Linda Christian Carrijo CarvalhoLinda Christian Carrijo CarvalhoLinda Christian Carrijo CarvalhoLinda Christian Carrijo Carvalho
LOPAP (LOPAP (LOPAP (LOPAP (Lonomia obliquaLonomia obliquaLonomia obliquaLonomia obliqua prothrombin activator prothrombin activator prothrombin activator prothrombin activator
proteaseproteaseproteaseprotease)))):::: clonagem e expressão em levedura clonagem e expressão em levedura clonagem e expressão em levedura clonagem e expressão em levedura Pichia Pichia Pichia Pichia
pastoris,pastoris,pastoris,pastoris, obtenção de um peptídeo sintético, análise obtenção de um peptídeo sintético, análise obtenção de um peptídeo sintético, análise obtenção de um peptídeo sintético, análise
estrutural e avaliação de suas potenciais aplicaçõesestrutural e avaliação de suas potenciais aplicaçõesestrutural e avaliação de suas potenciais aplicaçõesestrutural e avaliação de suas potenciais aplicações
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia.
São PauloSão PauloSão PauloSão Paulo
2002002002009999
Linda Christian Carrijo CarvalhoLinda Christian Carrijo CarvalhoLinda Christian Carrijo CarvalhoLinda Christian Carrijo Carvalho
LOPAP (LOPAP (LOPAP (LOPAP (Lonomia obliquaLonomia obliquaLonomia obliquaLonomia obliqua prothrombin activatprothrombin activatprothrombin activatprothrombin activator proteaseor proteaseor proteaseor protease): ): ): ):
clonagem e expressão em levedura clonagem e expressão em levedura clonagem e expressão em levedura clonagem e expressão em levedura Pichia pastoris,Pichia pastoris,Pichia pastoris,Pichia pastoris,
obtenção de um peptídeo sintético, análise estrutural e obtenção de um peptídeo sintético, análise estrutural e obtenção de um peptídeo sintético, análise estrutural e obtenção de um peptídeo sintético, análise estrutural e
avaliação de suas potenciais aplicaçõesavaliação de suas potenciais aplicaçõesavaliação de suas potenciais aplicaçõesavaliação de suas potenciais aplicações
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia. Área de concentração: Bioquímica e Biologia Molecular Orientadora: Dra. Ana Marisa ChudzinskiDra. Ana Marisa ChudzinskiDra. Ana Marisa ChudzinskiDra. Ana Marisa Chudzinski----Tavassi Tavassi Tavassi Tavassi
São PauloSão PauloSão PauloSão Paulo
2009200920092009
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
reprodução não autorizada pelo autor
Carrijo Carvalho, Linda Christian.
LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease): clonagem e expressão em levedura Pichia pastoris, obtenção de um peptídeo sintético, análise estrutural e avaliação de suas potenciais aplicações / Linda Christian Carrijo Carvalho. -- São Paulo, 2009.
Orientador: Ana Marisa Chudzinski Tavassi. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/IPT/Instituto Butantan. Área de concentração: Biotecnologia. Linha de pesquisa: Bioquímica e biologia molecular. Versão do título para o inglês: LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease): cloning and expression in Pichia pastoris yeast, design of a synthetic peptide, structural analysis and evaluation of its potential applications. Descritores: 1. Bioquímica 2. Proteínas recombinantes 3. Peptídeos 4. Hemostasia 5. Biologia celular 6. Matriz extracelular I. Chudzinski-Tavassi, Ana Marisa II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia III. Título.
ICB/SBIB0200/2009
A Deus,
pelo amor e por todas as dádivas,
por me permitir errar e aprender,
pelo dom da vida!
Ao meu pai, Jose e minha mãe, Lucila, com
muito amor, pela sua dedicação imensurável,
que são meu exemplo de força e
perseverança. A minha irmã Lanna e meus
irmãos Paulo e Cleber, pela compreensão nos
momentos de ausência, pelo constante apoio
e carinho.
Ao Fábio, meu marido, pelo amor,
cumplicidade, compreensão e cuidado. Por
estar ao meu lado em todos os momentos,
compartilhando as dificuldades e as
conquistas.
A meus avôs, tios, primos e todos os meus
amigos, que sempre torceram por mim e me
ajudaram.
A todos os professores e mestres que
enriqueceram a minha vida com suas lições
profissionais e pessoais, pela amizade, apoio e
incentivo.
AGRADECIMENTOS
À Dra. Ana Marisa Chudzinski-Tavassi, pela orientação e confiança que
depositou em mim. A amizade construída ao longo deste tempo foi muito
positiva, me permitindo conhecer além do lado profissional, a beleza do seu
lado humano. Obrigada pela acolhida, pelo constante estímulo, pelo
aprendizado e por todas as oportunidades que me fizeram crescer pessoal e
profissionalmente. Seu entusiasmo contagiante foi um fator diferencial para o
sucesso deste trabalho, que me levou a vivenciar uma nova face da pesquisa
científica, dedicada ao desenvolvimento de novas moléculas e inovação.
A todos os pesquisadores, técnicos e pós-graduandos do Laboratório de
Bioquímica e Biofísica do Instituto Butantan, que estiveram sempre dispostos
a ajudar, apoiar, ensinar e dar suporte. Especialmente à Durvanei A. Maria,
Adriana R. Lopes, Rafael Porto, Isabel Batista, Fernanda Faria, Miryam Paola
A. Flores, Simone Simons, Janaina Ventura, Luana Wlian, Paulo Sá, Sandra
Barreto, Daniella Oliveira, Karla Roedel, Daniel Furlin, Nicole Mambelli, Jáfia
Lacerda e Erica Akagi. Aos colegas que não estão mais no Laboratório pelos
ensinamentos, pela troca de experiências e pelo exemplo que deixaram:
Márcio Fritzen, Agostinho Pereira, Oscar Ramos, Jeanne Claine Modesto,
Maria Esther R. Silva, Carla Seibert, e em especial ao Cleyson V. Reis, que
me ajudou na fase inicial deste trabalho.
À Profa. Dra. Suely Gomes de Figueiredo, do Centro de Ciências
Biomédicas - UFES, por me apresentar ao “mundo das proteínas”, me
ensinando as bases da Bioquímica, da Pesquisa Científica e, principalmente,
da ética profissional. Seus ensinamentos, conselhos e sua amizade, foram
muito importantes para que eu pudesse ir adiante.
À Profa. Dra. Sandra Farsky e a Kaline Waismam, da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas - USP, pela colaboração proveitosa que mantivemos
neste período.
Aos que colaboraram nas várias etapas deste trabalho: Dr. Cleyson V.
Reis, Dra. Carla Seibert, Dra. Paola Flores, Dra. Janaina Ventura, Luana
Wlian, Dr. Oscar Ramos, Dra. Isabel Batista e Dr. Durvanei Maria, do
Laboratório de Bioquímica e Biofísica - Instituto Butantan; Dra. Mickie Takagi
e Dra. Viviane Maimoni Gonçalves, do Laboratório de Bioprocessos, Centro de
Biotecnologia - Instituto Butantan; Dr. Robson L. Melo, do CAT - Instituto
Butantan; Profa. Dra. Aparecida Sadae Tanaka, do Depto. de Bioquímica -
UNIFESP; Profa. Dra. Maria Filomena Rodrigues e Dra. Rosana Picoli, do
Laboratório de Biotecnologia Industrial - IPT; Prof. Dr. Francisco Maffei, Dra.
Sônia Andrade Chudzinski e Dra. Lilian Peceguini, do Instituto de Ensino e
Pesquisa - Hospital Sírio Libanês; Profa. Dra. Consuelo Junqueira Rodrigues,
da Faculdade de Medicina - USP.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - USP, em especial
aos funcionários da Secretaria Marcos, Eliane e Fábia, e à presidente do
programa Profa. Dra. Ana Clara Schenberg pelo apoio.
À Biblioteca do Instituto de Ciências Biomédicas, em especial a
bibliotecária Maria José de Jesus Carvalho, pela ajuda na revisão e
normalização da tese.
Ao suporte oferecido pelos Funcionários do Instituto Butantan e da
Universidade de São Paulo.
Enfim, a todos que contribuíram para a realização deste trabalho,
muitos que porventura não foram citados, mas que certamente foram
indispensáveis em alguma etapa deste trabalho, doando um pouco de sua
atenção, talento, conhecimento e amizade.
Agradeço a vocês imensamente!
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Bioquímica e
Biofísica do Instituto Butantan, com suporte financeiro das
agências:
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
Bolsa de Doutorado Direto – PROCESSO 05/59739-9
Financiadora de Estudos e Projetos, Governo Federal
“Senhor, tu me sondas e me conheces. Sabes
quando me assento e quando me levanto; de
longe penetras os meus pensamentos.
Esquadrinhas o meu andar e o meu deitar e
conheces todos os meus caminhos. Tu me
cercas por trás e por diante e sobre mim pões
a mão.”
Salmo 139
“A coisa mais indispensável a um homem é
reconhecer o uso que deve fazer do seu
próprio conhecimento.”
Platão
RESUMO
Carrijo Carvalho LC. LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease): clonagem e expressão em levedura Pichia pastoris, obtenção de um peptídeo sintético, análise estrutural e avaliação de suas potenciais aplicações [Tese]. São Paulo: Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia da Universidade de São Paulo/Instituto Butantan/ Instituto de Pesquisas Tecnológicas; 2009.
O contato acidental com lagartas da mariposa Lonomia obliqua causa
envenenamento caracterizado como síndrome hemorrágica devido a uma
coagulopatia de consumo. O Lopap é uma das toxinas mais abundantes
nas cerdas desta lagarta, caracterizado como uma serino protease que
apresenta atividade ativadora de protrombina e atividade antiapoptótica.
Esta proteína é o único membro descrito da família das lipocalinas com
atividade proteolítica. Membros desta família são conhecidos como
carreadores de moléculas lipofílicas, reguladores de processos metabólicos
e homeostáticos, além do envolvimento na modulação de respostas
celulares, tendo em comum a presença de três domínios conservados na
estrutura primária. Tendo em vista potenciais aplicações terapêuticas e
biotecnológicas do Lopap, este trabalho teve como objetivo a obtenção do
Lopap recombinante (rLopap) por metodologia escalonável e a avaliação
de sua atividade in vivo e in vitro. O Lopap foi clonado a partir do
transcriptoma das cerdas de L. obliqua e expresso na levedura Pichia
pastoris, sendo recuperado na forma enzimaticamente ativa e com
capacidade procoagulante sobre plasma humano. Em modelo animal de
controle sistêmico da hemostasia, o rLopap foi capaz de diminuir o tempo
de sangramento em animais anticoagulados com enoxaparina. A partir de
domínios conservados de lipocalinas encontrados na seqüência primária
do Lopap, peptídeos sintéticos foram obtidos e testados em cultura de
células endoteliais. Um peptídeo relacionado ao segundo domínio (motif
2), designado antiapoptotic peptide (AP), foi capaz de reproduzir os
efeitos do Lopap na modulação da sobrevivência celular. Em cultura de
fibroblastos, AP foi capaz de induzir a síntese de proteínas de matriz
extracelular como colágeno, fibronectina e tenascina. O aumento de
colágeno foi observado também na derme de animais tratados localmente
com AP, cujo efeito persistiu por mais de três meses. A ocorrência, em
outras proteínas, de seqüências relacionadas a AP foi investigada através
da busca em bancos de dados públicos por seqüência de proteínas
(blastp) e por domínios conservados (motif search library, blast conserved
domain). Os resultados obtidos mostraram a presença de seqüências
similares em lipocalinas de origem humana e animal como purpurina,
prostaglandina D sintase e apolipoproteína D e também em proteínas de
vírus, bactérias, parasitas e insetos, muitas das quais não tem função
descrita. O alinhamento do modelo tridimensional do Lopap com outras
lipocalinas descritas com atividade antiapoptótica (purpurina e
prostaglandina D sintase) mostrou que a localização e conformação
tridimensional da região correspondente a AP têm padrão semelhante às
seqüências da purpurina e prostaglandina D sintase. Os valores relativos
de polaridade, hidropaticidade e exposição ao solvente dos aminoácidos
desta região também foram semelhantes nestas proteínas. Através destes
resultados, pode-se sugerir que a seqüência identificada confere uma
propriedade comum e conservada em muitas lipocalinas. A desvinculação
da ação procoagulante do Lopap através da obtenção de um peptídeo
sintético abre perspectivas para seu uso em várias aplicações que se
baseiam em sua ação na modulação celular, como um componente
cosmético, no reparo e remodelamento tecidual e em várias disfunções
que envolvem morte celular e perda de colágeno.
Palavras-chave: Bioquímica. Proteínas recombinantes. Peptídeos.
Hemostasia. Biologia celular. Matriz extracelular.
ABSTRACT
Carrijo Carvalho LC. LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease): cloning and expression in Pichia pastoris yeast, design of a synthetic peptide, structural analysis and evaluation of its potential applications [Doctoral thesis]. São Paulo: Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia da Universidade de São Paulo/Instituto Butantan/Instituto de Pesquisas Tecnológicas; 2009.
Accidental contact with the Lonomia obliqua moth caterpillar causes
envenoming outcomes characterized as hemorrhagic syndrome due to a
consumption coagulopathy. Lopap is one of the most abundant toxins in
the caterpillar’s bristles. This protein was characterized as a serine
protease which displays prothrombin activation and antiapoptotic
activities. Lopap is the only member of the lipocalin family with proteolytic
activity. Members of lipocalins family are recognized as carriers of small
lipophilic molecules, regulators of methabolic and homeostatic process, by
their involvement in the modulation of cells responses, and share three
characteristic conserved domains in their primary structure. In view of the
potential therapeutic of biotechnological applications of Lopap, this work
aimed to obtain recombinant Lopap (rLopap) by a scaled-up methodology
and the evaluation of the rLopap’s activity in vivo and in vitro. Lopap was
cloned from the transcriptome of the L. obliqua bristles and expressed in
the Pichia pastoris yeast. The recombinant protein was recovered in its
enzymatic active form and displayed procoagulante effect on human
plasma. rLopap was able to reduce the bleeding time in animals that was
anticoagulated with enoxaparin in an experimental model to evaluate
systemic hemostasis. Based on lipocalin conserved domains found in
Lopap primary sequence, synthetic peptides were obtained and assayed
on endothelial cell culture. A peptide related to the second domain (motif
2), called antiapoptotic peptide (AP), was able to reproduce the effects of
Lopap in the modulation of cell survival. In fibroblast culture, AP was able
to induce the synthesis of extracellular matrix proteins, such as collagen,
fibronectin and tenascin. The increase of collagen content was also
observed in the dermis of animals locally treated with AP. This effect was
observed up to three months after treatment. The presence of AP-related
sequences in other proteins was investigated by search at public data
banks considering complete protein sequences (blastp) and conserved
domains (motif search library, blast conserved domain). Results showed
the occurrence of similar sequences among human and animal lipocalins,
such as purpurin, prostaglandin D synthase and apolipoprotein D, and also
in proteins from virus, bacteria, parasites and insects, many of these have
no functions described. Alignment of the Lopap tridimensional model with
other antiapoptotic lipocalins (purpurin and prostaglandin D synthase)
revealed that the region corresponding to AP sequence have similar
tridimensional structures among these proteins. The relative polarity,
hydropathicity and solvent accessibility values observed for each amino
acid residue of AP and related sequences in the tertiary structure of their
proteins also had a similar pattern. These results suggest that AP-related
sequence signatures confer a common property in many lipocalins. The
trim of the Lopap procoagulant activity by means of obtaining a synthetic
peptide open perspectives for its use in several applications that are based
merely on its action via cell modulation, for example, as a cosmetic
component, aiding tissue repair and remodeling, and in many dysfunctions
involving cell death and loss of collagen.
Keywords: Biochemistry. Recombinant proteins. Peptides. Hemostasis.
Cell biology. Extracellular matrix.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ciclo biológico de Lonomia obliqua (fases).................38
Figura 2 - Lagarta Lonomia obliqua............................................39
Figura 3 - Representação esquemática do sistema
hemostático..............................................................
43
Figura 4 - Esquema representativo da hidrólise da
protrombina.............................................................
44
Figura 5 - Seqüência nucleotídica e de aminoácidos do Lopap....49
Figura 6 - Alinhamento da seqüência primária do Lopap com
outros membros da família das lipocalinas,
mostrando as regiões conservadas (motifs)...............
50
Figura 7 - Estrutura tridimensional do Lopap obtida por
modelagem molecular................................................
51
Figura 8 - Estrutura em β-barril da apolipoproteína D
humana.....................................................................
53
Figura 9 - Estrutura da prostaglandina D sintase murina
destacando as características estruturais de
lipocalinas.................................................................
55
Figura 10 - Mapa do pAE............................................................60
Figura 11 - Oligonucleotídeo P1.................................................62
Figura 12 - Oligonucleotídeo PRIPIC9F.......................................66
Figura 13 - Perfil eletroforético do inserto codificante do
Lopap.......................................................................
100
Figura 14 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) do rLopap
expresso com cauda de 6xHis em E. coli Origami....
102
Figura 15 - Atividade ativadora de protrombina de diferentes
clones (C1 a C5) de Pichia pastoris transformada
para expressão do rLopap.......................................
104
Figura 16 - Cromatografia em coluna de afinidade
Benzamidina-Sepharose...........................................
107
Figura 17 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) do material
obtido após expressão do rLopap em Pichia
pastoris em meio complexo BMMY e após
purificação em Benzamidina-Sepharose...................
108
Figura 18 - Curva de crescimento de Pichia pastoris
expressando rLopap em meio mínimo BMM com
diferentes pHs........................................................
112
Figura 19 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) do sobrenadante
do meio de cultivo durante a expressão do rLopap
em Pichia pastoris em meio mínimo BMM.................
114
Figura 20 - Imunodetecção do rLopap expresso em
pH 5,0 purificado por cromatografia
em Benzamidina-Sepharose.....................................
115
Figura 21 - Atividade ativadora de protrombina do rLopap
expresso em pH 5,0 purificado por cromatografia
em Benzamidina-Sepharose....................................
116
Figura 22 - Curva de crescimento de Pichia pastoris em
biorreator para expressão do rLopap......................
119
Figura 23 - Efeito da temperatura na estabilidade da atividade
ativadora de protrombina de amostras contendo
rLopap expresso em Pichia pastoris........................
122
Figura 24 - Efeito do pH na estabilidade da atividade
ativadora de protrombina de amostras contendo
rLopap expresso em Pichia pastoris.........................
123
Figura 25 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) de amostras
contendo rLopap expresso em Pichia pastoris
incubadas em diferentes pHs para teste de
estabilidade.............................................................
