Introduo a tcnicas cromatogrficas
CROMATOGRAFIA = mtodo de separao no qual os constituintes de uma amostra a serem separados so distribudos entre 2 fases:
Estacionria: geralmente de grande rea, slida ou lquida Mvel: um fluido que percola atravs da fase estacionria
1903 - TSWETT, botnico russo: separao e isolamento de pigmentos de plantas em colunas de slica gel (cromatografia = color writing)ter de petrleo
mistura de pigmentos pigmentos separados
CaCO3
Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever] (grego)
Dcadas de 30 40 MARTIN & SYNGE: cromatografia partio Dcada de 50: TLC e GC
Dcada de 60: cromatografia permeao em gel Dcadas de 70 e 80: HPLC moderna
Cromatograma
o resultado da cromatografia.
Cromatgrafo
o equipamento atravs do qual se faz a cromatografia.
Tempo de reteno
o tempo que um analito fica em contato com a fase estacionria
Fase Estacionria: Slica (polar) Fase Mvel: Hexano (apolar)
Frente do solvente
Nvel do solvente
Amostra Fase mvel Fase estacionria Detetor
FASE MVEL:
Lquido Cromatografia Lquida (CL) HPLC Gs Cromatografia Gasosa (CG) CGAR Gs em condies supercrticas SFC (Cromatografia a fluido supercrtico)
Fluxo por gravidade
Cromatografia Clssica Tempo Volume de(min)0 5 10
FM (ml)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Massa residual (mg)0 0 23 61 36 88 40 4 0 11 20 10 3
C B AFE = CaCO3 FM = ter de Petrleo
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Cromatografia ClssicaCromatograma120 Massa residual (mg) 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Tempo (min)
Separao dos componentes da amostra
CROMATOGRAFIA
CFS Cromatografia a Fluido Supercrtico
CL Cromatografia a Lquido
CG Cromatografia a Gs
CL Planar
CL Coluna
Cromatografia Papel
CCD Cromatografia Camada Delgada
Coluna Empacotada
Coluna "Open Tubular" Capilar dc < 350 um
Coluna Capilar empacotada dc = 8 mm
FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.
Tcnica Pr-requisito GC
Analitos Interao Fase estacionria
Volteis e termicamente estveis (nas condies de operao)
HPLC
Solveis na fase mvel
Fase estacionria e fase mvel
Sensvel
a diversas amostras, incluindo orgnicas, biomolculas e ons - Pode-se analisar um universo de substncias significativamente maior do que por GC
Cromatografia de adsoro (slido-lquido) Cromatografia de partio (lquido-lquido) Cromatografia de troca inica Cromatografia por excluso de tamanho
Ligao Inica = transferncia de eltrons Na Cl Na+ction ons
Clnion
-
Ligao Covalente = compartilhamento de um par de eltrons entre 2 tomos APOLAR: H H F F O O H POLAR: + H Cl O + H N + H H F F O O
Descrio dos grupos de substncias Apolares
EXEMPLOS Hidrocarbonetos, lipdeos, polmeros plsticos... steres, cetonas, aldedos, lcoois, amidas, aminas, heterocclicos... Sais, cidos, bases... Ismeros estruturais, geomtricos e ticos. Protenas, enzimas, polissacardeos...
