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SUMRIO
INTRODUO ......................................................................................... 3
2 MEIOS DE CULTURA .......................................................................... 8
3 ISOLAMENTO .................................................................................... 103.1 MTODOS CLSSICOS .............................................................. 11
3.1.1 TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS ........................ 113.1.2 TCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO .......... 123.1.3 TCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO ......... 123.1.4 TCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE ............. 143.1.5 TCNICAS EM CULTIVO LQUIDO ...................................... 153.1.6 ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTNUO ............................ 16
3.2 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS ESPECFICOS ............ 173.2.1 ISOLAMENTO DE FUNGOS ................................................. 173.2.2 ISOLAMENTO DE BACTRIAS ............................................ 183.2.3 ISOLAMENTO DE ALGAS .................................................... 193.2.4 ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS .................................. 19
4 NOVOS METODOS ............................................................................ 224.1 BASE DOS MTODOS ................................................................ 22
4.1.1 PCR (REAO EM CADEIA DA POLIMERASE) .................. 234.1.2 MARCADORES MOLECULARES ......................................... 26
4.2 MTODOS BASEADOS NA HIBRIDIZAO .............................. 264.2.1 SOUTHERN BLOT ................................................................ 27
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4.2.2 NORTHERN BLOT ................................................................ 274.3 MICROARRANJO ........................................................................ 28
4.4 MTODOS BASEADOS EM MARCADORES DE DNA ............... 29
4.4.1 SSCP ..................................................................................... 294.4.2 DGGE/TGGE ......................................................................... 304.4.3 RFLP ..................................................................................... 314.4.4 VNTR ..................................................................................... 31
5 METAGENOMICA .............................................................................. 325.1 METAGENMICA X OUTRAS TCNICAS ................................. 335.2 A ESTRATGIA DA METAGENMICA ....................................... 355.3 VANTAGENS DESVANTAGENS ................................................. 36
REFERNCIAS ..................................................................................... 38ANEXOS ................................................................................................ 41
ANEXO 1 - Isolation, identification and physiological study of
Lactobacillus fermentumLPB for use as probiotic in chickens ..................... 41ANEXO 2 - Isolation and serological identification of enteropathogenic
Escherichia coliin pasteurized milk in Brazil ................................................. 47
ANEXO 3 - Isolation, properties and kinetics of growth of a
thermophilic Bacillus..................................................................................... 53
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INTRODUO
O crescimento acelerado da populao mundial acentua a preocupaoem relao produo e demanda de alimentos, novos medicamentos, fontes
alternativas de energia entre outras preocupaes com o bem estar das
pessoas, isso sem esquecer-se da conservao do meio ambiente. Neste
sentido, a Biotecnologia apresenta grande contribuio, j que permite o
desenvolvimento de novas e modernas tcnicas sem agredir tanto o meio
ambiente quanto as alternativas oriundas do petrleo, por exemplo. Nestas
tcnicas, a utilizao de microorganismos constante e serve aos mais
diversos fins, como na fixao de nitrognio, no controle biolgico de pragas,
na degradao de resduos no meio ambiente, nas fermentaes, no
desenvolvimento de novos medicamentos e tcnicas de diagnstico, entre
outros. Assim, a explorao dos recursos naturais, realizada com a aplicao
de tcnicas biotecnolgicas que utilizam microorganismos, permite a utilizao
de reas consideradas inicialmente inaproveitveis ou o melhoramento de de
tcnicas j conhecidas. Isto permite a reduo de custos, alm de contribuir
para um menor consumo energtico e para a preservao ambiental. As
vantagens apresentadas na aplicao de tcnicas biotecnolgicas que utilizam
microorganismos propiciaram o reconhecimento da importncia das colees
de culturas de microorganismos ou centros de cepas (que podem fornecer
microrganismos de caractersticas j conhecidas), bem como o aumento da
demanda desse material por parte de universidades, institutos de pesquisa e
empresas.
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Muitas vezes, porm, no se consegue o microrganismo ideal em um
banco de culturas. Para se fazer uso dos microrganismos, ento, deve-se
colet-los, isol-los, testar e medir a sua produo para ento utiliz-los em
larga escala (se for o caso). Um grande exemplo do uso de microrganismo est
na fermentao, j que ele constitui um dos quatro pilares de um processo
fermentativo, ou seja, sua seleo de extrema importncia, pois ele ditar
procedimentos e caractersticas que se seguiro at a obteno do produto
final.
Isolar um microrganismo consiste em obter culturas puras que envolvem
somente o organismo de interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleo de
uma colnia atravs da observao de certas caractersticas como a produo
de determinado produto ou mesmo da prpria morfologia da colnia.
Uma cultura livre de outros microrganismos contaminantes onde o
microrganismo de interesse est presente de forma homognea denominada
cultura axnica. Um cultivo desse tipo d oportunidade de investigao de
caractersticas fisiolgicas e genticas sem a interferncia de outros
microrganismos. Entretanto, muitas vezes um organismo apresenta
determinada atividade ou produo de determinado metablito justamente
devido s interaes com o meio em que est inserido. Isolado, esse
microrganismo pode apresentar a caracterstica investigada em menor
proporo ou mesmo no apresent-la.
