VANESSA PINHO RIBEIRO
ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO E DO EFEITO
TERAPÊUTICO DA ADMINISTRAÇÃO
INTRAMIOCÁRDICA OU INTRAVENOSA DAS
CÉLULAS MONONUCLEARES DE MEDULA
ÓSSEA NO MODELO EXPERIMENTAL DE
INFARTO DO MIOCÁRDIO.
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO
DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2 0 0 7
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ii
VANESSA PINHO RIBEIRO
ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO E DO EFEITO TERAPÊUTICO
DA ADMINISTRAÇÃO INTRAMIOCÁRDICA OU
INTRAVENOSA DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DE
MEDULA ÓSSEA NO MODELO EXPERIMENTAL DE
INFARTO DO MIOCÁRDIO.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Bioengenharia e Biotecnologia Animal de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências biológicas (Fisiologia).
Orientadores: Antônio Carlos Campos de Carvalho
Regina Coeli dos Santos Goldenberg
Rio de Janeiro 2007
iii
PINHO-RIBEIRO, VANESSA Estudo da distribuição e do efeito terapêutico da administração intramiocárdica ou intravenosa
das células mononucleares de medula óssea no modelo experimental de infarto do miocárdio.
Vanessa Pinho Ribeiro. Rio de Janeiro, 2007.
xiii, 115f
Tese de Doutorado em Ciências Biológicas (Fisiologia) - Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2007.
Orientadores: Antônio Carlos Campos de Carvalho e Regina Coeli dos Santos Goldenberg
1- Infarto Agudo do Miocárdio 2-Medula óssea 3-Terapia celular 4- Tecnécio.
I - Universidade do Rio de Janeiro.
II- Título
iv
VANESSA PINHO RIBEIRO
ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO E DO EFEITO TERAPÊUTICO DA
ADMINISTRAÇÃO INTRAMIOCÁRDICA OU INTRAVENOSA DAS
CÉLULAS MONONUCLEARES DE MEDULA ÓSSEA NO MODELO
EXPERIMENTAL DE INFARTO DO MIOCÁRDIO.
Rio de Janeiro, 16 de maio de 2007.
Antônio Carlos Campos de Carvalho
Pós-Doutor - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
Regina Coeli dos Santos Goldenberg
Pós-Doutora - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
Léa Mirian Barbosa da Fonseca
Doutora - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
Paulo Roberto Slud Brofman Doutor - Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC-PR)
Rosália Mendez-Otero
Pós-Doutora - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
v
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Cardiologia Celular e Molecular
(LCCM) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de
Janeiro (UFRJ), sob orientação do Dr. Antônio Carlos Campos de Carvalho e co-orientação
da Drª Regina Coeli dos Santos Goldenberg com o apoio financeiro das seguintes instituições:
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ).
Programa Nacional de Excelência (PRONEX).
vi
Esta tese é dedicada
Aos meus pais, Jofre e Luiza, pelo apoio emocional proporcionado todos estes anos,
seja diante da dificuldade para realização de um experimento, ou durante o nervosismo
excessivo proporcionado pelo exame de qualificação. Pelo exemplo de dedicação, amor,
carinho, união e caráter que vocês me proporcionaram durante toda a minha vida. Por me
ensinarem que sempre devemos ir em busca de nossos sonhos de forma digna, honesta, sem
trapaças e falsidade. Por me mostrarem que a vida é feita de obstáculos que devem ser vividos
e vencidos, para que possamos aprender com nossos erros, amadurecer, e nos tornarmos
pessoas melhores. Muito obrigada por tudo e principalmente por me apoiarem, acreditarem no
meu potencial, e torcerem incondicionalmente pelo sucesso da BIOMÉDICA de vocês na
ciência.
A minha tia Eliane (LILI), que sempre esteve presente nos meus momentos de
angústia, nervosismo e nas conquistas também. Por sempre zelar pelo meu bem-estar, e se
interessar pelo andamento da tese, e meus projetos futuros. Muito obrigada pelo amor e
carinho de sempre.
vii
Não basta ensinar ao homem uma especialidade, porque
se tornará assim uma máquina utilizável e não uma
personalidade. É necessário que adquira um sentimento,
um senso prático daquilo que vale a pena ser
empreendido, daquilo que é belo, do que é moralmente
correto". (Albert Einstein)
viii
Aos meus orientadores Prof. ANTÔNIO CARLOS C. DE CARVALHO e Profª REGINA COELI
GOLDENBERG, pelo aprendizado proporcionado durante estes quase sete anos de convivência
no laboratório, que contribuíram bastante para o meu crescimento pessoal e profissional.
Aos membros do LABORATÓRIO DE MARCAÇÃO DE CÉLULAS E MOLÉCULAS do
Departamento de Radiologia e do Serviço de Medicina Nuclear do Hospital Universitário
Clementino Fraga Filho, especialmente: SÉRGIO, CLÁUDIA, FLÁVIA, DRª BIANCA E DRª LÉA,
pela da marcação das células e realização das imagens cintilográficas.
Aos meus primeiros orientadores Dr. SÉRGIO G. COUTINHO e a Drª ALDA M. DA CRUZ que
me proporcionaram os primeiros ensinamentos da carreira científica. Minha eterna
admiração...
À Drª NAZARETH ROCHA pela realização das imagens ecocardiográficas e discussões sobre
os protocolos de isquemia temporária.
Ao professor JOÃO PEDRO S. WERNECK DE CASTRO por participar efetivamente deste
projeto, seja experimentalmente ou intelectualmente. Obrigada por tudo.
Ao professor EMERSON LOPES OLIVARES e o doutorando RICARDO HENRIQUE COSTA E
SOUZA por eventualmente me socorrerem na administração intramiocárdica das células.
À aluna de doutorado e minha amiga PATRÍCIA FIDELIS DE OLIVEIRA pela sua contribuição
na realização das análises hemodinâmicas, paciência e auxílio nas minhas primeiras
canulações da veia jugular, e especialmente por me apoiar na fase de maior estresse durante a
tese: a qualificação. Obrigada, Pat. Não vou esquecer o que você fez por mim.
Aos alunos de iniciação científica: SAMANTHA SOARES, NATHÁLIA ALVES, DIOGO LEITE,
RAFAEL PALETTA E DÉBORA FRANÇA que durante estes quatro anos de realização da tese,
contribuíram, sofreram com as dificuldades e torceram pelo desenvolvimento deste trabalho.
Obrigada a todos. Saibam que eu também aprendi com vocês.
ix
À Técnica DAISY AVANZI (TIA DAISY) por me auxiliar na realização dos cortes
histológicos, pelo seu carinho, dedicação e claro, pelas suas caronas de volta para casa. Muito
obrigada, tia Daisy.
À Técnica JULIANA NASCIMENTO por sempre estar pronta e disposta a ajudar. Obrigada, Ju.
Às minhas três amigas patas do laboratório: JU DIAS, DEB e CAROL que compartilharam
comigo nestes anos, momentos de alegria e confraternização nos Congressos e nights ; mas
também estavam presentes em momentos de muito estudo e trabalho. Ju, valeu por nossos
estudos juntas. Deb, obrigada por sempre estar disposta a ajudar, mesmo que você não tenha
nenhum comprometimento com o experimento. Carol, foi com esse projeto que tudo
começou, lembra? Desde então, nossa amizade só cresceu. Obrigada por tudo, amigas. Adoro
vocês.
Às minhas amigas: RITA que mesmo distante sempre me incentivou e apoiou nesta
carreira; CRIS, pelo interesse, torcida e sua amizade todos esses anos; ANNA BEATRIZ,
FERNANDA E FLÁVIA que apesar da distância no momento, ainda se interessam e torcem pelo
meu sucesso. Ao meu amigo RICARDO, que sempre presente, se interessava pelo andamento
da tese com muito carinho e paciência para escutar.
A todos os membros do LABORATÓRIO DE ELETROFISIOLOGIA CARDÍACA ANTÔNIO PAES DE
CARVALHO e do LABORATÓRIO DE CARDIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR que de alguma
forma contribuíram para o desempenho deste trabalho.
Aos MEUS PAIS, meu IRMÃO JOFRE, à minha TIA ELIANE, pelo apoio, compreensão,
incentivo, carinho e colaboração durante o desenvolvimento da tese.
Aos meus tios Francisco e Valéria pelo apoio e pela colaboração na reta final da tese, e a
toda minha família.
Aos ratinhos, não agradeço, mas peço desculpas. Foi para o bem da ciência.
x
AE - átrio esquerdo
âQRS ângulo do vetor médio de despolarização ventricular
ASE - sociedade americana de ecocardiografia
ATP adenosina trifosfato
AVE - acinesia do ventrículo esquerdo
AVED - área do ventrículo esquerdo em diástole
AVES - área do ventrículo esquerdo em sístole
BPM - batimentos por minuto
BSS - solução salina balanceada
CEMO - células de estroma de medula óssea
c-kit+ positivo para o c-Kit
CMMO - células mononucleares da medula óssea
CPM - contagem por minuto
CTH - células tronco hematopoiéticas
DDF - diâmetro da cavidade ventricular ao final da diástole
DDF - diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo
DMEM
dullbecco s modified eagle medium
dP/dT + - primeira derivada temporal positiva máxima da pressão ventricular
dP/dT- - primeira derivada temporal negativa máxima da pressão ventricular
DSF - diâmetro da cavidade ventricular ao final da Sístole
DSF - diâmetro sistólico final do VE
ECG - eletrocardiograma
ECO - ecocardiograma
ES células-tronco embrionárias ( embrionic stem cells )
FC - freqüência cardíaca
xi
FE - fração de ejeção
FEA - fração de encurtamento de área
Fenc - fração de encurtamento
HSC - células tronco hematopoiéticas ( hematopoietic stem cells )
i.m. - via intramiocárdica
i.v. - via intravenosa
IAM - infarto agudo do miocárdio
ICAM-1 - intercellular adhesion molecule
ICC - insuficiência cardíaca congestiva
IM - infarto do miocárdio
iQRS - índice de amplitude do complexo QRS
MCI - massa celular interna
ME - matriz extracelular
MMP-1 metaloproteinase 1
MMP-9 metaloproteinase 9
MMPs metaloproteinases
Nim - Animais normais que receberam injeção intramiocárdica de células mononucleares de
medula óssea.
Niv
Animais normais que receberam injeção intravenosa de células mononucleares de
medula óssea.
