI et al., 2005).

O bicarbonato é formado pela ação da enzima anidrase carbônica que

dissocia carbonato em HCO3- e H+ nas células epiteliais e parietais. Ele

mantém o pH na superfície mucosal próximo à neutralidade, gerando um

gradiente em que o pH na superfície da célula epitelial é consideravelmente

mais elevado que no lúmem gástrico (FLEMSTRÖM; ISENBERG, 2001;

ALLEN; FLEMSTRÖM, 2005).

O epitélio duodenal secreta HCO3- em velocidade maior que as demais

porções do intestino delgado distal, provavelmente devido a uma seletividade

de HCO3- pelos canais apicais nesta parte do intestino. Esta secreção é

aumentada por uma baixa no pH do lúmem duodenal, uma resposta mediada

por reflexos neurais (via VIP e ACh) e a produção mucosal de PGs por ação

direta nas células produtoras de HCO3-, via receptores EP3 duodenais e EP1

gástrico (ALLEN; FLEMSTRÖM, 2005).

As PGs são mediadores lipídeos sintetizados a partir do ácido

araquidônico, pela ação das enzimas cicloxigenases (COX) e liberadas por

estímulos químicos ou mecânico (SCHUSTER, 1998; BOTTING, 2006). A COX

existe em três isoformas, a COX-1, a COX-2 (VANE, et al., 1994) e a COX-3

que são catalisadoras da conversão do ácido araquidônico em PGs (VANE et

al., 1994; CHANDRASEKHARAN et al., 2002). A COX-1 é expressa

constitutivamente, sendo responsável pela geração de PGs envolvidas na

homeostasia, proteção da mucosa gástrica, regulação da hemodinâmica renal

e estimulação da agregação plaquetária (POONAM; VINAY; GAUTAM, 2005;

SAWATZKY; MEGSON; ROSSI, 2005). Já a COX-2 normalmente é encontrada

em níveis celulares baixos, tendo sua expressão induzida por citocinas,

mitógenos e endotoxinas de células inflamatórias e é responsável pela

produção elevada de PGs que ocorre durante o processo inflamatório

27

(SAWATZKY; MEGSON; ROSSI, 2005; BOTTING, 2006). A inativação das

COXs 1 e 2 resulta no dano gastrintestinal (Figura 3) (GRETZER et al., 1998;

BOTTING, 2006).

AINES

INIBIÇÃO DA COX1 INIBIÇÃO DA COX2

ESTIMULAÇÃO DA ICAM-1

ATIVAÇÃO DE NEUTRÓFILOS E

PRODUÇÃO DE RADICAL LIVRE

INJÚRIA MICROVASCULAR

FORMAÇÃO DA ÚLCERA

INIBIÇÃO DA PRODUÇÃO DE FATORES DE CRESCIMENTO

INIBIÇÃO DO MECANISMO DE REPAO EPITELIAL

INJÚRIA EPITELIAL

INIBIÇÃO DA BARREIRA MUCO/BICARBONATO

DANO DIRETO SOBRE A MUCOSA

Figura 3- Mecanismo da injúria da mucosa gástrica causada pela inibição da

COX. (GUDIS; SAKAMOTO, 2005).

A ação citoprotetora das PGs ocorre principalmente pelas PGs da série

E (PGE2) (BOTTING, 2006), como conseqüência de vários mecanismos:

apoptose de células inflamatórias – via receptores EP2 e EP4 (HOSHINO et al,

2003), aumento da produção de muco (receptores EP1 e EP4) e secreção de

bicarbonato gástrico e duodenal (receptores EP1 e EP3 respectivamente)

(TAKEUCHI et al., 1999; OHNISHI et al., 2001), inibição da motilidade gástrica

(receptor EP3), diminuição da secreção gástrica (receptor EP3) e aumento do

fluxo sanguíneo mucosal (receptor EP3)(KATO et al., 2005).

Outro fator importante na proteção da mucosa gástrica é o óxido nítrico

(NO), uma molécula gasosa gerada a partir do aminoácido L-arginina pela ação

da enzima sintase do óxido nítrico (NOS) (Figura 9). A NOS pode se apresentar

em duas isoformas: a constitutiva (cNOS) normalmente expressa em células e

tecidos normais, cuja expressão e atividade não é afetada no processo

inflamatório; e a induzível (iNOS) que é expressa de forma elevada na

inflamação aguda e crônica (GUO et al., 2003). O NO é um neurotransmissor

28

inibitório não adrenérgico não colinérgico (NANC) (GUO et al., 2003; TODA,

HERMAN, 2005) e apresenta dualidade: em baixas concentrações ele regula

funções homeostáticas, enquanto que em altas concentrações age como

molécula citotóxica (MARTIN; JIMÉNEZ; MOTILVA, 2001).

No músculo liso gastrintestinal, o NO promove relaxamento por

mecanismo direto ao ativar a enzima ciclase de guanilil solúvel que produz o

monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) e indiretamente por causar

hiperpolarização da membrana, diminuindo assim o peristaltismo e o

esvaziamento gástrico (TODA; HERMAN, 2005). Intervém também em outras

funções do trato gastintestinal (TGI) como inibição da secreção ácida,

regulação do fluxo sanguíneo mucosal, ajuda a manter a barreira muco-

bicarbonato e a integridade tecidual, apresenta atividade antioxidante ao

inativar espécies reativas de oxigênio (EROs) geradas pela injúria gástrica e

atividade antiinflamatória por inibir a adesão de leucócitos ao endotélio,

promover vasodilatação e hiperemia na área próxima a inflamação, assim

favorecendo o processo de cicatrização (MARTIN; JIMÉNEZ; MOTILVA, 2001).

Nos sistemas biológicos existem condições favoráveis para reações

oxidativas, pela existência de lipídeos insaturados nas membranas celulares e

pelas reações oxidativas que ocorrem no metabolismo normal, levando a

produção de radicais livres (RL) como as EROs. Porém, as células possuem

sistemas de equilíbrio entre a produção e a eliminação desses radicais.

Quando há um desequilíbrio entre o sistema pró-oxidante e o sistema

antioxidante, tem-se o estresse oxidativo que pode resultar na morte celular

(JORDÃO JUNIOR et al., 1998).

Os principais sistemas antioxidantes compreendem as vitaminas A, C e

E, glutationa reduzida (GSH), grupamentos sulfidrila livres e enzimas

antioxidantes - superoxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase

(GPx) e glutationa redutase (GR). As enzimas antioxidantes constituem o

principal mecanismo de defesa antioxidante intracelular, pois eliminam ânio

superóxido (O2•-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e hidroperóxidos que

poderiam oxidar os substratos celulares (ANTUNES NETO et al., 2007)

A glutationa é o tiol não protéico mais abundante. A capacidade padrão

de redução dos tióis intracelulares, particularmente a glutationa, mantém o

meio intracelular em estado reduzido. Este detém o estresse oxidativo por

29

reduzir H2O2 a água, tranformando-se em glutationa oxidada (GSSG), reação

esta catalizada pela glutationa peroxidase (TOUYZ, 2004).

A integridade da mucosa gástrica é mantida também por um contínuo

processo de morte e proliferação celular, que envolve a migração de células

cicatrizantes, do fator de crescimento epidérmico (EGF), do fator de

crescimento de fibroblasto b (bFGF), do fator de crescimento transfomante-β

(TGF-β) e do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), que além de

estimular a proliferação celular, podem afetar locomoção, contratilidade,

diferenciação celular e angiogênese (WALLACE; GRANGER, 1996; BISWAS et

al., 2003).

A microcirculação, localizada abaixo do epitélio, é responsável pelo

suprimento de oxigênio e nutrientes da mucosa gástrica e remoção, diluição e

neutralização de substâncias tóxicas. Quando a microvasculatura é danificada,

as células endoteliais iniciam o reparo e construção de uma nova rede

vascular. A resposta microcirculatória na defesa mucosal é mediada pelo

sistema nervoso extrínseco e intrínseco que liberam o peptídeo relacionado ao

gene da calcitonina (CGRP), que via liberação de NO promove vasodilatação

(TORNAWSKI, 1995; WALLACE; GRANGER, 1996; MARTIN; WALLACE,

2006).

1.2.5 Terapêutica da úlcera péptica

O tratamento da úlcera péptica (Figura 4) é freqüentemente dirigido para

a utilização de medicamentos que diminuam a acidez gástrica (anti-secretores),

fortaleçam as defesas mucosais do estômago e duodeno (citoprotetores),

erradicação da bactéria H. pylori e processos cirúrgicos (quando a úlcera é

hemorrágica, obstrutiva ou perfurativa) (LIPOF; SHAPIRO; KOZOL, 2006;

UMAMAHESWARI et al., 2006).

Inicialmente se acreditava que sem ácido não haveria úlcera. Assim a

inibição farmacológica do ácido passou a exercer papel dominante no

tratamento da úlcera péptica. Esta inibição pode ser realizada pela utilização de

substâncias que neutralizam a acidez ou que inibem a sua secreção.

Os antiácidos são capazes de neutralizar o ácido gástrico pela sua

natureza básica, com conseqüente elevação do pH gástrico. Apresentam

30

eficácia limitada, por isto seu uso tem diminuído nos últimos anos. Quando

utilizados em quantidades suficientes e por um período relativamente longo,

podem cicatrizar as úlceras duodenais, sendo menos eficazes na úlcera

gástrica. Os principais representantes são: os sais de alumínio e de magnésio.

Como os sais de magnésio causam diarréia e os de alumínio causam

constipação, são utilizados em associação para preservar a função intestinal

(MÖSSNER; CACA, 2005).

Figura 4- Tratamento da úlcera péptica (adaptado de RAFFA; RAWLS;

BEYZAROV, 2006).

Os anti-secretores são os agentes que inibem a secreção de ácido

gástrico. As principais classes de anti-secretores são: (1) antagonistas H2 que

agem pela ligação com os receptores H2 da histamina na célula parietal

impedindo a estimulação da secreção de ácido gástrico induzida pela

histamina, gastrina e ACh; a secreção de pepsina também diminui com a

redução no volume de suco gástrico. É frequente a ocorrência de recidivas

quando se interrompe o tratamento com estas drogas. Os principais

representantes são: cimetidina, ranitidina, famotidina e nizatidina; (2) inibidores

da bomba de prótons (PPIs) que são pró-fármacos e agem na etapa final da

secreção do ácido. São ativados pelo ácido e ligam-se irreversivelmente às

enzimas H+,K+-ATPase, bloqueando-as. Esta inibição é independente do modo

de estimulação da célula parietal. Apresenta como principais representantes:

31

omeprazol, lansoprazol, pantoprazol e rabeprazol (RANG et al., 2007;

MÖSSNER; CACA, 2005).

Com o avanço das pesquisas na área de úlcera se percebeu que as

lesões ulcerativas não ocorriam apenas pelo excesso de ácido, mas também

pela diminuição dos fatores protetores da mucosa. Hoje, é consenso que o

desequilíbrio entre fatores protetores e agressores exerce um papel importante

na integridade da mucosa e na patogenia da lesão (KONTUREK et al., 2004a),

passando-se então a utilização de drogas que aumentem esta defesa.

Os citoprotetores potencializam os mecanismos de proteção da mucosa

e/ou proporcionam uma barreira física sobre a superfície da úlcera. Ligam-se a

proteínas da matrix da mucosa gástrica, protegendo a lesão contra o ácido e a

pepsina. São exemplos: o sucralfato - complexo de alumínio e sacarose

sulfatada, que na presença de ácido libera o alumínio, adquire carga negativa e

liga-se a proteínas e glicoproteínas de carga positiva. Também estimula a

produção de PGs e a secreção de muco e bicarbonato; a carbenoxolona - um

derivado de produto natural retirado da raiz do alcaçuz, aumenta a produção de

muco; o misoprostol - um análogo das PGs I1, inibe secreção de ácido no

estado basal e em resposta ao alimento, histamina e gastrina, aumenta o fluxo

sanguíneo e a secreção de muco e bicarbonato (MÖSSNER; CACA, 2005;

RANG et al., 2007).

A infecção da mucosa gástrica pelo H. pylori é considerada hoje um

importante agente etiológico da úlcera péptica (CHOI et al., 2007). Para

erradicar esse microorganismo, utiliza-se uma combinação de antibióticos,

sendo a adesão ao tratamento um fator de suma importância, prevenindo a

recorrência da úlcera, pois restaura a capacidade da mucosa produzir

bicarbonato e manter a integridade (KONTUREK et al, 2004b). As combinações

mais utilizadas na clínica são dois antimicrobianos com PPIs, ou com

antagonista H2 ou quelatos de bismuto (MARMO, NETO, 2005; MÖSSNER;

CACA, 2005).

O grande alvo dos pesquisadores na atualidade é a busca de drogas

antiulcerogênicas mais eficazes, que apresentem menos efeitos colaterais e

menos índices de recidivas que as drogas existentes no mercado e os produtos

naturais são os principais alvos. Assim, extratos e princípios ativos originários

de plantas podem levar ao desenvolvimento de novas drogas, sendo

32

importante avaliá-los como alternativa às terapêuticas antiulcerogênica

consagradas e que não são livres de efeitos adversos e/ou provocar recidivas.

1.3 Espécie vegetal selecionada para o estudo

Na família Celastraceae são encontrados 88 gêneros e 1300 espécies

distribuídas principalmente em climas tropicais e subtropicais (SPIVEY,

WESTON; WOODHEAD, 2002). As folhas e a casca do caule de muitas

espécies de Celastraceae são utilizadas na medicina tradicional por suas

propriedades analgésica, antiinflamatória, antiulcerogênica entre outras

(CORRÊA, 1984).

Dentre os gêneros pertencentes a esta família, destaque é dado ao

gênero Maytenus que quimicamente é caracterizado pela presença de

metabólitos secundários como flavonóides, triterpenos, sesquiterpenos,

alcalóides e taninos condensados que podem justificar o uso popular

(BRUNING ; WAGNER, 1978; GONZÁLES et al., 1982; CHÁVEZ et al., 1997;

LEITE et al, 2001; JORGE et al, 2004; OLIVEIRA et al., 2006; TIBERT et al.,

2007).

Atualmente são conhecidas cerca de 80 espécies distribuídas em todo o

território brasileiro (JORGE et al, 2004; JOFFILY; VIEIRA, 2005), algumas

citadas na literatura por exercer atividade antiulcerogênica como a M. ilicifolia

(SOUZA-FORMIGONI et al, 1991; JORGE et al, 2004), M. truncata (SILVA et

al., 2005), M. aquifolium (SOUZA-FORMIGONI et al, 1991; GONZALEZ et al.,

2001) e M. robusta (ANDRADE et al, 2007).

1.3.1 Maytenus rigida Mart.

Maytenus rigida Mart. (Figura 5) popularmente conhecida como “bom-

nome”, “chapéu de couro” ou “pau-de-colher” é uma árvore de pequeno porte,

que apresenta cascas lisa fosca, cinza escuro manchado de cinza claro e

branco. Mantém a folhagem na época de estiagem, só a perdendo no rigor da

seca mais intensa. Ocupa áreas muito secas da caatinga e agreste de Sergipe,

Pernambuco e Paraíba. Ocorre em aglomerados e é de fácil reconhecimento

33

por suas folhas verde escuro contrastando com o cinza do seu caule

(ANDRADE-LIMA, 1989).

A entrecasca do seu caule faz parte da composição do vinho de jurema

utilizado nos cultos afro-indígenas (MOTA; ALBUQUERQUE, 2002) e de

acordo com a medicina tradicional o chá é utilizado para problemas renais,

como antiinflamatório, analgésico, cicatrizante, para gastrite, úlcera gástrica,

hipotensora, hepatoprotetora e antidiarréica (CARRICONDE, 2004).