125
Figura 26 - Perfil cromatográfico em coluna HiPrep QFF do
material obtido no processo de cultivo de Pichia
pastoris em biorreator para expressão do rLopap.....
128
Figura 27 - Perfil cromatográfico em coluna Superose 12 da
fração ativa obtida na primeira etapa de
purificação (P1 QFF).................................................
129
Figura 28 - Viabilidade de células endoteliais (tEND) com
apoptose induzida por TNF-αααα e tratadas com
rLopap.....................................................................
131
Figura 29 - Tempo de sangramento em coelhos heparinizados
tratados com rLopap...............................................
133
Figura 30 - Tempo de coagulação (TTPa) em coelhos
heparinizados tratados com rLopap........................
134
Figura 31 - Seqüência de aminoácidos dos peptídeos
sintéticos desenhados a partir da seqüência
primária do Lopap....................................................
136
Figura 32 - Efeito de peptídeos sintéticos derivados da
seqüência do Lopap sobre a viabilidade de células
endoteliais...............................................................
138
Figura 33 - Efeito de diferentes concentrações dos peptídeos
P2 e P4 na viabilidade de células endoteliais..........
139
Figura 34 - Efeito de inibidores de serino protease sobre a
atividade antiapoptótica de P2.................................
141
Figura 35 - Localização da seqüência dos peptídeos P2 e P4 na
estrutura tridimensional do Lopap...........................
143
Figura 36 - Comparação de propriedades físicas e estruturais
da região do Lopap envolvida na modulação
celular e a região correspondente em lipocalinas
antiapoptóticas.......................................................
151
Figura 37 - Imunofluorescência para fibronectina, tenascina e
procolágeno em cultura fibroblastos tratados com
P4............................................................................
153
Figura 38 - Aumento de colágeno na derme de camundongos
tratados com P4......................................................
155
Figura 39 - Ganho de colágeno na derme de camundongos
tratados com diferentes doses de P4......................
156
Figura 40 - Ganho de colágeno na derme de camundongos
tratados com doses cumulativas de P4....................
158
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação de ativadores de protrombina de venenos de serpentes..............................................
45
Tabela 2 - Meio definido (Fermentation Basal Salts)................ 75
Tabela 3 - Solução de traço de metais (PTM1)......................... 76
Tabela 4 - Concentração de proteínas no meio de cultivo durante a expressão do rLopap em P. pastoris em meio complexo BMMY.............................................
106
Tabela 5 - Atividade ativadora de protrombina das frações da cromatografia em Benzamindina-Sepharose................................................................
109
Tabela 6 - Atividade procoagulante do rLopap sobre plasma humano normal citratado.........................................
109
Tabela 7 - Efeito citoprotetor do rLopap em HUVECs................110
Tabela 8 - Concentração de proteínas e atividade ativadora de protrombina ao final da expressão do rLopap em P. pastoris em meio mínimo BMM.......................
111
Tabela 9 - Parâmetros do processo de cultivo de P. pastoris em biorreator para expressão do rLopap..................
118
Tabela 10 - Concentração de proteínas e atividade ativadora de protrombina durante a fase de indução da expressão do rLopap em biorreator........................
118
Tabela 11 - Recuperação de proteínas solúveis após clarificação do material obtido em biorreator.........
120
Tabela 12 - Eficiência de colunas de troca iônica e interação hidrofóbica para purificação do rLopap expresso em P. pastoris.......................................................
127
Tabela 13 - Purificação parcial do rLopap expresso em P. pastoris.................................................................
130
Tabela 14 - Propriedades dos peptídeos sintéticos derivados da seqüência do Lopap..........................................
135
Tabela 15 - Domínios de proteínas com seqüências similares a P2 e P4 identificados pela busca no Motif Search Library.......................................................
144
Tabela 16 - Alinhamento dos resultados de busca por domínios conservados (CDART) relacionados com a seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4.........................................................................
145
Tabela 17 - Alinhamento dos resultados de busca pelo blastp com a seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4.........................................................................
148
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A – absorbância
α-trombina – trombina enzimaticamente ativa
AE – atividade específica
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOX1 – álcool oxidase 1
AP – antiapoptotic peptide, peptídeo antiapoptótico
Arg – arginina
ARS – acessibilidade relativa ao solvente
AT III – antitrombina III
BMG – buffered minimal glycerol, meio mínimo de glicerol
BMGY – buffered glycerol-complex medium, meio complexo de glicerol
BMM – buffered minimal methanol, meio mínimo de metanol
BMMY – buffered methanol-complex medium, meio complexo de metanol
CDART – Conserved Domain Architecture Retrieval Tool
cDNA – ácido desoxirribonucléico complementar
CID – coagulação intravascular disseminada
VC – volume de coluna
DMSO – dimetilsulfóxido
DNA – ácido desoxirribonucléico
DO – densidade óptica
E. coli – Escherichia coli
EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético
F – fator de coagulação
F1.2 – fragmento 1.2 resultante da clivagem da protrombina
FBS – fermentation basal salts, meio definido
FDA – Food and Drug Administration
FF – Fast Flow
FII – fator II ou protrombina
FIIa – fator II ativado ou trombina
FV – fator V ou pró-acelerina
FVIII – fator VIII ou fator anti-hemofílico
FX – fator X ou fator de Stuart-Prower
FXa – fator X ativado
FXII – fator XII ou fator de Hageman
FXIII – fator XIII ou fator estabilizante de fibrina
HPLC – high pressure liquid chromatography, cromatografia líquida de alta
pressão
HUVECs – human umbilical vein endothelial cells, células endoteliais de
veia de cordão umbilical humano
IL - interleucina
Ile – isoleucina
INPI – Instituto Nacional da Propriedade Industrial
IPTG – isopropil-β-D-tiogalactosídeo
L. obliqua – Lonomia obliqua
LB – Luria-Bertani
mAU – miliunidade de absorbância
MD – meio mínimo de dextrose
MMDB – Molecular Modeling Database
mRNA – ácido ribonucléico mensageiro
MTT – 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina
NCBI – National Center for Biotechnology Information
NMWC – corte nominal de massa molecular
NO – óxido nítrico
OD – oxigênio dissolvido
P. pastoris – Pichia pastoris
PBS – tampão fosfato-salina
PCR – polymerase chain reaction, reação em cadeia da polimerase
PMSF – fluoreto de fenil-metil-sulfonil
PPG – polipropilenoglicol
PTM1 – Pichia trace metal, solução de traço de metais
QFF – Q-Sepharose Fast Flow
rLopap – Lopap recombinante
SCR – structurally conserved regions
SEM – erro padrão
SFB – soro fetal bovino
SDS – dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida em condições
desnaturantes
Thr – treonina
TNF-α – fator de necrose tumoral alfa
TP – tempo de protrombina
TTPa – tempo de tromboplastina parcial ativada
U – unidade de atividade enzimática
YNB – yeast nitrogen base
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...........................................................................31
2 REVISÃO DE LITERATURA.......................................................35
2.1 As lagartas do gênero Lonomia............................................35
2.2 Síndrome hemorrágica causada pela lagarta L. obliqua........40
2.3 Lopap – o ativador de protrombina da lagarta L. obliqua.... 42
2.4 Lipocalinas......................................................................... 52
3 MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................59
3.1 Obtenção do rLopap na forma solúvel em sistema
bacteriano (E. coli Origami).......................................................
59
3.1.1 Clonagem em vetor de expressão pAE e obtenção de solução-
estoque do plasmídeo...................................................................
59
3.1.2 Expressão e purificação do rLopap..........................................63
3.2 Clonagem e expressão do rLopap na levedura Pichia
pastoris.....................................................................................
65
3.2.1 Linhagens e plasmídeos....................................................... 65
3.2.2 Síntese de oligonucleotídeos iniciadores para amplificação do
DNA............................................................................................
65
3.2.3 Reação de PCR e ligação do DNA ao “pGEM-T easy”...................67
3.2.4 Transformação em bactéria......................................................68
3.2.5 Digestão do DNA plasmidial com enzimas de restrição e
ligação ao pPIC9K..........................................................................
68
3.2.5.1 Digestão com Sna BI.........................................................68
3.2.5.2 Digestão com Eco RI...........................................................69
3.2.5.3 Ligação do DNA ao pPIC9K.................................................69
3.2.6 Sequenciamento do DNA........................................................70
3.2.7 Transformação na levedura P. pastoris.....................................70
3.2.8 Cultivo celular e avaliação da expressão do rLopap....................71
3.3 Escalonamento do processo de produção do rLopap..............72
3.3.1 Expressão da proteína recombinante utilizando meio de
cultivo complexo...........................................................................
72
3.3.2 Otimização da expressão da proteína recombinante utilizando
meio de cultivo mínimo..................................................................
73
3.3.3 Expressão da proteína recombinante em biorreator....................74
3.3.3.1 Preparo do inóculo.............................................................74
3.3.3.2 Inoculação no reator..........................................................75
3.3.3.3 Controle das variáveis........................................................76
3.3.3.4 1ª Etapa: fase de crescimento............................................77
3.3.3.5 2ª Etapa: fase de indução com metanol...............................78
3.3.3.6 Separação do sobrenadante................................................78
3.4 Processamento do material após expressão em
biorreator...................................................................................
79
3.4.1 Clarificação e concentração em membranas de fibra oca.............79
3.4.2 Diálise.................................................................................80
3.5 Avaliação da estabilidade do rLopap expresso em
Pichia pastoris............................................................................
81
3.5.1 Estabilidade em diferentes temperaturas..................................81
3.5.2 Estabilidade em diferentes soluções.........................................81
3.5.3 Estabilidade em diferentes valores de pH.................................82
3.6 Estabelecimento do processo de purificação do rLopap
expresso em Pichia pastoris......................................................
83
3.6.1 Cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose............83
3.6.2 Screening em colunas de troca iônica e interação hidrofóbica.....84
3.6.3 Cromatografia de troca aniônica em Q-Sepharose.................... 84
3.6.4 Cromatografia de gel filtração............................................... 85
3.7 Ensaios bioquímicos............................................................85
3.7.1 Dosagem de proteínas..........................................................85
3.7.2 Precipitação de proteínas..................................................... 85
3.7.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)....................86
3.7.4 Imunobloting.......................................................................86
3.8 Avaliação da atividade procoagulante do rLopap in vitro.....87
3.8.1 Atividade ativadora de protrombina........................................87
3.8.2 Atividade procoagulante sobre plasma humano........................87
3.9 Avaliação da atividade antiapoptótica do rLopap.................88
3.9.1 Cultivo de células endoteliais de cordão umbilical humano.........88
3.9.2 Cultivo de células endoteliais de timo murino...........................88
3.9.3 Teste de viabilidade celular pelo método do MTT..................... 89
3.10 Avaliação da ação do rLopap in vivo como agente
hemostático sistêmico..............................................................
90
3.11 Mapeamento peptídico do Lopap.......................................91
3.11.1 Ensaios de atividade procoagulante e antiapoptótica de
peptídeos derivados do Lopap........................................................
91
3.11.2 Avaliação do efeito de inibidores de serino proteases sobre a
atividade de peptídeo citoprotetor derivado do Lopap.........................
92
3.11.3 Análises estruturais.............................................................92
3.12 Avaliação do efeito de um peptídeo sintético derivado do
Lopap sobre a expressão de proteínas de matriz extracelular
em cultura de fibroblastos.........................................................
94
3.12.1 Cultivo de fibroblastos e tratamento com o peptídeo.............. 94
3.12.2 Imunofluorescência indireta.................................................95
3.13 Avaliação do efeito de um peptídeo sintético derivado do
Lopap sobre a síntese de colágeno na derme.............................
96
3.13.1 Tratamento experimental....................................................96
3.13.2 Avaliação dos animais.........................................................97
4 RESULTADOS......................................................................... 99
4.1 Obtenção do rLopap em E. coli Origami................................99
4.2 Obtenção do rLopap em Pichia pastoris................................103
4.2.1 Clonagem e expressão do rLopap em P. pastoris......................103
4.2.2 Expressão do rLopap em meio complexo (BMGY/BMMY)............105
4.2.3 Expressão do rLopap em meio mínimo (BMG/BMM)..................110
4.2.4 Expressão do rLopap em biorreator....................................... 117
4.2.5 Testes de estabilidade..........................................................120
4.2.6 Purificação do rLopap...........................................................126
4.3 Efeitos do rLopap em animais previamente tratados com
heparina (enoxaparina)............................................................
132
4.4 Identificação e caracterização da seqüência do Lopap
envolvida na modulação da sobrevivência celular......................
135
4.4.1 Obtenção e avaliação de peptídeos sintéticos derivados do
Lopap.........................................................................................
135
4.4.2 Efeito de inibidores de serino proteases sobre a atividade
antiapoptótica de peptídeo derivado do Lopap...................................
140
4.4.3 Análise estrutural e caracterização da seqüência do Lopap
envolvida na modulação celular......................................................
142
4.5 Efeito de peptídeo sintético derivado do Lopap sobre
a síntese de proteínas de matriz extracelular in vitro e
in vivo.....................................................................................
152
4.5.1 Aumento da síntese de proteínas de matriz extracelular em
cultura de fibroblastos...................................................................
152
4.5.2 Aumento da síntese de colágeno na derme de camundongos.....154
5 DISCUSSÃO............................................................................159
5.1 Proposta do trabalho............................................................159
5.2 Obtenção do rLopap em Pichia pastoris.................................162
5.3 Efeito do rLopap in vivo........................................................165
5.4 Mapeamento peptídico do Lopap...........................................166
5.5 Considerações finais.............................................................170
6 CONCLUSÕES..........................................................................172
REFERÊNCIAS............................................................................173
APÊNDICE - Súmula Curricular.................................................
195
_________ INTRODUÇÃO 32
1 INTRODUÇÃO
Lonomia obliqua é uma espécie de mariposa comumente encontrada
na região Sul do Brasil. Em sua fase larval são conhecidas como lagartas
ou taturanas e apresentam o corpo coberto por cerdas, que ao contato
com a pele secretam veneno com propriedades procoagulantes. O
envenenamento causa uma síndrome hemorrágica devido à coagulação
intravascular disseminada levando a coagulopatia de consumo (Zannin et
al., 2003). O Lopap é uma das toxinas mais abundantes presente nas
cerdas destas lagartas (Veiga et al., 2005; Ricci-Silva et al., 2008).
Estudos com a proteína nativa demonstraram experimentalmente que o
Lopap induz efeitos semelhantes aos observados com o extrato bruto das
cerdas da lagarta em animais de laboratório e aos observados no
envenenamento humano, causando depleção de fibrinogênio e
incoagulabilidade sanguínea (Reis et al., 1999, 2001a). Neste sentido, o
Lopap tem sido apontado como uma das principais toxinas presentes no
veneno de L. obliqua (Carrijo-Carvalho e Chudzinski-Tavassi, 2007).
O Lopap foi inicialmente caracterizado como um ativador de
protrombina com atividade do tipo serino protease (Reis et al., 2001b).
Contudo, esta proteína não apresenta similaridade com nenhum ativador
de protrombina ou serino proteases conhecidos, mas tem domínios
conservados na seqüência primária característicos de lipocalinas e sua
estrutura secundária e terciária segue padrão semelhante a membros
desta família, com a predominância de folhas β-pregueadas formando
uma estrutura molecular em forma de cálice ou barril (Reis et al., 2006).
O envolvimento de algumas lipocalinas em mecanismos de reparo,
remodelamento tecidual (Olsson, 1997; Rassart et al., 2000; Descalzi
Cancedda et al., 2000; Sousa et al., 2005; Hemdahl et al., 2006) e
sobrevivência celular (Schubert et al., 1986; Taniike et al., 2002; Tong et
al., 2005) tem sido proposto. Em estudos prévios com o Lopap nativo em
cultura de células endoteliais que inicialmente foram realizados para
avaliar possíveis efeitos sobre a modulação da hemostasia independente
_________ INTRODUÇÃO 33
de fatores da coagulação, foi observado que o Lopap apresentava também
uma atividade citoprotetora (Fritzen et al., 2005). Particularmente, a
indução da sobrevivência celular não é uma propriedade esperada para
uma toxina. Desta forma, todas estas características indicam que o Lopap
representa uma molécula com características únicas, que despertam
interesse tanto científico - relativo às particularidades bioquímicas e
estruturais desta proteína, quanto terapêutico e biotecnológico,
relacionado à caracterização das propriedades desta molécula e potenciais
aplicações. No início deste trabalho, haviam três patentes depositadas no
Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI) com fase internacional
(PCT) em co-titularidade com a FAPESP, com base nas diferenças
estruturais que permitem enquadrar o Lopap como um novo ativador de
protrombina, sua atividade procoagulante, em seu potencial
desfibrinogenante, e em sua atividade citoprotetora (Chudzinski-Tavassi e
Reis, 2002; Chudzinski-Tavassi et al., 2004, 2005).
Um dos fatores limitantes ao estudo do Lopap é sua obtenção. A
obtenção do Lopap nativo é limitada a pequenas quantidades purificadas a
partir do extrato das cerdas das lagartas de L. obliqua; à disponibilidade
sazonal destas lagartas, restrita aos meses mais quentes do ano; e à
coleta e transporte das mesmas, a partir de cidades da região Sul do
Brasil. A obtenção do Lopap na forma recombinante é limitada pela
possibilidade de manutenção das atividades enzimática e celular na
proteína recuperada ao final dos processos de expressão e purificação, e
pela necessidade de uma metodologia escalonável.
A partir de uma biblioteca de genes transcritos nas cerdas de L.
obliqua (Reis, 2002), o Lopap foi clonado e obtido na forma recombinante
(rLopap) monomérica pela expressão em cepa de Escherichia coli com
cauda de poli-histidina, na forma de corpúsculos de inclusão (Reis et al.,
2006). As limitações para obtenção do rLopap pelo sistema bacteriano
descrito são: a obtenção da proteína com um enovelamento correto, pois
a produção em corpúsculos de inclusão implica em uma fase de
desnaturação seguida de renaturação in vitro; a baixa atividade catalítica
_________ INTRODUÇÃO 34
da proteína obtida; a ausência de processamentos pós-traducionais; a
presença de uma cauda de poli-histidina na proteína recombinante
recuperada. Todos estes aspectos mostram a importância do
desenvolvimento e aprimoramento de metodologias de obtenção do
rLopap com especial atenção quanto à estabilidade da molécula.
