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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Vegetal e Bioprocessos
VARIAÇÃO DAS CONDIÇÕES NUTRICIONAIS PARA
OTIMIZAÇÃO DO CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE LIPÍDEOS
POR MICROALGAS
Carolina Tolomini Miranda
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Biotecnologia Vegetal e Bioprocessos,
da Universidade do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte
dos requisitos necessários à obtenção do título de
doutor em Ciências – Ciências Biológicas
(Biotecnologia Vegetal).
Orientadora: Prof.a
Dr.a Sandra M.F.O. Azevedo
Rio de Janeiro
Março de 2017
ii
iv
iv
Miranda, Carolina Tolomini
Variação das condições nutricionais para otimização do crescimento e
produção de lipídeos por microalgas. Rio de Janeiro, 2017.
xiii, 111f.:il.
Tese (doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Pós graduação
em Biotecnologia Vegetal, 2017.
Orientador: Sandra Maria Feliciano de Oliveira e Azevedo
1.Otimização. 2.Nitrato e fosfato. 3.CO2. 4.Microalgas. 5.Cultivo. 6.Lipídeos.
I. Azevedo, Sandra Maria Feliciano de Oliveira. II. Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Pós graduação em Biotecnologia Vegetal.IV.Título.
v
v
Às pessoas que contribuíram com a
realização desta tese.
vi
vi
AGRADECIMENTOS
À Prof.a Dra.Sandra M. F. O. Azevedo pela orientação durante a realização deste
trabalho e pela atenção dispensada durante a minha permanência no Laboratório de
Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias (LETC).
Ao Centro de Pesquisas Leopoldo Américo Miguez de Mello (CENPES) por fornecer a
linhagem de Chlamydomonas sp. utilizada neste trabalho.
À Prof.a Dra.Paula Fernandes de Aguiar (IQ/UFRJ) pelo incentivo e pela contribuição
para que os objetivos deste trabalho fossem alcançados.
À Prof.a
Dra. Geórgia Atella e Mileane Busch, por colaborarem na realização de
importantes análises.
Às Prof.as
Dra. Valéria Freitas de Magalhães e Dra. Raquel Moraes Soares pela
amizade e pelas críticas e sugestões sempre oportunas. À equipe do LETC pela amizade
e constante incentivo estendidos para além do laboratório. Ao MSc. Daniel Vinícius
Neves de Lima pela parceria, meu colaborador de longa data.
Aos Professores membros de banca Dr. Ricardo M. Chaloub, Dra. Mariângela Menezes,
Dr. Paulo Sérgio Salomon, Dra. Yordanka Reyes Cruz e Dr. Celso Sant’anna que
generosamente contribuíram para uma melhor apresentação da versão final desta tese.
Ao Prof. Dr. José Vanderli Andreta, responsável pela minha iniciação na pesquisa
científica, meu eterno reconhecimento.
Aos meus pais e irmãos.
Ao meu companheiro Gabriel, que diariamente contribui para que a nossa casa seja um
ambiente fértil de ideias e de realizações dos nossos projetos.
À minha sorte, pois eu continuo acreditando que dentre todos os valores intrínsecos ao
indivíduo, a sorte também é decisiva para que as coisas deem certo na vida de uma
pessoa.
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vii
RESUMO
A otimização do meio de cultivo é uma etapa crucial para a viabilização da produção de
biodiesel a partir dos lipídeos oriundos do metabolismo de microalgas. Neste trabalho
foram avaliados os efeitos da combinação da limitação de nutrientes, do aumento da
salinidade e da suplementação de CO2 no acúmulo dos lipídeos de duas linhagens de
microalgas Clorofíceas, Ankistrodesmus sp. (ANRF-01) e Chlamydomonas sp.
(CHLRN-01), a fim de determinar a condição ótima para este acúmulo. Os resultados
obtidos revelaram que a redução em 75% da concentração original de nitrato e fosfato
do meio ASM-1 apresentou melhores resultados de produção de biomassa e de lipídeos,
na ordem de 23,0 g.L-1 e 31,4%, para ANRF-1, e, 60 g.L
-1 e 22.5%, para CHLRN-1,
respectivamente. Ambas as linhagens mostraram-se aptas para o cultivo em meio
salobro contendo 0,5g L-1 de NaCl. ANRF-1 apresentou um expressivo aumento na
produção de biomassa e no rendimento lipídico quando cultivada em meio ASM-1
suplementado com 5% de CO2, demonstrando um importante potencial para a mitigação
de CO2 proveniente de gases de combustão. Por outro lado, em CHLR-01, foi verificado
um efeito inibitório no crescimento celular acompanhado e uma diminuição do acúmulo
de lipídeos sendo, portanto, não recomendada a aplicação de 5% de CO2 no meio para o
cultivo desta linhagem. O perfil de ácidos graxos produzidos por ANRF-1 e CHLRN-1
foi majoritariamente constituído por C16:0 (ácido palmítico), C18:1n-9c (ácido oleico),
18:2n-6c (ácido linolênico) e C18:3n-3 (ácido α linolênico), um perfil lipídico
promissor não apenas para a indústria de biocombustíveis, mas também para as
indústrias de fármacos e alimentícia, pela alta variedade de ácidos graxos
poliinsaturados ômega 3 e ômega 6.
viii
viii
ABSTRACT
Culture medium optimization is a crucial step for viability of biodiesel production from
lipids of microalgae. In this work were evaluated the effects of nutrients limitation,
salinity increase and CO2 addition in lipid production by two strains of Chlorophyceae
microalgae, Ankistrodesmus sp. (ANRF-01) e Chlamydomonas sp. (CHLRN-01), to
determine the optimal condition for these production. The results revealed that the
reduction to 75% of ASM-1 nitrate and phosphate concentrations presented superior
results of biomass and lipid production, in order of 23,0 g.L-1 and 31,4% for ANRF-1
and 60 g.L-1
and 22.5% for CHLRN-1, respectively. Both strains were suitable for
cultivation in brackish medium containing 0,5g L-1
NaCl. ANRF-1 showed an
expressive increase in biomass production and lipid yield in ASM-1 medium 5% CO2
added, showing an important potential for CO2 mitigation from combustion gases. In
other hand, for CHLRN-1 the 5% CO2 addition leaded to an inhibitory effect on cell
growth with a decrease in lipid production. Being therefore the addition of 5% CO2 not
recommended for this strain. The Fatty acid profile produced by ANRF-1 and CHLRN-
1 was mainly composed of C16:0 (palmitic acid), C18:1n-9c (oleic acid), 18:2n-6c
(linolenic acid) and C18:3n-3 (α-linolenic acid) promising not for biofuels industry
only, but also for the pharmaceutical and food industries, due to the high variety of
polyunsaturated fatty acids of omega3 and omega 6.
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ix
ÍNDICE
1 Introdução.................................................................................................................. 1
1.1 Fatores que afetam o crescimento e o metabolismo de microalgas ................... 4
1.1.1 Luz .............................................................................................................. 4
1.1.2 Temperatura ................................................................................................ 5
1.1.3 Carbono inorgânico .................................................................................... 6
1.1.4 pH ............................................................................................................... 7
1.1.5 Oxigênio dissolvido .................................................................................... 8
1.1.6 Salinidade ................................................................................................... 8
1.1.7 Nutrientes.................................................................................................. 10
1.2 Justificativa ...................................................................................................... 14
1.3 Objetivo geral................................................................................................... 14
1.3.1 Objetivos específicos ................................................................................ 15
2 Material e métodos .................................................................................................. 16
2.1 Linhagens de microalgas utilizadas no estudo ................................................. 16
2.2 Manutenção das linhagens ............................................................................... 19
2.3 Parâmetros de cultivo do pré-inóculo .............................................................. 19
2.4 Parâmetros físicos e químicos .......................................................................... 20
2.4.1 Luz ............................................................................................................ 20
2.4.2 Temperatura .............................................................................................. 20
2.4.3 pH ............................................................................................................. 21
2.5 Experimentos ................................................................................................... 22
2.5.1 Experimento Fatorial simples 23 para otimização do meio de cultivo ..... 22
2.5.2 Experimentos com suplementação de CO2 ............................................... 24
2.6 Parâmetros fisiológicos .................................................................................... 25
2.6.1 Avaliação do crescimento celular das linhagens ...................................... 25
2.6.2 Determinação do peso seco da biomassa das microalgas ......................... 25
2.6.3 Concentração de clorofila a ...................................................................... 26
2.6.4 Determinação do rendimento lipídico da biomassa produzida ................. 27
2.6.5 Quantificação dos ésteres metílicos de ácidos graxos .............................. 28
x
x
2.7 Análise estatística dos resultados ..................................................................... 29
2.7.1 Metodologia de superfície de resposta ..................................................... 29
2.7.2 Função de Derringer ................................................................................. 30
2.7.3 Analise da variância (ANOVA) ............................................................... 31
3 Resultados ............................................................................................................... 32
3.1 Microalgae Lipid and Biodiesel Production: A Brazilian Challenge .............. 32
3.1.1 Introduction .............................................................................................. 33
3.1.2 Biotechnological potential of microalgae ................................................. 35
3.1.3 Cultivation ................................................................................................ 37
3.1.4 Light, CO2 and nutrients ........................................................................... 38
3.1.5 Lipids from microalgae ............................................................................ 41
3.1.6 Conversion of fatty acids into biodiesel ................................................... 44
3.1.7 Challenges, prospect and conclusion ........................................................ 46
3.2 Optimization of nitrogen, phosphorus and salt for lipid accumulation of
microalgae: Towards the viability of microalgae biodiesel ........................................ 48
3.2.1 Introduction .............................................................................................. 49
3.2.2 Material and Methods ............................................................................... 51
3.2.3 Results and discussion .............................................................................. 55
3.2.4 Conclusion ................................................................................................ 67
3.3 Impacts of nutrients and CO2 concentrations on growth and lipid production
by microalgae .............................................................................................................. 68
3.3.1 Introduction .............................................................................................. 69
3.3.2 Materials and Methods ............................................................................. 72
3.3.3 Results and Discussion ............................................................................. 76
3.3.4 Conclusion ................................................................................................ 85
4 Discussão geral ........................................................................................................ 87
5 Conclusões .............................................................................................................. 93
7 ANEXO I .............................................................................................................. 109
8 ANEXO II – .......................................................................................................... 111
xi
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Micrografia óptica da microalga (A) Ankistrodesmus sp. (ANRF-1) e (B)
Chlamydomonas sp. (CHLRN-1) em aumento de 400x e após 4 dias de cultivo em meio
ASM-1. ........................................................................................................................... 18
Figura 2: Área designada ao cultivo de Ankistrodesmus sp. (ANRF-1) demonstrando a
disposição das lâmpadas e do sensor para medição da temperatura externa. ................. 21
Figura 3: Experimento fatorial para otimização do meio de cultivo. Da esquerda para
direita experimentos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e controle da linhagem ANRF-1. ... 23
Figura 4: Misturador de gases para misturas de dióxido de carbono e ar utilizados nos
experimentos com adição de 5% de CO2. ...................................................................... 25
Figura 5: Membranas com concentrado de Ankistrodesmus sp (ANRF-1) para
determinação da biomassa seca. ..................................................................................... 26
Figura 6: Derringer function of biomass and lipid productivity from Ankistrodesmus sp.
(ANRF-1) and Chlamydomonas sp. (CHLRN-1) for each design point experimented. 58
Figura 7: 3D response surface and contour plots of nitrate, phosphate and sodium
chloride concentrations levels on biomass production (A, C and E) and lipid yield (B, D
and F) of Ankistrodesmus sp. when NaCl was fixed at level (-1), (0) and (+1),
respectively. .................................................................................................................... 60
Figura 8: 3D response surface and contour plots of nitrate, phosphate and sodium
chloride concentrations levels on biomass production (A, C and E) and lipid yield (B, D
and F) of Chlamydomonas sp. when NaCl was fixed at level (-1), (0) and (+1),
respectively. .................................................................................................................... 61
Figura 9: Differences between optimized medium and ASM-1 in the lipid content and
FAMEs of Ankistrodesmus sp. (A) and Chlamydomonas sp. (B). Data points are means
of three independent experiments and error bars show SD. ........................................... 63
xii
xii
Figura 10: GC chromatogram of representative FAMEs from microalgae
Ankistrodesmus sp. in optimized medium (A) and ASM-1 (B) after 10 days of
cultivation. Numerals above peaks show the retention time of appropriate peak in
minutes. (C) FAMEs content in lipid extract in optimized medium (black columns) and
ASM-1 (gray columns) * The position of the double bond was not identified, **
correspond to 16:3n3 Δ4,7,10
and *** 16:3n3 Δ7,10,13
. Data points are means of three
independent experiments and error bars show SD. ........................................................ 65
Figura 11: GC chromatogram of representative FAMEs from microalgae
Chlamydomonas sp. in optimized medium (A) and ASM-1 (B) after 10 days of
cultivation. Numerals above peaks show the retention time of appropriate peak minutes.
(C) FAMEs content in lipid extract in optimized medium (black columns) and ASM-1
(gray columns) * The position of the double bond was not identified, ** correspond to
16:3n3 Δ4,7,10
and *** 16:3n3 Δ7,10,13
. Data points are means of three independent
experiments and error bars show SD. ............................................................................. 66
Figura 12: Growth curves and biomass production of Ankistrodesmus sp. (A and B) and
Chlamydomonas sp. (C and D). Data points are means of three independent experiments
and error bars show SD. ................................................................................................. 76
Figura 13: Esters profile of most representative FAMEs produced by Ankistrodesmus sp
(A) and Chlamydomonas sp (B) after 10 days of cultivation. * There was not identified
the position of the double bond, ** correspond to 16:3n-3 Δ4,7,10
and *** 16:3n-3
Δ7,10,13. Data points are means of three independent experiments and error bars show
SD. .................................................................................................................................. 84
xiii
xiii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Respostas de algumas microalgas às concentrações de nitrogênio, fósforo e
carbono disponíveis no meio de cultura. ........................................................................ 13
Tabela 2: Concentrações de nitrato, fosfato e cloreto de sódio utilizadas no
planejamento fatorial 23, nas repetições do ponto central e no controle (meio ASM-1).22
Tabela 3: Matriz das experiências do planejamento fatorial 23 para otimização das
concentrações de nitrato, fosfato e cloreto de sódio visando o aumento do rendimento
lipídico das microalgas testadas. .................................................................................... 23
Tabela 4: Composition of neutral and polar lipids of Isochrysis galbana, Phaeodactylum
tricornutum and Porphyridium cruentum under continuous cultivation in tubular
photobioreactor. Adapted from Cartens et al. 1996, Giménez et al. 1998 and Molina
Grima et al. 2003. ........................................................................................................... 42
Tabela 5: Fatty acids methyl esters (FAMEs) of soybean (Glycine max), cotton
(Gossypium hirsutum) and microalgae. Adapted from Ma & Hanna 1999, Yoo et al.
2010 and La Russa et al. 2012. ....................................................................................... 42
Table 6: Lipid content of microalgae. Adapted from Becker, 1994; Chisti 2008a; Yoo
et al. 2010; Miranda, 2011 and Pereira et al. 2012. ........................................................ 43
Tabela 7: Comparison of properties between diesel with microalgae biodiesel and with
the standard of the American Society for Testing and Materials (ATSM). Adapted from
Miao & Wu 2006. ........................................................................................................... 45
Tabela 8: Variables and factor levels of the simple factorial design. ............................. 54
Tabela 9: Matrix of the experimental design with experimental values for biomass
productivity, lipid productivity and lipid yield (% of biomass dry weight) on the 10th
day of cultivation at stationary phase of growth............................................................. 57
xiv
xiv
Tabela 10: Effect of culture conditions on number of cells, specific growth rate, dry
weight of biomass, pH and chlorophyll at 10th
day cultivation. The values are means of
three independent experiments ± SD. ............................................................................. 79
Tabela 11: Lipid crude extract, Lipid content (% of biomass dry weight), total FAMEs
and percentage of saturated, monounsaturated and polyunsaturated fatty acids regarding
to the FAMEs content at 10th
day cultivation. The values are means of three independent
experiments ± SD. .......................................................................................................... 81
1
1 Introdução
O termo microalga é uma designação genérica dada a um grupo de organismos
extremamente diversificado, que desempenha funções importantes nos ambientes em
que ocorrem e variam sazonalmente sua distribuição na medida em que as condições
físicas e químicas da água mudam (Guschina & Harwood, 2006). As microalgas são
consideradas fundamentais para a manutenção da vida na Terra, uma vez que
contribuem com a produção do O2 da atmosfera (Bold, 1942; Bolton, 2006). Elas
também despertam o interesse por aplicações biotecológicas em diversos grupos de
pesquisa, devido à sua ampla versatilidade metabólica e também por sua importância
nutricional, econômica e ecológica (Reynolds, 2006; Schenk et al. 2008; Sun et al.
2014).
As principais aplicações biotecnológicas das microalgas incluem a utilização dos
pigmentos carotenóides na aquicultura de moluscos, crustáceos e peixes, bem como na
produção de suplementos para alimentação humana (Ben-Amotz 1995; WU et al. 2001;
Benemann 2008; Chisti 2008; Schenk et al. 2008). Mas além da produção de pigmentos,
outras aplicações também podem ser conferidas a esses organismos: (i) o uso direto da
biomassa no pré-tratamento de águas residuais (Larsdotter, 2006); (ii) a extração de
proteínas, vitaminas, ácidos graxos poliinsaturados e outros compostos, relacionados a
alguma atividade benéfica para sistemas biológicos (Buono et al. 2014); (iii) a utilização
da biomassa residual na fertilização de solos agrícolas (Šingliar et al. 2013). Contudo,
dada à complexidade dos elementos envolvidos em um sistema de cultivo em larga
escala, a produção em escala comercial destes compostos é restrita a poucos gêneros de
microalgas.
2
Nos últimos 30 anos indústrias de biotecnologia de microalgas do Japão, Estados
Unidos, México, Itália, Israel, França, Canadá, Austrália e Índia têm aprimorado
técnicas para produção e utilização de produtos a partir de microalgas e desenvolvido
novas técnologias de valorização da biomassa desses organismos (Borowitzka &
Borowitzka 1988; Ben-Amotz et al. 1989; WU et al. 2000; Chisti 2007). No Brasil os
cultivos de microalgas para fins comerciais, em sua maioria, restringem-se à produção
de insumos para aquicultura, contudo, o setor de bioenergia vive uma expectativa pela
consolidação das microalgas como fonte viável de biomassa para a produção de
biodiesel.
O biodiesel é um biocombustível formado por uma mistura de ésteres metílicos ou
etílicos de ácidos graxos, produzida pela reação de um óleo ou gordura com um álcool,
na presença de um catalisador (Marchetti et al., 2007). Os triacilgliceróis de cadeia
longa, com 14 a 18 carbonos, são os principais ácidos graxos utilizados para a produção
de biodiesel por serem facilmente transesterificáveis (Huang et al. 2009). As microalgas
possuem um excelente potencial de produção de triacilgliceróis, pois estes constituem a
principal forma de armazenamento de energia metabólica nestes organismos.
Dependendo da espécie, do tempo e das condições de cultivo, é possível alcançar um
rendimento de 80% em triacilgliceróis do total de lipídeos extraídos da biomassa (Meng
et al. 2008).
De modo geral, a biomassa de microalgas é constituída de 10 a 20% de lipídeos,
20 a 30% de carboidratos e 40 a 60% de proteínas, além de em quantidades menores,
ácidos nucleicos e pigmentos (Spolaore et al. 2006; Su et al. 2014). A composição
lipídica varia dependendo das condições físico-químicas do cultivo e do estado
fisiológico das microalgas (Veraart et al. 2008). Quando cultivadas em condições
3
ótimas de crescimento, as microalgas produzem predominantemente ácidos graxos
livres, glicolipídeos e fosfolipídeos. Quando submetidas às condições de estresse
fisiológico intensificam a produção de lipídeos com ácidos graxos em sua composição,
principalmente triacilglicerol (TAG), monoacilglicerol, diacilglicerol e esteróis, que
juntos, chegam a constituir até 80% da massa seca total de lipídeos (Huerlimann et al.