O isolamento inicia com a escolha da fonte mais provvel de conter o
microrganismo desejado, podendo variar desde solo at guas, ar, lodo,
alimentos ou rgos. Caractersticas que um determinado organismo possui
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para se desenvolver em certo ambiente so usadas como fatores seletivos no
processo de isolamento.
O solo contm uma grande variedade de microrganismos (apenas 1g desolo apresenta de 1 a 10 milhes de espcies de microrganismos), incluindo
bactrias, fungos, protozorios, algas e vrus. Apesar desta diversidade, os
microrganismos cultivveis predominantes entre a microflora do solo so
fungos e bactrias heterotrficas do domnio Bacteria. preciso, contudo, levar
em considerao que a flora microbiana presente numa amostra de solo
depende de vrias caractersticas do solo particular em estudo (por exemplo,
umidade, pH, temperatura, contedo em oxignio gasoso e composio em
material orgnico e inorgnico); e que, alguns destes parmetros ambientais
podem variar, por exemplo, ao longo do ano ou em funo do tipo de utilizao
que dada ao solo (por exemplo, tipo de cultura agrcola, pastoreio, etc.).
Estima-se que somente 1 a 9% de microrganismos presentes no solo
so capazes de formar colnias em meios de cultura laboratoriais, como o
caso dos meios TSA ou PDA. Os outros 91 a 99% da flora bacteriana do solo
correspondem principalmente a clulas no cultivveis.
O isolamento, assim como todo o processo que ir se desenvolver
futuramente, deve ser o mais econmico possvel, levando-se em considerao
a produtividade que ser obtida pelo microrganismo e os gastos necessrios
para isolamento e manuteno do microrganismo em questo. Fatores
importantes na escolha de um microrganismo so: suas caractersticas
nutricionais, pois se almeja obter microrganismos que utilizem substratos
baratos; a temperatura tima, visando o menor gasto com aquecimento ou; a
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compatibilidade com o fermentador utilizado e com o processo de cultivo
desejado; e a estabilidade gentica. Pode ser mais barato comprar uma cultura
do que isol-la da natureza, mas tambm pode ser que se encontre um
organismo muito melhor depois de uma procura extensa no meio ambiente.
Entretanto, geralmente necessrio utilizar uma cepa dos bancos como uma
referncia para comparao com novos microrganismos descobertos atravs
do isolamento da natureza.
Em qualquer laboratrio de pesquisa ou de produo que envolva o uso
de microrganismos, todas as operaes tcnicas devem ser realizadas em
ambientes controlados quanto sua esterilidade. A no-observncia deste
requisito pode dar origem a contaminaes por bactrias e fungos, que
determinam o descarte do produto, impedindo o cumprimento dos
compromissos de produo assumidos e alterando a relao de custo prevista.
Medidas de precauo devem ser tomadas para evitar a contaminao do
ambiente onde so processados produtos da complexidade dos
imunobiolgicos. Especial ateno deve ser dispensada ao treinamento do
pessoal tcnico que trabalha nessas reas, quanto higiene pessoal e
utilizao correta de vestimentas prprias para atividades em reas
controladas, por constituir-se no principal veiculador de partculas viveis,
sejam esporos fngicos ou bactrias. Tambm importante que a amostra seja
identificada com o maior nmero de detalhes (data da coleta, parmetros do
ambiente como pH, temperatura, presso, salinidade, entre outros).
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A tabela 1 mostra o nmero de espcies de seres vivos atualmente
conhecidas e a estimativa das espcies existentes no mundo. Mais adiante
sero abordadas novas tecnologias baseadas na biologia molecular que
realmente contribuem na descoberta desses novos microrganismos, auxiliando
na explorao de toda a diversidade disponvel no planeta.
TABELA 1 - Nmero de espcies de seres vivos atualmente conhecidase estimativa de espcies existentes no mundo
FONTE: AZEVEDO, 1998.
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2 MEIOS DE CULTURA
Os microrganismos tal como outros organismos vivos necessitam deobter os nutrientes apropriados do seu meio ambiente. Para realizar o
isolamento de um microrganismo corretamente, portanto, imprescindvel o
uso de meio de cultivo adequado, levando em conta pH, aerao, presso
osmtica, entre outros fatores. O meio de cultura um material nutriente
preparado em laboratrio, lembrando sempre da correta assepsia, cuja
utilizao importante tanto para o crescimento quanto para transporte e
armazenamento de microrganismos.
Nos meios slidos (os que contem gar) o crescimento pra por
exausto de nutrientes, devendo realizar-se a transferncia de colnias para
novo meio. No entanto estes meios permitem a individualizao das colnias.
Os meios lquidos (sem gar) permitem melhor difuso de metablitos, mas
no o isolamento de colnias.
Os meios de cultivo podem ser:
Meios sintticos (quimicamente definidos): so aqueles em que a
composio qumica exata conhecida. So utilizados normalmente em
trabalhos experimentais em laboratrios ou para o crescimento de seres
autotrficos.
