Www.uricer.edu.Br Eal Hp DissertPDF Turma2004 DissertThaisFontoura2006

URI CAMPUS DE ERECHIM DEPARTAMENTO DE CINCIAS AGRRIAS

PROGRAMA DE MESTRADO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS

Produo de lipases por fermentao em estado slido e fermentao submersa utilizando Penicillium verrucosum como microrganismo

Thas da Luz Fontoura Pinheiro

Dissertao de Mestrado submetida ao Programa de Mestrado em Engenharia de Alimentos da URI-Campus de Erechim, como requisito parcial obteno do grau de Mestre em Engenharia de Alimentos, rea de concentrao: Engenharia de Alimentos, da Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Misses URI - Campus de Erechim.

ERECHIM, RS BRASIL MARO DE 2006

ii

Dedico esta conquista ao meu grande amor Daniel, pela sua compreenso, incentivo e todas

as alegrias que sempre me deu.

iii

AGRADECIMENTOS

A Deus pelo amparo constante. Aos meus pais, Odete e Edina, pelo incentivo e amor demonstrados em

todos os momentos. s minhas irms, Angelita e Marta, e madrinha Celi por todo o apoio que

me deram. s minhas orientadoras, Prof. Dbora de Oliveira e Prof. Helen Treichel,

pela oportunidade de realizar este trabalho, pelo imenso aprendizado durante o trabalho de pesquisa, pela pacincia e rigor com os meus erros, pelo carinho e compreenso, e tambm pelos conselhos dispensados em um perodo difcil da minha vida.

Ao Prof. Marco Di Luccio por todas as contribuies a este trabalho e minha formao e por ter me ajudado a chegar at aqui.

Prof. Francine Padilha e Prof. Rogrio Cansian por toda a ateno dispensada e por todo o conhecimento que me transmitiram.

Prof. Denise Freire por ter cedido o fungo Penicillium verrucosum para o desenvolvimento desta pesquisa.

Aos amigos da Central de Materiais por me auxiliarem sempre que necessrio.

s colegas Ndia e Aniela pelo desenvolvimento de parte do trabalho e por terem me ensinado muito sobre fermentao.

minha querida Geciane, pelo carinho que me recebeu e por todo o conhecimento que me transmitiu.

inesquecvel J, pelas palavras de incentivo e ombro amigo sempre oferecido nas horas em que eu mais precisava.

bolsista Natlia, pela colaborao com este trabalho e pela disponibilidade em me ajudar.

Ao Lindomar, por toda a contribuio tcnica que deu esta dissertao. s queridas colegas Patrcia e Stephani, pela amizade, companheirismo e

pelo apoio emocional e tcnico concedido durante todo este perodo.

iv

querida amiga Silvana, por ter contribudo enormemente com este trabalho, compartilhando interesses, atividades, preocupaes e alegrias.

Aos demais colegas e amigos do Curso de Mestrado em Engenharia de Alimentos da URI-Campus de Erechim e do Laboratrio de Biotecnologia de Alimentos, pelos momentos de alegria e descontrao, e pelas experincias compartilhadas.

grande amiga Potira, pela amizade e pelo auxlio prestado durante momentos difceis.

URI-Campus de Erechim e ao Departamento de Engenharia de Alimentos pelo apoio no desenvolvimento do projeto e por possibilitarem a minha formao.

v

SUMRIO

RESUMO ...............................................................................................................xiii ABSTRACT............................................................................................................xiv 1 INTRODUO....................................................................................................1 2 REVISO BIBLIOGRFICA...............................................................................4

2.1 Definio de lipases........................................................................................4 2.2 Fontes de lipases............................................................................................5 2.3 Vantagens e aplicaes das lipases microbianas...........................................5

2.3.1 Indstria de alimentos...............................................................................7 2.3.2 Indstria oleoqumica................................................................................7 2.3.3 Indstria de detergentes...........................................................................8 2.3.4 Indstria farmacutica..............................................................................8 2.3.5 Tratamento de efluentes..........................................................................9

2.4 Produo de lipases microbianas.................................................................10 2.5 Formas de produo de lipases....................................................................13

2.5.1 Fermentao em estado slido..............................................................13 2.5.2 Fermentao submersa..........................................................................19

2.6 Caracterizao de lipases.............................................................................22 2.7 Consideraes finais.....................................................................................23

3 MATERIAL E MTODOS..................................................................................24 3.1 Materiais........................................................................................................24 3.1.1 Reagentes e meios de cultura.................................................................24 3.1.2 Equipamentos..........................................................................................24

3.2 Mtodos.......................................................................................................25 3.2.1 Fermentao em Estado Slido............................................................ 26

3.2.1.1 Microrganismo............................................................................... 26 3.2.1.2 Inculo............................................................................................26 3.2.1.3 Preparo dos meios de cultivo.........................................................27 3.2.1.4 Preparo das amostras....................................................................27 3.2.1.5 Mtodos Analticos.........................................................................28

vi

3.2.1.6 Estudo da produo de lipases......................................................31 3.2.1.7 Caracterizao da lipase obtida por fermentao em estado

slido..............................................................................................35 3.2.2 Fermentao Submersa.........................................................................36

3.2.2.1 Microrganismo................................................................................36 3.2.2.2 Inculo............................................................................................36 3.2.2.3 Preparo dos meios de cultivo.........................................................37 3.2.2.4 Preparo das amostras....................................................................37 3.2.2.5 Mtodos Analticos.........................................................................37 3.2.2.6 Estudo da produo de lipases......................................................40 3.2.2.7 Caracterizao das lipase obtida por fermentao

submersa........................................................................................43 4 RESULTADOS E DISCUSSO. ......... ............................................................44

4.1 Caracterizao dos substratos e indutores..................................................44 4.2 Fermentao em Estado Slido...................................................................45

4.2.1 Estudo do indutor........ ...........................................................................45 4.2.2 Estudo do inculo ideal...........................................................................48 4.2.3 Avaliao da concentrao de suplemento na produo de lipases por

fermentao em estado slido............................................................... 49 4.2.4 Otimizao da produo de lipase por fermentao em estado

slido......................................................................................................51 4.2.5 Cintica de produo de lipase para a condio otimizada...................54 4.2.5.1 Avaliao dos parmetros cinticos.................................................56 4.2.6 Caracterizao parcial da lipase produzida por fermentao em estado

slido......................................................................................................57 4.2.6.1 Temperatura e pH timos...............................................................58 4.2.6.2 Temperatura de estabilidade..........................................................60 4.2.6.3 Influncia do pH no estudo da estabilidade da lipase................... 63

4.2.7 Consideraes finais............................................................................. 64 4.3 Fermentao Submersa...............................................................................65

4.3.1 Estudo do indutor....................................................................................65

vii

4.3.1.1 Produo de Biomassa...................................................................68 4.3.2 Otimizao da produo de lipase por fermentao

submersa................................................................................................69 4.3.2.1 Meio Sinttico.................................................................................69 4.3.2.2 Meio Industrial................................................................................76

4.3.3 Caracterizao parcial da lipase obtida por fermentao submersa................................................................................................84

4.3.3.1 Meio Sinttico.................................................................................84 4.3.3.2 Meio Industrial................................................................................88

4.3.4 Consideraes finais..............................................................................90 5 CONCLUSES E SUGESTES.......................................................................91

5.1 Concluses..................................................................................................91 5.2 Sugestes para trabalhos futuros................................................................92

6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.................................................................94 7 ANEXO I..........................................................................................................106

viii

NDICE DE TABELAS

Tabela 2.1. Principais aplicaes da FES na indstria alimentcia.........................17

Tabela 3.1. Componentes dos meios de cultura e principais reagentes utilizados.. .....................................................................................................................25

Tabela 3.2. Variveis e nveis estudados no planejamento de experimentos 22 para otimizao das condies de processo por FES.................................33

Tabela 3.3. Variveis e nveis estudados no planejamento fatorial completo 22 para temperatura e pH timos da enzima obtida por FES...........................36

Tabela 3.4. Variveis e nveis estudados no planejamento experimental PB de 12 ensaios mais 3 pontos centrais para produo de lipases por FS em meio sinttico........................................................................................................41

Tabela 3.5. Variveis e nveis estudados no planejamento fatorial completo 22 para o meio de cultura sinttico por FS................................................................42

Tabela 3.6. Variveis e nveis estudados no planejamento experimental PB de 12 ensaios mais 3 pontos centrais para produo de lipases por FS em meio industrial.......................................................................................................42

Tabela 3.7. Variveis e nveis estudados no planejamento fatorial completo 23 para o meio de cultura industrial por FS...... ......................................................43

Tabela 3.8. Variveis e nveis estudados no planejamento fatorial completo 22 para temperatura e pH timos da enzima obtida por FS.....................................43

Tabela 4.1. Caracterizao dos substratos e indutores..........................................44 Tabela 4.2. Indutores estudados para produo de lipases por FES e suas

respectivas atividades enzimticas..............................................................46 Tabela 4.3. Anlise estatstica (Teste de Tukey) dos melhores resultados

obtidos..........................................................................................................47 Tabela 4.4. Resultados do estudo cintico para a atividade lipsica em meio basal

e PDA...........................................................................................................48

ix

Tabela 4.5. Matriz do planejamento experimental realizado (valores codificados e reais com as respostas da atividade lipsica) para produo de lipases por FES..............................................................................................................51

Tabela 4.6. Anlise de varincia para a atividade lipsica por FES.......................52 Tabela 4.7. Parmetros cinticos para produo de lipase por FES utilizando

Penicillium verrucosum...............................................................................57 Tabela 4.8. Matriz do planejamento experimental completo para avaliao da

temperatura e pH timos (valores codificados e reais) com as respostas da atividade de lipase por FES.........................................................................59

Tabela 4.9. Anlise de varincia para a atividade lipsica.....................................59 Tabela 4.10. Acompanhamento da atividade lipsica no extrato concentrado obtido

por FES sob a temperatura de 25C...... ....................................................61 Tabela 4.11. Acompanhamento da atividade lipsica no extrato concentrado obtido

por FES sob a temperatura de 35C............................................................61 Tabela 4.12. Acompanhamento da atividade lipsica no extrato concentrado obtido



por FES sob a temperatura de 65C............................................................62 Tabela 4.15. Valores das atividades enzimticas versus os valores de pH

estudados em FES.......................................................................................63 Tabela 4.16. Indutores estudados e suas respectivas atividades lipsicas em