2010; Renaud et al. 2002). Estudos realizados em ambientes naturais verificaram que
ácidos graxos saturados, como por exemplo, C14:0 (ácido mirístico), C16:0 (ácido
plamítico) e C18:0 (ácido esteárico) são componentes majoritários do conjunto de
ácidos graxos da maioria das classes de microalgas. Por outro lado, a composição dos os
ácidos graxos instaurados apresentam especificidades por existirem rotas alternativas na
produção não compartilhadas entre determinadas classes de microalgas, estas variações
são reflexos dos processos de adaptação das microalgas ao ambiente (Sushchik et al.
2010; Lang et al. 2011; Sun et al. 2014).
A produção e o consumo de biodiesel no Brasil tem aumentado progressivamente
desde que a Lei 11.097, de 13 de janeiro de 2005, estabeleceu a obrigatoriedade da
adição de biodiesel ao óleo diesel comercializado em qualquer parte do território
nacional. A diversificação das fontes ricas em lipídeos para conversão em biodiesel é
fundamental para se alcançar as metas governamentais de substituição do diesel
mineral. Contudo, um dos desafios impostos para a comercialização do biodiesel
produzido a partir de microalgas é a sua viabilidade econômica. Portanto, estudos
ecofisiológicos que visem à otimização das condições de cultivo de linhagens isoladas
de corpos d’água brasileiros e potencialmente promissoras para a produção de biodiesel
são bastante recomendáveis.
4
1.1 Fatores que afetam o crescimento e o metabolismo de microalgas
1.1.1 Luz
Dentre os fatores ambientais que impactam o crescimento e a produtividade
lipídica de microalgas, a luz (bem como sua qualidade e fotoperíodo) está entre os
fatores primários que se destacam pela sua importância (Wahidin et al. 2013). A luz é a
fonte de energia básica da fotossíntese e essencial para a produtividade de culturas
fotoautotróficas. Na natureza, a intensidade luminosa frequentemente está bem acima da
saturação e pode ser suficiente para inibir o crescimento durante grande parte do dia.
As microalgas absorvem energia luminosa através dos pigmentos, em
comprimentos de onda entre 400 e 700nm. Os limites de tolerância à luz variam
extensamente entre as espécies de microalgas e também conforme a seu habitat de
origem. As intensidades de saturação e inibição também dependem da adequação de
outros fatores do ambiente, incluindo temperatura, concentração de CO2 e de nutrientes
(Jacob-Lopes et al. 2009; Passarge et al. 2006). A concentração de clorofila a e de
carotenoides é um importante indicador do estado fisiológico de microalgas mantidas
em cultivo. Normalmente em condições adequadas de crescimento as culturas
inicialmente apresentam uma redução na concentração de clorofila em função da
disponibilidade de luz para as células, seguido por um aumento desta concentração em
função do auto-sombreamento decorrente do crescimento celular (Bolton 2006).
Estudos sobre a influência da luz nos níveis de síntese de carotenoides e de
ácidos graxos de Dunaliella salina reportam um aumento expressivo da produção de β-
caroteno e do acúmulo de C16:0 e C18:1, após o aumento da intensidade luminosa
(Ben-Amotz et al. 1989). Para Hematoccocus pluvialis, o aumento do conteúdo de
astaxantina é positivamente correlacionado ao aumento da intensidade luminosa dos
5
cultivos (Giannelli et al. 2015). Por outro lado, altas intensidades luminosas podem ser
estressantes para as microalgas. Quando a taxa fotossintética se estabiliza, o excesso de
luz pode provocar a fotoinibição das culturas, levando a danos que resultem na redução
do crescimento celular e da produção de metabólitos, ou até mesmo, na morte celular
(Samuelsson et al. 1987).
Em culturas muito densas, a irradiância da superfície da cultura diminui
rapidamente em direção as partes mais profundas da cultura. Entre as várias estratégias
que podem ser aplicadas para lidar com a flutuação da irradiância durante o cultivo, a
agitação das culturas por aeração do cultivo é a mais utilizada. Movimentando as células
de regiões com baixa iluminação para regiões de alta iluminação e permitindo que as
células sejam expostas a um padrão luz/ escuro alternado. Contudo, um aspecto que não
pode ser ignorado é que a agitação por aeração da cultura não pode ser aplicada a todas
as culturas, devido à sensibilidade da parede celular ao cisalhamento de muitas espécies
de microalgas (Richmond, 2013; ZHU et al. 2013).
1.1.2 Temperatura
A temperatura é outro fator limitante para as microalgas. No ambiente, a
temperatura afeta principalmente a distribuição das espécies. Em cultivos, a temperatura
impacta os mecanismos bioquímicos e biofísicos das células, levando determinadas
espécies a prosperarem em condições incompatíveis com a sobrevivência de outras
(Sarmento, 2012). A adaptação de microalgas a uma extensa faixa de temperatura é
uma característica particularmente interessante para a manutenção de cultivos, uma vez
que, em ambientes abertos, a temperatura tende a variar amplamente ao longo do dia.
No Brasil, as regiões com maiores potenciais econômicos e de sustentabilidade
ambiental (norte e nordeste) são caracterizadas por temperaturas predominantemente
6
elevadas ao longo de todo o ano. Com exceções de espécies adaptadas ao frio e de
espécies termofílicas, a grande maioria das microalgas atinge maiores taxas de
crescimento específico em temperaturas de 25 a 35 °C (Reynolds, 2006).
A temperatura também afeta a produção de lipídeos e a composição dos ácidos
graxos de microalgas. De modo geral, maiores acúmulos de ácidos graxos saturados são
verificados em baixas temperaturas (17 e 18 °C) (Guschina & Harwood 2006b). Para
algumas espécies de ambientes extremamente frios, tende-se a verificar um aumento do
número de ramificações n-3 e n-6 (ômega 3 e 6, respectivamente) no conteúdo de ácidos
graxos poliinsaturados (Léveillé et al. 1997). Tais variações são entendidas como um
processo de adaptação comum primariamente relacionado ao papel destes ácidos graxos
na fluidez de membranas celulares (Thompson, 1996).
1.1.3 Carbono inorgânico
Além da luz e da água, a disponibilidade do carbono inorgânico é necessário,
para que a fotossíntese ocorra. Em sistemas aquáticos as concentrações de CO2
dissolvidos são controlados por fatores que incluem troca atmosférica, decomposição da
matéria-orgânica, fotossíntese, respiração dos organismos e pH do meio . As principais
formas de carbono inorgânico solúveis no meio aquático incluem CO2, HCO3-, H2CO3
e CO3-2
. Geralmente, em pH abaixo de 5,0 o conteúdo de carbono inorgânico está
presente na forma de CO2, HCO3
- em pH entre 7,0 e 9,0 e CO3
-2 em
pH acima de 9. Em
temperatura acima de 25°C, o conteúdo de ácido carbônico pode ser ignorado devido à
sua rápida deprotonação (Fan et al. 2008).
A baixa pressão parcial relativa de CO2 no ar, entre 0,03 e 0,04%, pode limitar a
taxa de fotossíntese das microalgas, como deixa evidente o aumento do crescimento
celular em resposta à suplementação de 5% de CO2 em cultivos ( Tsuzuki et al. 1990;
7
Klinthong et al. 2015). As microalgas demonstram alta eficiência fotossintética devido à
existência de mecanismos de concentração de carbono, constituídos pelo transporte ativo
de carbono inorgânico e pela presença da enzima anidrase carbônica, que catalisa a
conversão do íon bicarbonato à CO2 livre, na região periplasmática quando o CO2 é
limitado. Através desses mecanismos o CO2 consegue facilmente atravessar a membrana
celular orientado pelo gradiente de força de densidade aumentando a assimilação do
carbono inorgânico pelas células (Raven et al. 2008). Altas concentrações de CO2
podem ser prejudiciais à fotossíntese e ao crescimento celular de algumas espécies da
mesma maneira que uma oferta limitada de CO2 pode restringir a fotossíntese e o
crescimento da maioria das espécies fotoautotróficas (Yoo et al. 2010; Gardner et al.
2011).
1.1.4 pH
O pH é um importante fator para o crescimento de microalgas por interferir na
solubilidade do dióxido de carbono e de minerais no meio de cultura.
Consequentemente o pH também influencia o metabolismo das microalgas, sendo
estreita a faixa de pH ótimo para cada espécie de microalga ( Reynolds, 2006). O pH
depende da composição e capacidade tamponante do meio, da quantidade de dióxido de
carbono (CO2) dissolvido, da temperatura (que determina a solubilidade do CO2) e da
atividade metabólica das células (Blanchemain et al.1994).
A grande maioria de microalgas são cultivadas na faixa de pH entre 7,0 e 9,0,
com pH ótimo na faixa de 8,2 a 8,7 e cessando seu crescimento em pH 9,5 (Bolton
2006). Contudo, é reportado que algumas espécies de microalgas crescem bem em pH
extremamente alto (entre 9,0 e 10,0) e extremamente baixo (abaixo de 4,0) (Cuaresma
et al. 2011; Berge et al. 2012). Em relação à absorção de carbono, as espécies que
8
conseguem utilizar HCO3- como fonte de carbono inorgânico quando o CO2 é limitado,
conseguem também realizar fotossíntese em pH elevado (Giordano et al. 2005).
1.1.5 Oxigênio dissolvido
A alta concentração de oxigênio dissolvido é um sinal de que uma cultura
fotoautotrófica saudável, com alta taxa de fotossíntese (Richmond 2013). Por outro
lado, uma concentração elevada de oxigênio em culturas com intensidade luminosa
elevada é indesejável porque a combinação entre oxigênio elevado e alta intensidade de
luz promove a oxidação dos produtos da fotossíntese em CO2 (fotorespiração). Uma vez
que a Rubisco possui funções carboxilase/oxigenase competitivas, uma concentração
elevada de O2 promove a atividade oxigenase da Rubisco, resultando na captação
preferencial de O2 em vez de CO2 e converte ribulose-1,5-bifosfato em ácido2-
fosfoglicérico e 2-fosfoglicolato. O efeito da fotorespiração é ainda pior em condições
de O2, luz e temperaturas elevadas, resultando em uma perda significativa de carbono,
refletindo na perda de produtividade de biomassa (Giordano et al. 2005; Beardall &
Giordano 2002). Os efeitos negativos de elevadas concentrações de O2 em cultivo
podem ser reduzidos mantendo elevada razão CO2:O2 e através da intensificação da
atividade dos mecanismos de concentração de carbono, a fim de promover maior
atividade carboxilase da enzima Rubisco (Fon Sing et al. 2013).
1.1.6 Salinidade
A salinidade é outro fator que influencia vários mecanismos fisiológicos e
bioquímicos associados ao crescimento de microalgas. As microalgas, de modo geral,
possuem boa tolerância ao aumento da salinidade nos cultivos e seus efeitos estão
baseados nos mecanismos de absorção de água, dirigidos osmoticamente, e na
9
concentração de solutos usados para gerar pressão osmótica (Renaud & Parry 1994).
Em condições de estresse salino as microalgas alteram seu metabolismo diminuindo o
crescimento e aumentando acúmulo de solutos e proteínas de resposta ao choque
osmótico, alterando a proporção dos ácidos graxos saturados e insaturados presentes na
membrana. Isto permite que as microalgas regulem o transporte de íons através da
membrana celular, protegendo-as das injúrias do meio circundante até que as condições
favoráveis ao crescimento sejam reestabelecidas (Takagi et al. 2006).
Fon Sing e colaboradores (2013) ao selecionarem espécies de microalgas de
ambientes hipersalinos da Austrália, para uso em cultivos abertos, encontraram
linhagens com habilidade para crescimento em salinidade de 3 a 11% NaCl (v:v)
verificando, contudo, que tanto a biomassa como a produtividade lipídica foram mais
elevadas com salinidade de 3% (NaCl). Comparativamente a água do mar possui
salinidade próxima de 3,5% em massa de sais dissolvidos cuja maior parte é cloreto de
sódio. Dunaliella salina é talvez a espécie de microalga mais halotolerante além de
outras espécies, incluindo Dunaliella tertiolecta, Chlamydomonas sp. e Tetraselmis sp.,
que também demonstraram boa resistência ao aumento da salinidade em cultivos
(Sonnekus 2010).
A tolerância a uma ampla faixa de salinidade é um dos critérios importantes para
o cultivo de microalgas em sistemas abertos, ao ar livre. Isto porque a variação da
salinidade decorre devido à extensa evaporação e/ou diluição dos cultivos causados por
altas temperaturas e chuva, respectivamente. Para compensar as perdas por evaporação,
adiciona-se água doce à cultura para manter a salinidade constante. Alternativamente,
água salina é usada levando ao aumento da salinidade ao longo do tempo (Ho, Ye, et al.
2014).
10
Estudos demonstram que as espécies de microalgas tolerantes a uma ampla gama
de salinidade são menos propensas à contaminação durante o escalonamento do cultivo
(Cohen et al. 1991). Dessa maneira, o uso de espécies com capacidade de crescimento
em água salobra ampliam o potencial econômico e da sustentabilidade ambiental desses
cultivos, especialmente em regiões áridas e semi-áridas brasileiras, não competindo com
água doce destinada para o consumo humano.
1.1.7 Nutrientes
Além de luz, temperatura e carbono, as microalgas necessitam de nutrientes
inorgânicos para produção de biomassa. Os principais nutrientes para o crescimento de
microalgas são nitrogênio, fósforo, ferro, oligoelementos e vitaminas. O nitrogênio é o
nutriente mais importante para a produção de biomassa e culturas expostas a
concentrações não limitantes de nitrogênio, respondem com o aumento do conteúdo de
proteínas nas células (Grobbelaar 2013). Em meios de cultivo sintéticos o nitrogênio
inorgânico disponível para a absorção está preferencialmente sob a forma de nitrato
(NO3-) ou na forma de íons amônio (NH4
+) (Bolton 2006). É mais comum a utilização
do nitrato, pelas implicações que a utilização do íon amônio produz no equilíbrio do pH
do meio. Porém, a capacidade de utilização de diferentes fontes de nitrogênio é
característica específica entre as espécies de microalgas.
O nitrogênio é, provavelmente, o nutriente mais estudado dentre aqueles que
podem causar efeitos no metabolismo lipídico de microalgas, sendo a privação de
nitrogênio no meio de cultura uma estratégia amplamente utilizada para aumentar o
conteúdo lipídico em culturas de microalgas (Gardner et al. 2011). Contudo, a
deficiência de nitrogênio nem sempre está diretamente ligada ao acúmulo de lipídeos.
Tetraselmis sp., por exemplo, acumula mais carboidratos em condições de limitação de
11
nitrogênio, indicando que o acúmulo de lipídeos pela limitação de nitrogênio é uma
resposta espécie específica (Huerlimann et al. 2010).
Em culturas de microalgas, a produção de lipídeos é influenciada pela razão
carbono/ nitrogênio (C/N) disponível no meio. De maneira geral, uma elevada razão
C/N favorece o acúmulo de lipídios devido à depleção de N na cultura. Por outro lado,
uma baixa razão C/N favorece uma maior proporção de ácidos graxos poliinsaturados
(Isleten-Hosoglu et al. 2012). Existem algumas hipóteses para explicar a biossíntese e o
acúmulo de lipídeos de microalgas em condições de nitrogênio reduzido. Sob a
limitação de nitrogênio, a energia derivada da fotossíntese, que normalmente é
direcionada para a produção de proteínas e subsequente crescimento celular, é em parte
desviada para a produção de compostos de reserva que não possuem nitrogênio, como
carboidratos e lipídeos (Klok et al. 2013). A conversão da glicose em lipídeos, quando o
nitrogênio é exaurido do meio, ocorre em situações com alta energia armazenada no
interior das células, em outras palavras, sob alta razão ATP/AMP (adenosina trifosfato e
adenosina monofosfato, respectivamente) intracelular.
O acúmulo de lipídeos pela redução de nitrogênio, além de estar relacionado
com níveis mais elevados de enzimas de síntese de lipídeos, também pode estar
relacionado com a diminuição nos níveis de enzimas associadas ao crescimento e
proliferação celular (Takagi et al. 2000). De acordo com esses mesmos autores, são
verificadas pelo menos três modificações no metabolismo das microalgas sob escassez
de nitrogênio que, por sua vez, levam ao aumento do conteúdo lipídico intracelular: (i)
diminuição da membrana tilacóide, (ii) ativação de lipases (acil-hidrolase e acil-
transferase) responsáveis pela hidrólise e síntese de ésteres a partir do glicerol e ácidos
graxo de cadeias longas, e, (iii) estimulação da hidrólise de fosfolipídeos. A
12
disponibilidade de nitrogênio também influencia o acúmulo de carotenoides em
algumas espécies de microalgas (Cuaresma et al. 2011).
O fósforo é o principal fator limitante da produtividade primária aquática,
devido à sua capacidade de se ligar facilmente a outros íons, como Ca2+
e Fe2+
, o que
resulta na sua precipitação e indisponibilização para absorção pelas microalgas
(Grobbelaar 2013). A exigência de fósforo para um crescimento ótimo varia
consideravelmente de espécie para espécie, mas de maneira geral, a maioria das
microalgas pode crescer sob baixa (˂ 10 µg L-1
) ou média ( de 10 a 30 µg L-1)
concentração de fósforo. Em meios de cultivo, o fósforo inorgânico está presente sob a
forma de ortofosfato (PO4-3
) ou de fosfatos monobásico (H2PO4-) ou dibásico (HPO4
-2)
(Bolton 2006).
Embora também sejam capazes de absorver outras frações de fosfato, a forma
preferencial para absorção pelas microalgas é o ortofosfato. A absorção do fosfato é
estimulada com a presença de luz, mas o que se observa é que as concentrações intra e
extracelular de fosfato tem fundamental importância porque a velocidade máxima de
absorção varia em função da concentração interna e externa desse elemento (Powell et
al. 2008). Os efeitos do fósforo sobre a composição química das microalgas têm sido
relatados em vários estudos (Chu et al. 2013; Oh et al. 2010; Khozin-Goldberg & Cohen
2006; Řezanka et al. 2011). Na Tabela 1 é apresentado um resumo geral das mudanças
na composição bioquímica de microalgas em resposta às concentrações de nitrogênio,
fósforo e carbono disponíveis no meio de cultura.
13
Tabela 1: Respostas de algumas microalgas às concentrações de nitrogênio, fósforo e carbono disponíveis no meio de cultura.
Fator Organismo Condições Mudanças Bioquímicas Observadas Referência
Nitrogênio
Phaeodactylum
tricornutum Limitação
Aumento da síntese de lipídeos, diminuição do conteúdo
de proteínas Morris et al. 1974
Chlorella
vulgaris
Redução em 75% Aumento da síntese de lipídeos de 2,9 para 16,4% Converti et al. 2009
Estarvação Aumento da assimilação de fósforo em 3,8 vezes e
aumento do acumulo de lipídeos de 37,7 para 54,8% Chu et al. 2013
Fósforo
Ankistrodesmus
falcatus Limitação
Diminuição do conteúdo de clorofila a e proteínas,
aumento do conteúdo de carboidratos e lipídeos Healey et al. 1979
Selenastrum
minutum Estarvação
Diminuição das taxas de respiração e de fixação de CO2 Theodorou et al. 1991
Carbono
C. reinhardtii pH acima de 9,0
Diminuição do acúmulo de carbono e alta demanda por
carbonato para manter a atividade fotossintética Moroney et al. 1985
Dunaliella salina CO2 de 2% para
10% por 7 dias
Aumento do conteúdo de ácidos graxos em 2,7 vezes Muradyan et al. 2004
14
1.2 Justificativa
Movido pelos benefícios para a saúde humana e por constituírem uma matéria-
prima atraente para a produção de biodiesel, o conhecimento das variações na
biossíntese e composição química de ácidos graxos de microalgas vem crescendo nas
últimas décadas. Contudo, sua produção em larga escala constitui um desafio pela
dificuldade de se obter culturas com alta produtividade e pelo alto custo de produção.
Muito embora a literatura apresente formas de manipulação do meio de cultura para
obtenção biomassa com elevados teores de lipídeos, a maioria destas pesquisas
contempla estudos com espécies de microalgas isoladas de ambientes temperados,
distantes das condições de luz e temperatura encontradas no Brasil. De modo que este
conhecimento necessita ser revisto e aprimorado para as linhagens nativas brasileiras.
Os cultivos cujos objetivos almejam maiores produções de biomassa e de
lipídeos, mostram-se dependentes de um grande número de variáveis, com efeitos
sinérgicos entre elas, sendo necessários estudos de otimização que considerem as
interações entre os diferentes fatores e seus impactos na fisiologia da espécie de
interesse.