Em levantamento de plantas medicinais do nordeste brasileiro, Agra et

al. (2007), citam a utilização popular do bom-nome para úlcera externa,

infecção e inflamação e câncer, na forma de decocto, infusão ou maceração.

Almeida et al. (2005) fazem referência ao uso popular desta espécie para

impotência sexual e reumatismo.

Figura 5- Árvore adulta de Maytenus rigida Mart. (A) e em detalhes frutos e

folhas (B) e caule (C) (Fotos cedidas por Dilma M. B. M. Trovão).

A

B C

34

Estudos fitoquímicos desta espécie mostram vários constituintes

químicos como: alcalóides com atividade inseticida (DELLE; MARINI;

BERNAYS, 1984), quinonas (ALMEIDA et al., 2005) triterpenos da série lupano

(OLIVEIRA et al., 1999; ALMEIDA et al., 2005) e n-Alcanos (OLIVEIRA,

SALATINO, 2000). Segundo Estevam (2006) no extrato alcoólico obtido da

entrecasca do caule de M. rigida foram determinados os seguintes

constituintes: lupeol (triterpeno), β-sitosterol (esteróide), ácido gálico (tanino),

epicatequina e 4-metil-epigalocatequina (flavonóides).

Estudos farmacológicos realizados com extratos obtidos de M. rigida

mostraram atividade antinociceptiva confirmando sua indicação popular (DIAS

et al. 2007), indícios de droga psicoativa, ou seja, estimulante do Sistema

Nervoso Central (SNC) no extrato aquoso (OMENA, 2007) e atividade

antioxidante dos extratos clorofórmio, acetato de etila e hidroalcoólico

(ESTEVAM, 2006).

Diante da necessidade de buscar novos produtos como alternativa

terapêutica no tratamento da úlcera gástrica e mediante as atividades

biológicas apresentadas pelos constituintes químicos já identificados nesta

espécie, além da atividade antiulcerogênica comprovada em outras espécies

pertencentes à família Celastraceae, Maytenus rigida Mart. foi selecionada para

estudo frente à atividade antiulcerogênica. O critério de escolha para a

utilização do extrato etanólico e fase acetato de etila obtidos de M. rigida, foi o

etnofarmacológico e quimiotaxonômico.

35

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

� Investigar a atividade antiulcerogênica, antidiarréica e

antiespasmódica de Maytenus rigida Mart. (Celastraceae), na

perspectiva de encontrar uma nova alternativa terapêutica.

2.2 Objetivos Específicos

� Realizar triagem farmacológica comportamental com o extrato

etanólico (EEOH) obtido da entrecasca do caule de M. rigida em

ratos e camundongos;

� Determinar a dose letal 50 % (DL50) do EEOH;

� Avaliar a atividade antiulcerogênica do EEOH e da fase acetato de

etila (AcOEt) em modelos clássicos de indução de úlcera gástrica em

ratos e camundongos;

� Definir a dose do extrato e da fase que produz o melhor efeito

antiulcerogênico;

� Avaliar os parâmetros bioquímicos da secreção gástrica mediante o

tratamento com o EEOH e com a F. AcOEt;

� Investigar os possíveis mecanismos de ação envolvidos com a

atividade antiulcerogênica pela produção de muco, prostaglandina,

óxido nítrico e compostos sulfidrila;

� Avaliar o efeito cicatrizante da F. AcOEt no modelo de indução de

úlcera por ácido acético 30 % em ratos;

36

� Avaliar os efeitos do EEOH e da F. AcOEt em modelo de atividade

antidiarréica em camundongos e sobre a motilitidade intestinal de

ratos.

� Investigar um possível efeito antiespasmódico do EEOH em íleo

isolado de cobaia.

37

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Locais da pesquisa

Este trabalho foi desenvolvido nos Laboratórios de Ensaios

Toxicológicos (LABETOX) e de Fisiologia Funcional Prof. Thomas George do

Laboratório de Tecnologia Farmacêutica Prof. Delby Fernades de Medeiros

(LTF) e no Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais da Universidade

Estadual de Campinas (UNICAMP), com o apoio financeiro da Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

3.2 Animais

Para a realização do presente trabalho foram utilizados ratos (Ratus

norvegicus, variedade Wistar) adultos, machos pesando entre 180 e 250 g,

camundongos (Mus musculus, variedade Swiss) adultos, de ambos os sexos

pesando entre 25 e 35 g e cobaias (Cavia porcellus) adultos, de ambos os

sexos pesando entre 300 e 500 g. Os animais foram fornecidos pelo Biotério

Prof. Thomas George do Laboratório de LTF/UFPB e do centro de Bioterismo

da Unicamp (CEMIB). Os animais foram mantidos em temperatura constante

(21 ± 2º C), com umidade relativa do ar entre 30 % e 70 %, ciclo claro-escuro

de 12 horas e tratados com água e alimentados com ração Purina tipo pellets

ad libitum.

Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética

em Pesquisa Animal-CEPA/LTF/UFPB sob protocolo nº 0513/05. Os

experimentos foram conduzidos de acordo com as normas internacionais para

o estudo com os animais de laboratório (ZIMMERNANN, 1983).

3.3 Espécie vegetal

O material botânico utilizado na investigação da atividade

antiulcerogênica em animais foi a entrecasca do caule de Maytenus rigida

Mart., coletada no município de Aroeira - Paraíba em 2004 e foi classificada

pela Dra. Maria de Fátima Agra, do Setor de Botânica do LTF da Universidade

38

Federal da Paraíba. Um exemplar desta espécie está depositado no Herbário

Lauro Pires Xavier da UFPB sob registro Agra et al. 3316 (JPB).

O extrato etanólico (EEOH) e a fase acetato de etila (AcOEt) obtidos da

entrecasca do caule de M. rigida, de acordo com a marcha fitoquímica de

extração (Figura 6), foram fornecidos pelos Profs. Drs. José Maria Barbosa

Filho e Maria de Fátima Vanderlei de Souza do LTF/UFPB.

Figura 6. Marcha fitoquímica para a obtenção do EEOH e a F. AcOEt de M.

rigida Mart..

3.4 Substâncias utilizadas

Para a realização dos experimentos, foram utilizadas as seguintes

substâncias: cloreto de sódio P.A. (QUIMEX-MERCK, Brasil), cimetidina

(SIGMA Chemical Co, EUA), lansoprazol 30 mg (ACHÉ, Brasil), carbenoxolona

(SIGMA Chemical Co, EUA), loperamida (Janssen Cilag Farmacêutica Ltda,

Brasil), atropina (SIGMA Chemical Co, EUA), etanol (MERCK, Alemanha),

piroxicam 20 mg (HEXAL, Brasil), óleo de rícino, N-etilmaleimida (SIGMA

Chemical Co, EUA), N-nitro-L-arginina-metil-éster (SIGMA Chemical Co, EUA),

hidróxido de sódio (QUIMEX-MERCK, Brasil), carvão ativado, fenoftaleína

(RIEDEL-DE HAËN, Alemanha), alcian blue (SIGMA Chemical Co, EUA) e

Material seco e pulverizado da casca do caule de M. rigida (3500 g)

Maceração em etanol (EtOH) a 95% (3x) Concentração em rotaevaporador à pressão reduzida

Obtenção do extrato etanólico bruto (EEOH) de M. rigida (491 g)

Hexano

Fase Hexânica (23 g) (4,7 %) Fase alcoólica 1

Clorofórmio

Fase Clorofórmica (12 g) (2,5 %)

Acetato de Etila

Fase Acetato de Etila (AcOEt - 244 g) (49,7 %)

Fase alcoólica 2

Fase alcoólica 3

39

goma arábica (Galênica, Brasil), ketamina (König do Brasil, Brasil), xilazina

(Vallée S/A, Brasil), cloridrato de carbamilcolina - carbacol (Merck, Alemanha),

cloreto de potássio (Reagen) e óleo de castor (Cremophor®) (Sigma-Aldrich). A

mistura carbogênica (95 % de O2 e 5 % de CO2) foi obtida da White Martins.

O EEOH, a F. AcOEt e demais substâncias foram solubilizados em

solução salina 0,9 % e preparadas imediatamente antes de cada experimento.

3.5 Solução nutritiva

Para os experimentos realizados in vitro foi utilizada a solução nutritiva

de Krebs modificada por Sun e Benishin (1994), cuja composição está descrita

na Tabela 1. O pH da solução era ajustado para os valores entre 7,2 e 7,4.

Quando a solução nutritiva era adicionada às cubas para órgãos isolados,

mantinha-se a temperatura de 37° C e aeração com carbogênio (95 % de O2 e

5 % de CO2).

Tabela 1 – Composição da solução de Krebs modificado (SUN; BENISHIN,

1994).

Substância Concentração (mM)

NaCl 117,0

KCl 4,7

MgSO4.7H2O 1,3

NaH2PO4.H2O 1,2

CaCl2.2H2O 2,5

Glicose 11,0

NaHCO3 25,0

40

3.6 Preparação da solução-estoque do EEOH e da F. AcOEt de Maytenus

rigida Mart., utilizada nos testes “in vitro”

O EEOH ou F. AcOEt foi solubilizado em Cremofor (3 %), essa solução

era diluída em água destilada até a concentração de 10 mg/mL e estocada a 0

°C, sendo novamente diluída em água destilada de acordo com a necessidade

de cada protocolo experimental. A concentração final de Cremofor nas cubas

nunca excedeu 0,01 % (V/V). Nesta concentração o Cremofor foi desprovido

de efeito contrátil ou relaxante no íleo isolado de cobaia.

3.7 Aparelhagem

Para registro das contrações isométricas o íleo foi suspenso em cubas

de vidro (6 mL) aquecidas à temperatura de 37° C por bombas termostáticas

modelo 597 (FISATOM, Brasil) e modelo Polystat 12002 (Cole-Parmer, Vernon

Hills, IL, EUA). As contrações isométricas foram registradas através de

transdutores de força modelo FORT-10 conectados a um amplificador modelo

TMB4M (ambos da World Precision Instruments, Sarasota, FL, EUA), que por

sua vez estava conectado a uma placa conversora analógico/digital instalada

em um microcomputador rodando o programa BioMed versão Rv2 (BioData,

João Pessoa, PB, Brasil). Os valores de pH eram ajustados através de um

pHmetro digital modelo PG 2000 (GEHAKA, São Paulo, SP, Brasil). As

substâncias e as drogas-teste foram pesadas em balança analítica modelo

AG200 e os animais em balança semi-analítica (ambas da GEHAKA, São

Paulo, SP, Brasil).

3.8 Avaliação da atividade toxicológica de Maytenus rigida

Inicialmente, o EEOH obtido da entrecasca do caule de M. rigida foi

submetido a um estudo de avaliação de toxicidade pela triagem

comportamental e determinação da DL50. Além de inferir as doses do EEOH

que seriam utilizadas nos estudos farmacológicos.

41

3.8.1 Triagem farmacológica comportamental e determinação da DL50

(SOUZA BRITO, 1994; ALMEIDA et al., 1999)

Foram utilizados camundongos machos e fêmeas (n = 10) que após

jejum de 12 horas, foram tratados com solução salina 0,9 % (10 mL/kg), EEOH

de M. rigida nas doses de 625, 1250, 2500 e 5000 mg/kg v.o. ou 250, 500,

1000 e 2000 mg/kg intraperitoneal (i.p.) Uma série de parâmetros

comportamentais descritos no protocolo experimental (anexo A) foram

observados durante as 4 primeiras horas com intervalos de 30 minutos, 1, 2, 3,

4 horas. A ocorrência de alguma alteração comportamental dos animais, em

decorrência do tratamento, permitiria inferir uma relação com a atividade no

sistema nervoso central e periférico e, conseqüentemente, sinais de toxicidade.

Os animais foram avaliados por 24, 48 e 72 horas com a finalidade de verificar

se haveria alguma morte e assim determinar a DL50 do EEOH de M. rigida.

3.9 Avaliação da atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida

Na avaliação da atividade antiulcerogênica de EEOH e F. AcOEt

administrados por via oral (v.o.), foram utilizados modelo de indução aguda de

úlcera gástrica que mimetizam a úlcera no homem pelos agentes lesivos:

HCl/etanol, etanol, estresse (por imobilização e frio) e antiinflamatório não

esteroidal (piroxicam). Para corroborar aos dados, foi realizada a avaliação dos

parâmetros bioquímicos do suco gástrico (pH, concentração de H+ e volume do

suco gástrico) utilizando para isto modelo de ligadura do piloro, em que o

EEOH ou a F. AcOEt foram administrados por via intraduodenal.

Os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical. O estômago

aberto ao longo da grande curvatura, lavado e colocado sobre placa para

quantificação macroscópica das lesões, com o auxílio de lupa OLYMPUS

Optical TL3 - SZ40. As lesões foram expressas como índice de lesão ulcerativo

(ILU), conforme número e severidade (SZELENYI; THIEMER, 1978):

- nível 1: pontos hemorrágicos e ulcerações até 1 mm;

- nível 2: ulcerações com 2 mm;

- nível 3: ulcerações profundas a partir de 3 mm.

ILU = Σ (lesões nível 1 x 1) + (lesões nível 2 x 2) + (lesões nível 3 x 3)

42

Foi utilizado também o modelo crônico de úlcera induzida por ácido

acético, no qual os animais foram tratados por 14 dias com a F. AcOEt de M.

rigida para verificar a capacidade de cicatrização da úlcera pela fase.

Os mecanismos de ação envolvidos na gastroproteção foram

investigados a partir da quantidade de muco gástrico, PGs, participação de NO

e dos compostos sulfidrilas.

3.9.1 Lesões gástricas induzidas por HCl/etanol (MIZUI; DOUTEUCHI,

1983)

Camundongos foram submetidos a um jejum de 24 horas (com acesso à

água ad libitum), divididos em 7 grupos (n = 6) e tratados com solução salina

0,9 % 10 mL/kg (controle negativo), lansoprazol 30 mg/kg (controle positivo),

EEOH 125, 250, 500 ou 750 mg/kg ou fase acetato 125, 250 ou 500 mg/kg

(grupos experimentais). Após 1 hora do tratamento, as lesões gástricas foram

induzidas pela administração de uma solução HCl/etanol (0,2 mL v.o.). Uma

hora após a administração do agente lesivo, os animais foram eutanasiados

por deslocamento cervical, os estômagos removidos e abertos ao longo da

grande curvatura e determinado o índice de lesão ulcerativa (SZELENYI;

THIEMER, 1978).

3.9.2 Lesões gástricas induzidas por etanol (MORIMOTO et al, 1991)

Ratos, submetidos a um jejum de 24 horas (com acesso à água ad

libitum), foram divididos em 7 grupos (n = 6) e tratados com solução salina 0,9

% (10 mL/kg), lansoprazol (30 mg/kg), EEOH (125, 250, 500 ou 750 mg/kg) ou

F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg). Após 1 hora do tratamento, as lesões

gástricas foram induzidas pela administração etanol absoluto (4 mL/kg v.o.).

Uma hora após a administração do etanol, os animais foram eutanasiados por

deslocamento cervical, os estômagos foram removidos e abertos ao longo da

grande curvatura e determinado o índice de lesão ulcerativa que foi calculado

de acordo com a metodologia descrita por Szelenyi; Thiemer (1978).

43

3.9.3 Lesões gástricas induzidas por estresse (imobilização e frio)

(LEVINE, 1971 com modificação)

Camundongos, submetidos a um jejum de 24 horas (com acesso à água

ad libitum), foram divididos em 6 grupos (n = 6) e tratados com solução 0,9 %

(10 mL/kg), cimetidina (100 mg/kg), EEOH (125, 250, 500 ou 750 mg/kg) ou F.

AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg). Após 30 minutos do tratamento, os animais

tiveram suas patas dianteiras e traseiras imobilizadas, foram colocados em

contensores de PVC (9 cm de comprimento x 3,5 cm de diâmetro) e

submetidos a uma temperatura de 4 ± 1 ºC por um período de 3 horas para

indução das úlceras gástricas. Após este período, os animais foram

eutanasiados por deslocamento cervical, os estômagos foram removidos e

abertos ao longo da grande curvatura e as lesões foram quantificadas e

determinado o índice de lesão ulcerativa (ILU) de cada animal.

3.9.4 Lesões gástricas induzidas por antiinflamatório não esteroidal

(piroxicam) (PUSCAS et al., 1997)

Camundongos, após jejum de 36 horas (com acesso à água ad libitum),

foram divididos em 6 grupos (n = 6) e tratados com solução salina 0,9 % (10

mL/kg), cimetidina (100 mg/kg), EEOH (250, 500, ou 750 mg/kg) ou F. AcOEt

(125, 250 ou 500 mg/kg). Após 30 minutos do tratamento, as lesões gástricas

foram induzidas com a injeção de piroxicam (30 mg/kg) pela via subcutânea.

Quatro horas após a administração do antiinflamatório, os animais foram

eutanasiados por deslocamento cervical, os estômagos foram removidos e

abertos ao longo da grande curvatura e as lesões foram quantificadas para que

se determinasse o índice de lesão ulcerativo (ILU) de cada animal.

3.9.5 Avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico no modelo

de ligadura do piloro (SHAY et al., 1945)

Ratos, após jejum de 36 horas (com acesso à água ad libitum), foram

divididos em grupos (n = 8) e sob anestesia (ketamina/xilazina) sofreram uma

incisão longitudinal logo abaixo da apófise xifóide para a localização e

44

amarradura de piloro. As administrações do EEOH (500 mg/kg), F. AcOEt (250

mg/kg), cimetidina 100 mg/kg (controle positivo) ou solução salina 0,9 %

(controle negativo) foram realizadas logo após a amarradura, por via

intraduodenal, e as incisões foram suturadas. Quatro horas após a cirurgia os

animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e a incisão reaberta;

após ligadura da cárdia (para preservação do conteúdo gástrico), o estômago

foi retirado. O conteúdo estomacal foi coletado para em seguida determinar os

parâmetros de volume gástrico, pH e concentração de ácido total. O conteúdo

do estômago foi pesado e, em seguida, calculado o volume do suco gástrico

expresso em g/4h. O pH foi verificado com o auxílio de um pHmetro digital PG

2000 (GEHAKA, Brasil) após centrifugação do conteúdo estomacal a 3000 rpm

por 10 minutos. Foram retirados 10 mL do sobrenadante, sendo esse

distribuído em alíquotas de 5 mL em 2 erlenmeyer para que fosse prosseguida

a titulação do suco gástrico e determinada a concentração de H+ expressa em

mEq/mL/4h. Para a titulação foi utilizada solução de hidróxido de sódio (NaOH)

0,01 N e fenolftaleina como solução indicadora com auxílio de uma bureta

digital Solarus® (HIRSCHMANN LABORGERATE, U.S.A).

3.9.6 Lesão gástrica induzida por ácido acético 30 % (TAKAGI; OKABE;

SAZIKI, 1969)

Ratos, após jejum de 36 horas (com acesso à água ad libitum), foram

divididos aleatoriamente nos grupos Sham, solução salina 0,9 %, cimetidina e

F. AcOEt (n = 10) e sob anestesia (ketamina/xilazina), foi realizada uma incisão

longitudinal logo abaixo da apófise xifóide. A parede anterior do estômago foi

exposta e 50 µL de ácido acético a 30 %, foram injetados na camada

subserosa da junção do fundo com o antro, com auxílio de uma seringa (Figura

7), com exceção do grupo Sham. Um dia após a cirurgia foram iniciados os

tratamentos por v.o., uma vez ao dia, durante 14 dias com a F. AcOEt 250

mg/kg, cimetidina 100 mg/kg (controle positivo) e solução salina 0,9 % 10

mL/kg (controle negativo). Ao final do tratamento, os animais foram

eutanasiados por deslocamento cervical e seus estômagos foram removidos e

abertos no sentido da grande curvatura, para a determinação da área da lesão

45

ulcerativa - ALU (mm2) com a ajuda de um paquímetro, utilizando a seguinte

equação:

ALU = altura da úlcera X largura da úlcera

Após o sacrifício, os órgãos vitais como coração, fígado, baço e rins foram

pesados e feito a relação entre o peso de cada órgão e o peso corporal de

cada animal para avaliação de um possível efeito tóxico do extrato neste

período de tratamento.

Figura 7- Ilustração da indução da úlcera com ácido acético 30 %

3.10 Avaliação dos mecanismos de ação citoprotetores envolvidos na

atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida

3.10.1 Determinação de muco aderido à parede gástrica (RAFATULLAH et

al., 1990 com modificações)

Ratos em jejum de 24 horas foram divididos em 4 grupos (n=5): Sham

(grupo não tratado), controle negatico (solução salina 0,9 % v.o), contole

positivo (carbenoxolona 100 mg/kg v.o.) e experimental (F. AcOEt 250 mg/kg

v.o.). Em seguida os animais foram anestesiados (quetamina/xilazina) e

sofreram uma incisão longitudinal logo abaixo da apófise xifóide para a

localização e amarradura do piloro. Quatro horas após a cirurgia os animais

foram eutanasiados por deslocamento cervical e a incisão reaberta, o

estômago foi retirado, a porção glandular do estômago foi separada, pesada e

imersa por 2 horas em 10 mL de solução de alcian blue de acordo com a

metodologia descrita por Rafatullah et al. (1990) com modificações. O excesso

46

de alcian blue foi removido lavando-se o estômago por duas vezes sucessivas

com 7 mL de solução de sacarose 0,25 mol/L; a primeira por 15 minutos e a

segunda por 45 minutos. O corante complexado ao muco aderido à parede

gástrica foi extraído com 10 mL de cloreto de magnésio 0,5 mol/L, agitando-se

intermitentemente por um minuto a cada 30 minutos durante 2 horas. Em 4 mL

da mistura foi adicionados 4 mL de éter etílico e, então, a solução foi submetida

à agitação por 2 minutos. A emulsão obtida foi centrifugada por 10 minutos a

3600 rpm e o precipitado foi descartado. As absorbâncias foram lidas em

espectrofotômetro a 598 nm. A leitura foi feita após realização de uma curva

padrão com várias concentrações de alcian blue. Os resultados foram

expressos em µg de Alcian blue/mL/g de tecido.

3.10.2 Determinação de prostaglandina E2 (PGE2) (CURTIS et al., 1995)

Ratos em jejum de 24 horas foram divididos aleatoriamente em 5

grupos: sham, solução salina 0,9 %, solução salina 0,9 % + indometacina, F.

AcOEt, e F. AcOEt + indometacina. Nos animais dos grupos 2 e 3 foi

administrado v.o. solução salina 0,9 % e nos animais dos grupos 4 e 5

receberam F. AcOEt. Após trinta minutos a indometacina (inibidor da síntese de

PGs) na dose de 20 mg/kg subcutânea foi administrada aos grupos 3 e 5. Uma

hora após o tratamento inicial os ratos foram eutanasiados, os estômagos

retirados e abertos, a mucosa raspada até sua total remoção. O conteúdo foi

pesado, picotado e logo suspenso em uma solução de 1 mL de tampão sódio

fosfato (10mM, pH 7,4); a solução assim obtida foi incubada a 37 °, por um

período de 20 min. A PG presente no tampão foi determinada por “kit”

imunoenzimático (RPN 222-Amersham) em espectrofotômero a 450 nm.

3.10.3 Avaliação da participação do óxido nítrico (SIKIRIC et al., 1997 com

modificações)

Ratos Wistar machos em jejum de 24 horas (com acesso a água ad

libitum) foram divididos em 8 grupos (n = 8) de acordo com os respectivos pré-

tratamentos. Os quatro grupos controle receberam injeção intraperitonial de

solução salina 0,9 % (10 mL/kg) e nos outros quatro grupos foi administrado N-

47

nitro-L-arginina-metil-ester (L-NAME) (10 mg/kg), um inibidor da NO-sintase.

Após 30 min, os grupos receberam por via oral os respectivos tratamentos,

solução salina 0,9 %, EEOH (500 mg/kg), a F. AcOEt (250 mg/kg) ou

carbenoxolona (100 mg/kg). Após 50 min, os animais foram tratados oralmente

com etanol absoluto. Os animais foram eutanasiados após 1 hora e os

estômagos removidos e abertos na grande curvatura. As lesões foram

avaliadas e o índice de lesão ulcerativa foi calculado.

3.10.4 Avaliação da participação dos grupamentos sulfidrila (MATSUDA et

al., 1999)

Ratos em jejum prévio de 24 horas (com acesso a água ad libitum)

foram divididos em oito grupos (n = 8) de acordo com os respectivos pré-

tratamentos. Os quatro grupos controle receberam injeção subcutânea de

solução salina 0,9 % (10 mL/kg) e os outros quatro grupos receberam por esta

mesma via N-etilmaleimida (NEM) 10 mg/kg, um bloqueador de grupamentos

sulfidrila. Após 30 min, os grupos receberam por v.o. os respectivos

tratamentos, solução salina 0,9 %, EEOH (500 mg/kg), a F. AcOEt (250 mg/kg)

ou carbenoxolona (100 mg/kg). Após 50 min, os animais foram tratados

oralmente com 1 mL de etanol absoluto. Os animais foram eutanasiados após

1 hora e os estômagos removidos e abertos na grande curvatura. As lesões

foram avaliadas e o índice de lesão ulcerativa foi calculado.

3.11 Avaliação da atividade antidiarréica e antimotilidade intestinal de

Maytenus rigida

3.11.1 Diarréia induzida por óleo de rícino (AWOUTERS et al, 1978)

Camundongos, em jejum de 12 horas (com acesso a água ad libitum),

foram divididos em grupos (n = 6) e tratados com solução salina 10 mL/kg

(controle negativo), loperamida (10 mg/kg), EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou

F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg). Após 1 hora dos tratamentos, foi

administrado 0,7 mL de óleo de rícino por animal por via oral. Os animais

foram colocados em caixas individuais forradas com papel branco. Após a

48

% de inibição =

administração do agente indutor da diarréia, foi realizada a contagem do

número de bolos fecais e observado a consistência dos bolos fecais por até 4

horas, classificando-os de acordo com a consistência em líquidos ou sólidos.

Foi então determinado o número de episódios líquidos e o número total de

bolos fecais.

3.11.2 Trânsito intestinal normal (STICKNEY; NORTHUP, 1959)

Ratos, em jejum de 12 horas (com acesso a água ad libitum), foram

divididos em grupos (n = 6) e tratados com solução salina 0,9 % (10 mL/kg),

atropina (2 mg/kg), EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou F. AcOEt (125, 250 ou

500 mg/kg). Após 30 minutos, foi administrado 0,5 mL por animal de uma

solução de carvão ativado (5 %) em goma arábica (5 %) e os animais

eutanasiados por deslocamento cervical, 30 minutos após a administração do

carvão ativado. A cavidade abdominal foi aberta e o intestino delgado

removido. Com auxílio de uma régua, foi determinado o comprimento total do

intestino delgado de cada animal (distância entre o piloro até a válvula

ileocecal), e a distância percorrida pelo marcador. Foi calculada a porcentagem

do percurso do carvão em função do comprimento total do intestino.

Os resultados foram expressos em porcentagem de inibição da distância

percorrida pelo marcador em relação ao comprimento total do intestino delgado

do grupo experimental em relação ao grupo, controle de acordo com a

equação:

(Distância do grupo controle – Distância grupo experimental)

Distância do grupo controle

3.11.3 Trânsito intestinal induzido por óleo de rícino (STICKNEY;

NORTHUP, 1959)

Ratos, em jejum de 12 horas (com acesso a água ad libitum), foram

separados em grupos (n = 6) e tratados com solução salina 0,9 % (10 mL/kg),

atropina (2 mg/kg), EEOH (500 mg/kg) ou F. AcOEt (250 mg/kg), após 30

minutos foi administrado 0,7 mL de óleo de rícino por animal e após 30 minutos

X 100 % de inibição =

49

foi administrado 0,5 mL de solução de carvão ativado (5 %) em goma arábica

(5 %). Após 30 minutos os animais foram eutanasiados por deslocamento

cervical, a cavidade abdominal aberta e o intestino delgado removido. Com

auxílio de uma régua, foi determinado o comprimento total do intestino delgado

de cada animal (distância entre o piloro até a válvula ileocecal), e a distância

percorrida pelo marcador. Os resultados foram expressos em porcentagem da

distância percorrida pelo marcador em relação ao comprimento total do

intestino delgado.

3.12 Avaliação da atividade antiespasmódica de Maytenus rigida

3.12.1 Efeito do EEOH e da F. AcOEt sobre as contrações tônicas

induzidas por KCl ou por carbacol em íleo isolado de cobaia (DANIEL;

KWANC; JANSSEN, 2001)

As cobaias foram mantidas em jejum por um período de 18 a 24 horas,

com acesso à água ad libitum antes do início dos experimentos. Após este

período foram eutanasiadas por deslocamento cervical seguida de secção dos

vasos cervicais. O abdômen foi aberto e um segmento do íleo de

aproximadamente 15 cm de comprimento foi retirado e colocado em uma placa

de Petri contendo solução nutritiva de Krebs modificado a 37 °C sob aeração

com carbogênio. Após cuidadosa dissecação, o segmento do íleo foi

seccionado em fragmentos de 2 a 3 cm de comprimento, suspensos

individualmente em cubas de vidro e deixados em repouso por 30 minutos,

tempo necessário para perfeita estabilização da preparação, durante este

período a solução nutritiva foi trocada a cada 15 minutos.

Após o período de estabilização, duas contrações submáximas similares

foram obtidas com KCl (40 mM) ou carbacol (10-6 M). Durante a fase tônica

sustentada da segunda resposta, tanto o EEOH como a F. AcOEt foram

aplicados de maneira cumulativa.

O relaxamento foi expresso como a percentagem reversa da contração

induzida por KCl ou carbacol. Os valores de concentração do EEOH ou da F.

AcOEt que produz 50 % de seu efeito máximo (CE50) foram obtidos por regressão

não-linear a partir das curvas concentrações-resposta obtidas

50

3.13 Análise estatística

Para os modelos que investigam a atividade antiulcerogênica,

antidiarréica e motilidade intestinal, os resultados estão expressos como a

média ± desvio padrão (d.p.) e foram submetidos à análise de variância de uma

via (ANOVA), seguido do pós-teste de Dunnett (para comparação dos grupos

tratados com o grupo controle negativo) ou teste de Tukey-Kramer (para

comparação entre os grupos tratados e escolha da melhor dose do EEOH e F.

AcOEt). O nível de significância considerado foi 95 % (P< 0,05). O programa

estatístico utilizado foi o GraphPad Prism versão 3,02 (GraphPad Software Inc.,

San Diego CA, U.S.A.).

Os resultados obtidos na avaliação da atividade antiespasmódica estão

expressos como a média ± e.p.m e foram analisados estatisticamente

empregando-se o teste “t” de Student ou análise de variância (ANOVA) “one-

way” seguido do teste de Bonferroni, em que os valores de p < 0,05 foram

considerados significantes. Os valores de CE50 (NEUBIG et al., 2003) foram

calculados por regressão não-linear e foram analisados pelo programa

GraphPad Prism versão 3,02 (GraphPad Software Inc., San Diego CA, U.S.A.).