FS.................................................................................................................65 Tabela 4.17. Teste de indutores para produo de lipases por FS

.....................................................................................................................67 Tabela 4.18. Produo de biomassa em funo dos indutores utilizados em

FS.................................................................................................................68 Tabela 4.19. Matriz do planejamento experimental PB de 12 ensaios mais 3

pontos centrais (valores codificados e reais) com as respostas da atividade lipsica no decorrer da FS utilizando meio sinttico.................................. 70

x

Tabela 4.20. Matriz do planejamento fatorial 22 (valores codificados e reais) com as respostas da atividade de lipase no decorrer da FS utilizando meio sinttico........................................................................................................73

Tabela 4.21. Matriz do planejamento experimental PB de 12 ensaios mais 3 pontos centrais (valores codificados e reais) com as respostas da atividade lipsica no decorrer da FS utilizando meio industrial...................................77

Tabela 4.22. Matriz do planejamento fatorial 23 com as respostas de atividade lipsica no decorrer da FS utilizando meio industrial...................................80

Tabela 4.23. Matriz do planejamento experimental completo para avaliao da temperatura e pH timos (valores codificados e reais) com as respostas da atividade de lipase por FS em meio sinttico...............................................85

Tabela 4.24. Anlise de varincia para a atividade lipsica por FS.......................86 Tabela 4.25. Matriz do planejamento experimental completo para avaliao da

temperatura e pH timos (valores codificados e reais) com as respostas da atividade de lipase por FS em meio industrial.............................................88

xi

NDICE DE FIGURAS

Figura 2.1. Caractersticas do fungo Penicillium verrucosum.................................11

Figura 3.1. Bqueres utilizados para a FES...........................................................27 Figura 3.2. Curvas de ajuste dos resultados de uma experincia idealizada de

fermentao.................................................................................................34

Figura 4.1. Atividade lipsica em 48 horas de fermentao para os diversos indutores estudados por FES.......................................................................47

Figura 4.2. Cintica de produo de lipase em meio basal e PDA.........................49 Figura 4.3. Curvas cinticas de atividade lipsica em funo da concentrao de

leo de soja por FES....................................................................................50 Figura 4.4. Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica

obtida por FES.............................................................................................53 Figura 4.5 Cintica de produo de lipase, protease e crescimento celular

(glicosamina) por FES..................................................................................55 Figura 4.6. Evoluo do pH e atividade protesica ao longo da

FES..............................................................................................................56 Figura 4.7. Atividade lipsica obtida por FES em funo da temperatura e

pH.................................................................................................................60 Figura 4.8. Grfico normalizado da atividade lipsica em funo do tempo e da

temperatura de exposio por FES.............................................................63 Figura 4.9. Atividade lipsica em funo do tempo e do pH de extrao da enzima

por FES........................................................................................................64 Figura 4.10. Atividade lipsica em 48 horas de fermentao para os diversos

indutores estudados em FS.........................................................................66 Figura 4.11. Perfil da atividade lipsica utilizando diferentes indutores por

FS.................................................................................................................67 Figura 4.12. Cintica de FS para produo de lipases utilizando meio sinttico:

Planejamento experimental PB...................................................................71

xii

Figura 4.13. Grfico de Pareto da produo de lipases por FS utilizando meio sinttico em funo das variveis independentes estudadas: Planejamento experimental PB..........................................................................................72

Figura 4.14. Cintica de FS para produo de lipases utilizando meio sinttico: Planejamento fatorial 22...............................................................................74

Figura 4.15. Grfico de Pareto para produo de lipases por FS utilizando meio sinttico em funo das variveis independentes estudadas em 96 horas de fermentao: Planejamento fatorial 22.........................................................74

Figura 4.16. Cintica de produo de lipase e crescimento celular (peso seco) na melhor condio experimental utilizando meio sinttico por FS.................................................................................................................75

Figura 4.17. Perfil da FS para produo de lipases utilizando meio industrial: Planejamento experimental PB....................................................................78

Figura 4.18. Grfico de Pareto para produo de lipases por FS utilizando meio industrial: Planejamento experimental PB...................................................79

Figura 4.19. Perfil da FS para produo de lipases utilizando meio industrial: Planejamento fatorial 23...............................................................................81

Figura 4.20. Grfico de Pareto para produo de lipases por FS utilizando meio industrial: Planejamento fatorial 23...............................................................82

Figura 4.21. Cintica de produo de lipase e crescimento celular (peso seco) na melhor condio experimental utilizando meio industrial por FS.................83

Figura 4.22. Superfcie de resposta e curva de contorno para a atividade enzimtica em funo da temperatura e pH por FS....................................87

Figura 4.23. Grfico de Pareto para determinao da temperatura e pH timos da atividade lipsica obtida por FS em meio industrial.....................................89

xiii

RESUMO

Produo de lipases por fermentao em estado slido e fermentao submersa utilizando Penicillium verrucosum como microrganismo

Thas da Luz Fontoura Pinheiro Maro/2006

Orientadoras: Dbora de Oliveira e Helen Treichel

O crescente interesse na produo de lipases est especialmente relacionado ao grande potencial biotecnolgico que estas enzimas apresentam. No entanto, os altos custos de produo destes biocatalisadores restringem, muitas vezes, sua utilizao. A aplicao de subprodutos agroindustriais como substrato na produo de lipases, alm de agregar valor a materiais de baixo custo no mercado, pode vir a reduzir em muito o preo final da enzima. Neste trabalho investigou-se a produo de lipases por Penicillium verrucosum por fermentao em estado slido utilizando farelo de soja como substrato slido e por fermentao submersa fazendo uso de meios sinttico e industrial. Avaliou-se o efeito de algumas variveis de processo e diferentes suplementaes do meio sobre a produo de lipases em escala de bancada, utilizando a tcnica de planejamento de experimentos e anlise de superfcie de resposta, visando obter condies que maximizem a produo da enzima. Observou-se que o fungo Penicilllium verrucosum apresentou um bom desempenho na produo da enzima por fermentao em estado slido, permitindo-se obter altos valores de atividade lipsica, 40 U/g em 48 horas de fermentao e 52 U/g em 72 horas de fermentao nas condies operacionais otimizadas (T= 27,5oC e U= 55%). A enzima bruta obtida por FES apresentou condies timas de atividade a 30C em pH 7,0 e manteve-se estvel a 35C em valores de pH entre 6,0 e 7,0. A produo da enzima por fermentao submersa apresentou valores de 3,15U/mL em 96 horas de fermentao no meio sinttico e de 2,22 U/mL em 72 horas de fermentao no meio industrial. A enzima obtida por meio sinttico apresentou as faixas de temperatura e pH timos de 29C a 32C, 40C a 45C e 7,0 a 8,5 respectivamente; e a lipase obtida por meio industrial apresentou a faixa de temperatura de 30C a 40C e pH entre 5,0 e 9,0 como valores timos.

xiv

ABSTRACT

Lipase production by solid state fermentation and submerged fermentation using Penicillium verrucosum

Thas da Luz Fontoura Pinheiro Maro/2006

Advisors: Dbora de Oliveira e Helen Treichel

The growing interest in lipase production is especially related to the great biotechnogical potential that these enzymes present. However, the high production costs of these biocatalysts many times restrict their use. The application of agro industrial by-products as substrate in lipase production, besides joining value to low cost materials in the market, can reduce the final price of the enzyme. In this work, lipase production was investigated, using Penicillium verrucosum and solid state fermentation of soy bran as substrate and by submerged fermentation using a synthetic and an industrial medium. The effects of some process variables and different media supplementations on lipase production were evaluated in laboratory scale, using the experimental design technique and response surface analysis, in order to obtain the conditions that maximize the production of the enzyme. The Penicilllium verrucosum presented a good performance in the enzyme production by solid state fermentation, yielding high values of lipase activity, 40 U/g in 48 hours of fermentation and 52 U/g in 72 hours of fermentation in the optimized operational conditions (T=27,5oC and U=55%). The crude enzymatic extract presented optimum pH and temperature of 7.0 and 30C, respectively, and stayed stable at temperature of 35C in pH values between 6.0 and 7.0. The enzyme production by submerged fermentation presented lipase activity of 3.15 U/mL in 96 hours of fermentation in the synthetic media and 2.22 U/mL in 72 hours of fermentation in the industrial media. The enzymatic extract obtained using synthetic medium showed optimum temperature and pH of 29C to 32C, 40C to 45C and 7,0 to 8,5, respectively; and the lipase obtained using industrial medium presented the strip of temperature from 30C to 40C and pH between 5,0 and 9,0 as optimum.

Captulo 1 Introduo

1

1 INTRODUO

As lipases so enzimas pertencentes famlia das hidrolases que tm como funo biolgica primordial catalisar a hidrlise de triacilgliceris insolveis para gerar cidos graxos livres, mono e diacilgliceris e glicerol. Alm de sua funo natural, as lipases podem catalisar reaes de esterificao, interesterificao e transesterificao em meio no-aquoso (Houde et al., 2004; Freire, 1996). Lipases microbianas so biocatalisadores de grande valor, devido principalmente a caractersticas como: ao sob condies amenas, estabilidade em solventes orgnicos, especificidade ao substrato e rgio enncio seletividade. (Snellman et al., 2002).