Polares
Inicos Ismeros Biopolmeros
ADSORO = tendncia de acmulo de uma substncia sobre a superfcie de outra, quando 2 fases imiscveis so colocadas em contatoFASE MVEL
FASE ESTACIONRIA (slida)
QUMICA = formao de ligaes qumicas FSICA = envolve interaes como pontes de hidrognio, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, etc
* temperatura : adsoro fsica adsoro qumica
Slida Apresenta na superfcie cargas inicas ou polares. Slica gel Alumina Florisil Carvo Carbonato de clcio
Exemplos:
polarFluxo
apolar
Separao de misturas em classes de compostos de diferentes polaridadesEstrutura -CH3 -F -Cl -NO2 -CH O -O-COCH3 -OH -CO-NH2 -COOHP O L A R I D A D E
Grupo funcional Metil Fluoro Cloro Nitro Aldedo Acetil Hidroxi Ceto Amino Carbonila
Fluorocarbonos Hidrocarbonetos saturados Olefinas Hidrocarbonetos aromticos Compostos halogenados teres Nitrocompostos steres ~ Cetonas ~ Aldedos lcoois ~ Aminas Amidas Lista em ordem crescente de tempo de reteno
PARTIO = distribuio de uma substncia entre 2 fases heterogneas fluidas, imiscveis entre si. Por exemplo: um gs e um lquido, ou 2 lquidos imiscveis
FASE ESTACIONRIA Fina camada de lquido que cobre as partculas de um suporte slido Este lquido pode ser: polar: polietilenoglicol, ODPN ( , -
oxidipropionitrila) apolar: hexano
FASE MVEL Sempre de polaridade contrria Alta estabilidade
FASE ESTACIONRIA Lquido quimicamente ligado ao suporte slido. FASE MVEL Sempre de polaridade contrria Alta estabilidade
MODO
GRUPO FUNCIONAL Dimetil silil
ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO Si CH3 CH3
FASE REVERSA
Octil silil Octadecil silil
Si Si
CH2 CH2
(CH2)6 (CH2)16
CH3 CH3
Fenil silil
Si
MODO
GRUPO FUNCIONAL Amino Ciano (nitrila)
ESTRUTURA DO GRUPO LIGADO NH2 CN
FASE NORMAL Diol
Si O Si O
O
CH2
CH OH
CH2OH
O
CH2
CH OH
CH2OH
1. 2. 3. 4.
Si OH + ROH Si OH + R3SiCl Si OH + SOCl2 Si Cl + RLi
Si OR
+ H2O
Si OSiR3 + HCl Si Cl Si R + SO2 + LiCl
apolar
polar polar
Fluxo
Hidrocarbonetos
aromticos, leos, esterides, plsticos, polmeros, alcalides (C18) urinrios, cidos carboxlicos, sulfonamidas, hormnios tireide, azocorantes (C8)
cidos
Classificao baseada na Natureza das Fases NPC RPC
Fase mvel Apolar hexano, isooctano Fase estacionria Polar slica, alumina Fase mvel Polar acetonitrila, metanol,
gua Fase estacionria Apolar C8, C18
GERALMENTE: NPC RPC
Cromatografia Adsoro Cromatografia Partio
FASE ESTACIONRIA = grupos inicos quimicamente ligados a um suporte (slica ou polmeros de alto PM). Pode ser: trocadora de ctions: grupo inico = sulfonato trocadora de nions: grupo inico = amnia quaternria
FASE MVEL = solues tampo (controle pH). Por exemplo: cido ctrico, fosfato de amnia, acetato de sdio, borato de sdio, etc. APLICAES = compostos inicos, aminocidos, protenas, peptdeos, etc
SO Na +
Suporte Polimrico ou de Slica
3
pH
Fluxo
+ SO 3 Na
A separao baseada no tamanho da molcula e no em fenmenos de interaes fsicas ou qumicas FASE ESTACIONRIA = partculas com dimetro mdio de poro fabricado sob medida. Assim, algumas molculas (menores) podem entrar nos poros pequenos, outras nos poros mdios, ou seja, so permeadas seletivamente. As molculas grandes so excludas excluso por tamanho.
FLUXO
Gel
Poro
Originalmente: separao de materiais biolgicos fase mvel = aquosa fase estacionria = gel de dextran/epicloridrina
FILTRAO EM GEL
Posteriormente: separao de polmeros fase mvel = solventes orgnicos fase estacionria = polmero tipo poliestireno
PERMEAO EM GEL
Controle
qualidade de polmeros de alto PM (assegurar propriedades fsicas) polmeros de baixo PM (poliestireno, ftalatos)
Separao
Tempo de reteno (tr) Largura do pico (wb)
Fator de Capacidade (k) Seletividade ( ) Resoluo (Rs) Fator de Simetria
Formato Ideal do Pico (Gaussiana)
Distribuio estatstica das molculas
A difuso pode causar alargamento do pico cromatogrfico
O Cromatograma
Rs = 2 ( tr2 tr1 ) / wb2 + wb1 Rs = separao real dos picos Rs = 0 (sem separao), Rs = 0,75 (separao ruim), Rs = 1,00 (separao parcial), Rs = 1,25 (separao da linha base).