51

4 RESULTADOS

4.1 Avaliação da atividade toxicológica de Maytenus rigida

4.1.1 Triagem farmacológica comportamental e determinação da DL50

Observando os parâmetros citados por Almeida e colaboradores (1999),

os animais não apresentaram alterações de comportamento após a

administração do EEOH obtido da entrecasca do caule de M. rigida, nas doses

utilizadas até 5000 v.o. e até 2000 mg/kg i.p., durante o tempo de observação

preconizado. Esses resultados indicam que o EEOH apresentou baixa

toxicidade nas condições avaliadas.

Foi observado que não houve mortes de animais durante as 72 horas

após a administração do EEOH, não sendo possível a determinação da DL50.

4.2 Avaliação da atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida

Souza Brito (1994) preconiza que estudos farmacológicos envolvendo

extrato vegetal ou seus derivados deverá ser avaliado até a dose máxima de

1000 mg/kg. Diante disso, as doses do EEOH (250, 500 e 750 mg/kg) e F.

AcOEt (125, 250 e 500 mg/kg) obtido de M. rigida foram definidas em função

de sua capacidade de inibirem as lesões gástricas.

4.2.1 Lesões gástricas induzidas por HCl/etanol

No modelo de indução por HCl/etanol por via oral em camundongos os

tratamentos com EEOH nas doses 250, 500 ou 750 mg/kg ou lansoprazol (30

mg/kg) v.o. inibiram significantemente as lesões ulcerativas em 44, 70, 78, 74,

% respectivamente, quando comparado ao controle negativo (Tabela 2).

52

Tabela 2- Efeito da administração oral do EEOH obtido de M. rigida ou

lansoprazol nas lesões gástricas induzidas por HCl/etanol em camundongos

Tratamento Dose

(mg/kg)

ILU

(Média ± d.p)

Inibição

(%)

Solução salina 0,9 % - 27 ± 2,4 -

Lansoprazol 30 7 ± 1,2** 74

EEOH 125 24± 1,9 11

250 15 ± 2,9** 44

500 8 ± 1,5** 70

750 6 ± 1,4** 78

ILU= Índice de Lesão Ulcerativa ANOVA F(5,30) = 120; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, **P<0,01.

4.2.2- Lesões gástricas induzidas por etanol

Os resultados obtidos para a espécie M. rigida nesse modelo de indução

pela administração de etanol (v.o) em ratos demonstraram que o EEOH (250,

500 ou 750 mg/kg) ou o lansoprazol (30 mg/kg) inibiu significantemente as

lesões ulcerativas em 52, 87, 95 e 65 % respectivamente, quando comparado

ao controle negativo (Tabela 3a).

Os resultados obtidos no modelo de indução de úlcera induzida por

etanol, para avaliar a F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg) ou o lansoprazol (30

mg/kg), demonstraram que ocorreu uma inibição significativa das lesões

ulcerativas em 47, 81, 87 e 58 % respectivamente, quando comparado ao

controle negativo (Tabela 3b).

53

Tabela 3- Efeito da administração oral do EEOH, F. AcOEt de M. rigida ou

lansoprazol nas lesões gástricas induzidas por etanol em ratos

Tratamentos Dose (mg/kg)

ILU (Média ± d.p)

Inibição (%)

(a) Solução salina 0,9 % - 130 ± 7,9 -

Lansoprazol 30 45 ± 7,3** 65

EEOH

125

250

500

750

119 ± 11,3

63 ± 5,9**

17 ± 2,7**

7 ± 2,6**

8

52

87

95

(b) Solução salina 0,9 %

Lansoprazol

F. AcOEt

-

30

125

137 ± 6,9

57 ± 7,1**

73 ± 8,3**

-

58

47

250

500

26 ± 4,0**

18 ± 2,7**

81

87

ILU= Índice de Lesão Ulcerativa ANOVA F(5,30) = 387 para o EEOH e F(4,25) = 354 para a F. AcOEt; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo *P<0,05 e **P<0,01.

Portanto, o EEOH e a F. AcOEt obtidos de M. rigida apresentaram

significativa atividade antiulcerogênica frente aos danos da mucosa gástrica

provocados por HCl/etanol e etanol em camundongos e ratos respectivamente.

4.2.3 Lesões gástricas induzidas por estresse (imobilização e frio)

No modelo de indução de úlcera gástrica por estresse (imobilização e

frio) em camundongos, os resultados da administração oral do EEOH (250, 500

ou 750 mg/kg) ou cimetidina (100 mg/kg) mostram que houve inibição de 65,

54

86, 89 e 69 %, respectivamente, quando comparado ao controle negativo

(Tabela 4a).

Os resultados obtidos na avaliação da F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg)

ou cimetidina (100 mg/kg), no modelo de úlcera induzida por estresse,

demonstraram que ocorreu uma inibição significativa das lesões ulcerativas em

60, 80, 87 e 62 % respectivamente, quando comparado ao controle negativo

(Tabela 4b).

De acordo com estes dados, o EEOH e a F. AcOEt obtidos de M. rigida

apresentaram significativa atividade antiulcerogênica frente aos danos

gástricos agudos provocados pelo estresse por imobilização e frio em

camundongos.

Tabela 4- Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M. rigida ou

cimetidina nas lesões gástricas induzidas por estresse em camundongos

Tratamento Dose

(mg/kg)

ILU

(Média ± d.p)

Inibição

(%)

(a) Solução salina 0,9 % - 161 ± 10,6 -

Cimetidina 100 50 ± 5,4** 69

EEOH 250 57 ± 5,0** 65

500 22 ± 2,9** 86

750 18 ± 2,8** 89

(b) Solução salina 0,9 %

Cimetidina

F. AcOEt

-

100

125

60 ± 2,7

23 ± 2,9**

24 ± 3,3**

-

62

60

250

500

12 ± 2,8**

8 ± 2,8**

80

87

ILU= Índice de Lesão Ulcerativa ANOVA F(4,25) = 552 para o EEOH e F(4,25) = 298 para a F. AcOEt; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, **P<0,01.

55

4.2.4 Lesões gástricas induzidas por antiinflamatório não esteroidal

(piroxicam)

No modelo de indução de úlcera gástrica por antiinflamatório não

esteroidal (piroxicam) em camundongos, os resultados da administração oral

do EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou de cimetidina (100 mg/kg) mostram que

houve inibição de 55, 81, 94 e 60 %, respectivamente, quando comparado ao

grupo controle negativo (Tabela 5a).

Semelhante experimento foi utlilizado para avaliar os efeitos da

administração da F. AcOEt (125, 250 e 500 mg/kg) ou de cimetidina (100

mg/kg) em camundongos submetidos aos danos gástricos provocados pelo

piroxicam. Os resultados obtidos demonstraram que ocorreu uma inibição

significativa das lesões ulcerativas em 41, 69, 80 e 64 % respectivamente,

quando comparado ao controle negativo (Tabela 5b).

Estes resultados mostram que o EEOH e F. AcOEt obtidos de M. rigida

apresentaram significante atividade antiulcerogênica, frente a formação aguda

das lesões na mucosa gástrica induzidas pelo antiinflamatório não esteroidal

piroxicam.

56

Tabela 5- Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M. rigida ou

cimetidina nas lesões gástricas induzidas por piroxicam em camundongos

Tratamento Dose

(mg/kg)

ILU

(Média ± d.p)

Inibição

(%)

(a) Solução salina 0,9 % - 47 ± 4,7 -

Cimetidina 100 19 ± 2,4** 60

EEOH 125 21 ± 2,9** 55

250 9 ± 2,3** 81

500 3 ± 1,2** 94

(b) Solução salina 0,9 %

Lansoprazol

F. AcOEt

-

125

125

39 ± 1,9

14 ± 2,2**

23 ± 2,9**

-

64

41

250

500

12 ± 1,7**

8 ± 2,1**

69

80

ILU= Índice de Lesão Ulcerativa ANOVA F(4,25) = 199 para o EEOH e F(4,25) =180 para a F. AcOEt; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, **P<0,01.

4.2.5 Avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico no modelo

de ligadura do piloro

No modelo de ligadura do piloro, foram avaliados parâmetros

bioquímicos do conteúdo estomacal como volume gástrico, pH e acidez total,

após a administração intraduodenal da solução salina 0,9 %, cimetidina (100

mg/kg), EEOH (500 mg/kg) ou F. AcOEt (250 mg/kg) em ratos.

Os dados obtidos mostraram que o EEOH e a F. AcOEt não

promoveram alterações nos parâmetros bioquímicos observados, diferente da

57

cimetidina que elevou o pH, o volume gástrico e diminuiu a concentração ácida

total (Tabela 6).

Tabela 6- Efeito da administração intraduodenal do EEOH e F. AcOEt de M.

rigida ou cimetidina sobre os parâmetros bioquímicos do suco gástrico no

modelo de ligadura do piloro em ratos

Tratamento Dose

(mg/Kg)

pH

Concentração

de H+

(mEq /mL /4 h)

Volume

gástrico (g)

Solução salina 0,9 % - 2,73± 0,22 9,63 ± 0,52 0,72 ± 0,08

Cimetidina 100 5,73 ± 0,52** 3,30 ± 0,53** 0,48 ± 0,05**

EEOH 500 3,05 ± 0,39 9,43 ± 0,47 0,73 ± 0,05

F. AcOEt 250 3,07 ± 0,45 9,27 ± 0,63 0,79 ± 0,03

ANOVA: F(3,20) = 71 para pH; F (3,20) = 192 para concentração de H+; F(3,20) = 39 para volume gástrico (P<0,05), seguido do teste de Dunnett comparado ao controle negativo **P<0,01.

4.2.6 Lesão gástrica induzida por ácido acético 30 %

No modelo de indução de úlcera gástrica por ácido acético 30 %, em

ratos foi realizado o tratamento durante 14 dias consecutivos com solução

salina 0,9 %, cimetidina (100 mg/kg) ou F. AcOEt obtida da M. rigida (250

mg/kg). Os resultados demonstraram que nos animais tratados com a F. AcOEt

(250 mg/kg) ou cimetidina (100 mg/kg) ocorreu uma redução na área da lesão

gástrica em 52 % e 50 %, respectivamente, quando comparado ao grupo

controle negativo (Gráfico 1). O grupo Sham, com animais em que não foram

induzido a úlcera, como esperado apresentou 0 % de lesão, sendo considerado

como controle normal.

58

0

25

50

75

Sham

Cimetidina 100 mg/kg

Fase AcOEt 250 mg/kg

Solução salina 0,9 %

50 % **

52 % **

**

Tratamentos

Áre

a de

Les

ão U

lcer

ativ

a

(AL

U)

mm

2

Gráfico 1- Efeito da administração oral da F. AcOEt de M. rigida ou cimetidina,

durante 14 dias, no modelo de indução de úlcera gástrica por ácido acético 30

% em ratos.

ANOVA F(3,20) = 26; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle, **P<0,01.

Partindo do mesmo modelo de indução de úlcera pelo ácido acético, foi

avaliado também o efeito da F. AcOEt obtida de M. rigida sobre o peso corporal

e sobre os órgãos vitais como coração, fígado, baço e rins dos ratos. Os dados

obtidos mostraram que não houve alteração significativa no peso dos órgãos e

no peso corpóreo (Tabela 7).

59

Tabela 7- Efeito da administração oral da F. AcOEt de M. rigida ou cimetidina

por 14 dias consecutivos sobre o peso corporal e dos orgãos de ratos com

úlcera induzida por ácido acético

Tratamentos

Solução salina

0,9 % Sham

Cimetidina

(100 mg/kg)

F. AcOEt

(250 mg/kg)

Peso corporal

coração

fígado

baço

rins

239,7 ± 14,28

0,45 ± 0,08

3,73 ± 0,26

0,25 ± 0,04

0,79 ± 0,01

278,4 ± 10,41**

0,45 ± 0,02

3,79 ± 0,26

0,24 ± 0,02

0,77 ± 0,01

225,7 ± 18,05

0,45 ± 0,02

3,87 ± 0,25

0,24 ± 0,03

0,77 ± 0,06

224,7 ± 20,60

0,43 ± 0,03

3,69 ± 0,19

0,28 ± 0,05

0,82 ± 0,08

ANOVA F(3,20)= 17 para peso corporal, F(3,20) = 0,78 para coração, F(3,20) = 0,71 para fígado, F(3,20) = 3 para baço e F(3,20) = 1 para rins, **P<0,01, seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle (solução salina 0,9 %).

4.3 Avaliação dos mecanismos de ação citoprotetores envolvidos na

atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida

4.3.1 Determinação do muco aderido à parede gástrica

Para verificar o envolvimento do muco na citoproteção produzida por

carbenoxolona 200 mg/kg e a F. AcOEt 250 mg/kg foi determinado o muco

aderido à mucosa gástrica, pela determinação da concentração de acian blue

em ratos após ligadura do piloro. Os resultados demonstram que a

carbenoxolona 200 mg/kg e a F. AcOEt 250 mg/kg, administrados oralmente

aumentaram a produção de muco de forma significativa, quando comparados

com o grupo controle negativo (solução salina 0,9 %) (Gráfico 2).

60

0

10

20

30

40

50

60solução salina 0,9 %

carbenoxolona 100 mg/kg

Fase AcOEt 250 mg/kg

**

*

Tratamentos

Qu

anti

dad

e d

e al

cian

blu

e ad

erid

o a

par

ede

gás

tica

[mg

/pes

o d

a p

orç

ão g

lan

du

lar

(g)]

Gráfico 2- Efeito do tratamento agudo com F. AcOEt de M. rigida ou

carbenoxolona no conteúdo de muco aderido à mucosa gástrica em ratos.

ANOVA F(2, 20)= 14; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, *P<0,05 e **P<0,01.

4.3.2 Determinação de prostaglandina E2 (PGE2)

Com a finalidade de avaliar o envolvimento da PGE2 na citoproteção

promovida pela F. AcOEt, foi verificado se a amostra vegetal era capaz de

modular a produção desta prostaglandina. Os dados mostram que a F. AcOEt

(250 mg/kg) manteve os níveis de PGE2 semelhante ao do grupo controle

negativo (solução salina 0,9 %). No entanto, quando a fase foi administrada no

grupo pré-tratado com indometacina (30 mg/kg) (um inibidor não seletivo da

síntese de prostaglandina), ocorreu uma redução significativa na produção de

PGE2 quando comparado ao grupo Sham, semelhante ao grupo solução salina

0,9 % pré-tratado com indometacina (Gráfico 3).

Estes dados indicam a não participação da PGE2 na citoproteção

promovida por M. rigida.

61

0

1

2

3Solução salina 0,9 %

Solução salina 0,9 % + Indometacina

Fase 250 mg/kg

Fase 250 mg/kg + Indometacina

Sham

+ ++

*****

Tratamentos

[PG

E2]

ng

/mg

pro

tein

a

Gráfico 3: Efeito do tratamento com a F. AcOEt de M. rigida nos níveis de

PGE2 em ratos.

ANOVA, F(4,16)= 10, (P<0,05), seguido do teste de Tuckey, comparado ao Sham, **P<0,01, ***P<0,001, comparado ao seu controle, +P<0,05, ++P<0,01.