Este trabalho teve como objetivo geral o desenvolvimento do Lopap
e o estudo de suas potenciais aplicações. Desta forma, nossos estudos
foram dedicados à obtenção do Lopap recombinante em sistema de
expressão na levedura Pichia pastoris, através de processo escalonável,
em avaliar os efeitos desta proteína in vitro e in vivo e, por outro lado,
através do mapeamento peptídico do Lopap, em identificar a região da
molécula envolvida nos efeitos do Lopap ao nível celular, e caracterizá-la
com relação à atividade catalítica do Lopap e com relação aos domínios
conservados em outros membros da família das lipocalinas. Os objetivos
específicos foram os seguintes:
1) expressar o Lopap na forma solúvel em E. coli Origami;
2) clonar e expressar o Lopap na levedura Pichia pastoris;
3) estabelecer um protocolo padrão de produção do rLopap na levedura
P. pastoris, por um processo escalonável, com produção em alta
densidade celular em biorreator;
4) estudar a estabilidade do rLopap;
5) avaliar a atividade procoagulante e antiapoptótica do rLopap;
6) avaliar experimentalmente a ação do rLopap como agente
hemostático em animais;
_________ INTRODUÇÃO 35
7) entender como os domínios moleculares do Lopap estão envolvidos
na sua ação celular - através da avaliação da atividade de peptídeos
sintéticos derivados de domínios conservados da proteína;
8) avaliar a ação de peptídeos sintéticos derivados do Lopap sobre a
síntese de moléculas de matriz extracelular em cultura de células e
na derme de animais.
REVISÃO DE LITERATURA 36
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 As lagartas do gênero Lonomia
As lagartas do gênero Lonomia são encontradas na América do Sul e
América Central (Lemaire, 1972a, b; Arocha-Piñango et al., 2000) e são
conhecidas por causarem envenenamento acidental associado à uma
síndrome hemorrágica (Arocha-Piñango et al., 1992; Kelen et al., 1995).
Duas espécies têm sido descritas com interesse clínico, por causar
envenenamento em humanos. L. obliqua é encontrada nas regiões Sul e
Sudeste do Brasil, Uruguai, Paraguai e Argentina, e L. achelous na
Venezuela, Guiana Francesa e Norte do Brasil (Carrijo-Carvalho e
Chudzinski-Tavassi, 2007). A espécie Lonomia obliqua Walker, 1855
(Lemaire, 1972b) está inserida na seguinte classificação taxonômica:
Reino: Animalia
Filo: Arthropoda
Subfilo: Mandibulata
Classe: Insecta
Subclasse: Pterygota
Infraclasse: Neoptera
Superordem: Endopterygota
Ordem: Lepidoptera
Superfamília: Bombycoidea
Família: Saturniidae
Gênero: Lonomia
Espécie: Lonomia obliqua
REVISÃO DE LITERATURA 37
Lepidoptera é a ordem dentre os insetos que agrupa mariposas e
borboletas, com mais de 180.000 espécies classificadas em 128 famílias,
sendo que a maioria não apresenta perigo ao contato humano. Apenas 12
famílias contêm membros considerados perigosos, podendo causar
injúrias ao homem que variam, dependendo da espécie envolvida, de
dermatites urticantes e asma a casos que evoluem para osteocondrite,
coagulopatia de consumo, falência renal e hemorragia intracerebral (Diaz,
2005). Estas espécies, em sua maioria são potencialmente venenosas na
fase larval, especialmente de mariposas, sendo que apenas uma família
de borboletas é descrita por ter espécies venenosas (Diaz, 2005). O
acidente com lagartas é denominado genericamente de erucismo (erucae
= larva). Na fase larval, esses insetos podem ser denominados lagartas ou
também taturanas (do tupi, tata = fogo e rana = semelhante) que, com
algumas exceções, são fitófagas e por isso também são consideradas
pragas para a agricultura (Kelen et al., 1995).
O ciclo biológico de L. obliqua é composto por quatro fases distintas
(Lorini e Corseul, 2001): ovo, larva (lagarta), pupa e adulto (mariposa)
(Figura 1). Após o acasalamento, a fêmea faz a postura dos ovos nas
folhas da planta que servirá de alimento para as futuras lagartas. O
período embrionário é de aproximadamente 17 dias. A fase de larva tem
duração de aproximadamente 90 dias, nos quais permanecem nas árvores
ou arbustos, alimentando-se de folhas. As lagartas de L. obliqua têm
coloração castanho-escura, com uma listra longitudinal contínua marrom-
escura contornada de preto na região dorsal do corpo, e outras duas
listras laterais longitudinais intercaladas por manchas claras levemente
amareladas (Figura 2A). A cabeça tem coloração castanho-escura com a
fronte amarelo-palha. Apresentam cerdas na forma de espinhos,
simetricamente dispostas ao longo do dorso, as quais são ramificadas e
pontiagudas, de aspecto arbóreo, com tonalidade esverdeada. As cerdas
são as estruturas que contêm o veneno e fazem sua inoculação ao contato
da pele das vítimas com as lagartas (Lorini e Corseul, 2001; Veiga et al.,
2001). Estas lagartas têm hábitos gregários, e podem ser encontradas em
REVISÃO DE LITERATURA 38
colônias de dezenas a centenas de indivíduos, camuflando-se sobre galhos
ou troncos de árvores (Figura 2B). A fase de larva é dividida em seis
estágios de desenvolvimento denominados ínstares. No sul do Brasil,
estas lagartas podem ser encontradas principalmente no período mais
quente do ano (primavera/verão), entre os meses de novembro a
fevereiro.
No final da fase larval, as lagartas se posicionam no tronco da
árvore, próximo ao solo, onde se transformarão em pupas. As pupas
permanecem no solo por um período que pode variar de 30 a 100 dias,
nos meses de inverno, dependendo das condições climáticas. Após este
período, as pupas se transformam em mariposas, que vivem apenas em
torno de oito dias, nos quais se acasalam e fazem a dispersão, reiniciando
o ciclo na natureza. Os adultos apresentam dimorfismo sexual. O macho
tem cerca de 6 cm de envergadura e a face dorsal das asas tem cor
amarelo-alaranjada com listras pretas transversais na porção anterior e
posterior. As fêmeas tendem a ser maiores e possuem tonalidade
castanho-acinzentada com listras transversais escuras nas asas.
Os inimigos naturais da L. obliqua são as larvas de moscas e vespas
que perfuram o tegumento das lagartas e se alimentam de estruturas
internas, impedindo o prosseguimento do ciclo biológico da lagarta na
passagem para pupa. Outro parasita, o Hexamermis sp (Nematoda), foi
isolado do tubo digestivo das lagartas. Mais recentemente, foi isolado e
identificado um poliedrovírus, o LoobMNPV (Lonomia obliqua múltiplo
nucleopolyhedrovírus), que é um agente exterminador de colônias de L.
obliqua (Moraes, 2002).
REVISÃO DE LITERATURA 39
Figura 1 - Ciclo biológico de Lonomia obliqua (fases). A) ovo; B) larva; C) pupa; D) adulto (macho e fêmea), a foto ao lado direito mostra o acasalamento. Fotos: Roberto H.P. Moraes – Instituto Butantan, com permissão.
A
C
D
macho
fêmea
REVISÃO DE LITERATURA 40
Figura 2 - Lagarta Lonomia obliqua.
A) Padrão de coloração; B) hábito gregário em tronco de árvore. Foto em B: Roberto H.P. Moraes – Instituto Butantan, com permissão.
A
B
REVISÃO DE LITERATURA 41
2.2 Síndrome hemorrágica causada pela lagarta L. obliqua
A inoculação do veneno de Lonomia ocorre após contato da pele da
vítima com as cerdas de uma, ou comumente muitas lagartas. Observa-se
um quadro de envenenamento sistêmico, com manifestações
hemorrágicas de intensidade variável, que é dependente, entre outros
fatores, da área do corpo da vítima e do número de lagartas envolvidas no
acidente (Vulinec, 1990).
Desde 1967, Arocha-Piñango e colaboradores têm reportado casos
de acidentes na Venezuela com a lagarta da espécie Lonomia achelous. Os
acidentes são caracterizados por uma síndrome hemorrágica que estes
autores atribuem à atividade fibrinolítica do veneno (Arocha-Piñango e
Layrisse, 1969). Observações posteriores demonstraram baixos níveis
plasmáticos de fibrinogênio, fator V (FV), fator XIII (FXIII) e
plasminogênio, aumento de produtos de degradação de fibrinogênio e em
casos severos queda nos níveis de protrombina (FII) e aceleração na
geração de trombina (FIIa) em pacientes após contato com a lagarta
(Arocha-Piñango e Pepper, 1981; Arocha-Piñango et al., 1992; Guerrero
et al., 1997). Desta forma os autores sugeriram que o envenenamento
por L. achelous desencadeia síndrome fibrinolítica severa associada a uma
coagulação intravascular disseminada (CID) (Arocha-Piñango et al.,
2000).
No Brasil, acidentes isolados foram identificados, em 1982, no
estado do Amapá e na Ilha de Marajó (Kelen et al., 1995) causados
também por L. achelous. A partir de 1989, um número crescente de
acidentes com L. obliqua tem sido reportado no Sul do Brasil em Santa
Catarina, Rio Grande do Sul e Paraná, atingindo também Estados da
Região Sudeste. Atualmente este é considerado um problema de saúde
pública (Diaz, 2005), e pode estar relacionado a diversos fatores, como
desmatamento e expansão urbana para regiões de floresta, utilização de
defensivos agrícolas, alteração das condições climáticas, diminuição de
REVISÃO DE LITERATURA 42
predadores e adaptação da espécie a espécies vegetais exóticas
introduzidas pelo homem (Lorini e Corseul, 2001).
Os sintomas clínicos incluem dermatite urticante, cefaléia, náuseas,
vômitos e dores musculares, com equimoses, hematomas espontâneos ou
decorrentes de traumas, hemorragias de cavidades mucosas (gengival,
nasal) e em feridas recentes, hematúria, hemorragias abdominais,
pulmonares e glandulares (Duarte et al., 1990; Kelen et al., 1995). Em
casos mais graves pode ocorrer hemorragia intracerebral e insuficiência
renal.
Dados laboratoriais mostram diminuição dos níveis plasmáticos de
fibrinogênio, FV, fator VIII (FVIII), e discreta redução de FXIII. Os níveis
de FII, fator X (FX), fator XII (FXII), fator de von Willebrand e
antitrombina III (AT III) não são alterados. A presença de fragmentos 1.2
da protrombina (F1.2) e do complexo trombina-antitrombina indicam que
ocorre geração de trombina. Quanto a fatores do sistema fibrinolítico,
ocorre diminuição moderada dos níveis de plasminogênio e α2-
antiplasmina com elevados níveis dos produtos de degradação de
fibrinogênio/fibrina e de fibrina cross-linked (D-dímeros) e do inibidor do
ativador de plasminogênio (PAI-1) (Zannin et al., 2003). Esses dados
foram obtidos em um estudo realizado por Zannin e colaboradores (2003),
no qual 105 pacientes foram avaliados. O conjunto dos dados obtidos a
partir da análise dos plasmas dos pacientes demonstra que ocorre
ativação do sistema de coagulação com uma forma de coagulação
intravascular disseminada, resultando em uma coagulopatia de consumo e
ativação secundária da fibrinólise.
Atualmente, pacientes envenenados por L. obliqua são tratados com
o soro antilonômico (Dias-da-Silva et al., 1996), que é produzido no
Instituto Butantan, e têm mostrado ser efetivo na reversão da
coagulopatia de consumo causada pelo veneno desta lagarta (Rocha-
Campos et al., 2001; Caovilla e Barros, 2004).
A atividade de toxinas procoagulantes no extrato das cerdas de L.
obliqua, que atuam na ativação de FX e de protrombina, foi demonstrada
REVISÃO DE LITERATURA 43
por Donato et al. (1998). Posteriormente, duas proteínas foram isoladas e
caracterizadas, sendo denominadas Losac (Lonomia obliqua Stuart factor
activator) (Alvarez Flores et al., 2006) e Lopap (Lonomia obliqua
prothrombin activator protease) (Reis et al., 1999; 2001b). A ação destas
proteínas na cascata de coagulação está mostrada na Figura 3, que
apresenta o sistema hemostático, com as vias e fatores de coagulação e
fibrinólise.
2.3 Lopap – o ativador de protrombina da lagarta L. obliqua
A forma nativa do Lopap foi isolada a partir do extrato das cerdas de
L. obliqua como um tetrâmero de aproximadamente 69 kDa, capaz de
ativar a protrombina de forma dose dependente. Esta proteína apresenta
atividade do tipo serino protease, é inibida por fluoreto de fenil-metil-
sulfonil (PMSF) e tem sua atividade aumentada em presença de íons cálcio
(Reis et al., 1999; 2001b).
O Lopap hidrolisa a protrombina em duas posições, na ligação
peptídica Arg284-Thr285, que também é o sítio de clivagem reconhecido
pela trombina, e com menor especificidade entre os aminoácidos Arg320-
Ile321, que é o sítio de clivagem do fator X ativado (FXa). Desta forma, o
Lopap ativa o FII gerando produtos de hidrólise similares àqueles
originados pelo FXa na ausência dos componentes do complexo
protrombinase, que são os fragmentos pretrombina, F1.2 e α-trombina
(Figura 4). A trombina formada a partir da hidrólise da protrombina pelo
Lopap é capaz de coagular fibrinogênio purificado, plasma humano e
hidrolisar substrato cromogênico (S-2238) (Reis et al., 2001b, Fritzen,
2002). Verificou-se também que a trombina produzida pelo Lopap é
inibida por AT III e é capaz de agregar plaquetas e coagular plasma e
fibrinogênio, sugerindo ser semelhante à α-trombina (Chudzinski-Tavassi
et al., 2001).
REVISÃO DE LITERATURA 44
Figura 3 - Representação esquemática do sistema hemostático. As vias clássicas de ativação dos sistemas de coagulação e fibrinólise estão mostradas, bem como os principais fatores envolvidos. F: fator de coagulação, a: ativado, HMWK: cininogênio de alto peso molecular, TF: fator tissular, tPA: ativador de plasminogênio tecidual, uPA: ativador de plasminogênio do tipo uroquinase, D-D: D-dímero.
REVISÃO DE LITERATURA 45
Figura 4 - Esquema representativo da hidrólise da protrombina. A separação em retângulos de cores diferentes representa os pontos de hidrólise na seqüência da protrombina. A via de hidrólise da protrombina pelo FXa representada à esquerda ocorre na ausência do complexo protrombinase, e à direita ocorre com a formação do complexo protrombinase em uma superfície fosfolipídica na presença do FVa como cofator. A ativação da protrombina pelo Lopap ocorre conforme a via representada à esquerda, sem formação de meizotrombina. S-S representa as pontes dissulfeto.
REVISÃO DE LITERATURA 46
A maioria dos ativadores de protrombina exógenos caracterizados é
originada do veneno de serpentes (Kini, 2005). De acordo com a
classificação atual (Kini et al., 2001), estas enzimas pertencem a quatro
grupos distintos (Tabela 1). De acordo com esta classificação, os dois
grupos de ativadores de protrombina com atividade do tipo serino
protease necessitam de cofatores para sua atividade catalítica, ao
contrário do Lopap. Desta forma o Lopap não se encaixa nesta
classificação, e os dados sugerem que esta proteína representa uma nova
classe de ativadores de protrombina, com mecanismo de catálise
enzimática diferente de outras serino proteases e ativadores de
protrombina purificados de venenos de serpentes.
Tabela 1 - Classificação de ativadores de protrombina de venenos de serpentes.
Grupo Cofator necessário Classe* Produto gerado
A - metaloprotease meizotrombina
B Ca2+ metaloprotease meizotrombina
C Ca2+, fosfolipídeos serino protease trombina
D Ca2+, fosfolipídeos, FVa serino protease trombina
Fonte: Kini et al., 2001.
A administração do Lopap nativo em ratos e camundongos induziu
incoagulabilidade sanguínea de forma semelhante ao extrato bruto de L.
obliqua nos pacientes (Zannin et al., 2003) e em animais experimentais
(Reis et al., 2001a), indicando que esta proteína é um componente
importante do veneno de L. obliqua, e possivelmente, um dos principais
fatores causadores da coagulopatia de consumo (Reis et al., 1999; Reis et
al., 2001a). Devido à sua ação procoagulante, o Lopap é capaz de
depletar o fibrinogênio do sangue de animais e induzir a incoagulabilidade
REVISÃO DE LITERATURA 47
sangüínea, porém com alteração de apenas 30% no número de plaquetas
(Reis et al., 2001a).
Experimentos em cultura de células endoteliais demonstraram que o
Lopap apresenta atividade moduladora sobre o endotélio vascular,
induzindo a expressão de moléculas de adesão, como a molécula de
adesão intercelular-1 (ICAM-1) e E-selectina, moléculas envolvidas na
inflamação, como interleucina-8 (IL-8) e na regulação do tônus vascular e
agregação plaquetária como o óxido nítrico (NO) e a prostaciclina (PGI2).
Além disso, Lopap apresentou atividade citoprotetora, inibindo o processo
de apoptose (Chudzinski-Tavassi et al., 2001; Fritzen et al., 2005), o que
desperta o interesse nesta proteína como ferramenta para pesquisa, bem
como para processos terapêuticos e biotecnológicos que envolvam a
modulação da sobrevivência celular.
O Lopap foi previamente obtido na forma recombinante em nosso
laboratório através de um sistema de expressão bacteriano. A seqüência
de ácido desoxirribonucléico (DNA) codificante do Lopap foi obtida a partir
do transcriptoma das cerdas da lagarta L. obliqua, que corresponde a uma
biblioteca de DNA complementar (cDNA) a partir dos transcritos de ácido
ribonucléico mensageiro (mRNA). O fragmento de cDNA do Lopap foi sub-
clonado em vetor de expressão pAE, e a proteína foi expressa em E. coli
com a fusão de 6 resíduos de histidina na porção N-terminal. Desta forma,
o rLopap foi obtido na forma ativa monomérica (Reis, 2002; Reis et al.,
2006).
Embora se tenha estabelecido um processo de obtenção do rLopap
em sistema bacteriano, esta metodologia apresenta algumas limitações. A
proteína recombinante expressa na forma solúvel e não é secretada no
meio, mas é expressa na forma de corpúsculos de inclusão, os quais são
extraídos por lise celular e solubilizados em uréia. A proteína necessita ser
renaturada in vitro através de técnicas de refolding, que são limitadas e
muitas vezes não permitem a obtenção da conformação terciária original
da proteína com perfeição. Além disso, a proteína recombinante obtida ao
final do processo de purificação por cromatografia de afinidade com níquel
REVISÃO DE LITERATURA 48
pode apresentar resíduos de uréia e imidazol, reagentes tóxicos e
irritantes, que podem interferir em testes in vivo e em cultura de células.
