VANESSA PINHO RIBEIROlivros01.livrosgratis.com.br/cp034042.pdf · iii PINHO-RIBEIRO, VANESSA Estudo da distribuição e do efeito terapêutico da administração intramiocárdica

VANESSA PINHO RIBEIRO

ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO E DO EFEITO

TERAPÊUTICO DA ADMINISTRAÇÃO

INTRAMIOCÁRDICA OU INTRAVENOSA DAS

CÉLULAS MONONUCLEARES DE MEDULA

ÓSSEA NO MODELO EXPERIMENTAL DE

INFARTO DO MIOCÁRDIO.

TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO

DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE

DOUTOR EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2 0 0 7

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ii


ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO E DO EFEITO TERAPÊUTICO

DA ADMINISTRAÇÃO INTRAMIOCÁRDICA OU

INTRAVENOSA DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DE

MEDULA ÓSSEA NO MODELO EXPERIMENTAL DE

INFARTO DO MIOCÁRDIO.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Bioengenharia e Biotecnologia Animal de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências biológicas (Fisiologia).

Orientadores: Antônio Carlos Campos de Carvalho

Regina Coeli dos Santos Goldenberg

Rio de Janeiro 2007

iii

PINHO-RIBEIRO, VANESSA Estudo da distribuição e do efeito terapêutico da administração intramiocárdica ou intravenosa

das células mononucleares de medula óssea no modelo experimental de infarto do miocárdio.

Vanessa Pinho Ribeiro. Rio de Janeiro, 2007.

xiii, 115f

Tese de Doutorado em Ciências Biológicas (Fisiologia) - Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2007.

Orientadores: Antônio Carlos Campos de Carvalho e Regina Coeli dos Santos Goldenberg

1- Infarto Agudo do Miocárdio 2-Medula óssea 3-Terapia celular 4- Tecnécio.

I - Universidade do Rio de Janeiro.

II- Título

iv


ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO E DO EFEITO TERAPÊUTICO DA

ADMINISTRAÇÃO INTRAMIOCÁRDICA OU INTRAVENOSA DAS

CÉLULAS MONONUCLEARES DE MEDULA ÓSSEA NO MODELO

EXPERIMENTAL DE INFARTO DO MIOCÁRDIO.

Rio de Janeiro, 16 de maio de 2007.

Antônio Carlos Campos de Carvalho

Pós-Doutor - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)

Regina Coeli dos Santos Goldenberg

Pós-Doutora - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)

Léa Mirian Barbosa da Fonseca

Doutora - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)

Paulo Roberto Slud Brofman Doutor - Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC-PR)

Rosália Mendez-Otero

Pós-Doutora - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)

v

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Cardiologia Celular e Molecular

(LCCM) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de

Janeiro (UFRJ), sob orientação do Dr. Antônio Carlos Campos de Carvalho e co-orientação

da Drª Regina Coeli dos Santos Goldenberg com o apoio financeiro das seguintes instituições:

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ).

Programa Nacional de Excelência (PRONEX).

vi

Esta tese é dedicada

Aos meus pais, Jofre e Luiza, pelo apoio emocional proporcionado todos estes anos,

seja diante da dificuldade para realização de um experimento, ou durante o nervosismo

excessivo proporcionado pelo exame de qualificação. Pelo exemplo de dedicação, amor,

carinho, união e caráter que vocês me proporcionaram durante toda a minha vida. Por me

ensinarem que sempre devemos ir em busca de nossos sonhos de forma digna, honesta, sem

trapaças e falsidade. Por me mostrarem que a vida é feita de obstáculos que devem ser vividos

e vencidos, para que possamos aprender com nossos erros, amadurecer, e nos tornarmos

pessoas melhores. Muito obrigada por tudo e principalmente por me apoiarem, acreditarem no

meu potencial, e torcerem incondicionalmente pelo sucesso da BIOMÉDICA de vocês na

ciência.

A minha tia Eliane (LILI), que sempre esteve presente nos meus momentos de

angústia, nervosismo e nas conquistas também. Por sempre zelar pelo meu bem-estar, e se

interessar pelo andamento da tese, e meus projetos futuros. Muito obrigada pelo amor e

carinho de sempre.

vii

Não basta ensinar ao homem uma especialidade, porque

se tornará assim uma máquina utilizável e não uma

personalidade. É necessário que adquira um sentimento,

um senso prático daquilo que vale a pena ser

empreendido, daquilo que é belo, do que é moralmente

correto". (Albert Einstein)

viii

Aos meus orientadores Prof. ANTÔNIO CARLOS C. DE CARVALHO e Profª REGINA COELI

GOLDENBERG, pelo aprendizado proporcionado durante estes quase sete anos de convivência

no laboratório, que contribuíram bastante para o meu crescimento pessoal e profissional.

Aos membros do LABORATÓRIO DE MARCAÇÃO DE CÉLULAS E MOLÉCULAS do

Departamento de Radiologia e do Serviço de Medicina Nuclear do Hospital Universitário

Clementino Fraga Filho, especialmente: SÉRGIO, CLÁUDIA, FLÁVIA, DRª BIANCA E DRª LÉA,

pela da marcação das células e realização das imagens cintilográficas.

Aos meus primeiros orientadores Dr. SÉRGIO G. COUTINHO e a Drª ALDA M. DA CRUZ que

me proporcionaram os primeiros ensinamentos da carreira científica. Minha eterna

admiração...

À Drª NAZARETH ROCHA pela realização das imagens ecocardiográficas e discussões sobre

os protocolos de isquemia temporária.

Ao professor JOÃO PEDRO S. WERNECK DE CASTRO por participar efetivamente deste

projeto, seja experimentalmente ou intelectualmente. Obrigada por tudo.

Ao professor EMERSON LOPES OLIVARES e o doutorando RICARDO HENRIQUE COSTA E

SOUZA por eventualmente me socorrerem na administração intramiocárdica das células.

À aluna de doutorado e minha amiga PATRÍCIA FIDELIS DE OLIVEIRA pela sua contribuição

na realização das análises hemodinâmicas, paciência e auxílio nas minhas primeiras

canulações da veia jugular, e especialmente por me apoiar na fase de maior estresse durante a

tese: a qualificação. Obrigada, Pat. Não vou esquecer o que você fez por mim.

Aos alunos de iniciação científica: SAMANTHA SOARES, NATHÁLIA ALVES, DIOGO LEITE,

RAFAEL PALETTA E DÉBORA FRANÇA que durante estes quatro anos de realização da tese,

contribuíram, sofreram com as dificuldades e torceram pelo desenvolvimento deste trabalho.

Obrigada a todos. Saibam que eu também aprendi com vocês.

ix

À Técnica DAISY AVANZI (TIA DAISY) por me auxiliar na realização dos cortes

histológicos, pelo seu carinho, dedicação e claro, pelas suas caronas de volta para casa. Muito

obrigada, tia Daisy.

À Técnica JULIANA NASCIMENTO por sempre estar pronta e disposta a ajudar. Obrigada, Ju.

Às minhas três amigas patas do laboratório: JU DIAS, DEB e CAROL que compartilharam

comigo nestes anos, momentos de alegria e confraternização nos Congressos e nights ; mas

também estavam presentes em momentos de muito estudo e trabalho. Ju, valeu por nossos

estudos juntas. Deb, obrigada por sempre estar disposta a ajudar, mesmo que você não tenha

nenhum comprometimento com o experimento. Carol, foi com esse projeto que tudo

começou, lembra? Desde então, nossa amizade só cresceu. Obrigada por tudo, amigas. Adoro

vocês.

Às minhas amigas: RITA que mesmo distante sempre me incentivou e apoiou nesta

carreira; CRIS, pelo interesse, torcida e sua amizade todos esses anos; ANNA BEATRIZ,

FERNANDA E FLÁVIA que apesar da distância no momento, ainda se interessam e torcem pelo

meu sucesso. Ao meu amigo RICARDO, que sempre presente, se interessava pelo andamento

da tese com muito carinho e paciência para escutar.

A todos os membros do LABORATÓRIO DE ELETROFISIOLOGIA CARDÍACA ANTÔNIO PAES DE

CARVALHO e do LABORATÓRIO DE CARDIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR que de alguma

forma contribuíram para o desempenho deste trabalho.

Aos MEUS PAIS, meu IRMÃO JOFRE, à minha TIA ELIANE, pelo apoio, compreensão,

incentivo, carinho e colaboração durante o desenvolvimento da tese.

Aos meus tios Francisco e Valéria pelo apoio e pela colaboração na reta final da tese, e a

toda minha família.

Aos ratinhos, não agradeço, mas peço desculpas. Foi para o bem da ciência.

x

AE - átrio esquerdo

âQRS ângulo do vetor médio de despolarização ventricular

ASE - sociedade americana de ecocardiografia

ATP adenosina trifosfato

AVE - acinesia do ventrículo esquerdo

AVED - área do ventrículo esquerdo em diástole

AVES - área do ventrículo esquerdo em sístole

BPM - batimentos por minuto

BSS - solução salina balanceada

CEMO - células de estroma de medula óssea

c-kit+ positivo para o c-Kit

CMMO - células mononucleares da medula óssea

CPM - contagem por minuto

CTH - células tronco hematopoiéticas

DDF - diâmetro da cavidade ventricular ao final da diástole

DDF - diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo

DMEM

dullbecco s modified eagle medium

dP/dT + - primeira derivada temporal positiva máxima da pressão ventricular

dP/dT- - primeira derivada temporal negativa máxima da pressão ventricular

DSF - diâmetro da cavidade ventricular ao final da Sístole

DSF - diâmetro sistólico final do VE

ECG - eletrocardiograma

ECO - ecocardiograma

ES células-tronco embrionárias ( embrionic stem cells )

FC - freqüência cardíaca

xi

FE - fração de ejeção

FEA - fração de encurtamento de área

Fenc - fração de encurtamento

HSC - células tronco hematopoiéticas ( hematopoietic stem cells )

i.m. - via intramiocárdica

i.v. - via intravenosa

IAM - infarto agudo do miocárdio

ICAM-1 - intercellular adhesion molecule

ICC - insuficiência cardíaca congestiva

IM - infarto do miocárdio

iQRS - índice de amplitude do complexo QRS

MCI - massa celular interna

ME - matriz extracelular

MMP-1 metaloproteinase 1

MMP-9 metaloproteinase 9

MMPs metaloproteinases

Nim - Animais normais que receberam injeção intramiocárdica de células mononucleares de

medula óssea.