Recentemente, as lipases assumiram um lugar de destaque no mercado mundial das enzimas, evidenciado pelo aumento da quantidade de informao reportada na literatura, o que reflete uma mdia de 1000 publicaes por ano. Depois das proteases e amilases, as lipases so consideradas como o terceiro grande grupo em volume de vendas, movimentando bilhes de dlares. Essa conquista se deve tanto pela sua versatilidade de aplicao quanto pela relativa facilidade de produo em massa, tornando-as especialmente atrativas para aplicaes industriais (Hasan et al., 2006; Jaeger e Reetz, 1998; Freire, 1996). O potencial de aplicaes industriais que as lipases possuem abrange a indstria de alimentos como aditivos (modificao de aromas), qumica fina (sntese de steres), detergentes (hidrlise de gorduras), tratamento de efluentes (decomposio e remoo de substncias oleosas), couro (remoo de lipdios das peles dos animais), farmacutica e a rea mdica (remdios, digestivos e enzimas para diagnsticos) (Burkert, 2002; Burkert et al., 2004). No entanto, os altos custos de produo destes biocatalisadores restringem, muitas vezes, sua utilizao (Freire, 1996). A produo de lipases pode ser realizada por fermentao submersa (FS) ou por fermentao em estado slido (FES). O primeiro processo utiliza um meio de cultura lquido, sendo este o mais utilizado e descrito em maior nmero de trabalhos com maiores detalhes (Martins, 2001); j o segundo, baseia-se na

Captulo 1 Introduo

2

utilizao de substratos slidos com baixas porcentagens de gua em sua composio (Alonso, 2001). Por estes substratos poderem oferecer suporte nutricional e de crescimento ao microrganismo, a FES apresenta-se como um processo mais vantajoso em relao fermentao submersa, alm de fornecer, em geral, altos rendimentos e facilidade na recuperao dos produtos (Sharma et al., 2001). A utilizao de subprodutos agroindustriais como substrato na produo de lipases, alm de agregar valor a materiais de baixo custo no mercado, pode vir a reduzir em muito o preo final da enzima, sendo que a aplicao da fermentao em estado slido em muitos casos diminui consideravelmente os custos do processo, quando comparada fermentao submersa (Castilho et al., 2000a). Assim, estudos sobre a utilizao de diferentes microrganismos, suplementos e substratos para a produo de lipases em meio lquido e meio slido podem contribuir no sentido de encontrar combinaes ideais para se obter lipases com altos rendimentos, utilizando substratos e condies operacionais que possibilitem a reduo dos custos do processo de produo em escala industrial (Vargas, 2004). Com base nestes aspectos, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a produo de lipases por fermentao submersa e fermentao em estado slido utilizando Penicillium verrucosum como microrganismo. Como objetivos especficos pode-se citar: avaliao de diferentes meios e suplementaes visando obter condies que maximizassem a produo da enzima e a caracterizao da enzima bruta. Investigou-se o efeito de algumas variveis de processo e diferentes suplementaes em escala de bancada, utilizando a tcnica de planejamento de experimentos e anlise de superfcie de resposta. A caracterizao da enzima bruta proveniente da fermentao em estado slido e submersa foi realizada quanto ao pH timo e de estabilidade e a temperatura tima e de estabilidade, no intuito de conhecer algumas propriedades das lipases obtidas. Como forma de apresentao, o presente trabalho foi dividido em captulos, os quais contemplam uma reviso da literatura buscando inserir o trabalho

Captulo 1 Introduo

3

desenvolvido, embasando-o teoricamente (Captulo 2). O Captulo 3 apresenta os materiais e metodologias empregadas para o desenvolvimento de todas as etapas do trabalho. No Captulo 4 so apresentados e discutidos os resultados obtidos para a produo de lipases por fermentao em estado slido e fermentao submersa utilizando Penicillium verrucosum e o Captulo 5, como forma de fechamento do trabalho, apresenta as concluses e sugestes para a continuidade do mesmo.

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica

4

2 REVISO BIBLIOGRFICA

Neste captulo ser apresentada uma abordagem sobre lipases, dando nfase especial s formas de produo, foco principal deste trabalho, contextualizando com dados e informaes reportadas na literatura.

2.1 DEFINIO DE LIPASES

As lipases so enzimas classificadas como hidrolases e atuam sobre ligaes ster presentes em acilgliceris, liberando cidos graxos e glicerol, constituindo uma classe especial de esterases (Jaeger e Reetz, 1998). A caracterstica de atuao em uma interface entre a fase aquosa e no-aquosa as distingue das esterases (Pandey et al., 2000).

Lipases catalisam reaes de substratos insolveis em gua (Alvarez-Macarie et al., 1999) e a hidrlise de acilgliceris para cidos graxos, diacilgliceris, monoacilgliceris e glicerol (Mahadik et al., 2002). Sob certas condies, elas tambm catalisam reaes de esterificaes, transesterificaes (acidlise, interesterificao, alcolise), aminlise e tiotransesterificao em solvente orgnico anidro, sistema bifsico e em soluo micelar com alta especificidade. O deslocamento do equilbrio na reao, no sentido direto (hidrlise) ou inverso (sntese), controlado pela quantidade de gua presente na mistura reacional (Pandey et al., 1999; Gandhi, 1997).

As lipases geralmente no requerem cofatores, atuam em uma ampla faixa de pH, so relativamente estveis a altas temperaturas, apresentam especificidade, regiosseletividade, quimiosseletividade e enncio-seletividade (Pandey et al., 1999; Gandhi, 1997).

Pesquisas relacionadas s lipases tm aumentado devido gama de possveis aplicaes prticas que possuem a nvel industrial. Estas enzimas tm sido utilizadas na hidrlise de gorduras, produo de cidos graxos e aditivos de


5

alimentos, sntese de steres e peptdeos, resoluo de misturas racmicas ou adio em detergentes (Maleata, 1996).

2.2 FONTES DE LIPASES

Tradicionalmente, as lipases eram obtidas do pncreas de animais. A descoberta foi feita por Claude Bernard, em 1856 e anos mais tarde, aumentou o interesse pelas lipases microbianas devido s dificuldades de acesso ao material de origem animal (Hasan et al., 2006).

As lipases so originrias de grande nmero de bactrias, fungos, plantas e animais, tendo suas propriedades variveis de acordo com sua procedncia. (Saxena et al., 2003). Particularmente, as enzimas microbianas so mais estveis que as extradas de plantas e animais, tornando sua produo mais conveniente e segura (Hasan et al., 2006).

As lipases provenientes de microrganismos constituem um grupo de valiosas enzimas de aplicao biotecnolgica, devido principalmente versatilidade de suas propriedades, no que se refere atuao enzimtica e especificidade ao substrato, e facilidade de produo em massa, sendo um dos grupos mais utilizados no segmento industrial (Hasan et al., 2006).

2.3 VANTAGENS E APLICAES DAS LIPASES MICROBIANAS

O uso de enzimas nas indstrias permite o desenvolvimento de processos tecnolgicos muito prximos aos eficientes processos executados pela natureza (Hasan et al., 2006).

Em funo da busca de novas fontes de enzimas, o interesse por microrganismos tem crescido muito nos ltimos anos. Existe um grande apelo econmico pelas lipases microbianas, j que a maioria destas enzimas


6

extracelular e, desta forma, os processos de produo e processamento das enzimas, com suas etapas de purificao, tm custo diminudo (Alonso, 2001).

Nos ltimos anos, devido a sua excelente capacidade rgio enncio seletiva numa variedade de solventes orgnicos e substratos, lipases tm emergido como um importante biocatalisador em aplicaes biomdicas (Pandey et al., 1999). Para sua utilizao na indstria biomdica e farmacutica, as lipases necessitam de um alto grau de pureza com propriedades especficas, sendo ento indispensvel o conhecimento de propriedades relacionadas ao substrato e parmetros do processo (pH, temperatura, etc.) (Benjamin e Pandey, 2000).

A versatilidade das lipases fazem com que estas possuam um vasto potencial de aplicao em alimentos, detergentes, farmacutica, couro, txtil, cosmtica e indstria papeleira (Houde et al., 2004). Alm disso, a utilizao de lipases pelas indstrias apresenta vantagens como: estabilidade a altas temperaturas e amplas faixas de pH, facilidade de separao dos produtos e, quando imobilizadas, podem ser submetidas s condies industriais tpicas, com reatores com temperaturas superiores a 70C por longos perodos de tempo (Hasan et al., 2006). As lipases tm sido investigadas extensivamente como alternativas de rotas para novas biotransformaes; centenas de snteses bio-orgnicas usando lipases tm sido descritas recentemente; a diversidade das aplicaes industriais gerais e propostas excede em muito as aplicaes de outras hidrolases (Alonso, 2001). Atualmente, as lipases so aplicadas em escala industrial, na produo de alimentos, detergentes, cosmtica e farmacutica (Jaeger e Reetz, 1998) e representam um mercado com grande potencial de crescimento (Alonso, 2001). Apesar de existirem diversas lipases sendo produzidas em larga escala e aplicadas comercialmente, a plena utilizao industrial destas enzimas passa necessariamente pela reduo de custos de produo. Isso poder ser alcanado atravs da seleo de novos microrganismos produtores, de melhoramento gentico, de modificaes no meio de cultura e de otimizao das condies de cultivo e dos sistemas de produo (Gutarra, 2003).


7

Nos itens a seguir sero apresentados alguns exemplos de aplicaes industriais das lipases.

2.3.1 INDSTRIA DE ALIMENTOS As lipases microbianas tm sido utilizadas para a obteno de cidos

graxos livres a partir da hidrlise seletiva de leos e gorduras presentes em diversos alimentos. Os cidos graxos livres podem ou no sofrer modificaes qumicas e, dependendo do tamanho da cadeia carbnica e do grau de insaturao, conferem um peculiar sabor e aroma para os alimentos, representando um importante papel nas propriedades fsico-qumicas, organolpticas e nutricionais de diversos produtos (Jaeger e Reetz, 1998). Na indstria de queijos elas so empregadas na alterao e intensificao do sabor e em processos de acelerao da maturao. Tambm na indstria de laticnios, as lipases so utilizadas para a obteno de margarinas de baixo teor calrico, entre outras (Alonso, 2001). A literatura reporta a hidrlise do leo de fgado de bacalhau para a produo de cidos graxos mega 3 insaturados, destinados s dietas de grupos clnicos especiais (Pandey et al., 1999). O enriquecimento de leos com cidos graxos poliinsaturados, como por exemplo, cido linolnico, conferem a estes atividades anti-carcinognicas e anti-esclerticas, sendo chamados atualmente de alimentos nutracuticos (Martins, 2001).