A proteína produzida por este sistema não tem processamentos pós-
traducionais que são realizados em sistemas eucariontes como
enovelamento, glicosilação e clivagem do peptídeo sinal. Outro fator
limitante é a presença de uma cauda de poli-histidina, que não é
compatível com as exigências de órgãos reguladores para a produção de
produtos com finalidade terapêutica, como a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA) e o órgão americano Food and Drug
Administration (FDA).
O rLopap expresso em E. coli não apresentou a mesma eficiência
catalítica que o Lopap nativo, observando-se alto índice de polimorfia
(variedade de formas estruturais), indicando problemas de enovelamento.
Quando o rLopap foi cromatografado em coluna de afinidade Benzamidina
Sepharose, observou-se a ligação de menos de 1% da proteína na resina.
Outro aspecto importante relativo à limitação do processo de obtenção do
Lopap em E. coli é a tendência à agregação/precipitação desta proteína e
sua capacidade de se ligar a outras moléculas por se tratar de uma
lipocalina.
A seqüência completa do Lopap (Figura 5) foi deduzida a partir do
cDNA (Reis, 2002). Esta seqüência não apresenta homologia com
seqüências de outros ativadores de protrombina, tampouco com serino
proteases conhecidas disponíveis em bancos de dados públicos, mas tem
alinhamento com seqüências de proteínas da família das lipocalinas de
origem humana e animal incluindo outros lepidópteros (Figura 6). A
presença de domínios conservados característicos de lipocalina na
seqüência primária do Lopap pode ser observada na Figura 6. A análise
por dicroísmo circular aliada a estudos de modelagem computacional
confirmaram que o Lopap apresenta uma estrutura característica da
família das lipocalinas (Reis et al., 2006), que é descrita como um β-barril
consistindo de oito folhas-β antiparalelas com α-hélices nas extremidades
(Figura 7). O Lopap é o primeiro membro conhecido da família das
REVISÃO DE LITERATURA 49
lipocalinas que apresenta atividade proteolítica e um dos poucos descritos
com atividade enzimática, como a prostaglandina D sintase (Nagata et al.,
1991) e epoxidases de plantas (Bugos et al., 1998).
Os dados de caracterização bioquímica e estrutural obtidos até o
momento indicam que o Lopap é uma molécula que reúne propriedades
únicas, diferentes de outras proteínas já descritas, o que faz desta
proteína um importante objeto de estudo. As ações do Lopap
demonstradas sobre o sistema de coagulação e sobre a viabilidade celular
abrem perspectivas para o estudo desta proteína como ferramenta
terapêutica e biotecnológica.
REVISÃO DE LITERATURA 50
Figura 5 - Seqüência nucleotídica e de aminoácidos do Lopap. A seqüência de aminoácidos do Lopap (em azul) foi deduzida a partir da seqüência nucleotídica do cDNA (em preto) obtida a partir do transcriptoma das cerdas de L. obliqua.
gacgtagttatagatggtgcgtgtcctgacatgaaggcggtatcgaaa 54
D V V I D G A C P D M K A V S K 18
tttgacatgaatgcttatcaaggaacgtggtacgagatcaagaaattccccgtg 108
F D M N A Y Q G T W Y E I K K F P V 36
gctaatgaagcgaacggtgattgtggaagtgttgagtatacccccgacaatgga 162
A N E A N G D C G S V E Y T P D N G 54
ctactgaaggtgagagcgggacacgttgaagatgatatcgagaagtttgttgtc 216
L L K V R A G H V E D D I E K F V V 72
ggagtcctcaccaagaatgcagacaccagcgatgctgagctcactctcagcgtt 270
G V L T K N A D T S D A E L T L S V 90
gtagtcggcgactacgtccgcgttgcaccgctgtggattctttctactgattac 324
V V G D Y V R V A P L W I L S T D Y 108
gacaactatgctatcggctactcctgcaaagactacaagaagagcaaccaacac 378
D N Y A I G Y S C K D Y K K S N Q H 126
agggtaaacatctggattctctcgaggaccaagactctcaacgaaagttccaag 432
R V N I W I L S R T K T L N E S S K 144
tccactgtcaacaagttccttaaggagcactcaaaggagttcgatcaatcgaaa 486
S T V N K F L K E H S K E F D Q S K 162
tttgtcgagacagatttctccgaaaaagcatgcttcttcaagaaatcacacgtg 540
F V E T D F S E K A C F F K K S H V 180
tacactgtaccattcggagcttaaattcgatttgtttggtctagtgctaataaa 594
Y T V P F G A Stop 187
aggtttttgggtttttaaatttaattaaccttataagtggaattaataataaat 648
Polyadenilation site
aagtgaaacaaaaaaaaaaaaaaaaaa 675
REVISÃO DE LITERATURA 51
Figura 6 - Alinhamento da seqüência primária do Lopap com outros membros da família das lipocalinas, mostrando as regiões conservadas (motifs). As seqüências de proteínas alinhadas e seus respectivos números de acesso no National Center for Biotechnology Information (NCBI) foram: PH2IP (prostaglandina D sintase, Q8WNM1), Lopap (AAW88441), BBP (bilin-binding protein, P09464), APOD (apolipoproteína D, NP_001638), INS (insecticianina A, P00305) e bombirina (BAB47155) (Reis et al., 2006).
REVISÃO DE LITERATURA 52
Figura 7 - Estrutura tridimensional do Lopap obtida por modelagem
molecular. A) Monômero, destacando a tríade catalítica predita e sítios de ligação de íons cálcio; B) tetrâmero (Reis et al., 2006).
A
B
N-terminal
biliverdina
sítio ativo
sítio ativo
entrada do
barril
REVISÃO DE LITERATURA 53
2.4 Lipocalinas
A família das lipocalinas reúne proteínas extracelulares com funções
diversas, presentes em vários sistemas fisiológicos. Estas proteínas
podem ser encontradas em microorganismos, plantas e animais - desde
invertebrados até ao homem. Membros desta família são conhecidos
principalmente como proteínas carreadoras de pequenas moléculas, mas
também estão envolvidos em processos metabólicos e de regulação
homeostática. Estas proteínas podem ser encontradas na forma
monomérica (aproximadamente 20 a 40 kDa) ou multimérica (Flower,
1996). As principais propriedades das lipocalinas são: 1) se ligam a
moléculas hidrofóbicas de baixo peso molecular; 2) se ligam a receptores
de membrana celular e a outras proteínas, podendo formar complexos
macromoleculares; 3) apresentam estrutura terciária na forma de um β-
barril, formado por oito folhas β antiparalelas mantidas por pontes de
hidrogênio e um sítio de ligação na cavidade central, onde se ligam as
moléculas a serem transportadas (Flower, 1996; Grzyb et al., 2006). Na
Figura 8 está representada a estrutura em β-barril típica de lipocalinas e a
ligação de moléculas para transporte no interior do barril.
REVISÃO DE LITERATURA 54
Figura 8 - Estrutura em β-barril da apolipoproteína D humana.
A) Vista frontal do β-barril, B) vista interna do β-barril, com a presença de uma molécula ligante (proteína em complexo com a progesterona). A estrutura terciária cristalográfica (Eichinger et al., 2007) foi visualizada pelo programa Cn3D (Wang et al., 2000a). Fonte: banco de dados 3D domains - Molecular Modeling Database (MMDB) do NCBI (Wang et al., 2000b), acesso: 2HZR (A) e 2HZQ (B).
A
B
REVISÃO DE LITERATURA 55
Apesar de apresentarem estrutura secundária e terciária altamente
conservada, em geral, as lipocalinas apresentam baixa similaridade na
seqüência de aminoácidos (10 a 20%). Contudo, observa-se a presença
de três domínios conservados na seqüência primária destas proteínas,
denominados structurally conserved regions (SCRs). Flower et al. (1993)
classificaram estes domínios como SCR1, SCR2 e SCR3. As proteínas que
apresentam estes três domínios característicos de lipocalinas são
classificadas no grupo kernel, que inclui a maioria das lipocalinas. Em um
segundo grupo, denominado outlier, são incluídas as lipocalinas com
maior divergência. Lipocalinas do grupo outlier apresentam apenas um ou
dois desses domínios, com mais freqüência o SCR1, enquanto o SCR2 é
encontrado exclusivamente em lipocalinas do grupo kernel (Flower, 1996).
Na Figura 9 estão ilustrados os componentes da estrutura de lipocalinas
do grupo kernel, destacando os três SCRs (motifs) presentes nestas
proteínas e a disposição das oito folhas principais que formam o barril,
conforme Flower et al. (1993). A extremidade onde se localiza o loop L1, e
os demais loops de número ímpar, corresponde à entrada do barril.
Membros da família das lipocalinas podem desempenhar diversas
funções como, por exemplo, no transporte de ácidos graxos (β-
lactoglobulina), transporte de retinol (retinol-binding protein), transporte
de feromônios (major urinary protein, apolipoproteína D), coloração em
invertebrados (bilin-binding protein, crustacianina), percepções olfativas e
gustativas (odorant binding protein, von Ebner's-gland protein), síntese de
prostaglandina (prostaglandina D sintase) e regulação do sistema imune
(C8γ, neutrophil gelatinase-associated lipocalin, α1-microglobulina)
(Flower, 1996; Grzyb et al., 2006). Lipocalinas também desempenham
papéis na regulação da diferenciação, proliferação, sobrevivência e adesão
celular. A apolipoproteína D, quiescience specific protein, purpurina, α1-
microglobulina e a neutrophil gelatinase-associated lipocalin são algumas
lipocalinas cujo envolvimento na regulação da homeostasia celular tem
sido descrito (Flower, 1994, 1996).
REVISÃO DE LITERATURA 56
Figura 9 - Estrutura da prostaglandina D sintase murina destacando as
características estruturais de lipocalinas. A) Vista frontal do β-barril; B) visualização da estrutura disposta de forma linear (adaptado) com as porções N e C-terminal, a localização dos três domínios conservados de lipocalinas (motifs), hélice do tipo 310 e α-hélice (A1), as folhas β que formam o barril (A-H), e os loops que as conectam (L1-L7). A estrutura terciária cristalográfica (Irikura et al., 2003) foi visualizada pelo programa Cn3D (Wang et al., 2000a). Fonte: banco de dados 3D domains - MMDB do NCBI (Wang et al., 2000b), acesso: 2CZT.
A B C D E F
G H
A1 310
I
motif 1 L4
L1
L2
L3 L5
L6
L7
motif 2 motif 3
A
B
REVISÃO DE LITERATURA 57
Além destas funções, o envolvimento de algumas lipocalinas como
fatores de proteção em resposta a estímulos ambientais e condições de
estresse tem sido demonstrado, como é o caso das proteínas de choque
térmico TaTIL e AtTIL (Charron et al., 2002) e as enzimas fotoprotetoras
de plantas zeaxantina epoxidase e violaxantina de-epoxidase (Bugos et
al., 1998). Lipocalinas de bactérias também estão envolvidas em
respostas a condições de estresse e possivelmente no rearranjo de
membrana (Bishop et al., 1995; Bishop, 2000). Nos animais, durante
condições adversas como em infecções e patologias, é observada
freqüentemente a elevação nos níveis de algumas lipocalinas, muitas
destas com funções reconhecidas na modulação do sistema imune e
inflamatório. Estas proteínas são conhecidas como imunocalinas
(Lögdberg e Wester, 2000). O aumento da expressão de lipocalinas está
associado a muitas doenças de ordem tumoral, inflamatória,
neurodegenerativa, bem como disfunções cardiovasculares, renais e
hepáticas (Rassart et al., 2000; Xu e Venge, 2000; Henze et al., 2008; Al-
Daghri et al., 2009; Yndestad et al., 2009; Tuladhar et al., 2009), embora
em alguns casos ainda não esteja definido se a proteína tem relação com
a etiologia da patologia ou se sua expressão é aumentada em resposta ao
estado patológico.
A participação de lipocalinas em processos de desenvolvimento
também tem sido demonstrada. O envolvimento da chondrogenesis-
associated lipocalin em processos de desenvolvimento durante a
embriogênese, formação óssea, remodelamento tecidual e na citoproteção
tem sido demonstrado (Pagano et al., 2002, 2003). A quiescence-specific
protein ou extracellular fatty acid-binding protein parece ser responsável
pela estabilização e manutenção da sobrevivência celular em populações
de células maduras (Bedard et al., 1989; Descalzi Cancedda et al., 1988;
Cancedda et al., 1990; Dozin et al., 1992; Mao et al., 1993; Descalzi
Cancedda et al., 2000, 2002; Giannoni et al., 2004). A uterocalina é
altamente expressa no útero e glândulas mamárias durante o processo de
involução destes tecidos após reprodução, e, possivelmente, tem papel na
REVISÃO DE LITERATURA 58
proteção de células residentes destes tecidos que devem sobreviver ao
processo de involução, frente a estímulos de indução de apoptose, à ação
de enzimas degradativas, presença de radicais livres, invasão de
neutrófilos e outras respostas de fase aguda (Ryon et al., 2002). A
purpurina é encontrada em associação com células neuronais da retina
conferindo proteção a estas células. A apolipoproteína D tem envolvimento
na citoproteção e regeneração de tecidos nervosos, células neuronais e
fibroblastos (Rassart et al., 2000; Do Carmo et al., 2008; Navarro et al.,
2008).
Apesar de haver um número crescente de trabalhos dedicados à
caracterização bioquímica e funcional de muitas lipocalinas, o exato papel
destas proteínas na regulação celular e em processos de desenvolvimento
e manutenção nos diversos sistemas fisiológicos ainda não está claro. O
possível envolvimento dos SCRs nas propriedades das lipocalinas tem sido
discutido. Flower (1996) e outros autores (North, 1989; Flower et al.,
1993) propuseram que estes domínios poderiam conferir propriedades
comuns ao diversos membros desta família através de seu envolvimento
na interação das lipocalinas com receptores celulares, e da manutenção de
um padrão conservado de sua estrutura terciária. Contudo, não há na
literatura bases experimentais que contribuam para o esclarecimento
desta questão. A maioria dos trabalhos tem sido dedicada à caracterização
das propriedades específicas de membros da família das lipocalinas,
especialmente aquelas de caráter individual, que diferenciam estas
proteínas umas das outras, por exemplo, na interação com diferentes
moléculas ligantes (Sivaprasadarao e Findlay, 1994; Melhus et al., 1995;
Glasgow et al., 1999; Wojnar et al., 2001; Gudderra et al., 2005). Outra
questão importante discutida na literatura é o papel de modificações pós-
traducionais como, por exemplo, padrões diferenciados de glicosilação,
nas atividades de lipocalinas, que muitas vezes conferem atividades
antagônicas a uma mesma molécula (Lögdberg e Wester, 2000).
Nos lepidópteros as lipocalinas têm sido associadas principalmente a
funções na coloração destes insetos, as quais se complexam a biliverdina
REVISÃO DE LITERATURA 59
IX e outros cromóforos que conferem pigmentação azul (Goodman et al.,
1985; Saito e Shimoda, 1997; Saito, 1998a, b; Saito et al., 1998;
Yamanaka et al., 2000; Choi et al., 2006). Estas lipocalinas são, em geral,
denominadas como biliverdin-binding protein, dentre as quais a
insecticianina é a melhor caracterizada (Riley et al., 1984; Goodman et
al., 1985; Holden et al., 1986; 1987; Riddiford et al., 1990; Li e Riddiford,
1992; 1994; Kang et al., 1995). O receptor de membrana desta proteína
foi identificado em ovócitos da mariposa Manduca sexta (Kang et al.,
1997). Estas proteínas são expressas diferencialmente nos vários estágios
de desenvolvimento do inseto (Riddiford et al., 1990), o que indica seu
envolvimento na fisiologia do animal. Também formam identificadas
lipocalinas de lepidópteros que se ligam a moléculas fluorescentes
(Mauchamp et al., 2006) hormônio (Sok et al., 2005; Zalewska et al.,
2009) e feromônio (Du e Prestwich, 1995).
Estudos incluindo análise proteômica e transcriptômica, têm
mostrado que lipocalinas correspondem às proteínas mais abundantes
encontradas nas cerdas e na hemolinfa das lagartas de L. obliqua, e
muitas destas lipocalinas foram identificadas como isoformas do Lopap
(Veiga et al., 2005; Chudzinski-Tavassi e Alvarez Flores, 2005; Ricci-Silva
et al., 2008). Neste caso, ainda não se sabe se o Lopap e as lipocalinas
em geral desempenham algum papel biológico para a própria lagarta além
de sua ação como toxina procoagulante no envenenamento.
MATERIAIS E MÉTODOS 60
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Obtenção do rLopap na forma solúvel em sistema bacteriano
(E. coli Origami)
3.1.1 Clonagem em vetor de expressão pAE e obtenção de solução-
estoque do plasmídeo
O inserto do Lopap foi previamente subclonado a partir de uma
biblioteca de cDNA das cerdas da lagarta L. obliqua pelo Dr. Cleyson
Valença Reis (Reis, 2002). Para expressão do rLopap, foi utilizado vetor de
expressão pAE (Figura 10) contendo a seqüência codificante do Lopap com
a fusão de seis resíduos de histidina (6xHis) à porção N-terminal da
proteína para possibilitar sua posterior purificação por cromatografia de
afinidade em coluna de Ni-Sepharose.
Para obtenção da solução-estoque de plasmídeos recombinantes
pAE-Lopap foi utilizada cepa da bactéria E. coli cálcio competente DH5α:
ø80 dlacZ∆M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rk-, mk+) SupE44,
relA1, deoR ∆(lac ZYA – arg I) u169, preparada de acordo com o método
de Inoue et al. (1990). Foram adicionados 3 µl do plasmídeo a uma
alíquota de 100 µl da bactéria competente, previamente descongelada em
banho de gelo por 15 min. A bactéria foi então submetida a choque
térmico, sendo incubada por no mínimo 30 min em banho de gelo, em
seguida 2 min em banho seco a 42 °C, e novamente em banho de gelo
por mais 5 min.
MATERIAIS E MÉTODOS 61
Figura 10 - Mapa do pAE. Vetor de expressão derivado do pRSETA (Invitrogen) e do pET3-His (Chen, 1994), construído no Laboratório de Biotecnologia do Instituto Butantan (Ramos et al., 2004).
MATERIAIS E MÉTODOS 62
Após a transformação, foram adicionados 350 µl de meio 2xYT
(triptona 1,6%, extrato de levedura 1,0%, NaCl 0,5%) e realizada
incubação por 90 min a 37 °C, 230 rpm. Posteriormente, alíquotas de 50,
100 e 200 µl foram semeadas em placas com meio 2xYT-ágar (1,5%)
contendo ampicilina (100 µg/ml), as quais foram incubadas por 18 h a 37
°C. Colônias isoladas foram inoculadas em 2,5 - 5,0 ml de meio 2xYT
contendo ampicilina (100 µg/ml) e incubadas a 37 °C, 250 rpm. Após 18 h
de incubação no meio líquido, a cultura foi centrifugada a 10.000 g por 5
min para recuperação das células.