OP - isquemia por oclusão permanente.
OPim - animais submetidos à isquemia por oclusão permanente tratados com células
mononucleares da medula óssea por via intramiocárdica.
OPiv - animais submetidos à isquemia por oclusão permanente tratados com células
mononucleares da medula óssea por via intravenosa.
xii
OT - isquemia por oclusão temporária.
OTiv - animais submetidos à isquemia por oclusão temporária tratados com células
mononucleares da medula óssea por via intravenosa.
PAVE - perímetro de acinesia do VE.
PVE - pressão desenvolvida pelo ventrículo esquerdo
PDFVE - pressão diastólica final do ventrículo esquerdo
PSVE - pressão sistólica do ventrículo esquerdo
PTVE - perímetro total do VE.
RNA - ácido ribonucléico
SDF-1 - stromal cell-derived factor-1
99m Tc - Tecnécio99 metaestável
TGF- 1 - transforming growth factor-beta
TIMPs - tissue inhibitor of MMPs (inibidor das MMPs)
TNF-
- fator de necrose tumoral ;
VCAM-1 - vascular cellular adhesion molecule
VDF - volume diastólico final
VE - ventrículo esquerdo
VSF - volume sistólico final
xiii
O infarto do miocárdio é a principal causa de mortalidade mundial. Atualmente, a
terapia com células da medula óssea é uma alternativa promissora para os pacientes com
doença cardiovascular isquêmica. Este estudo se propõe a identificar os sítios preferenciais de
migração das células de medula óssea (CMMO) durante a isquemia miocárdica aguda, e
correlacionar o impacto da presença destas células sobre a função cardíaca dos animais. Para
tanto, ratos Wistar foram submetidos à isquemia por oclusão temporária (OT) ou permanente
(OP) da artéria coronária esquerda. Quarenta e oito horas após o procedimento cirúrgico, as
CMMO foram marcadas com 99mTecnécio, e transplantadas pelas vias im (4-6 x 106) ou iv (1-
5 x 107) em ratos normais (N) e operados. A distribuição das células foi determinada por
imagens cintilográficas e contagem da radioatividade presente nos órgãos isolados, enquanto
que os parâmetros cardíacos foram analisados pelo eletro e ecocardiograma, assim como pela
hemodinâmica e teste de esforço. Após a terapia im, o percentual de células presente no
coração dos animais OP (2,516
0,394 %) foi significativamente maior comparado aos
normais (N) (1,190
0,255 %) (p < 0,001). No caso da terapia iv, os percentuais de células
presentes no coração dos animais normais (0,012
0,002 %), OP (0,047
0,022 %) e OT
(0,028
0,005 %) não foram estatisticamente diferentes. Três semanas após o tratamento
intravenoso ou intramiocárdico com CMMO, os animais apresentaram onda Q em DI, âQRS
> 90º, fração de encurtamento inferior a 50%, bem como perfil hemodinâmico e teste de
esforço típicos de animais infartados. Assim, a administração das CMMO por via iv ou im, 48
horas após o IAM não promoveu melhora na função cardíaca dos animais.
xiv
The myocardial infarction is the major cause of world´s mortality. Nowadays, therapy
with bone marrow cells is an exciting alternative for patients of ischemic cardiovascular
diseases. The aim of this study is evaluate the effect of mononuclear bone marrow cell
(BMMC) intravenous (i.v.) and intramyocardial (im) transplantation on an experimental
model of myocardial infarction (MI). For this, Wistar rats were submitted to temporary (TO)
and permanent (PO) occlusion of left coronary artery. Forty eight hours after surgery,
BMMCs were labeled with 99mTechnetium and infused by im (4-6 x 106) or iv (1-5 x 107) vias
in normal (N) and operated rats. The cell distribution was obtained by scintigraphy and
radioactive counting of isolated organs. Electrocardiogram, echocardiogram, cardiopulmonary
test and hemodynamic analyses evaluated cardiac parameters. After im injection, the
percentual of cells found in the heart of PO group (2,516
0,394 %) was significantly higher
than in N (1,190
0,255 %) (p < 0,001). At i.v. therapy, the percentual of the cells found in
the heart of normal (0,012
0,002 %), PO (0,047
0,022 %) and TO (0,028
0,005 %)
groups were not statistically different. Three weeks after both kinds of cellular therapy (i.m.
or i.v.), PO group still have Q wave in LI, âQRS > 90º, shortening fraction with less than
50%, hemodynamic and cardiopulmonary test profiles were typical of infarcted hearts. This
work demonstrate that the intramyocardial and intravenous injection, 48 hours after MI not
improved the cardiac function of the animals.
xv
1 INTRODUÇÃO
1.1 - O INFARTO DO MIOCÁRDIO
1.2 - ISQUEMIA E REPERFUSÃO
1.3 - TERAPIAS CELULARES
1.3.1 - CÉLULAS-TRONCO
1.3.2 - A MEDULA ÓSSEA
1.4 - MEDICINA NUCLEAR
1
1
3
5
6
8
11
2 OBJETIVOS
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
3.2 ETAPA 1 : MODELOS DE INDUÇÃO DO INFARTO AGUDO EXPERIMENTAL
3.2.1 GRUPO OP: MODELO DE OCLUSÃO PERMANENTE DA ARTÉRIA CORONÁRIA
ESQUERDA
3.2.2 GRUPO OT: MODELO DE OCLUSÃO TEMPORÁRIA DA ARTÉRIA CORONÁRIA
ESQUERDA.
3.2.2.1 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS APLICADOS AOS ANIMAIS SUBMETIDOS À
OCLUSÃO TEMPORÁRIA DA ARTÉRIA CORONÁRIA ESQUERDA
3.3 - ISOLAMENTO DAS CÉLULAS DE MONONUCLEARES DE MEDULA ÓSSEA (CMMO)
3.4 ETAPA 2: ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA
3.4.1 DETERMINAÇÃO DA TOPOGRAFIA DE CORAÇÃO NAS IMAGENS CINTILOGRÁFICAS
3.4.2 - MARCAÇÃO DAS CÉLULAS COM TECNÉCIO 99M
3.4.3
INJEÇÃO DAS CÉLULAS MARCADAS COM TECNÉCIO 99M
3.4.4 - IMAGENS CINTILOGRÁFICAS
3.4.5 - CONTAGEM DA RADIOATIVIDADE PRESENTE NOS ÓRGÃOS ISOLADOS
3.5 ETAPA 3: ACOMPANHAMENTO DA FUNÇÃO CARDÍACA APÓS O TRATAMENTO COM
CMMO OU VEÍCULO.
3.5.1 MARCAÇÃO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES
3.5.2 - ANÁLISE FUNCIONAL
3.5.2.1 ANÁLISE ELETROCARDIOGRÁFICA
3.5.2.2 ANÁLISE ECOCARDIOGRÁFICA
15
16
16
20
20
20
21
29
21
22
23
23
23
24
25
29
29
29
30
30
31
35
SUMÁRIO
xvi
3.5.2.3 ANÁLISE HEMODINÂMICA
3.5.2.3.1 CANULAÇÃO DA ARTÉRIA CARÓTIDA COMUM
3.6 TESTE DE ESFORÇO
3.7 ANÁLISE ANATOMO-HISTO-PATOLÓLGICA
3.7.1 - PREPARO DO MATERIAL
3.7.1.2 - IDENTIFICAÇÃO DAS CÉLULAS MARCADAS
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
4 RESULTADOS
4.1 ETAPA 1 : COMPARAÇÃO DOS DIFERENTES MODELOS EXPERIMENTAIS DE
INDUÇÃO DO INFARTO DO MIOCÁRDIO
4.1.1 ANÁLISE ELETROCARDIOGRÁFICA
4.1.2 ANÁLISE ECOCARDIOGRÁFICA
4.2
PESQUISA DAS CÉLULAS MARCADAS COM HOECHST APÓS A ADMINISTRAÇÃO
INTRAVENOSA DE CMMO NOS ANIMAIS DO GRUPO OT
4.3 ETAPA 2: ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DE
MEDULA ÓSSEA NO ORGANISMO
4.3.1 MARCAÇÃO DAS CÉLULAS
4.3.2
IMAGENS CINTILOGRÁFICAS E CONTAGEM DA RADIOATIVIDADE PRESENTE
NOS ÓRGÃOS ISOLADOS.
4.3.2.1 CONTROLES EXPERIMENTAIS
4.3.2.2 GRUPOS EXPERIMENTAIS
4.3.2.2.1 ANIMAIS NORMAIS
4.3.2.2.1.1 ADMINISTRAÇÃO INTRAMIOCÁRDICA DE CMMO
4.3.2.2.1.2 ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA DE CMMO
4.3.2.2.1.3
COMPARAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DAS CMMO NO ORGANISMO APÓS
ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA E INTRAMIOCÁRDICA.
4.3.2.2.2 ANIMAIS SUBMETIDOS À OCLUSÃO PERMANENTE
4.3.2.2.2.1 ADMINISTRAÇÃO INTRAMIOCÁRDICA DE CMMO
4.3.2.2.2.2 ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA DE CMMO
4.3.2.2.2.3
COMPARAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO DAS CMMO NO ORGANISMO APÓS
ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA E INTRAMIOCÁRDICA.