4.3.3 – Avaliação da participação do óxido nítrico (NO)

Na avaliação do envolvimento do NO no efeito gastroprotetor do extrato e

da F. AcOEt, os ratos foram pré-tratados com L-NAME, um inibidor da sintase

do óxido nítrico. Como esperado, foi observado um aumento nas lesões

ulcerativas induzidas pelo etanol nos ratos pré-tratados com L-NAME (Figura

8).

Os dados obtidos no modelo que investiga a participação de NO na

proteção induzida por EEOH 500 mg/kg e F. AcOEt 250 mg/kg, mostram que

nos ratos dos grupos previamente tratados com solução salina 0,9 % e depois

tratados com EEOH, F. AcOEt ou carbenoxolona, ocorreu uma inibição

significativa do ILU em 48, 49 e 58 % respectivamente. Entretanto, quando

foram avaliados os grupos pré-tratados com o L-NAME (bloqueador da sintase

de oxido nítrico) e posteriormente tratados com EEOH, F. AcOEt ou

carbenoxolona foi observado uma exacerbação do ILU com inibição de apenas

33, 35 e 40 % respectivamente, quando comparados ao seu controle negativo.

(Gráfico 4).

62

Figura 8- Estômagos de ratos tratados com solução salina 0,9 %/solução

salina 0,9 % (A), solução salina 0,9 %/EEOH (B), solução salina 0,9 %/F.

AcOEt (C), L-NAME/solução salina 0,9 % (D), L-NAME/EEOH (E) ou L-

NAME/F. AcOEt (F).

0

100

200

300

Salina

Carbenoxolona 100 mg/kg

Extrato 500 mg/kg

Fase 250 mg/kg

** ** **

Salina L-NAME

** **

58 %48 % 49 %

40 %

33 % 35 %

******

******

Tratamentos

ILU

(Mé

dia

± d

p)

Gráfico 4. Efeito da administração oral do EEOH, F. AcOEt de M. rigida ou

carbenoxolona na úlcera gástrica induzida por etanol em ratos pré-tratados

com L-NAME.

ANOVA F(7,56) = 312; (P<0,01), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, **P<0,01, ***P<0,001.

A B C

D E F

63

O pré-tratamento com L-NAME reduziu a proteção exercida pelo EEOH

e F. AcOEt obtidos da M. rigida, sugerindo o envolvimento de NO citoproteção.

4.3.4 Avaliação da participação dos grupamentos sulfidrila (SH)

Na avaliação do envolvimento dos grupamentos sulfidrilas no efeito

gastroprotetor do extrato e da fase, os ratos foram pré-tratados com NEM, um

bloqueador dos grupamentos sulfidrila endógenos. Como esperado, foi

observado um aumento nas lesões ulcerativas induzidas pelo etanol nos ratos

pré-tratados com NEM (Figura 9).

Ao avaliar os dados obtidos neste modelo, foi observado que os animais

dos grupos previamente tratados com solução salina 0,9 % e depois tratados

com EEOH, F. AcOEt ou carbenoxolona, ocorreu uma inibição significativa do

ILU em 57, 56 e 58 % respectivamente. Entretanto, quando foram avaliados os

grupos pré-tratados com o NEM (bloqueador de grupamentos sulfidrila) e

tratados com EEOH, F. AcOEt e carbenoxolona, foi observado uma

exacerbação do ILU com apenas 31, 33 e 39 % de inibição quando

comparados ao seu controle negativo (Gráfico 5).

Os resultados demonstraram que a via dos grupamentos sulfidrila está

envolvida na ação citoprotetora promovida M. rigida.

Figura 9- Estômagos de ratos tratados com solução salina 0,9 %/solução salina 0,9 % (A), solução salina 0,9 %/EEOH (B), solução salina 0,9 %/F. AcOEt (C), NEM/solução salina 0,9 % (D), NEM/EEOH (E) e NEM/F. AcOEt (F)

A B C

D E F

64

0

100

200

salina

carbenoxolona 100 mg/kg

fase 250 mg/kg

** ** **

extrato 500 mg/kg

NEMSalinaTratamentos

58% 57% 56%

39%

31%33%

******

******

ILU

(M

édi

a±± ±±

dp

)

Gráfico 5. Efeito da administração oral do EEOH, F. AcOEt de M. rigida ou

carbenoxolona na úlcera gástrica induzida por etanol em ratos pré-tratados

com NEM. ANOVA F(7,56) = 364.25, (P<0,05), seguido do teste de Dunnett,

comparado ao controle negativo, **P<0,01, ***P<0,001.

4.4 Avaliação da atividade antidiarréica de Maytenus rigida

4.4.1 Diarréia induzida por óleo de rícino

No modelo de diarréia induzida por óleo de rícino em camundongos, os

resultados da administração do EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou loperamida

(10 mg/kg) mostram que houve inibição de 32, 68, 80 e 68%, respectivamente,

quando comparados ao controle negativo em relação ao número total de fezes.

O EEOH inibiu também o número de fezes líquidas (Tabela 8a).

No modelo de diarréia induzida por óleo de rícino, os resultados obtidos

para a F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg) e loperamida (10 mg/kg)

demonstraram que ocorreu uma inibição significativa do número total de fezes

de 40, 55, 73 e 80 % respectivamente, quando comparado ao controle

negativo. Esta fase diminuiu também o número de fezes líquidas (Tabela 8b).

65

Estes resultados mostram que tanto o extrato quanto a F. AcOEt

produziram efeito antidiarréico em camundongos neste modelo de indução, nas

doses utilizadas, como pode ser observado pela redução no número de fezes

líquidas e o número de fezes totais.

Tabela 8- Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M. rigida ou

loperamida na diarréia induzida por óleo de rícino em camundongos

Tratamento Dose

(mg/kg)

Fezes líquidas

(Média ± d.p)

Fezes totais

(Média ± d.p)

Inibição

(%)

(a) Solução salina 0,9 %

Loperamida

EEOH

-

10

250

500

750

17 ± 2,0

4 ± 1,4**

13 ± 1,9**

3 ± 0,8**

3 ± 0,9**

25 ± 1,9

8 ± 2,4**

17 ± 2,7**

8 ± 1,8**

5 ± 1,2**

68

32

68

80

(b) Solução salina 0,9 % - 9,4 ± 1,1 12,0 ± 1,9

Loperamida 10 0 ± 0,0** 2,4 ± 0,9** 80

F. AcOEt 250 5,2 ± 0,4** 7,2 ± 0,8** 40

500 3,0 ± 0,7** 5,4 ± 0,9** 55

750 2,4 ± 0,9** 3,2 ± 1,1** 73

ANOVA F(4,20) = 79 feses totais e F(4,20) = 91 fezes líquidas para o EEOH; F(4,20)

= 52 para fezes totais e F(4,20) = 101 para fezes líquidas para a F. AcOEt; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparados ao controle, **P<0,01.

4.4.2 Trânsito intestinal normal

No modelo de motilidade intestinal em ratos, os resultados da

administração oral de atropina (2 mg/kg) e o EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg)

mostram que houve inibição de 25, 24, 35 e 37 %, respectivamente, do

66

percentual da distância percorrida pelo carvão ativado no intestino do rato,

quando comparado ao controle negativo (Tabela 9a).

No modelo de motilidade intestinal, os resultados obtidos para a F.

AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg) e atropina (2 mg/kg) demonstraram que

ocorreu uma inibição significativa da distância percorrida pelo carvão ativado

no intestino do rato, de 23, 33, 37e 37 % respectivamente, quando comparado

ao controle negativo (Tabela 9b).

Estes resultados mostram que tanto o EEOH quanto a F. AcOEt nas

doses utilizadas são capazes de inibir o trânsito intestinal normal de rato e que

isto pode contribuir para o efeito antidiarréico e antiulcerogênico.

Tabela 9- Efeito da administração oral do EEOH e da F. AcOEt de M. rigida ou

atropina no trânsito intestinal de ratos.

Tratamento Dose

(mg/kg)

% de distância

percorrida pelo carvão

(Média ± d.p)

Inibição

(%)

(a) Solução salina 0,9 % - 84 ± 5,9 -

Atropina 2 63 ± 4,9** 25

EEOH 125 64 ± 2,6** 24

250 55 ± 3,9** 35

500 53 ± 3,6** 37

(b) Solução salina 0,9 %

Atropina

F. AcOEt

-

2

125

78 ± 4,5

49 ± 4,4**

60 ± 2,6**

-

37

23

250

500

52 ± 3,5**

49 ± 1,2**

33

37

ANOVA F(4,20) = 47 para o EEOH e F(4,20) =71 par a F. AcOEt; **P<0,01, seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle solução salina 0,9 %.

67

4.4.3 Trânsito intestinal induzido por óleo de rícino

Os resultados obtidos para a espécie M. rigida no modelo de trânsito

intestinal induzido por óleo de rícino em ratos, demonstraram que a atropina (2

mg/kg), o EEOH (500 mg/kg) e F. AcOEt (250 mg/kg) inibiram

significantemente a distância percorrida pelo carvão ativado, em 43, 43 e 42 %

respectivamente, quando comparado ao controle negativo (Tabela 10).

Estes resultados, quando comparados aos resultados do experimento de

trânsito intestianal normal, expressos nas tabelas 13 e 14, mostram que tanto o

EEOH quanto a F. AcOEt são efetivos em inibir o trânsito intestinal, sem

diferenças entre os estados normal e induzido por óleo de rícino.

Tabela 10- Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M. rigida ou

atropina no trânsito intestinal induzido por óleo de rícino em ratos.

Tratamento Dose

(mg/kg)

% de distância

percorrida pelo carvão

(Média ± d.p)

Inibição

(%)

Solução salina 0,9 % - 89 ± 4,6 -

Atropina 2 51 ± 3,2** 43

Extrato 500 50 ± 5,1** 43

F. AcOEt 250 52 ± 3,5** 42

ANOVA F(3,20) = 97, (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, **P<0,01

4.5 Avaliação da atividade antiespasmódica de Maytenus rigida

4.5.1 Efeito do EEOH ou da F. AcOEt sobre as contrações tônicas

induzidas por KCl ou por carbacol em íleo isolado de cobaia

O EEOH (0,1 – 500 µg/mL) relaxou de maneira dependente de

concentração e significante o íleo de cobaia (Figura 10 ) pré-contraído com

68

40 mM de KCl (CE50 = 39,4 ± 12,6 µg/mL) ou com 10–6 M de carbacol

(CE50 = 11,6 ± 2,5 µg/mL). Os valores de CE50 não apresentaram diferença

significante entre si e o Emax (100 %) do EEOH foi atingido na concentração de

81 µg/mL e de 500 µg/mL quando a contração era induzida por carbacol e KCl,

respectivamente (Gráfico 6). A responsividade do íleo aos agentes contráteis

testados foi restaurada entre 45 e 60 min após a retirada do EEOH da cuba.

De maneira semelhante, a F. AcOEt (0,1 – 500 µg/mL) também relaxou

de maneira dependente de concentração e significante o íleo de cobaia

(Figura 11) pré-contraído com 40 mM de KCl (CE50 = 22,0 ± 5,3 µg/mL) ou com

10-6 M de carbacol (CE50 = 16,6 ± 4,4 µg/mL). Não houve diferença significante

entre os valores de CE50 como pode ser observado no Gráfico 7. A

responsividade do íleo aos agentes testados foi restaurada cerca de 40min

após a retirada da F. AcOEt da cuba.

Quando se comparou os valores de CE50 do extrato EEOH e de sua F.

AcOEt frente ao mesmo agente contrátil testado, verificou-se que não houve

diferença significante entre si.

69

A

B

Figura 10 – Registros originais do efeito relaxante do EEOH de M. rigida sobre

as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (A) e 10-6 M de carbacol (B)

em íleo isolado de cobaia. As setas representam as concentrações cumulativas

(0,1, 0,3, 1, 3, 9, 27, 81 243 e 500 µg/mL, respectivamente) do EEOH.

70

Gráfico 6 – Efeito do EEOH de M. rigida sobre as contrações tônicas induzidas

por 40 mM KCl (■) ou 10 - 6 M de carbacol (□) em íleo isolado de cobaia

(n = 5). Os símbolos e as barras verticais representam a média e o e.p.m.,

respectivamente.

-1 0 1 2 3

0

25

50

75

100

KCl

CE50 = 39,4 ± 12,6 µg/mL

CCh

CE50 = 11,6 ± 2,5 µg/mL

log [EEtOH] µg/mL

Rel

axam

ento

(%

)

71

A

Figura 11 – Registros originais do efeito relaxante da F. AcOEt de M. rigida

sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (A) e 10-6 M de

carbacol (B) em íleo isolado de cobaia. As setas representam as concentrações

cumulativas (0,1, 0,3, 1, 3, 9, 27, 81 243 e 500 µg/mL, respectivamente) da F.

AcOEt.

72

Gráfico 7 – Efeito da F. AcOEt de M. rigida sobre as contrações tônicas

induzidas por 40 mM KCl (▲) ou 10 - 6 M de carbacol (∆) em íleo isolado de

cobaia (n = 5). Os símbolos e as barras verticais representam a média e o

e.p.m., respectivamente.

-1 0 1 2 3

0

25

50

75

100

KClCE50 = 22,0 ± 5,3 µg/mL

CChCE50 = 16,6 ± 4,4 µg/mL

log [Fase AcOEt] µg/mL

Rel

axam

ento

(%

)

73

5 DISCUSSÃO

No presente trabalho avaliou-se a atividade antiulcerogênica,

antidiarréica e antiespasmódica do extrato etanólico bruto (EEOH) e de sua

fase Acetato de Etila (AcOEt) obtidos da entrecasca do caule de Maytenus

rigida Mart. utilizando-se para isso abordagens in vivo e in vitro em modelos

animais. Os resultados mais relevantes deste estudo é a demonstração pela

primeira vez de que M. rigida apresenta atividade antiulcerogênica frente aos

modelos que mimetizam a úlcera no homem e que esta atividade

gastroprotetora está relacionada ao aumento da liberação de muco, a

participação de óxido nítrico e de grupamentos sulfidrila, além da ação

antidiarréica, antimotilidade e antiespasmódica.

A úlcera péptica é uma doença que resulta do desequilíbrio entre os

fatores agressivos (primariamente ácido gástrico e pepsina) e os fatores de

defesa da mucosa (PGs, fluxo sanguíneo mucosal e substâncias antioxidantes)

(KONTUREK, 2005). Atinge cerca de 5 % da população mundial, sendo mais

freqüente nos países orientais. Nos países em desenvolvimento, cerca de 10 a

15 % dos homens e de 4 a 15 % das mulheres são acometidos desta doença.

No Brasil não há números oficiais, mas estima-se que 10 % da população tem,

tiveram ou terão úlcera péptica (BANDYOPADHYAY et al., 2001; PRADOS;

MIQUEL, 2004; YUAN; PADOL; HUNT, 2006).

A abordagem terapêutica da úlcera péptica envolve o uso de agentes

que possam restaurar o equilíbrio existente na mucosa gástrica. Assim, a

terapia da úlcera péptica se baseia na supressão da secreção ácida gástrica

com os agentes anti-secretórios (antiácidos, antagonistas do receptor H2 da

histamina e inibidores da bomba de prótons) ou no aumento da produção e/ou

liberação de fatores protetores com os agentes citoprotetores (sucralfato,

misoprostol e quelato de bismuto) ou ainda na erradicação da H. pylori com

antibióticos (UMAMAHESWARI et al., 2006; CHOI et al., 2007). Atualmente, os

métodos endoscópicos controlam em 83 a 93 % dos sangramentos das úlceras

hemorrágicas. Porém, ocorre falha na hemostasia endoscópica, caracterizada

pela recidiva hemorrágica, devendo-se indicar tratamento operatório

(PARREIRA et al., 2002).