Niv

Animais normais que receberam injeção intravenosa de células mononucleares de

medula óssea.

OP - isquemia por oclusão permanente.

OPim - animais submetidos à isquemia por oclusão permanente tratados com células

mononucleares da medula óssea por via intramiocárdica.

OPiv - animais submetidos à isquemia por oclusão permanente tratados com células

mononucleares da medula óssea por via intravenosa.

xii

OT - isquemia por oclusão temporária.

OTiv - animais submetidos à isquemia por oclusão temporária tratados com células

mononucleares da medula óssea por via intravenosa.

PAVE - perímetro de acinesia do VE.

PVE - pressão desenvolvida pelo ventrículo esquerdo

PDFVE - pressão diastólica final do ventrículo esquerdo

PSVE - pressão sistólica do ventrículo esquerdo

PTVE - perímetro total do VE.

RNA - ácido ribonucléico

SDF-1 - stromal cell-derived factor-1

99m Tc - Tecnécio99 metaestável

TGF- 1 - transforming growth factor-beta

TIMPs - tissue inhibitor of MMPs (inibidor das MMPs)

TNF-

- fator de necrose tumoral ;

VCAM-1 - vascular cellular adhesion molecule

VDF - volume diastólico final

VE - ventrículo esquerdo

VSF - volume sistólico final

xiii

O infarto do miocárdio é a principal causa de mortalidade mundial. Atualmente, a

terapia com células da medula óssea é uma alternativa promissora para os pacientes com

doença cardiovascular isquêmica. Este estudo se propõe a identificar os sítios preferenciais de

migração das células de medula óssea (CMMO) durante a isquemia miocárdica aguda, e

correlacionar o impacto da presença destas células sobre a função cardíaca dos animais. Para

tanto, ratos Wistar foram submetidos à isquemia por oclusão temporária (OT) ou permanente

(OP) da artéria coronária esquerda. Quarenta e oito horas após o procedimento cirúrgico, as

CMMO foram marcadas com 99mTecnécio, e transplantadas pelas vias im (4-6 x 106) ou iv (1-

5 x 107) em ratos normais (N) e operados. A distribuição das células foi determinada por

imagens cintilográficas e contagem da radioatividade presente nos órgãos isolados, enquanto

que os parâmetros cardíacos foram analisados pelo eletro e ecocardiograma, assim como pela

hemodinâmica e teste de esforço. Após a terapia im, o percentual de células presente no

coração dos animais OP (2,516

0,394 %) foi significativamente maior comparado aos

normais (N) (1,190

0,255 %) (p < 0,001). No caso da terapia iv, os percentuais de células

presentes no coração dos animais normais (0,012

0,002 %), OP (0,047

0,022 %) e OT

(0,028

0,005 %) não foram estatisticamente diferentes. Três semanas após o tratamento

intravenoso ou intramiocárdico com CMMO, os animais apresentaram onda Q em DI, âQRS

> 90º, fração de encurtamento inferior a 50%, bem como perfil hemodinâmico e teste de

esforço típicos de animais infartados. Assim, a administração das CMMO por via iv ou im, 48

horas após o IAM não promoveu melhora na função cardíaca dos animais.

xiv

The myocardial infarction is the major cause of world´s mortality. Nowadays, therapy

with bone marrow cells is an exciting alternative for patients of ischemic cardiovascular

diseases. The aim of this study is evaluate the effect of mononuclear bone marrow cell

(BMMC) intravenous (i.v.) and intramyocardial (im) transplantation on an experimental

model of myocardial infarction (MI). For this, Wistar rats were submitted to temporary (TO)

and permanent (PO) occlusion of left coronary artery. Forty eight hours after surgery,

BMMCs were labeled with 99mTechnetium and infused by im (4-6 x 106) or iv (1-5 x 107) vias

in normal (N) and operated rats. The cell distribution was obtained by scintigraphy and

radioactive counting of isolated organs. Electrocardiogram, echocardiogram, cardiopulmonary

test and hemodynamic analyses evaluated cardiac parameters. After im injection, the

percentual of cells found in the heart of PO group (2,516

0,394 %) was significantly higher

than in N (1,190

0,255 %) (p < 0,001). At i.v. therapy, the percentual of the cells found in

the heart of normal (0,012

0,002 %), PO (0,047

0,022 %) and TO (0,028

0,005 %)

groups were not statistically different. Three weeks after both kinds of cellular therapy (i.m.

or i.v.), PO group still have Q wave in LI, âQRS > 90º, shortening fraction with less than

50%, hemodynamic and cardiopulmonary test profiles were typical of infarcted hearts. This

work demonstrate that the intramyocardial and intravenous injection, 48 hours after MI not

improved the cardiac function of the animals.

xv

1 INTRODUÇÃO

1.1 - O INFARTO DO MIOCÁRDIO

1.2 - ISQUEMIA E REPERFUSÃO

1.3 - TERAPIAS CELULARES

1.3.1 - CÉLULAS-TRONCO

1.3.2 - A MEDULA ÓSSEA

1.4 - MEDICINA NUCLEAR

1

1

3

5

6

8

11

2 OBJETIVOS

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 ANIMAIS

3.2 ETAPA 1 : MODELOS DE INDUÇÃO DO INFARTO AGUDO EXPERIMENTAL

3.2.1 GRUPO OP: MODELO DE OCLUSÃO PERMANENTE DA ARTÉRIA CORONÁRIA

ESQUERDA

3.2.2 GRUPO OT: MODELO DE OCLUSÃO TEMPORÁRIA DA ARTÉRIA CORONÁRIA

ESQUERDA.

3.2.2.1 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS APLICADOS AOS ANIMAIS SUBMETIDOS À

OCLUSÃO TEMPORÁRIA DA ARTÉRIA CORONÁRIA ESQUERDA

3.3 - ISOLAMENTO DAS CÉLULAS DE MONONUCLEARES DE MEDULA ÓSSEA (CMMO)

3.4 ETAPA 2: ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA

3.4.1 DETERMINAÇÃO DA TOPOGRAFIA DE CORAÇÃO NAS IMAGENS CINTILOGRÁFICAS

3.4.2 - MARCAÇÃO DAS CÉLULAS COM TECNÉCIO 99M

3.4.3

INJEÇÃO DAS CÉLULAS MARCADAS COM TECNÉCIO 99M

3.4.4 - IMAGENS CINTILOGRÁFICAS

3.4.5 - CONTAGEM DA RADIOATIVIDADE PRESENTE NOS ÓRGÃOS ISOLADOS

3.5 ETAPA 3: ACOMPANHAMENTO DA FUNÇÃO CARDÍACA APÓS O TRATAMENTO COM

CMMO OU VEÍCULO.

3.5.1 MARCAÇÃO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES

3.5.2 - ANÁLISE FUNCIONAL

3.5.2.1 ANÁLISE ELETROCARDIOGRÁFICA

3.5.2.2 ANÁLISE ECOCARDIOGRÁFICA

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29

29

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31

35

SUMÁRIO

xvi

3.5.2.3 ANÁLISE HEMODINÂMICA

3.5.2.3.1 CANULAÇÃO DA ARTÉRIA CARÓTIDA COMUM

3.6 TESTE DE ESFORÇO

3.7 ANÁLISE ANATOMO-HISTO-PATOLÓLGICA

3.7.1 - PREPARO DO MATERIAL

3.7.1.2 - IDENTIFICAÇÃO DAS CÉLULAS MARCADAS

3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

4 RESULTADOS

4.1 ETAPA 1 : COMPARAÇÃO DOS DIFERENTES MODELOS EXPERIMENTAIS DE

INDUÇÃO DO INFARTO DO MIOCÁRDIO

4.1.1 ANÁLISE ELETROCARDIOGRÁFICA

4.1.2 ANÁLISE ECOCARDIOGRÁFICA

4.2

PESQUISA DAS CÉLULAS MARCADAS COM HOECHST APÓS A ADMINISTRAÇÃO

INTRAVENOSA DE CMMO NOS ANIMAIS DO GRUPO OT

4.3 ETAPA 2: ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DE

MEDULA ÓSSEA NO ORGANISMO

4.3.1 MARCAÇÃO DAS CÉLULAS

4.3.2

IMAGENS CINTILOGRÁFICAS E CONTAGEM DA RADIOATIVIDADE PRESENTE

NOS ÓRGÃOS ISOLADOS.

4.3.2.1 CONTROLES EXPERIMENTAIS

4.3.2.2 GRUPOS EXPERIMENTAIS

4.3.2.2.1 ANIMAIS NORMAIS

4.3.2.2.1.1 ADMINISTRAÇÃO INTRAMIOCÁRDICA DE CMMO

4.3.2.2.1.2 ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA DE CMMO

4.3.2.2.1.3

COMPARAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DAS CMMO NO ORGANISMO APÓS

ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA E INTRAMIOCÁRDICA.

4.3.2.2.2 ANIMAIS SUBMETIDOS À OCLUSÃO PERMANENTE

4.3.2.2.2.1 ADMINISTRAÇÃO INTRAMIOCÁRDICA DE CMMO

4.3.2.2.2.2 ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA DE CMMO

4.3.2.2.2.3

COMPARAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DAS CMMO NO ORGANISMO APÓS

ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA E INTRAMIOCÁRDICA.