4.3.2.2.3 ANIMAIS SUBMETIDOS À OCLUSÃO TEMPORÁRIA
35
35
36
38
38
38
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40
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54
54
57
59
59
59
59
64
64
xvii
4.3.2.2.4 COMPARAÇÃO DA DISTRIBUIÇÃO NO ORGANISMO DAS CMMO EM ANIMAIS
NORMAIS E SUBMETIDOS À ISQUEMIA APÓS ADMINISTRAÇÃO
INTRAVENOSA E INTRAMIOCÁRDICA
4.4
ETAPA 3: ACOMPANHAMENTO DA FUNÇÃO CARDÍACA DE ANIMAIS NORMAIS E
SUBMETIDOS À ISQUEMIA PERMANENTE TRATADOS COM CMMO OU VEÍCULO
4.4.1 ANÁLISE ELETROCARDIOGRÁFICA
4.4.2 ANÁLISE ECOCARDIOGRÁFICA
4.4.3 ANÁLISE HEMODINÂMICA
4.4.4 TESTE DE ESFORÇO
4.4.5 PESQUISA DAS CÉLULAS MARCADAS
64
68
68
73
80
83
85
5 - DISCUSSÃO 88
6 - CONCLUSÕES 101
7 - BIBLIOGRAFIA 102
1
1.1 O INFARTO DO MIOCÁRDIO
O infarto do miocárdio (IM) é uma cardiopatia isquêmica, causada por obstrução de
vasos da circulação coronariana, que promove redução da perfusão local com conseqüente
morte de cardiomiócitos (Factor, 1990). Após a perda de cardiomiócitos necróticos, inicia-se
rapidamente uma série de respostas celulares através da sinalização célula-célula; que regula o
reparo tecidual, contribuindo para a reconstrução do miocárdio infartado e a manutenção da
integridade do ventrículo. Este processo caracteriza-se, inicialmente, pela atração e invasão de
células inflamatórias no sítio da lesão, ativação e síntese de peptídeos, formação de novos
vasos sangüíneos (angiogênese), e surgimento bem como replicação de células do tipo
fibroblasto. Esta fase inflamatória inicial de cicatrização com resultante formação de tecido de
granulação, é seguida por uma fase fibrogênica que resulta no tecido cicatricial. Este que por
muito tempo foi considerado inerte é: dinâmico, vascularizado, metabolicamente ativo e
contrátil. A matriz é composta por miofibroblastos (fibroblastos fenotipicamente
transformados) que não são encontrados no tecido cardíaco normal (exceto nos folhetos
valvares) (Sun & Weber 2000). Tal transformação fenotípica parece ser influenciada pelo
TGF- 1 ( transforming growth factor-beta ). Desmouliere e colaboradores (1993)
demonstraram em estudos in vitro e in vivo que o TGF- 1 contribui para a diferenciação do
fibroblasto em miofibroblasto. Esta citocina é sintetizada por macrófagos ativados que no 1º e
2º dias após o IM aparecem no sítio da lesão. Em seguida surgem os miofibroblastos que
permanecem na cicatriz do infarto por longos períodos de tempo (muitos meses em ratos, e
anos em humanos) (Willems et al. 1994) e contribuem com o acúmulo de colágeno na região.
O balanço entre a síntese e a degradação de colágeno são os determinantes primários da
fibrose tecidual (Sun & Weber 2000). A degradação do colágeno envolve enzimas
proteolíticas conhecidas como metaloproteinases (MMPs). Sun e colaboradores (2000)
observaram durante a fase inicial de reparo do IM, em ratos, um aumento da atividade de
2
MMP-1 (colagenase). Esta enzima tem atividade proteolítica e aumenta a degradação de
fibrilas de colágeno no sítio do IM. Em contrapartida, as TIMPs ( tissue inhibitor of MMPs )
que neutralizam esta atividade colagenolítica e inibem a forma ativada das MMPs, são
encontradas em grande quantidade no sítio do infarto a partir da primeira semana (Cleutjens et
al. 1995). Isto gera um acúmulo progressivo de colágeno no sítio do infarto. Além disso, os
miofibroblastos residentes na cicatriz que são nutridos pelos novos vasos que se formaram,
continuam sintetizando colágeno tipo I, contribuindo assim para a formação do tecido fibroso
e o remodelamento estrutural das regiões não infartadas que estão distantes da área lesada,
conforme observamos nos grandes infartos transmurais (Sun & Weber 2000). Estas
transformações agudas e crônicas tanto na área infartada necrótica quanto na não-necrótica,
bem como na região peri-infarto, geram uma cascata de alterações estruturais e geométricas
progressivas nos ventrículos que são geralmente referidas como remodelamento cardíaco
(Litwin et al. 1994, Jain et al. 2001). Este processo promove mudanças nas dimensões da
parede ventricular e câmara cardíaca. Uma vez que a matriz extracelular (ME) está em contato
íntimo com todos os outros componentes do miocárdio, ela desempenha uma importante
função na manutenção da forma, tamanho e função ventriculares. O ventrículo submetido a
estresse, inicialmente exibe função adequada, forma normal, e relação massa-volume
ventricular acima do normal. Entretanto, em um determinado ponto, a capacidade
compensatória do coração é exaurida e o mesmo começa a falhar. Dependendo da magnitude
e da duração do estresse, os miócitos sobreviventes hipertrofiam, e a ME sofre alterações na
concentração bem como nos tipos de fibrilas de colágeno presentes. Neste estágio, a espessura
da parede ventricular está desproporcionalmente reduzida, o volume da câmara ventricular
bastante aumentado e o ventrículo tende a se tornar esférico (Janiki et al. 2006), ocorrendo
comprometimento da sua função e podendo evoluir para o quadro de insuficiência cardíaca
congestiva (ICC). Tal síndome ainda é considerada um importante problema de saúde pública
3
(Itescu et al. 2003), e por isso torna-se fundamental o conhecimento de todas as alterações
fisiológicas e histopatológicas do coração, promovidas pelo infarto. Sendo assim, vários
grupos têm utilizado principalmente dois modelos experimentais para reproduzir de forma
fidedigna tais alterações: o modelo de oclusão permanente da artéria coronária esquerda e de
oclusão temporária deste mesmo vaso. Este último procedimento também é conhecido como
modelo de isquemia e reperfusão.
1.2 ISQUEMIA E REPERFUSÃO
A isquemia é caracterizada pela deficiência no aporte sangüíneo a determinado órgão
ou tecido. A sua principal conseqüência é hipóxia ou anóxia locais, ou seja, a deficiência
parcial ou total de oxigênio, respectivamente. Esta carência provoca alterações diretas nas
mitocôndrias, o que ocasiona a diminuição da fosforilação oxidativa e, conseqüentemente, dos
níveis de ATP (adenosina trifosfato). Isto por sua vez, compromete totalmente o sistema de
produção protéica celular e a bomba de sódio e potássio, aumentando os níveis de cálcio e
levando à tumefação celular (edema intracelular) (Case et al 1989). Até aqui, os danos são
reversíveis. Com a persistência da isquemia, ocorre uma vacuolização das mitocôndrias, que
podem ser visualizadas segundo Case e colaboradores (1989), 30 a 40 min após a isquemia.
Nesse estágio, instauram-se eventos de lesão celular irreversível, atuando principalmente nas
membranas. Há uma perda contínua de proteínas, enzimas e ácidos ribonucléicos (RNAs),
essenciais para a célula. Membranas lisossômicas são rompidas, levando ao extravasamento
das enzimas lisossomais para o citoplasma. Essas enzimas provocam digestão enzimática dos
componentes celulares, ocasionando a morte celular por autólise. Portanto, a isquemia
provoca lesões reversíveis e irreversíveis, as quais são devidas principalmente à alteração dos
níveis de ATP e de cálcio.
4
Os distúrbios metabólicos durante isquemia ou hipóxia tissular são muito bem
estabelecidos, porém, evidências clínicas e experimentais demonstram que os principais
eventos que promovem disfunções celular e tecidual, relacionam-se com a subseqüente
reperfusão (Evora et al. 1996).
A lesão de reperfusão é caracterizada por alterações funcionais e estruturais, que se
tornam aparentes durante o restabelecimento do fluxo após um período isquêmico. A
restauração do fluxo sangüíneo pode resultar em alguns efeitos deletérios, tais como: necrose
de células lesadas; acentuado edema celular; e restauração não uniforme do fluxo para todas
as porções do tecido (Evora et al. 1996). Conforme descrito anteriormente, quando o fluxo
sangüíneo tissular é interrompido, uma série de processos metabólicos e enzimáticos são
afetados, promovendo acúmulo de lactato, ativação de várias proteases intracelulares, e
aumento da permeabilidade vascular, que causa edema tissular. Por isso, a reversibilidade
deste processo está diretamente relacionada com a duração da isquemia (Stahl et al. 1989
apud Evora et al. 1996), e a reperfusão deve ser restabelecida o mais rápido possível. Embora
seja inquestionável o benefício da reperfusão precoce, a reintrodução do oxigênio em um
meio isquêmico desencadeia diversos eventos que provocam lesões tissulares adicionais e
acúmulo intracelular de cálcio (Ku 1982 apud Evora et al.1996, Braunwald & Kloner 1985).
No tecido cardíaco, a aceleração do processo necrótico dos miócitos lesionados
irreversivelmente, o edema celular, o fenômeno de não-refluxo (restauração não uniforme do
fluxo sangüíneo após uma isquemia temporária, que promove disfunções no tecido cardíaco),
o paradoxo cálcio e oxigênio (lesões celulares ocasionadas pelo grande influxo de cálcio e de
oxigênio para o interior da célula após o restabelecimento da perfusão), a produção de radicais
livres do oxigênio (que podem prejudicar os miócitos isquêmicos), e a depressão da função
ventricular pós-isquêmica prolongada, são exemplos de eventos decorrentes da reentrada de
oxigênio no tecido isquêmico (Braunwald & Kloner 1985). Tais efeitos contribuem para o
5
desenvolvimento de doenças cardíacas isquêmicas, como por exemplo, o infarto do
miocárdio, que dentre as doenças cardiovasculares destaca-se por possuir maior taxa de
mortalidade (Hristov et al. 2006). Os pacientes sobreviventes a grandes infartos apresentam
alto risco de desenvolverem ICC (Takemura & Fujiwara 2006). De acordo com Hosenpud e
colaboradores (2000), 44 % dos pacientes com ICC são candidatos a transplante cardíaco
(Hosenpud et al. 2000), uma vez que as opções terapêuticas existentes atualmente
(farmacológicas e cirúrgicas) são limitadas e muitas vezes incapazes de interromper a
progressão deste quadro. Apesar de em alguns casos o transplante proporcionar um aumento
na sobrevida, as complicações causadas pela imunossupressão e a escassez de doadores
limitam a eficiência deste procedimento (Chiu et al. 1995). Portanto, a comunidade científica
busca alternativas terapêuticas para melhorar a sobrevida e a qualidade de vida destes
pacientes. Uma das mais promissoras possibilidades de conduta terapêutica que atualmente
está sob extensa investigação é a terapia celular.
1.3 TERAPIAS CELULARES
De acordo com Fraser e colaboradores (2004), a terapia ideal para ser empregada no
tratamento do infarto do miocárdio deveria: minimizar a perda de cardiomiócitos pela redução
da morte celular, promover o retorno do miocárdio hibernante para sua função normal,
estimular a revascularização da região isquêmica através do aumento da angiogênese, e
regenerar cardiomiócitos viáveis para substituir aqueles perdidos na isquemia inicial,
preservando a função contrátil e reduzindo a formação de cicatriz. Uma das mais promissoras
possibilidades de conduta terapêutica que vem chamando bastante atenção é a terapia celular.