2.3.2 INDSTRIA OLEOQUMICA O uso de lipases para a hidrlise de gorduras em mbito industrial proporciona vantagens como a diminuio de gastos com energia e a minimizao da degradao trmica dos compostos, quando comparado s vias qumicas tradicionais. Estas so provavelmente as principais atraes que levam substituio das tecnologias qumicas atuais pelas biolgicas. Devido ao seu valor nutritivo, a no degradao de cidos graxos poliinsaturados pode ser importante para a preservao de aditivos de alimentos tais como mono e diacilgliceris, sendo estes ltimos, os componentes principais dos novos leos para cozimento,


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que tm a proposta de retardar o aumento de triglicerdios e colesterol no sangue (Hasan et al., 2006). O espao para a aplicao de lipases na indstria oleoqumica amplo. As gorduras e os leos so produzidos em grande escala pelo mundo gerando em torno de 60 milhes de toneladas sendo que mais de 2 milhes de toneladas so utilizadas em processos que consomem uma grande quantidade de energia tais como hidrlise, glicerlise e alcolise. Entretanto, apesar de sua superioridade aparente, os mtodos enzimticos ainda no alcanaram um nvel de explorao comercial proporcional a seu potencial de aplicaes (Hasan et al., 2006).

2.3.3 INDSTRIA DE DETERGENTES O campo de aplicao das lipases mais importante comercialmente a

indstria de detergentes. Aproximadamente 1000 toneladas de lipases so adicionadas a 13 bilhes de toneladas de detergentes produzidos a cada ano, competindo com os surfactantes normalmente empregados, pela maior eficincia na remoo de manchas, em superfcies e em tecidos, pela menor temperatura necessria lavagem e pela biodegradabilidade (Martins, 2001). Os desafios para a utilizao de lipases em formulaes de detergentes consistem nas caractersticas que estas enzimas devem apresentar, como estabilidade nas condies de lavagem, entre pH 10,0 e 11,0 das formulaes e em temperaturas de 30 a 60C; alm disso, devem apresentar pouca ou nenhuma especificidade pelo substrato, sendo capazes de atuar sobre diversos leos, e por fim, devem resistir aos componentes da formulao e degradao causada por enzimas proteolticas tambm presentes (Martins, 2001).

2.3.4 INDSTRIA FARMACUTICA Recentemente foi evidenciado o esforo da indstria farmacutica em

produzir compostos opticamente puros, em detrimento da produo das misturas racmicas, que por sua vez levava a uma srie de implicaes, como a ocorrncia de vrios efeitos colaterais indesejados. Isto porque a maioria dos frmacos


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sintetizados possui um ou mais centros quirais, e ainda continua a ser comercializada como uma mistura racmica (Alonso, 2001). H interesse nos leos de peixes de regies frias (anchova e sardinha) devido aos efeitos fisiolgicos e teraputicos (atuam no sistema cardaco, circulatrio e imunolgico e nos processos inflamatrios e carcinognicos) encontrados nos cidos graxos de cadeia longa, presentes nesses leos. A maior parte da produo mundial dos cidos EPA (eicosapentaenico) e DHA (docosahexaenico) so hidrogenados para a produo de margarinas e outros produtos, praticamente destruindo suas propriedades teraputicas. Por isso de interesse industrial obter triglicerdeos homogneos a partir desses cidos, j que os triglicerdeos so encontrados nos alimentos e no organismo humano. Portanto, a sntese catalisada por lipases desejvel para produo de triglicerdeos a partir desses cidos com um alto grau de pureza (Burkert, 2002).

2.3.5 TRATAMENTO DE EFLUENTES O tratamento de efluentes de diversas origens uma nova rea de

aplicao para as lipases. O derramamento de leo em oceanos e rios e em grandes reas de terra tem sido uma constante nos dias atuais. O despejo do rejeito da indstria de laticnios e indstria oleoqumica, principalmente nos leitos fluviais, ocorre de forma criminosa no Brasil, seja pela falta de uma legislao mais rgida ou pelo descaso das autoridades competentes. As lipases surgem como uma excelente alternativa para o tratamento do rejeito industrial composto por material graxo (Alonso,2001).

Cabe ressaltar que as aplicaes das lipases citadas anteriormente so apenas ilustrativas e esto em nmero bastante reduzido em relao s possibilidades de utilizao destas enzimas no futuro. A sua plena utilizao esbarra na reduo dos custos dos processos de produo e purificao, na busca por novas cepas produtoras, no melhoramento gentico destas cepas, alm da mutagnese stio dirigida, ou da modificao qumica das lipases afim de que produzam maiores quantidades destas enzimas em tempos menores, com caractersticas desejveis (Martins, 2001).


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2.4 PRODUO DE LIPASES MICROBIANAS

Microrganismos so muito versteis, porm bastante sensveis s condies do ambiente ao qual esto sendo submetidos. Em um planejamento experimental para produo de lipases, fatores que influenciam o processo como composio do meio, pH, temperatura e aerao devem ser estritamente controlados (Alonso, 2001; Marek e Bednarski, 1996).

As lipases microbianas em geral so extracelulares, sendo excretadas atravs da membrana externa para o meio de cultura. A otimizao das condies de fermentao para lipases microbianas de grande interesse, desde que as condies de cultura no influenciem nas propriedades da enzima, bem como na proporo de lipase extracelular e intracelular (Wooley e Peterson, 1994).

Uma grande variedade de microorganismos tem habilidade de produzir lipases, sendo funo de alguns parmetros reacionais e apresentando diferentes especificidades, massa molecular, sensibilidade temperatura e pH (Burkert, 2002; Burkert et al., 2004). No entanto, do ponto de vista industrial, os fungos so os preferidos como fontes de lipases, pois as enzimas produzidas por eles geralmente so extracelulares, facilitando a sua extrao do meio fermentado e tambm por serem considerados microorganismos seguros para aplicao na indstria de alimentos, bebidas e farmacutica (Mahadik et al., 2002; Burkert, 2002; Burkert et al., 2004).

A literatura reporta que diversos gneros de fungos filamentosos tm sido estudados como fontes de lipases por exemplo, Rhizopus (Pastore et al., 2003), Aspergillus (Mahadik et al., 2004), Rhizomucor (Cordova et al., 1998), Penicillium (Jesus et al., 1999), Mucor (Abbas et al., 2002), entre outros.

Penicillium considerado um gnero universal de fungos encontrados em todo o planeta. A maioria das espcies saprfita e geralmente ou ocasionalmente encontrada no solo, vegetais podres, sementes e gros. H mais de 20 anos tm-se estudado a taxonomia e classificao das espcies do gnero Penicillium com base em dados morfolgicos e qumicos Penicillium verrucosum comumente encontrado em cereais estocados em regies de clima temperado


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(Jesus et al., 1999). Apresenta como caractersticas principais: colnia radialmente sulcada, velutinosa, miclio branco, conidiognese moderada de cor verde-acinzentada. A Figura 2.1 apresenta algumas caractersticas do fungo Penicillium verrucosum.

Figura 2.1. Caractersticas do fungo Penicillium verrucosum.

Na formulao de um meio fermentativo deve-se proporcionar nutrientes necessrios ao crescimento do microrganismo e produo de metablitos e alm disso, este deve ser adequado para suprir energia para biossntese e manuteno celular (Smits et al., 1996).

Este deve ser composto basicamente por fonte de carbono, fonte de nitrognio (seja ela orgnica ou inorgnica), sais orgnicos, vitaminas e indutores, quando necessrios para a produo de lipase, visto que existem lipases induzveis e constitutivas. As lipases constitutivas so aquelas que so produzidas independente do meio de cultura onde o microrganismo se encontra, j as lipases induzveis tm sua produo estimulada pela presena de algum indutor presente no meio de cultivo (Alonso, 2001).

Foi demonstrado que a presena de substratos lipdicos (e seus metablitos, como cidos graxos) pode estimular a produo de lipases, como em Candida rugosa (Dalmau et al., 2000). Neste estudo, avaliou-se os efeitos de diferentes fontes de carbono, testando substratos lipdicos e no-lipdicos. Verificou-se que no segundo grupo de substratos, alguns do suporte para o


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crescimento do microrganismo, porm pouca atividade lipsica obtida. Foi ainda realizada a combinao de dois tipos de substratos, o que no aumentou a produo da enzima.

Na produo de lipase por Penicillium restrictum foi estudada a influncia da razo carbono/nitrognio adicionado ao meio de cultivo, fazendo uso de leo de oliva, peptona e amido. Observou-se que pequenas variaes nos nveis de nutrientes exercem grande influncia na quantidade de enzima obtida e que, o meio basal, ao ser enriquecido diferentemente, pode proporcionar a produo de enzimas variveis (Gombert et al., 1999).

Como fonte de carbono podem ser utilizados carboidratos, lipdios ou protenas, sendo o lipdio normalmente utilizado como indutor. Comumente as fontes de nitrognio j presentes no meio de cultura contm algumas, seno todas as vitaminas necessrias para o metabolismo do microrganismo. Porm, existem casos onde alguma vitamina ou uma suplementao necessria para o crescimento celular (Alonso, 2001; Becker et al.,1997).

Cada microrganismo apresenta um valor de pH timo para o crescimento e que muitas vezes no o mesmo para produo de lipases (Gao et al., 2000). possvel que ocorram variaes nos valores de pH durante o cultivo, os quais podem ser influenciados tanto pelo microrganismo e pela composio do meio, quanto pelos demais parmetros da fermentao (Alonso, 2001).

Calor produzido tanto pela atividade microbiana quanto pela agitao do sistema; sendo que para se obter boas condies para o crescimento e produo de enzimas, torna-se indispensvel o controle da temperatura ideal (Alonso, 2001).

Microrganismos produtores de lipases apresentam uma ampla faixa de temperatura de crescimento. Em geral, fungos e leveduras tm uma temperatura tima entre 22 e 30C (Toida et al., 1995). Os processos fermentativos, em sua maioria, so aerbicos e desta forma o fornecimento de oxignio se torna indispensvel. A demanda de oxignio em uma fermentao seja ela a nvel industrial ou laboratorial, normalmente suprida pela agitao e aerao do meio fermentativo. A produtividade de muitas fermentaes


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para produo de lipases ou outros metablitos pode ser influenciada pela disponibilidade do oxignio, portanto, qualquer fator que possa interferir nesta disponibilidade do oxignio para as clulas microbianas deve ser considerado (Alonso, 2001). Pesquisas tm demonstrado que a agitao e aerao so parmetros que influenciam diretamente a produo de lipases. Elibol e Ozer (2000) verificaram que a produtividade da enzima depende fortemente da agitao quando se utiliza Rhizopus arrhizus. Neste caso, a aerao exerceu forte influncia no crescimento celular, o que tambm foi observado por Koutinas et al. (2003), que avaliou estes parmetros com Aspergillus awamori. Resultados semelhantes foram encontrados para os cultivos realizados com Penicillium restrictum. Neste estudo a produo de lipases mostrou-se positivamente influenciada pela variao da agitao e a aerao no apresentou efeito sobre a produo da enzima (Freire et al., 1997).