Meios complexos: so aqueles que apresentam algum componente
com composio varivel. Nesse caso esto includos extratos de leveduras,
de carne, de plantas ou produtos da digesto protica como peptonas. O meio
na forma lquida chamado de caldo nutriente; na forma slida, gar nutriente.
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A tabela 2 mostra alguns tipos de meio de cultivo existentes e em que
ocasies eles devem ser utilizados.
TABELA 2 Meios de cultura
Tipo FinalidadeQuimicamentedefinido
Crescimento de quimioautotrficos e autotrficos e anlisesmicrobiolgicas.
Complexo Crescimento da maioria dos organismos quimio-heterotrficos.
Redutor Crescimento de anaerbios obrigatrios.
Seletivo
Impedir o crescimento de microrganismos no desejados;favorecer o crescimento do organismo de interesse (meioscom telurito de potssio para isolamento de Corynebacteriumdiphtheriae, gar Salmonella-Shigella (SS) e garMacConkey, meios com sais biliares e verde brilhante paraisolamento seletivo de Salmonella)
Diferencial
Diferenciar colnias do organismo de interesse dos outrosmicrorganismos (meio de Teague ou Eosina Azul deMetileno diferencial para coliformes, gar MacConkey para adiferenciao de enterobactrias, gar sangue, agar Baird-
Parker para isolamento e diferenciao de cocos Grampositivos)
Enriquecimento
Semelhante ao seletivo, mas com a caracterstica importantede aumentar o nmero de bactrias de interesse tornando-adetectvel (Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivode Salmonelas, Caldo Tioglicolato para Clostridiumperfringens.)
Fonte: Adaptado de TORTORA et al., 2006.
Alm desses, existem meios com funes menos conhecidas, como os
meios de triagem (para avaliar determinadas atividades metablicas permite
caracterizao e identificao presuntiva de muitos microrganismos), os meios
de identificao (para a realizao de provas bioqumicas e verificao de
funes fisiolgicas de organismos), os meios de dosagem (determinaes de
vitaminas, antibiticos e aminocidos), entre outros.
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Alm do que j foi citado existem, ainda, tcnicas de sucesso que
combinam a utilizao de diferentes meios para aumentar o numero de
isolados ou direcionar o isolamento para uma dada linhagem, por exemplo.
3 ISOLAMENTO
O isolamento inicia com a escolha da fonte mais provvel de conter o
microrganismo desejado. Caractersticas que um determinado organismo
possui para se desenvolver em certo ambiente so usadas como fatores
seletivos no processo de isolamento.
Depois de recolhida a amostra, a cultura pode necessitar ou no de um
pr-tratamento ou enriquecimento do meio sinttico onde a cultura ser feita. O
pr-tratamento uma etapa que facilita o isolamento do microrganismo e
poder ou no ser seguido de um enriquecimento. Ele aplicado em amostras
que no podem ser utilizadas de imediato. O enriquecimento geralmente
aplicado em amostras onde se sabe que o nmero de microrganismos de
interesse pequeno em comparao com o nmero dos outros que l se
encontram. Nesse caso, as condies de cultivo geralmente favorecem o
crescimento e multiplicao do microrganismo de interesse. Apenas depois
dessa(s) etapa(s) o isolamento, chamado de indireto, poder ser seguido,
fazendo-se a caracterizao do microrganismo.
Caso no haja necessidade de nenhum dos dois tratamentos, a
caracterizao do microrganismo poder ser realizada. Se for necessrio um
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pr-tratamento, este poder ou no ser seguido de um enriquecimento. Apenas
depois dessa etapa o isolamento, dito indireto, poder ser feito seguido da
caracterizao do microrganismo.
3.1 MTODOS CLSSICOS
3.1.1 TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS
Esse mtodo tambm chamado de esgotamento de ala. Atravs de
uma ala de platina, de um fio de platina ou at mesmo um swab, coleta-se
uma pequena parcela da colnia crescida no meio e espalha-se sobre uma
placa de Petri com gar fazendo movimentos em zigue-zague, formando um
caminho na forma de estrias. importante que a cada mudana de direo no
estriamento, uma parte da amostra anterior seja arrastada para o esgotamento,
para garantir que a cultura continue no procedimento e que se produza o efeito
de diluio. Numa nova seleo, devem ser escolhidas as culturas mais
diludas, que tm maior chance de estarem mais isoladas. A figura 1 ilustra a
direo das estrias na placa, bem como o efeito de diluio esperado, onde em
algumas regies observam-se colnias isoladas.
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FIGURA 1 Semeadura por estrias
FONTE: TORTORA, et al, 2006
3.1.2 TCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO
Essa tcnica (ilustrada pela figura 2) consiste em despejar um pequeno
volume da soluo de microrganismos ( em geral contendo de 30-300 clulas)
no centro de uma placa de Petri com gar j solidificado com o auxlio de uma
pipeta estril. Em seguida, utiliza-se de uma ala de Drigalski j flambada (de
modo a manter a esterilidade) para espalhar aquele volume depositado por
toda a superfcie do gar. As colnias crescem espalhadas por toda a
superfcie do Agar, por isso essa uma tcnica muito utilizada para purificao
de colnias.