1.3 Objetivo geral
O objetivo geral desse estudo foi estabelecer as concentrações de nitrato, fosfato,
cloreto de sódio e CO2 dirigidos ao acúmulo de ácidos graxos e com o menor
comprometimento do crescimento de duas microalgas nativas, Ankistrodesmus sp. e
Chlamydomonas sp. Adicionalmente, foi realizada a caracterização e a quantificação do
perfil de ésteres produzidos por essas linhagens frente às modificações da cultura
testadas, considerando que o conhecimento dos perfis lipídicos fornecem subsídios para
a seleção de linhagens cujo alvo lipídico esteja estabelecido.
15
1.3.1 Objetivos específicos
(i) Reunir informações através de revisão da literatura sobre as perspectivas e os
desafios da produção de biodiesel a partir de microalgas e as condições que aumentam o
potencial econômico e a sustentabilidade ambiental dos sistemas de produção de
microalgas.
(ii) Avaliar a utilização de uma abordagem fatorial para otimização do meio de cultura
visando estabelecer a melhor condição de crescimento e de acúmulo de lipídeos das
linhagens de microalgas estudadas.
(iii) Testar os efeitos da redução da concentração de nutrientes (nitrogênio e fósforo) e
do aumento da disponibilidade de carbono inorgânico (CO2) sob o crescimento e
acúmulo de lipídeos pelas mesmas linhagens de microalgas.
16
2 Material e métodos
2.1 Linhagens de microalgas utilizadas no estudo
Foram utilizadas duas linhagens de microalgas da classe Chlorophyceae (Round
1965,1971): Ankistrodesmus sp. (ANRF-1), Figura 1A, isolada a partir de amostras de
água bruta do rio Paraíba do Sul coletadas em 2009 no Reservatório do Funil e
Chlamydomonas sp (CHLRN-1), Figura 1B, gentilmente cedida pelo Centro de
Pesquisas e Desenvolvimento Leopoldo A. Miguez de Mello, (CENPES) no ano de
2013.
O gênero Ankistrodesmus (Corda) está entre os gêneros de microalgas da classe
Chlorophyceae que merecem atenção por ser um dos mais comuns em coletas de
fitoplâncton. Esses organismos são comumente encontrados em ambientes continentais
de clima tropical e temperado, principalmente aqueles grande disponibilidade de
nutrientes (Ramos et al. 2016). De maneira geral organizam-se em colônia, raramente
células solitárias, formando fascículos paralelos ou às vezes dispostos em espiral uma
célula em torno do outra. A parede celular é discreta e o cloroplasto parietal, sem
pirenóides. A reprodução ocorre por autósporos, dispostos em paralelo dentro da célula
mãe e liberados após a dissolução da parede celular (Bicudo & Menezes, 2006). No
Brasil, há registro da ocorrência de dez espécies nativas, porém não endêmicas, em oito
das doze regiões hidrográficas do país, incluindo Atlântico Leste, Amazônica,Atlântico
Nordeste oriental, Atlântico Sul, Atlântico Sudeste, Paraná, São Francisco e Tocantins-
Araguaia (Tucci et al. 2015). Representantes desse gênero apresentam grande potencial
para cultivo, devido a sua elevada taxa de crescimento em cultura. Contudo, o
conhecimento sobre o comportamento fisiológico dos representantes deste gênero de
microalgas ainda é escasso e restrito a poucos estudos (Sipaúba-Tavares & Pereira
2008; Kilham S S et al. 1997; Nascimento et al. 2013).
17
Chlamydomonas (Ehrenberg) é um gênero de microalga unicelular também da
classe Clorophyceae, sendo talvez, Chlamydomonas reinhardtii a espécie de microalga
mais estudada (Merchant et al. 2012). O gênero compreende indivíduos normalmente
monadóides, de hábito solitário e vida livre, com grande variedade de formas das quais
a elipsoide e a ovóide são as mais comuns. A parede celular é nítida e na maioria das
espécies é verificada uma papila anterior mediana. O cloroplasto é parietal, único por
célula, podendo ocorrer desde um até vários pirenoides. Os dois flagelos apresentam
tamanhos iguais entre si, são homodinâmicos e se inserem apicalmente no polo anterior
da célula, apresentam vacúolos contráteis e um estigma conspícuo, de coloração
avermelhada (Bicudo & Menezes, 2006). No Brasil há registro de vinte e sete espécies
nativas, não endêmicas, nas regiões hidrográficas do Atlântico Sudeste e do Paraná,
com ocorrência confirmada nos estados do Espírito Santo, Rio de Janeiro e São Paulo
(Tucci et al. 2015). O gênero Chlamydomonas é um importante modelo para estudos
sobre fotossíntese, motilidade, respostas à estímulos, reconhecimento celular e outros
temas de biologia celular e molecular, além de apresentar crescimento elevado e perfil
lipídico adequado para a produção de biodiesel.
Ambas as linhagens encontram-se depositadas na coleção de culturas do
Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias (LETC) localizado no
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho na Universidade Federal do Rio de Janeiro.
18
Figura 1: Micrografia óptica da microalga (A) Ankistrodesmus sp. (ANRF-1) e (B)
Chlamydomonas sp. (CHLRN-1) em aumento de 400x e após 4 dias de cultivo em meio
ASM-1.
B
A
19
2.2 Manutenção das linhagens
A manutenção das linhagens utilizadas como pré-inóculo dos experimentos foi
realizada através de repicagem periódica em meio de cultivo ASM-1 completo (Gorham
et al.,1964), contendo para cada litro de meio 0,17 g NaNO3, 0,05 g MgSO4 7 H2O, 0,04
g MgCl2 6 H2O, 0,03 g CaCl2 2H2O, 0,02 g KH2PO4, 0,03 g Na2HPO4 12 H2O, 0,003 g
H3BO3, 0,001 g MnCl2 4H2O, 0,001 g FeCl2 6H2O, 0,0002 g ZnCl, 0,00002 g CoCl2
6H2O, 0,000001 g CuCl e 0,008 g Na2 EDTA. A intensidade luminosa de manutenção
utilizada foi de 200 µmols fótons m2-1
s-1
, fotoperíodo de 12 horas, temperatura de 23
°C ± 2 °C e regime de alimentação em batelada. O meio de cultivo ASM-1 foi escolhido
por ser um meio adequado ao crescimento de microalgas, que contém 2 vezes mais
nitrato (0,17 g L-1
) e 5 vezes mais fosfato (0,05 g L-1
) do que, por exemplo, o meio WC
que contém 0,08 g L-1
NaNO3 e 0,01 g L-1
KH2PO4 (Guillard & Larentzen, 1972),
permitindo, com isso, o aumento entre os intervalos de repiques das culturas.
2.3 Parâmetros de cultivo do pré-inóculo
Foram adotados intervalos de 15 dias entre os repiques da cultura até os que
fosse alcançado volume de 500 mL e posteriormente 1000 mL, momento em que foi
inserido o aparato de aeração com ar comprimido, em um fluxo constante de 1L min-1
.
A intensidade luminosa dos cultivos foi elevada para de 200 para 1.400 µmol fótons m-2
s-1
, considerando que cultivos de microalgas são preferencialmente realizados ao ar
livre, utilizando as condições naturais de iluminação. A temperatura dos cultivos
experimentais foi mantida em 27 °C ± 1 °C e dado ao aumento do metabolismo das
linhagens, em consequência ao aumento intensidade luminosa, o intervalo de repique foi
reduzido para 10 dias até os cultivos alcançarem um volume final de 4L.
20
2.4 Parâmetros físicos e químicos
2.4.1 Luz
A iluminação artificial de cultivos é utilizada para simular intensidades
luminosas encontradas em ambientes naturais em faixas que permitam a realização da
fotossíntese. Estudos anteriores realizados pelo nosso grupo mostraram que a utilização
de altas intensidades luminosas foi uma forma eficiente de alcançar a redução do tempo
de cultivo. Neste estudo foram utilizadas lâmpadas fluorescentes e de cor branca
(lâmpada fria), sendo 10 lâmpadas de 20W, dispostas atrás dos frascos com as culturas e
6 lâmpadas de 40 W, dispostas no centro e nas extremidades laterais da área reservada
para as culturas, com fotoperíodo de 12 horas (Figura 2). A densidade de fótons
disponível para os cultivos medida no interior dos frascos de 1400 µmol fótons.m2-1
.s-1
e
a medida da densidade do fluxo de fótons foi realizada através de um sensor quântico
modelo US-SQS/L acoplado a um integrador radiométrico esférico (LiCor, Inc. USA).
2.4.2 Temperatura
Neste estudo as culturas foram mantidas em condição de temperatura ambiente
de 23 °C ± 2 °C (temperatura de manutenção do pré-inóculo) e 27 °C ± 1 °C
(temperatura experimental), ambos valores médios registrados no intervalo de 24 horas
durante 10 dias. A temperatura dos cultivos foi acompanhada através de um
termohigrômetro digital (Impac) acoplado a um sensor de contato, cujo sensor de
medição foi mantido na área externa dos cultivos (Figura 2).
21
Figura 2: Área designada ao cultivo de Ankistrodesmus sp. (ANRF-1) demonstrando a
disposição das lâmpadas e do sensor para medição da temperatura externa.
2.4.3 pH
Nesse estudo, a determinação do pH do meio e de sua variação durante os
cultivos foi realizada por meio de um medidor de pH calibrado com solução tampão de
pH 4 e 7 em temperatura ambiente. A verificação nos experimentos com suplementação
de CO2, descritos adiante no item 2.4, foi realizada em dias alternados após 5 horas do
início do fotoperíodo concomitantemente à injeção de CO2 nos cultivos.
22
2.5 Experimentos
2.5.1 Experimento Fatorial simples 23 para otimização do meio de cultivo
Um planejamento fatorial simples 23 a dois níveis (+1) e (-1) foi utilizado para
avaliar os efeitos das interações de três variáveis (NO3, PO43-
e NaCl) no acúmulo dos
lipídeos das linhagens de Ankistrodesmus sp e Chlamydomonas sp em cultivos em
batelada. Foram incluídas três repetições do ponto central, nível (0) para cada variável.
O nitrato e o fosfato foram testados nas proporções de 0 (-1), 25 (0) e 50% (+1) da
concentração original indicada para o meio ASM-1, conforme descrito na Tabela 2. O
controle dos experimentos foi realizado com meio ASM-1 repleto. No total foram
realizados 12 experimentos simultâneos para cada linhagem (Tabela 3). Os
experimentos tiveram duração de 10 dias e tanto as experiências quanto o controle
foram iniciados a partir de um inoculo com densidade celular de 5x10-5
cel.mL-1
, pH 7,
temperatura de 27 °C ± 1 °C, intensidade luminosa de 1.400µmols fótons.m2-1
.s-1
,
fotoperíodo de 12 horas e aeração constante (Figura 3).
Tabela 2: Concentrações de nitrato, fosfato e cloreto de sódio utilizadas no
planejamento fatorial 23, nas repetições do ponto central e no controle (meio ASM-1).
Variáveis Símbolos Níveis dos fatores testados
Controle (-1) (0) (+1)
NaNO3 X1 0 0,04 g L-1
0,08 g L-1
0,17 g L-1
KH2PO4 and Na2 HPO4
X2 0 0,01 g L-1
0,02 g L-1
0,05 g L-1
NaCl X3 0 5,0 g L-1
10,0 g L-1
0
23
Tabela 3: Matriz das experiências do planejamento fatorial 23 para otimização das
concentrações de nitrato, fosfato e cloreto de sódio visando o aumento do rendimento
lipídico das microalgas testadas.
Experimentos Nitrato Fosfato Cloreto de sódio
1 0 (-1) 0 (-1) 0 (-1)
2 0,08 g L-1
(+1) 0 (-1) 0 (-1)
3 0 (-1) 0,02 g L-1
(+1) 0 (-1)
4 0,08 g L-1
(+1) 0,02 g L-1
(+1) 0 (-1)
5 0 (-1) 0 (-1) 10,0 g L-1
(+1)
6 0,08 g L-1
(+1) 0 (-1) 10,0 g L-1
(+1)
7 0 (-1) 0,02 g L-1
(+1) 10,0 g L-1
(+1)
8 0,08 g L-1
(+1) 0,02 g L-1
(+1) 10,0 g L-1
(+1)
9 0,04 g L-1
(0) 0,01 g L-1
(0) 5,0 g L-1
(0)
10 0,04 g L-1
(0) 0,01 g L-1
(0) 5,0 g L-1
(0)
11 0,04 g L-1
(0) 0,01 g L-1
(0) 5,0 g L-1
(0)
Controle 0,17 g L-1
0,04 g L-1
0
Figura 3: Experimento fatorial para otimização do meio de cultivo. Da esquerda para
direita experimentos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e controle da linhagem ANRF-1.
Os limites das variáveis foram escolhidos com base em revisão da literatura em
que também foi considerada a viabilidade operacional dos experimentos. Os
24
experimentos foram analisados através do modelo matemático proposto por
Montgomery (2008):
y=b0+(b1x1)+(b2x2)+(b3x3)+(b12x1x2)+(b13x1x3)+(b23x2x3)+(b123x1x2x3)+(b11x1x1)+(b22x2
x2)+(b33x3x3)
Onde: y= resposta de interesse; b0= intercepção do modelo; b1, b2 e b3, b12,b13, b23, b123,
b11, b22 e b33 são os coeficientes de regressão obtidos por regressão linear. As respostas
de interesse desse estudo foram a produção de biomassa (mg L-1
) e o rendimento
lipídico (mg L-1
).
2.5.2 Experimentos com suplementação de CO2
Neste estudo também foi avaliado o efeito do aumento da concentração de CO2
sobre o crescimento e a produção de lipídeos das linhagens ANRF-1 e CHLRN-1. Os
cultivos foram realizados com meio N-P reduzido, que continha 0,04 g L-1
de NaNO3;
0,01 g L-1
de KH2PO4 e Na2HPO4; 5,0 g L-1
NaCl e demais micronutrientes nas
concentrações originais do meio ASM-1. Foram repetidas as mesmas condições de luz,
fotoperíodo, pH e temperatura, bem como a duração dos cultivos conforme descrito nos
experimentos do item 2.2.2. Além do CO2 proveniente do ar atmosférico, em torno de
0,04%, os cultivos receberam suplementação de CO2 em uma proporção equivalente a
5,0% do volume do ar injetado utilizando um aparelho para mistura de gases (Figura 4).
A suplementação foi adicionada diariamente, em um fluxo contínuo de 0,5 L min
-1,
durante 8 horas seguidas e a partir da terceira hora do início do fotoperíodo. O
controle dos experimentos com meio otimizado foi realizado com meio ASM-1 repleto
sem cloreto de sódio. O controle da suplementação de CO2 foi realizado através dos
experimentos com meio otimizado e dos experimentos com meio ASM-1 repleto, sem a
adição de CO2. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
25
Figura 4: Misturador de gases para misturas de dióxido de carbono e ar utilizados nos
experimentos com adição de 5% de CO2.
2.6 Parâmetros fisiológicos
2.6.1 Avaliação do crescimento celular das linhagens
O crescimento celular das linhagens ANRF-1 e CHLRN-1 foi acompanhado
através da contagem do número de células utilizando-se o contador automático Casy
Counter, calibrado para determinação somente de células viáveis presentes na amostra.
As análises foram realizadas nos experimentos com e sem adição de CO2, descritos no
item 2.4, nos tempos amostrais t0, t2, t4, t6, t8 e t10.
2.6.2 Determinação do peso seco da biomassa das microalgas
A biomassa foi estimada por gravimetria da massa seca, de forma que alíquotas
de 20 a 30 mL dos cultivos foram filtradas em membrana de fibra de vidro com
26
diâmetro de 47mm (Sartorius Glasfiber Prefilter 13400-47-Q), conforme apresentado na
Figura 5. Em seguida os filtros foram mantidos em estufa a 60 °C até atingirem peso
constante. Foi determinada a massa de cada membrana antes filtragem das amostras e
após filtração das amostras. Para o calculo de produção da biomassa em mg L-1
,
utilizou-se a seguinte equação:
Biom= Pf - Pi x1000 / V
Onde: Biom= biomassa seca mg L-1
, Pf = massa do filtro com amostra, Pi =massa inicial
do filtro, 1000= equivalente ao volume de 1L do cultivo em mL e V= volume filtrado da
amostra em mL.
Figura 5: Membranas com concentrado de Ankistrodesmus sp (ANRF-1) para
determinação da biomassa seca.
2.6.3 Concentração de clorofila a
O estado fisiológico das linhagens foi acompanhado in vivo através da medida
da concentração de clorofila-a, utilizando um fluorímetro PHYTO-PAM com detector
de emissão PHYTO ED (Schreiber et al. 1998). O instrumento foi calibrado com
27
amostras de ANRF-1 e CHLRN-1 cultivadas em meio ASM-1 repleto nas condições de
manutenção descritas no item 2.1. As análises foram realizadas nos experimentos com e
sem adição de CO2, descritos no item 2.4, nos tempos amostrais T0, T2, T4, T6, T8 e
T10.
2.6.4 Determinação do rendimento lipídico da biomassa produzida
A extração dos lipídeos totais foi realizada pelo método Bligh & Dyer (Bligh &
Dyer, 1969), adaptado. Volumes de 80mL retirados de cada cultivo , contendo de 13 a
40 mg de biomassa (conforme o tempo do cultivo), foram concentrados por
centrigufação a 2,800 x g por 10 minutos e ressuspenso em água ultra pura (2x) para
remoção dos sais restantes do meio de cultivo. A biomassa úmida foi congelada,
liofilizada e armazenada em -20°C até o seu uso. Nas amostras de biomassa seca (de 20
a 90mg) foram adicionados 0.8mL de água destilada, as amostras foram sonicadas
durante 10 min em seguida 1mL de clorofórmio e 2mL de metanol foram adicionados e
homogeneizados até formação de uma única fase. Para a extração dos lipídeos a
mistura permaneceu em agitação em agitador orbital por 2 horas e em seguida foi
centrifugada a 2,800 x g durante 15 minutos para separação das fases (orgânica e
lipídica). O sobrenadante foi retirado com pipeta Pasteur e reservado, em seguida o
pellet foi ressuspenso novamente em 1mL de clorofórmio, 2mL de metanol e 0.8mL de
água destilada e homogeneizada até formação de uma única fase. A segunda extração
também teve duração de 2 horas sob agitação em agitador orbital. Novamente a mistura
foi centrifugada a 2,800 x g durante 15 minutos para separação das fases e em seguida o
sobrenadante contendo o extrato lipídico foi retirado e acrescentado ao anterior. A
evaporação dos solventes contidos no extrato lipídico foi realizada com nitrogênio
28
gasoso e a massa do extrato foi determinada por análise gravimétrica do peso seco. Para
o cálculo da massa do extrato lipídico em mg L-1 utilizou-se a seguinte equação:
EBL = PL x 1000 / V
Onde: EBL= Massa do extrato lipídico em mg L-1
, 1000 = equivalente ao volume de 1L
do cultivo em mL e V = volume da amostra utilizada na extração.
2.6.5 Quantificação dos ésteres metílicos de ácidos graxos
Os procedimentos descritos a seguir foram realizados em colaboração com o
Laboratório de Bioquímica de Lipídeos do Instituto de Bioquímica Médica da UFRJ.
Os ésteres contidos no extrato lipídico foram obtidos através de adaptações ao método
descrito por Christie (1989). Amostras de extrato lipídico contendo até 15mg foram
dissolvidas em 1mL de tolueno e 2mL de ácido sulfúrico 1% em metanol. A mistura foi
homogeneizada e deixada em banho a 50°C durante uma noite. Posteriormente foi
adicionado 1 mL de cloreto de sódio 5% em água destilada e em seguida novamente
homogeneizada. Foram adicionados 2mL de hexano para extração dos ésteres. A
mistura foi homogeneizada e centrifugada a 3000rpm durante 10 minutos para
separação das fases. A fração contendo os ésteres metílicos (inferior) foi retirada com
pipeta Pasteur e reservada. Uma segunda extração com 2mL de hexano realizada. Os
solventes foram removidos por evaporação com nitrogênio gasoso e os ésteres metílicos
permaneceram armazenados a -20°C até o momento da análise, quando foram
ressuspendidas em 50µL de hexano.