4.3.2.2.3 ANIMAIS SUBMETIDOS À OCLUSÃO TEMPORÁRIA

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64

64

xvii

4.3.2.2.4 COMPARAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO NO ORGANISMO DAS CMMO EM ANIMAIS

NORMAIS E SUBMETIDOS À ISQUEMIA APÓS ADMINISTRAÇÃO

INTRAVENOSA E INTRAMIOCÁRDICA

4.4

ETAPA 3: ACOMPANHAMENTO DA FUNÇÃO CARDÍACA DE ANIMAIS NORMAIS E

SUBMETIDOS À ISQUEMIA PERMANENTE TRATADOS COM CMMO OU VEÍCULO

4.4.1 ANÁLISE ELETROCARDIOGRÁFICA

4.4.2 ANÁLISE ECOCARDIOGRÁFICA

4.4.3 ANÁLISE HEMODINÂMICA

4.4.4 TESTE DE ESFORÇO

4.4.5 PESQUISA DAS CÉLULAS MARCADAS

64

68

68

73

80

83

85

5 - DISCUSSÃO 88

6 - CONCLUSÕES 101

7 - BIBLIOGRAFIA 102

1

1.1 O INFARTO DO MIOCÁRDIO

O infarto do miocárdio (IM) é uma cardiopatia isquêmica, causada por obstrução de

vasos da circulação coronariana, que promove redução da perfusão local com conseqüente

morte de cardiomiócitos (Factor, 1990). Após a perda de cardiomiócitos necróticos, inicia-se

rapidamente uma série de respostas celulares através da sinalização célula-célula; que regula o

reparo tecidual, contribuindo para a reconstrução do miocárdio infartado e a manutenção da

integridade do ventrículo. Este processo caracteriza-se, inicialmente, pela atração e invasão de

células inflamatórias no sítio da lesão, ativação e síntese de peptídeos, formação de novos

vasos sangüíneos (angiogênese), e surgimento bem como replicação de células do tipo

fibroblasto. Esta fase inflamatória inicial de cicatrização com resultante formação de tecido de

granulação, é seguida por uma fase fibrogênica que resulta no tecido cicatricial. Este que por

muito tempo foi considerado inerte é: dinâmico, vascularizado, metabolicamente ativo e

contrátil. A matriz é composta por miofibroblastos (fibroblastos fenotipicamente

transformados) que não são encontrados no tecido cardíaco normal (exceto nos folhetos

valvares) (Sun & Weber 2000). Tal transformação fenotípica parece ser influenciada pelo

TGF- 1 ( transforming growth factor-beta ). Desmouliere e colaboradores (1993)

demonstraram em estudos in vitro e in vivo que o TGF- 1 contribui para a diferenciação do

fibroblasto em miofibroblasto. Esta citocina é sintetizada por macrófagos ativados que no 1º e

2º dias após o IM aparecem no sítio da lesão. Em seguida surgem os miofibroblastos que

permanecem na cicatriz do infarto por longos períodos de tempo (muitos meses em ratos, e

anos em humanos) (Willems et al. 1994) e contribuem com o acúmulo de colágeno na região.

O balanço entre a síntese e a degradação de colágeno são os determinantes primários da

fibrose tecidual (Sun & Weber 2000). A degradação do colágeno envolve enzimas

proteolíticas conhecidas como metaloproteinases (MMPs). Sun e colaboradores (2000)

observaram durante a fase inicial de reparo do IM, em ratos, um aumento da atividade de

2

MMP-1 (colagenase). Esta enzima tem atividade proteolítica e aumenta a degradação de

fibrilas de colágeno no sítio do IM. Em contrapartida, as TIMPs ( tissue inhibitor of MMPs )

que neutralizam esta atividade colagenolítica e inibem a forma ativada das MMPs, são

encontradas em grande quantidade no sítio do infarto a partir da primeira semana (Cleutjens et

al. 1995). Isto gera um acúmulo progressivo de colágeno no sítio do infarto. Além disso, os

miofibroblastos residentes na cicatriz que são nutridos pelos novos vasos que se formaram,

continuam sintetizando colágeno tipo I, contribuindo assim para a formação do tecido fibroso

e o remodelamento estrutural das regiões não infartadas que estão distantes da área lesada,

conforme observamos nos grandes infartos transmurais (Sun & Weber 2000). Estas

transformações agudas e crônicas tanto na área infartada necrótica quanto na não-necrótica,

bem como na região peri-infarto, geram uma cascata de alterações estruturais e geométricas

progressivas nos ventrículos que são geralmente referidas como remodelamento cardíaco

(Litwin et al. 1994, Jain et al. 2001). Este processo promove mudanças nas dimensões da

parede ventricular e câmara cardíaca. Uma vez que a matriz extracelular (ME) está em contato

íntimo com todos os outros componentes do miocárdio, ela desempenha uma importante

função na manutenção da forma, tamanho e função ventriculares. O ventrículo submetido a

estresse, inicialmente exibe função adequada, forma normal, e relação massa-volume

ventricular acima do normal. Entretanto, em um determinado ponto, a capacidade

compensatória do coração é exaurida e o mesmo começa a falhar. Dependendo da magnitude

e da duração do estresse, os miócitos sobreviventes hipertrofiam, e a ME sofre alterações na

concentração bem como nos tipos de fibrilas de colágeno presentes. Neste estágio, a espessura

da parede ventricular está desproporcionalmente reduzida, o volume da câmara ventricular

bastante aumentado e o ventrículo tende a se tornar esférico (Janiki et al. 2006), ocorrendo

comprometimento da sua função e podendo evoluir para o quadro de insuficiência cardíaca

congestiva (ICC). Tal síndome ainda é considerada um importante problema de saúde pública

3

(Itescu et al. 2003), e por isso torna-se fundamental o conhecimento de todas as alterações

fisiológicas e histopatológicas do coração, promovidas pelo infarto. Sendo assim, vários

grupos têm utilizado principalmente dois modelos experimentais para reproduzir de forma

fidedigna tais alterações: o modelo de oclusão permanente da artéria coronária esquerda e de

oclusão temporária deste mesmo vaso. Este último procedimento também é conhecido como

modelo de isquemia e reperfusão.

1.2 ISQUEMIA E REPERFUSÃO

A isquemia é caracterizada pela deficiência no aporte sangüíneo a determinado órgão

ou tecido. A sua principal conseqüência é hipóxia ou anóxia locais, ou seja, a deficiência

parcial ou total de oxigênio, respectivamente. Esta carência provoca alterações diretas nas

mitocôndrias, o que ocasiona a diminuição da fosforilação oxidativa e, conseqüentemente, dos

níveis de ATP (adenosina trifosfato). Isto por sua vez, compromete totalmente o sistema de

produção protéica celular e a bomba de sódio e potássio, aumentando os níveis de cálcio e

levando à tumefação celular (edema intracelular) (Case et al 1989). Até aqui, os danos são

reversíveis. Com a persistência da isquemia, ocorre uma vacuolização das mitocôndrias, que

podem ser visualizadas segundo Case e colaboradores (1989), 30 a 40 min após a isquemia.

Nesse estágio, instauram-se eventos de lesão celular irreversível, atuando principalmente nas

membranas. Há uma perda contínua de proteínas, enzimas e ácidos ribonucléicos (RNAs),

essenciais para a célula. Membranas lisossômicas são rompidas, levando ao extravasamento

das enzimas lisossomais para o citoplasma. Essas enzimas provocam digestão enzimática dos

componentes celulares, ocasionando a morte celular por autólise. Portanto, a isquemia

provoca lesões reversíveis e irreversíveis, as quais são devidas principalmente à alteração dos

níveis de ATP e de cálcio.

4

Os distúrbios metabólicos durante isquemia ou hipóxia tissular são muito bem

estabelecidos, porém, evidências clínicas e experimentais demonstram que os principais

eventos que promovem disfunções celular e tecidual, relacionam-se com a subseqüente

reperfusão (Evora et al. 1996).

A lesão de reperfusão é caracterizada por alterações funcionais e estruturais, que se

tornam aparentes durante o restabelecimento do fluxo após um período isquêmico. A

restauração do fluxo sangüíneo pode resultar em alguns efeitos deletérios, tais como: necrose

de células lesadas; acentuado edema celular; e restauração não uniforme do fluxo para todas

as porções do tecido (Evora et al. 1996). Conforme descrito anteriormente, quando o fluxo

sangüíneo tissular é interrompido, uma série de processos metabólicos e enzimáticos são

afetados, promovendo acúmulo de lactato, ativação de várias proteases intracelulares, e

aumento da permeabilidade vascular, que causa edema tissular. Por isso, a reversibilidade

deste processo está diretamente relacionada com a duração da isquemia (Stahl et al. 1989

apud Evora et al. 1996), e a reperfusão deve ser restabelecida o mais rápido possível. Embora

seja inquestionável o benefício da reperfusão precoce, a reintrodução do oxigênio em um

meio isquêmico desencadeia diversos eventos que provocam lesões tissulares adicionais e

acúmulo intracelular de cálcio (Ku 1982 apud Evora et al.1996, Braunwald & Kloner 1985).

No tecido cardíaco, a aceleração do processo necrótico dos miócitos lesionados

irreversivelmente, o edema celular, o fenômeno de não-refluxo (restauração não uniforme do

fluxo sangüíneo após uma isquemia temporária, que promove disfunções no tecido cardíaco),

o paradoxo cálcio e oxigênio (lesões celulares ocasionadas pelo grande influxo de cálcio e de

oxigênio para o interior da célula após o restabelecimento da perfusão), a produção de radicais

livres do oxigênio (que podem prejudicar os miócitos isquêmicos), e a depressão da função

ventricular pós-isquêmica prolongada, são exemplos de eventos decorrentes da reentrada de

oxigênio no tecido isquêmico (Braunwald & Kloner 1985). Tais efeitos contribuem para o

5

desenvolvimento de doenças cardíacas isquêmicas, como por exemplo, o infarto do

miocárdio, que dentre as doenças cardiovasculares destaca-se por possuir maior taxa de

mortalidade (Hristov et al. 2006). Os pacientes sobreviventes a grandes infartos apresentam

alto risco de desenvolverem ICC (Takemura & Fujiwara 2006). De acordo com Hosenpud e

colaboradores (2000), 44 % dos pacientes com ICC são candidatos a transplante cardíaco

(Hosenpud et al. 2000), uma vez que as opções terapêuticas existentes atualmente

(farmacológicas e cirúrgicas) são limitadas e muitas vezes incapazes de interromper a

progressão deste quadro. Apesar de em alguns casos o transplante proporcionar um aumento

na sobrevida, as complicações causadas pela imunossupressão e a escassez de doadores

limitam a eficiência deste procedimento (Chiu et al. 1995). Portanto, a comunidade científica

busca alternativas terapêuticas para melhorar a sobrevida e a qualidade de vida destes

pacientes. Uma das mais promissoras possibilidades de conduta terapêutica que atualmente

está sob extensa investigação é a terapia celular.