3.1.3 TCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO
O mtodo de semeadura por derramamento, ou tambm conhecido por
pour plate muito utilizado para bactrias e fungos, principalmente para
contagem de micro-organismos cultivveis na amostra. A amostra original
diluda de forma a se otimizar a separao de colnias. Um pequeno volume da
melhor diluio (que deve ser previamente testada) ento derramado em uma
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placa de Petri sem gar. Em seguida, derrama-se gar fundido na temperatura
de 45C e mistura-se os dois com uma agitao leve da placa, deixa-se o meio
solidificar e incuba-se essa placa. As colnias se desenvolvero tanto acima
quanto abaixo da superfcie (colnias internas). Deve-se tomar cuidado com
microrganismos sensveis ao calor, pois eles certamente podem ser
danificados pelo gar fundido e podem ficar impossibilitados de formar
colnias.
A figura 2 ilustra um comparativo entre o mtodo do espalhamento e o
pour plate.
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FIGURA 2 Comparativo entre a tcnica de semeadura porespalhamento e o pour plate
FONTE: Black, 2002.
3.1.4 TCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE
Utilizando uma agulha de platina e semeia-se o material contido nela
picando um gar slido contido num tubo. Com isso haver o crescimento de
microrganismos em anaerbios no fundo e aerbios perto da superfcie do
gar. Alm disso, possvel observar caractersticas de mobilidade de
microrganismos. A figura 3 ilustra o processo.
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FIGURA 3 Tcnica de semeadura em profundidade
Fonte: Adaptado de DROVAL, LIMA e HABU, 2001
3.1.5 TCNICAS EM CULTIVO LQUIDO
Geralmente os meios lquidos proporcionam um grande aumento de
determinada populao microbiana. Tambm utilizado quando o
microrganismo inibido pelo meio slido ou no capaz de formar colnia, um
exemplo disso so algumas bactrias que no crescem em meio solido devido
a sua baixa atividade de gua. Para cultivos lquidos, utiliza-se a tcnica das
diluies sucessivas. Toma-se 1g ou 1ml da amostra e dilui-se em 9ml de,
geralmente, uma soluo salina 0,85%. Dessa diluio, toma-se novamente
1ml, que diludo novamente em 9ml de soluo, obtendo a diluio
correspondente a 10-2, e assim sucessivamente, como mostra a figura 4.
Espera-se que em certo momento se obtenha culturas provenientes de
somente uma nica clula. dessa forma que feita o isolamento e a
contagem de clulas de Escherichia coliem guas ou alimentos, por exemplo,
ou para algas, visto que seu habitat natural , em geral, aqutico. Toma-se
para isolamento, em geral, as trs ltimas diluies. A tcnica pode ainda ser
utilizada como prvia para isolamento em cultivo slido.
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FIGURA 4 Diluies sucessivas
FONTE: Adaptado de PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.
3.1.6 ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTNUO
Mtodos de isolamento dependendo da capacidade de desenvolvimento
de um microrganismo em determinado meio, sendo que para isso ele dever
produzir um nmero muito maior de clulas do que em relao aos outros.
Cultivo em meio de enriquecimento geralmente feito em Erlenmeyers.
No entanto, o crescimento de um determinado organismo oriundo de uma
amostra variada na forma de batelada pode resultar numa mudana dascondies do meio, e, portanto, ocorre uma variao nas presses seletivas.
Isso pode ser reajustado inoculando uma parcela desse meio de
enriquecimento em um novo meio idntico ao inicial. Aps um bom
desenvolvimento do microrganismo desejado, semeia-se uma alquota em meio
slido.
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A prevalncia do microrganismo desejado com relao aos outros
depender da taxa mxima de crescimento dele com relao aos outros
organismos capazes de tambm crescer no meio. Portanto, aquele capaz de
crescer mais rapidamente com os substratos disponveis ter um nmero maior
de clulas. Em um cultivo contnuo, a taxa de crescimento depende da taxa de
diluio e da concentrao do substrato limitante.
Essa tcnica bastante utilizada na seleo de microrganismos para a
produo de biomassa, mas tambm j foi usada para o isolamento de
bactrias produtoras de enzimas
3.2 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS ESPECFICOS
3.2.1 ISOLAMENTO DE FUNGOS
Expor placas de Petri, contendo gar Sabouraud dextrose durante 15
minutos em diferentes locais. Cultivar temperatura ambiente. Aps 4 dias
realizar a contagem de colnias crescidas e iniciar a identificao das mesmas.
ISOLAMENTO DE FUNGOS DE LQUIDOS
Para o isolamento de fungos que utilizam a gua como via de disperso,
utiliza-se tcnicas de diluio comuns e semeadura em agar Sabouraud.Para o
isolamento de fungos aquticos, as tcnicas so especficas.
Semeia-se 1 ml da amostra do lquido em agar Sabouraud. Espalhar
com ala de platina e cultivar temperatura ambiente. Aps 4 dias realiza-se a
contagem de colnias crescidas e inicia-se a identificao das mesmas. Em
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alguns casos necessrio proceder diluio da gua e semear pela tcnica
de pour plate.