Para análise dos ésteres foi utilizado um CG-MS Shimadzu (GP2010 Plus)
equipado com uma coluna Agilent (HP Ultra 2), com fase estacionária de 5% fenil
metilpolisiloxano, comprimento de 25m, diâmetro interno de 0,20mm e 0,33µm de
29
espessura de filme. O injetor foi mantido a 250°C, com divisão de fluxo split, na razão
de 1:1. A temperatura do forno da coluna foi elevada a 40-160°C, com taxa de
aquecimento de 30°C/min; de 160-233°C, com taxa de aquecimento de 1°C/min e de
233-300°C, com taxa de aquecimento de 30°C/min, mantida nessa temperatura por 10
minutos. O gás de arraste utilizado foi o hélio, com velocidade linear de 36.1cm/seg.
Para detecção por espectrometria de massas foi utilizado detector contendo fonte de
ionização por elétrons (EI-70 eV) e analisador de massas quadrupolo operando em
varreduras de 50 a 650 unidades de massa atômica (u.m.a.). A interface foi mantida a
240°C e a fonte de íons a 240°C. A identificação dos constituintes da mistura foi feita
por comparação dos tempos de retenção e padrões de fragmentação das amostras aos
padrões de referência (Supelco 37 Component FAME Mix, Sigma Aldrich). O ácido
graxo C19:0 (nonadecaenóico)foi utilizado como padrão interno.
2.7 Análise estatística dos resultados
2.7.1 Metodologia de superfície de resposta
A determinação da região ótima de trabalho foi obtida através da metodologia de
superfície de resposta introduzida em 1951 por Box & Wilson. Embora a maioria das
publicações envolvendo MSR tenha sido observada na indústria química e alimentícia,
o interesse em MSR se espalhou para as áreas biológicas, biomédicas e farmacêuticas
(Rambali et al.2001). O método empregado neste trabalho para a construção das
superfícies de resposta, a partir do modelo matemático adotado, consistiu em fixar uma
das variáveis (concentração de cloreto de sódio) em diferentes níveis (-1), (0) e (+1) e
atribuir incrementos de 0,1 as demais variáveis (concentrações de nitrato e fosfato)
varrendo-se a faixa (-1) a (+1) (Myers et al. 2009). Assumindo a concentração de
cloreto de sódio como fator fixo, as superfícies de resposta foram representadas por um
30
gráfico tridimensional, onde as concentrações de nitrato e fosfato corresponderam,
respectivamente, aos eixos y e x. O eixo z correspondeu ao resultado obtido (biomassa e
rendimento lipídico em mg L-1
) através da previsão do modelo. As respostas foram
representadas por um plano e projetadas em um gráfico bidimensional utilizando o
software Sigma Plot ® versão 12.5.
2.7.2 Função de Derringer
A inspeção visual de um gráfico de superfície pode não ser o suficiente para
determinar as condições ótimas de produção, principalmente quando mais de uma
resposta é avaliada (Divjak et al.1998; Aguiar et al.1997). A função de Derringer é uma
metodologia de decisão multicritério que consiste na atribuição de um número a uma
qualidade (resposta) matematicamente, e, portanto, numericamente é possível escolher a
resposta mais satisfatória. Esta transformação é realizada através da determinação de
uma escala adimensional, de forma que a pior resposta ou a resposta não desejável é
definida na escala como d=0, e para a melhor resposta ou a resposta desejável d=1.
Neste estudo foram admitidos como valores não desejáveis os resultados de biomassa e
lipídeos (avaliados simultaneamente) que estiveram abaixo da metade dos valores
obtidos no experimento controle de cada linhagem. Valores iguais ou superiores aos
resultados obtidos nos experimentos controle foram admitidos como desejáveis.
O cálculo dessa transformação foi realizado através do sistema de equações:
di = 0, para y <= ymin
di = 1, para y >= ymax
di = [(y - ymin) / (ymax - ymin)]
31
Onde di= valores individuais obtidos a partir do sistema de equações para cada
critério utilizado (biomassa e rendimento lipídico em mg.L-1
); ymin= valor a partir do
qual a resposta não é desejada (179,2 mg L-1
e 32,4 mg L-1
para ANRF-1; 440,0 mg L-1
e 48,0 mg L-1
, para CHLRN-1); ymax= valor a partir do qual a resposta é desejada (358,4
mg L-1
e 64,8 mg L-1
para ANRF-1; 880,0 mg L-1
e 170,0 mg L-1
para CHLRN-1) e D=
ao valor global, obtido a partir da média geométrica dos valores individuais.
2.7.3 Analise da variância (ANOVA)
As diferenças nos valores médios obtidos entre os tratamentos e o controle dos
experimentos foram medidas através da análise da variância e a significância das
diferenças foi definida por comparação das médias aplicando-se o Teste de Tukey.
Ambos os testes foram realizados através do software Sigma Plot ® versão 12.5.
32
3 Resultados
3.1 Microalgae Lipid and Biodiesel Production: A Brazilian Challenge
Miranda, C.T., Pinto, R.F., de Lima, D.V.N., Viegas, C.V., da Costa, S.M. and
Azevedo, S.M.F.O. (2015). American Journal of Plant Sciences, 6, 2522-2533.
http://dx.doi.org/10.4236/ajps.2015.615254
Abstract
Global increases in atmospheric CO2 and climate change are drawing
considerable attention to identifying sources of energy with lower environmental impact
than those currently in use. Biodiesel production from microalgae lipids can, in the
future, occupy a prominent place in energy generation because they represent a
sustainable alternative to petroleum-based fuels. Several species of microalgae produce
large amounts of lipids per biomass unit. Triacylglycerol is the fatty acid used for
biodiesel production and the main source of energy reserves in microalgae. A review of
the current literature indicates that nutrient limitations could lead to triacylglycerol
accumulation in different species of microalgae. This revision focused in the
biotechnological potential and viability of biodiesel production from microalgae in
Brazil. Further efforts in microalgae screening for biodiesel production are needed to
discover a native microalgae that would be feasible for biodiesel production in terms of
biomass productivity and oil. Brazil is located in a tropical region with high light rates
and adequate average temperatures for the growth of microalgae. The wide availability
of bodies of water would allow the country to produce renewable energy from
microalgae.
Keywords: Biodiesel, microalgae, lipids, cultivation
33
3.1.1 Introduction
The use of renewable energy sources and reduction of environmental impacts is
the main theme of the global public policy for reducing the effects of greenhouse gas
emissions on global climate change (Schenk et al. 2008). In 2013, the emissions
associated with the Brazilian energetic matrix exceeded 400 million tons of carbon
dioxide released into the atmosphere, most of which was generated by the transport
sector. The Brazilian annual emission per capita for producing and consuming energy
was estimated to be 2.3 tons, which is 8 times less than the American and 3 times less
than the European or Chinese emissions per capita. Despite the fact that 41% of the
internal Brazilian energy supply originated from renewable sources, in transportation
sectors only 16.5% of fuel sources have renewable origin. The main biofuels used are
ethylic alcohol (14.3%) from sugar cane; and biodiesel (2.4%) from vegetable oils, fatty
materials such as chicken fat, pork fat and used frying oil (EPE, 2014). Projections
made by federal institutions and energy companies, indicate continuous increase in fuel
consumption by the transportation sector, in this sense, biofuels play an important role
in the future of clean energy generation and environmental security (Kan et al. 2009;
Pant et al. 2010).
Following the worldwide movement, Brazil turned its attention to biodiesel
research in the late 1990s. The initial goal was to introduce biodiesel into the Brazilian
energy matrix, with a focus on social inclusion and regional development. However, it
was the diffusion of the National Program for Production and Use of Biodiesel (PNPB)
and definition of a legal and regulatory framework for biodiesel production, distribution
and investment resources that made significant progress in the use of biodiesel. In 2005,
the addition of 2% biodiesel in diesel oil was mandated, which was successfully
extended to 5% by the National Energy Policy Council (CNPE) in 2010, anticipating
34
the three-year goal set by Law No. 11.097 on January 13, 2005. To suit these targets,
there was an increase in biodiesel production in the country. In 2005, production was
approximately 4.6 million petroleum barrel equivalent (BEP), while in 2014, driven by
the increase in the diesel oil mix, production reached 19.4 million BEP, which is 4.2
times more than in 2005. Brazil currently imports a more expensive diesel than the
biodiesel produced internally because the expectation for the coming years is for the
biodiesel content in diesel oil to increase to 40% (EPE, 2014).
As of 2013, there are 65 authorized plants located in 16 Brazilian states with a
nominal capacity for biodiesel production of 7.1 million m3/year. The highest
concentration of these biodiesel plants is in the states of Mato Grosso (31%), Rio
Grande do Sul (11.5%) and Goiás (9.8%) (EPE, 2014). The raw materials for biodiesel
production in Brazil are diverse, such as palm in the north; soybeans, sunflower and
peanuts in the South, Southeast and Midwest; and castor beans, which are considered
the best option in the northeast but have not shown significant results in other regions.
Soybean has been prominent in the commercial production of biodiesel in Brazil, and
the second most common raw material is bovine fat, which accounts for approximately
10%. Even the cultivation of oilseeds is a true alternative for biofuel production, and
some relevant aspects need to be considered, including the competition for land that
could be used for food production, increased market prices of derived products, growing
and harvesting crop-based regimes, among others. Therefore, research on biodiesel
production has highlighted the use of additional renewable sources such as microalgae.
These microorganisms are promising raw materials in the production of third-generation
fuels, especially if they are associated with the use of other high-value compounds
produced by microalgae (Chisti et al. 2008b; Harun et al. 2010; Greenwell et al. 2010;
Rajendran et al. 2015).
35
In the last decade, Brazil multiplied government and private initiatives related to
researches in microalgae biodiesel, increasing the number of researches and scientific
publications in the area. Advances are being obtained in order to optimize the resources
and transpose laboratory scale to production scale. In 2010 it was created Microalgae
Network, which involves 10 Brazilian institutions of the south, southeast, north and
northeast of the country. Currently some pilot plants for algae cultivation in higher scale
are found in the states of Santa Catarina, Rio de Janeiro, Pernambuco and Natal.
This work aims to present some fundamental aspects of microalgae screening,
cultivation, lipid improvement, oil extraction and conversion related to advances and
challenges in the generation of microalgae biodiesel in Brazil.
3.1.2 Biotechnological potential of microalgae
Microalgae is a generic term for organisms, mostly photosynthetic and
predominantly aquatic, that are distributed in the water column guided by spatial and
seasonal gradients according physical, chemical and biological parameters. The main
taxonomic divisions are Cyanophyta, Chlorophyta, Charophyta, Euglenophyta,
Heterokontophyta, Cryptophyta, Dinophyta and Prymnesiophyta. It is estimated that
there are approximately 26000 species of microalgae in the environment, of which only
a few have been identified for successful commercial application (Guschina & Harwood
2006a; Bicudo & Menezes 2006). Within the US Department of Energy’s Aquatic
Species Program (ASP) to develop microalgae as a source of biodiesel, more than 3000
strains of microalgae from ponds and oceans have been isolated. In the Brazilian
territory, representatives of all classes of algae have been identified in inland waters,
soil and/or sub aerial environments, particularly from the Chlorophyta class s (Parmar et
al. 2011).
36
Chlorophyta is a division of green algae that includes approximately 500 genera
and 8000 species and is preferably found in environments with a great availability of
nutrients (Becker, 2004). The main representatives belong to the Chlorococcales and
Volvocales orders and have wide morphological variety, including unicellular, colonial
and filamentous forms. The photosynthetic pigments are chlorophyll a and b;
xanthophylls; lutein and prasinoxantin; and carotenoids α, β, and γ, which can be
synthesized and accumulated outside of the chloroplast under conditions of nitrogen
limitation or other cellular stress (Wiltshire et al. 2000; Work et al. 2012).
Microalgae are recognized by their photosynthetic efficiency, high growth rates
and proportionally high level of lipids. The commercial exploitation of these organisms
began in the 1960s in Japan, when strains of Chlorella were used to produce high
concentrations of polysaccharides and value-added fatty acids. In the last 30 years,
industries in Japan, the United States, Mexico, Italy, Israel, France, Canada, Australia
and India have enhanced techniques, such as combustion, gasification, pyrolysis,
fermentation and oil extraction, from microalgae biomass. The use of pigments in
aquaculture, animal feed and supplements for human consumption are widely reported.
Recently, the bioenergy industry has experienced an expectation by the consolidation of
the use of microalgae as a viable biomass source for methane, biodiesel and bio-
hydrogen production. The commercial production of microalgae for these uses shows
the potential of microalgae use as a feedstock for high value-added products. Indeed, for
biofuel production, microalgae can be cultivated in places unsuitable for food
cultivation, eliminating wasted space by making use of non-arable, nutrient-poor land
that will not support conventional agriculture(Fon Sing et al. 2013; Ben-Amotz et al.
1989; Benemann, 2000; Raposo et al. 2013).
37
3.1.3 Cultivation
Microalgae are usually cultivated at a large scale using two types of systems:
open systems (open ponds) and closed systems (photobioreactors). Open ponds are
generally shallow and constructed of concrete, fiberglass or polycarbonate; the cultures
are maintained in constant circulation with natural lighting and temperature. These
systems are suitable for crops that tolerate extreme conditions, such as high pH
(Spirulina) and high salt concentrations (Dunaliella), or those with fast growth, for
example, Chlorella, Chlamydomonas, Scenedesmus and Ankistrodesmus (Richmond,
1988; Ben-Amotz, 1995). Under optimal conditions, biomass production rates are
estimated to be 50 g m-2
day-1
and lipid production to be 12 L m-2
a-1
(Sheehan et al.
1998). Until recently, only production in open ponds was considered due to the high
cost of the most advanced bioreactors. However, open ponds are more susceptible to
contamination by indigenous species that have low lipid productivity, predators,
extreme temperatures and low light-utilization efficiency. In this sense, it is common to
use the combination of open ponds and closed bioreactors, i.e., a closed-tank bioreactor
that grows algae inside a contained environment in which ideal growing conditions can
be artificially maintained to ensure the growth of only the desired strains of microalgae
(Koller et al. 2012).
Photobioreactors could minimize contamination by other microorganisms and
have the potential for higher lipid productivity scales, compensating, in theory, for the
high associated cost. The most-used materials are plastic, glass and polycarbonate. A
vertical photobioreactor such as a thin-plate photobioreactor is cited in the literature for
the high yields reported, 24 g m-2
day-1
and lipid production of 23 Lm-2
a-1
(Ho et al.
2012). These systems reduce the light path by increasing the light availability for each
cell. They also have advantages in continuous operation mode and the control of culture
38
conditions. Therefore, the amount of nutrients, temperature, light and pH can be
adjusted to obtain higher biomass production in a shorter time. Even though closed
bioreactors solve some of the problems of open ponds, they come with their own set of
challenges, such as higher costs due to more specialized equipment and more intensive
energy needs (Jian-Ming et al. 2010; Liu et al. 2011; Rodolfi et al. 2009).
3.1.4 Light, CO2 and nutrients
Light provides energy to transfer electrons from water to NADP+, forming
NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) and generating ATP (adenosine
tri-phosphate). The light saturation point of microalgae is approximately 600 foot-
candles. Once the light energy is received by the microalgae, only a fraction of it is
assimilated in the form of biomass. It is assumed that no efficiency can exceed 32% of
the photosynthetically active radiation (PAR) available. However, even though light is
the primary substrate for the photosynthetic energy conversion, the excess of light can
reduce growth by photoinhibition or promote cell death by damaging the polypeptides
in the PSII reaction center. The light regime and photoperiod are also critical
components in determining the biomass production of culture. Optimal light/dark
regimes have been found to vary from 12:12 to 16:8 hours for most cultures (Parmar et
al. 2011; Wahidin et al. 2013).
CO2 is the one of the most important nutrients for microalgal growth, and high
concentrations of CO2 are responsible for lipid synthesis during microalgal growth. The
availability and mechanisms of the CO2 concentration are closely linked to the
photosynthetic efficiency, nutrient acquisition, assimilation, cell growth and lipid
production. CO2 concentrations up to 5% promote an increase in cell growth, but further
investigations are still required to determine the influence of higher CO2 concentrations
39
on the physiology of microalgae, with special attention to growth, biomass and lipid
production (Giordano et al. 2005; Gardner et al. 2011; Huang et al. 2010).
The nutrient availability affects the chemical composition and growth rate of the
algae. The nutritional process of microalgae is based on the uptake of dissolved
nutrients, mainly in their inorganic form. Thus, some elements are required in low
concentrations (on the order of nanograms or micrograms per liter), such as silica, iron,
manganese, molybdenum, copper, cobalt, zinc, boron and vanadium. These
micronutrients are incorporated into essential organic molecules that participate in the
primary reactions for these organisms. Other elements are required in higher
concentrations, on the order of milligrams per liter, such as carbon, hydrogen, nitrogen,
oxygen, phosphorus, potassium, sulfur and sodium. These macronutrients form
structural components of biomolecules and membranes, participate in energy processes,
and regulate metabolic activities, and their absence or insufficiency can affect vital
functions of these microorganisms. The most important nutrients are phosphorus and
nitrogen, which are only directly available for the growth of microalgae in their
dissolved form (Fogg & Thake, 1987; Dowhan, 1997; Andersen, 2005; C. S. Reynolds
2006).
Phosphorus comprises the molecules involved in vital processes such as nucleic
acids and adenosine triphosphate (ATP), enzymatic phosphorylation, dephosphorylation
modulations and composition of the phospholipids. The relatively small amount of
bioavailable phosphorus makes it a limiting element of aquatic primary productivity.
Although microalgae are capable of absorbing phosphate from different sources,
orthophosphate is preferred. The phosphorous absorption is stimulated in the presence
of light and the maximum absorption rate varies depending on the intracellular and
extracellular concentrations of this element. In phosphorus deficiency conditions,
40
microalgae can achieve higher absorption rate than cells in phosphate-saturating
conditions, absorbing 8-16 times more than the minimum cell share of phosphate and
converting the internal stock in the form of polyphosphate bodies. This mechanism
sustains 3-4 generations of growth in phosphate-depleted conditions. However, the
relationship between the reduction in phosphorus present in the medium and the
increase in lipid synthesis is not clear, but it is physiologically interesting when
considering that these organisms have compartments capable of storing phosphorous in
the form of polyphosphate bodies (Harold, 1963; Hutchinson, 1973; Yao et al. 2011).
Nitrogen is another important nutrient for cell growth. The inorganic nitrogen
source available for absorption is ammonium ions (NH4+), nitrite (NO2
-) and nitrate
(NO3-). Nitrate is the most used form in culture medium because when using ammonia
the pH could drop significantly during cell growth due to the release of H+ ions. A
nitrogen limitation promotes a decrease in the content of the thylakoid membrane, the
activation of acyl hydrolase, and the stimulation of phospholipid hydrolysis. On the
other hand, limiting the concentrations of nitrogen promotes the activation of
diacylglycerol acyltransferase, which converts acyl-CoA to triglyceride in microalgae.
This indicates that the utilization of intracellular stores of nitrogen-rich compounds
provides energy and carbon for the biosynthesis of triacylglycerols (Piorreck & Pohl,
1984; Msanne et al. 2012).
Several factors can stress microalgae. For biotechnological purposes, the
limitation of nutrients is the most studied stress condition because it leads to the
accumulation of high value compounds. When light sources and CO2 are available and
the photosynthetic mechanism is active, there is a decrease in cell division,
photosynthetic rates, protein synthesis and the deviation of the photosynthetic energy
41
waived for cell division for the accumulation of carbohydrates and lipid synthesis
(Courchesne et al. 2009; Pancha et al. 2014).
3.1.5 Lipids from microalgae
Different types of microalgae have different lipid yields, i.e., lipid productivity
largely depends on the microalgae species (Nascimento et al. 2013). Using carbon,
photosynthetically fixed microalgae synthesize fatty acids from sources of inorganic
carbon and also directly from organic carbon sources such as glucose and acetate. The
lipids are compounds of glycerol, sugar or base esterified with 12-22 carbon chains,
saturated or unsaturated, primarily classified into polar lipids and neutral lipids. Polar
lipids include phospholipids, galactolipids, sphingolipids, steroids and prostaglandins.
The neutral lipids are divided into monoacylglycerol, diacylglycerol and triacylglycerol,
along with the number of esterifications present in fatty acid chain. Fatty acids comprise
the largest fraction of lipids, between 25-60% of the total lipids. Among the neutral
lipids, triacylglycerols are targeted for biodiesel production (Derner et al. 2006).