A/B Ideal = 1
Rs
Cromatografia gasosa de alta resoluo
Substncias que podem ser arrastadas por um fluxo de um gs; Misturas cujos constituintes sejam volteis; De forma geral, CG aplicvel para separao e anlise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIO de at 300oC e sejam termicamente estveis.
2 1 3 4
6
5
1 - Reservatrio de Gs e Controles de Vazo / Presso. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatogrfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrnica de Tratamento (Amplificao) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).
1. 2. 3. 4.
Temperatura do forno Vazo do gs de arraste Escolha da fase estacionria Temperatura de injeo e do detector
A Fase Mvel em CG no interage com a amostra; ela apenas a carrega atravs da coluna. Assim usualmente referida como GS DE ARRASTE; Requisitos:
INERTE No deve reagir com a amostra, fase
estacionria ou superfcies do instrumento; PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionria.
2 4
1 3
1 - Septo (silicone) 2 - Alimentao de gs de arraste)
TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposio; Regra Geral: Tin = 50oC acima da j temperatura de ebulio do componente menos voltil; VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado fsico da amostra. Tpico: poucos microlitros (amostra lquida em coluna capilar)
Microsseringa de 10 L:
mbolo
agulha (inox 316)
corpo (pirex)
Coluna
EMPACOTADA (pouco usada) = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m
CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 mParedes internas recobertas
Depositados sobre a superfcie de: s-lidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares)FE lquida SUPORTE Slido inerte poroso Tubo capilar de material inerte
LQUIDOS
Para minimizar a perda de FE lquida por volatilizao, normalmente ela : Entrecruzada: as cadeias polimricas so quimicamente ligadas entre si Quimicamente ligadas: as cadeias polimricas so presas ao suporte por ligaes qumicas
Colunas recheadas com material finamente granulado (empacotadas) ou depositado sobre a superfcie
SLIDOS
AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO Maior flexibilidade na otimizao da separao; BOA ESTABILIDADE QUMICA E TRMICA Maior durabilidade da coluna, no reage com componentes da amostra; POUCO VISCOSA Colunas mais eficientes (menor resistncia transferncia do analito entre fases); DISPONVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA Colunas reprodutveis; ausncia de picos fantasma nos cromatogramas.
ColunaAlm da interao com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna Estrutura depende de sua PRESSO DE VAPOR p0 = f qumica (p0). Temperatur do analito a da colunaTemperatura da coluna Presso de vapor Velocidade de migrao
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR
FE Slidas: AdsoroO fenmemo fsico-qumico responsvel pela interao analito + FE slida a
ADSORO
A adsoro ocorre na interface entre o gs de arraste e a FE slida Slidos com grandes reas superficiais (partculas finas, poros) ADSORO Solutos polares Slidos com grande nmero de stios ativos (hidroxilas, pares de eletrons...)
- Grandes reas superficiais (at 102 m2/g).