ISOLAMENTO DE DERMATFITOS DO SOLO (Mtodo deVanbreuseghen)
Esta tcnica permite-nos conhecer a biologia dos dermatfitos, seus
ciclos evolutivos e sua ocorrncia em determinada regio. Os dermatfitos tm
a capacidade de crescer em queratina e, devido a este fato, utilizamos plos e
outro material que a contenha como isca para "pescar o dermatfito.
Colocar uma quantidade de terra em placa de Petri estril. Espalhar os
plos sobre a superfcie da terra. Umedecer com gua estril. Fechar e
identificar a placa. Deixar temperatura ambiente, observando-a
periodicamente. Aps crescimento de miclio branco penugento ao redor dos
plos, examin-los entre lmina e lamnula com uma gota de lactofenol azul
algodo.
ISOLAMENTO DE FUNGOS DE SUBSTRATOS ALIMENTARES
Faz-se uma suspenso do substrato em gua destilada estril
(g/ml), uma diluio seriada e semeia-se pela tcnica pour plate em agar
batata acidificado. O material ser diludo adequadamente e a semeadura ser
realizada na superfcie do gar.
3.2.2 ISOLAMENTO DE BACTRIAS
Bactrias existem em grande variedade na natureza, e cada tipo
necessita de um meio de isolamento diferente. Algumas necessitam gar
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suplementado com extratos na concentrao de 10 a 50% do volume total,
outras necessitam de infuses feitas do material da onde foram coletadas (solo,
lama, folhas, pedras, troncos, detritos). Podem ser usados tambm alguns
meios seletivos como gar sangue, verde bile brilhante, MRS, ou McConkey
3.2.3 ISOLAMENTO DE ALGAS
Para isolar eficientemente algas, necessrio simular em parte o
ambiente onde a amostra foi coletada, como pH, temperatura, salinidade,luminosidade. Mtodos de diluio so bastante indicados nesse caso, uma
vez que algas e microalgas so normalmente encontradas em meio lquido. A
filtragem de amostras e posterior inoculao do filtro em novo meio estril
tambm um mtodo utilizado.
3.2.4 ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS
Actinomicetos so bactrias filamentosas que fazem parte da maioria
dos substratos naturais. No difcil isolar actinomicetos de amostras que
tambm contm fungos devido s suas propriedades fisiolgicas distintas. O
uso de antibiticos e antifngicos tambm auxilia no isolamento, como mostra a
tabela 3.
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Tabela 3 - Antibiticos usados e microrganismos alvo que so inibidos
Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995.
Os actinomicetos geralmente crescem lentamente, e demoram de 4 a 20
dias para formarem colnias definidas quando incubadas temperatura de 65-
80C . O crescimento desses microrganismos tambm favorecido quando h
no meio de cultivo algum dos componentes listados na tabela 4:
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Tabela 4 - Substncias que estimulam o desenvolvimento deactinomicetos em geral e actinomicetos produtores de antibiticos
Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995.
Pela tabela 5 percebe-se que a quantidade de actinomicetos obtidos
variando a fonte de carbono e nitrognio e o tipo de meio utilizado.
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Tabela 5 - Comparao de meio AGS com meio de chitin e efeito dasfontes de carbono e nitrognio no meio*
Fonte: EL-NAKEEB and LECHEVALIER, 1963.
4 NOVOS METODOS
4.1 BASE DOS MTODOS
Para a realizao dos mtodos novos de isolamento existem duas
ferramentas principais, a PCR e os marcadores moleculares. Ambos sero
explicados a seguir.
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4.1.1 PCR (REAO EM CADEIA DA POLIMERASE)
A reao em cadeia da polimerase (em ingls, Polymerase Chain
Reaction - PCR) um mtodo utilizado para amplificao(criao de mltiplas
cpias) rpida de segmentos-alvo especficos de DNA ou cDNA sem o uso de
um organismo vivo, a cpia ocorre in vitro. Os produtos de uma PCR sao
chamados amplicons.
Para a execuo da tcnica da PCR preciso que se tenha
conhecimento prvio da sequncia do cido nuclico que se deseja amplificar,
dita sequncia alvo. A partir disto, desenham-se dois iniciadores (primers)
para dar partida ao processo de sntese em um local especfico.Um primer
serve para sintetizar a sequncia alvo no sentido 3 - 5e outro para o sentido
inverso isto , 5-3. O primer uma pequena sequncia de nucleotdeos que
hibridiza no incio da sequncia alvo que se quer amplificar e da qual ele
complementar. Ao reconhecer o primer, a polimerase sintetiza uma cpia
complementar, obedecendo informao contida na sequncia de DNA que
ser replicada (sintetizada). A PCR precisa ainda de deoxinucleosdeos
trifosfatados (dATP; dTTP; dGTP; dCTP) que so quatro componente qumicos
diferentes que atuam como se fossem tijolos na construo da molcula de
DNA.
O primeiro passo para a realizao de um PCR a coleta da amostra
biolgica. O segundo passo consiste em extrair o DNA a partir do material coletado.
Esta extrao segue um critrio de metodologia bsico, que varia dependendo da
amostra utilizada.