74

Apesar dessas intervenções terapêuticas e cirúrgicas serem

consideradas rápidas e eficazes no tratamento da úlcera péptica, há problemas

na utilização destes tratamentos que precisam ser contornadas a exemplo dos

antagonistas H2 que induzem rápida tolerância durante o tratamento e pode

ocorrer efeito rebote após a retirada da droga (CHOI, et al., 2007). Assim, não

existe no mercado fármaco antiulcerogênicos que apresentem 100 % de

eficácia, que impeçam recidivas das lesões ulcerativas e apresentem ausência

de efeitos colaterais. Com isso, se faz necessário a pesquisa de novas

alternativas terapêuticas para o tratamento da úlcera gástrica, principalmente a

partir de produtos naturais.

Entre os vários gêneros que vem despertando grande interesse na

comunidade científica, está o gênero Maytenus, com várias espécies

empregadas na medicina popular para tratar distúrbios gastrintestinais

(CARRICONDE, 2004). A M. ilicifolia é a principal espécie da família

Celastraceae usada para o tratamento da úlcera gástrica. Porém, devido ao

uso indiscriminado no Brasil esta planta está entrando para a lista das espécies

em extinção (NIERO et al., 2001). Faz-se necessário então, se buscar

comprovação de outras espécies que são utilizadas como antiulcerogênicas

que possam servir de alternativa à utilização de M. ilicifolia.

Considerando que não há relato de estudos farmacológicos em relação

a ação antiulcerogênica desta espécie e que a mesma apresenta compostos

potencialmente ativos, a espécie vegetal M. rigida foi selecionada pelo critério

etnofarmacológico e quimiotaxonômico (presença de flavonóides) para a

investigação farmacológica quanto à sua atividade antiulcerogênica nos

modelos de indução aguda de úlcera gástrica, que mais se assemelham às

úlceras gástricas que acometem o homem, buscando a comprovação científica

de sua utilização como antiulcerogênica já consagrada pela população.

Segundo Almeida et al., (2005) esta espécie é rica em triterpenos,

quinonas e flavonóides. Os triterpenos são produzidos pelas plantas para atrair

polinizadores, inibir a germinação e impedir a perda de água. Apresentam

atividades antiespasmódica, cardiovascular, anestésica local, anti-séptica,

antiinflamatória e antitumoral (SIMÕES; SPITZER, 2002). As quinonas

apresentam atividade laxante, antibacterina, antifúngica e antiespasmódica

(BRUNETON, 1991). Os flavonóides são compostos polifenólicos sintetizados a

75

partir do aminoácido fenilalanina, conferem as colorações naturais das plantas

e possuem diversos efeitos bioativos considerados importantes para a saúde

humana (DI CARLO et al., 1999). Apresentam atividades: antineoplásica,

antimutagênica, hepatoprotetora, antiinflamatória, analgésica, antidiabética,

anti-histamínica, antidiarréica, antiespasmódica e gastroprotetora (DI CARLO et

al., 1999; CARVALHO et al., 2002; ZUANAZZI; MONTANHA, 2000).

O efeito gastroprotetor de alguns flavonóides pode ser mediado pela

secreção de muco e bicarbonato, aumento das PGs endógena, inibição das

bombas H+/K+ATPases das células parietais impedindo a secreção ácida,

“varredura” de radicais livres e inibição de mediadores inflamatórios como

leucotrienos e óxido nítrico (DI CARLO et al., 1999; PARK et al., 2004;

ZAYACHKIVSKA et al., 2005).

Os flavonóides isolados da F. AcOEt obtida de M. rigida, a epicatequina

e 4-metilepigalocatequina (ESTEVAM, 2006), apresentam atividade

antioxidante (DAVID et al., 2002) e antiagregante plaquetária (NEIVA et al.,

2003).

Como parte do estudo farmacológico, o EEOH obtido de M. rigida foi

inicialmente avaliado quanto à toxicidade em camundongos de ambos os

sexos, onde foram observados parâmetros comportamentais e o número de

morte dos animais tratados com o extrato, com a finalidade de determinar a

dose letal 50 % (DL50).

A ausência de alterações significativas nos parâmetros analisados e por

não ter havido morte dos animais, demonstra baixa toxicidade desta espécie

vegetal nas condições e doses avaliadas o que impossibilitou a determinação

da DL50.

Segundo Souza Brito (1994) geralmente os extratos brutos vegetais e

seus derivados são testados até a dose de 1000 mg/kg em triagens

farmacológicas. Assim, neste estudo essa dose máxima foi estabelecida

conforme a presença da atividade antiulcerogênica, sendo selecionadas as

doses de 250, 500 e 750 mg/kg do EEOH.

Assim, passou-se a investigar a atividade antiulcerogênica do extrato

etanólico e da fase acetato de etila obtidos da entrecasca do caule de M. rigida.

Esta fase foi escolhida por ser rica em compostos fenólicos como flavonóides

(STEVAM, 2006).

76

O modelo de úlcera induzido por etanol tem sido amplamente utilizado

na triagem de atividade gastroprotetora. As lesões hemorrágicas gástricas

produzidas pelo etanol ocorrem por mecanismos variados, como o efeito tóxico

direto reduzindo a produção de muco e secreção de bicarbonato

(MARHUENDA; MARTIN; LASTRA, 1993), ativação da via da 5-lipoxigenase,

além de diminuir o fluxo sanguíneo, promover superprodução de radicais livres

que levam a peroxidação lipídica (desestabilização da membrana). Estes dois

últimos fatores causam danos na membrana celular, esfoliação, erosão epitelial

e morte celular (BIRDANE et al., 2007).

O etanol absoluto causa necrose das células superficiais da mucosa por

precipitar seus constituintes citoplasmáticos e romper a membrana celular.

Promove perturbação dos mastócitos que liberam mediadores vasoativos como

o leucotrieno C4 (LTC4) e histamina. Estes mediadores por sua vez causam

venoconstrição ao mesmo tempo em que a histamina provoca dilatação

arterial. Estes dois eventos causam hiperemia, que em conjunto com o

aumento da permeabilidade produzida por histamina e LTC4, provocam edema

mucosal. Quando o venoespasmo é muito violento, rompe as veias mucosais e

ocorre então a hemorragia (OATES; HAKKINEN, 1988).

A ingestão crônica ou aguda do etanol causa dano na mucosa gástrica,

que pode estar também associado com a geração de EROs, os quais

produzem um desequilíbrio entre o processo oxidante e antioxidante da célula,

com consequente peroxidação lipídica associada a depleção de componentes

dos sistemas antioxidantes enzimático como a superóxido desmutase (SOD),

glutationa peroxidase (GPx) e glutationa S-transferase (GST) e não enzimático

como a glutationa reduzida (GSH) (HIROKAWA et al., 1998; REPETTO;

LLESUY, 2002).

Após a absorção pelo estômago e a parte superior do intestino, o etanol

é rapidamente transportado para outros órgãos, inclusive para o trato digestivo.

O etanol é então oxidado a acetaldeído pela flora intestinal normal e pelo

fígado, resultando em elavadas concentrações deste metabólito que é volátil e

altamente tóxico. O acetaldeido forma complexo com a glutationa, diminuindo a

disponibilidade deste antioxidante, favorecendo a peroxidação lipídica

(SALASPURO, 2003).

77

Os resultados obtidos neste modelo agudo de indução mostraram que

tanto o EEOH como a F. AcOEt foram capazes de proteger a mucosa gástrica

contra as lesões induzidas por etanol em ratos assim como o extrato também

foi efetivo no modelo de HCl/etanol em camundongos, mostrando um possível

efeito antiulcerogênico da planta investigada.

Como o modelo de etanol é inespecífico, ou seja, essa proteção pode

estar relacionada a fatores anti-secretores ou citoprotetores da mucosa gástrica

(MORIMOTO et al., 1991), passou-se a investigar o modelo de úlcera induzido

por estresse (imobilização e frio), que aponta para um mecanismo anti-

secretório.

O estresse como fator etiológico pode ajudar a explicar a crescente

tendência ao desenvolvimento e complicações da úlcera gástrica. A incidência

de úlcera provocada por estresse tem aumentado pela urbanização da

sociedade, em períodos de grandes movimentos de massa realizados pela

população, em treinamentos militares, além do uso de anticoagulantes e de

altas doses de corticosteróides e prolongadas hospitalização em unidades de

terapia intensiva (BHATIA; TANDON, 2005; METZ, 2005).

Existem vários modelos animais de lesão gástrica induzida por estresse,

como: imobilização, baixas temperaturas, ruídos, nado forçado, radiação,

cirurgias abdominais e cranianas, exposição ao éter e choque (TACHÉ et al.,

2001), mas o modelo mais amplamente utilizado é o que utiliza como agente

agressor a imobilização dos animais a baixas temperaturas (GLAVIN; SZABO,

1992).

O estresse por imobilização e frio é responsável por alterações no SNC,

causando aumento na secreção e motilidade gástrica dependente do nervo

vago e mediado pela liberação do homônio liberador de tirotropina (TRH). Este

hormônio em associação com a dimunuição da tempertaura corporal durante o

estresse, promove liberação do hormônio estimulante da tireóide (TSH)

(TAKEUCHI et al., 1999; TANAKA et al., 2007). Esta atividade vagal quando

exacerbada tem sido sugerida por Goa e Monk (1987) como fator primordial na

ulceração induzida por estresse, uma vez que pode ser parcial ou totalmente

prevenida por vagotomia.

O estresse estimula o sistema nervoso tanto simpático como o

parassimpático no estômago. Esta estimulação é responsável pelo aumento da

78

motilidade com conseqüente aumento da contração do músculo gastrintestinal,

levando a compressão muscular e isquemia mucosal. A estimulação simpática

causa diretamente vasoconstrição arteriolar, com redução significativa do fluxo

sanguíneo, promovendo hipóxia local e isquemia, que gera EROs, peroxidação

lipídica e depleção do conteúdo de glutationa (GUTH; PAULSEN; NAGATA,

1984; BANDYOPADHYAY et al., 2001).

O estresse também aumenta a secreção de ácido e reduz a produção de

muco mediado pela liberação de histamina, aumenta a liberação de radicais

livres, acúmulo de peróxido de hidrogênio que inativa a síntese de PGs e

também favorece a geração de outras EROs (HIRUMA-LIMA et al., 2006).

Estes eventos em combinação exercem papel fundamental na ulceração

gástrica induzida por estresse.

O EEOH e a F. AcOEt de M. rigida foram capazes de inibir o

desenvolvimento das úlceras induzidas por imobilização e frio a exemplo do

lansoprazol. Como no modelo de estresse há um aumento na secreção de

ácido, inibição da secreção de muco e bicarbonato (pela estimulação da via

histaminérgica e pela inibição da ação das PGs), além do aumento na

produção de radicais livres, é possível sugerir que o EEOH e a fase

apresentem atividade antiulcerogênica por mecanismos anti-secretório,

citoprotetor e/ou antioxidante.

Com base nos resultados obtidos, passamos a investigar um modelo

mais específico relacionado com a citoproteção que é o modelo de

antiinflamatório não esteroidal, utilizando para isto EEOH (250, 500 e 750

mg/kg) e F. AcOEt (125, 250 e 500 mg/kg) obtidos de M. rigida em

camundongos.

Os AINEs causam danos na mucosa gástrica tanto no homem como em

animais experimentais, sendo que no homem está associado à administração

crônica destas drogas que provocam efeitos adversos como úlcera gástrica e

duodenal, podendo levar a hemorragia ou perfuração (WALLACE, 2001).

O mecanismo patogênico dessas lesões envolve inúmeros fatores,

sendo freqüentemente atribuído a inibição da biossíntese das PGs

gastroprotetoras, o que acarreta uma superprodução de leucotrienos e outros

produtos da via da 5-lipoxigenase, além de ativação/infiltração de neutrófilos,

distúrbios microcirculatórios, hipermotilidade gastrintestinal e aumento da

79

secreção de ácido luminal, além da ação local destas drogas (SUZUKI et al.,

2000; SCHUBERT, 2006). Os neutrófilos são recrutados para o local da

inflamação por quimiotaxia e participam da amplificação da resposta

inflamatória, promovendo a extensão do dano causado por AINEs e não

participa do início da lesão. A hipermotilidade gástrica é o mais importante

evento no início das lesões produzidas por estes agentes (SUZUKI et al.,

2000).

Os AINEs ao inibirem a síntese das PGs, muda o esvaziamento gástrico

pós-prandial e inibe as contrações migratórias interdigestivas (CMIs) no jejum

que culminam com a retenção de fatores que promovem a injúria gástrica

(NARITA et al, 2006).

Quando em contato direto com a mucosa, os AINEs se dissociam

formando altas concentrações de íons ácidos orgânicos fracos, que quebram o

gradiente de íons hidrogênio entre o lume gástrico e o tecido da mucosa. A

interação entre o lume gástrico e o tecido da mucosa é essencial tanto para

continuidade epitelial, como para manutenção da sua integridade. Os AINEs

causam desestruturação da barreira protetora de muco-bicarbonato e da

membrana das células epiteliais provocando retrodifusão de ácido,

desequilíbrio iônico, formação de radicais livres e morte celular. Esta ação local

sugere que danos na barreira superficial são resultados do contato dos AINEs

com o tecido da mucosa além do reflexo de uma resposta bioquímica e

farmacológica, como a inibição da COX (WALLACE; BELL, 1996;

LICHTENBERGER, 2001).

Os AINEs alteram as propriedades hidrofóbicas da superfície da mucosa

gastrintestinal, tornando-a mais susceptível a injúria, mesmo quando

administrados por via parenteral, sugerindo que o dano local pode não ser o

principal mecanismo da toxicidade gastroduodenal produzida por esta classe

de droga. Esta alteração na hidrofobicidade pode persistir por até 24 horas

devido a circulação enterohepática sofrida pelos AINEs (LUGEA et al., 1997).

Muitos AINEs como o piroxicam são ácidos fracos que se concentram no

interior da células gástricas cujo pH é baixo. Estudos in vitro e in vivo têm

mostrado que os AINEs ou aumentam a secreção basal de ácido ou

80

potencializam a secreção estimulada por vários agentes como a histamina

(SCHUBERT, 2006).

Neste modelo o EEOH e a F. AcOEt obtidos de M. rigida, também

mostraram efeito gastroprotetor ao inibir a formação das úlceras induzidas por

piroxicam. Mesmo não sendo este um modelo de indução muito específico,

uma vez que envolve além do mecanismo citoprotetor clássico inibidor da

síntese de prostaglandina, envolve mecanismos anti-secretórios e

antioxidadantes, é possível sugerir um efeito citoprotetor do extrato e da fase.

Com base nestes dados, pode-se concluir parcialmente que o EEOH e

fase AcEOt obtido de M. rigida, inibiram as ulcerações gástricas produzidas

pelos agentes lesivos utilizados nos modelos agudos de úlcera e que pode

estar relacionado tanto a inibição da secreção ácida gástrica, aumento dos

mecanismos de proteção da mucosa, bem como pela ação antioxidante.

Estes resultados são semelhantes aos obtidos com outras espécies de

Maytenus, a exemplo de M. ilicifolia (SOUZA-FORMIGONI et al, 1991; JORGE

et al, 2004; BAGGIO et al., 2007), M. truncata (SILVA et al., 2005), M.

aquifolium (SOUZA-FORMIGONI et al, 1991; BERSANI-AMADO et al., 2000;

GONZALEZ et al., 2001), M. robusta (ANDRADE et al., 2007).