2.5 FORMAS DE PRODUO DE LIPASES

2.5.1 FERMENTAO EM ESTADO SLIDO O processo de fermentao em meio slido bastante caracterstico e utiliza substratos insolveis com baixas porcentagens de gua em sua composio, os quais devem atuar tanto como suporte fisiolgico quanto como fonte de nutrientes na ausncia de gua livre (Alonso, 2001; Pandey, 1992; Pandey, 2003). Na formulao do meio de fermentao vrias fontes de carbono (substrato principal) so utilizadas, entre elas cita-se (Alonso, 2001): Farelo de trigo (Silva et al., 2000; Ellaiah et al., 2004), farelo de arroz (Ellaiah et al., 2004), farelo de cevada (Dominguez et al., 2003), bagao de cana-de-acar (Cordova et al., 1998; Ellaiah et al., 2004), torta de cco (Benjamin e Pandey, 2001), torta de soja (Vargas, 2004), torta de babau (Palma et al., 2000; Gombert et al., 1999; Castilho et al., 2000), entre outros, alm da incorporao opcional de alguma fonte de carbono indutora para a produo de lipases (leos, cidos graxos, detergentes). Em alguns casos, fontes de nitrognio complementar so utilizadas:


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licor de milho, extrato de levedura, uria, sais de amnio e outros. Sais metlicos e micro-elementos podem ser suplementados para suprir as necessidades do microrganismo (Alonso, 2001). No processo de fermentao em estado slido deve-se levar em considerao alguns aspectos importantes, como a seleo do microrganismo, a escolha do substrato, a otimizao dos parmetros do processo, o isolamento e a purificao do produto, dentre outros fatores (Pandey, 2003). Com base na classificao terica, o fato da umidade contida no meio de fermentao ser muito baixa, somente permitiria o uso de um nmero limitado de microrganismos, principalmente fungos e leveduras para fermentao em estado slido. Culturas de bactrias exigem alta atividade de gua e, portanto, no seriam adequadas fermentao em estado slido. No entanto, existem relatos que demonstram que bactrias podem ser usadas nestes processos, quando bem controladas e manipuladas (Pandey et al., 2000; Pandey, 2003). Nos ltimos anos, a tcnica de fermentao em estado slido tem recebido uma maior ateno dos pesquisadores, tanto para produo de enzimas, quanto para obteno de substncias de interesse da indstria de alimentos, pois tem mostrado que pode ofertar maior produtividade ou produtos com melhores caractersticas do que a fermentao submersa. Alm disso, h a possibilidade de utilizao de substratos de baixo valor agregado, diminuindo assim o custo da produo (Robinson e Nigam, 2003). Desde 1986, h no Brasil uma srie de pesquisas sendo desenvolvidas a fim de agregar valor aos produtos e subprodutos da agricultura tropical, principalmente pelo aumento da gerao de resduos agroindustriais na regio. A utilizao dos resduos da agroindstria brasileira, alm de fornecer diferentes alternativas de substratos para fermentao, tambm ajuda na diminuio dos problemas de poluio (Pandey et al., 1999). O processo seletivo dos substratos slidos depende de vrios fatores, entre eles, o custo e viabilidade envolvendo assim a investigao de diferentes resduos agroindustriais. Estes, normalmente so ricos nutricionalmente, sendo que no processo de fermentao em estado slido eles fornecem no somente os


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nutrientes para a cultura, mas tambm servem como suporte das clulas microbianas (Couto e Sanromn, 2006). Dentre os fatores importantes para o crescimento microbiano e atividade no substrato, particularmente o tamanho das partculas (granulometria) e nveis de umidade/atividade de gua so pontos crticos. Geralmente pequenas partculas de substrato fornecem uma grande superfcie de contato com o microrganismo, mas resulta num baixo crescimento. Contrariamente, grandes partculas fornecem maior aerao, mas limitam a superfcie de contato para uso microbiano. Portanto o tamanho da partcula dever ser selecionado de acordo com cada processo em particular (Pandey et al., 1999).

Estudos demonstram que a umidade do meio de fermentao um fator determinante no sucesso deste processo, sendo que nveis elevados de umidade causam diminuio da porosidade e dificultam a transferncia de oxignio. No entanto, nveis baixos de umidade do meio diminuem a solubilidade do substrato slido e produzem um aumento do turgor da gua (Mahadik et al., 2002).

Atualmente, h poucos modelos de biorreatores que operam em condies de estado slido disponveis no mercado. Isto ocorre, principalmente devido aos vrios problemas encontrados no controle de diferentes parmetros, sabendo-se que difcil o controle das condies ambientais em biorreatores, particularmente temperatura e umidade (Couto e Sanromn, 2006). O equipamento utilizado para este tipo de fermentao composto por cmaras de fermentao de volume definido, onde existe um controle da temperatura e da porcentagem de umidade do meio. Em escala industrial de produo, este meio disposto em bandejas de alta rea superficial e com uma profundidade que varia de 1 a 10 centmetros. Em escala laboratorial so utilizadas bandejas menores ou placas de Petri, que so acondicionadas nas cmaras (Alonso, 2001). O tempo e a temperatura de fermentao so bastante variveis. Dependendo do microrganismo em questo, o tempo costuma variar de 1 a 7 dias, enquanto a temperatura pode variar de 20 a 40C (Alonso, 2001).


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A fermentao em estado slido apresenta como vantagens o baixo custo das matrias primas empregadas no meio de cultivo, a simplicidade do meio de fermentao utilizado, a menor probabilidade de contaminao do meio pela menor quantidade de gua presente e a possibilidade de obteno da enzima extracelular mais concentrada (Martins, 2001; Alonso, 2001). Outra questo interessante a alta produtividade obtida com esta tcnica (Couto e Sanromn, 2006). Benjamin e Pandey (1995) e Castilho et al. (2000) compararam a fermentao submersa e a fermentao em estado slido como sistemas de produo de lipases, constatando aumento da produo da enzima e de sua estabilidade por meio do segundo sistema. Apesar do processo de fermentao em estado slido apresentar vrias vantagens, alguns problemas so apresentados durante a sua execuo. A dificuldade nas medidas dos parmetros como aerao, pH, temperatura, umidade e a baixa homogeneidade do meio so questes que dificultam a produo de substncias de interesse em grande escala (Martins, 2001; Couto e Sanromn, 2006). A automao deste processo dificultada pelo equipamento em si e apresenta um maior custo em mo de obra em escala industrial. Alm desses inconvenientes, existe a necessidade do pr-tratamento do substrato para a eliminao de possveis contaminantes que venham a interferir na produo de lipase e no crescimento do microrganismo (Alonso, 2001). A fermentao em estado slido reproduz processos microbiolgicos naturais. No caso de aplicaes industriais, estes processos naturais, se monitorados, produzem o produto desejado (Couto e Sanromn, 2006). Assim, vrios produtos de valor agregado tm sido produzidos por essa tcnica fazendo uso de matrias primas provenientes da natureza (Pandey, 2000). Esse tipo de fermentao tem mostrado tambm um enorme potencial tecnolgico no que diz respeito ao desenvolvimento de produtos que apresentam componentes derivados de microrganismos como raes para animais, produtos para a indstria alimentcia, qumica e farmacutica. Estas aplicaes envolvem a biotransformao de produtos e resduos agrcolas para enriquecimento nutricional, produo de biomassa e formao de produtos com alto valor


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agregado, como metablitos secundrios biologicamente ativos, incluindo antibiticos, alcalides, enzimas, cidos orgnicos, biopesticidas, micro-pesticidas e bioerbicidas, biossufactantes, biocombustveis, compostos aromticos, etc. (Pandey, 2003). As principais aplicaes do processo de fermentao em estado slido na indstria de alimentos esto apresentadas na Tabela 2.1.

Tabela 2.1. Principais aplicaes da FES na indstria alimentcia. Aplicao Referncias

Produo de flavors Medeiros et al., 2001; Larroche et al., 1999.

Produo de enzimas

Alfa-amilases

Lipases

Pectinases

Francis et al., 2003; Ramachandran et al., 2004.

Jesus et al., 1999; Vargas, 2004; Gombert et al., 1999; Palma et al., 2000.

Castilho et al., 2000; Bai et al., 2004.

Produo de cidos orgnicos

cido ltico

cido ctrico

Naveena et al., 2005.

Prado et al., 2004.

Produo de goma xantana Stredansky e Conti, 1999.

Estudando a produo de lipases por fermentao em estado slido, Palma et al. (2000) utilizaram o fungo Penicillium restrictum e torta de babau como meio basal. O meio foi enriquecido com peptona, tween 80 e leo de oliva verificando-


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se que a maior atividade lipsica (27,8 U/g em 25 horas de fermentao) foi obtida quando se utilizou a peptona como suplemento.

Cordova et al. (1998) investigaram o uso de bagao de cana de acar e torta de oliva (resduo da indstria de leo de oliva) para a produo de lipases por Rhizopus rhizopodiformis e Rhizomucor pusillus. As maiores atividades enzimticas obtidas foram de 79,6 U/g com R. rhizopodiformis e 20,2 U/g com R. pusillus respectivamente, quando se utilizou uma mistura de 50:50 dos substratos estudados.

A produo de lipases por Penicillium simplicissimum em meio slido usando torta de soja como substrato foi estudada por Vargas (2004). Foi constatado que a maior produo da enzima (30 U/g em 80 horas de fermentao) ocorreu sob as condies de 27,5C e 55% de umidade do meio e que a torta de soja rica em nutrientes e no necessita de adio de fontes suplementares de carbono e nitrognio para aumentar a produo de lipases.