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O terceiro passo consiste em preparar a mistura de reao. A mistura de
reao contm as substncias necessrias para fazer novas cpias de DNA no
processo da PCR. Ento, dentro de um tubo so colocados: a soluo tampo (para
manter a mistura de reao no pH e condies inicas ideais para a reao), os
deoxinucleotdeos j mencionados, os primers, a Taq Polimerase e o DNA
extrado da amostra.
O quarto e ultimo passo consiste na reao em si que feita em uma
mquina especial, chamada de termociclador, que aquece e resfria o tubo em
vrios ciclos consecutivos para amplificar o DNA.
A reao no termociclador ocorre em trs etapas que se repetem em ciclo:
Desnaturao do DNA alvo pelo calor (1 minuto a 94-96C), para separar as
duas cadeias
Associao dos iniciadores por ligaes de hidrognio ao DNA alvo em
cadeia simples (temperaturas entre 50 e 65C, durante 1 minuto; a
temperatura a usar depende da % GC da sequncia a amplificar)
Extenso dos iniciadores atravs da sntese da cadeia complementar de
cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (1 minuto a 72C)
O processo pode ser repetido vrias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possvel
aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentrao de DNA pr-existente (figura
5).
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FIGURA 5 Esquema da PCR.
FONTE: site e-escola, 2011.
A PCR encontra sua principal aplicao em situaes onde a quantidade de
DNA disponvel reduzida. Em teoria, possvel amplificar qualquer DNA. Uma das
principais aplicaes da PCR na medicina forense, onde pequenas amostras de
DNA retiradas da cena de um crime (pedaos de cabelo, gotas de sangue ou saliva,
pedaos de plo ou at mesmo a minscula quantidade de DNA deixada em uma
impresso digital) so amplificadas para serem analisadas pelo mtodo de
fingerprinting. A PCR tambm rotineiramente utilizado em procedimentos
cientficos de biologia molecular como amplificao para gerar mutagnese,
deteco de mutaes ou preparao de fragmentos de DNA para clonagem
(insero em plasmdeo, por exemplo) como tambm pode ser utilizado para
identificao de patgenos que esto presentes em amostras como por a exemplo
identificao de agentes como Cndida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vrus do
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papiloma humano e seus gentipos, HBV Vrus da Hepatite B, etc Alm disso, ela
tambm utilizada na paleontologia para o sequenciamento gnico de animais pr-
histricos.
4.1.2 MARCADORES MOLECULARES
Os marcadores moleculares constituem regies do genoma possveis de
serem detectadas e cuja presena ou ausncia pode caracterizar um organismo
cuja seqncia e funo, na maioria das vezes, so desconhecidas (Gostimsky et
al., 1999).
4.2 MTODOS BASEADOS NA HIBRIDIZAO
A hibridao in situ um mtodo que permite identificar o locus
cromossmico onde se localiza uma determinada sequncia de DNA
previamente clonada. Este mtodo tem como princpio a complementaridade
das bases que reage a organizao de DNA.
O DNA de um esfregao metafsico e o DNA de uma sonda so
transformados em sequncias monocatenares atravs da desnaturao e
posteriormente so postos em contacto em condies de hibridao. Assim a
sonda vai hibridar com a sequncia cromossmica onde se localizam as bases
complementares. Visto que a sonda previamente marcada (com um
fluorocromo), o local de ligao torna-se visvel o que permite identificar
especificamente o local do cromossoma onde se localiza o gene ou a
sequncia no codificadora em causa.
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A realizao desta tcnica pode ser feita usando uma nica sonda ou
at mesmo vrias sondas, cada uma marcada com um fluorocromo diferente.
Esta ltima tcnica chama-se FISH multiplex.
Os padres de bandas de um cromossoma so diversos e depende da
tcnica usada e do corante.
4.2.1 SOUTHERN BLOT
O Southern blot uma tcnica que permite obter informao sobre a
massa molecular e a quantidade relativa de uma determinada sequncia de
DNA. A tcnica uma combinao de electroforese em gel do DNA (este
frequentemente fragmentado por enzimas de restrio antes de fazer o
Southern), transferncia deste para uma membrana e hibridizao com uma
sonda marcada (radioactiva ou fluorescente). Aps a hibridizao, a membrana
lavada para remover sonda no ligada a DNA e obtm-se uma imagem
atravs de autoradiografia ou autofluorescncia. A imagem obtida d a
localizao do DNA que liga a sonda, com a intensidade do sinal dando uma
medida relativa da quantidade de DNA que hibridiza.
4.2.2 NORTHERN BLOT
O Northern blot estuda o perfil de expresso de RNA mensageiro, onde,
quando e quanto de determinado RNA mensageiro (correspondente
expresso de um determinado gene) est presente numa dada amostra. uma
das formas mais simples de determinar em que momento certos genes esto a
ser expressos em sistemas vivos. Neste processo, o RNA separado numa
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electroforese em gel, transferido para uma membrana e detectado de forma
similar ao DNA no Southern blot.