As observed for most photosynthetic organisms, the biosynthesis of fatty acids
from microalgae is divided into three main stages: (1) acetyl coenzyme A (acetyl CoA)
synthesis in the cytosol; (2) saturated fatty acids synthesis with 16-18 carbons,
desaturation and carbon chain elongation and (3) acyl glycerol (triglyceride) synthesis.
Lipids are produced throughout the cell cycle, and initially the synthesis is directed to
form structural lipids for primary metabolism and then to the triacylglycerol formation.
Triacylglycerols are the main form of energy stored in microalgae, and the composition
of this fatty acid class seems to be related to not only the genetics of species but also
environmental conditions and cellular stress by which microalgae are submitted (Chiu et
al. 2009b; Pereira et al. 2013).
42
The concentration and composition of oils in microalgae can vary significantly
at different stages of growth and among species. For example, in the early stages of
growth, green algae produce relatively high concentrations of polar lipids and
polyunsaturated. While in the stationary phase, green algae produce predominantly
neutral lipids (Li et al. 2014; Sánchez-Saavedra & Voltolina 2006). The major profile of
lipids and fatty acids methyl are shown in Table 4.
Table 4: Composition of neutral and polar lipids of Isochrysis galbana, Phaeodactylum
tricornutum and Porphyridium cruentum under continuous cultivation in tubular
photobioreactor. Adapted from Cartens et al. 1996, Giménez et al. 1998 and Molina
Grima et al. 2003.
Lipids
% of lipids
Isochrysis
galbana
Phaeodactylum
tricornutum
Porphyridium
cruentum
Neutral 26.5 (43.0) 23.2 (51.0) 39.5 (47.0)
Polar 73.5 (57.0) 76.8 (49.0) 60.5 (53.0)
Glycolipids 59.3 (37.0) 49.1(35.0) 45.0 (43.0)
Phospholipids 14.2 (20.0) 27.7 (14.0) 15.5 (10.0)
Table 5: Fatty acids methyl esters (FAMEs) of soybean (Glycine max), cotton
(Gossypium hirsutum) and microalgae. Adapted from Ma & Hanna 1999, Yoo et al.
2010 and La Russa et al. 2012.
Fatty acids % of FAMEs
Soybean Cotton Microalgae1 Microalgae
2 Microalgae
3
Palmitoleic (C16:1) - - 4 1,7 3.4
Palmitic (C16:0) 11.75 28.33 36.3 32.9 2.1
Linolenic (C18:3) 6.31 - - 9.1 - Linoleic (C18:2n6) 55.53 57.51 31.1 17.7 47.8
Oleic (C18:1n9) 23.26 13.27 25.9 18.3 24.8
Estearic (C18:0) 3.15 0.89 2.7 5.09 1.3
(1) Scenedesmus sp. (KCTC AG20831), (2) Chlamydomonas reinhardtii (CC3491) and
(3) Chlorella vulgaris.
43
Table 6: Lipid content of microalgae. Adapted from Becker, 1994; Chisti 2008a; Yoo et
al. 2010; Miranda, 2011 and Pereira et al. 2012.
Microalgae
Lipid
% biomass
Microalgae
Lipid
% biomass
Ankistrodesmus sp 29 – 40 Nannochloris sp 30 – 50
Amphidinium sp 8 – 10 Nannochloropsis sp 31 – 68
Amphora sp 21 Nannochloropsis sp 44
Botryococcus braunii 25 – 80 Nannochloropsis salina 22
Chlamydomonas reinhardtii 21 Navicula jeffreyi 6
Chlorella emersonii 28 – 32 Neochloris oleoabundans 35 – 54
Chlorella protothecoides 57 Nitzschia sp 45 – 37
Chlorella pyrenoidosa 46 Parietochloris incise 30
Chlorella vulgaris 14 – 22 Pavlova pinguis 3 – 7
Chlorella zofingiensis 51 Phaeodactylum sp 20 – 30
Chlorococcum sp 7 Pleurochrysis carterae 30 – 50
Crypthecodinium cohnii 20 Proteomonas sulcata 8
Cyanobium sp 8 Prymnesium parvum 22 – 38
Cylindrotheca sp 16 – 37 Rhodomonas salina 5
Dunaliella primolecta 23 Scenedesmus dimorphus 16 – 40
Dunaliella salina 6 Scenedesmus obliquus 12 – 14
Dunaliella tertiolecta 35 Skeletonema sp 3
Euglena gracilis 14 – 20 Schizochytrium sp 50 – 77
Hormidium sp 38 Spirulina maxima 6 – 7
Heterocapsa sp 6 Spirulina platensis 4 – 9
Isochrysis sp 25 – 33 Thalassiosira sp 8
Monoraphidium sp 20 Tetraselmis sp 12–14
Monallanthus salina > 20 Tetraselmis suecica 15 – 23
The fatty acid profile for green algae is quite similar to other terrestrial plants,
such as soy and cotton, and is being considered as a potential alternative to biofuel
industries (
Table 5). For over 50 years, studies of microalgae for biofuel production have
been described in the literature (Uziel et al. 1975). However, the microalgae
fermentation processes for the production of methanol and ethanol and oil production
are relatively new approaches and the studies are limited to a few strains (Pulz et al.
44
2008; Mata et al. 2010; Ho et al. 2012). In terms of lipid production, microalgae are
divided into two categories: those with high lipid content and low growth rate and those
with high growth rate and low lipid content (Table 6). Species such as Phaeodactylum
tricornutum, Scenedesmus almeriensis, Chlorella vulgaris and Nannochloropsis
oculata, under specific conditions, showed yields of approximately 90% of recovered
methyl esters(Musharraf et al. 2012; Rawat et al. 2013). However, in the Brazilian
scope, the industrial potential of these organisms remains to be met, largely due to the
incomplete knowledge surrounding the production of metabolites in strains isolated in
Brazilian environments.
3.1.6 Conversion of fatty acids into biodiesel
Biodiesel is a mixture of methyl or ethyl esters of long chain produced from oils
by esterification and transesterification of fatty acids. The esterification is the reaction
of fatty acids with an alcohol, such as methanol or ethanol, to form methyl or ethyl
esters and water. Generally, mineral acids such as sulfuric acid catalyze the
esterification reaction. Both reactions are reversible, and the displacement of the
balance to obtain the products may occur by removing one of the products, preferably
water, or using an excess of a reagent such as alcohol. The reactions start with the
conversion of triglycerides to diglycerides and then diglycerides to monoglycerides;
finally, the monoglycerides are converted into alkyl monoesters and glycerol (Fukuda et
al. 2001; Marchetti et al. 2007).
The physical and chemical characteristics of the oil are determined by the nature
of the fatty acids. Each oil has specific characteristics with respect to the density,
viscosity, oxidation stability, solidification point and acid index. Table 7 presents data
45
relating the properties found in microalgae biodiesel and conventional diesel (Monyem
& Van Gerpen, 2001; Boehman, 2005).
The alkaline transesterification is the route most used industrially in oil matrices
for economic reasons. However, it is recognized that basic catalysis has operational
problems when the vegetable oil has a high content of free fatty acids, which, during the
reaction, produce emulsions that hinder the separation of the glycerine esters at the end
of the reaction. Considering the high rate of free fatty acids in the oil from microalgae,
the basic catalyst is not suitable for the process of transesterification (Fukuda et al.
2001; Khalil, 2006; Griffiths et al. 2010; Suarez et al. 2009). It showed that the use of
acid catalysts to produce methyl esters from microalgae resulted in higher yields than
when catalysts were in the presence of base (Nagle & Lemke, 1990).
Table 7: Comparison of properties between diesel with microalgae biodiesel and with the
standard of the American Society for Testing and Materials (ATSM). Adapted from Miao & Wu
2006.
Properties Biodiesel of
Microalgae Diesel Standard ASTM
Density (Kg/l) 0.864 0.838 0.86-0.9
Viscosity (mm2/s CST a
40 °C) 5.2 1.9-4.1 3.5-5.0
Flash point (°C) 115 75 Min 100
Freezing point (°C) -12 -50-10 -
Pour Point (°C) -11 -3.0 (Max. -6)
Summer Max.= 0;
Winter < -15
Acid value (mg KOH, g-1
) 0.374 Max 0.5 -
Calorific value (MJ/Kg) 41 40-45 -
Proportion of H/C 1.81 1.81 -
46
The direct acid-catalyzed transesterification has also proven to be a promising
technology for the production of biodiesel from a feedstock that contains large amounts
of free fatty acids, such as seed oil of Jatropha curcas (Shuit et al. 2010). Therefore,
acid transesterification biomass may prove to be an important technology for the
production of biodiesel, not only from microalgae oils. Recently, hydroesterification has
been viewed as an alternative to microalgae biodiesel production due to its promising
results to obtain fatty acids with above 80% recovery from the hydrolysis of wet
biomass (Almarales et al. 2012; Reyes et al. 2012).
3.1.7 Challenges, prospect and conclusion
One of the challenges for the commercialization of biodiesel from microalgae is
the economic viability. Certain barriers still need to be overcome since the energy
demanded for cultivation, harvesting, oil extraction and conversion could be higher than
the energy produced. The demand for water, nutrients and carbon are also aspects that
have been considered. From a technical point of view biodiesel production from
microalgae is not yet feasible but with possibilities for improvements (Lardon et al.
2009; Carioca et al. 2009).
In the course of fatty acid production, there are other useable products such as
proteins, carbohydrates, essential fatty acids and other nutrient contents. The
encouragement of the total use of biomass improves the industrial value of microalgae
biomass and becomes economically attractive microalgae biodiesel production (Lardon
et al. 2009; Stuart et al. 2010). As part of the integrated biorefineries concept, it is
recommended the efficient use of natural resources and recovery of materials, energy
and nutrients contained in the by-products or generated from other processes. The
utilization of domestic wastewater in microalgae ponds has demonstrated a possibility
47
for the integrated process to produce oil for biodiesel. These ponds can be used in
secondary or tertiary treatment and are advantages in terms of cost, energy requirements
and greenhouse gas mitigation (Sydney et al. 2011).
Some countries, such as China, Taiwan, Israel, India, Germany, Canada and the
United States, have announced initiatives for the commercial production of microalgae
for biodiesel production purposes. It is clear the advance of knowledge about this
theme. However, it is also observed that this effort takes place in an isolated form, with
few cross-actions and exchange of know-how (Franco et al. 2013). The Brazilian market
is faced with the prospect of a significant increase in biodiesel demand by the evolution
of biodiesel addition to the diesel blend. A lot of work is still needed before the
potential offered by microalgae as source of biodiesel is fully exploited.
The literature cited throughout this review shows that most of these studies were
performed with strains isolated from temperate regions and therefore environmental
conditions different than those observed in Brazil. Another point is that these studies are
not effective in elucidating what would be the best growing conditions in both
laboratory and scale production, which enables the use of microalgae as the raw
material for the production of biodiesel. It reiterates the need to obtain Brazilian strains
that can withstand the climatic conditions to which they will be exposed to in our
country, as well as to enhance the design and development of technologies that can
reduce costs while increasing yields.
Acknowledgments
The authors would like to thank the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES) and the Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e
Tecnologia (Inmetro) for the scholarships.
48
3.2 Optimization of nitrogen, phosphorus and salt for lipid accumulation of
microalgae: Towards the viability of microalgae biodiesel
Carolina T. Miranda, Daniel V. N. de Lima, Georgia C. Atella, Paula F. de Aguiar and
Sandra M. F. O. Azevedo. (2016). Natural Science, 8, 557-573.
http://dx.doi.org/10.4236/ns.2016.812055
Abstract
In recent years, microalgae biodiesel have attracted expressive attention and
investment, once they were considered a potential resource for energy. Although, the
wide use of microalgae biodiesel is restricted by its high production cost. For cost-
efficient and sustainable production of biodiesel from microalgae, a proper understand
of the variables and their impacts on physiology of the strains is required. In this study a
simple factorial design 23 was used to find optimal conditions for the cultivation of
Ankistrodesmus sp. and Chlamydomonas sp. in batch culture. The three components
considered were nitrate, phosphate and sodium chloride, used to assess the metabolic
versatility of the strains in brackish conditions. The results showed that culture medium
with 0.04 g.L-1
nitrate, 0.01 g.L-1
phosphate and 5.0 g.L-1
sodium chloride resulted to be
the most effective condition to growth and fatty acids accumulation. Using this optimal
condition, Ankistrodesmus sp. and Chlamydomonas sp. increased in 2.1 and 2.4 folds
their fatty acids yield, respectively. Importantly, this protocol reduced 75% of the nitrate
and phosphate concentrations of the original medium (ASM-1). Additionally, fatty acids
analysis found that these strains were mainly constituted of C16-C18, in accordance
with the requirements for biodiesel production. The simple factorial design applied here
proved to be an important tool towards a better understanding of synergistic effects of
49
tested factors on microalgae metabolism, and the resulting information could be used
effectively to improve microalgae cultivation.
Keywords: Optimization, Microalgae, Lipids, Ankistrodesmus, Chlamydomonas,
Experimental Design
3.2.1 Introduction
Optimization of microalgae growth in cultures has been a challenge ever since
culturing conditions were established by pioneering studies more than a century ago
[1,2]. Interest in this issue increased when microalgae became an alternative choice for
the exploitation of several high value products including lipids, pigments, bioactive
compounds and chemicals for industrial applications. According to current knowledge,
microalgae biodiesel is at the forefront of the next generation of biofuel systems (Ma &
Hanna 1999; Huang et al. 2010; Brennan & Owende 2010). The numerous attributes of
microalgae include: (i) high phototrophic productivity and thus the ability of large scale
microalgae to use natural light (Koller et al. 2012; Sforza et al. 2012); (ii) fast growth
rates (Venkata Mohan & Devi 2014; Passarge et al. 2006); (iii) the potential for non-
cropland cultivation (Wijffels et al. 2013; Smith et al. 2010); (iv) the potential to trap
greenhouse gases (CO2) and recycle waste water and nutrients (Chen et al. 2015;
Larsdotter 2006; Quiroz Arita et al. 2015); and (v) huge potential to convert sunlight
into reduced carbon molecules, such as carbohydrates and lipids (Thompson 1996). So
far the production of biodiesel from microalgae has obtained significant advances in
laboratory scale. However, the costs of microalgae production, low lipid yield and water
demand still restrict their large scale exploitation. In this sense, the optimization of
culture conditions figure as a key step to minimizing costs and to achieving desirable
50
conditions to exploit the production of microalgae as a biodiesel feedstock (Li et al.
2011; Work et al. 2012; Picardo et al. 2013).
Microalgae growth is controlled by light, nutrients, temperature, salinity and pH.
To adapt their metabolism to different environments, changes in shape, size, mobility
and chlorophyll content occur to ensure the acquisition of light and nutrients (C. S.
Reynolds 2006; Sommer 1999). Lipids are fundamental components in virtually every
aspect of microalgae life. Processes such as energy transfer, signal transduction,
biosynthesis of macromolecules and photosynthesis are membrane bound, and highly
dependent on lipid composition. Thus, lipids that maintain the physiological functions
of membranes allow microalgae to re-adjust to environmental change and to tolerate
severe stress. Microalgae species can accumulate lipids in the form of triacylglycerol
(TAG) up to 20 – 30% of their dry cell weight, and some few species even up to 50%
(Miranda et al. 2015). TAGs are constituted of three fatty acids esterified to a glycerol
backbone and are one of the most concentrated forms of energy available in eukaryotic
cells (Gurr et al. 2002). There is a vast range of commercial applications for these lipids,
which includes biodiesel production, leading to an increased interest to improve
microalgae culture techniques that ensure high levels of productivity (Mata et al. 2010;
Spolaore et al. 2006; Meng et al. 2009). Until now, the most commonly applied stress to
improve TAG accumulation in microalgae has been the removal of nitrogen from
culture medium (Řezanka et al. 2011; Gao et al. 2013). However, the deficiencies have
been also observed to limit the growth of microalgae bring an unsatisfactory result.
Other stress conditions such as phosphorus depletion, and high pH, salinity, light or
temperature have been described, but quantitative data is still lacking. High
concentrations of sodium chloride (up to 1.0 M) have been reported to increase
intracellular accumulation of fatty acids in microalgae (Siaut et al. 2011; Takagi et al.
51
2006). In addition, the inhibitory effect of sodium chloride in cultures of microalgae has
been exploited for contamination control that could lead to biomass losses in open
ponds systems, however advances in these area are still in progress (Ho, Ye, et al.
2014),(Rawat et al. 2013). Nevertheless, since culturing success generally depends on
the environmental conditions of the proposed cultivation area, as well as the available
infrastructure, it can be difficult to compare data reported by different authors.
Our study aimed to establish the nitrate, phosphate and sodium chloride
concentrations to improve the fatty acids accumulation of two indigenous strains of
microalgae, as well as to provide an effective way of saving resources without thereby
compromising the performance of cultures. Additionally, microalgae biomass obtained
at optimized condition were subjected to further fatty acids analysis. The option of
using brackish water instead of fresh-water for algae culturing, especially in Brazilian
arid and semi-arid regions, can enhance the economic potential and environmental
sustainability of microalgae biofuel systems. We chose a simple factorial design
combined with response surface methodology (RSM) to assess a large range of
experimental concentrations in order to optimize culture conditions and avoid the
defects brought by single-factor optimization. These methods have been successfully
utilized in others fields such as the chemical industry and engineering, but to our
knowledge has been scarcely reported to optimization of microalgae cultures
(Nicolaisen et al. 2014; Chen et al. 2014).
3.2.2 Material and Methods
3.2.2.1 Strains and cultivation
Ankistrodesmus sp. (ANRF-1) and Chlamydomonas sp. (CHLRN-1) isolated
from Brazilian ponds were obtained from the Laboratory of Cianobacterial
52
Ecophysiology and Toxicology culture collection in the Biophysics Institute Carlos
Chagas Filho - Federal University of Rio de Janeiro. Strains were chosen with respect to
their ability to grow under high light intensities and their potential to produce lipids
with biotechnological relevance. Batch cultures were growth in ASM-1 medium,
containing 0.17 g NaNO3, 0.05 g MgSO4 7 H2O, 0.04 g MgCl2 6 H2O, 0.03 g CaCl2
2H2O, 0.02 g KH2PO4, 0.03 g Na2HPO4 12 H2O, 0.003 g H3BO3, 0.001 g MnCl2 4H2O,
0.001 g FeCl2 6H2O, 0.0002 g ZnCl, 0.00002 g CoCl2 6H2O, 0.000001 g CuCl, 0.008 g
Na2 EDTA and salinity 0.5 ppt per liter of ultrapure water. Cultures were sparged with
constant air bubbling (0.5 L min-1
) and incubated at 22 ±2°C with a light intensity of
1.400 µmol photons m-2
s-1
provided by cool white fluorescent light and a photoperiod
of 12 hours. The initial concentration of both strains was 5x10-5
cells mL-1
,
corresponding to 43.3 mg biomass for Ankistrodesmus sp. and 19.0 mg for
Chlamydomonas sp.
3.2.2.2 Determination of growth, biomass production and lipid extraction
The microalgae growth was measured using a Casy Counter equipment standard for
dye-free determination of cell viability by Electrical Current Exclusion (ECE). 100.0 µL
of lugol-fixed samples diluted in 5.0 mL Casy Ton were gently stirred to determine cell
concentrations by measuring capillary 60 µm. For biomass analysis samples of each
culture was harvested on the tenth day of cultivation (at the stationary stage of cells) and
then concentrated by centrifugation at 2,800 x g for 15 min at 4 °C. Pellets were washed
with ultrapure water and dried in a freeze dryer and stored at -20°C until analysis. The
dry weight was determined gravimetrically. For lipid extraction, biomass was pre-
treated using methanol and then kept for 10 min in a sonifier cell disruptor on ice. Lipid
extraction was performed using the Bligh & Dyer method (Bligh & Dyer 1959) adapted
53
for microalgae cells. A solution of chloroform, methanol and water (1:2:0.5 v/v) was
added to the mixture and shaken for 3 hours at 160 rpm to extract the lipids. The
solution was centrifuged to separate biomass of the organic phase and evaporated under
flowing nitrogen gas to determine the yield of lipid extract by gravimetry.
3.2.2.3 Experimental design
A simple 23 factorial design was used in order to optimize nitrate, phosphate and salt
concentrations to improve the lipid yield of Ankistrodesmus sp. and Chlamydomonas sp.