A proposta desta terapia em pacientes com doenças isquêmicas é melhorar a função contráctil
da câmara ventricular e impedir a progressão da insuficiência cardíaca pela administração de
um determinado tipo celular no paciente. Atualmente, as células-tronco têm sido empregadas
6
como um novo e promissor método para limitar a expansão do infarto e prevenir o
remodelamento cardíaco (Kraitchman et al. 2005).
1.3.1 CÉLULAS-TRONCO
As células-tronco são caracterizadas como células indiferenciadas (sem especialização
funcional e marcadores de diferenciação tecido-específicos), com capacidade de proliferação,
auto-renovação, e plasticidade (capacidade de se diferenciar em vários tecidos distintos)
(Loeffler & Potten,1997). A sua taxa de proliferação é baixa (Alison et al. 2002), e as células-
tronco podem seguir dois diferentes modelos de divisão celular: o chamado determinístico, no
qual sua divisão gera sempre uma célula-tronco idêntica e uma célula progenitora já
comprometida com alguma linhagem específica; ou o dito aleatório (ou estocástico), onde
algumas células-tronco geram somente novas células-tronco e outras geram apenas células
progenitoras já comprometidas (Loeffler & Potten 1997). As células-tronco mais primitivas
são o oócito fertilizado (zigoto) e as descendentes das duas primeiras divisões mitóticas. Estas
células são consideradas totipotentes, pois são capazes de gerar um embrião e o trofoblasto da
placenta (Dawn & Bolli 2005). Após quatro dias, estas células totipotentes começam a se
especializar formando uma massa de células esférica chamada de blastocisto, que por sua vez
contém a massa celular interna (MCI), da qual o embrião se desenvolve. A MCI do blastocisto
é formada por células-tronco embrionárias (do inglês, embrionic stem cells
ES), que se
diferenciam em células dos três folhetos embrionários (endoderma, mesoderma e ectoderma).
Porém, estas células não são capazes de originar a placenta e os tecidos que sustentam a
gestação. Desta forma, as células ES são células-tronco ditas pluripotentes. A maioria dos
tecidos possui células-tronco multipotentes, ou seja, capazes de produzir uma limitada
variedade de linhagens celulares diferenciadas de acordo com a sua localização (Alison et al.
2002, Lovell and Marthur 2004). As células-tronco do sistema nervoso central, por exemplo,
7
são multipotentes, uma vez que são capazes de originar três linhagens distintas: neurônios,
oligodendrócitos e astrócitos (Clarke et al. 2000, Momma et al. 2000). Por último, na
hierarquia das células-tronco temos as chamadas células unipotentes (ou progenitoras
comprometidas), capazes de originar um único tipo celular específico (ex: células-tronco
constituintes da camada basal da epiderme, que originam somente as células escamosas
queratinizadas da pele) (Lovell and Marthur 2004). Estas progenitoras comprometidas
originam células com capacidade de auto-renovação limitada e rápida taxa de proliferação. A
seguir, estas células se dividem originando células terminalmente diferenciadas, que perdem a
sua capacidade de proliferação e mais tarde evoluem para um processo de morte celular
programada (Alison et al. 2002).
Baseando-se na pluripotencialidade das células ES, estas seriam consideradas o tipo
celular mais apropriado para ser empregado na terapia celular. Contudo, o potencial
teratogênico, a necessidade de tratamento imunossupressor e questões éticas são fatores
limitantes para o seu uso terapêutico (Leri et al. 2005), o que torna as células-tronco adultas
as principais candidatas a serem usadas em tal tipo de terapia.
As células-tronco adultas estão presentes em muitos tecidos e órgãos, onde são
encontradas como células primitivas capazes de reparar danos causados por doenças ou lesões
durante a vida do indivíduo. Estas células tecido-específicas têm sido descritas em muitos
órgãos, tais como: medula óssea, trato gastrointestinal, pele, pulmões, fígado, músculo
esquelético, sistema nervoso central, e coração. Destas, a população mais bem estudada é a de
células tronco da medula óssea. (Dawn & Bolli 2005).
1.3.2 A MEDULA ÓSSEA
A medula óssea pode ser vista como um tecido organizado em dois compartimentos: o
compartimento hematopoiético, que fornece ao organismo células maduras de todas as
linhagens sangüíneas; e o compartimento estromal, que proporciona um microambiente
8
adequado para a auto-renovação, proliferação e diferenciação das células-tronco e
progenitoras hematopoiéticas (Hüttmann et al. 2003). Além disso, o compartimento estromal
abriga progenitores vasculares (Jackson et al. 2001) e células mesenquimais, capazes de se
diferenciarem em tipos celulares da maioria dos tecidos conjuntivos (Bianco et al. 2001).
A população hematopoiética está distribuída na medula óssea em sítios específicos,
denominados microambientes. Nestes sítios encontramos células-tronco hematopoiéticas
(CTH), e progenitores das linhagens mielóide e linfóide em diferentes estágios de
diferenciação, ou seja, populações de células imaturas, em estágio intermediário de
desenvolvimento e maduras (Bianco 2000).
As CTH são caracterizadas como células multipotentes, com alta capacidade de
proliferação, auto-renovação e diferenciação em uma variedade de linhagens mielóide e
linfóide especializadas (Osawa et al. 1996, Goodell et al. 1996). São capazes de reconstituir e
manter todas as linhagens sangüíneas (Lovell & Mathur 2004), uma vez que possuem
habilidade para balancear os mecanismos de auto-renovação e diferenciação de acordo com a
necessidade do organismo. Além disso, sofrem morte celular programada e são mobilizadas
para fora da medula óssea em direção à circulação sangüínea (Weissman 2000, Bonnet et al.
2002) quando existe necessidade. São caracterizadas fenotipicamente por expressarem o
marcador hematopoiético CD45, bem como CD34, CD133 e CD117 (também chamado de c-
kit), porém, os marcadores de linhagem estão ausentes (lin-) (Dawn & Bolli 2005). Na fase
adulta, elas estão presentes no sangue ou na medula óssea, sendo o processo de hematopoiese
bastante hierarquizado.
Uma variedade de estímulos (citocinas solúveis, ligadas à membrana, ou associadas à
matriz extracelular, e moléculas de adesão celular) do estroma da medula óssea influenciam
as CTH e sua progênie (Whetton & Spooncer, 1998) na modulação da quiescência, na auto-
renovação, no comprometimento das CTH com determinada linhagem celular; bem como na
9
proliferação, maturação e apoptose das células maduras (Dennis & Charbord, 2002). Além
disso, o estroma da cavidade medular, constituído por células endoteliais, osteoblastos,
células adventícias, células reticulares e células-tronco mesenquimais, fornece o suporte físico
necessário para a migração das células hematopoiéticas (CH) maduras até os sinusóides
(vasos sangüíneos de parede fina) (Bianco 2000). Estes por sua vez, localizam-se próximos
aos sítios ativos de hematopoiese e transportam as células sangüíneas recém formadas para a
circulação periférica. Isto demonstra a importância do estroma na estimulação e regulação do
desenvolvimento das CH, bem como das próprias células do estroma da medula óssea
(CEMO), e da célula-tronco mesenquimal (Minguell et al. 2000).
As células mesenquimais de medula óssea foram isoladas inicialmente por
Friedenstein e colaboradores (1974) e subseqüentemente por outros investigadores (Caplan et
al. 1991, Clark et al. 1995, Pittinger et al. 1999), baseada na sua capacidade de aderência à
superfície da placa de cultivo do tecido e seu grande potencial de diferenciação. Estas células
in vitro parecem capazes de se diferenciar em diversas linhagens celulares: osteoblastos,
condrócitos, adipócitos (Caplan et al. 1991, Prockop et al. 1997, Pittinger et al. 1999),
músculo esquelético (Ferrari et al. 1998), músculo cardíaco (Makino et al. 1999, Tomita et al.
1999, Wang et al. 2000, Toma et al. 2002, Hakuno et al. 2002), células endoteliais (Jian et al.
2002), hepatócitos (Petersen et al. 1999, Alison et al. 2000, Theise et al. 2000, Jian et al.
2002), neurônios, oligodendrócitos e astrócitos (Sanchez-Ramos et al. 2000, Woodbury et al.
2000, Jian et al. 2002).
Baseando-se nestes fatos, vários investigadores têm utilizado as células de medula
óssea como terapia alternativa no infarto do miocárdio experimental (Tomita et al. 1999,
Wang et al. 2000, Orlic et al. 2001a, Orlic et al. 2001b, Jackson et al. 2001, Shake et al.
2002, Strauer et al. 2002, Hamano et al. 2002, Olivares et al. 2004; Olivares et al. 2007).
Destacando alguns destes trabalhos, Tomita e colaboradores (1999) implantaram
10
células mesenquimais tratadas in vitro com 5-azacitidina (um agente demetilante de DNA) no
coração de ratos, 21 dias após a crioinjúria, e demonstraram que apesar delas não se
transdiferenciarem em cardiomiócitos, induziram angiogênese e impediram a expansão da
cicatriz e dilatação da câmara ventricular. Na fase cicatricial do modelo de infarto do
miocárdio foi demonstrada angiogênese em cães submetidos ao tratamento intramiocárdico
com células de medula óssea 30 dias após a oclusão da artéria coronária descendente anterior
(DA). Entretanto, não houve melhora na função cardíaca de tais animais (Hamano et al.
2002). A melhora no desempenho cardíaco foi evidenciada por Shake e colaboradores (2002),
em porcos infartados, tratados com injeção intramiocárdica de células mesenquimais, 14 dias
após a oclusão da artéria coronária esquerda. Tal melhora foi observada através do aumento
na espessura da parede ventricular e redução na disfunção contráctil. Nossos resultados
prévios demonstraram que a administração intramiocárdica de células mesenquimais de
medula óssea, 28 dias após a oclusão da artéria coronária de ratos, diminuiu o grau de lesão
evidenciado, pelo eletro e ecocardiograma, duas semanas após o tratamento (Olivares et al.
2004). Além disso, os efeitos benéficos sobre a função cardíaca podem ser aprimorados pelo
tratamento prévio com captopril (Olivares et al. 2007).