Caractersticas - Slidos finamente granulados (dimetros de parGerais: tculas tpicos de 105 m a 420 m). Mais usados:
Polmeros Porosos Porapak (copolmero estireno-divinilbenzeno), Tenax (polixido de difenileno) Slidos Inorgnicos Carboplot, Carboxen (carves ativos grafitizados), Alumina, Peneira Molecular (argila microporosa) Principais Aplicaes:- Separao de gases fixos - Compostos leves - Sries homlogasGASES DE REFINARIA Coluna:Carboxen-1000 60-80 mesh; 15 x 1/8 TCO : 35oC a 225oC / 20oC. min-1 L Gs de Arraste: He @ 30 ml.min-1 Detector: TCD
FE Lquidas: PartioPOLIGLICISMuito polares; sensveis a umidade e oxidao; ainda muito importantes. Principal: Polietilenoglicol (nomes comerciais: H O OH Carbowax, DB-Wax, Supelcowax,CH2 CH2 etc.) HP-Wax, Estrutura Qumica:n
AMINAS ALIFTICAS Coluna:4 % Carbowax 20M s/ Carbopack B + 0,8% KOH TCO : 200oC L (isotrmico) Gs de Arraste: N2 @ 20 mL.min-1 Detector: FID Amostra: 0,01 L da mistura de aminas
Maior parte das aplicaes em CG moderna Quatro grandes grupos estruturais:
PARAFINAS
Apolares; alta inrcia qumica; praticamente abandonadas. Principais: esqua-lano (C30 H62 ), Apiezon (graxas para vcuo).
POLISTERES
steres de dilcoois com dicidos. Polares; altamente sensveis a umidade e oxidao; uso em declnio. Principais: DEGS, EGA, EGS.STERES METLICOS DE CIDOS GRAXOS Coluna:5%DEGS-PS s/ Supel-coport 100/120 mesh; 6 x 1/8 TCO : 200oC (isotrmico) L Gs de Arraste: N2 @ 20 ml.min-1 Detector: FID Amostra: 0,5 L de soluo em clorofrmio contendo 0,5 g de cada
O fenmemo fsico-qumico responsvel pela interao analito + FE lquida a
Partio
A partio ocorre no interior do filme de FE lquida Filmes espessos de FE lquida ABSORO Grande superfcie lquida exposta ao gs de arraste Interao forte entre a FE lquida e o analito (grande solubilidade)
SILICONES (polisiloxanas)CH3 Si CH3 R1 Si R2 CH3 Si CH3 H3C O O n CH3
As FE mais empregadas em CG. Cobrem ampla faixa de polaridades e propriedades qumicas diversas. R1, R2 = qualquer radical orgnico
- Ligao Si-O extremamente estvel = elevada estabilidade trmica e qumica das FE. - Silicones so fabricados em larga escala para diversas aplicaes = minimizao de custo do produto + tecnologia de produo e purificao largamente estudada e conhecida. - Praticamente qualquer radical orgnico ou inorgnico pode ser ligado cadeia polimrica = FE ajustveis a separaes especficas + facilidade de imobilizao por entrecruzamento
FE derivadas de polidimetilsiloxano (PDMS) por substituio de -CH3 por radicais orgnicos, em ordem crescente aproximada de polaridade:
Su Diferenas entre FE de composio similar provenientes de fornecedores diferentes:
Separao de pesticidas - FE = 100 % PDMS1 - TCNB 2 - Dichloram 3 - Lindano 4 - PCNB 5 - Pentacloroanilina 6 - Ronilano 7 - Antor 8 - pp-DDE 9 - Rovral 10 - Cypermetrin 11 - Decametrin
17 min
Coluna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 m) o o o o -1 TCO :195 C (6,5 min) / 195 C a 275 C (10 C.min ) L Gs de Arraste: He @ 35 cm.min-1 Detector: FID
Separao de piridinas - FE = 100 % CNpropilsilicone1 2 3 4 5 6 piridina 2-metilpiridina 2,6-dimetilpiridina 2-etilpiridina 3-metilpiridina 4-metilpiridina
3 min
Coluna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 m) o TCO :110 C (isotrmico) L Detector: FID Gs de Arraste: N2 @ 16 cm.min-1 Amostra: 0,1
L de soluo 1-2% das piridinas em 3-
Separao de fenis - FE = fenilmetilsilicones
50% Ph 50% Me 5% Ph 95% Me
Colunas empacotadasTubo de material inerte recheado com FE slida granulada ou FE lquida depositada sobre suporte slido. MATERIAL DO TUBOao inox vidro pirex nquel TEFLON MESH
= 3 mm a 6 mm L = 0,5 m a 5 mdp 177 - 250 m 149 - 177 m 125 - 149 m
Granulometria do recheio
60 - 80 mesh 80 - 100 mesh 100 - 120 mesh
Eficincia maximizada com: - Diminuio de dC - Diminuio de dp - Recheio regularLimitados pela resistncia passagem de gs de arraste
Colunas empacotadasA FE lquida deve ser disposta sobre um
SUPORTE slidoUso quase universal:
rea superficial entre 0,5 e 10 m2.g-1 microporos regulares (~ 1 m) NO interagir com a amostra boa resistncia mecnica
TERRA DIATOMCEA
Esqueletos fsseis (SiO2 + xidos metlicos) de algas microscpicas
secagem calcinao fuso com soda lavagem com cido silanizao
Chromosorb Anachrom Supelcoport ...