Analisando a proteção promovida tanto pelo EEOH quanto pela fase

AcEOt obtidos de M. rigida nos modelos de indução aguda de úlcera gástrica

que avaliam a existência de possível atividade antiulcerogênica e utilizando o

teste estatístico de Tukey que faz a comparação de todos os grupos entre si,

foi observado que os grupos tratados com as doses de 500 e 750 mg/kg de

EEOH não apresentaram diferenças significativas entre si; o mesmo foi

observado com as doses de 250 e 500 mg/kg da F. AcOEt, o que permitiu

definir a dose de 500 mg/kg para o EEOH e de 250 mg/kg para a F. AcOEt

como as melhores doses, que passaram a ser utilizadas na determinação do

mecanismo de ação.

O ácido gástrico é um importante fator para a gênese da ulceração em

ratos com ligadura do piloro (SHAY et al.,1945). Segundo Baggio et al., (2003)

a ligadura do piloro promove hipersecreção gástrica devido ao reflexo vago-

vagal promovido pelo estímulo dos mecanorreceptores presentes na mucosa

antral e a distensão gástrica produzida pelo acúmulo de secreção parece

influenciar ainda mais a secreção ácida, possivelmente pelo aumento na

81

liberação de hormônios gastrintestinais. Neste modelo as úlceras ocorrem

também devido a autodigestão da mucosa gástrica e rompimento da barreira

de muco gástrico (SAIRAM et al., 2002). É um modelo que mostra possíveis

alterações nos parâmetros bioquímicos do conteúdo gástrico (TOMA et al.,

2004) como pH, acidez total e volume gástrico, podendo ser considerada como

atividade anti-secretória as substâncias que afetam a acidez gástrica.

No entanto, a administração do EEOH e F. AcOEt por via intraduodenal

não produziu alterações significativas em nenhum dos parâmetros avaliados,

diferente da cimetidina, o que sugeri portanto, que ambos EEOH e F. AcOEt

não apresentaram atividade sistêmica quando administrados pela via

selecionada. Porém, a atividade anti-secretória de M. rigida não pode ser

totalmente descartada, uma vez que esta amostra vegetal não foi avaliada

nesse modelo por via oral e não foram determinados os níveis dos hormônios

gastrina e somatostatina que são fortes indicadores de atividade anti-

secretória.

No modelo de ligadura do piloro, os resultados diferem daqueles

apresentados pela fração rica em flavonóides de M. robusta, que apresentou

redução do volume gástrico e da acidez total e aumento do pH gástrico

(ANDRADE et al., 2007).

Na seqüência, avaliamos o potencial de cura da espécie em estudo, ou

seja, a capacidade de acelerar o processo de cicatrização da úlcera induzida

por ácido acético 30 %. Este modelo em ratos introduzido por Takagi, Okabe;

Saziki (1969) se assemelha à úlcera crônica humana em termos de

características patológicas e mecanismo de cicatrização, responde bem a

várias drogas antiulcerogênicas como inibidores de bomba, sucralfato e fatores

de crescimento, além de ocorrer recidiva espontânea como em pacientes com

úlcera péptica (OKABE, AMAGASE, 2005).

O ácido acético promove a formação de úlcera de natureza perfurativa

devido a liberação de histamina, que aumenta a permeabilidade capilar e a

retrodifusão de ácido gástrico (TAKAGI, OKABE; SAZIKI, 1969;

UMAMAHESWARI et al., 2006).

Histologicamente a úlcera é formada por duas estruturas principais, a

margem da úlcera formada pela mucosa não necrótica, em que as glândulas

tornam-se dilatadas e suas células sofrem diferenciação, expressam receptores

82

para o fator de crescimento epidermal e proliferam ativamente e a base da

úlcera formada por tecido de granulação que se desenvolve após 48 - 72 horas

após a ulceração. O tecido de granulação é formado de células do tecido

conectivo (macrófagos, fibroblastos e células endoteliais) (TARNAWSKI, 2005).

A cicatrização da úlcera é um processo complexo que envolve migração

celular, proliferação, reepitelização, angiogênese e deposição da matrix. Todos

estes eventos são controlados por fatores de crescimento, fatores de

transcrição e citocinas e culminam com a formação de escaras (TARNAWSKI,

2005). Estes processos são acompanhados por aumento do fluxo sanguíneo

na área lesada, aumento nos níveis de gastrina plasmática e de citocinas pró-

inflamatórias como o fator de necrose tumoral alfa e interleucina-1 beta

(BRZOZOWSKI, 2003), que são regulados pelos fatores de crescimento, em

especial o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF). A angiogênese

no tecido de granulação na base da úlcera e a replicação das células epiteliais

na margem da úlcera restabelecem a arquitetura glandular (WALLACE, 2005),

como também restauram a lâmina própria (MILANI; CALABRO, 2001; SHIN et

al., 2002; TSUJI et al., 2002). A medida que a úlcera vai sendo cicatrizada,

ocorre uma redução desses fatores (BRZOZOWSKI; KONTUREK;

KONTUREK, 2001).

O NO endógeno acelera a cicatrização da úlcera por manter o fluxo

sanguineo próximo à área lesada e aumentar a angiogênese. Quando gerado

pela iNOS o NO pode ter efeito benéfico na cicatrização da úlcera por induzir

apoptose das células inflamatórias (BRZOZOWSKI, 2003; OKABE, AMAGASE,

2005). No entanto, Guo et al., (2003) mostraram que a ativação da enzima

iNOS pode contribuir para a inflamação durante a formação da úlcera,

enquanto que as enzimas HO-1 (enzima que metaboliza grupos heme a

biliverdina, monóxido de carbono e ferro) e COX-2 quando ativadas podem

promover cicatrização com resolução da inflamação e remodelagem do tecido

ulcerado.

A secreção de muco e bicarbonato, que pode ser aumentado tanto por

PGs quanto por NO, também é importante no processo de cicatrização da

úlcera, uma vez que a camada formada por muco e bicarbonato protege as

células recém formadas da ação do ácido gástrico (TARNAWSKI et al, 1995;

LIMA et al, 2006).

83

O modelo de úlcera induzida por ácido acético em rato também serve de

suporte para monitorar a evolução do peso corporal em animais submetidos a

diferentes tratamentos, além de ser um indicador da possível presença de

toxicidade subaguda após 14 dias de tratamento em relação a parâmetro como

peso relativo de órgãos vitais (CALVO et al., 2007).

No experimento de úlcera induzida por ácido acético 30 %, a fase AcEOt

e cimetidina foram capazes de acelerar a cicatrização da úlcera gástrica

crônica em ratos. Resultados semelhantes também foram observados por

Baggio et al., (2007) para M. ilicifolia.

Os animais também não apresentaram diferenças significativas em

relação ao ganho de peso corporal, nem ao peso relativo dos órgãos vitais

como coração, fígado, baço e rins, em relação ao grupo controle. Esses dados

em conjunto com os obtidos na triagem comportamental, indicam a baixa

toxicidade da espécie M. rigida.

Na pespectiva de compreender os mecanismos envolvidos na ação

antiulcerogênica do EEOH e F. AcOEt obtidos da entrecasca do caule de M.

rigida passou-se a investigar modelos experimentais que envolva a

participação de muco, PGs, NO e grupos sulfidrila (SHs).

O muco gástrico é um importante fator protetor da mucosa gástrica e

consiste de glicoproteínas semelhantes às mucinas, que podem ser detectadas

pela quantidade de alciam blue ligado a elas (BOLTON; PALMER; COHEN,

1978). O muco pode ser encontrado aderido à mucosa gástrica (também

conhecido como muco insolúvel) ou muco livre (também conhecido como muco

solúvel).

A propriedade protetora da barreira de muco não depende somente da

estrutura de gel, mas também da quantidade ou da espessura da camada de

muco que recobre a superfície mucosal (PENISSI; PIEZZI, 1999).

Tanto PGE2 quanto NO são responsáveis pela produção e liberação de

muco das células epiteliais e células do colo das glândulas gástricas, e os

compostos sulfidrílicos são responsáveis por manterem a estabilidade do muco

ao formar pontes de dissulfeto com suas subunidades (AVILA et al., 1996;

CHANDRANATH, BASTAK; SINGH, 2002; KUSHIMA et al., 2005).

No experimento no qual o conteúdo de muco aderido à mucosa foi

usado como indicador da secreção de muco, os resultados mostram que o

84

tratamento dos animais com a fase AcEOt (250 mg/kg), aumentou

significativamente o conteúdo de muco gástrico, sugerindo que o efeito desta

fase é mediado pelo aumento da secreção de muco.

As PGs, principalmente a PGE2, exercem importante papel na proteção

da mucosa gástrica contra vários agentes necrotizantes. Ela fortalece a barreira

mucosal ao aumentar a produção de muco e secreção de bicarbonato,

melhorar a circulação, diminuir a difusão de ácido, aumentar os níveis de

fosfolipídeos na superfície epitelial (que aumenta a hidrofobicidade mucosal),

inibir a formação de radicais livres e liberação de enzimas pelos neutrófilos,

diminuir a motilidade, além de inibir apoptose (HOSHINO et al, 2003; LIMA et

al, 2006; CHOI et al., 2007).

A síntese da PGE2, a partir do ácido araquidônico, pela ação das

enzimas COX-1 e COX-2 é estimulada nas células da mucosa gástrica na

presença de substâncias biologicamente ativas como citocinas, NO e ACh

(OHNISHI et al., 2001; GUDIS; SAKAMOTO, 2005).

As PGs derivadas da COX-2 induzem a produção do fator de

crescimento do hepatócito (HGF), fator de crescimento do endotélio vascular

(VEGF) (envolvido na angiogênese) e fator de crescimento epidérmico (EGF)

(envolvido na proliferação celular) que estão envolvidos nos processos de

reparo da úlcera dependente (GUDIS, SAKAMOTO, 2005).

O efeito biológico das PGs, é mediado por receptores de membranas

específicos, denominados receptores EP1, EP2, EP3 e EP4, que são acoplados

a proteínas-G de membrana, porém com diferentes vias de transdução de sinal

intracelular (SUGIMOTO; NARUMIYA; ICHIKAWA, 2000). A ativação do

receptor EP1 resulta na liberação intracelular de IP3 e DAG ativando a via do

Ca2+, enquanto que ligantes de EP2 e EP4, ativam o sistema ciclase de adenilil-

AMPc e ligantes EP3 inibem esse sistema (PAWLIK et al., 2002).

A capacidade das PGs de impedir o aparecimento das lesões

produzidas por AINEs é funcionalmente relacionada a inibição da motilidade,

que atenua os distúrbios microcirculatórios devido a contração do estômago

(SUZUKI et al., 2000).

A ação preventiva das PGs derivadas da COX-2 no local da inflamação

contra a ação de agentes necrotizantes é conhecida como citoproteção

(GUDIS, SAKAMOTO, 2005; LIMA et al, 2006; CHOI et al., 2007) e a inibição

85

da biossíntese das PGs por indometacina e outros AINEs relacionados

suprime este efeito (GRETZER et al, 1998).

Com base nessas informações passou-se a investigar a participação da

PGE2 na produção de muco promovido por M. rigida. Os resultados obtidos

demonstram que a F. AcOEt não promoveu aumento na produção de PGE2

quando comparada ao seu respectivo controle o que indica que o aumento do

muco produzido pela fase independe do aumento da síntese de PGs, o que

sugeri o envolvimento de outra via que não a das PGs.

Assim, passou-se a investigar o envolvimento do óxido nítrico no

aumento da produção de muco, uma vez que o NO em seu mecanismo

gastroprotetor também é capaz de aumentar a produção e liberação do muco.

O NO liberado das células endoteliais e células neuronais está envolvido

na manutenção da integridade da mucosa gástrica, pois mantém o fluxo

sanguíneo que é fundamental para a proteção da mucosa (MARTIN; JIMÉNEZ;

MOTILVA, 2001; GUO et al., 2003). Além disso, promove inibição da adesão e

migração de leucócitos, atua como seqüestrador de radicais livres, inibe a

secreção de ácido, promove secreção de muco, promove reparo tecidual e

inibe a agregação plaquetária (WALLACE; GRANGER, 1996; MARTIN;

JIMÉNEZ; MOLTIVA, 2001; GUO et al., 2003). O NO também está envolvido

na regulação do peristaltismo intestinal, do esvaziamento gástrico e na

atividade motora antral além de participar do processo de cicatrização da

úlcera gástrica (GUO et al., 2003).

A inibição da síntese do NO por L-NAME, promove diminuição do fluxo

sanguíneo mucosal, indicando que o NO diminui a lesão induzida por etanol

pela regulação da microcirculação (MATSUDA et al., 1999).

Assim para averiguar o envolvimento do óxido nítrico no mecanismo

protetor da mucosa do EEOH e F. AcOEt obtidos de M. rigida, foi realizado o

modelo agudo de úlcera induzida por etanol em ratos pré-tratados com N-nitro-

L-arginina-metil-ester (L-NAME) uma droga bloqueadora da síntese do NO, em

que foi observado que a proteção produzida pelo extrato e fase foi revertida

pela administração prévia de L-NAME. Portanto, pode-se sugerir que M. rigida

promove citoproteção depedente das ações do NO, possivelmente por

aumentar a produção de muco.

86

Na seqüência passou-se a investigar a participação dos grupos sulfidrila

na citoproteção produzida por M. rigida.

Os organismos aeróbios são protegidos da ação de ROS por meio de

sistemas antioxidantes como as enzimas superóxido desmutase, glutationa

peroxidase e catalase, e sistemas antioxidantes não enzimáticos a exemplo do

β-caroteno, a vitamina C e compostos sulfidrila como a glutationa (BIRDANE et

al., 2007).

Antioxidantes sintéticos são extensivamente utilizados como aditivos

alimentares e são consumidos em quantidades apreciáveis, porém problemas

de toxicidade têm sido cada vez mais constantes com a utilização destes

agentes, o que tem aumentado o interesse no desenvolvimento de

antioxidantes naturais (REPETTO; LLESUY, 2002).

A GSH é o tiol não protéico mais abundante nas células dos mamíferos,

sendo considerada como o mais importante composto sulfidrila intracelular,

estando envolvido em muitos processos funcionais, celulares e principalmente

quanto a sua participação em algumas reações de detoxicação (JORDÃO

JÚNIOR et al., 1998).

Os grupos sulfidrílicos são classificados em proteicos (composto de

peptídeos de baixo peso molecular como a glutationa na sua forma reduzida –

GSH) e não protéicos (composto das proteínas de alto peso molecular, como a

glutationa complexada a albumina) (FAURE; LAFOND, 1995; JORDÃO

JÚNIOR et al., 1998).

A glutationa funciona como seqüestrador nucleofílico e como co-fator na

redução do peróxido de hidrogênio mediado pela enzima glutationa-peroxidase

sendo, portanto, antioxidante endógeno. É oxidada a glutationa dissulfeto ao

doar elétrons para a glutationa peroxidase e/ou reagir diretamente com as

ROS, que podem subseqüentemente reduzir os níveis de GSH (BIRDANE et

al., 2007).

A GSH protege a mucosa gástrica do estresse oxidativo induzido por

etanol ao se ligar aos radicais livres que são formados após a injúria tecidual

por este agente nocivo. O etanol quebra as pontes de sulfetos que unem as

subunidades de muco tornando o muco solúvel em água, reduzindo assim seu

efeito protetor (KUSHIMA et al., 2005).

87

O possível envolvimento de compostos sulfidrila endógenos no efeito

gastroprotetor de M. rigida foi investigado no modelo de úlcera induzido por

etanol, em que os animais foram pré-tratados com NEM (bloqueador de

sulfidrila) antes da administração do agente lesivo. Tanto o EEOH quanto a F.