O pellet de células foi submetido à extração plasmidial, utilizando kit
“Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System” (Promega). O produto
obtido (solução de plasmídeos recombinantes purificados, em água) foi
analisado por eletroforese em gel de agarose 1% (corrida a 100 V por 1
h), e submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR, polymerase
chain reaction).
A reação de PCR foi realizada com o “kit 2X PCR Master Mix”
(Fermentas), em volume final de 25 µl, utilizando como oligonucleotídeos
iniciadores o oligonucleotídeo sense P1 (Figura 11) e o oligonucleotídeo
anti-sense SP6, o qual é baseado na seqüência do plasmídeo (Life
Technologies). Foi utilizado 1 µl de DNA plasmidial como molde, 2 µl de P1
e 1 µl de SP6, ambos na concentração de 10 pM/µl (100 µM) diluídos em
tampão TE (Tris-HCl 10 mM, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) 1
mM). Para controle negativo de amplificação foi adicionada água ultrapura
em lugar do DNA plasmidial. As condições da PCR foram: desnaturação
inicial a 94 °C por 3 min, 30 ciclos de desnaturação (94 °C, 45 seg),
anelamento (50 °C, 25 seg), extensão (72 °C, 4 min) e uma extensão
final a 72 °C por 15 min seguida de resfriamento a 4 °C. Em seguida, as
amostras foram submetidas a eletroforese em gel de agarose 1,5% em
tampão TAE 1x (tris-acetato 0,04 M, EDTA 1 mM). Após a corrida
eletroforética (100 V por 2 h), o gel foi corado com solução de brometo de
etídio 0,1 µg/ml, sob a luz ultravioleta (Sambrook, 1989).
MATERIAIS E MÉTODOS 63
Figura 11 - Oligonucleotídeo P1. Oligonucleotídeo (primer) degenerado desenhado a partir da seqüência N-terminal do Lopap, com sítio de restrição BamH I, que corresponde ao sítio de inserção da seqüência codificante do Lopap no vetor pAE.
Sense Primer 1 (P1)
AT GGA TCC GAC GTA GTT ATM GAY GGN GC
BamH I D V V I D G A
M = C ou A
Y = T ou C
R = A ou G
N = A, T, C ou G
MATERIAIS E MÉTODOS 64
3.1.2 Expressão e purificação do rLopap
O vetor pAE contendo o inserto do Lopap foi transformado em cepa
de E. coli competente Origami (DE3) pLys (Novagen), que é uma cepa
derivada de K-12 com mutações nos genes que codificam para as enzimas
tioredoxina redutase (trxB) e glutationa redutase (gor), o que torna o
ambiente citoplasmático destas bactérias menos redutor e, portanto
favorável à formação de pontes dissulfeto (Novagen Catalog, 2002-2003).
Desta forma, bactérias Origami são utilizadas para favorecer a obtenção
de proteínas recombinantes na forma solúvel e ativa (Xiong et al., 2005).
Para transformação, 3 µl da solução-estoque de plasmídeo pAE-
Lopap foram adicionados a 100 µl da bactéria competente, previamente
descongelada em banho de gelo por 15 min. A bactéria foi incubada por
mais 30 min em banho de gelo, e em seguida em banho seco a 42 °C por
2 min, e novamente em banho de gelo por 5 min. Após a transformação,
foram adicionados 350 µl de meio SOC (triptona 2%, extrato de levedura
0,5% NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgSO4 10 mM, glicose 20 mM) e
realizada incubação por 90 min a 37 °C, 190 rpm. Posteriormente,
alíquotas de 100 e 200 µl foram semeadas em placas com meio Luria-
Bertani (LB) sólido (triptona 1%, extrato de levedura 1%, NaCl 1%, ágar
1,5%) contendo ampicilina (100 µg/ml), as quais foram incubadas por 18
h a 37 °C. Colônias isoladas foram inoculadas em 5,0 ml de meio LB
(triptona 1%, extrato de levedura 1%, NaCl 1%) contendo ampicilina (100
µg/ml) e incubadas a 37 °C, 190 rpm por 18 h para obtenção do pré-
inóculo. O pré-inóculo foi adicionado a 500 ml de meio LB para formar o
inóculo, que foi incubado a 37 °C, 200 rpm até obtenção de uma leitura
de densidade óptica a 600 nm (DO600nm) de 0,6-0,8. Para iniciar a indução
da expressão da proteína recombinante, a temperatura foi reajustada para
16 °C e foi adicionado isopropil-β-D-tiogalactosídeo (IPTG) para a
concentração final de 1 mM. A fase de expressão durou aproximadamente
20 h. Após este período, a cultura foi centrifugada (5000 g, 10 min, 4 °C),
o sobrenadante foi descartado e o pellet celular congelado.
MATERIAIS E MÉTODOS 65
O pellet celular foi ressuspendido em tampão de lise Tris-HCl 50 mM
pH 7,5 contendo imidazol 10 mM, NaCl 0.5 M e triton X-100 0,5%. A lise
celular para extração de proteína intracelular foi realizada em sonicador,
com 5 ciclos de 1 min (pulsos de 10 seg, 70 mA, ∼16 W) e intervalos de 4
min entre cada ciclo, em banho de gelo. Alternativamente, a extração de
proteína intracelular foi realização por processo de lise enzimática
utilizando “BugBuster Master Mix” (Novagen), que contém nuclease e
lisozima em solução tampão. As células foram ressuspendidas nesta
solução, utilizando 10 ml do reagente para cada 100 ml de meio cultivado
e a mistura foi incubada por 15 min à temperatura ambiente com
agitação. Em ambos os processos utilizando lise mecânica ou enzimática,
a fração solúvel foi recuperada após centrifugação a 10.000 g, 4 °C, 20
min.
Para recuperação da proteína recombinante, a fração solúvel foi
aplicada em coluna Ni-Sepharose pré-equilibrada com o tampão de lise.
Após lavagem com tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 contendo imidazol 20
mM e NaCl 0,5 M para eluição de contaminantes retidos inespecificamente
na coluna, a fração contendo a proteína recombinante foi eluída no
mesmo tampão contendo 0,3 M de imidazol. Em seguida, a fração
purificada foi dialisada em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,5 contendo NaCl
0,145 M por 48 h e em seguida aplicada em coluna Sephadex G-25 (5 ml)
HiTrap Desalting (GE Healthcare), para remoção completa do imidazol,
que atua como inibidor de serino proteases. A fração eluída da
cromatografia em Ni-Sepharose foi submetida à cromatografia líquida de
alta pressão (HPLC) em coluna de fase reversa C8 (Zorbax), eluição com
gradiente de metanol, fluxo de 1ml/min, em cromatógrafo Shimatzu. As
frações obtidas em cada etapa do processo de recuperação do rLopap
expresso em Origami foram analisadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE), conforme item
3.7.3.
MATERIAIS E MÉTODOS 66
3.2 Clonagem e expressão do rLopap na levedura Pichia pastoris
3.2.1 Linhagens e plasmídeos
Os experimentos iniciais de clonagem e expressão de Lopap em
levedura Pichia pastoris foram realizados em colaboração com a Profa.
Dra. Aparecida Sadae Tanaka do Depto. de Bioquímica da UNIFESP e com
o Dr. Cleyson Valença Reis, durante seu Pós-Doutorado em nosso
Laboratório. Como molde foi utilizado o vetor pAE contendo o inserto com
a seqüência codificante da proteína (Reis, 2002).
As linhagens de microorganismos e os plasmídios utilizados
foram: E. coli DH5α: ø80 dlacZ∆M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1,
hsdR17(rk-, mk+) SupE44, relA1, deoR ∆(lac ZYA – arg I) u169; P. pastoris
GS115: his4, Mut+ (Invitrogen).
Os plasmídeos utilizados foram: “pGEM-T Easy Vector Systems”
(Promega), que contém os promotores T7 e SP6 flanqueando a região de
sítios de múltipla clonagem (multiple cloning site - MCS), para a
subclonagem de produtos de PCR (de acordo com o Manual técnico
PROMEGA, 1999); pPIC9K – “Pichia Vector for Multicopy Integration and
Secreted Expression” (Invitrogen), para expressão da proteína
recombinante em levedura na forma solúvel, secretada para o meio
extracelular (de acordo com Manual técnico da Invitrogen n° V175-20).
3.2.2 Síntese de oligonucleotídeos iniciadores para amplificação do DNA
Os oligonucleotídeos iniciadores foram construídos pela IDT
(Integrated DNA Technnologies). O oligonucleotídeo sense (PRIPIC9F) foi
desenhado a partir da seqüência N-terminal da proteína (Figura 12). A
este oligonucleotídeo foi acrescentado um sítio de restrição Sna BI para
subseqüente clonagem unidirecional. O oligonucletídeo anti-sense utilizado
foi o PRset rev. Estes oligonucleotídeos foram diluídos em tampão TE para
uma concentração final de 10 pmol/µl (100 µM).
MATERIAIS E MÉTODOS 67
Figura 12 - Oligonucleotídeo PRIPIC9F. Oligonucleotídeo (primer) desenhado a partir da seqüência N-terminal do Lopap, com sítio de restrição Sna BI para permitir posterior clonagem no vetor pPIC 9K.
Sense Primer (PRIPIC9F)
TAC GTA GAC GTA GTT ATA GAT GGT GCG TGT CCT GAC Sna BI D V V I D G A C P D
MATERIAIS E MÉTODOS 68
3.2.3 Reação de PCR e ligação do DNA ao “pGEM-T easy”
O inserto do cDNA que codifica para o Lopap, contido no pAE, foi
amplificado por PCR para ligação no plasmídeo “pGEM-T easy”. As reações
de PCR foram preparadas para um volume final de 50 µl, contendo 1 µl de
dNTPs 10 mM, 5 µl do tampão para Taq DNA Polimerase 10x (Pharmacia),
1,5 µl de MgCL2 50 mM, 0,5 µl de Taq DNA polimerase 2,5 U, 2 µl do
oligonucleotídio PRIPIC9F, 6 µl do oligonucleotídio PRset rev e 1 µl do DNA
plasmidial (pAE) como molde. As condições da PCR foram: desnaturação
inicial a 94 °C por 3 min, 30 ciclos de desnaturação (94 °C, 45 seg),
anelamento (50 °C, 25 seg), extensão (72 °C, 4 min) e uma extensão
final a 72 °C por 15 min, seguida de resfriamento a 4 °C.
Em seguida, a amostra foi analisada por eletroforese em gel de
agarose 1% (corrida a 100 V por 2 h). Após migração eletroforética, a
banda correspondente ao produto de amplificação esperado (≈ 600 pb) foi
recortada do gel e o DNA foi extraído com o kit “Concert Gel Extraction”
(Life Technologies) e eluído em 50 µl de H2O.
A ligação do fragmento de DNA amplificado ao “pGEM-T easy” foi
realizada em um volume final de 20 µl, contendo 12 µl do produto de PCR,
2 µl do plasmídeo, 4 µl do tampão “T4 DNA ligase 5x” e 2 µl da “T4 DNA
Ligase” 1 U/µl (Life Technologies) a 16 °C por 18 h. A relação
vetor:inserto foi calculada segundo a fórmula descrita no manual da
Promega (“Promega Protocols and Applications Guide”, 1999):
ng de vetor x Kb do inserto x relação molar inserto/vetor = ng de inserto
Kb do vetor
MATERIAIS E MÉTODOS 69
3.2.4 Transformação em bactéria
Após a reação de ligação descrita no item anterior o vetor “pGEM-T
easy” foi utilizado para o processo de transformação em bactéria
competente DH5α, preparada de acordo com o método de Inoue et al.
(1990). Para transformação, foram adicionados 5 µl da solução de ligação
vetor-inserto a uma alíquota de 100 µl da bactéria competente,
previamente descongelada em banho de gelo por 15 min. A bactéria foi
então incubada por no mínimo 30 min em banho de gelo, em seguida 2
min em banho seco a 42 °C, e novamente em banho de gelo por mais 5
min. Após a transformação, foram adicionados 300 µl de meio
LB/ampicilina (100 µg/ml) e realizada incubação por 1 h a 37 °C, 220
rpm. Posteriormente, alíquotas de 50, 100 e 200 µl foram semeadas em
placas com meio LB-Kan, as quais foram incubadas por 18 h a 37 °C. Uma
colônia isolada foi inoculada em 5 ml de meio LB/ampicilina (100 µg/ml),
e incubada por 18 h a 37 °C. Os plasmídios foram purificados utilizando
kit “Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System” (Promega).
3.2.5 Digestão do DNA plasmidial com enzimas de restrição e ligação ao
pPIC9K
3.2.5.1 Digestão com Sna BI
Para a primeira reação de digestão, foi utilizada uma alíquota de 20
µl do DNA plasmidial extraído na etapa anterior. A esta solução, foram
adicionados 5 µl de tampão B 10x (Promega), 0,5 µl de albumina de soro
bovino e 20 µl da enzima Sna BI. A reação ocorreu em um volume de 50
µl, com incubação por 18 h a 37 °C.
MATERIAIS E MÉTODOS 70
3.2.5.2 Digestão com Eco RI
O material obtido após a primeira digestão (50 µl) foi incubado com
7,5 µl de tampão H 10x (Promega), 0,75 µl de albumina de soro bovino e
15 µl da enzima Eco RI. A mistura de reação, com volume final de 75 µl,
foi incubada por 1 h a 37 °C. Em seguida, o material foi submetido a
eletroforese em gel de agarose 1% (corrida a 80 V por 2 h). Após
migração eletroforética, a banda correspondente ao fragmento de DNA
com tamanho esperado foi recortada e o DNA foi extraído do gel com o kit
“Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System” (Promega).
3.2.5.3 Ligação do DNA ao pPIC9K
A reação de ligação foi realizada em um volume final de 20 µl,
contendo 5 µl do inserto, 5 µl do vetor pPIC9K (Invitrogen), 4 µl do
tampão T4 DNA ligase 5x e 1 µl de T4 DNA Ligase 1U/µl (Life
Technologies), com incubação por 18 h a 16 °C. O produto resultante da
ligação do inserto do Lopap no vetor (pPIC9k-Lopap) foi utilizado para
transformação da bactéria DH5α. Este processo foi realizado por choque
térmico, conforme item 3.2.4. Após a transformação, foram adicionados
300 µl de meio LB/ampicilina (100 µg/ml) e realizada incubação por 1 h a
37 °C, 220 rpm. Alíquotas de 50, 100 e 200 µl foram semeadas em meio
LB-ágar/ampiclina, e incubadas por 18 h a 37 °C.
Das colônias formadas, 15 foram selecionadas, sendo coletadas e
inoculadas individualmente em 5 ml de meio LB/ampicilina (100 µg/ml) e
incubadas por 18 h a 37 °C, sob agitação de 220 rpm/min. Os plasmídios
foram purificados de cada clone utilizando “kit mini-prep Wizard plus SV
(Promega)”, eluídos com 50 µl de água e, em seguida, congelados a -20
°C. Os plasmídios obtidos foram selecionados através da análise por
eletroforese em gel de agarose 1% (corrida a 80 V por 2 h). Os clones que
apresentaram bandas de tamanhos diferentes do esperado foram
descartados.
MATERIAIS E MÉTODOS 71
3.2.6 Seqüenciamento do DNA
Os clones obtidos foram seqüenciados para verificar se o inserto se
ligou na forma e posição adequadas. O seqüenciamento do DNA foi
realizado pelo método de terminação de cadeia por dideoxinucleotídeo,
adaptado para o seqüenciador automático ABI 377 (Perkin-Elmer). Foram
preparados 400 ng do DNA plasmidial preparado com o Kit “In Concert
Plasmid DNA Mini-prep System” (Life Technologies) que foram usados
como molde na reação de seqüenciamento. A Taq DNA polimerase, dNTPs,
ddNTPs ABI Prism Big Dye Terminator foram do “Ready Reaction Kit”
(Perkin-Elmer). Foram usados nas reações os oligonucleotídeos 5’ AOX1
promoter fragment: bases 1-948 e 3’ AOX1 fragment: bases 6122-6879
(Invitrogen).
Os produtos de amplificação foram separados em gel de
seqüenciamento de DNA de 36 cm de comprimento (acrilamida:bis-
acrilamida 4,25% na proporção de 19:1, em 1xTBE e uréia 7 M), montado
segundo as especificações do fabricante do sistema ABI PRISM (Perkin
Elmer). O sistema de detecção desse aparelho consiste em uma fonte de
laser e um detector de fluorescência, localizados na parte inferior do gel
de seqüenciamento. Cada dNTP emite uma fluorescência específica que é
captada pelo detector, e este por sua vez envia a informação a um
computador que automaticamente registra a posição do nucleotídeo no
eletroferograma. A corrida foi realizada por 7 h.
3.2.7 Transformação da levedura P. pastoris
Antes da transformação, o plasmídeo pPIC9K-Lopap foi submetido à
linearização para permitir sua inserção no genoma de P. pastoris. Para
reação de linearização foi utilizado 42 µl (5 µg) de DNA plasmidial, 3 µl da
enzima Sal I (Invitrogen) e 5 µl de tampão REact 10. A mistura de reação
foi incubada por 4 h a 37 °C, sendo em seguida submetida a processo de
MATERIAIS E MÉTODOS 72
purificação fenol:clorofórmio de acordo com o método descrito por Beuken
et al. (1998).
A levedura P. pastoris foi transformada com o plasmídio linearizado
por processo de eletroporação. Foi utilizada uma alíquota 80 µl de células
competentes e 10 µl do DNA linearizado, transferindo-se a mistura para
uma cubeta de 0,2 cm gelada. Em seguida, o material foi mantido em
banho de gelo por 5 min e submetido à eletroporação (25 µF, 400 Ω e 1,5
KV). Imediatamente após a eletroporação, foi adicionado sorbitol 1 M
gelado na cubeta e o conteúdo foi transferido para tubo estéril. Alíquotas
de 200 e 400 µl desse material foram semeadas em placas com meio
mínimo de dextrose (MD) (yeast nitrogen base - YNB 1,34%, biotina 4 x
10-5%, dextrose 1%, ágar 1,5%) e as placas foram incubadas a 30 °C por
48 h.