1.3 TERAPIAS CELULARES

De acordo com Fraser e colaboradores (2004), a terapia ideal para ser empregada no

tratamento do infarto do miocárdio deveria: minimizar a perda de cardiomiócitos pela redução

da morte celular, promover o retorno do miocárdio hibernante para sua função normal,

estimular a revascularização da região isquêmica através do aumento da angiogênese, e

regenerar cardiomiócitos viáveis para substituir aqueles perdidos na isquemia inicial,

preservando a função contrátil e reduzindo a formação de cicatriz. Uma das mais promissoras

possibilidades de conduta terapêutica que vem chamando bastante atenção é a terapia celular.

A proposta desta terapia em pacientes com doenças isquêmicas é melhorar a função contráctil

da câmara ventricular e impedir a progressão da insuficiência cardíaca pela administração de

um determinado tipo celular no paciente. Atualmente, as células-tronco têm sido empregadas

6

como um novo e promissor método para limitar a expansão do infarto e prevenir o

remodelamento cardíaco (Kraitchman et al. 2005).

1.3.1 CÉLULAS-TRONCO

As células-tronco são caracterizadas como células indiferenciadas (sem especialização

funcional e marcadores de diferenciação tecido-específicos), com capacidade de proliferação,

auto-renovação, e plasticidade (capacidade de se diferenciar em vários tecidos distintos)

(Loeffler & Potten,1997). A sua taxa de proliferação é baixa (Alison et al. 2002), e as células-

tronco podem seguir dois diferentes modelos de divisão celular: o chamado determinístico, no

qual sua divisão gera sempre uma célula-tronco idêntica e uma célula progenitora já

comprometida com alguma linhagem específica; ou o dito aleatório (ou estocástico), onde

algumas células-tronco geram somente novas células-tronco e outras geram apenas células

progenitoras já comprometidas (Loeffler & Potten 1997). As células-tronco mais primitivas

são o oócito fertilizado (zigoto) e as descendentes das duas primeiras divisões mitóticas. Estas

células são consideradas totipotentes, pois são capazes de gerar um embrião e o trofoblasto da

placenta (Dawn & Bolli 2005). Após quatro dias, estas células totipotentes começam a se

especializar formando uma massa de células esférica chamada de blastocisto, que por sua vez

contém a massa celular interna (MCI), da qual o embrião se desenvolve. A MCI do blastocisto

é formada por células-tronco embrionárias (do inglês, embrionic stem cells

ES), que se

diferenciam em células dos três folhetos embrionários (endoderma, mesoderma e ectoderma).

Porém, estas células não são capazes de originar a placenta e os tecidos que sustentam a

gestação. Desta forma, as células ES são células-tronco ditas pluripotentes. A maioria dos

tecidos possui células-tronco multipotentes, ou seja, capazes de produzir uma limitada

variedade de linhagens celulares diferenciadas de acordo com a sua localização (Alison et al.

2002, Lovell and Marthur 2004). As células-tronco do sistema nervoso central, por exemplo,

7

são multipotentes, uma vez que são capazes de originar três linhagens distintas: neurônios,

oligodendrócitos e astrócitos (Clarke et al. 2000, Momma et al. 2000). Por último, na

hierarquia das células-tronco temos as chamadas células unipotentes (ou progenitoras

comprometidas), capazes de originar um único tipo celular específico (ex: células-tronco

constituintes da camada basal da epiderme, que originam somente as células escamosas

queratinizadas da pele) (Lovell and Marthur 2004). Estas progenitoras comprometidas

originam células com capacidade de auto-renovação limitada e rápida taxa de proliferação. A

seguir, estas células se dividem originando células terminalmente diferenciadas, que perdem a

sua capacidade de proliferação e mais tarde evoluem para um processo de morte celular

programada (Alison et al. 2002).

Baseando-se na pluripotencialidade das células ES, estas seriam consideradas o tipo

celular mais apropriado para ser empregado na terapia celular. Contudo, o potencial

teratogênico, a necessidade de tratamento imunossupressor e questões éticas são fatores

limitantes para o seu uso terapêutico (Leri et al. 2005), o que torna as células-tronco adultas

as principais candidatas a serem usadas em tal tipo de terapia.

As células-tronco adultas estão presentes em muitos tecidos e órgãos, onde são

encontradas como células primitivas capazes de reparar danos causados por doenças ou lesões

durante a vida do indivíduo. Estas células tecido-específicas têm sido descritas em muitos

órgãos, tais como: medula óssea, trato gastrointestinal, pele, pulmões, fígado, músculo

esquelético, sistema nervoso central, e coração. Destas, a população mais bem estudada é a de

células tronco da medula óssea. (Dawn & Bolli 2005).

1.3.2 A MEDULA ÓSSEA

A medula óssea pode ser vista como um tecido organizado em dois compartimentos: o

compartimento hematopoiético, que fornece ao organismo células maduras de todas as

linhagens sangüíneas; e o compartimento estromal, que proporciona um microambiente

8

adequado para a auto-renovação, proliferação e diferenciação das células-tronco e

progenitoras hematopoiéticas (Hüttmann et al. 2003). Além disso, o compartimento estromal

abriga progenitores vasculares (Jackson et al. 2001) e células mesenquimais, capazes de se

diferenciarem em tipos celulares da maioria dos tecidos conjuntivos (Bianco et al. 2001).

A população hematopoiética está distribuída na medula óssea em sítios específicos,

denominados microambientes. Nestes sítios encontramos células-tronco hematopoiéticas

(CTH), e progenitores das linhagens mielóide e linfóide em diferentes estágios de

diferenciação, ou seja, populações de células imaturas, em estágio intermediário de

desenvolvimento e maduras (Bianco 2000).

As CTH são caracterizadas como células multipotentes, com alta capacidade de

proliferação, auto-renovação e diferenciação em uma variedade de linhagens mielóide e

linfóide especializadas (Osawa et al. 1996, Goodell et al. 1996). São capazes de reconstituir e

manter todas as linhagens sangüíneas (Lovell & Mathur 2004), uma vez que possuem

habilidade para balancear os mecanismos de auto-renovação e diferenciação de acordo com a

necessidade do organismo. Além disso, sofrem morte celular programada e são mobilizadas

para fora da medula óssea em direção à circulação sangüínea (Weissman 2000, Bonnet et al.

2002) quando existe necessidade. São caracterizadas fenotipicamente por expressarem o

marcador hematopoiético CD45, bem como CD34, CD133 e CD117 (também chamado de c-

kit), porém, os marcadores de linhagem estão ausentes (lin-) (Dawn & Bolli 2005). Na fase

adulta, elas estão presentes no sangue ou na medula óssea, sendo o processo de hematopoiese

bastante hierarquizado.

Uma variedade de estímulos (citocinas solúveis, ligadas à membrana, ou associadas à

matriz extracelular, e moléculas de adesão celular) do estroma da medula óssea influenciam

as CTH e sua progênie (Whetton & Spooncer, 1998) na modulação da quiescência, na auto-

renovação, no comprometimento das CTH com determinada linhagem celular; bem como na

9

proliferação, maturação e apoptose das células maduras (Dennis & Charbord, 2002). Além

disso, o estroma da cavidade medular, constituído por células endoteliais, osteoblastos,

células adventícias, células reticulares e células-tronco mesenquimais, fornece o suporte físico

necessário para a migração das células hematopoiéticas (CH) maduras até os sinusóides

(vasos sangüíneos de parede fina) (Bianco 2000). Estes por sua vez, localizam-se próximos

aos sítios ativos de hematopoiese e transportam as células sangüíneas recém formadas para a

circulação periférica. Isto demonstra a importância do estroma na estimulação e regulação do

desenvolvimento das CH, bem como das próprias células do estroma da medula óssea

(CEMO), e da célula-tronco mesenquimal (Minguell et al. 2000).

As células mesenquimais de medula óssea foram isoladas inicialmente por

Friedenstein e colaboradores (1974) e subseqüentemente por outros investigadores (Caplan et

al. 1991, Clark et al. 1995, Pittinger et al. 1999), baseada na sua capacidade de aderência à

superfície da placa de cultivo do tecido e seu grande potencial de diferenciação. Estas células

in vitro parecem capazes de se diferenciar em diversas linhagens celulares: osteoblastos,

condrócitos, adipócitos (Caplan et al. 1991, Prockop et al. 1997, Pittinger et al. 1999),

músculo esquelético (Ferrari et al. 1998), músculo cardíaco (Makino et al. 1999, Tomita et al.

1999, Wang et al. 2000, Toma et al. 2002, Hakuno et al. 2002), células endoteliais (Jian et al.

2002), hepatócitos (Petersen et al. 1999, Alison et al. 2000, Theise et al. 2000, Jian et al.

2002), neurônios, oligodendrócitos e astrócitos (Sanchez-Ramos et al. 2000, Woodbury et al.

2000, Jian et al. 2002).

Baseando-se nestes fatos, vários investigadores têm utilizado as células de medula

óssea como terapia alternativa no infarto do miocárdio experimental (Tomita et al. 1999,

Wang et al. 2000, Orlic et al. 2001a, Orlic et al. 2001b, Jackson et al. 2001, Shake et al.

2002, Strauer et al. 2002, Hamano et al. 2002, Olivares et al. 2004; Olivares et al. 2007).

Destacando alguns destes trabalhos, Tomita e colaboradores (1999) implantaram

10

células mesenquimais tratadas in vitro com 5-azacitidina (um agente demetilante de DNA) no

coração de ratos, 21 dias após a crioinjúria, e demonstraram que apesar delas não se

transdiferenciarem em cardiomiócitos, induziram angiogênese e impediram a expansão da

cicatriz e dilatação da câmara ventricular. Na fase cicatricial do modelo de infarto do

miocárdio foi demonstrada angiogênese em cães submetidos ao tratamento intramiocárdico

com células de medula óssea 30 dias após a oclusão da artéria coronária descendente anterior

(DA). Entretanto, não houve melhora na função cardíaca de tais animais (Hamano et al.

2002). A melhora no desempenho cardíaco foi evidenciada por Shake e colaboradores (2002),

em porcos infartados, tratados com injeção intramiocárdica de células mesenquimais, 14 dias

após a oclusão da artéria coronária esquerda. Tal melhora foi observada através do aumento

na espessura da parede ventricular e redução na disfunção contráctil. Nossos resultados

prévios demonstraram que a administração intramiocárdica de células mesenquimais de

medula óssea, 28 dias após a oclusão da artéria coronária de ratos, diminuiu o grau de lesão

evidenciado, pelo eletro e ecocardiograma, duas semanas após o tratamento (Olivares et al.