(Table 8). In addition, three experiments were performed at intermediate concentrations
(level 0) for an estimate of the experimental error. The compounds were tested at three
different concentrations: absence (-1), intermediate (0) and elevated (+1). These were as
follows: for NaNO3 (X1) 0.00 g L-1
(-1), 0.04 g L-1
(0) and 0.08 g L-1
(+1), for
KH2PO4/Na2HPO47H2O (X2) 0.00 g L-1
(-1), 0.01 g L-1
(0) and 0.02 g L-1
(+1), and for
NaCl (X3) 0.00 g L-1
(-1), 5.0 g L-1
(0) and 10.0 g L-1
(+1). Except for NaCl, the levels
(0) and (+) correspond to 25 and 50% of their concentrations in ASM-1 medium. Limits
chosen for each variable were based on previous experiments and literature review,
taking into account the operating viability. As controls, we included three replicates of
the intermediate concentrations of level (0) for each compound tested. Experiments
were analyzed using a mathematical model as follows:
y=b0+(b1x1)+(b2x2)+(b3x3)+(b12x1x2)+(b13x1x3)+(b23x2x3)+(b123x1x2x3)+(b11x
1x1)+(b22x2x2)+(b33x3x3)
Where y is the predictive response (biomass production and lipid yield); b0 is the
model intercept and b1, b2, b3, b12,b13,b23, b123 and b11,b22,b33 are the regression
coefficients obtained by linear regression (Montgomery 2009). Were evaluated the
responses of biomass productivity (mg L-1
d-1
); lipid productivity (mg L-1
d-1
) and lipid
yield (percentage of biomass).
54
Table 8: Variables and factor levels of the simple factorial design.
Variables Symbols Levels of the factors
(-) (0) (+) Control
NaNO3 X1 0 0.04 g L-1
0.08 g L-1
0.17 g L-1
KH2PO4 and Na2 HPO4
X2 0 0.01 g L-1
0.02 g L-1
0.05 g L-1
NaCl X3 0 5.0 g L-1
10.0 g L-1
0
3.2.2.4 Surface response
The optimum response range was determined by Surface Response Methodology
(RSM) (Rambali et al. 2001). Using all three variables, this methodology was applied
by fixing one of the variables (sodium chloride) at different levels (concentrations), and
preparing the surface with the two remaining variables assigning increments of 0.2 in
the range of the nitrate and KH2PO4/Na2HPO47H2O concentrations between -1 and +1
levels. The response surfaces were represented by a three-dimensional graph and
significance analysis of these variables was evaluated trough Derringer Function, a
multi criteria decision methodology. Data analysis was performed with Sigma Plot®
version12.5.
3.2.2.5 Fatty acid methyl ester analysis (FAMEs)
Lipid samples extracted from Ankistrodesmus sp. and Chlamydomonas sp. were
esterified according to Christie (1989). Samples up to 50.0 mg were dissolved in 1.0 mL
of toluene to which 2.0 mL sulfuric acid 1% (in methanol) was added. The solution was
kept overnight at 50°C, after which 1.0 mL of sodium chloride 5% was added. The fatty
acids were extracted twice with 2.0 mL of hexane and dried under flowing nitrogen gas.
All samples were analyzed by gas chromatography using a Shimadzu (GP2010 Plus),
55
equipped with an electron ionization detector (EI-70 eV), a quadrupole mass analyzer
and an Agilent HP Ultra 2 (5%- phenyl)-methylpolysiloxane column. Helium was used
as carrier gas with a flow rate of 32.9 cm s
-1. The injector was set at 250 °C and
temperature programming was performed as follows: the column temperature was
elevated to 40-160 °C at a heating rate of 30 °C min-1
, 160-233 °C at a heating rate of
1°C min-1
and from 233 °C until 300 °C at a heating rate of 30 °C min-1
for 10 min. The
interface and the ion source were kept at 240 °. The components were identified by
comparing their retention times and fragmentation patterns with standard Supelco 37
Component FAME Mix-Sigma. Nonadecanoic acid (C19:0) was used as an internal
standard.
3.2.3 Results and discussion
3.2.3.1 Optimization of nitrate, phosphate and sodium chloride concentrations
So far various studies have been carried out to demonstrate that the nitrogen and
phosphorous concentration affect the growth and lipid accumulation contrary. To
maximize cell growth, sufficient concentrations of these nutrients would be required
while their starvation can increase lipid accumulation for several microalgae species
(Xiong et al. 2008; Su et al. 2011). It is imperative that an ideal condition for
microalgae culturing should favor these two aspects.
In this study, a majority of the cells inoculated was viable and in a condition to
divide immediately after inoculation of twelve experiments. The exponential growth
was observed to begin after first day of inoculation being zero the length of lag phase.
However, nitrogen and phosphorous absence limited the exponential growth of the
cultures, as showed in design points 1 and 3, respectively reflecting in a shorter duration
of exponential growth phase (data not shown). The results indicate that modifications of
56
nitrate, phosphate and sodium chloride concentrations strongly affected the biomass
productivity of Ankistrodesmus sp. and Chlamydomonas sp., between 14.0 – 30.4 mg L-
1 d
-1 and 21.6 – 85.0 mg L
-1 d
-1, respectively (Table 9). These results are in consonance
with the general findings of other authors (Widjaja et al. 2009; Lv et al. 2010). The
results also showed that reduced nitrate and phosphate concentrations improved lipid
accumulation in the tested strains. Lipid productivity of Ankistrodesmus sp. and
Chlamydomonas sp. varied between the twelve experimental conditions, ranging from
3.0 to 7.8 mg L-1
d-1
and from 10.3 to 16.5 mg L-1
d-1
, respectively. Significant
enhancements of lipid yield, up to 20% of biomass dry weight for both strains were
obtained in most of the conditions tested except in experiments 2 and 4 for
Ankistrodesmus sp. and 2, 4, 6, and 8 for Chlamydomonas sp., all of which had the
highest nitrate concentrations. Reduced nitrate and phosphate concentrations when
combined with added sodium chloride also affected positively the lipid accumulation of
Chlamydomonas sp. (experiments 6 to 8 and level 0), even with a slight decrease of
biomass productivity, in accordance with results reported by other researchers (Rawat et
al. 2013; Sharma et al. 2012).
57
Table 9: Matrix of the experimental design with experimental values for biomass
productivity, lipid productivity and lipid yield (% of biomass dry weight) on the 10th
day of cultivation, at stationary phase of growth.
Design
points
Factors and
levels
ANRF-1 CHLRN-1
X1 X2 X3
Biomass Lipid % Biomass Lipid %
1 (-) (-) (-) 18.2 5.0 27.6 45.3 16.5 36.5
2 (+) (-) (-) 25.6 4.9 18.5 73.6 13.3 18.8
3 (-) (+) (-) 21.4 6.0 28.3 45.0 13.2 29.4
4 (+) (+) (-) 30.4 5.0 16.2 85.0 15.1 17.7
5 (-) (-) (+) 15.5 4.0 26.2 21.6 11.0 49.8
6 (+) (-) (+) 18.5 6.0 31.6 70.0 11.5 16.4
7 (-) (+) (+) 14.0 3.0 21.2 42.3 11.6 27.4
8 (+) (+) (+) 18.2 6.0 33.3 80.6 12.0 14.8
9 (0) (0) (0) 24.1 7.8 32.6 56.0 14.4 25.8
10 (0) (0) (0) 21.0 6.4 30.9 60.3 10.0 16.6
11 (0) (0) (0) 24.0 7.3 30.8 65.0 16.3 25.2
Level 0 (9 to 11)
Average 23.0 7.2 31.4 60.4 13.6 22.5
DP 1.8 0.7 1.0 4.5 3.2 5.15
Control
ASM-1 36.8 6.4 18.0 88.0 9.6 10.9
The Derringer function (D) in Figure 6 illustrates the statistical analysis of the
results. In this figure, the Y axis corresponds to the design points, the X axis
corresponds to the desirability degree ranging from 0 (undesirable) to 1 (most desirable)
and the bar length corresponds proportionally to the significance of each factor and its
association at the levels tested (-1), (0) and (+1) on the variables biomass and lipid
productivity, simultaneously. Values that exceed the vertical line are statistically
significant at the 95% confidence level. The results indicated that the three factors as
58
their interactions were significant for both biomass and lipid productivity of
Ankistrodesmus sp. and Chlamydomonas sp., at the 95% confidence level. According to
this statistical analysis, cell productivity and lipid yield are attained by concentrations of
0.08 g L-1
NaNO3, 0.02 g L-1
KH2PO4/Na2 HPO4 (design point 4) at the 95% confidence
level. The interaction between NaCl with NaNO3 and KH2PO4/Na2HPO4 is also
significant (at the 95% confidence level) when all factors were at mid-level (design
point 0).
Figure 6: Derringer function of biomass and lipid productivity from Ankistrodesmus sp.
(ANRF-1) and Chlamydomonas sp. (CHLRN-1) for each design point experimented.
3.2.3.2 Surface response analysis
The surface response analysis (Figure 7 A) showed that maximal biomass
productivity for Ankistrodesmus sp. was achieved with concentrations of nitrate at mid-
level (0.04 g L-1
), phosphate at the +1 level (0.02 g L-1
) and sodium chloride at the -1
level (0.00 g L-1
). For Chlamydomonas sp., maximum productivity (90.0 mg L-1
d-1
)
59
was produced when nitrate and phosphate were set at the +1 level (0.08 and 0.02 g L-1
,
respectively), independent of the sodium chloride concentration (Figure 8 A, C and E).
In addition, was verified that changes in the order of 0.5 of the phosphate concentration
decreasing from the +1 level (0.02 g L-1
) to the -1 level (0.00 g L-1
) had an important
impact on biomass productivity of both strains, leading to a significant reduction on
biomass production. The highest lipid productivity for Ankistrodesmus sp. (9.0 mg L-1
d-
1) was achieved with concentrations of nitrate at mid-level (0.04 g L
-1), phosphate at the
+1 level (0.02 g L-1
), sodium chloride at mid-level (5.0 g L-1
) and at the +1 level (10.0 g
L-1
), as shown in Figure 7 (D and F). Lipid yield in Chlamydomonas sp. (Figure 8 B)
was higher when nitrate, phosphate and sodium chloride concentrations were kept at the
-1 level. A combination of nitrate at the -1 level, phosphate at the +1 level and sodium
chloride at the -1 level resulted in a highly satisfactory lipid yield. However, to achieve
this outcome, the concentrations must be rigorously controlled since small deviations
may result in a significant decrease of biomass and lipid production. The most robust
surface with high yields of biomass and lipids was obtained at intermediate levels (0)
for nitrate (0.04 g L-1
), phosphate (0.01 g L-1
) and sodium chloride (5.0 g L-1
) and can
therefore be considered as better conditions for both strains.
60
Figure 7: 3D response surface and contour plots of nitrate, phosphate and sodium
chloride concentrations levels on biomass production (A, C and E) and lipid yield (B, D
and F) of Ankistrodesmus sp. when NaCl was fixed at level (-1), (0) and (+1),
respectively.
61
Figure 8: 3D response surface and contour plots of nitrate, phosphate and sodium
chloride concentrations levels on biomass production (A, C and E) and lipid yield (B, D
and F) of Chlamydomonas sp. when NaCl was fixed at level (-1), (0) and (+1),
respectively.
62
The accuracy of these protocol was verified through experiments repetition
using the optimized conditions described above (level 0), as well as ASM-1 medium
(control) in triplicate. The results of both treatments (optimized condition and control)
were very similar, confirming the validity of the model and protocol used in this study.
After a 10 day growth period in optimized medium, we observed a strong increase of
lipid content (126%) in Chlamydomonas sp. compared with lipid production in ASM-1
medium (Figure 9 B). Chlamydomonas was not considered an oleaginous alga until
recent studies indicated that they can accumulate considerable amounts of fatty acids
under appropriate conditions (Morowvat et al. 2010; Merchant et al. 2012; Fan et al.
2011). In our study, Chlamydomonas sp. (CHLRN-1) achieved a lipid productivity of
15.0 mg L-1
d-1
(24% of biomass) of which 68% were fatty acids, higher than reported
in other relevant studies with indigenous strains of Chlamydomonas (Ho Ye, et al. 2014;
Talebi et al. 2013 and Díaz et al. 2014). The lipid content of Ankistrodesmus sp.
(ANRF-1) increased by 36% in the optimized medium (Figure 9 A), with a lipid
productivity of 8.4 mg L-1
d-1
rich in fatty acids (13% of lipid extract) favorable for
biodiesel production. Compared with Chlamydomonas sp., the Ankistrodesmus strain
had a slower growth rate resulting in a biomass yield that could be considered a limiting
factor for industrial purposes. However, in addition to the key importance of volumetric
biomass and lipid yield, other factors such as ease of cultivation, harvesting, and
prevailing environmental conditions also affect the final choice of microalgae strains as
feedstock for biodiesel production (Talebi et al. 2013). While cell growth was reduced
with the reduction of nitrogen and phosphorus concentrations, the successful increase of
lipid accumulation under the same condition may counterbalance the losses in biomass
productivity. It is relevant from a biotechnological point of view, which must also
consider the economic cost of chemicals for industrial cultivation of microalgae.
63
3.2.3.3 Fatty acid methyl esters (FAMEs)
The degree of saturation/unsaturation of fatty acids determines the quality of
biodiesel. Therefore, we examined the fatty acid profiles produced from cultures of
Ankistrodesmus sp. and Chlamydomonas sp. under operating conditions determined in
this study. Fatty acids were identified and quantified by GC/MS following extractive
methylation to fatty acid methyl esters (FAMEs). The total content of FAMEs for
Ankistrodesmus sp. was 47.4 mg g-1
of the produced biomass in the optimized medium,
and did not differ significantly from that obtained in ASM-1 medium (19.9 mg g-1
,
Figure 9A). For Chlamydomonas sp. the total content of FAMEs was significantly
higher (at 99% of confidence level) in the optimized medium than in ASM-1 (162.7 mg
g-1
and 68.1 mg g-1
of biomass produced, respectively, Figure 9 B).
Figure 9: Differences between optimized medium and ASM-1 in the lipid content and
FAMEs of Ankistrodesmus sp. (A) and Chlamydomonas sp. (B). Data points are means
of three independent experiments and error bars show SD.
The reduction of nutrients or the addition of sodium chloride did not trigger
variations of FAME profiles in the two tested microalgae, with the exception of C18:5
in Chlamydomonas sp., which increased significantly in comparison to the control
condition, explaining the distinct increase of FAMEs overall. Ankistrodesmus sp.
showed high concentrations of unsaturated fatty acids with therapeutic properties
64
(Figure 10 A and B). The predominant fatty acids were: C18:3n3 (alpha-linolenic acid),
C18:1n9c (oleic acid) and C18:2n6c (linoleic acid), representing omega 3, 6 and 9,
respectively (Figure 10 C). In accordance to the literature (Piorreck & Pohl 1984;
Converti et al. 2009), C16:0 (palmitic) was the most representative saturated fatty acid
in both microalgal strains, and its concentration did not significantly change under the
various concentrations of nutrients tested. This is not surprising since palmitic acid is a
major component of most microalgal classes, while the profiles of unsaturated fatty
acids differ among algal groups (Reuss & Poulsen 2002; Lang et al. 2011).
Chlamydomonas sp. (Figure 11 A and B) produced large amounts of C18:1n9c and
C18:3n3 when cultivated in optimized medium. We observed a larger variety of
saturated fatty acids in this strain, including C15:0 (pentadecanoic acid), C17:0
(hepatdecanoic acid), C:20 (arachidic acid) and C:22 (behenic acid) (Figure 11 C). A
similar variety is characteristic for tallow or palm oils, which are rich in saturated fatty
acids and used to produce biodiesel in Brazil.
65
Figure 10: GC chromatogram of representative FAMEs from microalgae
Ankistrodesmus sp. in optimized medium (A) and ASM-1 (B) after 10 days of
cultivation. Numerals above peaks show the retention time of appropriate peak in
minutes. (C) FAMEs content in lipid extract in optimized medium (black columns) and
ASM-1 (gray columns) * The position of the double bond was not identified, **
correspond to 16:3n3 Δ4,7,10
and *** 16:3n3 Δ7,10,13
. Data points are means of three
independent experiments and error bars show SD.
66
Figure 11: GC chromatogram of representative FAMEs from microalgae
Chlamydomonas sp. in optimized medium (A) and ASM-1 (B) after 10 days of
cultivation. Numerals above peaks show the retention time of appropriate peak minutes.
(C) FAMEs content in lipid extract in optimized medium (black columns) and ASM-1
(gray columns) * The position of the double bond was not identified, ** correspond to
16:3n3 Δ4,7,10
and *** 16:3n3 Δ7,10,13
. Data points are means of three independent
experiments and error bars show SD.
67
3.2.4 Conclusion
The simple factorial design associated with response surface methodology was
found to be effective in optimizing the concentrations of nitrate and phosphate for an
efficient use of chemicals in microalgae cultivation. In order to increase lipid production
nitrate and phosphate concentrations of the ASM-1 medium can be reduced by 75%,
reducing biomass losses and improving the control of operation conditions. Our results
conclude that Ankistrodesmus sp. (ANRF-1) and Chlamydomonas sp. (CHLRN-1)
could be suitable for biodiesel production due to a high proportion of C16-C18 fatty
acids, attending the basic requirements for biodiesel production. In addition, the ability
to grow in a medium with added sodium chloride also contributes to the significant
potential of these strains for biodiesel production, demonstrating that fresh-water is not
required for further scaling up to semi-pilot scale. This is particularly relevant in a
global scenario where fresh water supplies must be protected to maintain environmental
and public health.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES) for providing the scholarships. Thanks to Centro
de Pesquisas e Desenvolvimento Leopoldo A. Miguez de Mello (CENPES) for
graciously providing the microalgae Chlamydomonas sp. (CHLRN-1 strain) and for the
financial support. We express our gratitude to Mileane S. Busch for the technical
assistance on GC-MS analysis.
68
3.3 Impacts of nutrients and CO2 concentrations on growth and lipid
production by microalgae
Carolina T. Miranda, Daniel V. N. de Lima, Georgia C. Atella and Sandra M. F. O.
Azevedo
Abstract
One of the greatest challenge to increase the production of biofuels by
microalgae is to reduce the cost of the biomass production with a linked of mitigation
for potential environment impacts generate from some industrial activities. CO2 fixation
by microalgae is a promising method for carbon capture and storage due to their
capacity to assimilate CO2. In this work two different genera of Chlorophyceae,
Ankistrodesmus sp. and Chlamydomonas sp., were grown autotrophycally under
aeration with compressed air and 5% CO2 (v/v) in order to investigate the impacts on
growth and fatty acids production in batch cultures. The cultures were tested in ASM-1
medium and N-P reduced to 25% of ASM-1 original concentrations. For
Ankistrodesmus sp. the highest yield of biomass and lipids was 0.5 and 0.01 gdw L-1
,
respectively (in ASM-1, 5% CO2) with increase of the total content of polyunsaturated
fatty acids of 12,4%. The highest yield of biomass and lipids of Chlamydomonas sp.
were 1.0 and 0.2 gdw L-1
(in N-P reduced and 5% CO2) with no significative variation of
polyunsaturated fatty acids content due to CO2 increase. The results showed that the
impacts of N, P and CO2 concentrations on growth and fatty acid production was
species specific with no general trend for the two strains. Nevertheless, changes in fatty
acid composition in each strain were observed as a function of culture conditions. Fatty
acids analysis found that these strains were mainly constituted of C16-C18. These fatty
acids are suitable for transesterification and conversion into biodiesel.
69
Keywords: Microalgae; Fatty acids; CO2; Nutrients; Biodiesel
3.3.1 Introduction
Microalgae as a eukaryotic group of photoautotrophic organisms that need three
essential blocks of requirements to growth: light, a source of inorganic carbon and
inorganic nutrients. Of course the tremendous variation on the amount and quality of
these requirements by different microalgae species and even strains constitute an
excellent source of metabolic biodiversity to be explored (Talebi et al. 2013; Sahu et al.
2013). One of biotechnology challenges in the last decades is the search for microalgae
strains capable to present an adequate growth and biomass production for biofuel use.
However for economic and social interest this condition should be associated with low
cost of production and remediation of some anthropogenic impact.