3.2.8 Cultivo celular e avaliação da expressão do rLopap
Dentre colônias formadas em placa, que corresponderam aos clones
transformados, 5 colônias isoladas foram escolhidas e inoculadas
individualmente em 2,5 ml de meio complexo de glicerol (BMGY - buffered
glycerol-complex medium: extrato de levedura 1%, peptona 2%, fosfato
de potássio 100 mM pH 6,0, YNB 1,34%, biotina 4 x 10-5%, glicerol 1%) e
incubadas a 30 °C por 18 h, sob agitação a 250 rpm, para crescimento do
pré-inóculo até obtenção de uma DO600nm entre 2 e 6.
O pré-inóculo foi centrifugado por 5 min a 1500 g, 25 °C. Para
preparo do inóculo, o sobrenadante foi descartado e o pellet celular foi
ressuspendido em meio complexo de metanol (BMMY - buffered methanol-
complex medium: extrato de levedura 1%, peptona 2%, fosfato de
potássio 100 mM pH 6,0, YNB 1,34%, biotina 4 x 10-5%, metanol 0,5%)
para uma DO600nm final de 1,0. O inóculo foi incubado a 30 °C, sob
agitação a 250 rpm, realizando-se a indução de expressão protéica pela
manutenção de 0,5% de metanol no meio. Para manter a concentração
necessária de metanol foram adicionados, após um período de 24 h de
MATERIAIS E MÉTODOS 73
incubação, 30 µl de metanol, e após 48 e 72 h, 50 µl de metanol. Após 96
h de incubação, o material foi resfriado em banho de gelo, e
posteriormente centrifugado por 5 min, a 1500 g, 4 °C. O sobrenadante
foi coletado e analisado quanto à expressão da proteína de interesse.
Para avaliar a expressão do rLopap, amostras de 20 µl de cada uma
das 5 culturas foram submetidas à análise por SDS-PAGE (item 3.7.3),
após concentrar 40 vezes o volume em membrana com corte de 5k,
utilizando dispositivo centricon (Millipore). A atividade pro coagulante da
proteína obtida foi avaliada em cada uma das 5 culturas através de
ensaios de ativação da protrombina utilizando substrato cromogênico S-
2238 (item 3.8.1). Nos testes de atividade foram utilizados 60 µl de
amostra de cada cultura, 60 µl do meio de cultura sem inóculo para o
branco, e, como controle, 60 µl de cultura transformada com vetor
contendo o inserto de uma proteína recombinante distinta, sem atividade
sobre a coagulação.
3.3 Escalonamento do processo de produção do rLopap
3.3.1 Expressão da proteína recombinante utilizando meio de cultivo
complexo
O clone da levedura para o qual foi observada maior atividade
ativadora de protrombina foi selecionado para a continuidade dos ensaios
de expressão do rLopap em maior escala. A partir da placa mestre, o
clone foi inoculado em 100 ml de meio BMGY e incubado por
aproximadamente 24 h a 30 °C, 250 rpm, para crescimento do pré-
inóculo até uma DO600nm de 2-6. Uma alíquota da cultura em meio BMGY
foi retirada e diluída 1:2 em sorbitol 1 M. A suspensão do clone foi dividida
em frações de 50 µL e armazenada em freezer a -80 °C para servir de
inóculo nos cultivos posteriores. A concentração de glicerol no meio foi
monitorada através de kit enzimático para a detecção de triglicérides,
utilizando glicerol como padrão. A etapa de indução da expressão com
MATERIAIS E MÉTODOS 74
metanol foi iniciada no momento em que todo o glicerol do meio foi
consumido.
O inóculo foi preparado conforme descrito no item 3.2.8, em um
volume de 500 ml de meio BMMY. Para indução contínua da expressão da
proteína recombinante a cada 24 h foi acrescido de 1 ml de metanol
100%. O crescimento celular foi monitorado pela leitura da DO600nm
realizando-se diluições com salina, quando necessário. Após um período
de 72 h de indução, o material foi centrifugado a 5000 g por 10 min a 4
°C. Em seguida, o sobrenadante foi filtrado em membrana de nitrato de
celulose com poro de 0,45 µm de diâmetro e foi congelado em alíquotas a
–80 °C para análise posterior.
3.3.2 Otimização da expressão da proteína recombinante utilizando meio
de cultivo mínimo
Uma alíquota-estoque (50 µl) do clone de P. pastoris foi inoculada
em 100 ml meio mínimo de glicerol (BMG - buffered minimal glycerol:
fosfato de potássio 100 mM pH 6,0, YNB 1,34%, biotina 4 x 10-5%,
glicerol 1%), e incubada por 48 h a 30 °C, com agitação de 250 rpm, para
crescimento do pré-inóculo até atingir uma DO600nm entre 20 e 30. Esta
cultura foi utilizada para inocular o meio mínimo de metanol (BMM -
buffered minimal methanol: fosfato de potássio 100 mM pH 6,0, YNB
1,34%, biotina 4 x 10-5%, metanol 0,5%), para a indução da expressão
da proteína recombinante. O inoculo foi preparado por diluição da cultura
em BMG no meio BMM para uma DO600nm final de 1,0. A expressão foi
realizada durante 107 h, a 25 °C, 250 rpm, adicionando-se diariamente
0,5-1,0% de metanol. Após o período de indução da expressão da
proteína recombinante, o material obtido foi centrifugado a 5000 g por 10
min, a 4 °C. O sobrenadante foi filtrado seqüencialmente nas membranas
de 1,2 µm RAW P04700 e 0,22 µm GPWP com pré-filtro AP20 (Millipore),
sendo em seguida aliquotado e congelado em freezer –80 °C para análise
posterior. A expressão foi realizada em diferentes valores de pH: 5,0, 6,0
MATERIAIS E MÉTODOS 75
e 7,0. Para ajustar o pH do meio para 5,0, utilizou-se ácido fosfórico, os
demais pHs foram ajustados no preparo do tampão fosfato de potássio.
3.3.3 Expressão da proteína recombinante em biorreator
A produção do rLopap em biorreator foi realizada de acordo com
protocolo de processo da Invitrogen (“Pichia Fermentation Process
Guidelines - Version B”), com algumas modificações. Foi realizado cultivo
de alta densidade celular em biorreator de 14 L (Biostat MD, B.Braun
Biotech). O ensaio consistiu de duas fases: 1) fase de crescimento celular,
com duas etapas distintas de processo (batelada – batch phase e batelada
alimentada – fed-batch phase) e uma fase de indução da expressão da
proteína recombinante, utilizando-se a técnica de fermentação de
batelada alimentada. Os ensaios foram realizados no Laboratório de
Biotecnologia Industrial – IPT, juntamente com a Profa. Dra. Maria
Filomena Rodrigues e Dra. Rosana Picoli, sendo de nossa responsabilidade
a elaboração do protocolo (com colaboração da Dra. Mickie Takagi do
Laboratório de Fermentações/ Divisão de Produção, Instituto Butantan), o
acompanhamento de todo o processo de fermentação, assim como o
preparo do inóculo e dos meios de cultura e soluções utilizados.
3.3.3.1 Preparo do inóculo
O inóculo foi preparado utilizando três frascos de 1 L do tipo
erlenmeyer, contendo 100 ml de meio BMG. Uma alíquota-estoque de 50
µL da suspensão do clone de P. pastoris foi utilizada para o preparo de
cada inóculo. Os frascos foram incubados em shaker (New Brunswick G-
25) com agitação de 300 rpm, a 30 °C durante 48 h, para atingir uma
concentração celular com DO600nm entre 15 e 30. Alíquotas do meio de
cultivo diluídas em salina na proporção de 1:10 e 1:100, após 24 h e 48 h
de incubação, respectivamente, foram utilizadas para as leituras de DO.
MATERIAIS E MÉTODOS 76
3.3.3.2 Inoculação no reator
O biorreator foi preparado para o recebimento do inóculo da
seguinte forma: foi esterilizado juntamente com o meio definido (FBS -
fermentation basal salts, Tabela 2) e em seguida resfriado até a
temperatura de 30 °C. O pH do meio foi ajustado para 5,0 através da
adição de hidróxido de amônio 14%. Após este procedimento, para
suplementação de sais, foi adicionada a solução de traço de metais (PTM1
- Pichia trace metal, Tabela 3), utilizando-se um volume de 4,35 ml por
litro de meio definido. O sensor de oxigênio foi calibrado antes da
inoculação (eletrodo de oxigênio Mettler-Toledo). O inóculo foi adicionado
no fermentador em volume suficiente para se obter uma DO600nm igual a
1, que correspondeu a um volume inicial do meio de fermentação de
aproximadamente 5 L.
Tabela 2 - Meio definido (Fermentation Basal Salts).
Componentes g/L
sulfato de cálcio 0,93
sulfato de potássio 18,2
sulfato de magnésio 7.H2O 14,9
hidróxido de potássio 4,13
ácido fosfórico 85% 26,7*
glicerol 40,0*
*Esta medida corresponde ao volume (ml/L).
MATERIAIS E MÉTODOS 77
Tabela 3 – Solução de traço de metais (PTM1).
Componentes g/L
sulfato cúprico pentahidratado 6
iodeto de sódio 0,08
sulfato de magnésio monohidratado 3
cloreto de cobalto 0,5
cloreto de zinco 20
ácido bórico 0,02
molibidato de sódio dihidratado 0,2
sulfato ferroso heptahidratado 65
ácido sulfúrico 5*
biotina1 0,2
PTM1 foi esterilizado por filtração e estocado à temperatura ambiente. *Esta medida corresponde ao volume (ml/L). 1A solução de biotina 500x (0,2 g/L) foi preparada separadamente em água e esterilizada por filtração, sendo adicionada no biorreator à parte da solução PTM1.
3.3.3.3 Controle das variáveis
No reator foram mantidas as condições de agitação e aeração
suficientes para manter a porcentagem de oxigênio dissolvido (OD)
sempre superior a 20%. O pH no meio foi mantido sempre numa leitura
igual a 5 (eletrodo de pH Mettler-Toledo), pela adição automática de
hidróxido de amônio 14%, e a temperatura foi mantida a 30ºC durante a
fase de crescimento, e 25 °C durante a fase de indução da expressão da
proteína recombinante.
Durante todo o processo de fermentação, o monitoramento da
concentração de glicerol, quando cabível, foi realizado por HPLC e pelo
controle das variáveis de oxigênio dissolvido. A concentração celular foi
monitorada pela medida da DO600nm de alíquotas retiradas do fermentador,
após centrifugação, descarte do sobrenadante e ressuspensão do pellet
celular em salina ácida (NaCl 150 mM, HCl 100 mM). Amostras (alíquotas
MATERIAIS E MÉTODOS 78
de 30 ml) foram obtidas no final de cada etapa da fermentação e pelo
menos duas vezes por dia. Para dosagem da concentração protéica e da
atividade específica da proteína recombinante, as alíquotas retiradas do
fermentador foram centrifugadas a 5000 g à temperatura ambiente por 10
min (Centrífuga da Sorvall RC 5B) e o sobrenadante congelado a –80 °C
para análise posterior.
3.3.3.4 1ª Etapa: fase de crescimento
• Fase de batelada:
A fase de crescimento em batelada foi realizada para adaptação da
levedura ao meio de cultura de fermentação e crescimento inicial de
biomassa. Esta fase foi mantida até esgotamento do glicerol do meio de
cultura, que correspondeu a um período entre 18 a 24 h. O completo
consumo do glicerol do meio na etapa de batelada foi sinalizado quando o
OD no meio aumentou para próximo de 100%.
• Fase de batelada alimentada:
Após a fase de fermentação em batelada, quando o glicerol foi
esgotado do meio, iniciou-se a fase de fermentação em batelada
alimentada. O objetivo dessa etapa é a obtenção de alta densidade celular
pelo acúmulo de biomassa. Para tanto, foi introduzido no fermentador
uma solução de alimentação contendo glicerol e PTM1 (glicerol 50%
contendo 12 ml de PTM1 e 12 ml de biotina 0,02% por litro) numa vazão
de alimentação de 18,15 ml/h/L de volume inicial de fermentação. Esta
etapa teve duração de aproximadamente 4 h. Durante este período,
observou-se consumo do glicerol que é indicado pelo nível de OD e foi
utilizado um total de aproximadamente 75 ml da solução de alimentação
para cada litro de volume inicial de fermentação. No final dessa etapa a
concentração de biomassa deve estar na faixa de 180 a 200 g/L (massa
úmida), com produção mínima de proteína recombinante.
MATERIAIS E MÉTODOS 79
3.3.3.5 2ª Etapa: fase de indução com metanol
A fase de indução com metanol foi iniciada apenas quando todo o
glicerol do meio foi consumido para que, ao iniciar a alimentação por
metanol, seja promova a indução completa do promotor para a expressão
da proteína recombinante. A ausência do glicerol foi indicada pelo
aumento na porcentagem de OD. Nesta fase, a temperatura foi reduzida e
mantida em 25 °C até o final da expressão, pois o crescimento em
metanol gera muito calor e o controle da temperatura neste estágio é
importante para a preservação da proteína recombinante secretada no
meio. A alimentação com metanol foi introduzida lentamente, para
permitir a adaptação da cultura à presença de metanol no meio.
Posteriormente, a vazão de alimentação foi aumentada progressivamente.
A solução de alimentação consistiu de 100% de metanol contendo 12 ml
de PTM1 e 12 ml de biotina 0,02% por litro, numa vazão inicial de
alimentação de 3,6 ml/h/L de volume inicial de fermentação durante as
primeiras 2-3 h, até a leitura de OD estabilizar e permanecer constante, e
por aproximadamente mais 2 h, quando começou a haver variação de OD
devido ao consumo do metanol. Em seguida, a vazão de alimentação foi
aumentada para 7,3 nas próximas 2 h, e depois para 10,9 ml/h/L de
volume inicial de fermentação, sendo mantida neste fluxo até o final da
fermentação. A duração da fase de indução com metanol foi de
aproximadamente 72 h, sendo utilizado um total de aproximadamente
740 ml da solução de alimentação por litro de volume inicial de
fermentação. A concentração de biomassa no final dessa fase deve estar
entre 350 a 450 g/L de massa úmida, com produção total da proteína
recombinante.
3.3.3.6 Separação do sobrenadante
O cultivo final (aproximadamente 8 litros) foi processado de duas
formas distintas: 2 L foram destinados para processamento através
MATERIAIS E MÉTODOS 80
filtração em membrana de fibra oca; e o restante do material foi
centrifugado (10.000 rpm, 30 min) e o sobrenadante filtrado em
membrana de éster de celulose 0,22 µm (GSWP14250, Millipore) com pré-
filtro em microfibra de vidro (AP1512450, Millipore) e armazenado em
freezer –80 °C, para purificação posterior.
3.4 Processamento do material após expressão em biorreator
3.4.1 Clarificação e concentração em membranas de fibra oca
O processamento de uma fração de 2 L do cultivo de P. pastoris,
obtido após processo de fermentação para produção do rLopap, foi
realizado através de uma etapa de clarificação e uma etapa de
concentração em equipamento Quix Stand, Bomba Watson Marlow modelo
323 e membranas de fibra oca (S6-4106-22, modelo CFP-1-E-4X2MA,
poro de 0,1 µm e área de superfície de 850 cm2, para clarificação; UFP-5-
C-4X2MA, corte nominal de massa molecular (NMWC) de 5 kDa e área de
superfície de 1.400 cm2, para concentração).
Para a clarificação do material, a membrana foi hidratada em água
Milli-Q e lavada com NaOH 100 mM, lavando-se em seguida com água
Milli-Q até a solução filtrada atingir pH igual a 7,0. A clarificação do
material foi realizada em duas etapas (1 L cada). O fluxo utilizado foi de
1,2 L/min. A pressão foi mantida em aproximadamente 10 psig e a força
de arrasto em aproximadamente 4.000 shear, para evitar o rompimento
das células. Durante todo o processo o compartimento de alimentação foi
mantido com agitação moderada para evitar sedimentação. A diluição do
material clarificado foi de no máximo 2 vezes o volume inicial, pela
lavagem da parte retida em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,3. O material
que ficou retido na membrana, o qual correspondeu à massa celular do
cultivo foi descartado.
O material clarificado foi posteriormente concentrado em até 20
vezes seu volume inicial, utilizando fluxo de 0,6 L/min. Durante todo o
MATERIAIS E MÉTODOS 81
processo o compartimento de alimentação foi mantido com agitação
moderada para evitar sedimentação. O material não-retido (ultrafiltrado),
o qual correspondeu à fração menor que 5 kDa foi descartado.
3.4.2 Diálise
Alíquotas do material obtido foram dialisadas, para os diferentes
ensaios, utilizando dispositivos de nanofiltração amicon ultra-15 (Millipore)
com NMWC de 5 kDa, em centrífuga refrigerada, considerando-se um
fator de diluição de 50-100 vezes. Estes dispositivos também foram
utilizados para concentração de amostras e frações cromatográficas,
quando necessário. Alternativamente, foi realizada diálise em membrana
de celulose regenerada com NMWC de 3,5 kDa (Fisher), à temperatura de
15 °C em um volume no mínimo 80 vezes maior que o volume da amostra
a ser dialisada, com duas trocas diárias, durante no mínimo 2 dias. Para
garantir diálise completa da amostra, a presença residual de sais do meio
de fermentação foi monitorada por teste de precipitação com cloreto de
cálcio em microplaca:
• Controle positivo:
10 µl de amostra não dialisada ou tampão fosfato de sódio + 10
µl de cloreto de cálcio 50 mM → precipitação visível
• Controle negativo:
10 µl de tampão Tris-HCl ou água + 10 µl de cloreto de cálcio 50
mM → ausência de precipitação
• Teste:
10 µl de amostra dialisada + 10 µl de cloreto de cálcio 50 mM
MATERIAIS E MÉTODOS 82
3.5 Avaliação da estabilidade do rLopap expresso em Pichia
pastoris
3.5.1 Estabilidade em diferentes temperaturas
A estabilidade da proteína recombinante obtida foi avaliada em
diferentes temperaturas. Foram utilizadas alíquotas do material expresso
em fermentador, após o processamento (clarificação e concentração) em
sistema de fibras ocas e diálise em solução salina (NaCl 0,9%), na
concentração de 373 µg de proteínas/ml. As alíquotas foram mantidas em
diferentes temperaturas (-80, -20, 4, 8, 25 e 37 °C) por 2, 24 e 120 h.
Após esses períodos as alíquotas foram testadas quanto à atividade
ativadora de protrombina (item 3.8.1), utilizando-se para comparação 20
µg de proteínas em cada teste. Também foram testadas amostras
liofilizadas.