Diferentes resduos agroindustriais foram utilizados para a produo de lipases por Aspergillus niger em uma pesquisa feita por Kamini et al. (1998). As maiores atividades lipsicas obtidas foram de 363 U/g em 72 horas quando utilizou-se torta de leo de gengibre e de 303 U/g em 96 horas de fermentao fazendo uso de farelo de trigo como substrato. Neste estudo, a adio de fontes de nitrognio e de indutores foi ineficaz para o aumento da produo da enzima.

Domnguez et al. (2003) investigaram a produo de lipases por Yarrowia lipolytica por fermentao em estado slido. Observou-se que o uso de materiais orgnicos como suporte para a produo de lipases alm de diminuir os custos de produo da enzima proporciona maiores atividades lipsicas quando comparado ao uso de suportes sintticos. Concluiu-se que a utilizao de nozes trituradas como substrato gerou cerca de 69 U/g de atividade enzimtica em 10 dias de fermentao, superando os resultados obtidos com farelo de cevada suplementado com leo de girassol, milho e oliva.


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2.5.2 FERMENTAO SUBMERSA A fermentao submersa, que tem como caracterstica principal a utilizao de um meio fermentativo lquido com nutrientes solveis, o processo mais utilizado para a produo de lipases (Martins, 2001; Alonso, 2001). Esse tipo de sistema de produo de lipases pode ser realizado em frascos agitados (erlenmeyers, por exemplo), fermentadores de bancada ou fermentadores em escala industrial. Os processos realizados em frascos agitados apresentam dificuldades no controle de certos parmetros, como por exemplo, a aerao, que uma varivel determinante em alguns casos de produo de lipases (Martins, 2001; Alonso, 2001). Apesar disso, a fermentao submersa para produo de lipases comumente executada em agitadores de bancada (frascos agitados) em escala laboratorial (Elibol e Ozer, 2000; Elibol e Ozer, 2002; Dalmau et al., 1999; Ellaiah et al., 2004, Kanwar et al., 2002, Tan et al., 2003; Mahadik et al., 2003; Ciafardini et al., 2006; Benjamin e Pandey, 1995; Asther et al., 2002). Existem fermentadores que operam de forma contnua, semi-contnua ou descontnua. No regime contnuo (Montesinos et al., 1996), h uma constncia na entrada de substrato conforme as necessidades do microrganismo e na sada do meio fermentado.

J os processos descontnuos podem ser realizados na forma de batelada, isto , quantidades nicas de substrato so fornecidas ao microrganismo no incio do cultivo, sendo este muito utilizado para produo de lipases (Shu et al., 2006; Koutinas et al., 2003; Li et al., 2001; Li et al., 2004; Freire et al., 1997; Freire et al., 1997; Freire et al.,1999). um processo de baixo custo, porm, necessita de uma maior vigilncia operacional para assegurar a reprodutibilidade e constncia das propriedades do produto.

A batelada alimentada consiste em realimentar o processo durante sua execuo, visando aumentar a produo, permitindo a explorao de aspectos cinticos do processo (Martins, 2001). A tcnica de fermentao submersa possui relativa facilidade de cultivo em grande escala, j que garante homogeneidade do meio e facilidade no controle dos parmetros do processo, principalmente se monitorados por sensores


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adequados (Couto e Sanromn, 2006). No entanto, a maior probabilidade de contaminao, pela maior quantidade de gua, um inconveniente deste processo. Outra limitao quando a enzima produzida extracelular, sendo obtida uma preparao mais diluda, inserindo uma etapa de concentrao mais trabalhosa na purificao (Alonso, 2001). A questo da viabilidade econmica da fermentao submersa frente fermentao em estado slido outro problema encontrado na conduo do processo, j que os meios de fermentao normalmente apresentam um alto custo.

Com a finalidade de estudarem a induo de diferentes fontes de carbono na produo de lipases por Fusarium solani, Maia et al. (2001) utilizaram um meio basal que consistia de 0,11% de MgSO4.7H2O, 0,015% de KH2PO4, 0,3% de NaNO3, 0,015% de NaCl, 0,015% de ZnSO4 e 0,001% de FeSO4, 0,5% de leos vegetais e 0,5% de triolena como fonte de carbono. Dentre os indutores estudados, o leo de gergelim foi o que proporcionou maior produo de lipases (0,88 U/mL) em 120 horas de fermentao a 28C e 120 rpm. Dalmau et al. (2000), pesquisando a produo de lipases por Candida rugosa, utilizaram um meio de cultura contendo por litro 15g de KH2PO4, 5,5g de K2HPO4, 5g de (NH4)2SO4, 0,5g de MgSO4.7H2O, 0,1g de NaCl, 0,1g de CaCl2. Foram testados como fonte de carbono na concentrao de 2g/L: cido palmtico, cido olico, triolena e Tween 80, sendo o cido palmtico o melhor indutor para a produo da enzima nas condies de 30C, 150 rpm em 48 horas de fermentao, gerando cerca de 5,3 U/mL. Freire et al. (1997) investigaram como fonte de carbono para produo de lipases por Penicillium restrictum o leo de oliva, a glicose e a lactose. Os resultados demonstraram que o crescimento celular para o leo de oliva e a glicose foi semelhante, porm, a atividade enzimtica foi cerca de 6 vezes superior com o uso de leo de oliva, indicando que a produo da enzima pode ser regulada pela glicose. Na presena da lactose no houve crescimento celular e ocorreu baixa produo da enzima, devido ao microrganismo no metabolizar este acar. Peptonas de carne, soja e casena a 2% foram investigadas como fonte de


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nitrognio e resultaram em um crescimento celular semelhante, no entanto, a capacidade de produo da enzima alcanou melhores nveis com a peptona de carne, obtendo um mximo de 13 U/mL de atividade enzimtica. O microrganismo em estudo foi incapaz de crescer na presena de nitrognio inorgnico. Em continuidade ao trabalho anterior, Freire et al. (1997a) verificaram o efeito da temperatura e pH inicial do meio de cultura na produo de lipase utilizando o mesmo microrganismo. As temperaturas estudadas foram 25C, 30C, 37C, e a faixa de pH variou de 5,5 a 8,0. Foi observado que a maior produo da enzima foi de 14 U/mL em 80 horas de fermentao sob temperatura de 30C e pH inicial de 5,5. A enzima foi caracterizada quanto sua estabilidade e condies timas de atuao. Atravs deste estudo foi possvel concluir que o pH e a temperatura tima foram de 7,0 e 37C, respectivamente. A enzima foi estvel na faixa de 30C a 37C em pH 7,0. A produo de lipases por Antrodia cinnamomea foi avaliada por Shu et al. (2006). O meio basal composto por 3% de glicose, 0,5% de peptona, 0,3% de extrato de levedura, 0,3% de extrato de malte, 0,1% de KH2PO4, 0,1% de MgSO4.7H2O e 0,1% de vitamina B1 foi suplementado por 0,01% de leo de oliva e protagonizou um aumento de 15 U/mL para 26 U/mL no 16 dia de fermentao sob as condies de 28C e 150 rpm. Um estudo comparativo de fermentao submersa e fermentao em estado slido utilizando Penicillium restrictum foi realizado por Castilho et al. (2000). Verificou-se que para a fermentao submersa foi necessrio um investimento capital 78% maior que o valor investido para a fermentao em estado slido, indicando que o segundo processo mais atrativo economicamente. Observou-se que as principais vantagens da fermentao em estado slido a possibilidade de uso de resduos agroindustriais como substrato e a produtividade que este processo apresenta, o que reduz consideravelmente os custos de produo de enzimas.


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2.6 CARACTERIZAO DE LIPASES

Lipases de vrias origens tm sido aplicadas em vrios segmentos, como na indstria farmacutica e na clnica. Nesse sentido, a caracterizao destas enzimas essencial tanto para o estabelecimento das condies de trabalho e aplicaes como para a determinao da temperatura e pH timos e de estabilidade (Alonso, 2001).

Pastore et al. (2003) realizaram a caracterizao bioqumica da lipase produzida por Rhizopus sp., verificando que a enzima bruta apresentou condies timas de atividade a 40C em valores de pH entre 6,0 e 6,5 e manteve 50% ou mais de sua atividade quando aquecida por 60 minutos temperaturas entre 40C e 55C.

A lipase produzida por Antrodia cinnamomea apresentou atividade tima com pH 8,0 e 40C, e tanto a atividade quanto a estabilidade diminuram significativamente com valores de pH acima de 10. A estabilidade da atividade enzimtica foi testada na faixa de temperatura de 25C a 60C e apresentou-se estvel na faixa de 25C a 45C (Shu et al., 2006). Burkert (2002) e Burkert et al. (2004) verificaram que a lipase produzida por Geotrichum candidum NRRL-Y552 apresentou condies timas de atividade a 37C e em pH 7,0 e observaram que a estabilidade da lipase maior em baixas temperaturas, como a de 30C, por exemplo.

A lipase produzida por Aspergillus niger caracterizada por Kamini et al. (1998) apresentou atividade tima em pH 7,0 e 37C e mostrou-se estvel em valores de pH entre 4,0 e 10,0 e na faixa de temperatura de 40C a 50C, sendo que esta tambm manteve sua estabilidade na presena de detergentes.

Kamini et al. (1998) ainda neste estudo, compararam a estabilidade trmica da lipase produzida por fermentao submersa e por fermentao em estado slido, verificando que a primeira manteve 57% de atividade a 60C, enquanto a segunda manteve 69% de atividade sob a mesma temperatura, mostrando que Aspergillus niger possui habilidade em produzir a enzima com maior estabilidade trmica por fermentao em estado slido.


23

2.7 CONSIDERAES FINAIS

Como pde ser observado atravs da reviso bibliogrfica apresentada neste captulo, h um grande interesse na obteno da enzima lipase devido ao seu amplo potencial de aplicao industrial. Verifica-se que, dependendo do microrganismo usado na fermentao, a lipase obtida possui uma especificidade em particular. As inmeras variveis que envolvem o processo de obteno da enzima vo desde a composio do meio (fonte de carbono, fonte de nitrognio, sais e indutores) at as condies operacionais como pH, temperatura, agitao, aerao e forma de conduo do processo fermentativo. A busca pela reduo dos custos de produo de lipases faz com que aumente as investigaes sobre substratos e formas de fermentao para que a obteno da enzima se torne mais vivel economicamente. Atualmente, a fermentao em estado slido vem ganhando espao e a ateno de pesquisadores por apresentar vantagens econmicas perante fermentao submersa, porm necessrio um estudo mais aprofundado a fim de conhecer a fisiologia do microrganismo e verificar sua melhor adaptao, para assim determinar o processo fermentativo mais vantajoso. Portanto, de grande valia estudos sistemticos como o caso do uso da metodologia do planejamento experimental, para a definio de variveis significativas como a concentrao dos meios de cultura e as condies de temperatura visando obter as condies timas de produo de lipase. A caracterizao da enzima tambm se torna interessante, pois possibilita um maior conhecimento das propriedades da lipase obtida.