Microalgae use CO2 as a carbon source and absorption of CO2 from microalgae in
water is a key factor in cultivation due to low solubility of CO2 in pure water, generally
1650ppt at 25°C. CO2 in water will be present in four different forms: CO2 at pH below
5, HCO3-2
at pH between 7 and 9, CO3-2
at pH 9 and H2CO3. At temperature above 25°
the carbon acid content can be ignored due to its rapid deprotonation. In general,
microalgae can assimilate CO2 through three different pathways: (I) directly via
plasmatic membrane, (II) through the use of bicarbonate by inducing the enzyme
carbonic anhydrase in a mechanism that converts HCO3- to CO2 and water or vice-versa,
and (III) the direct transport of bicarbonate via plasmatic membrane (Raven et al. 2008;
Klinthong et al. 2015). Inside the chloroplast, CO2 is fixed by rubisco producing two
molecules of 3-phosphoglycerate in which, through a series of reactions, these two 3-
carbon organic acids are synthesized as substrates for starch and lipid (Roberts et al.
2007). The CO2 capture capacity is between 22 and 52% with optimal CO2
70
concentrations for most microalgae at 5% CO2 conditions. Some species are able to
tolerate concentration of 15%, and very few species can grow under extremely high CO2
levels (up to 70%), however, with the carbon fixation and biomass production rates
lower than under lower CO2 concentration (Řezanka et al. 2011; Klok et al. 2013).
On the other hand, the increase of CO2 emissions from different sources, including
industrial exhaust gases and soluble carbonate salts, providing a promise alternative for
the use of microalgae for CO2 mitigation while producing several high-value products,
such as lipids. Lipids are a group of molecules that comprise the building blocks of
biological membranes acting as metabolic regulators and cellular signaling of living
systems. Storage lipids in the form of triacylglycerol (TAG) are one of the most
concentrated forms of energy available in eukaryotic cells (Gurr et al. 2002). These fatty
acids vary in length of the carbon chain, number, orientation and position of the double
bonds and represent a relatively inert class of compounds that is easy to isolate from
biological material. For this reason they are considered chemotaxonomic markers to
define groups in flowering plants, trees and algae (Lang et al. 2011). The analysis of
fatty acids in microalgae is an emerging field which is expected to reveal the
identification of novel fatty acids with new functional group as well as chemically
similar to that produced by plants and founded in fossil fuel (Talebi et al. 2013; Sahu et
al. 2013). Thus, microalgae offer a very promising source of raw material for biodiesel
production due to relative high productivity and its potential to CO2 mitigation
(International Energy Agency 2012). However, to enable commercial applications of
microalgae in industry, reliable forms to enhance the production at a reduced cost are
needed. It is already demonstrated that CO2 availability improves the lipid yield without
restricting the growth of microalgae (Ho et al. 2012). The improvement of carbon
supplying leads to an acceleration of microalgae metabolism rapidly increasing the
71
production of starch to the point where additional carbon is used directly for lipid
production (Murray et al. 2012; Chiu et al. 2009b).
The impacts of light intensity (Jakob et al. 2007; Wahidin et al. 2013), temperature
(Converti et al. 2009; Kurpan et al. 2015), salinity (Sonnekus 2010; Pancha et al. 2015),
pH (Gardner et al. 2011; Posadas et al. 2015), nutrient content and supply and
cultivation procedures (Roleda et al. 2013; Yeesang & Cheirsilp, 2011) on microalgae
metabolism are being heavily investigated in the last years in order to identify promise
lipid producers. The lipid content of microalgae is most commonly increased by
limitation of some essential nutrients such as nitrogen. It is observed that acetyl-CoA
carboxylase enzyme activity and transcripts is strongly induced during these conditions,
leading to an enhancement of primary metabolites such as lipids (Harwood & Guschina
2009; Guschina & Harwood 2006b). Phosphorous is an essential element in the process
of photosynthesis, and an important nutrient for algal growth. This element can affect
lipid productivity under nitrogen deficiency. It is reported that in lower concentrations
of phosphorous, microalgae use assimilate phosphorous to synthesizing compounds
consisted of protein such as enzymes for the lipid synthesis, providing material and
energy for lipid accumulation in algal cells (Chu et al. 2013; Bold 1942; Khozin-
Goldberg & Cohen 2006).
Microalgae metabolism could be adapted to produce specific molecules with
biotechnological relevance, providing a wide array of opportunities to develop products
using innovative approaches of bio-refinery concept (Khan et al. 2009; Duong et al.
2012). However the economic feasibility of microalgae products is critically dependent
of their yield and cost. Despite the increasing number of reports describing relevant
technological solutions for microalgal-based production, they still need to be hardly
revisited during the optimization of laboratorial and industrial phases. This study aimed
72
to investigate the impact of nitrogen, phosphorous and carbon dioxide concentrations on
growth and fatty acid production of two local strains of microalgae in order to verify the
potential of these organisms for industrial application. N and P starvation and CO2
addition have been successfully utilized to induce lipid accumulation in microalgae
towards the biodiesel production (Chiu et al. 2009a; Ho, Nakanishi, et al. 2014).
3.3.2 Materials and Methods
3.3.2.1 Strains and culture conditions
Ankistrodesmus sp. (ANRF-1) and Chlamydomonas sp. (CHLRN-1) isolated
from Brazilian ponds were obtained from the Laboratory of Cyanobacterial
Ecophysiology and Toxicology culture collection at Biophysics Institute Carlos Chagas
Filho - Federal University of Rio de Janeiro. Cultures were batch cultivated in ASM-1
medium 0.17 g NaNO3, 0.05 g MgSO4 7 H2O, 0.04 g MgCl2 6 H2O, 0.03 g CaCl2 2H2O,
0.02 g KH2PO4, 0.03 g Na2HPO4 12 H2O, 0.003 g H3BO3, 0.001 g MnCl2 4H2O, 0.001 g
FeCl2 6H2O, 0.0002 g ZnCl, 0.00002 g CoCl2 6H2O, 0.000001 g CuCl, 0.008 g Na2
EDTA per liter of ultrapure water, and N-P reduced medium containing 25% of nitrate
and phosphate concentrations of ASM-1 (0.04 g L-1
NaNO3, 0.01g L-1
PO43-
) and 5.0 g
L-1
NaCl per liter of ultrapure water (Miranda et al. 2016). Experimental conditions
were mixed with compressed air containing 5% CO2 supplemented at 0.5 L min-1
during 8 h/day (following the light cycle) and the control of each condition were mixed
with compressed air containing approximately 0.04% CO2 at 22 °C ± 2 °C, 1400.0 µmol
photons m2 s
-1 and photoperiod of 12 hours. Initial pH was 7.0 once nitrogen and
phosphorous uptake efficiencies in neutral/alkalic circumstances were proved to be
larger than in acid circumstances (Zhang et al. 2014). Culture inoculum was consisted
in a stock of cells incubated in ASM-1 medium at the same conditions of light and
73
temperature described above during six days at concentration of 1x10-6
cells mL-1
(0.04
gdw L-1
for Ankistrodesmus sp. and 0.02 gdw L-1
for Chlamydomonas sp.). All conditions
were tested in triplicate and during cultivation time pH, chlorophyll total content and
photosynthetic activity were measured in vivo at 48-h intervals using a standard bench
top pH meter and a Phyto-Pam Phytoplankton Analyzer, equipped with the Optical
Unit ED101-US, respectively.
3.3.2.2 Growth and biomass dry weight
Samples lugol-fixed were collected at 48-h intervals to determine cell density
(cell mL-1
) by capillary measurement in Casy Counter in duplicates. Biomass dry
weight were determinate at each two days by filtering 10.0 mL of culture using glass
fiber filters to collect the biomass. The biomass was washed with 10.0 mL of ultrapure
water twice, to remove media salts and dried for 20-h at 60°C oven until the filter
weight was constant. Dry weight was calculated by subtracting the dry weight of the
clean filter from the oven dried weight of the filter with biomass. Average biomass
production was calculated from the difference in biomass dry weight within the
cultivation time, as show in Eq. (1):
P = Xf-Xi (Eq. 1)
Where Xf correspond to biomass concentration in gdw L-1
at sampling interval (days 2, 4,
6, 8 and 10) and Xi correspond to biomass concentration at beginning of cultivation time
(day 0).
Biomass concentration values were used to determine specific growth rates (µ d-1
) as
indicate below:
µ = lnX2-lnX1/T2-T1 (Eq. 2)
74
Where X2 and X1 correspond to biomass concentration in gdw L-1
at times T2 and T1 (in
days), the end and the beginning of the exponential growth phase, respectively.
3.3.2.3 Lipid Analysis
Microalgae cells were pretreated by ultrasonication in water using a needle
sonifier at ice bath to lipid extraction using a modified method of Bligh & Dyer [2].
Lipids were twice extracted with chloroform, methanol and water (1:2:0.5 v/v) for 3
hours under orbital shaking, separated into chloroform and aqueous methanol layers by
centrifugation and dried in flowing nitrogen gas. Fatty acids were esterified according
to Christie (1989), in which until fifty-miligram of crude lipid extract samples were
solved with 1mL of toluene and then 2 mL sulfuric acid 1% (in methanol) was added.
The solution was kept overnight at 50°C and after that 1mL of sodium chloride 5%. The
fatty acids were extracted with 2 mL of hexane (2 times) and dried under flowing
nitrogen gas. The crude lipid extract and the fatty acids total contents were measured
gravimetrically (g L-1
) and used to determine the contribution in percentage terms on
biomass dry weight.
Fatty acids profile was analyzed by gas chromatography using a Shimadzu
(GP2010 Plus) equipped with a electron ionization detector (EI-70 eV) quadrupole mass
analyzer and column Agilent HP Ultra 2 (5%- phenyl)-methylpolysiloxane. Helium was
used as carrier gas with a flow rate 32.9 cm s
-1. Injector was set at 250 °C and
temperature programming was performed. The column temperature was elevated to 40-
160 °C with heating rate 30 °C min-1
, 160-233 °C with heating rate 1°C min-1
and from
233 °C until 300 °C with heating rate 30 °C min-1
for 10 min. The interface was kept at
240 ° C and the ion source at 240 ° C. The components were identified by comparing
75
their retention times and fragmentation patterns with standards Supelco 37 Component
FAME Mix-Sigma. Nonadecanoic acid (C19:0) it was used as an internal standard.
3.3.2.4 Statistical analysis
All data are shown as the means and standard deviation (±SD) of three
independent biological replicates. The results were analyzed by analyses of variance
(ANOVA). The significance of the differences was defined by comparison of the means
by applying the Tukey's test. Both tests were performed using Sigma Plot ® software
version 12.5.
76
3.3.3 Results and Discussion
Figure 12: Growth curves and biomass production of Ankistrodesmus sp. (A and B) and
Chlamydomonas sp. (C and D). Data points are means of three independent experiments
and error bars show SD.
Growth curves analysis of Ankistrodesmus sp. showed that the highest value of
growth (2.1x107 cells mL
-1) and biomass dry weight (0.48 g L
-1) was verified in ASM-1
and 5% CO2 cultures, values significant higher than those obtained in N-P reduced
medium (1.3 x107 cells mL
-1 and 0.35 g L
-1, respectively) at 99% of confidence level. In
ASM-1 and 5% CO2 cultures the specific growth rate was 0.36 d-1
with exponential
growth of four days, starting at first day and entering in stationary growth phase at
77
fourth day cultivation (Figure 12 A and B). Cultures in ASM-1 without CO2
supplementation follow the same growth interval than in ASM-1 5% CO2, however,
with a slightly smaller specific growth rate (0.34 d-1
) and dry weight content (0.4 g L-1
),
as shown in Table 10.
For N-P reduced cultures the specific growth of Ankistrodesmus sp.was 0.25 d-1
with potential for exponential growth also of four days, starting at first day and
beginning the stationary phase at fourth day cultivation. On this condition, the specific
growth rate decreased significantly to 0.25 d-1
, in comparison to ASM-1 and 5% CO2 at
99% of confidence level. Under nitrogen and phosphate limitation, cell division and
biomass dry weight were severely retarded. However in this condition biomass dry
weight increased 1.75 folds after ten days of cultivation, from 0.2 to 0.35 gdw L-1
,
indicating that nitrate and phosphate concentrations was sufficient for cell division. The
chlorophyll content was drastically reduced from 5.8 (ASM-1) to 1.8 pg cell-1
at tenth
day cultivation, when the concentration of nitrate and phosphate was available at limited
concentrations.
Chlamydomonas sp. showed higher values of growth and biomass dry weight
(3.1x107
cells mL-1
and 1.0 g L-1
, respectively) in ASM-1 cultures, at 99% of confidence
level (Figure 12 C and D). Growth curves analysis showed that in this condition the
specific growth rate was 0.69 d-1
with exponential growth of four days, starting at first
day and entering in stationary growth phase at fourth day cultivation. N-P reduced
cultures showing a limited condition for cell division of Chlamydomonas sp. and the
values of specific growth rate and biomass dry weight (0.59 and 0.50 d-1
, 0.62 and 0.46
gdw L-1
, respectively) tended to be lower even with the increase of 5% CO2
concentrations, without changing the length of exponential growth phase (Table 10).
However, Chlamydomonas sp. undergoes the growth phases at any concentration of
78
nutrients, multiplying rapidly and increased cell density exponentially with the time. It
could be as result of the inoculums which were started from stocks of culture at
exponential phase of growth. Similar findings were reported by Vasumathi et al. for
Scenedesmus sp. (Vasumathi et al. 2012).
The chlorophyll content of Chlamydomonas sp. was also drastically reduced in
N-P reduced condition, from 3.2 (ASM-1) to 1.3 pg cell-1
in this condition. Indeed, in
both strains it was observed that chlorophyll content decreased staring at second day, in
response to light improvement by inoculums dilution, and keeps the drop during
microalgae growth, seemingly, by nitrate exhaustion of medium. It was apparent that
chlorophyll cell content was closely connect with the nutrients concentration in culture
medium, thus, it seems reasonable hypothesize that under medium optimized conditions
nitrogen was limiting at an initial nitrate concentrations, thus under those conditions
microalgae may could be used part of its proteins from antenna complex as a source of
nitrogen, to sustain the cellular growth and other cell metabolism functions.
79
Table 10: Effect of culture conditions on number of cells, specific growth rate, dry weight of biomass, pH and chlorophyll at 10th
day cultivation.
The values are means of three independent experiments ± SD.
Strains Conditions Number of cells Growth rate Dry weight pH Chlorophyll
Cell mL-1
µ d-1
gdw L-1
At 10th
day pg cell-1
ANRF-1 N-P reduced 1.3x107 ± 1.5x10
6 (cd) 0.25 ± 0.04
(bc) 0.35 ± 0.007
(cc) 9.9 ± 0.34
(bc) 1.8
± 0.04
(cc)
N-P reduced 5% CO2 1.2x107 ± 5.8x10
5 (cb) 0.28 ± 0.02
(ba) 0.30 ± 0.002
(cb) 10.3 ± 0.05
(bb) 1.6
± 0.002
(ca)
ASM-1 1.8x107 ± 1.7x10
6 (bc) 0.34 ±0.02
(ab) 0.39 ± 0.002
(bc) 10.1 ± 0.02
(ac) 5.8
± 0.03
(bb)
ASM-1 5% CO2 2.1x107 ± 1.5x10
5 (aa) 0.36 ± 0.04
(aa) 0.48 ± 0.003
(aa) 10.7 ± 0.02
(aa) 6.8
± 0.04
(aa)
CHLRN-1 N-P reduced 1.5x107 ± 3.2x10
5 (bd) 0.59 ± 0.02
(bd) 0.62 ± 0.004
(cd) 8.5 ± 0.11
(bc) 1.3
± 0.01
(dc)
N-P reduced 5% CO2 1.0x107 ± 1.6x10
6 (cb) 0.50 ± 0.04
(bb) 0.46 ± 0.005
(bb) 9.6 ± 0.93
(ba) 2.0
± 0.04
(ca)
ASM-1 3.1x107 ± 5.4x10
6 (ac) 0.69 ± 0.05
(ac) 1.03± 0.004
(ac) 10.5 ± 0.7
(ab) 3.2
± 0.04
(bb)
ASM-1 5% CO2 3.0x107 ± 4.3x10
6 (aa) 0.63 ± 0.13
(aa) 0.98 ± 0.003
(aa) 10.2 ± 0.2
(aa) 2.4
± 0.03
(aa)
Specific growth rate was obtained by linear regression from the logarithm of biomass dry weight (g L-1
) at the exponential growth phase.p-
80
Table 11 summarized the changes in lipid production during cultivation of
Ankistrodesmus sp. and Chlamydomonas sp. For Ankistrodesmus sp. the highest lipid
content of dry weight (25%) was observed in cultures N-P reduced and 5% CO2.
Although, under ASM-1 and 5% CO2 (nutrient replete conditions), lipid content of
Ankistrodesmus sp. biomass was improved in 24% from 0.07 to 0.11g L-1, at 99% of
confidence level. At this condition the lipid productivity was 57% higher than compared
with N-P reduced and 5% CO2 condition, showing an improvement of the lipid yield as
function of biomass increase, in opposition to the knowledge that microalgae growth
and increased oil yield are mutually exclusives.
Compared to cultures N-P reduced and 5% CO2, at ASM-1 and 5% CO2
Ankistrodesmus sp. showed a significant improvement of polyunsaturated fatty acids
(PUFAs) yield, from 39.3 to 50%. Similar proportions of saturated fatty acids (SFAs)
on average 27,6% were verified among the conditions tested. Except from a few
exceptions, CO2 has been demonstrate to be favorable for high accumulation of
polyunsaturated fatty acids (Zeng et al. 2011).
Chlamydomonas sp. showed that N-P reduced and 5% CO2 was the most
effective treatment to improve lipid productivity and FAMEs content (at 99% of
confidence level) varying from 10.5% and 0.07 g L-1
in ASM-1 to 35.3% and 0.10 g L-1
,
respectively, of biomass dry weight (Table 11) In opposition, ASM-1 and 5% CO2
cultures showed the lowest lipid productivity (7.34%) even though it has revealed the
highest yield of FAMEs in lipid content, 95.7%.
81
Table 11: Lipid crude extract, Lipid content (% of biomass dry weight), total FAMEs and percentage of saturated, monounsaturated and
polyunsaturated fatty acids regarding to the FAMEs content at 10th
day cultivation. The values are means of three independent experiments ± SD.
Strains Conditions
Lipid extract Lipid/dry weight FAMEs FAMEs/Lipid FAMEs/SFA FAMEs/MUFA FAMEs/PUFA
g L-1
% g L-1
% % % %
ANRF-1 N-P reduced 0.08 ± 0.02 (cc)
24.1 ± 0,01 (cc)
0.05 ± 0.001 (cc)
66.4 ± 0.02 (bd)
25.2 ± 3.7 (bb)
27.6 ± 4.6 (cb)
44.0 ± 3.8 (cc)
N-P reduced
5% CO2
0.07 ± 0.02 (cb)
25.0 ± 0.03 (ca)
0.05 ± 0.008 (ca)
67.7 ± 0.08 (bb)
28.5 ± 3.9 (ba)
28.9 ± 4.4 (ca)
39.3 ± 2.9 (cb)
ASM-1 0.07 ± 0.01 (bc)
17.7 ± 0,02 (bb)
0.02 ± 0.001 (bb)
44.1 ± 0.18 (ac)
29.1 ± 6.4 (ab)
31.4 ± 5.4 (bb)
37.6 ± 1.8 (bc)
ASM-1 5%
CO2
0.11 ± 0.05 (aa)
23.4 ± 0,01 (aa)
0.05 ± 0.005 (aa)
47.7 ± 0.04 (aa)
27.7 ± 1.2 (aa)
19.5 ± 0.9 (aa)
50.0 ± 1.4 (aa)
CHLRN-1 N-P reduced 0.15 ± 0.01 (cd)
23.8 ± 0.01 (dd)
0.10 ± 0.001 (bb)
68.4 ± 0.01 (cc)
34.3 ± 1.3 (bb)
28.9 ± 1.6 (bb)
33.9 ± 1.0 (bb)
N-P reduced
5% CO2
0.16 ± 0.02 (cb)
35.3 ± 0.01 (cb)
0.10 ± 0.001 (ba)
65.4 ± 0.08 (cb)
34.8 ± 2.4 (ba)
33.1 ± 4.3 (ba)
29.2 ± 4.5 (ba)
ASM-1 0.11 ± 0.01 (bc)
10.5 ± 0.01 (bc)
0.07 ± 0.002 (ab)
65.2 ± 0.18 (bc)
28.1 ± 7.2 (ab)
34.9 ± 1.8 (ab)
36.3 ± 3.8 (ab)
ASM-1 5%
CO2
0.07 ± 0.01 (aa)
7.34 ± 0.01 (aa)
0.06 ± 0.002 (aa)
95.7 ± 0.22 (aa)
33.7 ± 4.8 (aa)
25.9 ± 4.5 (aa)
36.5 ± 3.4 (aa)
82
The similar relative proportions of SFAs, MUFAs and PUFAs of
Chlamydomonas sp. among the conditions tested showing that the decrease and the
increase of fatty acids unsaturation are not rationalized in terms of adaptation to
growing conditions. It is hypothesized that the reduced concentration of nitrogen and
phosphorous promoted a reorganization of lipid metabolism in detriment of other lipid
compounds, since the relative proportion of fatty acids remained the same, without
major changes among the conditions tested. This view was supported by indings
observed by other studies as shown in Léveillé et al. (1997) and Harwood & Guschina
(2009).