AcOEt tiveram seus efeitos protetores da mucosa gástrica reduzidos quando

comparados aos grupos que foram pré-tratados com solução salina 0,9 %,

indicando a participação de SHs endógenos no efeito gastroprotetor da espécie

em estudo. Este resultado difere do encontrado para a fração rica em

flavonóides de M. ilicifolia (BAGGIO et al., 2007).

Com base nos dados apresentados, podemos sugerir que M. rigida

promove citoproteção ao aumentar o conteúdo de muco gástrico e que este

aumento está relacionado a participação do NO e grupamentos sulfidrila,

porém, independente de prostaglandina. É possível que os flavonóides

presentes em M. rigida, especialmente na F. AcOEt sejam, pelo menos em

parte, responsáveis pela atividade citoprotetora desta espécie, uma vez que os

flavonóides possuem propriedades anti-oxidantes, além de reforçar o sistema

de defesa da mucosa gástrica através do estímulo da secreção muco (MARTIN

et al., 1994; ANIAGU et al., 2005).

Como não podemos descartar o possível efeito do extrato e fase sobre

outros mediadores que contribuem para a ulceração e ou proteção da mucosa

gástrica, novos experimentos para melhor caracterizar os mecanismos

envolvidos na gastroproteção de M. rigida deverão ser realizados.

Em geral drogas que apresentam atividade antiinflamatória também

apresentam a propriedade de inibir a diarréia induzida por óleo de rícino,

sugerindo o envolvimento das PGs (AWOUTERS et al., 1978) e/ou do NO

(MASCOLO et al., 1994) no seu mecanismo.

Nessa pespectiva e considerando que M. rigida apresenta indicação

popular no tratamento de distúrbios gastrintestinais (CARRICONDE, 2004) e

apresentou ação antiinflamatória no modelo edema de pata induzida por

carragenina (SANTOS et al, 2007), passou-se a investigar o possível efeito do

EEOH e F. AcOEt obtidos de M. rigida sobre o intestino pelos modelos de

diarréia induzida por óleo de rícino e do modelo de motilidade intestinal.

A diarréia resulta de anormalidades funcionais do tubo digestivo, que

produzam redução da absorção ou aumento da secreção de água e eletrólitos

88

(OLIVEIRA, 2003). É tida como a passagem do conteúdo intestinal não

formado a uma taxa diária correspondente ao dobro de uma pessoa normal.

Para restaurar este processo, muitos pacientes necessitam de terapia

antidiarréica, que objetiva aumentar a resistência ao fluxo e aumentar a

absorção mucosal e diminuir a secreção (AKINDELE; ADEYEMI, 2006).

O óleo de rícino, extraído das sementes de Ricinus communis quando

ingerido é hidrolisado pelas lípases pancreáticas a glicerol e ácido ricinoléico,

sendo este último o responsável pela atividade diarréica do óleo (AKINDELE;

ADEYEMI, 2006).

Vários mecanismos têm sido propostos para a diarréia induzida por óleo

de rícino, nos quais podemos citar a inibição da atividade da enzima Na+, K+-

ATPase intestinal, o que reduz a absorção de fluidos normais; ativação da

adenilato ciclase com conseqüente aumento de AMPc mucosal o qual medeia

o acúmulo de secreção no intestino delgado e cólon e afeta a contratilidade do

músculo liso intestinal; estimulação da síntese de PGs que por sua vez inibe

reabsorção de NaCl e água; além da estimulação da secreção do fator de

ativação plaquetário (ROUF et al., 2007; AFROZ et al., 2006). Mascolo et al.

(1994) descreveram o envolvimento também do NO ao observarem que

inibidores da sintase do NO impedem a diarréia induzida por óleo de rícino em

ratos. Uchida et al. (2000) citam que o NO está implicado na ativação

colinérgica da secreção de água.

Para determinarmos o efeito antidiarréico do EEOH e F. AcOEt de M.

rigida, foi utilizado o teste com óleo de rícino, que é amplamente empregada

para o “screen” de drogas com esta propriedade. Uma das vantagens deste

modelo é a grande reprodutibilidade de evacuação de fezes não formadas duas

horas após a administração laxante (BORRELLI, et al., 2006).

O EEOH e F. AcOEt foram capazes de inibir a diarréia neste modelo,

podendo esta inibição ser pelo aumento da absorção de água e eletrólitos no

TGI, uma vez que diminuiu o números de bolos fecais líquidos.

Drogas que inibem o trânsito intestinal em estados fisiopatológicos

podem ser eficazes no alívio da diarréia (BORRELLI, 2006). Suzuki et al (2000)

sugerem que a hipermotilidade gástrica tem estreita relação com a formação da

úlcera induzida por AINES como a indometacina. Com a hipermotilidade

gástrica, ocorre um aumento da motilidade intestinal. Segundo Anthony et al.

89

(1993), contrações anormais da parede intestinal promovem ruptura da camada

de muco sobre o epitélio gastrintestinal, levando a um aumento da

susceptibilidade da mucosa a ação de patógenos e substâncias irritantes.

A hipermotilidade intestinal pode ser devida à deficiência de PG

periféricas, enquanto que a hipermotilidade gástrica pode ser devido à

deficiência de PG tanto periférica quanto centrais (YOKOTA et al., 2005).

O NO também está envolvido na regulação da motilidade gastrintestinal,

uma vez que é capaz de diminuir o trânsito intestinal (YU; LIAO; CHEN, 2000).

O NO é um NT inibitório do músculo liso intestinal de humanos, agindo

via mecanismo mediado pelo ciclase de guanilil/GMPc e mecanismo

independente de GMPc (TODA; HERMAN, 2005) e está envolvido na

regulação da motilidade gastrintestinal, uma vez que é capaz de diminuir o

trânsito intestinal (YU; LIAO; CHEN, 2000). Tem sido demonstrado que a

inibição da biossíntese do NO desencadeia o aparecimento de uma rápida

propagação das contrações migratórias pós-prandial, indicando que o NO está

envolvido na modulação da motilidade intestinal no jejum e no pós-prandial

(TODA; HERMAN, 2005).

Em sua revisão sobre o estresse e o trato gastrintestinal, Bhatia e

Tandon (2005) descrevem que o estresse aumenta a permeabilidade colônica

e o número de mastócitos mucosal. Os produtos da degradação dos mastócitos

promovem influxo de células polimorfonucleares e aumentam a secreção e a

motilidade intestinal levando a dor e a diarréia.

É também conhecido que a velocidade do curso intestinal é um dos

fatores que afetam a intensidade da absorção luminal. Assim, provavelmente

as substâncias que diminuem a motilidade gastrintestinal, regulam a

biodisponibilidade de drogas administradas por via oral, como os agentes

antiúlcera, assim favorecendo o processo de cicatrização da úlcera (KUSHIMA

et al., 2005).

O modelo de transito intestinal consiste na administração de um

marcador (solução de carvão ativado 5 % em goma arábica 5 %) e na

avaliação do trajeto do mesmo no intestino delgado durante um período de

tempo (STICKNEY; NORTHUP, 1959). O EEOH e a F. AcOEt obtidos de M.

rigida demonstraram efeito inibitório sobre a propulsão intestinal tanto normal

90

quanto induzida por óleo de rícino, porém sem significância estastística entre

os dois modelos.

Uma propriedade antiespasmódica pode ser deduzida do fato que a

referida espécie causou uma diminuição no movimento propulsivo do carvão

ativado no intestino delgado, sugerindo que no efeito inibitório sobre a

motilidade intestinal pode estar envolvido um mediador local como o NO, pois

estudos demonstram que inibidores da NOS aumentam a freqüência de

contrações e aumentam o esvaziamento gastrintestinal (TACK et al., 2002).

Isto pode contribuir ao menos em parte para a atividade antidiarréica por

permitir um maior tempo para absorção de água e eletrólitos pelo TGI, e por

dificultar o esvaziamento gástrico, o que é importante também para impedir o

aparecimento da úlcera gástrica, sendo um indicativo de que há envolvimento

do tônus muscular na atividade antiúlcera do EEOH e da F. AcOEt obtidos da

M. rigida.

O modelo do músculo liso intestinal de cobaia é um meio importante

para se investigar mecanismos de ação de substâncias que possam ser

utilizadas em processos fisiopatológicos, como, diarréias e cólicas intestinais. A

diarréia é um problema médico frequente (FARTHING, 2000) e ainda é uma

das principais ameaças à saúde em populações pobres de países tropicais e

subtropicais. A Organização Mundial da Saúde (OMS) calcula que 3-5 bilhões

de casos ocorrem anualmente (1 bilhão de crianças menores de 5 anos) e

cerca de 5 milhões de mortes ocorrem devido a diarréia anualmente (2,5

milhões de crianças menores de 5 anos) (HEINRICH et al., 2005; ESTRADA-

SOTO et al., 2007).

Alguns agentes antidiarréicos são conhecidos por apresentar efeito

antiespasmódico (HAJHASHEMI et al., 2000), como por exemplo, difenoxilato

(Lomotil) e loperamida (Imosec), entretanto podem causar depressão do

Sistema Nervoso Central (RYU et al., 2004). Sem contar com os

antiespasmódicos ou espasmolíticos clássicos como o extrato fluido de

beladona (Elixir Paregórico), tintura de ópio, atropina, escopolamina

(Buscopan), papaverina, diciclomina (Bentyl), dentre outros que também

apresentam efeitos centrais (BROWN; TAYLOR, 2006; KOROLKOVAS, 2007).

91

Com objetivo de investigar se o EEOH e a sua F. AcOEt estariam

exercendo efeito antiespasmódico, avaliou-se seus efeitos sobre o íleo de

cobaia pré-contraido com KCl ou com carbacol. A evidência de que tanto o

extrato como a F. AcOEt induziram relaxamento do íleo pré-contraído

comprovam esta hipótese. O fato de não haver diferença significante entre a

potência relaxante do EEOH e da F. AcOEt frente aos agentes contráteis

testados sugere que esses podem estar agindo por um mecanismo de ação

comum à via de sinalização dos agentes contráteis testados, e não em nível de

receptor na membrana plasmática.

Uma vez que o íleo é um órgão totalmente dependente de variação do

potencial de membrana (NOUAILHETAS et al., 1985) e como o componente

tônico da contração induzida por agonistas de acoplamento misto (fármaco e

eletromecânico) como carbacol (UNNO; KOMORI; OHASHI, 1995; BOLTON et

al., 1981) ou por um agente despolarizante (KCl) (acoplamento eletromecânico)

é mantido quase que exclusivamente por influxo de Ca2+ através dos canais de

Ca2+ dependentes de voltagem (CaV) (BOLTON, 1979; REMBOLD, 1996;

BOLTON; 2006), sugere-se que o EEOH e a F. AcOEt podem estar agindo por

bloqueio do influxo de Ca2+ através dos CaV.

Os resultados apresentados nesse trabalho ora desenvolvido indicam

uma ação citoprotetora do EEOH e da F. AcOEt obtidos de M. rigida

dependente da liberação de muco sem participação efetiva das PGs, porém

dependente da via do NO, além da participação de grupamentos sulfidrílicos

não-protéicos, e também atividade antidiarréica e antimotilidade que podem

ajudar na ação antiulcerogênica. Provavelmente essas atividades, estão

relacionadas, ao menos em parte, à presença dos flavonóides presentes no

EEOH e na F. AcOEt.

Neste contexto, os resultados obtidos neste estudo nos fornecem base

farmacológica para utilização de M. rigida, validando seu uso popular e

indicando seu potencial terapêutico como antiulcerogênico, antidiarréico e

antiespasmódico.

92

6 CONCLUSÕES

� O extrato etanólico (EEOH) obtido da entrecasca do caule de

Maytenus rigida Mart. (Celastracea) apresentou baixa toxicidade (in

vivo) nas condições avaliadas por não alterar o comportamento e não

causar morte nos animais;

� O extrato EEOH e a fase acetato de etila (AcOEt) obtidos da M.

rigida, nas doses utilizadas apresentaram atividade antiulcerogênica

frente aos agentes indutores: etanol, antiinflamatório não-esteroidal

(piroxicam) e estresse (imobilização e frio);

� A atividade antiulcerogênica está relacionada com aumento na

produção de muco gástrico, com participação de NO e grupamentos

sulfidrila;

� O EEOH e a F. AcOEt não alteraram os parâmetros bioquímicos do

suco gástrico: volume gástrico, pH e concentração de H+, sugerindo

a não absorção sistêmica;

� A F. AcOEt induziu o processo de cicatrização da úlcera gástrica por

ácido acético após tratamento crônico;

� O EEOH e a F. AcOEt apresentaram atividade antidiarréica em

camundongos;

� O EEOH e a F. AcOEt inibiram a motilidade intestinal normal e

induzido por óleo de rícino em rato;

� O EEOH e a F. AcOEt apresentaram efeito antiespasmódico em íleo

isolado de cobaia.

93

7 PERSPECTIVAS

De acordo com os resultados obtidos da investigação da atividade

antiulcerogênica e antidiarréica do EEOH e da F. AcOEt obtidos da entrecasca

do caule de Maytenus rigida Mart., propõem-se as seguintes perspectivas para

complementar esse estudo:

� Determinar os níveis séricos de somatostatina e gastrina;

� Determinar os parâmetros bioquímicos do suco gástrico quando avaliada

a via oral de administração;

� Avaliar os fatores envolvidos no processo de cicatrização de lesões

ulcerativas no modelo crônico de úlcera gástrica;

� Avaliar os mecanismos de ação antioxidante de M. rigida;

� Determinar o envolvimento da bomba H+, K+ no mecanismo de ação de

M. rigida;

� Avaliar as via envolvidas na alteração na motilidade gastrointestinal

promovida pelo extrato e pela F. AcOEt;

� Avaliar a participação de canais iônicos no efeito antiespasmódico de M.

rigida.

� Identificar os princípios ativos presentes nas frações ativas.

94

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APÊNDICES

Apêndice 1

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Apêndice 2

Carta de submissão do artigo "Evaluation of the antiulcerogenic activity obtained from the extract ethanolic of Maytenus rigida Mart. in rodents" Dear Dr.Batista, Your submission entitled "Evaluation of the antiulcerogenic activity obtained from the extract ethanolic of Maytenus rigida Mart. in rodents" has been received by journal Journal of Ethnopharmacology You will be able to check on the progress of your paper by logging on to Elsevier Editorial as an author. The URL is http://ees.elsevier.com/jep/. Your manuscript will be given a reference number once an Editor has been assigned. Thank you for submitting your work to this journal. Kind regards, Journal of Ethnopharmacology

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ANEXOS

Anexo 1- Protocolo experimental para triagem comportamental Planta selecionada Doses Data Via de administração Animais Responsável técnico Grupos

Quantificação dos efeitos (0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente,

(++) efeito intenso

Atividade farmacológica

Até 30’ 1 h 2 h 3 h 4 h 1 – SNC A- Estimulantes Hiperatividade Irritabilidade Agressividade Tremores Convulsões Piloereção Movimento intenso das vibrissas Outros B- Depressora Hipnose Ptose Sedação Anestesia Reflexo do endireitamento Catatonia Analgesia Resposta ao toque diminuído Perda do reflexo corneal Perda do reflexo auricular C- Outros comportamentos Ambulação Groming Rearing Escalar Vocalizar Sacudir a cabeça Contorções abdominais Abdução das patas do trem posterior Estereotipia 2 – SN AUTÔNOMO Diarréia Constipação Defecação aumentada Respiração forçada Lacrimejamento Micção Salivação Cianose Tono muscular Força para agarrar 3 – MORTE

Fonte: ALMEIDA et al., 1999.

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Anexo 2- Certidão de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal do

LTF/UFPB

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