Alguns autores têm investigado a eficácia da administração intramiocárdica das
células mononucleares de medula óssea tanto no modelo animal (Olivares et al. 2007) quanto
em humanos (Perin et al. 2003, Perin et al. 2004). No entanto, esta via é bastante invasiva
para aplicação em pacientes. Por este motivo, alguns pesquisadores têm investigado a
administração intravenosa (i.v.) de preparações contendo células-tronco, a fim de aumentar a
população endógena que migraria para o miocárdio após o infarto (Nagaya et al. 2004).
Entretanto, a localização destas células exógenas no tecido infartado tem contado
primariamente com análises histológicas pós-morte. Assim, a distribuição dinâmica destas
células-tronco injetadas perifericamente e o seu tráfego só podem ser desvendados através de
11
estudos comparativos com a eutanásia seriada de uma grande quantidade de animais. Para que
isto seja evitado, e para atender as normas de bioética para a utilização de animais
experimentais são necessários métodos que avaliem a distribuição e o destino das células-
tronco, de forma não invasiva, sem a necessidade da histologia pós-morte (Kraitchman et al.
2005). Atualmente, dispomos de técnicas de medicina nuclear capazes de analisar a
distribuição de células (previamente marcadas com radiotraçadores) administradas por via
intravenosa, fornecendo de forma não invasiva, imagens cintilográficas que determinam o
potencial migratório destas células para o sítio da lesão.
1.4 MEDICINA NUCLEAR
A Medicina Nuclear é a especialidade médica que utiliza elementos radioativos
(radionuclídeos) in vivo para diagnosticar e/ou tratar doenças. Avalia a função e a estrutura
dos órgãos, o que possibilita uma identificação precoce de certas anormalidades, bem como
tem sua aplicação terapêutica em tratamentos de algumas doenças (ex: hipertireoidismo,
câncer de tireóide, dor óssea, etc.) Além disso, é bastante empregada no estudo da fisiologia e
fisiopatologia humanas, uma vez que estuda o curso temporal de um traçador radioativo e a
resposta fisiológica do corpo, através de imagens in vivo obtidas pela cintilografia (Bailey &
Adamson 2003).
Os traçadores radioativos são radioisótopos empregados no organismo em pequenas
quantidades, cujo percurso pode ser acompanhado por aparelhos detectores de radiação. A
radioatividade emitida é capaz de atravessar a matéria, e dependendo da sua energia,
percebida pelo aparelho detector onde estiver (Cardoso ). Para
estudos diagnósticos sugere-se que a energia da radiação esteja em uma faixa adequada para
os sistemas de detecção, e que o isótopo apresente um rápido decaimento para forma não
radioativa (= meia vida, ou seja, tempo que leva para metade dos átomos passarem da forma
http://www.cnen.gov.br>
12
radioativa para forma estável). Baseado nestes critérios, o radioisótopo mais empregado
atualmente em medicina nuclear é o 99Tecnécio.
O 99tecnécio metaestável (99mTc) é um elemento radioativo fundamental para a
medicina nuclear, que permite realizar investigações de diversas funções vitais. Ele é gerado a
partir da eluição do 99molibdênio (produto de fissão produzido em reatores nucleares) em
solução de NaCl 0,9%, apresentando-se sob a forma química de pertecnato de sódio (NaTcO4)
(Marques et al. 2001). Este radioisótopo apresenta estados de oxidação que variam de +7 (o
mais estável, e a forma pelo qual é fornecida pelo gerador) até +1. As reações de
radiomarcação com 99mTc envolvem a redução do pertecnato (99mTcO4-) a estados de oxidação
mais baixos que podem ser estabilizados por uma série de ligantes, como por exemplo,
doadores de N, O, S e P. Por causa da sua baixa energia emitida (radiação gama com energia
de 140 keV), da sua meia vida curta (seis horas) e da sua fácil aquisição, o 99mTc é o
radionuclídeo mais utilizado na cintilografia gama (Marques et al. 2001), podendo ser
administrado sob a forma química de pertecnetato de sódio ou ligado a outras moléculas. As
doses administradas são medidas em função do número de eventos radioativos por segundo,
sendo expresso em unidades Becquerel (1 Bq = 1 desintegração por segundo) ou Curie (1 Ci =
3,7 x 1010 Bq). Após a sua administração, geralmente por via endovenosa, o 99mTc e os demais
radioisótopos, ou os compostos aos quais estão acoplados (radiofármacos) têm um
comportamento biológico que é idêntico ao de similares não radioativos (Meira
htpp://br.geocities.com/luizmeira/cintilo.htm). A distribuição e o grau de concentração do
elemento radioativo nos diversos órgãos são avaliados por meio de imagens cintilográficas.
A cintilografia é uma técnica não invasiva, segura, indolor, de baixo custo, e com
sensibilidade elevada para avaliar o funcionamento dos diversos órgãos (ex: coração, rins,
cérebro, e outros) (Bailey & Adamson
2003). Tal método é baseado na administração
endovenosa do radioisótopo (também chamado de traçador ), e na avaliação da energia gama
13
emitida pelos traçadores. Uma vez presente na circulação periférica, o radioisótopo é atraído
para órgãos específicos. O seu deslocamento e percurso podem ser acompanhados, pois a
energia emitida pelo traçador (geralmente radiação gama) é captada por um aparelho
chamando câmara de cintilação (ou gama câmara). A gama câmara é o sistema de detecção de
radioatividade utilizado para o estudo da distribuição in vivo dos diferentes compostos
radiomarcados. A interação da radiação gama no detector da câmara leva a emissão de luz
(cintilação), posteriormente convertida em sinal elétrico. A câmara de cintilação detecta a
radiação e determina a posição da fonte emissora (correspondente à área em que a luz foi
emitida) e sua energia (intensidade da luz emitida). Além da maior resolução, os
equipamentos mais modernos destacam-se pela capacidade de adquirir e processar estudos
tomográficos (SPECT = single photon emission computed tomography ), trazendo maior
sensibilidade e precisão na localização de lesões. Dentre as várias aplicações da cintilografia,
podemos destacar a sua capacidade de diagnosticar doença arterial coronariana, através da
chamada cintilografia de perfusão miocárdica (Meira
htpp://br.geocities.com/luizmeira/cintilo.htm).
A cintilografia de perfusão do miocárdio avalia o fluxo de sangue para o músculo
cardíaco através das artérias coronárias. Isto possibilita definir possíveis obstruções
coronarianas, analisar a probabilidade da ocorrência de um infarto do miocárdio, e ainda pode
estimar a extensão de um infarto prévio. Este exame caracteriza-se pela captação da
radioatividade emitida por um radiofármaco (administrado por via endovenosa), o qual se
concentra nos miócitos, na dependência da sua irrigação e sua integridade celular, gerando
assim uma imagem do coração. Um radiofármaco bastante utilizado ligado ao 99mTc é o
tetrofosminn (Meira htpp://br.geocities.com/luizmeira/cintilo.htm). Este complexo interage
diretamente com o cardiomiócito, sendo captado por difusão passiva através de um gradiente
transmembrana. Além disso, fixa-se de forma estável com pouca redistribuição, em estruturas
14
citoplasmáticas, e possui afinidade pelo meio intramitocondrial. O grau de captação deste
radiofármaco é diretamente proporcional à perfusão miocárdica no momento de sua
administração, isto é, se uma área do coração não recebe sangue (isquemia), o traçador não
consegue chegar neste local, não há captação de radioatividade, e esta região não aparece na
imagem cintilográfica. Tal radiofármaco, após administração endovenosa e acúmulo no
miocárdio (que capta cerca de 1% da dosagem administrada), músculo esquelético, fígado,
baço, e rins, em proporção a perfusão regional, é rapidamente retirado da circulação (Meira
htpp://br.geocities.com/luizmeira/cintilo.htm).
Baseado nos princípios citados anteriormente, o tetrofosmin-99mTc vem sendo
amplamente utilizado na detecção de áreas de perfusão miocárdica de pacientes infartados
através da cintilografia de perfusão miocárdica. Além disso, células marcadas com um
traçador radioativo, como o 99mTc, infundidas na circulação periférica, podem ser localizadas
de forma não invasiva através de imagens cintilográficas. Portanto, a medicina nuclear é
bastante útil nos estudos que envolvem a aplicação da terapia celular, principalmente aqueles
relacionados com as vias de administração.
15
Este estudo se propõe a identificar os sítios preferenciais de migração das células de
medula óssea (CMMO) durante a isquemia miocárdica aguda, e correlacionar o impacto da
presença destas células sobre a função cardíaca dos animais. Para tal, os objetivos deste
trabalho são:
- Identificar a distribuição das CMMO marcadas com 99mTc, administradas por via
intravenosa, em ratos submetidos à isquemia miocárdica aguda através da oclusão permanente
da artéria coronária esquerda.
- Verificar se existe diferença na distribuição das CMMO administradas por via
intravenosa, entre os modelos de oclusão temporária e permanente da artéria coronária
esquerda.
- Comparar a distribuição das CMMO marcadas com 99mTc, administradas por via
intravenosa e intramiocárdica, em ratos submetidos à isquemia aguda por oclusão permanente.
- Avaliar o efeito dos tratamentos intravenoso e intramiocárdico com CMMO na
função cardíaca dos animais submetidos à oclusão permanente da artéria coronária esquerda.
- Comparar o efeito do tratamento intramiocárdico e intravenoso.
16
3.1
ANIMAIS
Ratos Wistar machos e fêmeas singenêicos pesando entre 200-250g fornecidos pelo nosso
biotério foram utilizados para obtenção das células de medula óssea, bem como para indução
do infarto do miocárdio e os experimentos de distribuição das células. Todos os
procedimentos seguiram as normas do Comitê de Ética do Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro para utilização de animais de
Laboratório. Os animais foram separados em grupos de acordo com as seguintes etapas do
estudo:
- ETAPA 1
Grupo de animais destinados à avaliação da função cardíaca nos diferentes
modelos experimentais de infarto: modelo de oclusão temporária e de oclusão permanente da
artéria coronária esquerda.
- ETAPA 2
Grupo de animais destinados à análise da distribuição das células
mononucleares da medula óssea (CMMO) no organismo.
- ETAPA 3 - Grupo de animais destinados à avaliação da função cardíaca dos animais
tratados com CMMO ou veículo.