2004). Além disso, os efeitos benéficos sobre a função cardíaca podem ser aprimorados pelo

tratamento prévio com captopril (Olivares et al. 2007).

Alguns autores têm investigado a eficácia da administração intramiocárdica das

células mononucleares de medula óssea tanto no modelo animal (Olivares et al. 2007) quanto

em humanos (Perin et al. 2003, Perin et al. 2004). No entanto, esta via é bastante invasiva

para aplicação em pacientes. Por este motivo, alguns pesquisadores têm investigado a

administração intravenosa (i.v.) de preparações contendo células-tronco, a fim de aumentar a

população endógena que migraria para o miocárdio após o infarto (Nagaya et al. 2004).

Entretanto, a localização destas células exógenas no tecido infartado tem contado

primariamente com análises histológicas pós-morte. Assim, a distribuição dinâmica destas

células-tronco injetadas perifericamente e o seu tráfego só podem ser desvendados através de

11

estudos comparativos com a eutanásia seriada de uma grande quantidade de animais. Para que

isto seja evitado, e para atender as normas de bioética para a utilização de animais

experimentais são necessários métodos que avaliem a distribuição e o destino das células-

tronco, de forma não invasiva, sem a necessidade da histologia pós-morte (Kraitchman et al.

2005). Atualmente, dispomos de técnicas de medicina nuclear capazes de analisar a

distribuição de células (previamente marcadas com radiotraçadores) administradas por via

intravenosa, fornecendo de forma não invasiva, imagens cintilográficas que determinam o

potencial migratório destas células para o sítio da lesão.

1.4 MEDICINA NUCLEAR

A Medicina Nuclear é a especialidade médica que utiliza elementos radioativos

(radionuclídeos) in vivo para diagnosticar e/ou tratar doenças. Avalia a função e a estrutura

dos órgãos, o que possibilita uma identificação precoce de certas anormalidades, bem como

tem sua aplicação terapêutica em tratamentos de algumas doenças (ex: hipertireoidismo,

câncer de tireóide, dor óssea, etc.) Além disso, é bastante empregada no estudo da fisiologia e

fisiopatologia humanas, uma vez que estuda o curso temporal de um traçador radioativo e a

resposta fisiológica do corpo, através de imagens in vivo obtidas pela cintilografia (Bailey &

Adamson 2003).

Os traçadores radioativos são radioisótopos empregados no organismo em pequenas

quantidades, cujo percurso pode ser acompanhado por aparelhos detectores de radiação. A

radioatividade emitida é capaz de atravessar a matéria, e dependendo da sua energia,

percebida pelo aparelho detector onde estiver (Cardoso ). Para

estudos diagnósticos sugere-se que a energia da radiação esteja em uma faixa adequada para

os sistemas de detecção, e que o isótopo apresente um rápido decaimento para forma não

radioativa (= meia vida, ou seja, tempo que leva para metade dos átomos passarem da forma

http://www.cnen.gov.br>

12

radioativa para forma estável). Baseado nestes critérios, o radioisótopo mais empregado

atualmente em medicina nuclear é o 99Tecnécio.

O 99tecnécio metaestável (99mTc) é um elemento radioativo fundamental para a

medicina nuclear, que permite realizar investigações de diversas funções vitais. Ele é gerado a

partir da eluição do 99molibdênio (produto de fissão produzido em reatores nucleares) em

solução de NaCl 0,9%, apresentando-se sob a forma química de pertecnato de sódio (NaTcO4)

(Marques et al. 2001). Este radioisótopo apresenta estados de oxidação que variam de +7 (o

mais estável, e a forma pelo qual é fornecida pelo gerador) até +1. As reações de

radiomarcação com 99mTc envolvem a redução do pertecnato (99mTcO4-) a estados de oxidação

mais baixos que podem ser estabilizados por uma série de ligantes, como por exemplo,

doadores de N, O, S e P. Por causa da sua baixa energia emitida (radiação gama com energia

de 140 keV), da sua meia vida curta (seis horas) e da sua fácil aquisição, o 99mTc é o

radionuclídeo mais utilizado na cintilografia gama (Marques et al. 2001), podendo ser

administrado sob a forma química de pertecnetato de sódio ou ligado a outras moléculas. As

doses administradas são medidas em função do número de eventos radioativos por segundo,

sendo expresso em unidades Becquerel (1 Bq = 1 desintegração por segundo) ou Curie (1 Ci =

3,7 x 1010 Bq). Após a sua administração, geralmente por via endovenosa, o 99mTc e os demais

radioisótopos, ou os compostos aos quais estão acoplados (radiofármacos) têm um

comportamento biológico que é idêntico ao de similares não radioativos (Meira

htpp://br.geocities.com/luizmeira/cintilo.htm). A distribuição e o grau de concentração do

elemento radioativo nos diversos órgãos são avaliados por meio de imagens cintilográficas.

A cintilografia é uma técnica não invasiva, segura, indolor, de baixo custo, e com

sensibilidade elevada para avaliar o funcionamento dos diversos órgãos (ex: coração, rins,

cérebro, e outros) (Bailey & Adamson

2003). Tal método é baseado na administração

endovenosa do radioisótopo (também chamado de traçador ), e na avaliação da energia gama

13

emitida pelos traçadores. Uma vez presente na circulação periférica, o radioisótopo é atraído

para órgãos específicos. O seu deslocamento e percurso podem ser acompanhados, pois a

energia emitida pelo traçador (geralmente radiação gama) é captada por um aparelho

chamando câmara de cintilação (ou gama câmara). A gama câmara é o sistema de detecção de

radioatividade utilizado para o estudo da distribuição in vivo dos diferentes compostos

radiomarcados. A interação da radiação gama no detector da câmara leva a emissão de luz

(cintilação), posteriormente convertida em sinal elétrico. A câmara de cintilação detecta a

radiação e determina a posição da fonte emissora (correspondente à área em que a luz foi

emitida) e sua energia (intensidade da luz emitida). Além da maior resolução, os

equipamentos mais modernos destacam-se pela capacidade de adquirir e processar estudos

tomográficos (SPECT = single photon emission computed tomography ), trazendo maior

sensibilidade e precisão na localização de lesões. Dentre as várias aplicações da cintilografia,

podemos destacar a sua capacidade de diagnosticar doença arterial coronariana, através da

chamada cintilografia de perfusão miocárdica (Meira

htpp://br.geocities.com/luizmeira/cintilo.htm).

A cintilografia de perfusão do miocárdio avalia o fluxo de sangue para o músculo

cardíaco através das artérias coronárias. Isto possibilita definir possíveis obstruções

coronarianas, analisar a probabilidade da ocorrência de um infarto do miocárdio, e ainda pode

estimar a extensão de um infarto prévio. Este exame caracteriza-se pela captação da

radioatividade emitida por um radiofármaco (administrado por via endovenosa), o qual se

concentra nos miócitos, na dependência da sua irrigação e sua integridade celular, gerando

assim uma imagem do coração. Um radiofármaco bastante utilizado ligado ao 99mTc é o

tetrofosminn (Meira htpp://br.geocities.com/luizmeira/cintilo.htm). Este complexo interage

diretamente com o cardiomiócito, sendo captado por difusão passiva através de um gradiente

transmembrana. Além disso, fixa-se de forma estável com pouca redistribuição, em estruturas

14

citoplasmáticas, e possui afinidade pelo meio intramitocondrial. O grau de captação deste

radiofármaco é diretamente proporcional à perfusão miocárdica no momento de sua

administração, isto é, se uma área do coração não recebe sangue (isquemia), o traçador não

consegue chegar neste local, não há captação de radioatividade, e esta região não aparece na

imagem cintilográfica. Tal radiofármaco, após administração endovenosa e acúmulo no

miocárdio (que capta cerca de 1% da dosagem administrada), músculo esquelético, fígado,

baço, e rins, em proporção a perfusão regional, é rapidamente retirado da circulação (Meira

htpp://br.geocities.com/luizmeira/cintilo.htm).

Baseado nos princípios citados anteriormente, o tetrofosmin-99mTc vem sendo

amplamente utilizado na detecção de áreas de perfusão miocárdica de pacientes infartados

através da cintilografia de perfusão miocárdica. Além disso, células marcadas com um

traçador radioativo, como o 99mTc, infundidas na circulação periférica, podem ser localizadas

de forma não invasiva através de imagens cintilográficas. Portanto, a medicina nuclear é

bastante útil nos estudos que envolvem a aplicação da terapia celular, principalmente aqueles

relacionados com as vias de administração.

15

Este estudo se propõe a identificar os sítios preferenciais de migração das células de

medula óssea (CMMO) durante a isquemia miocárdica aguda, e correlacionar o impacto da

presença destas células sobre a função cardíaca dos animais. Para tal, os objetivos deste

trabalho são:

- Identificar a distribuição das CMMO marcadas com 99mTc, administradas por via

intravenosa, em ratos submetidos à isquemia miocárdica aguda através da oclusão permanente

da artéria coronária esquerda.

- Verificar se existe diferença na distribuição das CMMO administradas por via

intravenosa, entre os modelos de oclusão temporária e permanente da artéria coronária

esquerda.

- Comparar a distribuição das CMMO marcadas com 99mTc, administradas por via

intravenosa e intramiocárdica, em ratos submetidos à isquemia aguda por oclusão permanente.

- Avaliar o efeito dos tratamentos intravenoso e intramiocárdico com CMMO na

função cardíaca dos animais submetidos à oclusão permanente da artéria coronária esquerda.

- Comparar o efeito do tratamento intramiocárdico e intravenoso.

16

3.1

ANIMAIS

Ratos Wistar machos e fêmeas singenêicos pesando entre 200-250g fornecidos pelo nosso

biotério foram utilizados para obtenção das células de medula óssea, bem como para indução

do infarto do miocárdio e os experimentos de distribuição das células. Todos os

procedimentos seguiram as normas do Comitê de Ética do Instituto de Biofísica Carlos

Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro para utilização de animais de

Laboratório. Os animais foram separados em grupos de acordo com as seguintes etapas do

estudo:

- ETAPA 1

Grupo de animais destinados à avaliação da função cardíaca nos diferentes

modelos experimentais de infarto: modelo de oclusão temporária e de oclusão permanente da

artéria coronária esquerda.