Captulo 3 Material e Mtodos

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3 MATERIAL E MTODOS

Neste captulo sero descritos os materiais, procedimentos experimentais e a metodologia analtica usados para o desenvolvimento do estudo da produo de lipases por Penicillium verrucosum durante a realizao deste trabalho.

3.1 MATERIAIS

3.1.1 REAGENTES E MEIOS DE CULTURA Os nutrientes necessrios para a formulao dos meios de cultivo e os

principais reagentes e produtos utilizados encontram-se listados na Tabela 3.1.

3.1.2 EQUIPAMENTOS Os principais equipamentos utilizados neste estudo foram os seguintes:

Cmara de fluxo laminar (Pachane); Germinadora para incubao (Tecnal TE-401); Bomba a vcuo (Marconi); Banho termosttico (Tecnal TE-210); Estufa para secagem (Marconi); Balana analtica (Bel Engineering); Agitador orbital (Marconi MA-410); Potencimetro (Gehaka); Espectrofotmetro (Agilent Tecnologies 8453); Dessecador (Kartell); Mixer manual (Black & Decker); Centrfuga (Hettich).


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Tabela 3.1. Componentes dos meios de cultura e principais reagentes utilizados. Produtos Reagentes

Acetato de sdio (Synth) Fosfato de Sdio Monobsico (Synth) Acetil Acetona (Vetec) Glicose (Synth)

Acetona (Quimex) Goma Arbica (Synth) cido actico glacial (Quimex) Hidrolisado de Levedura (Prodeza, Mogi

Mirim-SP) cido clordrico (Quimex) Hidrxido de Potssio (Quimex)

cido tricloro-actico (Vetec) Hidrxido de Sdio (Nuclear) Agar (Vetec) Meio PDA* (Acumedia)

gua de macerao de Milho (Corn Products do Brasil)

Melao (Usina Ester, Cosmpolis-SP)

Amido solvel (Synth) leo de mamona (Delaware) Azocasena (Sigma) leo de milho (Salada)

Carbonato de Clcio (Vetec) leo de oliva (Arisco) Carbonato de Sdio (Synth) leo de soja (Soya) Cloreto de Sdio (Proton) p-dimetilaminobenzaldedo (Vetec)

Etanol (Quimex) Peptona bacteriolgica (Inlab) Extrato de levedura (Vetec) Biftlato de Potssio (Nuclear)

Farelo de Soja (Olfar) Sulfato de Amnio (Vetec) Fenolftalena (Nuclear) Sulfato de Magnsio (Synth)

Fosfato de Potssio (Vetec) Tween 80 (Vetec) Fosfato de Sdio Dibsico (Nuclear)

* Composio: aps o preparo de 39g em 1L o meio contm: 4g/L de infuso de batata, 20g/L de glicose e 15g/L de gar.

3.2 MTODOS

Nesta seo est apresentada a metodologia empregada para a produo de lipases por Penicillium verrucosum. Primeiramente, ser descrita a metodologia empregada na execuo dos experimentos por fermentao em estado slido e, numa segunda etapa, a metodologia empregada na fermentao submersa.


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3.2.1 FERMENTAO EM ESTADO SLIDO

3.2.1.1 Microrganismo O fungo Penicillium verrucosum empregado foi isolado previamente por

Freire (1996) em solo brasileiro. Este microorganismo foi pr-selecionado como bom produtor de lipases atravs das metodologias de seleo em meio slido e lquido descritas na literatura (Freire, 1996). Este fungo tem sido permanentemente estocado em glicerol, slica e meio slido recoberto com leo mineral sob refrigerao. A propagao de esporos para posterior fermentao foi feita por um perodo de 7 dias a 27,5C.

3.2.1.2 Inculo Foram testados dois meios para a produo de inculo. O primeiro

chamado de meio basal constitudo por: amido solvel 2%; leo de oliva 1%; extrato de levedura 0,1%; MgSO4. 7H2O 0,025%; KH2PO4 0,5%; CaCO3 0,5% e Agar 1,5%, (m/v). Todos os componentes do meio foram solubilizados e levados fervura para completa dissoluo do amido. Aps a fervura o meio basal foi emulsificado com auxlio de um mixer manual e 100 mL de meio foram transferidos para erlenmeyer de 500 mL. O segundo meio (Potato Dextrose Agar - PDA) constitudo por PDA 3,9% (m/v) e gua destilada. Aps a solubilizao completa do componente, ocorre a transferncia de 100 mL de meio para erlenmeyer de 500 mL. Os dois meios foram autoclavados a 121C por 30 minutos.

Do tubo estoque, retirou-se uma alada e transferiu-se para um tubo de ensaio contendo 10 mL de soluo de Tween 80. Aps a homogeneizao retirou-se 0,30 mL e inoculou-se nos erlenmeyers j resfriados mantendo-se em cmara de germinao a 27,5C por 7 dias (Vargas, 2004). O recolhimento de esporos foi feito adicionando-se 10 mL de soluo de Tween 80 (0,1% v/v) e prolas de vidro estreis ao erlenmeyer. Retirou-se 1 mL da soluo contendo esporos, este volume foi transferido para um tubo de 9 mL de soluo de Tween 80 sendo estocados a 4C por, no mximo, 15 dias.


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3.2.1.3 Preparo dos meios de cultivo O substrato utilizado em todos os experimentos de fermentao em meio

slido consistiu de farelo de soja obtido no moinho Olfar (Erechim- RS) o qual foi peneirado (Tyler 35-60) e armazenado em freezer at o momento da sua utilizao.

A fermentao em meio slido foi realizada em bqueres de polipropileno de 500 mL tampados com manta acrlica de acordo com a Figura 3.1.

Em cada bquer eram colocados 10 g de farelo de soja e a adio de gua ao meio era realizada de acordo com a determinao prvia da umidade desejada e por gotejamento manual com auxlio de pipeta volumtrica de forma que toda a rea do farelo fosse recoberta. Os bqueres eram autoclavados a 1,0 atm por 15 minutos e aps o resfriamento, inoculava-se a suspenso de esporos previamente diluda at concentrao de esporos desejada (4 x 108 esporos/g).

Figura 3.1. Bqueres utilizados para a FES.

3.2.1.4 Preparo das amostras Aps macerao das amostras em cmara de fluxo, retirava-se de cada

frasco duas alquotas de 0,5 g para posterior anlise de umidade e pH. Ao restante do material, o qual era pesado em erlenmeyers de 250 mL, eram adicionados 45 mL de tampo fosfato de sdio 100mM pH 7,0 e se efetuava a


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incubao em agitador orbital temperatura de 37C e velocidade de agitao de 150 rpm por 30 minutos. Em seguida, era feita a extrao da frao lquida por prensagem manual em filtro de nylon e o sobrenadante era utilizado para a dosagem de atividade lipsica e protesica. A frao slida retida no filtro era utilizada para dosagem de glicosamina, que foi utilizada como medida indicativa do crescimento microbiano.

3.2.1.5 Mtodos Analticos

Caracterizao dos substratos e indutores A caracterizao do farelo de soja, do hidrolisado de levedura, do melao e

da gua de macerao de milho foi feita seguindo as Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz (IAL, 1985). As anlises realizadas foram: umidade (diferena de massa), lipdeos (Mtodo Soxhlet e solvente a frio) e nitrognio (mtodo de Kjeldahl).

Medida de atividade lipsica Utilizou-se como substrato para dosagens da atividade lipsica, leo de

oliva (10% m/v) emulsionado por trs minutos com goma arbica (5%p/v) em tampo fosfato de sdio 100 mM pH 7,0. A 18 mL desta emulso contidos em erlenmeyers de 125 mL foram adicionados 2mL da amostra. Aps incubao por 15 minutos a 37C e 150 rpm, a reao foi interrompida e os cidos graxos extrados pela adio de 20 mL de uma soluo de acetona/etanol (1:1 v/v). Os cidos graxos eram, ento, titulados com uma soluo de NaOH (0,05 M) at pH 11.

Os brancos reacionais eram preparados colocando-se as amostras aps a incubao em agitador orbital e adicionando-se imediatamente acetona/etanol, realizando-se aps, a titulao. As dosagens de atividade foram feitas em duplicata e a mdia aritmtica dos valores encontrados foi utilizada para o clculo da atividade lipsica.


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Uma unidade de atividade lipsica foi definida como a quantidade de enzima que libera 1 mmol de cido graxo por minuto nas condies descritas acima que pode ser determinada atravs da equao 3.1 (Leal, 2000).

( )

=

AuAs

m

VdVctMVbVa

A

1000

(3.1)

Onde:

A = atividade lipsica (U/g); Va = volume da amostra titulada (mL);

Vb = volume do branco titulado (mL); Vc = volume da amostra usada na reao (mL); Vd = Volume do tampo usado para a extrao (mL); t = tempo de reao (minutos); M = molaridade da soluo de NaOH;

m = massa contida no erlenmeyer (g); As = massa da amostra seca (g); Au = massa da amostra mida (g).

Medida de atividade protesica Em tubos de polipropileno de 1,5 mL foram adicionados 0,5 mL de amostra

e 0,5 mL de soluo de azocasena1 0,5% (m/v) preparada em tampo acetato 50 mM pH 5,0. Os tubos foram ento incubados durante 15 minutos2 a 37C. Aps o perodo de incubao, a reao enzimtica foi interrompida adicionando-se 0,5 mL

1 Detalhes sobre preparo desta soluo ver Anexo 1

2 Tempo determinado aps acompanhamento cintico da reao utilizando algumas amostras


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de soluo de cido tricloro-actico (TCA) 10% (m/v), em banho de gelo. Os tubos com a mistura foram centrifugados a 12.900 x g por 20 minutos. Retirava-se ento 1 mL do sobrenadante, ao qual foi adicionado 1 mL de soluo de hidrxido de potssio 5 M. Fazia-se ento a determinao da absorbncia da soluo por espectrofotmetro (Agilent Tecnologies) em 428 nm. O branco das reaes era preparado adicionando-se a amostra aps a adio do TCA. O branco do aparelho foi preparado substituindo-se o volume de amostra por tampo acetato 50 mM pH 5,0.