A análise dos parâmetros cardíacos nos diferentes modelos experimentais de infarto (Etapa
1) visa a validação do modelo de oclusão temporária da artéria coronária esquerda, para que
posteriormente a distribuição intravenosa das CMMO seja comparada em ambos os modelos
de isquemia propostos. Sendo assim, na etapa 1 foram avaliados os parâmetros cardíacos dos
seguintes grupos: animais normais, uma vez que estudos prévios não mostraram diferença no
eletro e ecocardiograma entre animais normais e falso-operados (Pinho-Ribeiro 2003),
animais submetidos à isquemia pela oclusão permanente ou oclusão temporária da artéria
coronária. Estes dois últimos grupos foram denominados OP e OT, respectivamente. A
descrição detalhada de todos os grupos da etapa 1 está descrita no quadro 1.
17
Nos animais da etapa 2 analisamos a distribuição das CMMO marcadas com o traçador
99mTc a fim de estabelecermos os possíveis sítios de migração das células após a
administração intravenosa em animais normais, OP e OT. Além disso, a distribuição das
CMMO em animais normais e OP após administração intramiocárdica das células também foi
analisada. O quadro 2 fornece a descrição detalhada de cada grupo desta etapa.
Nos animais da etapa 3 analisamos a os parâmetros cardíacos de ratos submetidos à
isquemia por oclusão permanente, tratados com injeção intramiocárdica (grupo OP im) ou
intravenosa (grupo OP iv) de CMMO ou veículo (salina), 48 horas após o procedimento
cirúrgico. No caso dos animais que receberam veículo, não houve diferença significativa entre
aqueles que receberam tratamento intravenoso e os que receberam injeção intramiocárdica,
por isso todos foram agrupados em um único grupo chamado OP. Os parâmetros cardíacos
avaliados basearam-se no eletrocardiograma (ECG), ecocardiograma (ECO), análise
hemodinâmica e teste de esforço. O ECG e o ECO foram realizados antes do tratamento com
CMMO ou com veículo (48h após o procedimento cirúrgico) e três semanas após o
tratamento com células ou veículo. As análises hemodinâmicas e o teste de esforço foram
realizados somente três semanas após a terapia celular. A descrição detalhada de todos os
grupos da etapa 3 está descrita no quadro 3.
18
Quadro 1 Descrição dos grupos da etapa 1.
ETAPA 1
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO CARDÍACA NOS DIFERENTES
MODELOS EXPERIMENTAIS DE INFARTO.
NORMAIS Análise da função cardíaca de animais normais (n = 10).
OP Análise da função cardíaca de animais submetidos à oclusão
permanente da artéria coronária esquerda (n = 10).
OT Análise da função cardíaca de animais submetidos à oclusão
temporária (90 minutos) da artéria coronária esquerda (n = 10).
Quadro 2 Descrição dos grupos da etapa 2.
ETAPA 2
ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS CMMO NO ORGANISMO.
N iv Análise da distribuição das CMMO injetadas por via intravenosa em
animais normais (n = 10).
N im Análise da distribuição das CMMO injetadas por via intramiocárdica
em animais normais (n = 10).
OP iv Análise da distribuição das CMMO após administração intravenosa
em animais submetidos à oclusão permanente da artéria coronária
esquerda (n = 10)
OP im Análise da distribuição das CMMO após administração
intramiocárdica em animais submetidos à oclusão permanente da
artéria coronária esquerda (n = 10)
OT iv Avaliação da distribuição das CMMO após administração intravenosa
em animais submetidos à oclusão temporária (90 minutos) da artéria
coronária esquerda (n = 7).
19
Quadro 3 Descrição dos grupos da etapa 3.
ETAPA 3
ANIMAIS INFARTADOS TRATADOS COM CMMO
OP
Análise da função cardíaca de animais submetidos à oclusão
permanente da artéria coronária esquerda após administração de
veículo (n = 10).
OP iv Análise da função cardíaca de animais submetidos à oclusão
permanente da artéria coronária esquerda após administração
intravenosa de CMMO (n = 10)
OP im Análise da função cardíaca de animais submetidos à oclusão
permanente da artéria coronária esquerda após administração
intramiocárdica de CMMO (n = 9)
20
3.2 ETAPA 1 : MODELOS DE INDUÇÃO DO INFARTO AGUDO EXPERIMENTAL
3.2.1
GRUPO OP: MODELO DE OCLUSÃO PERMANENTE DA ARTÉRIA
CORONÁRIA ESQUERDA
O modelo de infarto experimental em ratos induzido pela oclusão permanente da
artéria coronária esquerda descrito por Selye e colaboradores (1960) foi utilizado em nosso
laboratório (Olivares et al. 2004, Werneck-de-Castro et al. 2006, Olivares et al. 2007). Para
tal, os animais foram anestesiados com halotano (Cristália®), e em seguida realizada uma
incisão de aproximadamente 1 cm de comprimento na pele, em nível paraesternal esquerdo,
na junção dos terços inferior e médio da distância entre a clavícula e o rebordo costal. Os
músculos peitoral maior e menor foram dissecados para melhor visualização do gradil costal
esquerdo. Realizou-se uma sutura em bolsa, da pele e dos músculos da região, deixando o nó
aberto até o término da cirurgia. Neste momento, os animais foram submetidos à ventilação
mecânica através de um pequeno ambú de fabricação doméstica com o intuito de estimular os
movimentos respiratórios espontâneos. Com o auxílio de uma pinça hemostática reta, fez-se a
incisão entre o 4o ou 5o espaço intercostal esquerdo, através do qual o coração foi
exteriorizado por meio de uma suave compressão manual torácica direita. Após a localização
da artéria coronária esquerda (geralmente sob a aurícula esquerda), a mesma foi ocluída com
fio de seda 6-0 através de um nó duplo o mais próximo possível de sua origem na aorta. Em
seguida, o coração foi recolocado rapidamente em sua posição anatômica original e o nó da
sutura em bolsa finalmente apertado. A taxa de mortalidade induzida pelo procedimento
cirúrgico foi entre 30 e 40%. Após 48 horas, realizamos ECG e/ou ECO para verificar se o
infarto foi realmente induzido.
21
3.2.2
GRUPO OT: MODELO DE OCLUSÃO TEMPORÁRIA DA ARTÉRIA
CORONÁRIA ESQUERDA
Os animais foram anestesiados com 50 mg/kg de cloridrato de quetamina (Vetaset ) e
5 mg/kg de cloridrato de xilazina (Rompum , Bayer), e após obtermos um plano anestésico
ideal, realizamos a entubação do animal. Para tal procedimento, o mesmo foi colocado em
decúbito dorsal e traqueotomizado. Desta forma, realizamos uma incisão em seu pescoço, os
músculos da região foram divulsionados, e a traquéia isolada. Em seguida, um jelco nº 30, foi
inserido entre os anéis da traquéia e conectado ao ventilador. Os animais foram mantidos sob
ventilação com pressão positiva com ar ambiente e suplementado com oxigênio (2L/min).
Para tanto, o ventilador foi calibrado de forma que a freqüência respiratória fosse em torno de
60-80 ciclos/minuto e o volume corrente fixado em 1ml/g. Uma vez entubado, foi realizada
uma incisão na região entre o 4º e 5º espaços intercostais, os músculos peitoral maior e menor
divulsionados para obtermos o acesso ao gradil costal e visualizarmos o coração dentro da
caixa torácica. Em seguida, o fluxo sangüíneo da artéria coronária esquerda foi ocluído
durante 90 minutos, a fim de provocar uma lesão isquêmica no miocárdio. Ao final deste
período, o fluxo sangüíneo foi restabelecido (reperfusão local). Em seguida, foi realizada uma
sutura em bolsa e o animal foi retirado do respirador.
3.2.2.1
PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS APLICADOS AOS ANIMAIS SUBMETIDOS
À OCLUSÃO TEMPORÁRIA DA ARTÉRIA CORONÁRIA ESQUERDA
Os animais submetidos à isquemia temporária foram avaliados 48h após o
procedimento cirúrgico, pelo ECG e/ou ECO, a fim de confirmarmos a presença de lesão
isquêmica. Uma vez confirmada a existência de disfunção cardíaca, os animais foram
submetidos dois diferentes protocolos experimentais especificados abaixo:
22
Marcação das células mononucleares de medula óssea com o corante nuclear
Hoechst, e injeção intravenosa destas células 48 horas após a cirurgia de oclusão
temporária, a fim de verificarmos se as células eram capazes de migrar para o
coração submetido à isquemia;
Marcação das CMMO com o radioisótopo 99mTc para avaliação da distribuição
destas células após administração intravenosa nos animais com oclusão
temporária.
Em ambos os protocolos, os animais foram sacrificados 24 horas após a administração
das células.
3.3
ISOLAMENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE MEDULA ÓSSEA
Ratos Wistar singenêicos pesando 200 a 300 g foram anestesiados com éter etílico PA
(Reagen, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e submetidos a deslocamento cervical. Com o auxílio de
uma pinça e uma tesoura estéreis retiramos a pele e os músculos adjacentes ao fêmur e à tíbia,
sempre evitando o rompimento de vasos sangüíneos presentes na região. As epífises ósseas
foram cortadas, e a cavidade medular lavada com meio de cultura Dulbecco s Modified Eagle
Medium (DMEM) (Life Tecnologies®, Grand Island, NY, EUA) utilizando uma seringa com
agulha de 18 gauge colocada sobre um tubo estéril de poliestireno cônico de 15 mL (Falcon ).
As células foram homogeneizadas com auxílio de pipeta Pasteur, e centrifugadas a 200 G
durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sedimento de células foi ressuspenso em
DMEM sem soro, e em seguida adicionado cuidadosamente sobre o Ficoll (Histopaque 1083
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA). A seguir, as células foram centrifugadas a
400 G durante 30 minutos à temperatura ambiente. Na interface Ficoll-meio, estão contidas as
células mononucleares (linfócitos e monócitos) e células-tronco de medula óssea, que foram
coletadas e colocadas em um tubo de poliestireno cônico de 15 ml (Falcon ). Em seguida,
23
foram ressuspensas em solução salina balanceada ( balanced salt solution - BSS), e
centrifugadas a 200 G durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi
desprezado, e este processo repetido mais duas vezes para retirar o Ficoll que possa ter sido
coletado junto com as células. As células foram contadas na câmara de Neubauer (Hausser
Scientific) e a sua viabilidade analisada com azul de Trypan. A população mononuclear
obtida foi utilizada logo em seguida para os experimentos de distribuição e/ou análise do
efeito da terapia celular.