3.5.2 Estabilidade em diferentes soluções
Com o objetivo de testar a solubilidade e estabilidade da amostra
em diferentes soluções a serem utilizadas em processos cromatográficos,
e outros ensaios, amostras do material clarificado foram dialisadas contra
diferentes tampões e diferentes concentrações salinas, à temperatura de
15 °C ou ambiente:
- Tris-HCl 20 mM, pH 7,3, com 0, 50, ou 150 mM de NaCl
- Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, com 0, 50, ou 150 mM de NaCl
- Acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, com 50 e 75 mM de NaCl
- Citrato de sódio 20 mM, pH 5,0, com 50 e 75 mM de NaCl
- Fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0, com 150 mM de NaCl
- Fosfato de potássio 50 mM, pH 7,2, com 150 mM de NaCl
- Solução salina (NaCl 0,85%, pH 5,5)
- Solução salina/bicarbonato (pH 7,0)
MATERIAIS E MÉTODOS 83
3.5.3 Estabilidade em diferentes valores de pH
A solubilidade e estabilidade da atividade da proteína recombinante
obtida foram avaliadas em diferentes valores de pH, com exceção do pH
6,0, próximo ao ponto isoelétrico do Lopap. Alíquotas do material
clarificado foram dialisadas nos tampões:
- Acetato de sódio 50 mM pH 5,0, com 50 mM de NaCl
- Tris-HCl 20 mM pH 7,0, com 50 mM de NaCl
- Tris-HCl 20 mM pH 8,0, com 50 mM de NaCl
- Tris-HCl 20 mM pH 9,0, com 50 mM de NaCl
As amostras dialisadas, na concentração de 450 µg de proteínas/ml,
foram incubadas por 24 h à temperatura ambiente. Em seguida, uma
alíquota de cada amostra foi centrifugada por 15 min, 20.000 g, a 20 °C e
depois filtrada em filtro de seringa 0,22 µm, para separação do
precipitado das proteínas solúveis. Medidas de absorbância (A) a 280 e
214 (quantificação de proteínas) e 600 nm (turbidez devido à
precipitação) foram obtidas após a diálise, após o período de incubação e
nas alíquotas após a remoção do precipitado. A fração solúvel das
alíquotas das amostras foi testada quanto à atividade ativadora de
protrombina (conforme item 3.8.1), utilizando-se 12 µg de proteínas para
comparação em cada teste. A fração solúvel e o precipitado de cada
amostra foram analisados por SDS-PAGE, conforme item 3.7.3.
Para testar se a redução de atividade apresentada em determinados
valores de pH foi resultante de uma alteração de conformação molecular
transitória ou permanente, todas as amostras foram re-dialisadas na
solução onde foi observado valor ótimo de pH para a atividade ativadora
de protrombina. As amostras foram novamente incubadas, centrifugadas,
filtradas e testadas quanto à atividade ativadora de protrombina, nas
mesmas condições descritas anteriormente. A fração solúvel das alíquotas
MATERIAIS E MÉTODOS 84
das amostras obtida após a primeira diálise foi testada novamente, para
comparação com as amostras re-dialisadas.
A presença de polipropilenoglicol (PPG), adicionado como
antiespumante no meio de fermentação, causa turbidez na amostra à
temperatura ambiente, que pode se confundir com a real precipitação de
proteínas. Portanto, a precipitação de proteínas foi confirmada através de
dois testes:
1) Reação colorimétrica (reagente de Bradford):
Gotas do reagente foram adicionadas ao pellet (material
precipitado, sedimentado ou obtido por centrifugação). A
visualização de coloração azul foi indicativa da presença de
proteínas.
2) Solubilização dependente de temperatura:
A solução com turbidez foi imersa em banho de gelo, para
solubilização do antiespumante com o resfriamento. A
visualização de solução translúcida foi indicativa da ausência de
precipitação protéica. Para as leituras de absorbância, 200 µl de
amostra foram pipetados em microplaca, e esta foi previamente
incubada por 5 min em refrigerador (≈ 8 °C) e 1 min à
temperatura ambiente.
3.6 Estabelecimento do processo de purificação do rLopap
expresso em Pichia pastoris
3.6.1 Cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose
A proteína recombinante obtida após processo de cultivo e
expressão em shaker foi purificada em coluna de afinidade Benzamidina-
Sepharose 4 Fast Flow, conforme instruções do fabricante (Amersham
Biosciences). A cromatografia de afinidade foi testada como primeira
MATERIAIS E MÉTODOS 85
etapa de purificação do rLopap, utilizando-se uma seringa de 5 ml
contendo 4 ml da resina, conectada a uma bomba peristáltica (Pharmacia)
com fluxo de 1 ml/min. O pH e a condutividade da amostra (sobrenadante
microfiltrado proveniente do cultivo) foram ajustados para pH 7,5 e 88
mS/cm de condutividade antes de ser aplicada à coluna. Como tampão de
equilíbrio foi utilizado Tris-HCl 50 mM, 0,5 M de NaCl, pH 7,5. A eluição foi
realizada com 50 mM de glicina pH 3,0, sendo coletadas frações de 1,0 ml
em 100 µl de Tris-HCl 1M pH 9,0. As frações obtidas (fração 1- não-retido
na coluna e fração 2- retido na coluna de afinidade) foram analisadas
quanto à atividade enzimática (atividade ativadora de protrombina,
conforme item 3.8.1), perfil eletroforético pela análise em SDS-PAGE
(conforme item 3.7.3) e imunodetecção, utilizando-se anticorpo anti-
rLopap, conforme descrito no item 3.7.4.
3.6.2 Screening em colunas de troca iônica e interação hidrofóbica
Para padronização e otimização do processo de purificação, foram
testadas colunas de troca catiônica e aniônica do kit “HiTrap IEX Selection
Kit” e de interação hidrofóbica do kit “HiTrap HIC Selection Kit” de 1 ml
cada, conforme manual do fabricante (GE Healthcare). Estas, assim como
as demais corridas cromatográficas descritas posteriormente, foram
realizadas em sistema FPLC, utilizando cromatógrafo automático Äcta
Purifier (GE Healthcare).
3.6.3 Cromatografia de troca aniônica em Q-Sepharose
O material obtido no processo de fermentação, após clarificação e
diálise, foi submetido à cromatografia em coluna HiPrep 16/10 (20 ml) Q-
Sepharose Fast Flow (QFF) (GE Healthcare) como primeira etapa de
purificação. Como tampão de equilíbrio foi utilizado Tris-HCl 20 mM pH
7,3, com 150 mM NaCl. O volume de amostra aplicado correspondeu a 1
volume de coluna (VC), coletando-se frações de 10 ml, com fluxo de 5
MATERIAIS E MÉTODOS 86
ml/min, no tampão de equilíbrio (5 VC). A eluição foi realizada com
gradiente não-linear de 1 M de NaCl no tampão de equilíbrio (5 VC).
3.6.4 Cromatografia de gel filtração
A fração ativa obtida da cromatografia em QFF foi aplicada à
cromatografia de gel filtração em coluna Superose 12 10/300 (24 ml) GL
(GE Healthcare), como segunda etapa de purificação. Foram aplicados 0,5
ml (0,20 mg) de amostra, coletando-se frações de 0,5 ml com gradiente
isocrático em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,3, com 150 mM NaCl (tampão
de equilíbrio), com fluxo de 0,5 ml/min.
3.7 Ensaios bioquímicos
3.7.1 Dosagem de proteínas
O conteúdo protéico das amostras obtidas ou utilizadas nos
diferentes ensaios foi estimado pelo método de Bradford (Bradford, 1976),
utilizando reagente de cor da Bio-Rad. Os ensaios foram realizados de
acordo com instruções do fabricante, utilizando albumina de soro bovino -
BSA (Sigma) como padrão.
3.7.2 Precipitação de proteínas
Devido à baixa resolução obtida na análise eletroforética de
proteínas de amostras provenientes de cultura de Pichia pastoris,
provavelmente devido a um alto conteúdo lipídico, estas amostras foram
previamente submetidas a precipitação metanol/clorofórmio.
Foram adicionados à amostra, nesta ordem: 4 volumes de metanol,
1 volume de clorofórmio e 3 volumes de água, homogeneizando-se em
vortex após a adição de cada solvente. Em seguida a mistura foi
centrifugada por 5 min a 4000 g, formando 3 fases distintas. A fase
MATERIAIS E MÉTODOS 87
superior do sobrenadante foi descartada. Foram adicionados 4 volumes de
metanol, homogeneizando-se em vórtex e a amostra foi centrifugada
novamente por 5 min a 4000 g. O sobrenadante foi descartado e a
amostra sedimentada foi secada com jato de nitrogênio gasoso.
3.7.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
As amostras obtidas nas várias etapas de produção do rLopap foram
analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato
de sódio (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970). Foram utilizados géis de
espessura de 1,0 mm com 5% de acrilamida para empilhamento e 12,5 ou
15% para separação. As amostras foram diluídas 1:2 no tampão de
aplicação (Tris-HCl 125 mM pH 6,8, SDS 140 mM, glicerol 20%, azul de
bromofenol 0,03 mM, contendo β-mercaptoetanol 0,1 M para redução) e
aquecidas a 100 °C por 5 min. As corridas eletroforéticas foram realizadas
sob corrente elétrica de 17-20 mA. Os géis foram corados por Coomassie
Brilliant Blue R-250 (azul de Coomassie) a 0,25% em metanol 50% por 18
h e descorado com ácido acético 7,5% por 3 h à temperatura ambiente.
Como marcadores de massa molecular foi utilizado kit da GE Healthcare
que contém padrões de baixo peso (LMWM): fosforilase B (94 kDa);
albumina bovina (67 kDa); ovoalbumina (43 kDa); anidrase carbônica (30
kDa); inibidor de tripsina de soja (SBTI – 20 kDa); e lactoalbumina (14
kDa).
3.7.4 Imunobloting
Os ensaios de imunobloting (western blot) foram realizados a partir
de géis de SDS-PAGE, conforme Towbin et al. (1979) Foram utilizados
como anticorpo primário soro anti-Lopap (1:250) obtido em coelhos,
anticorpo secundário anti-IgG de coelho, conjugado à fosfatase alcalina
(1:7500) e solução reveladora “Western Blue Stabilized Substrate for
Alkaline Phosphatase” (Promega).
MATERIAIS E MÉTODOS 88
3.8 Avaliação da atividade procoagulante do rLopap in vitro
3.8.1 Atividade ativadora de protrombina
A capacidade do rLopap em ativar a protrombina foi avaliada
indiretamente através do ensaio de formação de trombina a partir da
protrombina usando o substrato cromogênico S-2238 (Chromogenix), de
acordo com Reis et al. (2001b). A atividade foi avaliada após pré-
incubação durante 20 min a 37 °C com protrombina (90 pM, Calbiochem),
na presença de 5 mM de CaCl2 para volume final de 200 µl em tampão
Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5. A hidrólise de S-2238 40 µM
(geração de p-nitroanilina) pela trombina formada a partir do Lopap foi
acompanhada espectrofotometricamente a 405 nm durante 20 min a 37
°C. Para controles negativos, foram aplicadas as mesmas quantidades dos
reagentes, omitindo-se a amostra, e as mesmas quantidades dos
reagentes e amostras, omitindo-se a protrombina. Uma unidade de
atividade enzimática (U) foi definida arbitrariamente como a variação em
miliunidades de absorbância a 405 nm por min (mAU/min), nas
condições do teste descritas acima.
3.8.2 Atividade procoagulante sobre plasma humano
A atividade procoagulante da proteína recombinante obtida após
purificação por cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose foi
avaliada sobre o plasma humano normal através de ensaio do tempo de
recalcificação de plasma citratado (citrato de sódio 3,8%, 1:10). A
amostra foi diluída em 0,2 ml de solução salina com 0,1 ml de CaCl2 25
mM. Após pré-incubação (1 min, 37 °C) foi adicionado 0,1 ml de plasma e
o tempo decorrido até a coagulação foi medido. O tempo de coagulação
do plasma na ausência de amostras do rLopap foi utilizado como controle.
MATERIAIS E MÉTODOS 89
3.9 Avaliação da atividade antiapoptótica do rLopap
3.9.1 Cultivo de células endoteliais de cordão umbilical humano
Este ensaio foi realizado com a colaboração da Dra. Carla Simone
Seibert, Pós-Doutoranda em nosso laboratório, para avaliar o efeito
citoprotetor do rLopap obtido através do sistema de expressão em Pichia
pastoris. Células endoteliais de veia de cordão umbilical humano (HUVECs
- human umbilical vein endothelial cells) obtidas de acordo com Jaffe et al.
(1973) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Cultilab) suplementado com
soro fetal bovino (SFB) 10%, antibiótico 1%, L-glutamina 2 mM, heparina
45 µg/ml, mercaptoetanol 50 µM, piruvato de sódio 1 mM, fator de
crescimento 25 µg/ml (Sigma). As células foram mantidas a 37 °C em
estufa com 5% de CO2 até ficarem confluentes na garrafa, foram
desprendidas utilizando solução de tripsina 0,4%/ EDTA 0,2% (Cultilab) e
adicionadas em placas de 96 poços (previamente gelatinizada) na
concentração de 15x103 células/poço para a realização do ensaio.
As células foram mantidas por 24 h a 37ºC em estufa com 5% de
CO2 para a adesão na placa e após este período foram incubadas por 48 h
com rLopap (produzido em shaker, purificado por cromatografia de
afinidade em Benzamidina-Sepharose) na concentração de 10 µg/ml
diluído em meio RPMI suplementado com SFB 1%, que é uma condição
proapoptótica. Como controle positivo, as células foram cultivadas em
meio RPMI suplementado com SFB 10%. Como controle negativo as
células foram cultivadas em meio RPMI suplementado com SBF 1% na
ausência do rLopap.
3.9.2 Cultivo de células endoteliais de timo murino
Este ensaio foi realizado em colaboração com a Dra. Miryam Paola
Alvarez Flores, Pós-Doutoranda em nosso laboratório, para avaliar a
atividade antiapoptótica das amostras de rLopap obtidas através do
MATERIAIS E MÉTODOS 90
sistema de expressão em P. pastoris. Foram utilizadas células endoteliais
de timo murino, linhagem tEND, na concentração de 7x103 células/poço
em placa de 96 poços com 100 µl de meio RPMI 1640, suplementado com
SFB 1%, antibiótico (penicilina 100 IU / estreptomicina 100 µg/ml) e L-
glutamina 2 mM. As células foram mantidas em estufa a 37 °C em
atmosfera 5% de CO2. Após incubação overnight, as células foram pré-
estimuladas com fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) durante 1 h, para
indução de apoptose. Foram utilizados 5 µl de TNF-α (1 µg/ml) para 95 µl
de meio RPMI contendo 0% ou 1% de SFB. Como controle, células não
estimuladas com TNF foram incubadas paralelamente com 0%, 1% ou
10% de SFB em meio RPMI. Após o tempo de incubação, o meio foi
retirado, e os poços lavados com tampão fosfato-salina (PBS) sem cálcio,
e as células foram tratadas por 48 h com frações do rLopap purificado
após primeira etapa cromatográfica de troca iônica em QFF (rLopap 1: 1
µg/ml) e após segunda etapa cromatográfica de troca iônica em Superose
12 (rLopap 2: 0,3 µg/ml), na presença de 0% ou 1% de SFB.
3.9.3 Teste de viabilidade celular pelo método do MTT
O teste de viabilidade celular foi realizado através do método
colorimétrico do MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de
tetrazolina), sal de monotetrazolium que é reduzido a formazan por
mitocôndrias ativas em células vivas. O MTT se incorpora nas células
viáveis, formando cristais de formazan, os quais, por sua vez, são
dissolvidos pela adição de dimetilsulfóxido (DMSO) e colorimetricamente
detectados pela leitura A 550 nm (Mosmann, 1983).
Após o tratamento das células, o sobrenadante foi removido e as
células aderidas na placa foram lavadas com PBS. Em seguida, foram
adicionados 100 µl de solução de MTT 0,5 mg/ml (Sigma) em cada poço.
A placa foi incubada em estufa a 37 °C com 5% de CO2 por 3 h. Em
seguida, o sobrenadante foi removido e foram adicionados 100 µl de
DMSO. Para o cálculo da viabilidade celular foi considerado como 100% de
MATERIAIS E MÉTODOS 91
viabilidade a leitura de células incubadas com SFB 10%, na ausência de
agentes estimulantes (TNF ou rLopap). Os resultados foram analisados
estatisticamente pela análise de variância (ANOVA), com intervalos de
confiança de 95%, seguido pelo teste de Bonferroni.
3.10 Avaliação da ação do rLopap in vivo como agente hemostático
sistêmico
Este experimento foi realizado em colaboração com a farmacêutica
Luana Wlian, mestranda em nosso Laboratório, e com o Prof. Dr.
Francisco Humberto Maffei e a Dra. Sonia de Andrade Chudzinski, do
Grupo de Pesquisa em Trombose e Hemostasia, Instituto de Ensino e
Pesquisa – Hospital Sírio Libanês (IEP-HSL). Através destes ensaios foi
avaliada a capacidade procoagulante do rLopap in vivo e sua efetividade
como antídoto para sangramento induzido com heparina de baixo peso
molecular (enoxaparina). Foram utilizados coelhos Nova Zelândia, machos
de 3,8–4,2 kg, randomizados em três grupos experimentais contendo 5
animais em cada (controle negativo = tratado apenas com salina; controle
positivo = tratado com protamina; teste = tratado com rLopap). Após
anestesia com ketamina 115 mg/kg e xilazina 11,5 mg/kg, os animais
foram depilados na região pélvica e toráxica, e tiveram expostas a artéria
femoral esquerda para monitoramento da pressão arterial, a veia femoral
direita para administração das drogas e controle da volemia, e a veia
jugular externa direita para coleta de sangue, conectada a um cateter. Os
coelhos foram anticoagulados com enoxaparina (Aventis, 20 mg/kg), e
após 10 min foram tratados o rLopap (fração ativa recuperada da
cromatografia em Superose 12, 1 µg/kg), com protamina (dosagem de
1:1 em relação à enoxaparina) ou apenas com o veículo (salina) no grupo
controle. Foram realizadas coletas de amostras de sangue (2 ml) 10 min
antes da adiminstração de heparina e nos tempos 0, 5, 10, 15, 17, 20, 30,
40, 60 e 90 min após administração de heparina, para dosagem do tempo
de tromboplastina parcial ativada (TTPa) e dos níveis de fibrinogênio. O
MATERIAIS E MÉTODOS 92
plasma foi obtido após centrifugação das amostras de sangue a 2500 g,
10 min, 25 °C. O TTPa e os níveis de fibrinogênio foram medidos nos
plasmas obtidos com kit comercial (Dade Bearing) em coagulômetro. O
tempo de sangramento foi medido alternadamente nas orelhas esquerda e
direita de cada animal, após incisão de 5 mm, nos seguintes tempos: 0, 5,
10, 15, 20, 30, 40, 60 e 90 min.