Uma unidade de atividade protesica foi definida como a quantidade de enzima que produz uma diferena unitria de absorbncia por minuto de reao entre o branco reacional e a amostra nas condies de ensaio, determinada atravs da Equao 3.2 (Charney e Tomarelli, 1947).

( )

=

AuAs

m

VdVat

fAbsfAbs

A

bba

(3.2)

Onde:

A = atividade protesica (U/g); Absa = leitura de absorbncia da amostra; Absb= leitura de absorbncia do branco; f = fator de diluio; t = tempo de reao (minutos); Va = volume de amostra (mL); Vd = Volume do tampo usado para a extrao (mL); m = massa contida no erlenmeyer (g); As = massa da amostra seca (g); Au = massa amostra mida (g).


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Medida de crescimento celular Como forma indireta de quantificar o crescimento celular, foi utilizada a

dosagem de glicosamina, segundo Aidoo et al. (1981). Adicionou-se 5 mL de uma soluo de cido clordrico 6 M a 0,5 g de amostra, colocando-se a mistura em banho de gua fervente por duas horas. Em seguida, a amostra foi resfriada e filtrada a vcuo. Do sobrenadante, transferia-se 1 mL para um balo de 25 mL, adicionando-se uma gota de soluo alcolica de fenolftalena 0,5% (p/v). Logo aps, a neutralizao foi efetuada adicionando-se soluo de hidrxido de sdio 3 N, at que a mistura atingisse a colorao rosa. Procedia-se ento titulao reversa com uma soluo de KHSO4 1%, at que a colorao rosa desaparecesse. O volume do balo foi ento completado com gua destilada. Aps a etapa de extrao descrita acima, tomava-se 1 mL da soluo e adicionava-se mesma 1 mL de soluo de acetil acetona3 em Na2CO3 0,5 N, colocando a mistura em banho de gua fervente por 20 minutos. Aps o resfriamento das amostras, adicionava-se 6 mL de etanol, em seguida, 1 mL de reagente de Erlich4. Os tubos foram ento incubados a 65 C por 10 minutos, e a absorbncia lida em espectofotmetro (Agilent Tecnologies) a 530 nm. O branco foi preparado adicionando-se gua no lugar da amostra.

3.2.1.6 Estudo da Produo de Lipases

Uso de diferentes indutores O tempo e a temperatura de fermentao na etapa da escolha dos

indutores foram definidos em 48 horas e 27,5C, respectivamente, segundo resultados obtidos em estudo com Penicillium simplicissimum (Vargas, 2004). Os experimentos foram realizados em duplicata para a definio do melhor suplemento em funo da atividade lipsica obtida.

Os meios de cultivos foram suplementados com os diferentes indutores, numa concentrao de 1% (p/v), sendo eles: leo de oliva extra-virgem (Arisco);

3,4 Detalhes sobre preparo desta soluo ver Anexo 1


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leo de milho (Salada); leo de soja (Soya); leo de mamona (Delaware); melao (Usina Ester, Cosmpolis-SP); hidrolisado de levedura (Prodex lac - Prodeza- Mogi Mirim-SP); gua de macerao de milho (Corn Products do Brasil) e glicose (Nuclear). Utilizou-se farelo puro de soja com duas granulometrias: tyler 16-42 e tyler 35-60 para verificao da real necessidade de indutores e a influncia da granulometria na produo da enzima e avaliou-se tambm o efeito do meio de crescimento, utilizando-se inculo proveniente do meio basal e do meio PDA.

Para a fermentao em estado slido misturou-se o indutor em gua deionizada e homogeneizou-se com mixer por 2 minutos. O volume da mistura a ser adicionado no farelo de soja foi determinado de acordo com a umidade final desejada de 55% (Vargas, 2004), descontando-se 2,5 mL adicionados no momento da inoculao com a suspenso de esporos e a umidade presente no farelo.

A adio da mistura (gua e indutor) ao farelo foi feita por gotejamento manual com auxlio de pipeta volumtrica de forma que toda a rea do farelo fosse recoberta. Os bqueres foram ento tampados com manta acrlica e papel alumnio e autoclavados a 1,0 atm por 15 minutos. Aps o resfriamento dos bqueres, inoculou-se a suspenso de esporos previamente diluda at concentrao de esporos desejada (4x108 esporos/g). A concentrao de esporos da suspenso de estoque foi determinada por contagem em cmara de Neubauer aps diluio adequada (10-3).

Os bqueres contendo os meios de cultivo foram incubados em cmara de germinao temperatura de 27,5C por 48 horas com injeo de ar umidificado, de forma a manter a umidade da cmara em 99%. Ao final do tempo de fermentao, as amostras foram retiradas para posterior anlise.

Otimizao das condies de processo na produo de lipases A tcnica de planejamento de experimentos uma ferramenta estatstica que permite determinar as variveis que exercem maior influncia no desempenho de um determinado processo, assim como avaliar possveis inter-relaes entre variveis de um processo. Alm disso, essa ferramenta tambm permite otimizar o


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sistema em estudo, com o objetivo de maximizar ou minimizar uma resposta. A principal vantagem da utilizao desta ferramenta a reduo do nmero de experimentos e a conseqente reduo de custos (Barros et al., 1996).

Para que as condies de produo de lipases pelo fungo Penicillium verrucosum fossem otimizadas, utilizou-se a tcnica de planejamento fatorial de experimentos e anlise de superfcie de resposta.

Um planejamento fatorial completo 22 com dois pontos axiais para cada varivel independente e um ponto central repetido trs vezes foi realizado. O tempo de fermentao foi fixado em 48 horas. A metodologia de superfcie de resposta foi utilizada para determinar a influncia das variveis estudadas e otimizar as condies de cultivo para a produo de lipases por fermentao em estado slido.

As variveis e nveis estudados encontram-se na Tabela 3.2 e foram determinadas com base na experincia prvia do grupo (Capra et al; 2003) e trabalhos disponveis na literatura (Vargas, 2004).

Tabela 3.2. Variveis e nveis estudados no planejamento de experimentos 22 para otimizao das condies de processo.

Nvel Temperatura (C) Umidade (%) -1,41 15 30

-1 18,6 37,3 0* 27,5 55 +1 36,4 72,7

+1,41 40 80

* Ponto Central

Ao final dos experimentos, os resultados obtidos foram analisados usando-se o programa Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.,2001).

Cinticas de fermentao Para realizao do estudo cintico, avaliou-se o efeito da concentrao de

substrato, utilizando-se a condio otimizada da etapa anterior (sem adio de


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suplemento) e com adio de 0,5% e 2,0% de leo de soja. O tempo de fermentao foi de 156 horas, avaliando-se a atividade lipsica a cada 12 horas.

Avaliao de parmetros cinticos Com o intuito de avaliar a evoluo dos valores de crescimento celular e

dos valores do produto (atividade lipsica) formado em funo do tempo, determinou-se os parmetros cinticos ou parmetros de transformao. A Figura 3.2 demonstra algumas curvas de ajuste que permitem calcular os parmetros desejados.

Foram construdas curvas de Atividade Lipsica x Tempo e Concentrao de Glicosamina x Tempo de onde se retirou os valores para os clculos utilizando as equaes 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8 e 3.9 (Borzani et al., 2001).

Figura 3.2. Curvas de ajuste dos resultados de uma experincia idealizada de fermentao.

rX = dX/dt (3.3) rP = dP/dt (3.7) X = (1/X)*dX/dt (3.4) P = (1/X)*rP (3.8) PX = (Xf Xo)/tf (3.5) PP = (Pf Po)/tf (3.9) YX/P = X/P (3.6)


35

Onde: rX: velocidade instantnea de produo de biomassa; rP: velocidade instantnea de formao de produto; X: velocidade especfica de formao de biomassa num determinado tempo; P: velocidade especfica de formao de produto num determinado tempo; PX: Produtividade em biomassa; PP: Produtividade em produto; YX/P: Fator de converso de biomassa em produto; tf: Tempo de fermentao em que se deseja conhecer a produtividade.

A velocidade instantnea e o fator de converso (biomassa/produto) foram obtidos na fase exponencial de crescimento (t=48h); j os demais parmetros foram determinados no tempo desejado.

3.2.1.7 Caracterizao da lipase obtida por fermentao em estado slido

Temperatura e pH timos Na determinao dos valores timos de temperatura e pH para a atividade

lipsica, foi realizado um planejamento fatorial completo 22. Preparou-se a emulso utilizada como substrato para medida de atividade lipsica com diferentes valores de pH de tampo fosfato de sdio e as amostras foram incubadas a variadas temperaturas por 15 minutos e 150 rpm. As faixas de pH e temperatura estudadas esto relacionadas na Tabela 3.3. Os experimentos foram realizados em duplicata.

Temperatura de estabilidade A fim de determinar a temperatura de estabilidade do extrato enzimtico

obtido por fermentao em estado slido, este foi submetido diferentes temperaturas no banho termosttico, sendo estas: 25C, 35C, 45C, 55C, 65C.

As dosagens de atividade lipsica nos tempos 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 horas aps incubao foram realizadas conforme descrito anteriormente. Os experimentos foram realizados em duplicata.


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Tabela 3.3. Variveis e nveis estudados no planejamento fatorial completo 22 para temperatura e pH timos.

Nvel Temperatura (C) pH -1,41 29,95 4,88

-1 32 5,5 0* 37 7,0 +1 42 8,5

+1,41 44,05 9,11 * Ponto Central

pH de estabilidade Para determinao do pH de estabilidade, a enzima foi extrada com

tampo fosfato de sdio 100 mM formulados com os seguintes valores de pH: 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 e 7,5. O extrato enzimtico foi incubado a 50C e a determinao da atividade lipsica foi realizada conforme descrit

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