- ETAPA 2

Grupo de animais destinados à análise da distribuição das células

mononucleares da medula óssea (CMMO) no organismo.

- ETAPA 3 - Grupo de animais destinados à avaliação da função cardíaca dos animais

tratados com CMMO ou veículo.

A análise dos parâmetros cardíacos nos diferentes modelos experimentais de infarto (Etapa

1) visa a validação do modelo de oclusão temporária da artéria coronária esquerda, para que

posteriormente a distribuição intravenosa das CMMO seja comparada em ambos os modelos

de isquemia propostos. Sendo assim, na etapa 1 foram avaliados os parâmetros cardíacos dos

seguintes grupos: animais normais, uma vez que estudos prévios não mostraram diferença no

eletro e ecocardiograma entre animais normais e falso-operados (Pinho-Ribeiro 2003),

animais submetidos à isquemia pela oclusão permanente ou oclusão temporária da artéria

coronária. Estes dois últimos grupos foram denominados OP e OT, respectivamente. A

descrição detalhada de todos os grupos da etapa 1 está descrita no quadro 1.

17

Nos animais da etapa 2 analisamos a distribuição das CMMO marcadas com o traçador

99mTc a fim de estabelecermos os possíveis sítios de migração das células após a

administração intravenosa em animais normais, OP e OT. Além disso, a distribuição das

CMMO em animais normais e OP após administração intramiocárdica das células também foi

analisada. O quadro 2 fornece a descrição detalhada de cada grupo desta etapa.

Nos animais da etapa 3 analisamos a os parâmetros cardíacos de ratos submetidos à

isquemia por oclusão permanente, tratados com injeção intramiocárdica (grupo OP im) ou

intravenosa (grupo OP iv) de CMMO ou veículo (salina), 48 horas após o procedimento

cirúrgico. No caso dos animais que receberam veículo, não houve diferença significativa entre

aqueles que receberam tratamento intravenoso e os que receberam injeção intramiocárdica,

por isso todos foram agrupados em um único grupo chamado OP. Os parâmetros cardíacos

avaliados basearam-se no eletrocardiograma (ECG), ecocardiograma (ECO), análise

hemodinâmica e teste de esforço. O ECG e o ECO foram realizados antes do tratamento com

CMMO ou com veículo (48h após o procedimento cirúrgico) e três semanas após o

tratamento com células ou veículo. As análises hemodinâmicas e o teste de esforço foram

realizados somente três semanas após a terapia celular. A descrição detalhada de todos os

grupos da etapa 3 está descrita no quadro 3.

18

Quadro 1 Descrição dos grupos da etapa 1.

ETAPA 1

AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO CARDÍACA NOS DIFERENTES

MODELOS EXPERIMENTAIS DE INFARTO.

NORMAIS Análise da função cardíaca de animais normais (n = 10).

OP Análise da função cardíaca de animais submetidos à oclusão

permanente da artéria coronária esquerda (n = 10).

OT Análise da função cardíaca de animais submetidos à oclusão

temporária (90 minutos) da artéria coronária esquerda (n = 10).


ETAPA 2

ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS CMMO NO ORGANISMO.

N iv Análise da distribuição das CMMO injetadas por via intravenosa em

animais normais (n = 10).

N im Análise da distribuição das CMMO injetadas por via intramiocárdica

em animais normais (n = 10).

OP iv Análise da distribuição das CMMO após administração intravenosa

em animais submetidos à oclusão permanente da artéria coronária

esquerda (n = 10)

OP im Análise da distribuição das CMMO após administração

intramiocárdica em animais submetidos à oclusão permanente da

artéria coronária esquerda (n = 10)

OT iv Avaliação da distribuição das CMMO após administração intravenosa

em animais submetidos à oclusão temporária (90 minutos) da artéria

coronária esquerda (n = 7).

19


ETAPA 3

ANIMAIS INFARTADOS TRATADOS COM CMMO

OP

Análise da função cardíaca de animais submetidos à oclusão

permanente da artéria coronária esquerda após administração de

veículo (n = 10).

OP iv Análise da função cardíaca de animais submetidos à oclusão

permanente da artéria coronária esquerda após administração

intravenosa de CMMO (n = 10)

OP im Análise da função cardíaca de animais submetidos à oclusão

permanente da artéria coronária esquerda após administração

intramiocárdica de CMMO (n = 9)

20

3.2 ETAPA 1 : MODELOS DE INDUÇÃO DO INFARTO AGUDO EXPERIMENTAL

3.2.1

GRUPO OP: MODELO DE OCLUSÃO PERMANENTE DA ARTÉRIA

CORONÁRIA ESQUERDA

O modelo de infarto experimental em ratos induzido pela oclusão permanente da

artéria coronária esquerda descrito por Selye e colaboradores (1960) foi utilizado em nosso

laboratório (Olivares et al. 2004, Werneck-de-Castro et al. 2006, Olivares et al. 2007). Para

tal, os animais foram anestesiados com halotano (Cristália®), e em seguida realizada uma

incisão de aproximadamente 1 cm de comprimento na pele, em nível paraesternal esquerdo,

na junção dos terços inferior e médio da distância entre a clavícula e o rebordo costal. Os

músculos peitoral maior e menor foram dissecados para melhor visualização do gradil costal

esquerdo. Realizou-se uma sutura em bolsa, da pele e dos músculos da região, deixando o nó

aberto até o término da cirurgia. Neste momento, os animais foram submetidos à ventilação

mecânica através de um pequeno ambú de fabricação doméstica com o intuito de estimular os

movimentos respiratórios espontâneos. Com o auxílio de uma pinça hemostática reta, fez-se a

incisão entre o 4o ou 5o espaço intercostal esquerdo, através do qual o coração foi

exteriorizado por meio de uma suave compressão manual torácica direita. Após a localização

da artéria coronária esquerda (geralmente sob a aurícula esquerda), a mesma foi ocluída com

fio de seda 6-0 através de um nó duplo o mais próximo possível de sua origem na aorta. Em

seguida, o coração foi recolocado rapidamente em sua posição anatômica original e o nó da

sutura em bolsa finalmente apertado. A taxa de mortalidade induzida pelo procedimento

cirúrgico foi entre 30 e 40%. Após 48 horas, realizamos ECG e/ou ECO para verificar se o

infarto foi realmente induzido.

21

3.2.2

GRUPO OT: MODELO DE OCLUSÃO TEMPORÁRIA DA ARTÉRIA

CORONÁRIA ESQUERDA

Os animais foram anestesiados com 50 mg/kg de cloridrato de quetamina (Vetaset ) e

5 mg/kg de cloridrato de xilazina (Rompum , Bayer), e após obtermos um plano anestésico

ideal, realizamos a entubação do animal. Para tal procedimento, o mesmo foi colocado em

decúbito dorsal e traqueotomizado. Desta forma, realizamos uma incisão em seu pescoço, os

músculos da região foram divulsionados, e a traquéia isolada. Em seguida, um jelco nº 30, foi

inserido entre os anéis da traquéia e conectado ao ventilador. Os animais foram mantidos sob

ventilação com pressão positiva com ar ambiente e suplementado com oxigênio (2L/min).

Para tanto, o ventilador foi calibrado de forma que a freqüência respiratória fosse em torno de

60-80 ciclos/minuto e o volume corrente fixado em 1ml/g. Uma vez entubado, foi realizada

uma incisão na região entre o 4º e 5º espaços intercostais, os músculos peitoral maior e menor

divulsionados para obtermos o acesso ao gradil costal e visualizarmos o coração dentro da

caixa torácica. Em seguida, o fluxo sangüíneo da artéria coronária esquerda foi ocluído

durante 90 minutos, a fim de provocar uma lesão isquêmica no miocárdio. Ao final deste

período, o fluxo sangüíneo foi restabelecido (reperfusão local). Em seguida, foi realizada uma

sutura em bolsa e o animal foi retirado do respirador.

3.2.2.1

PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS APLICADOS AOS ANIMAIS SUBMETIDOS

À OCLUSÃO TEMPORÁRIA DA ARTÉRIA CORONÁRIA ESQUERDA

Os animais submetidos à isquemia temporária foram avaliados 48h após o

procedimento cirúrgico, pelo ECG e/ou ECO, a fim de confirmarmos a presença de lesão

isquêmica. Uma vez confirmada a existência de disfunção cardíaca, os animais foram

submetidos dois diferentes protocolos experimentais especificados abaixo:

22

Marcação das células mononucleares de medula óssea com o corante nuclear

Hoechst, e injeção intravenosa destas células 48 horas após a cirurgia de oclusão

temporária, a fim de verificarmos se as células eram capazes de migrar para o

coração submetido à isquemia;

Marcação das CMMO com o radioisótopo 99mTc para avaliação da distribuição

destas células após administração intravenosa nos animais com oclusão

temporária.

Em ambos os protocolos, os animais foram sacrificados 24 horas após a administração

das células.

3.3

ISOLAMENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE MEDULA ÓSSEA

Ratos Wistar singenêicos pesando 200 a 300 g foram anestesiados com éter etílico PA

(Reagen, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e submetidos a deslocamento cervical. Com o auxílio de

uma pinça e uma tesoura estéreis retiramos a pele e os músculos adjacentes ao fêmur e à tíbia,

sempre evitando o rompimento de vasos sangüíneos presentes na região. As epífises ósseas

foram cortadas, e a cavidade medular lavada com meio de cultura Dulbecco s Modified Eagle

Medium (DMEM) (Life Tecnologies®, Grand Island, NY, EUA) utilizando uma seringa com

agulha de 18 gauge colocada sobre um tubo estéril de poliestireno cônico de 15 mL (Falcon ).

As células foram homogeneizadas com auxílio de pipeta Pasteur, e centrifugadas a 200 G

durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sedimento de células foi ressuspenso em

DMEM sem soro, e em seguida adicionado cuidadosamente sobre o Ficoll (Histopaque 1083

Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA). A seguir, as células foram centrifugadas a

400 G durante 30 minutos à temperatura ambiente. Na interface Ficoll-meio, estão contidas as

células mononucleares (linfócitos e monócitos) e células-tronco de medula óssea, que foram

coletadas e colocadas em um tubo de poliestireno cônico de 15 ml (Falcon ). Em seguida,

23

foram ressuspensas em solução salina balanceada ( balanced salt solution - BSS), e

centrifugadas a 200 G durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi

desprezado, e este processo repetido mais duas vezes para retirar o Ficoll que possa ter sido

coletado junto com as células. As células foram contadas na câmara de Neubauer (Hausser

Scientific) e a sua viabilidade analisada com azul de Trypan. A população mononuclear

obtida foi utilizada logo em seguida para os experimentos de distribuição e/ou análise do

efeito da terapia celular.