COLUNAS EMPACOTADASFE Lquidas: SuporteTamanho de Poro Densidade Aparente
Chromosorb - caractersticas geraisrea Superficial
NM OEC r ms r P ho o ob C r ms r W ho o ob C r ms r G ho o ob
m
2
.g
1
g l .m
1
m
Tratamentos especiais:
4 ,0 1 ,0 0 ,5
04 ,7 02 ,4 05 ,8
04- 2 , 8- 9 -
3 0 1 5 5
AW Lavado com cido, para remoo de metais NAW Sem lavagem com cido HP ou DMCS ou HDMS Silanizados (menor adsoro)
% M x. de FE
Chromosorb P Rseo, muito ativo. Chromosorb W Branco, mais inerte que o P. Chromosorb G Similar ao W, maior resistncia mecnicaOrdem crescente de inrcia
Colunas capilaresTubo fino de material inerte com FE lquida ou slida depositada sobre as paredes internas. MATERIAL DO TUBOslica fundida vidro pirex ao inox Nylon Silcosteel
= 0,1 mm a 0,5 mm L=5m a 100 m
Colunas de slica so revestidas externamente com camada de polmero (poliimida) para aumentar resistncia mecnica e qumica
Colunas Capilares x Empacotadas:CAPILARE S L = N Colunas mais eficientes Vi Dispositivos especiais de injeo
Separao de PAH com LVI (Vinj = 25 L, soluo 400 ppb em CH2Cl2)
Coluna: HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 m) TCO : 5 min a 50C / 20C min-1 / 2 min A 320C L Gs de Arraste: He @ 2 ml.min-1 Detector: FID
Temperatura de colunaTEMPERATUR A DA COLUNACONTROLE CONFIVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA
Forno da colunaCaractersticas Desejveis de um AMPLA FAIXA DE TEMPERATURA Forno: DE USO Pelo menos de Tamiente at b 400oC. Sistemas criognicos (T < Tamiente ) podem ser necessrios em b casos especiais. TEMPERATURA INDEPENDENTE DOS DEMAIS MDULOS No deve ser afetado pela temperatura do
TCO BAIXA: L
- Componentes mais volteis so separados - Componentes menos vol-teis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos
TCO ALTA: L
- Componentes mais volteis no so separados - Componentes menos volteis eluem mais rapidamente
Programao linear de Temperatura de colunaConsegue-se boa separao dos componentes da amostra em menor tempo Parmetros de uma programao de temperatura: TIN Temperatura Inicial I TFIM Temperatura Final tIN Tempo Isotrmico Inicial I tFIM Tempo Final do Programa R Velocidade de AquecimentoTEMPERAT URATFIM R TIN I tIN I tFIM
TEMPO
DetectoresDispositivos que examinam continuamente o material que sai da coluna, gerando sinal quando da passagem de substncias que no o gs de arraste
Grfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA dealmente: cada substncia separada aparece
Desempenho de detectoresQUANTIDADE MNIMA DETECTVELMassa de um analito que gera um pico com altura igual a trs vezes o nvel de rudoSINA L (S)
= S N 3RUDO (N)
RUDO Qualquer componente do sinal gerado pelo detector que no se origina da amostra
Fontes de Rudo
Contaminantes nos gases Impurezas acumuladas no detector Aterramento eltrico deficiente
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU TCD): Variao da condutividade trmica
do gs de arraste.
DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC OU FID) ons gerados durante a queima dos
eluatos em uma chama de H2 + ar. DETECTOR
OU ECD) Supresso de corrente causada pela
POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE
absoro de eltrons por eluatos altamente eletroflicos.
PRINCPIO:
DCT
Variao na condutividade trmica do gs quando da eluio de um analito.A taxa de transferncia de calor entre um corpo quente e um corpo frio depende da condutividade trmica do gs no espao que separa os corpos
Se a condutividade trmica do gs diminui, a quantidade de calor transferido tambm diminui - o corpo quente se aquece.
Cela de Deteco do DCT:
i5 4 2 1 3
1 Bloco metlico (ao) 2 Entrada de gs de arraste 3 Sada de gs de arraste 4 Filamento metlico (liga W-Re)aquecido
5 Alimentao de corrente eltricapara aquecimento do filamento
PRINCPIO
DIC
Formao de ons quando um composto queimado em uma chama de hidrognio e oxignioO efluente da coluna misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 + O2 no existem ons, ela no conduz corrente eltrica.
Quando um composto orgnico elui, ele tambm queimado. Como na sua queima so formados ons, a chama passa a conduzir corrente eltrica
COLETOR
ARFLAME TIP
H2BLOCO
COLUNAO ar e o H2 difundem para o interior do coletor, onde se misturam ao efluente da coluna e queimam: Uma diferena de potencial eltrico aplicada entre o flame tip e o coletor - quando se formam ons na chama, flui uma corrente eltrica:
Compostos que NO produzem resposta no DIC:Gases nobres NH3, NxOy
H2, O2, N2
SiX4 (X = halognio)
CO, CO2, CS2
H2 O
CCl4, peralogenados
HCOOH, HCHO *
PRINCPIO
Captura de eltrons
Supresso de um fluxo de eletrons lentos (termais) causada pela sua absoro por espcies eletroflicas Um fluxo contnuo de eletrons lentos estabelecido entre um ando (fonte radioativa -emissora) e um catodo.
Na passagem de uma substncia eletroflica alguns eletrons so absorvidos, resultando uma supresso de corrente eltrica.
2 3
1
4 5 1 2 4Anodo (fonte radioativa - emissora)
Sada de gases Cavidade
3 5
Catodo Coluna cromatogrfica
HPLC
CLAECromatografia Lquida de Alta Eficincia
HPLC ModernaInjetor Pr-coluna
Reservatrios para os solventes
Bomba HPLC Coluna Analtica
Sistema de Tratamento de Dados
Detector Filtro em linha Scavenger
Velocidade
fluxo
0,1-3,0 mL/mim para colunas analticas > 5,0 mL/min para colunas preparativas
Presso
operao
500-2000 psi para colunas analticas
Entrada
Filtros
Tubo
Recheio
Filtro Sada
Serve para proteger a coluna de separao. Fase e dimetro iguais aos da coluna de separao. 10-20% do comprimento da coluna de separao
ISOCRTICA = a composio da fase mvel no muda durante a corrida. = a composio da fase mvel varia durante a anlise, de acordo com a natureza dos analitos.
GRADIENTE
Passo Solve
1
30
Solvatante Baixa Viscosidade Transparncia no UV No Fluorescncia
Baixa presso de vapor Atxico No corrosivo No inflamvel Baixo Custo
Agitao mecnica ou magntica
Aquecimento Banho
de ultrassom a vcuo de gs inerte
Filtrao
Borbulhamento
Solvente de base gua / tampo Metanol Acetonitrila THFFora de eluio
Solventes moduladores
Solvente de base n-hexano Solventes moduladores Clorofrmio Acetato de etila MetanolFora de eluio
Equipamento com uma pequena clula de fluxo conectado na sada da coluna e que monitora a concentrao dos analitos. mais comuns: UV/Vis (absorvncia) ndice de Refrao Espectrmetro de Massas Fluorescncia Outros: Eletroqumico, Condutividade,
Detectores
Infravermelho, etc.