4.3 MICROARRANJO
Microarranjo, uma tcnica experimental da Biologia Molecular que
busca medir os nveis de expresso de transcritos em larga escala, ou seja,
medindo muitos (em alguns casos todos os) transcritos simultaneamente.
Um DNA microarray, ou DNA-chip, consiste num arranjo pr-definido de
molculas de DNA (fragmentos de DNA genmico, cDNAs ou
oligonucleotdeos) quimicamente ligadas uma superfcie slida, usualmente
lminas de microscpio revestidas com compostos que conferem carga
positiva. Os microarrays tambm podem ser preparados em membranas de
nylonpositivamente carregadas.
Os microarrays so utilizados na deteco e quantificao de cidos
nucleicos (RNAm na forma de cDNA ou DNA genmico) provenientes de
amostras biolgicas, as quais so postas para hibridar com o DNA fixado no
array (hibridao por complementariedade de bases). A deteco possvel
pois as amostras so "marcadas" com fluorocromos cianina 3 (Cy3) ou cianina
5 (Cy5) quando utiliza-se microarraysem vidro ou com o istopo 33-P quando
os arraysso preparados em membranas de nylon.
Para ambos os casos se faz necessrio a gerao de uma imagem de
hibridao, que obtida por meio de leitores (scanners) a laser (para os
fluorocromos) ou leitores de fsforo (para o istopo 33-P). O uso mais
freqente dos microarrays na determinao da expresso gnica (perfil do
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transcriptoma). A alta performance desta tcnica que pode-se determinar a
expresso diferencial de milhares de genes num nico experimento, mas o seu
alto custo faz com que ela nao seja, pelo menos ainda, uma tecnica muito
utilizada.
4.4 MTODOS BASEADOS EM MARCADORES DE DNA
A seguir sero descritos alguns mtodos que utilizam marcadores de
DNA como base.
4.4.1 SSCP
A SSCP, ou tcnica do polimorfismo de conformao da fita simples do
DNA, baseia-se no potencial de formao de estruturas secundrias da fita
simples do DNA que era obtido inicialmente, por meio de desnaturao do
produto de amplificao antes do incio da eletroforese.
Este mtodo utiliza um iniciador contendo o terminal 5 marcado
(fosforilado) e durante o PCR, esse iniciador incorporado uma das fitas do
DNA, que ao ser submetido a um tratamento como uma exonuclease que
reconhece o iniciador fosforilado, a fita marcada digerida preferencialmente.
A migrao da fita simples em um gel de poliacrilamida dependente da
conformao que ela assume de acordo com sua seqncia de bases durante
a eletroforese. Os produtos de amplificao de interesse para a anlise da
comunidade microbiana podem ser posteriormente clonados e sequenciados.
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4.4.2 DGGE/TGGE
As tcnicas baseadas na eletroforese com gis desnaturantes, como o
DGGE (eletroforese em gel com gradiente desnaturante) e TGGE (eletroforese
em gel com gradiente de temperatura) esto sendo amplamente utilizadas nos
estudos de ecologia microbiana.
So tcnicas utilizadas para separar fragmentos de DNA de mesmo
tamanho mas com seqncia de nucleotdeos diferentes. Primeiro feita a
amplificao do DNA atravs de PCR, onde um dos iniciadores apresenta uma
regio rica em G+C (grampo G-C, para impedir a total desnaturao da dupla
fita do DNA durante a eletroforese). Os fragmentos obtidos por PCR, de
mesmo tamanho, so ento separados de acordo com a sua composio
nucleotdica, atravs de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo
gradiente desnaturante (uria e formamida) que rompe as pontes de hidrognio
entre os nucleotdeos, no caso da DGGE. A seqncia de nucleotdeos
determina o momento em que o DNA, inicialmente em fita dupla, passar a
adquirir uma estrutura de fita simples, onde as duas fitas simples se mantm
ligadas pelo grampo. Nesta condio, a velocidade de migrao no gel
extremamente reduzida, ocorrendo a separao de outros fragmentos que
apresentam composio nucleotdica diferente. Para a TGGE, ao invs do
gradiente qumico desnaturante, utilizada uma cuba especial que promove
um gradiente de temperatura.
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4.4.3 RFLP
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) uma tcnica em que
os organismos podem ser diferenciados pela anlise de padres derivados da
clivagem do seu DNA. Se dois organismos diferirem na distncia entre os stios
de clivagem de uma endonuclease de restrio, o comprimento dos fragmentos
produzidos vai diferir quando o DNA for digerido com uma enzima de restrio.
Para a deteco de RFLPs, pode ser usada a me todologia de
Shouthern Blottin. Aps restrio enzimtica os fragmentos de DNA genmico
so sujeitos a electroforese em gel e posteriormente transferidos para um
suporte slido de nitrocelulose atravs do arrastamento por capilaridade. Aps
hibridizao com sondas radioativas este processo possibilita a identificao,
entre milhares de fragmentos de restrio obtidos, de sequncias bem
determinadas.
4.4.4 VNTR
O VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) uma metodologia que
se baseia na existncia de uma sequncia repetitiva especfica ativa em
diferentes indivduos de uma populao.