3.4 ETAPA 2: ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA
3.4.1
DETERMINAÇÃO DA TOPOGRAFIA DO CORAÇÃO NAS IMAGENS
CINTILOGRÁFICAS
Para determinarmos a topografia do coração nas imagens cintilográficas em ratos
normais e infartados através da oclusão permanente da artéria coronária, injetamos por via
intravenosa (i.v.) tetrofosmin (MyoviewTM, Amershan Health AS, Oslo, Noruega) marcado
com 99mTc em ratos normais e OP (24 horas após a cirurgia). Isto nos permitiu diferenciar
áreas com perfusão miocárdica normal daquelas com fibrose (infarto) através de imagens
cintilográficas. As regiões com perfusão adequada emitem radioatividade e aparecem na
imagem. Entretanto, as áreas que possuem irrigação comprometida, não aparecem na imagem,
pois o radiofármarco não chega nessa região.
3.4.2 - MARCAÇÃO DAS CÉLULAS COM 99mTECNÉCIO
Após o isolamento das CMMO conforme já descrito, as mesmas foram marcadas com
o radioisótopo 99mTecnécio e transplantadas pela via endovenosa ou no miocárdio dos animais
dos diversos grupos experimentais descritos no quadro 2.
24
O processo de marcação das células com 99mTc consistiu na incorporação do
radionuclídeo às mesmas. Para tanto, as células foram incubadas, a temperatura ambiente,
com concentrações variando de 5 a 20 g/mL de SnCl2 durante 5 minutos. Em seguida, este
complexo foi incubado com o radionuclídeo (7,4 x 104 Bq) durante mais 5 minutos, e
centrifugado três vezes com NaCl 0,9% a 450 G durante 20 minutos. Ao final da última
lavagem, separamos o precipitado e o sobrenadante. O precipitado foi ressuspenso em NaCl
0,9%, e distribuído em seringas contendo 0,1 mL ou 0,3 mL cada. A quantidade de
radioatividade presente tanto no sobrenadante quanto no precipitado foi quantificada para
determinarmos a eficiência de marcação das células (quantidade de radioatividade
incorporada nas células).
3.4.3
INJEÇÃO DAS CÉLULAS MARCADAS COM 99mTECNÉCIO
Os animais foram anestesiados, colocados em decúbito dorsal, com suas patas traseiras
e dianteiras imobilizadas, para que as células fossem administradas por via intravenosa (i.v.)
ou intramiocárdica (i.m.), nos grupos submetidos à isquemia (48 horas após o procedimento
cirúrgico) e nos animais normais. Os protocolos experimentais utilizados estão descritos
detalhadamente nas Figura 1, 2 e 3.
Para administração das células por via i.v, fizemos uma incisão na pele do animal na
região lateral, abaixo do pescoço para visualização da veia jugular. Desta forma, com auxílio
de uma seringa de 1mL, injetamos as células marcadas com 99mTc direto pela veia jugular. O
conteúdo (0,3 mL) foi liberado lentamente dentro do vaso, e a seringa retirada do interior do
vaso, cuidadosamente, a fim de evitarmos extravasamento de sangue. Em seguida o animal foi
suturado, e em períodos pré-determinados (uma, três e 24 horas após a injeção das células)
realizamos as imagens cintilográficas.
25
Já para a administração por via i.m., o coração foi exteriorizado (conforme descrito
anteriormente no item 3.2.1) e as CMMO marcadas com 99mTc (0,1 mL) foram injetadas em
um único ponto do miocárdio com auxílio de uma seringa de insulina. No caso dos animais
infartados, a administração i.m. das células foi realizada no miocárdio viável adjacente à
cicatriz. Uma vez terminado tal processo, o coração foi colocado novamente em sua posição
anatômica original e o tórax suturado conforme descrito anteriormente no modelo de indução
do infarto experimental. As imagens cintilográficas foram realizadas nos mesmos períodos
pré-determinados descritos anteriormente.
Nos animais normais e OP, as células foram administradas tanto por via i.v. quanto
i.m., sendo que neste último grupo, as mesmas foram injetadas 48 horas após o procedimento
cirúrgico, com concomitante confirmação da indução do infarto pela presença de onda Q na
derivação DI do registro eletrocardiográfico. Já nos animais do grupo OT, as células foram
administradas somente por via i.v., também após confirmação da indução do infarto pelo
ECG.
3.4.4 - IMAGENS CINTILOGRÁFICAS
As imagens cintilográficas foram analisadas na gama câmara (Siemens) com
colimador pinhole de alta definição e janela selecionada para 140 KeV, em diversos intervalos
de tempo: uma hora, três horas, e 24 horas após a infusão das células. Para realização de tal
procedimento, o animal foi anestesiado com cloridrato de quetamina (Vetaset ) e cloridrato
de xilazina (Rompum , Bayer), conforme já descrito no item 3.2.2. Em seguida, o animal foi
colocado em decúbito dorsal, suas patas fixadas com fita adesiva em um suporte de madeira, e
este colocado sob o colimador de alta resolução e baixa energia da gama câmara. A aquisição
das imagens foi realizada em imagens planares, estáticas, de 5 minutos cada, com matriz 256
x 256, de corpo inteiro e nas incidências anterior, lateral e oblíqua com 45º.
26
Figura 1
Protocolo experimental da análise da distribuição das células em animais normais.
A figura A esquematiza o protocolo realizado nos animais tratados com injeção
intramiocárdica (N im), enquanto que a figura B mostra o esquema dos animais tratados com
injeção intravenosa (N iv). T0 = tempo zero.
24h
Contagem dos órgãos isolados
Imagem cintilográfica
Marcação das CMMO com 99mTc
T0
Injeção intramiocárdica de 4 x 106 CMMO
marcadas com 99mTc
1h
3h
Imagem cintilográfica
Imagem cintilográfica
A
24h
Contagem dos órgãos isolados
Imagem cintilográfica
Marcação das CMMO com 99mTc
T0
Injeção intravenosa de 1-3 x 107 CMMO marcadas com 99mTc
1h
3h
Imagem cintilográfica
Imagem cintilográfica
B
27
Figura 2
Protocolo experimental da análise da distribuição das células em animais
submetidos à oclusão permanente da artéria coronária (OP). A figura A esquematiza o
protocolo aplicado aos animais tratados com injeção intramiocárdica (OP im), enquanto que a
figura B mostra o esquema dos animais tratados com injeção intravenosa (OP iv). T0 = tempo
zero.
72h
Contagem dos órgãos isolados
Imagem cintilográfica
Oclusão permanente da artéria coronária
esquerda
T0
Injeção intravenosa de 1-2 x 107 CMMO
marcadas com 99mTc
49h 51h
Imagem cintilográfica
Imagem cintilográfica
B
48h
Marcação das CMMO com 99mTc
Confirmação da indução do infarto
pelo ECG
72h
Contagem dos órgãos isolados
Imagem cintilográfica
Oclusão permanente da artéria coronária
esquerda
T0
Injeção intramiocárdica de 6 x 106 CMMO
marcadas com 99mTc
49h 51h
Imagem cintilográfica
Imagem cintilográfica
A
48h
Marcação das CMMO com
99mTc
Confirmação da indução do infarto
pelo ECG
28
Figura 3
Protocolo experimental da análise da distribuição das células em animais
submetidos à oclusão temporária da artéria coronária (OT) tratados com injeção intravenosa
de CMMO. T0 = tempo zero.
72h
Contagem dos órgãos isolados
Imagem cintilográfica
Oclusão durante 90 da artéria coronária
esquerda
T0
Injeção intravenosa de 2-5 x 107 CMMO
marcadas com 99mTc
49h 51h
Imagem cintilográfica
Imagem cintilográfica
A
48h
Marcação das CMMO com 99mTc
Confirmação da indução do infarto
pelo ECG
29
3.4.5 CONTAGEM DA RADIOATIVIDADE PRESENTE NOS ÓRGÃOS ISOLADOS
Vinte e quatro horas após a infusão intravenosa das células, o animal foi eutanasiado
conforme descrito anteriormente, e a maioria dos seus órgãos retirados e pesados
isoladamente. Após a pesagem, os órgãos: coração, pulmões, fígado, baço, rins, estômago, e
tíbia; foram distribuídos em tubos de ensaios, e os mesmos colocados em um contador de
radiação gama, que quantifica a radioatividade gama emitida por cada amostra de órgão
isolado. Em seguida, realizamos cálculos para converter estes valores representados em
contagem por minuto (cpm) em termos percentuais, analisando os seguintes parâmetros:
% dose-órgão
Representa a quantidade de radiação presente em determinado órgão.
Ou seja: (cpm do órgão/ nº de desintegrações radioativas por minuto corrigidas
pelo decaimento) x 100
% grama-tecido É a dose-órgão dividida pelo peso do órgão, em gramas. Isto é:
[(cpm do órgão/ nº de desintegrações radioativas por minuto corrigidas pelo
decaimento)/peso do órgão] x 100
3.5
ETAPA 3: ACOMPANHAMENTO DA FUNÇÃO CARDÍACA APÓS O
TRATAMENTO COM CMMO OU VEÍCULO
3.5.1 MARCAÇÃO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES
Os animais dos grupos OP im e OP iv, que tiveram suas funções cardíacas
acompanhadas, receberam por via i.m. ou i.v., respectivamente, células previamente marcadas
com um corante nuclear (Hoechst). Após a marcação, uma alíquota foi examinada em
microscópio de epifluorescência (AXIOVERT 100, Carl ZEISS), e excitada com iluminação
por lâmpada de mercúrio de alta pressão, HBO 50W, (
= 490 m) sendo a emissão
monitorada utilizando um filtro de 350 m a fim de verificar a marcação nuclear das células
30
com o corante. Uma vez confirmada a marcação, as células foram centrifugadas a 200 g
durante 5 minutos a temperatura ambiente, para obtenção do sedimento. O mesmo foi
ressuspenso em salina, e centrifugado a 200 g durante cinco minutos. Este processo foi
repetido de três a quatro vezes para a retirada do possível excesso do corante. Ao final da
última centrifugação, o volume foi ajustado de acordo com o número de células necessárias
para o transplante celular, em alíquotas de 5-6 x 106 células em 0,1 mL e 3-4 x 107 células em
0,3 mL para injeções intramiocárdica e intravenosa, respectivamente.