3.4 ETAPA 2: ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA

3.4.1

DETERMINAÇÃO DA TOPOGRAFIA DO CORAÇÃO NAS IMAGENS

CINTILOGRÁFICAS

Para determinarmos a topografia do coração nas imagens cintilográficas em ratos

normais e infartados através da oclusão permanente da artéria coronária, injetamos por via

intravenosa (i.v.) tetrofosmin (MyoviewTM, Amershan Health AS, Oslo, Noruega) marcado

com 99mTc em ratos normais e OP (24 horas após a cirurgia). Isto nos permitiu diferenciar

áreas com perfusão miocárdica normal daquelas com fibrose (infarto) através de imagens

cintilográficas. As regiões com perfusão adequada emitem radioatividade e aparecem na

imagem. Entretanto, as áreas que possuem irrigação comprometida, não aparecem na imagem,

pois o radiofármarco não chega nessa região.

3.4.2 - MARCAÇÃO DAS CÉLULAS COM 99mTECNÉCIO

Após o isolamento das CMMO conforme já descrito, as mesmas foram marcadas com

o radioisótopo 99mTecnécio e transplantadas pela via endovenosa ou no miocárdio dos animais

dos diversos grupos experimentais descritos no quadro 2.

24

O processo de marcação das células com 99mTc consistiu na incorporação do

radionuclídeo às mesmas. Para tanto, as células foram incubadas, a temperatura ambiente,

com concentrações variando de 5 a 20 g/mL de SnCl2 durante 5 minutos. Em seguida, este

complexo foi incubado com o radionuclídeo (7,4 x 104 Bq) durante mais 5 minutos, e

centrifugado três vezes com NaCl 0,9% a 450 G durante 20 minutos. Ao final da última

lavagem, separamos o precipitado e o sobrenadante. O precipitado foi ressuspenso em NaCl

0,9%, e distribuído em seringas contendo 0,1 mL ou 0,3 mL cada. A quantidade de

radioatividade presente tanto no sobrenadante quanto no precipitado foi quantificada para

determinarmos a eficiência de marcação das células (quantidade de radioatividade

incorporada nas células).

3.4.3

INJEÇÃO DAS CÉLULAS MARCADAS COM 99mTECNÉCIO

Os animais foram anestesiados, colocados em decúbito dorsal, com suas patas traseiras

e dianteiras imobilizadas, para que as células fossem administradas por via intravenosa (i.v.)

ou intramiocárdica (i.m.), nos grupos submetidos à isquemia (48 horas após o procedimento

cirúrgico) e nos animais normais. Os protocolos experimentais utilizados estão descritos

detalhadamente nas Figura 1, 2 e 3.

Para administração das células por via i.v, fizemos uma incisão na pele do animal na

região lateral, abaixo do pescoço para visualização da veia jugular. Desta forma, com auxílio

de uma seringa de 1mL, injetamos as células marcadas com 99mTc direto pela veia jugular. O

conteúdo (0,3 mL) foi liberado lentamente dentro do vaso, e a seringa retirada do interior do

vaso, cuidadosamente, a fim de evitarmos extravasamento de sangue. Em seguida o animal foi

suturado, e em períodos pré-determinados (uma, três e 24 horas após a injeção das células)

realizamos as imagens cintilográficas.

25

Já para a administração por via i.m., o coração foi exteriorizado (conforme descrito

anteriormente no item 3.2.1) e as CMMO marcadas com 99mTc (0,1 mL) foram injetadas em

um único ponto do miocárdio com auxílio de uma seringa de insulina. No caso dos animais

infartados, a administração i.m. das células foi realizada no miocárdio viável adjacente à

cicatriz. Uma vez terminado tal processo, o coração foi colocado novamente em sua posição

anatômica original e o tórax suturado conforme descrito anteriormente no modelo de indução

do infarto experimental. As imagens cintilográficas foram realizadas nos mesmos períodos

pré-determinados descritos anteriormente.

Nos animais normais e OP, as células foram administradas tanto por via i.v. quanto

i.m., sendo que neste último grupo, as mesmas foram injetadas 48 horas após o procedimento

cirúrgico, com concomitante confirmação da indução do infarto pela presença de onda Q na

derivação DI do registro eletrocardiográfico. Já nos animais do grupo OT, as células foram

administradas somente por via i.v., também após confirmação da indução do infarto pelo

ECG.

3.4.4 - IMAGENS CINTILOGRÁFICAS

As imagens cintilográficas foram analisadas na gama câmara (Siemens) com

colimador pinhole de alta definição e janela selecionada para 140 KeV, em diversos intervalos

de tempo: uma hora, três horas, e 24 horas após a infusão das células. Para realização de tal

procedimento, o animal foi anestesiado com cloridrato de quetamina (Vetaset ) e cloridrato

de xilazina (Rompum , Bayer), conforme já descrito no item 3.2.2. Em seguida, o animal foi

colocado em decúbito dorsal, suas patas fixadas com fita adesiva em um suporte de madeira, e

este colocado sob o colimador de alta resolução e baixa energia da gama câmara. A aquisição

das imagens foi realizada em imagens planares, estáticas, de 5 minutos cada, com matriz 256

x 256, de corpo inteiro e nas incidências anterior, lateral e oblíqua com 45º.

26

Figura 1

Protocolo experimental da análise da distribuição das células em animais normais.

A figura A esquematiza o protocolo realizado nos animais tratados com injeção

intramiocárdica (N im), enquanto que a figura B mostra o esquema dos animais tratados com

injeção intravenosa (N iv). T0 = tempo zero.

24h

Contagem dos órgãos isolados

Imagem cintilográfica

Marcação das CMMO com 99mTc

T0

Injeção intramiocárdica de 4 x 106 CMMO

marcadas com 99mTc

1h

3h



A

24h




T0

Injeção intravenosa de 1-3 x 107 CMMO marcadas com 99mTc

1h

3h



B

27

Figura 2

Protocolo experimental da análise da distribuição das células em animais

submetidos à oclusão permanente da artéria coronária (OP). A figura A esquematiza o

protocolo aplicado aos animais tratados com injeção intramiocárdica (OP im), enquanto que a

figura B mostra o esquema dos animais tratados com injeção intravenosa (OP iv). T0 = tempo

zero.

72h



Oclusão permanente da artéria coronária

esquerda

T0

Injeção intravenosa de 1-2 x 107 CMMO

marcadas com 99mTc

49h 51h



B

48h


Confirmação da indução do infarto

pelo ECG

72h



Oclusão permanente da artéria coronária

esquerda

T0

Injeção intramiocárdica de 6 x 106 CMMO

marcadas com 99mTc

49h 51h



A

48h

Marcação das CMMO com

99mTc


pelo ECG

28

Figura 3

Protocolo experimental da análise da distribuição das células em animais

submetidos à oclusão temporária da artéria coronária (OT) tratados com injeção intravenosa

de CMMO. T0 = tempo zero.

72h



Oclusão durante 90 da artéria coronária

esquerda

T0

Injeção intravenosa de 2-5 x 107 CMMO

marcadas com 99mTc

49h 51h



A

48h



pelo ECG

29

3.4.5 CONTAGEM DA RADIOATIVIDADE PRESENTE NOS ÓRGÃOS ISOLADOS

Vinte e quatro horas após a infusão intravenosa das células, o animal foi eutanasiado

conforme descrito anteriormente, e a maioria dos seus órgãos retirados e pesados

isoladamente. Após a pesagem, os órgãos: coração, pulmões, fígado, baço, rins, estômago, e

tíbia; foram distribuídos em tubos de ensaios, e os mesmos colocados em um contador de

radiação gama, que quantifica a radioatividade gama emitida por cada amostra de órgão

isolado. Em seguida, realizamos cálculos para converter estes valores representados em

contagem por minuto (cpm) em termos percentuais, analisando os seguintes parâmetros:

% dose-órgão

Representa a quantidade de radiação presente em determinado órgão.

Ou seja: (cpm do órgão/ nº de desintegrações radioativas por minuto corrigidas

pelo decaimento) x 100

% grama-tecido É a dose-órgão dividida pelo peso do órgão, em gramas. Isto é:

[(cpm do órgão/ nº de desintegrações radioativas por minuto corrigidas pelo

decaimento)/peso do órgão] x 100

3.5

ETAPA 3: ACOMPANHAMENTO DA FUNÇÃO CARDÍACA APÓS O

TRATAMENTO COM CMMO OU VEÍCULO

3.5.1 MARCAÇÃO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES

Os animais dos grupos OP im e OP iv, que tiveram suas funções cardíacas

acompanhadas, receberam por via i.m. ou i.v., respectivamente, células previamente marcadas

com um corante nuclear (Hoechst). Após a marcação, uma alíquota foi examinada em

microscópio de epifluorescência (AXIOVERT 100, Carl ZEISS), e excitada com iluminação

por lâmpada de mercúrio de alta pressão, HBO 50W, (

= 490 m) sendo a emissão

monitorada utilizando um filtro de 350 m a fim de verificar a marcação nuclear das células

30

com o corante. Uma vez confirmada a marcação, as células foram centrifugadas a 200 g

durante 5 minutos a temperatura ambiente, para obtenção do sedimento. O mesmo foi

ressuspenso em salina, e centrifugado a 200 g durante cinco minutos. Este processo foi

repetido de três a quatro vezes para a retirada do possível excesso do corante. Ao final da

última centrifugação, o volume foi ajustado de acordo com o número de células necessárias

para o transplante celular, em alíquotas de 5-6 x 106 células em 0,1 mL e 3-4 x 107 células em

0,3 mL para injeções intramiocárdica e intravenosa, respectivamente.