Uma repetio em srie (tandem repeat) uma sequncia curta do
DNA que repetido na forma de head-to-tail num locus cromossmico
especfico. As repeties em srie esto presentes ao longo de todo o genoma
humano; sendo que algumas sequncias so encontradas em somente um
local (denominado VNTRs) e o nmero de unidades repetidas varia entre
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indivduos. Um VNTR nos seres humanos, por exemplo, uma sequncia de
17 pb do DNA repetida entre 70 e 450 vezes no genoma.
5 METAGENOMICA
Denominada tambm de Genmica Ambiental, Ecogenmica ou
Genmica de Comunidades; o termo "metagenmica" foi usado pela primeira
vez por Jo Handelsman (University of Wisconsin) em 1998. Metagenoma o
nome dado ao genoma coletivo da microbiota total encontrada em um
determinado hbitat. Enquanto a metagenmica, em si, a anlise genmica
da comunidade de microrganismos de um determinado ambiente por tcnicas
independentes de cultivo. Essa abordagem consiste na extrao de DNA
diretamente do ambiente e construo de uma biblioteca metagenmica com
este genoma misto. Essa estratgia permite o acesso a genes de bactrias
incultivveis. Atravs de tcnicas de cultivo puro, como as apresentadas
anteriormente, os microrganismos podem ser estudados individualmente.
Entretanto essa abordagem limita a avaliao taxonmica, filogentica e a
estimativa da diversidade microbiana da biosfera, pois apenas cerca de 1% dos
microrganismos so cultivveis em laboratrio pelas tcnicas clssicas de
cultivo.
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5.1 METAGENMICA X OUTRAS TCNICAS
Tantos os mtodos clssicos quanto a metagenmica partem da coleta
da amostra do ambiente. Mas, enquanto a metodologia clssica primeiro cultiva
o microorganismo para obter uma cultura pura para depois isolar o DNA, a
metagenmica inicia diretamente com esse isolamento. Isso faz com que, a
principio, ela esteja apta a isolar 100% da fonte gentica em um ambiente.
A figura 6 apresenta em fluxograma das estratgias para deteco,
monitoramento e caracterizao da diversidade em amostras ambientais,
considerando tanto as tcnicas clssicas quanto as novas.
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FIGURA 6 Estratgias para monitoramento e caracterizao dadiversidade em amostras ambientais.
FONTE: PALMIERI, D. A.
Comparando a figura anterior com a figura 7, que mostra as estratgias
da metagenmica, percebe-se a simplicidade de sua essncia. claro, sem
esquecer a complexidade de cada etapa.
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FIGURA 7 Etapas da metagenmica.
FONTE: SESHADRI, R, 2007
5.2 A ESTRATGIA DA METAGENMICA
A metagenmica se d basicamente por trs etapas:
1. Clonagem: consiste no isolamento e propagao de molculas de
DNA idnticas. O sistema de clonagem molecular se d a partir da estruturao
de um DNA recombinante, que se replicam quando colocado em uma clula
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bacteriana. Na bactria, alm do DNA, existe tambm o plasmdeo, que uma
molcula de DNA circular encontrada em bactrias que podem ser utilizadas
para levar DNA de um organismo para outro de uma espcie diferente.
O plasmdeo retirado da bactria e cortado pela enzima de restrio.
Depois, um fragmento do plasmdeo, se une ao outro fragmento de DNA de um
organismo diferente, que fica sujeito a outra ao de tal enzima de restrio, a
enzima DNA-ligase est comprometida neste processo. Ao final deste
processo, resulta-se um plasmdeo com o nome de vetor, que inserido na
clula bacteriana para se replicar.
2. Seqenciamento: usado para obter informaes importantes sobre a
identificao gentica, variaes e funes gnicas. Feito em equipamentos
especiais para isso. Esses equipamentos vem sendo cada vez mais
modernizados como o caso do Genome Sequencer FLX System de 2010,
que oferece mais de um milho de leituras por corrida e leituras de 400 pares
de bases, adequado para seqenciamento de genomas completos,
caracterizao metagenmica de sistemas complexos e mais.
3. Bioinformtica: aps o seqenciamento preciso ter uma ferramenta
para analisar as sequncias obtidas, a bioinformtica apresenta softwares que
auxiliam nessas analises, principalmente com a existncia das bibliotecas
genmicas.
5.3 VANTAGENS DESVANTAGENS
O maior problema da tcnica o fato de se ter que lidar com um numero
desconhecido de organismos. Nas outras tcnicas o pesquisador tem que se
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preocupar apenas com um organismo, isso facilita para que ele possa manter o
controle de seu experimento.
A tabela 6 mostra uma comparao entre as vantagens e desvantagensda metagenmica.
TABELA 6 Vantagens e desvantagens da metagenmica.
FONTE: Daniel, 2005
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ANEXOS
ANEXO 1 - Isolation, identification and physiological study of
Lactobacillus fermentum
LPB for use as probiotic in chickens
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ANEXO 2 - Isolation and serological identification of
enteropathogenic Escherichia coliin pasteurized milk in Brazil
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ANEXO 3 - Isolation, properties and kinetics of growth of a
thermophilic Bacillus
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