PRINCPIO: quando vrios grupos funcionais so expostos radiao, sofrem excitao eletrnica a qual resulta na absoro de energia em comprimentos de onda especficos para os grupos. Comprimento de onda: 210-380 nm UV Comprimento de onda: 380-800 nm Visvel 90% compostos orgnicos absorvem luz em alguma regio do UV-Vis 65% das amostras analisadas por CL absorvem luz na regio de comprimento de onda = 254 nm
Detector UV-VIS
Detectam compostos com fluorescncia natural (aflatoxinas) ou que se tornam fluorescentes aps reao de derivao (cloreto dansyl, fluorescena, OPA)
PRINCPIO: mede a mudana do ndice de refrao do efluente da coluna IR : caracterstica fsica de cada composto IR da substncia analisada IR da fase mvel Anlise isocrtica, controle de temperatura Detector universal, no seletivo e pouco sensvel Aplicaes: separaes preparativas, cromatografia de excluso por tamanho, acares, etc.
SENSIBILIDADE Fluorescncia: 1.000 vezes mais sensvel que
UV-Vis UV-Vis: 1.000 vezes mais sensvel que IR ESPECIFICIDADE
Aumenta com a sensibilidade
Amostra: Coluna:
quantidades indicadas ao lado
50 l,
SB-C18 4,6 x 75 mm 3,5 m
Fase Mvel:
70 mM KH2PO4 1 mM EDTA/ACN:gua 97/3 pH 4,5; ml/min; 1,5
Fluxo:
Temperatura: ambiente Eletroqumico Detetor:
Fluorescencia.
Pode-se efetuar anlises qualitativas e quantitativas com rapidez mais moderna
Tecnologia Pode-se
fazer identificaes de substncias de forma inequvoca
e- 70 eV70 e- < eV A+
ABC
A B C+ . e- de baixa energia.
+BC A.
AB.
.
+ C+
+ B C+ A B+ + C A+ + B
B+ + C B + C+
A + B+
Partculas
da fase estacionria extremamente pequenas (dimetro < 10 m) bombas para operaes a altas presses (at 2000 psi) e baixas vazes (0,1 a 10 mL / min) especiais e ultra-puros
Solventes
Detectores
seletivos e supersensveis, com tamanho de clula de deteco < 10 L
Vantagens da HPLC: Alta resoluo
resolve (separa) at centenas de componentes em amostras complexas Deteco de alta sensibilidade detecta at nos limites de pg - ng Anlises rpidas e precisas anlises de 1 - 60 min, preciso de 1% RSD Anlises automatizadas usando injetor automtico e sistema de tratamento de dados
Substncias qumicas Pouco volteis Polares ou inica Macromolculas Termicamente instveis Enanciomricas Biomolculas
Requisito: A mistura a ser analisada deve ser solvel na fase mvel.
Amostra
PM < 1.000 Insolvel gua Solvel hexano Solvel metanol Amostra no-aquosa NPC (slica) NPC (fase ligada) Solvel gua
PM > 1.000
No-inica
Inica
Amostra aquosa RPC RPC "ion-pair" Cromatografia troca inica
Biopolmeros solveis gua Polmeros insolveis gua Condies no-desnaturantes Preparativa Informao tamanho Cromatografia permeao gel Cromatografia filtrao gel Preparativa Cromatografia troca inica RPC Condies desnaturantes (separao analtica)
Todos os clculos so feitos a partir da rea de um pico, fornecida ao final da corrida; Os compostos de interesse no podem sofrer adsoro, decomposio trmica ou decomposio cataltica no sistema cromatogrfico; Os padres devem ter alta pureza; O pico de interesse deve corresponder a somente uma substncia, ou seja, no deve ocorrer coeluio.
A quantidade de massa analisada deve estar na faixa linear de resposta do detector, do amplificador e do sistema de integrao; Conhecimento mximo possvel da amostra (presena de substncias no detectveis e /ou no eludas); Repetibilidade.
Do
volume injetado; Da concentrao da substncia; Do fator de resposta de uma dada substncia em determinado detector.