3.5.2 - ANÁLISE FUNCIONAL

3.5.2.1

ANÁLISE ELETROCARDIOGRÁFICA

O registro eletrocardiográfico foi realizado 48 horas após o procedimento cirúrgico, e

três semanas após a terapia com células ou salina, utilizando um eletrocardiógrafo

convencional (Cardimax FX-2111

Fukuda Denshi) conforme descrito por Santos & Masuda

(1991). Para o registro eletrocardiográfico, os animais foram anestesiados com a combinação

de cloridrato de quetamina (Vetaset ) e cloridrato de xilazina (Rompum , Bayer) conforme

descrito anteriormente. Após o estabelecimento de um bom plano anestésico, verificado

através da ausência de reflexos posturais e motores, os animais foram colocados em decúbito

dorsal e suas patas dianteiras presas com fitas adesivas a fim de manter uma angulação de 90º

em relação ao examinador do corpo, evitando assim qualquer alteração na posição anatômica

do coração. O posicionamento dos animais foi rigorosamente padronizado para diminuírmos a

variabilidade entre os registros, sobretudo para o cálculo dos vetores médios de

despolarização ventricular. Em seguida, agulhas hipodérmicas 30 x 1 conectadas aos quatro

eletrodos (derivações do plano frontal) foram colocadas nas patas dianteiras direita e esquerda

e na coxa esquerda, além da coxa direita que estava ligada ao fio terra (Figura 4A). As

derivações analisadas no plano frontal foram: DI, DII, DIII, aVR, aVL e aVF. O aparelho foi

31

calibrado para a velocidade de 50 mm/s e sensibilidade de 20 mm = 1 mV. Os parâmetros

analisados foram: presença de onda Q na derivação DI, orientação do vetor médio de

despolarização (âQRS) no plano frontal, e índice da amplitude do complexo QRS (soma do

complexo QRS nas derivações DI, DII e DIII).

3.5.2.2

ANÁLISE ECOCARDIOGRÁFICA

Os exames foram realizados 48h após o procedimento cirúrgico (grupos 1, 2 e 3) para

confirmação da presença de infarto. Na etapa 3, além de ter sido analisada neste período, a

função cardíaca também foi avaliada três semanas após a terapia com células ou veículo. As

imagens ecocardiográficas foram obtidas em um equipamento comercialmente disponível

(Megas - Esaote) que permite a aquisição de imagens nos modos uni e bidimensional, com um

transdutor do tipo eletromecânico na faixa de 10 MHz.

Os animais foram anestesiados conforme já descrito no item 3.2.2, depilados na região

torácica, e em seguida, aplicado um gel no seu tórax, para diminuir o contato com o ar e

melhorar a qualidade das imagens obtidas (Figura 4B). Os animais foram colocados em

decúbito dorsal ou lateral esquerdo, para obtenção de imagens longitudinais e transversais por

um pesquisador que desconhecia o histórico do animal. Os parâmetros avaliados

compreenderam: análise da geometria cardíaca e a função sistólica do ventrículo esquerdo

(VE), de acordo com o padrão da Sociedade Americana de Ecocardiografia (ASE) e conforme

descrito por Sahn e colaboradores (1978).

O exame foi realizado antes da cirurgia, 48h horas após o IAM, e três semanas após a

terapia celular ou após administração de veículo.

A geometria cardíaca foi analisada utilizando o modo unidimensional (Modo-M) para

avaliar os seguintes parâmetros: diâmetro da cavidade ventricular ao final da sístole (DSF) e

diâmetro da cavidade ventricular ao final da diástole (DDF), ambos em mm.

32

A função sistólica foi determinada pela da análise da fração de encurtamento (FEnc) e

da fração de ejeção (FE) do VE.

A fração de encurtamento foi calculada pela diferença entre o diâmetro diastólico final

(DDF) e o diâmetro sistólico final (DSF), dividida pelo DDF e multiplicada por 100. Assim:

FEnc (%) = [(DDF DSF) / DDF] x 100

Nos animais normais e falso-operados, a fração de ejeção, outro parâmetro de

avaliação da função sistólica, foi calculada elevando-se ao cubo os valores de DDF e DSF

(método cúbico), obtendo-se assim o volume diastólico final (VDF) e volume sistólico final

(VSF), conforme mostra a fórmula abaixo:

FE (%) = [(DDF)3 (DSF) 3 / (DDF) 3 ] x 100

FE (%) = [VDF VSF / VDF] x 100

Nos grupos de animais infartados, o coração encontrava-se muito dilatado, perdendo

sua forma cônica e invalidando o cálculo dos volumes pelo cubo dos diâmetros cavitários em

sístole e diástole. Para evitar tais erros, o ecocardiógrafo determinou automaticamente no

modo-M os volumes sistólico e diastólico já corrigidos pela fórmula de Teichholz:

V = [7,0 / 2,4 + D] x (D3)

Onde: V = volume ventricular final na diástole ou na sístole; e D = diâmetro diastólico ou

sistólico final ventricular (cm).

Nos animais submetidos à oclusão temporária da coronária, além de calcularmos as

frações de encurtamento e de ejeção pelo modo-M, a função sistólica foi calculada também

33

pelo método de Simpson. Este consiste na delimitação (com auxílio de um cursor) de toda a

cavidade ventricular em sístole e em diástole, o que proporciona a avaliação da função

sistólica global do coração (frações de ejeção e de encurtamento do VE). Desta forma,

minimizamos a possibilidade de realizarmos medidas equivocadas da função ventricular,

devido à super ou subestimação de segmentos específicos do VE.

Nos animais da etapa 3, a partir das imagens bidimensionais, também calculamos

outros dois parâmetros: a fração de encurtamento de área (FEA) e o percentual de acinesia do

ventrículo esquerdo (AVE), parâmetros estes também incluídos na avaliação global da câmara

ventricular esquerda.

O percentual da fração de encurtamento de área (FEA) foi calculado através das áreas

do ventrículo esquerdo em sístole (AVES) e em diástole (AVED), conforme descrito a seguir:

% FEA = [(ADVE-ASVE) /ADVE] x 100

Já o percentual de acinesia do ventrículo esquerdo, que caracteriza a extensão do

infarto, foi calculado a partir dos perímetros de acinesia do VE (PAVE) e total do VE

(PTVE), medidos ao final da diástole, conforme descrito a seguir:

% AVE = [(PTVE - PAVE)/PTVE] x 100

34

Figura 4

Análise da função cardíaca dos ratos. A -

exame eletrocardiográfico . Note os eletrodos

fixados nas patas dianteiras e traseiras do animal (setas). B -

exame ecocardiográfico. Note o gel

condutor em contato com o transdutor e a pele do animal.

B

A

35

3.5.2.3

ANÁLISE HEMODINÂMICA

3.5.2.3.1 CANULAÇÃO DA ARTÉRIA CARÓTIDA COMUM

Os animais foram anestesiados conforme descrito anteriormente no item 3.2.2,

colocados em decúbito dorsal sob uma mesa cirúrgica, e suas patas traseiras e dianteiras

imobilizadas. Uma vez adquirido o plano anestésico ideal, fizemos uma incisão na pele do

animal na região inferior direita lateral a traquéia (Figura 5A). Com auxílio de duas pinças

curvas, divulsionamos os músculos próximos da artéria carótida, e isolamos a mesma (Figura

5B). O fluxo de sangue local foi obstruído, e com o auxílio de uma pinça oftálmica, fizemos

um pequeno corte no vaso, para a inserção da cânula de polietileno (PE 10

diâmetro interno

de 0,28 mm e externo

0,61 mm

Becton Dickson) dentro do vaso (Figura 5C). Para termos

certeza da eficácia da canulação do VE, a mesma era conectada ao transdutor de pressão

(MLT380/D, instrumentos/ADI) associado a um sistema de aquisição Power-Lab400

(instrumentos/ADI), e o registro de pressão obtido deveria ser característico do VE. A outra

extremidade do cateter foi transpassada subcutaneamente entre as escápulas do animal,

permitindo que a mesma fosse exteriorizada no seu dorso (Figura 5D) para realização do

registro hemodinâmico. As análises da pressão intraventricular esquerda foram realizadas com

o animal anestesiado e acordado, considerando que o efeito do anestésico poderia interferir

nos registros hemodinâmicos do animal. Vinte quatro horas após a colocação da cânula

intraventricular, a extremidade exteriorizada foi acoplada ao transdutor de pressão

(MLT380/D, instrumentos/ADI) que se encontrava associado ao sistema de aquisição Power-

Lab400 (instrumentos/ADI). Após um período de adaptação de 30 minutos, iniciamos a

aquisição do registro da pressão intraventricular esquerda dos animais acordados. Os dados

hemodinâmicos foram calculados a partir da média de 10 batimentos cardíacos consecutivos.

Os parâmetros avaliados foram: freqüência cardíaca (FC); pressão sistólica do ventrículo

esquerdo (PSVE); pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE); pressão

36

desenvolvida pelo ventrículo esquerdo (PVE), representada pela diferença entre PSVE e

PDFVE; a primeira derivada temporal positiva máxima da pressão ventricular representada

pela primeira derivada temporal positiva máxima de pressão ventricular (dP/dT+); e a

primeira derivada temporal negativa máxima da pressão ventricular representado pela dP/dT-.

3.6 TESTE DE ESFORÇO

Três semanas após o procedimento cirúrgico, os animais foram submetidos ao estresse

físico em uma esteira de ratos completamente vedada (esteira Accupacer, Accuscan

Instruments, Inc Columbs, Ohio, USA), com inclinação fixada em 10 graus.

O protocolo de exercício máximo utilizado foi uma adaptação do trabalho de

Henderson e colaboradores (2002). Em síntese, cada animal passou por um processo de

adaptação ao exercício que correspondia a um período de três dias, no qual o rato corria

durante 5 minutos a uma velocidade constante de 17 cm/s. No quarto dia, testamos a

capacidade máxima em exercício de cada rato. O início do teste foi realizado com uma

velocidade inicial de 17 cm/s e inclinação constante de 10º. A cada dois minutos, a velocidade

da esteira foi aumentada em 2 cm. Os animais que paravam de correr se aproximavam da área

de choque, e estes estímulos elétricos os mantinham em exercício, a

Documents

VANESSA PINHO RIBEIROlivros01.livrosgratis.com.br/cp034042.pdf · iii PINHO-RIBEIRO, VANESSA Estudo da distribuição e do efeito terapêutico da administração intramiocárdica