3.5.2 - ANÁLISE FUNCIONAL
3.5.2.1
ANÁLISE ELETROCARDIOGRÁFICA
O registro eletrocardiográfico foi realizado 48 horas após o procedimento cirúrgico, e
três semanas após a terapia com células ou salina, utilizando um eletrocardiógrafo
convencional (Cardimax FX-2111
Fukuda Denshi) conforme descrito por Santos & Masuda
(1991). Para o registro eletrocardiográfico, os animais foram anestesiados com a combinação
de cloridrato de quetamina (Vetaset ) e cloridrato de xilazina (Rompum , Bayer) conforme
descrito anteriormente. Após o estabelecimento de um bom plano anestésico, verificado
através da ausência de reflexos posturais e motores, os animais foram colocados em decúbito
dorsal e suas patas dianteiras presas com fitas adesivas a fim de manter uma angulação de 90º
em relação ao examinador do corpo, evitando assim qualquer alteração na posição anatômica
do coração. O posicionamento dos animais foi rigorosamente padronizado para diminuírmos a
variabilidade entre os registros, sobretudo para o cálculo dos vetores médios de
despolarização ventricular. Em seguida, agulhas hipodérmicas 30 x 1 conectadas aos quatro
eletrodos (derivações do plano frontal) foram colocadas nas patas dianteiras direita e esquerda
e na coxa esquerda, além da coxa direita que estava ligada ao fio terra (Figura 4A). As
derivações analisadas no plano frontal foram: DI, DII, DIII, aVR, aVL e aVF. O aparelho foi
31
calibrado para a velocidade de 50 mm/s e sensibilidade de 20 mm = 1 mV. Os parâmetros
analisados foram: presença de onda Q na derivação DI, orientação do vetor médio de
despolarização (âQRS) no plano frontal, e índice da amplitude do complexo QRS (soma do
complexo QRS nas derivações DI, DII e DIII).
3.5.2.2
ANÁLISE ECOCARDIOGRÁFICA
Os exames foram realizados 48h após o procedimento cirúrgico (grupos 1, 2 e 3) para
confirmação da presença de infarto. Na etapa 3, além de ter sido analisada neste período, a
função cardíaca também foi avaliada três semanas após a terapia com células ou veículo. As
imagens ecocardiográficas foram obtidas em um equipamento comercialmente disponível
(Megas - Esaote) que permite a aquisição de imagens nos modos uni e bidimensional, com um
transdutor do tipo eletromecânico na faixa de 10 MHz.
Os animais foram anestesiados conforme já descrito no item 3.2.2, depilados na região
torácica, e em seguida, aplicado um gel no seu tórax, para diminuir o contato com o ar e
melhorar a qualidade das imagens obtidas (Figura 4B). Os animais foram colocados em
decúbito dorsal ou lateral esquerdo, para obtenção de imagens longitudinais e transversais por
um pesquisador que desconhecia o histórico do animal. Os parâmetros avaliados
compreenderam: análise da geometria cardíaca e a função sistólica do ventrículo esquerdo
(VE), de acordo com o padrão da Sociedade Americana de Ecocardiografia (ASE) e conforme
descrito por Sahn e colaboradores (1978).
O exame foi realizado antes da cirurgia, 48h horas após o IAM, e três semanas após a
terapia celular ou após administração de veículo.
A geometria cardíaca foi analisada utilizando o modo unidimensional (Modo-M) para
avaliar os seguintes parâmetros: diâmetro da cavidade ventricular ao final da sístole (DSF) e
diâmetro da cavidade ventricular ao final da diástole (DDF), ambos em mm.
32
A função sistólica foi determinada pela da análise da fração de encurtamento (FEnc) e
da fração de ejeção (FE) do VE.
A fração de encurtamento foi calculada pela diferença entre o diâmetro diastólico final
(DDF) e o diâmetro sistólico final (DSF), dividida pelo DDF e multiplicada por 100. Assim:
FEnc (%) = [(DDF DSF) / DDF] x 100
Nos animais normais e falso-operados, a fração de ejeção, outro parâmetro de
avaliação da função sistólica, foi calculada elevando-se ao cubo os valores de DDF e DSF
(método cúbico), obtendo-se assim o volume diastólico final (VDF) e volume sistólico final
(VSF), conforme mostra a fórmula abaixo:
FE (%) = [(DDF)3 (DSF) 3 / (DDF) 3 ] x 100
FE (%) = [VDF VSF / VDF] x 100
Nos grupos de animais infartados, o coração encontrava-se muito dilatado, perdendo
sua forma cônica e invalidando o cálculo dos volumes pelo cubo dos diâmetros cavitários em
sístole e diástole. Para evitar tais erros, o ecocardiógrafo determinou automaticamente no
modo-M os volumes sistólico e diastólico já corrigidos pela fórmula de Teichholz:
V = [7,0 / 2,4 + D] x (D3)
Onde: V = volume ventricular final na diástole ou na sístole; e D = diâmetro diastólico ou
sistólico final ventricular (cm).
Nos animais submetidos à oclusão temporária da coronária, além de calcularmos as
frações de encurtamento e de ejeção pelo modo-M, a função sistólica foi calculada também
33
pelo método de Simpson. Este consiste na delimitação (com auxílio de um cursor) de toda a
cavidade ventricular em sístole e em diástole, o que proporciona a avaliação da função
sistólica global do coração (frações de ejeção e de encurtamento do VE). Desta forma,
minimizamos a possibilidade de realizarmos medidas equivocadas da função ventricular,
devido à super ou subestimação de segmentos específicos do VE.
Nos animais da etapa 3, a partir das imagens bidimensionais, também calculamos
outros dois parâmetros: a fração de encurtamento de área (FEA) e o percentual de acinesia do
ventrículo esquerdo (AVE), parâmetros estes também incluídos na avaliação global da câmara
ventricular esquerda.
O percentual da fração de encurtamento de área (FEA) foi calculado através das áreas
do ventrículo esquerdo em sístole (AVES) e em diástole (AVED), conforme descrito a seguir:
% FEA = [(ADVE-ASVE) /ADVE] x 100
Já o percentual de acinesia do ventrículo esquerdo, que caracteriza a extensão do
infarto, foi calculado a partir dos perímetros de acinesia do VE (PAVE) e total do VE
(PTVE), medidos ao final da diástole, conforme descrito a seguir:
% AVE = [(PTVE - PAVE)/PTVE] x 100
34
Figura 4
Análise da função cardíaca dos ratos. A -
exame eletrocardiográfico . Note os eletrodos
fixados nas patas dianteiras e traseiras do animal (setas). B -
exame ecocardiográfico. Note o gel
condutor em contato com o transdutor e a pele do animal.
B
A
35
3.5.2.3
ANÁLISE HEMODINÂMICA
3.5.2.3.1 CANULAÇÃO DA ARTÉRIA CARÓTIDA COMUM
Os animais foram anestesiados conforme descrito anteriormente no item 3.2.2,
colocados em decúbito dorsal sob uma mesa cirúrgica, e suas patas traseiras e dianteiras
imobilizadas. Uma vez adquirido o plano anestésico ideal, fizemos uma incisão na pele do
animal na região inferior direita lateral a traquéia (Figura 5A). Com auxílio de duas pinças
curvas, divulsionamos os músculos próximos da artéria carótida, e isolamos a mesma (Figura
5B). O fluxo de sangue local foi obstruído, e com o auxílio de uma pinça oftálmica, fizemos
um pequeno corte no vaso, para a inserção da cânula de polietileno (PE 10
diâmetro interno
de 0,28 mm e externo
0,61 mm
Becton Dickson) dentro do vaso (Figura 5C). Para termos
certeza da eficácia da canulação do VE, a mesma era conectada ao transdutor de pressão
(MLT380/D, instrumentos/ADI) associado a um sistema de aquisição Power-Lab400
(instrumentos/ADI), e o registro de pressão obtido deveria ser característico do VE. A outra
extremidade do cateter foi transpassada subcutaneamente entre as escápulas do animal,
permitindo que a mesma fosse exteriorizada no seu dorso (Figura 5D) para realização do
registro hemodinâmico. As análises da pressão intraventricular esquerda foram realizadas com
o animal anestesiado e acordado, considerando que o efeito do anestésico poderia interferir
nos registros hemodinâmicos do animal. Vinte quatro horas após a colocação da cânula
intraventricular, a extremidade exteriorizada foi acoplada ao transdutor de pressão
(MLT380/D, instrumentos/ADI) que se encontrava associado ao sistema de aquisição Power-
Lab400 (instrumentos/ADI). Após um período de adaptação de 30 minutos, iniciamos a
aquisição do registro da pressão intraventricular esquerda dos animais acordados. Os dados
hemodinâmicos foram calculados a partir da média de 10 batimentos cardíacos consecutivos.
Os parâmetros avaliados foram: freqüência cardíaca (FC); pressão sistólica do ventrículo
esquerdo (PSVE); pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE); pressão
36
desenvolvida pelo ventrículo esquerdo (PVE), representada pela diferença entre PSVE e
PDFVE; a primeira derivada temporal positiva máxima da pressão ventricular representada
pela primeira derivada temporal positiva máxima de pressão ventricular (dP/dT+); e a
primeira derivada temporal negativa máxima da pressão ventricular representado pela dP/dT-.
3.6 TESTE DE ESFORÇO
Três semanas após o procedimento cirúrgico, os animais foram submetidos ao estresse
físico em uma esteira de ratos completamente vedada (esteira Accupacer, Accuscan
Instruments, Inc Columbs, Ohio, USA), com inclinação fixada em 10 graus.
O protocolo de exercício máximo utilizado foi uma adaptação do trabalho de
Henderson e colaboradores (2002). Em síntese, cada animal passou por um processo de
adaptação ao exercício que correspondia a um período de três dias, no qual o rato corria
durante 5 minutos a uma velocidade constante de 17 cm/s. No quarto dia, testamos a
capacidade máxima em exercício de cada rato. O início do teste foi realizado com uma
velocidade inicial de 17 cm/s e inclinação constante de 10º. A cada dois minutos, a velocidade
da esteira foi aumentada em 2 cm. Os animais que paravam de correr se aproximavam da área
de choque, e estes estímulos elétricos os mantinham em exercício, a