Considera que o fator de resposta o mesmo para todas as substncias. Assim, a composio percentual de um composto A dada por:
SA %A = x100 S Onde SA a rea do pico correspondente substncia A e S a rea total do cromatograma.
VANTAGENS
DESVANTAGENS
Simples e prtica; Independe do volume injetado; Independe da estabilidade do aparelho; No necessria a utilizao de padres.
No serve para amostras complexas; Exige o registro de todos os componentes da amostra; No adequada para anlise de pequenas concentraes; Normalmente a exatido baixa; Presume que todos os constituintes tem a mesma resposta no detector.
Em
uma anlise do progresso da reao A B, retirou-se uma alquota do meio reacional e realizouse uma anlise por CGAR, resultando em um pico de rea 3500 para o composto A e 5000 para o composto B. Qual o rendimento da reao?
Anloga
normalizao interna, mas leva em considerao os diferentes fatores de resposta de cada substncia. Esses fatores so determinados atravs da injeo de padres de concentrao conhecida de todos os constituintes da amostra.
Uma amostra de duas substncias, A e B foi analisada cromatograficamente, obtendo-se dois picos distintos, de reas iguais a 200 e 400 respectivamente. A fim de se determinar os fatores de resposta, foi injetada uma amostra contendo a mesma concentrao de cada substncia, resultando em reas iguais a 120 e 80. Qual a composio da amostra?
Anloga
utilizada em espectrofotometria. Desta vez, temse a curva de calibrao em rea x concentrao. Para facilitar os clculos, injeta-se sempre o mesmo volume; As condies do cromatgrafo devem ser mantidas constantes.
VANTAGENS
DESVANTAGENS
possvel quantificar apenas um pico; Independe da deteco de todos os constituintes da amostra (serve para amostras mais complexas); Possvel anlise de concentraes pequenas (traos).
Depende do volume injetado (evitvel), que carrega uma incerteza; Depende da estabilidade do cromatgrafo e do detector durante todo o anlise.
muito difcil analisar amostras exatamente nas mesmas condies dos padres; Um padro injetado concomitantemente amostra de concentrao desconhecida; Escolha do padro interno:
No deve estar presente na amostra; Deve ter comportamento cromatogrfico similar ao
da substncia a ser analisada; Estar numa concentrao conhecida; Ser termicamente estvel; No ficar adsorvido na fase estacionria; T.R. diferente dos constituintes da amostra.
A curva de calibrao tem a forma:Sx CX = f X / PI S PI C PI
Onde
Sx a rea do pico correspondente substncia x; SPI a rea do padro interno; C as concentraes e f o fator relativo.
Preparam-se vrios padres com vrias concentraes conhecidas da substncia a ser analisada; Adiciona-se uma quantidade conhecida do padro interno, de modo que as reas (do padro e do PI) sejam semelhantes; Constroi-se um grfico em que o eixo X a razo da concentrao (ou massa) da substncia em anlise pela concentrao (ou massa) do padro interno e o eixo y a relao entre as reas da substncia X e do padro interno; Para anlise da amostra desconhecida introduz-se, de preferncia, a mesma quantidade de padro interno utilizada no preparo dos padres; Injeta-se a mistura, calculam-se as reas da substncia e do PI e as relaes entre elas e interpola-se no grfico obtido anteriormente, de modo a se obter a relao de concentrao. E, a partir do resultado obtido, calcula-se a concentrao de X na amostra desconhecida.
VANTAGENS
DESVANTAGENS
No so necessrios vrios padres, como acontece na normalizao das reas; As mesmas da padronizao externa e mais: Volume injetado e
Dificuldade na escolha de um padro interno que atenda a todos os requisitos necessrios para uma dada anlise;
estabilidade do cromatgrafo deixam de ser um fator limitante
Anlise
de cloreto de vinila, usando hexano como padro interno. Construo da curva:
Y
= 1,1436x 0,0125 Pela relao das reas obtidas, y = 1,458. Nesse ponto, X = 1,286. Assim:Cx = 1,286 C PI C x = 1,286C PI = 1,286 x 2 = 2,573 ppm