Fatty acids analysis was conducted in order to investigate the potential
application of these organisms for biodiesel production and other relevant applications,
considering the potential for application in an integrated biorefinery concept. It was
observed a huge variety of fatty acids since from the most common components that
naturally occurring as to the minors and more exclusively components found in oil from
microalgae. Some of lipid compounds were not been identified with available standards.
Important notice that lignoceric acid (C24:0) verified on ester profile of the two studied
strains can be resulting of the disruption of cell wall indicating that the pretreatment
used to breaking cell wall before lipid extraction procedure was efficient (Breuer et al.
2013).
In Ankistrodesmus sp. the predominant fatty acids obtained were C18:3n-3
(alpha-linolenic acid) and C18:1n-9c (oleic acid 6), omega-3 and 9, respectively. C16:0
(palmitc acid) and C18:2n-6c (linoleic acid), commonly found in microalgae, oil plants
and animal tissues were also found in higher levels (Figura 13 A). Some esters were
better induced by nutrient reduction, especially C18:1n-9t (elaidic acid) fairly
widespread as minor component in microalgae oil. For this reason his commercial value
83
is quite elevate. Interestingly C20:0 (arachidic acid) and C22:0 (behenic acid) were
exclusively verified in conditions of ASM-1 with CO2 supplementation in opposition to
Kilham et al (Kilham S S et al. 1997) whose do not verified modifications in lipid
composition between phosphorus-limited, nitrogen-limited and non-limited cells.
For Chlamydomonas sp. the major fatty acids produced were found to be
C18:3n-3 (alpha-linolenic acid), C18:1n-9c, C16:0, C18:0 (stearic acid), C16:3n-3
Δ7,10,13 (hexadecatrienoic acid – HTA) and C18:2n-6c (Figura 13 B). Under
concentrations of nitrogen and phosphorous reduced fatty acids content differing
significantly from those obtained with ASM-1 medium, achieving 22.8% of biomass
produced. It was observed that CO2 supplementation responses by the occurrence of
C17:1 (cis-10-heptadecenoic acid) and C24:1 (nervonic acid), this second one an
elongation product of oleic acid. The profile identified was consistent with those
previously reported for Chlamydomonas reinhardtii wild-types by James et al.,
Merchant et al. and Siaut et al (James et al. 2011; Merchant et al. 2012; Siaut et al.
2011).
84
Figura 13: Esters profile of most representative FAMEs produced by Ankistrodesmus sp
(A) and Chlamydomonas sp (B) after 10 days of cultivation. * There was not identified
the position of the double bond, ** correspond to 16:3n-3 Δ4,7,10
and *** 16:3n-3 Δ7,10
,13. Data points are means of three independent experiments and error bars show
SD.
85
Fatty acid profiles are an important consideration for biodiesel production once
biodiesel properties and quality are inherent to the mixtures of fatty acids used (Hellier
& Ladommatos 2015; Xiao et al. 2000). MUFAs, such as C18:1 provides a reasonable
balance between cold flow, oxidative stability and combustion properties and are
therefore preferable to SFAs or PUFAs (Knothe 2005; Knothe & Steidley 2005). Some
proportion of PUFAs in a biodiesel feedstock can be beneficial to the flow properties
under cold conditions but under higher levels can impact negatively its oxidative
stability, leading to an increasing of production costs due to the need for anti-oxidant
fuel additives (Olmstead et al. 2013). On the other hand, the presence of SFAs improves
the combustion properties of the biodiesel but also give rise to cold flow problems that
limit its geographical market or year-round suitability (Jeong et al. 2008). Is evident the
difficulty in determine an ideal fatty acid profile for biodiesel production. However,
discussion of lipid accumulation pathway and their attributes can inform critical
decisions related to the selection of microalgae and culture processes for commercial
production. Further analysis of biodiesel quality produced from these raw materials and
their acceptance for industrial production becomes important.
3.3.4 Conclusion
Lipid productivity of Chlamydomonas sp. (CHLRN-1) and Ankistrodesmus sp
(ANRF-1) was better improved by N-P reduced and 5% CO2. In addition
Ankistrodesmus sp. showed that 5% CO2 supplementation is an efficient method for its
fatty acid improvement, for this reason could be taken in order to obtain higher lipid
productivity of this strain. The major fatty acids palmitc, oleic, linolenic and α linolênic
fatty acids were the same in both strains, indeed these fatty acids are specific
86
biomarkers of Chlorophycea class. The relative high proportions of omega-3 fatty acids
founded in lipid content of these two microalgae were quite relevant because could
increase process flexibility in a commercial scale, through the combination of biodiesel
and omega-3 production. We believe that our results will contribute to extending the
general knowledge on microalgae culturing and on the applicability of these strains to
produce lipids with biotechnological relevance.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES) for the scholarships. Thanks to Centro de
Pesquisas e Desenvolvimento Leopoldo A. Miguez de Mello for kindly giving in the
microalgae Chlamydomonas sp. (CHLRN-1). We would express our gratitude to
Mileane S. Busch for the technical assistance on GC-MS analysis.
87
4 Discussão geral
No Brasil e no mundo, a busca por segurança energética tem feito com que
centros de pesquisa empenhem-se na busca por fontes de energia alternativas ao
petróleo, procurando mitigar problemas econômicos, sociais e ambientais com especial
interesse no aproveitamento de microalgas devido a sua promissora capacidade de
crescimento e síntese de ácidos graxos. A utilização do meio de cultivo apropriado é de
grande importância para a viabilidade da produção de biodiesel por lipídeos oriundos do
metabolismo de microalgas, especialmente a otimização do meio de cultura,
considerando que além de conter os nutrientes necessários para a produção de biomassa
o meio também fornece condições para o acúmulo desses lipídeos. Contudo, o
crescimento celular e acúmulo de lipídeos seguem rotas metabólicas antagônicas e as
condições que favorecem o crescimento celular limitam a síntese lipídica, que alcança
seu potencial máximo em condições adversas ao crescimento de microalgas. É crescente
o número de trabalhos buscando alternativas para superar a limitação desse
antagonismo. Mas considerando que o preço final do biodiesel comercializado é baixo,
em comparação a outros produtos derivados de microalgas com alta pureza e utilizados
na produção de fármacos, esses esforços se concentram principalmente em alternativas
que não encareçam o custo de produção da biomassa de microalgas e de seus produtos.
Nesse sentido, a limitação e a redução da concentração de nitrato e fosfato no
meio de cultura são, talvez, as maneiras mais utilizadas para indução do acúmulo de
lipídeos em microalgas. Contudo, esta redução também acarreta um efeito inibitório do
crescimento celular, devido à escassez desses nutrientes no meio de cultivo,
necessitando que sejam estabelecidas concentrações e até mesmo estratégias de cultivo
que permitam a produção adequada de biomassa e também a produção de lipídeos.
88
A partir destas considerações, a otimização das concentrações de nitrato e
fosfato do meio de cultivo apresentadas neste trabalho procurou estabelecer as
concentrações destes nutrientes que favorecessem o acúmulo de lipídeos com o menor
comprometimento da produção de biomassa pelas linhagens estudadas.
A literatura sobre esse assunto é vasta, crescente e fornece informações que,
embora não possam ser extrapoladas para diferentes linhagens, contribuem para o
desenvolvimento de cultivos mais produtivos. Neste estudo a utilização de uma
metodologia fatorial, durante a investigação dos efeitos de diferentes concentrações de
nitrato, fosfato e cloreto de sódio sobre o crescimento e o acúmulo de lipídeos de
ANRF-1 e CHLRN-1, foi de grande importância para que se alcançassem melhores
condições para ambas as respostas, e, além de fornecer dados mais precisos, por
considerar o efeito sinérgico entre as variáveis testadas. Esta metodologia também
possibilitou a economia de tempo e recursos através do modelo gerado capaz de prever
um maior número de resultados a partir de um número menor de experimentos. Esta
ferramenta é, portanto, imprescindível para a otimização do meio de cultivo de
microalgas, cujo sucesso é dependente de um grande número de variáveis.
Através dos experimentos de otimização, buscou-se avaliar os efeitos gerados
pela combinação da limitação de nutrientes e do aumento da salinidade no acúmulo dos
lipídeos produzidos pelas microalgas testadas a fim de determinar a melhor condição
para este acúmulo. Porque assim como a limitação nutricional, a salinidade é um fator
altamente limitante do crescimento de algumas microalgas podendo levar ao acúmulo
de substâncias de reserva por esses organismos. Os resultados da otimização do meio
mostrou que a condição contendo 25% da concentração original de nitrato e fosfato do
meio ASM-1 foi a mais apropriada, resultando em valores de produtividade de biomassa
e rendimento lipídico na ordem de 23,0 g.L-1 e 31,4%, respectivamente, para ANRF-1,
89
e, 60 g.L-1
e 22.5%, respectivamente, para CHLRN-1. Para algumas linhagens de
microalgas, incluindo ANRF-1 e CHLRN-1, o aumento da salinidade atua como um
fator de estresse e de uma forma indireta repercute sob a produção e o acúmulo dos
lipídeos produzidos por esses organismos. Estes resultados também mostram que é
possível cultivar ambas as linhagens em meio de cultivo salobro, sem que isso interfira
negativamente sobre o crescimento ou no acúmulo de lipídeos por estas linhagens.
A partir desses primeiros resultados, duas estratégias de cultivo dirigidas ao
crescimento e ao acúmulo de lipídeos foram consideradas: a suplementação do meio de
cultivo com 5 % de CO2 e a redução em 75% da concentração original de nitrato e
fosfato do meio, respectivamente. O conceito por trás da estratégia de usar uma maior
concentração de CO2 para melhorar o desempenho da produtividade lipídica de
microalgas é simples e baseia-se na maximização das taxas de crescimento e da
conversão do CO2 em biomassa e compostos complexos que beneficiam a biomassa
produzida, tais como os lipídeos. Para entender o efeito dessas condições sobre o
crescimento e a produção de lipídeos pelas linhagens testadas, cultivos contendo altas
concentrações de nitrato e fosfato e cultivos sem a suplementação de CO2 foram
realizados, permitindo a comparação dos resultados enquanto utilizavam-se altas e
baixas concentrações de nitrato, fosfato e dióxido de carbono no meio.
Os resultados de crescimento da linhagem ANRF-1 mostraram que altas
concentrações de nitrato e fosfato com 5% de CO2 promoveram o maior crescimento e o
maior rendimento em peso seco da biomassa entre as condições testadas. Também foi
observado um aumento expressivo do acúmulo de lipídeos de ANRF-1 que resultou em
uma produtividade lipídica superior as das culturas cultivadas em meio com
concentrações de nitrato e fosfato reduzidas para 25% das concentrações originais do
meio ASM-1. O perfil lipídico de ANRF-1, em ambas as condições, foi constituído
90
majoritariamente por C16:0 (ácido palmítico), C18:1n-9c (ácido oleico), 18:2n-6c
(ácido linolênico) e C18:3n-3 (ácido α linolênico), um perfil considerado adequado
para a produção de biodiesel. Outro aspecto interessante do perfil lipídico de ANRF-1
refere-se à presença dos ácidos graxos saturados C20:0 (ácido araquídico) e C22:0
(ácido beênico),exclusivos dos cultivos realizados sob altas concentrações de nitrato e
fosfato e 5% CO2. Estes ácidos graxos são usados industrialmente para retardar a
evaporação de solventes e em óleos lubrificantes, o que pode ampliar o potencial de
aplicação de ANRF-1 para esta rota biotecnológica. Além de promover o aumento do
crescimento e do acúmulo de lipídeos, a suplementação das culturas com 5% de CO2
também resultou em um importante aumento na proporção relativa de ácidos graxos
poliinsaturados do total de ácidos graxos produzidos por ANRF-1, deixando evidente
que esta linhagem é capaz de utilizar efetivamente o CO2 para o crescimento e síntese
de lipídeos.
A linhagem CHLRN-1, embora também tenha alcançado maior crescimento
celular na condição de alta concentração de nitrato e fosfato, a suplementação de 5% de
CO2 não apresentou efeito importante sobre rendimento final do número de células ou
sobre o peso seco da biomassa nesta condição. A ausência de modificações no número
total de células e no peso seco da biomassa de Chlamydomonas reinhardtii entre os
cultivos aerados com ar atmosférico e os suplementados com 5% de CO2 também é
reportada por Gardner e colaboradores (2011). Duas possíveis explicações para a
ausência de modificações no rendimento final das culturas de CHLRN-1 suplementadas
com 5% de CO2 podem ser consideradas: o aumento em 5% da concentração de CO2
não foi suficiente para promover modificações no ritmo de crescimento da cultura e/ou
possivelmente as culturas estavam limitadas por algum outro fator importante para o
crescimento celular, como por exemplo o nitrogênio, um efeito comum dos cultivos
91
realizados em regime nutricional de batelada. Contudo, a comparação dos resultados de
crescimento entre as linhagens mostrou que CHLRN-1 apresentou um rendimento
celular final expressivamente maior do que obtido por ANRF-1.
Para CHLRN-1, a redução em 75% das concentrações de nitrato e fosfato do
meio sem a suplementação de CO2 mostrou-se a mais apropriada para obtenção de
maior produtividade lipídica por esta linhagem. O aumento de 5% da concentração de
CO2 associado a redução das concentrações de nitrato e fosfato mostrou um efeito
inibitório no crescimento celular e uma diminuição do acúmulo de lipídeos nesta
condição, sendo, portanto, não recomendada a sua aplicação para o cultivo desta
linhagem. O perfil de ácidos graxos produzidos por CHLRN-1 quando cultivada sob
concentrações de nitrato e fosfato reduzidas foi majoritariamente constituído por C16:0
(ácido palmítico), C18:1n-9c (ácido oleico), 18:2n-6c (ácido linolênico) e C18:3n-3
(ácido α linolênico), como o de ANRF-1, igualmente interessante para a produção de
biodiesel. Esta condição também responde, pela ocorrência do ácido graxo C16:3n-3
Δ4,7,10, um ácido graxo da família dos Ω3 gerado pela conversão de C16:1 (ácido
palmitoleico) através da reação de desaturação do tipo Δ12.
Ainda existem desafios a serem enfrentados antes que a produção de microalgas
para produção de biodiesel possa ser viabilizada ampliada em escalas comerciais.
Contudo, as microalgas tem-se mostrado uma excelente matéria-prima para obtenção de
diversos compostos de interesse comercial. Os lipídeos produzidos pelas microalgas têm
se consolidado como matéria-prima para vários setores da indústria de transformação e
no desenvolvimento de tecnologias limpas, devido às suas propriedades
biotecnológicas, podendo atuar na biorremediação de metais pesados bem como na
biofixação de nitrogênio e fósforo. Isto confere uma possibilidade de aplicação
comercial em múltiplas áreas, como tratamento de águas residuais, produção de energia
92
e obtenção de lipídeos de alto valor agregado. Os resultados encontrados nesse estudo
confirmam que as linhagens ANRF-1 e CHLRN-1 possuem perfil lipídico promissor
não apenas para a indústria de biocombustíveis, mas também para as indústrias de
fármacos e alimentícia, pois possuem alta variedade de ácidos graxos poliinsaturados
das famílias Ω3 e 6, constituindo uma alternativa para viabilizar a produção de biodiesel
de microalgas através da integração de biotecnologias para obtenção de produtos
intermediários e finais a partir de microalgas.
93
5 Conclusões
A otimização do meio de cultivo foi obtida com uma redução de 75% das
concentrações originais de nitrato e fosfato do meio ASM-1.
Ambas as linhagens estudadas mostraram-se aptas para o cultivo em meio
salobro contendo 0,5g L-1 de NaCl.
ANRF-1 alcançou um expressivo aumento na produção de biomassa e no
rendimento lipídico quando cultivada em meio ASM-1 suplementado com 5%
de CO2, demonstrando um importante potencial para a mitigação de CO2
proveniente de gases de combustão.
Para CHLRN-1 a condição de nitrato e fosfato reduzido mostrou-se a mais
adequada em termos de produtividade lipídica.
As diferenças entre as linhagens ANRF-1 e CHLRN-1 demonstraram que as
respostas ao aumento da concentração de CO2 no meio de cultivo são espécie-
específica, sendo necessária uma investigação mais aprofundada da influência
desse fator na fisiologia das microalgas, com especial atenção para o
crescimento, mecanismos de concentração de carbono e sobre a eficiência no
uso dos nutrientes pelas linhagens de interesse.
Apesar do atual cenário de alto custo de produção, que pode restringir o seu uso,
e da clara necessidade de mais investimentos em P&D nesta área, a utilização de
microalgas para a produção de biodiesel apresenta um potencial único de uso,
especialmente na perspectiva integrada de uma biorrefinaria, devido às múltiplas
aplicações de sua biomassa e da alta qualidade dos lipídeos produzidos.
94
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109
7 ANEXO I – COMUNICAÇÕES CIENTÍFICAS
7.1 Artigos publicados
- Miranda, C.T., Pinto, R.F., de Lima, D.V.N., Viegas, C.V., da Costa, S.M. and
Azevedo, S.M.F.O. (2015). Microalgae Lipid and Biodiesel Production: A Brazilian
Challenge. American Journal of Plant Sciences, 6, 2522-2533.
http://dx.doi.org/10.4236/ajps.2015.615254
- Miranda, C.T., de Lima, D.V.N., Atella, G.C., de Aguiar, P.F.and Azevedo, S.M.F.O.
(2016) Optimization of Nitrogen, Phosphorus and Salt for Lipid Accumulation of
Microalgae: Towards the Viability of Microalgae Biodiesel. Natural Science , 8, 557-
573. http://dx.doi.org/10.4236/ns.2016.812055
7.2 Resumos publicados em congressos
- Some aspects of microalgae oil production. V Workshop on Pollutants in the
Environment. Rio de Janeiro, 2013.
- Avaliação da produção de lipídeos em três linhagens de clorofíceas submetidas a
diferentes condições nutricionais visando à produção de biodiesel. IV Latin American
Congress of Algae Biotechnology & Workshop of the National Network of Marine
Algae Biotechnology. Florianópolis, 2013.
- Avaliação do aumento temporal da exposição à alta intensidade luminosa sob o
crescimento e produção de lipídeos por Ankistrodesmus sp. e Scenedesmus sp. IV Latin
American Congress of Algae Biotechnology & Workshop of the National Network of
Marine Algae Biotechnology. Florianópolis, 2013.
110
- Variação das condições nutricionais para otimização da produção de lipídeos por
Ankistrodesmus sp. (Chlorophyceae). IV Latin American Congress of Algae
Biotechnology & Workshop of the National Network of Marine Algae Biotechnology.
Florianópolis, 2013.
7.3 Palestras
- Microalgas: Matéria prima para produção de biocombustíveis de 3ª geração. A
presentada na Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). Rio de Janeiro, 2013.
- Microalgas: Energia, a estrela do tema. Apresentada na Universidade do Grande Rio
(UNIGRANRIO), Rio de Janeiro, 2013.
- Aspectos fisiológicos e potencial biotecnológico das microalgas. Apresentada na
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Rio de Janeiro, 2013.
111
8 ANEXO II – COORIENTAÇÃO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
1- Daniel Vinícius Neves de Lima (2011-2015): Avaliação do aumento temporal da
exposição à alta intensidade luminosa sob o crescimento e produção de lipídeos por
Ankistrodesmus sp. e Scenedesmus sp.