3.11 Mapeamento peptídico do Lopap
Tendo como base os domínios conservados (motifs) característicos
de lipocalinas presentes na seqüência primária do Lopap (Reis et al.,
2006), foram desenhados quatro peptídeos: P1 e P3, com 20 resíduos de
aminoácidos; P2, com 19 resíduos e P4, com 11 resíduos. P1 e P3 estão
relacionados com os motifs 1 e 3, respectivamente, enquanto P2 e P4
estão relacionados ao motif 2. Os peptídeos foram sintetizados pela
ORPEGEN Pharma (Alemanha), e analisados quanto à massa molecular
por espectrometria de massa MALDI-MS e quanto ao grau de pureza por
HPLC. Os testes in vivo e in vitro com estes peptídeos foram realizados em
colaboração com a Janaina de Souza Ventura, Doutoranda em nosso
laboratório, e com a Profa. Dra. Consuelo Junqueira Rodrigues, do
Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina - Universidade de São
Paulo.
3.11.1 Ensaios de atividade procoagulante e antiapoptótica de peptídeos
derivados do Lopap
A capacidade dos peptídeos sintéticos derivados do Lopap (P1, P2,
P3 e P4) de ativar a protrombina foi avaliada através do ensaio de geração
de trombina, utilizando o substrato cromogênico S-2238, conforme item
3.8.1. A atividade procoagulante destes peptídeos em plasma humano foi
avaliada de acordo com o item 3.8.2.
MATERIAIS E MÉTODOS 93
A atividade antiapoptótica dos peptídeos foi avaliada em cultura de
HUVECs conforme descrito no item 3.9.1. As células foram tratadas com
cada peptídeo na concentração de 5 µg/ml e a viabilidade celular foi
avaliada após 72 h, pelo teste do MTT (item 3.9.3). Os peptídeos que
apresentaram atividade antiapoptótica foram testados após 120 h de
incubação com diferentes concentrações, para obtenção de uma curva
dose-resposta.
3.11.2 Avaliação do efeito de inibidores de serino protease sobre a
atividade de peptídeo citoprotetor derivado do Lopap
Dentre os peptídeos derivados do Lopap, o peptídeo citoprotetor
identificado de maior tamanho, foi utilizado neste ensaio. O peptídeo na
concentração de 0,1 mg/ml em solução salina foi incubado por 15 min a
37 °C com 5 mM de PMSF, que é um inibidor de serino proteases que
reage especificamente com o resíduo ativo de serina da molécula. Para
controle positivo da atividade antiapoptótica, o peptídeo foi incubado na
ausência do inibidor. Para controle negativo, apenas o PMSF foi incubado
na ausência do peptídeo. Após incubação, a solução do peptídeo tratado
com o inibidor, assim como os controles, foram aplicados em coluna
“desalting MicroSpin” G-25 (GE Healthcare) para remoção do PMSF e as
amostras recuperadas foram liofilizadas para concentração do volume.
A atividade antiapoptótica do peptídeo (0,3 µg/ml) foi avaliada em
culturas de HUVECs (conforme item 3.9) após 120 h. O efeito da
aprotinina, que também é um inibidor de serino protease, foi avaliado
através da adição de concentração não tóxica (3 µg/ml) diretamente no
meio de cultura, juntamente com o peptídeo.
3.11.3 Análises estruturais
O modelo da estrutura tridimensional do Lopap com a predição de
seu sítio catalítico foi previamente obtido por Reis et al. (2006). Este
MATERIAIS E MÉTODOS 94
modelo foi utilizado para analisar a co-localização das seqüências
peptídicas identificadas com envolvimento na ação celular do Lopap,
através do programa RasMol, versão 2.5 (Sayle e Milner-White, 1995).
Partindo da seqüência compreendida pelos peptídeos citoprotetores
derivados do Lopap, foi realizada uma busca por domínios conservados
similares em bancos de dados de proteínas através do “Motif Search” –
“Search Motif Library” (Kyoto University Bioinformatics Center, 2009).
Foram utilizados como parâmetros de busca os índices de corte padrão e a
inclusão de todos os bancos de dados disponíveis. Dos resultados obtidos,
foram excluídas todas as seqüências que não apresentavam correlação de
seqüência com a região comum (seqüência coincidente) dos peptídeos
citoprotetores.
Outra estatégia utilizada para busca de regiões conservadas em
outras proteínas que apresentam similaridade com a região de seqüência
do Lopap relativa aos peptídeos citoprotetores foi a busca por domínios
conservados utilizando o “Conserved Domain Architecture Retrieval Tool”
(CDART – Geer et al., 2002) como ferramenta de busca no NCBI e a
seqüência completa do Lopap (AAW88441). Apenas as seqüências que
apresentaram alinhamento na região correspondente aos peptídeos
citoprotetores do Lopap foram consideradas. A seqüência comum aos
peptídeos ativos derivados do Lopap também foi submetida à busca direta
no NCBI utilizando blastp (Altschul et al., 1990).
A similaridade estrutural entre o Lopap e outras lipocalinas que
também apresentam atividade antiapoptótica foi analisada através de
ferramentas de bioinformática, com a colaboração do Dr. Oscar H.P.
Ramos. A localização e alinhamento da seqüência dos peptídeos ativos no
modelo de estrutura terciária do Lopap, com seqüências relacionadas
presentes na purpurina e na prostaglandina D sintase foram realizados
com o programa Pymol (DeLano, 2002). Os modelos da purpurina
(P08938) e da prostaglandina D sintase (P41222) foram obtidos pelo
ModBase (Pieper et al., 2009). A acessibilidade relativa ao solvente (ARS)
dos átomos das cadeias principais e laterais de cada resíduo de
MATERIAIS E MÉTODOS 95
aminoácido da seqüência correspondente à região dos peptídeos ativos do
Lopap e seu equivalente em um tripeptídeo composto por Gly-Xaa-Gly,
onde Xaa representa o resíduo de aminoácido, foram calculados utilizando
a ferramenta VADAR (Willard et al., 2003), e comparados com as
respectivas seqüências na purpurina e na prostaglandina D sintase. O
cálculo da ARS de cada resíduo como um todo foi realizado pelo ASA-
VIEW (Ahmad et al., 2004). A polaridade e hidropaticidade de cada um
dos resíduos de aminoácido do Lopap e correspondentes das outras
proteínas analisadas, foram avaliadas, respectivamente, de acordo com o
método de Grantham (1974) e Kyte e Doolittle (1982).
3.12 Avaliação do efeito de um peptídeo sintético derivado do
Lopap sobre a expressão de proteínas de matriz extracelular em
cultura de fibroblastos
Dentre os peptídeos que apresentaram atividade citoprotetora, o
peptídeo de menor tamanho foi escolhido para utilização nos ensaios
seguintes para avaliar o efeito deste peptídeo sobre a síntese de
moléculas de matriz extracelular in vitro. Este ensaio foi realizado com a
colaboração da Profa. Dra. Consuelo Junqueira Rodrigues, da Faculdade de
Medicina – USP. Foram utilizadas culturas primárias de fibroblastos
humanos e a produção de colágeno, fibronectina e tenascina foi analisada
utilizando técnicas de imunocitoquímica.
3.12.1 Cultivo de fibroblastos e tratamento com o peptídeo
Culturas primárias de fibroblastos humanos foram obtidas conforme
previamente descrito por Aldo Filho (2006). Para preparo de subculturas,
a placa com fibroblastos, crescidos em meio Ham–F-12 (Gibco) com 15%
SFB (Cultilab), antibióticos (ampicilina 20 mg/ml, estreptomicina 20
mg/ml, gentamicina 40 mg/ml), foi lavada por 3 vezes com o PBS, e
adicionou-se tripsina-EDTA 1:250 (Cultilab) para descolamento das células
MATERIAIS E MÉTODOS 96
aderidas ao fundo da placa. Em seguida, foi adicionado meio de cultura +
SFB para inativação da tripsina. A suspensão celular foi retirada e
centrifugada por 5 min a 1.800 rpm. Após desprezar o sobrenadante e
ressuspender o sedimento com 1 ml de meio de cultura + SFB, foi
realizada a contagem de células viáveis. A determinação de viabilidade
celular foi realizada pelo teste de exclusão celular pelo corante azul de
tripan (Sigma), solução de 0,5% diluída em PBS 9:1, e somente as
amostras de fibroblastos que continham acima de 90% de células viáveis
foram subcultivadas. Células do 2° subcultivo foram acondicionadas em
placas de 24 poços contendo lâminas circulares de 13 mm de diâmetro, na
concentração de 1,15 x105 células/poço em 1 ml de meio de cultura + SBF
+ antibióticos. Após período de incubação de 48 h (37 °C/CO2 5%) para
aderência das células, o meio foi trocado, adicionando-se os tratamentos
com o peptídeo nas concentrações de 0,35 µg/ml e 5 µg/ml em 0,5 ml de
meio de cultura. Após a adição dos tratamentos, as células foram
incubadas por 96 h a 37 °C com 5% de CO2. O grupo controle consistiu de
cultivos de fibroblastos nas mesmas condições, onde solução salina
(solvente do peptídeo) foi adicionada em lugar do peptídeo.
3.12.2 Imunofluorescência indireta
Após fixação, as lâminas foram removidas e a produção de
moléculas de matriz foi observada por imunofluorescência indireta, com
anticorpos primários (Sigma): monoclonal anti-fibronectina celular, anti-
tenascina humana e HSP47 (procolágeno), e com anticorpo secundário
Alexa Fluor 488 (Molecular Probes), o qual é excitado a um comprimento
de onda de 495 nm, emitindo fluorescência verde com leitura a 519 nm. A
percentagem de produção de cada molécula em relação à área total (µm2)
foi analisada em microscópio de fluorescência e quantificada com o auxílio
de sistema de análise de imagens (Kontron Electronic 300, ZEISS), a
partir de imagens obtidas de 10 campos microscópicos (40x10) por
lâmina.
MATERIAIS E MÉTODOS 97
Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística descritiva e
a comparação entre grupos foi realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (não-
paramétrico) ou ANOVA (paramétrico). As análises foram realizadas com o
auxílio do progama SigmaStat 2.0 (Jandel Scientific). Foi adotado nível de
significância de p<0.05.
3.13 Avaliação do efeito de um peptídeo sintético derivado do
Lopap sobre a síntese de colágeno na derme
3.13.1 Tratamento experimental
Camundongos Balb/C fêmeas, previamente depilados no dorso,
foram tratados por via intradérmica com o peptídeo sintético derivado do
Lopap, o qual foi previamente avaliado em ensaios in vitro em cultura de
fibroblastos. Este ensaio foi realizado com a colaboração da Janaina
Ventura, doutoranda em nosso laboratório. Foram utilizados diferentes
esquemas de tratamento (dose única ou múltiplas doses, diferentes
concentrações) e os animais foram avaliados em diferentes intervalos de
tempo quanto à produção de colágeno na derme, hemostasia global e
alterações hematológicas. Este experimento foi realizado como um ensaio
piloto para entendimento da ação do peptídeo derivado do Lopap em
modelo animal e para delinear o esquema de tratamento deste peptídeo
em animais.
Um total de 68 camundongos de 20-25 g, foram divididos
aleatoriamente em 6 grupos: grupos (G) 1-4 com 5 subgrupos (n=2) e
grupos 5–6 com 6 subgrupos (n=2):
- G1 e G2) único tratamento com salina (G1) ou 0,3 µg de P4 (G2),
avaliados em diferentes intervalos de tempo após o tratamento (1, 2,
3, 4 e 12 semanas);
MATERIAIS E MÉTODOS 98
- G3 e G4) único tratamento com doses variadas de P4 (0,04, 0,2, 1,0,
5,0 e 25 µg), avaliados 1 semana (G3) ou 4 semanas (G4) após o
tratamento;
- G5 e G6) tratamentos cumulativos (de 2 a 4 vezes, 1 vez por
semana,) com salina (G5) ou 0,3 µg de P4 (G6), avaliados 1 semana
após o último tratamento, ou seja, após 2, 3 e 4 semanas após o
início do tratamento, e também após 12 semanas do término de cada
tratamento.
Para tratamento, os animais foram injetados com 0,5 ml do peptídeo
em solução salina na região lombar esquerda e, como controle, foi
injetado 0,5 ml de solução salina na região direita, que foi utilizada como
controle para medição do nível basal de colágeno no mesmo animal. Os
grupos controle foram administrados apenas com salina e foram utilizados
para gerar valores de referência para avaliação de alterações
hematológicas e avaliação de toxicidade.
3.13.2 Avaliação dos animais
Nos respectivos intervalos de tempo, os animais foram anestesiados
com ketamina 10% (100 mg/kg) e xilasina (16 mg/kg) em PBS por via
intraperitoneal. Em seguida, foi coletado 1 ml de sangue por punção
cardíaca, em 3,8% de citrato de sódio na proporção de 1:10 (citrato de
sódio:sangue). Também foi coletado sangue em um capilar heparinizado
pela via retro-orbital, para avaliação do hemograma. Posteriormente, os
animais foram eutanasiados por deslocamento cervical. Para análises
histológicas da derme, foram retirados por dissecção fragmentos de pele
de 1 x 1 cm da área dorsal tratada ou controle nos lados esquerdo e
direito dos animais. Os fragmentos de pele foram armazenados a 4 °C em
formalina tamponada 10%, pH 7,4 até a análise histológica. O sangue
coletado dos animais foi processado imediatamente por centrifugação a
1500 g, 25 °C, 15 min, para obtenção do plasma, que foi utilizado para
MATERIAIS E MÉTODOS 99
ensaios de coagulação com a medida do tempo de protrombina (TP), do
TTPA, e dos níveis plasmáticos de fibrinogênio, utilizando kits comerciais
(Diamed) em Coagulômetro Quick Timer (Drake). A contagem do
hemograma foi realizada em analisador hematológico automático (Advia,
Bayer). Para avaliação de sinais de toxicidade, os animais foram
observados quanto a alterações no peso corporal, alterações
macroscópicas na superfície tratada e estereótipos comportamentais.
Lâminas histológicas foram preparadas a partir dos fragmentos de
pele dos animais e submetidas à coloração de Picrosirius, para avaliação
quantitativa do colágeno. A coloração de Picrosirius cora as fibras
colágenas em vermelho e não cora outras estruturas da derme. A
quantificação da porcentagem de colágeno em relação à área total (µm2)
foi realizada com auxílio de Sistema Analisador de Imagens Kontron 300
(Zeiss). A média da fração de área das fibras colágenas na derme foi
obtida a partir da análise microscópica de 05 campos dos cortes
histológicos de cada animal.
A análise estatística foi realizada pelo método de Variância ANOVA
seguido de teste comparativo múltiplo de TUKEY-KRAMER. Os valores
foram expressos em média ± desvio padrão, considerando-se valores
significantes p<0,05.
RESULTADOS 100
4 RESULTADOS
4.1 Obtenção do rLopap em E. coli Origami
Para confirmar a presença do inserto codificante do Lopap nos
plasmídeos pAE-Lopap purificados, obtidos de 6 colônias isoladas da
bactéria E. coli DH5α, estes foram submetidos à reação de PCR, utilizando
oligonucleotídeos iniciadores específicos para a seqüência do Lopap
(sense) e para a seqüência do vetor (anti-sense). Como pode ser
observado na Figura 13, em todas as reações foi obtido produto
amplificado correspondente à seqüência de DNA codificante do Lopap
(>600 bp), confirmando a presença do inserto nos plasmídeos utilizados
para expressão do Lopap em E. coli.
RESULTADOS 101
Figura 13 - Perfil eletroforético do inserto codificante do Lopap.
Da esquerda para direita, produto amplificado por PCR a partir dos plasmídeos extraídos dos clones 1 a 6 de E. coli DH5α, utilizando primer específico para o Lopap. Gel de agarose 1%, DNA visualizado com brometo de etídeo em luz ultravioleta. À direita do gel: padrão O’GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Fermentas).
bp 3000 2500
2000
1500
1000 750
500
250
RESULTADOS 102
O rLopap foi expresso em E. coli Origami e recuperado na forma
solúvel após extração por lise celular. A fração purificada por
cromatografia de afinidade em coluna de Ni-Sepharose apresentou
rendimento de aproximadamente 5 mg/L de meio de cultura. A Figura 14
mostra o perfil eletroforético do rLopap obtido por este sistema de
expressão, com massa molecular de 21 kDa. A proteína recombinante
obtida não apresentou atividade enzimática sobre a protrombina no teste
de atividade ativadora de protrombina com substrato cromogênico S-
2238, mas apresentou atividade antiapoptótica em cultura de HUVECs
(dados não mostrados). Este dado indica que o ambiente redutor em
bactérias Origami não é suficiente para garantir uma conformação
terciária favorável para manter a atividade catalítica do rLopap, apesar de
se observar o acúmulo da proteína recombinante expressa na fração
solúvel intracelular e não em corpúsculos de inclusão.
RESULTADOS 103
Figura 14 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) do rLopap expresso com cauda de 6xHis em E. coli Origami. P: padrão de massa molecular (“low molecular weight marker” – GE Healthcare), FS: fração solúvel obtida após lise celular e centrifugação, Ni-S: fração purificada em coluna Ni-Sepharose, eluída em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,5 com 145 mM NaCl e 0,3 M de imidazol, C8: fração purificada eluída em coluna C8 com 100% de metanol (HPLC). Gel: 15% de acrilamida, corado com azul de Coomassie.
kDa P FS Ni-S C8
97,0 66,0 45,0
30,0
20,1
14,4
RESULTADOS 104
4.2 Obtenção do rLopap em Pichia pastoris
4.2.1 Clonagem e expressão do rLopap em P. pastoris
A seqüência de DNA que codifica o Lopap foi corretamente
subclonada no vetor pPIC9K. Das colônias de bactéria DH5α
transformadas, 15 foram utilizadas para purificação dos plasmídeos. A
análise em gel de agarose 1% indicou que os plasmídeos de todos os
clones apresentaram insertos de tamanho compatível, uma vez que as
bandas apresentavam cerca de 10 kb conforme o esperado. O
seqüenciamento dos clones demonstrou a inserção correta no vetor, na
posição adjacente ao promotor AOX1 (álcool oxidase 1), e em fase de
leitura. O seqüenciamento de cerca de 400 pb confirmou a seqüência
previamente conhecida para o Lopap.
A partir da levedura P. pastoris transformada com o plasmídeo
linearizado pPIC9k e semeada em placas, cresceram várias colônias. Das
colônias formadas, 5 foram selecionadas e induzidas à expressão do
rLopap com 0,5% de metanol. O promotor AOX1 é um promotor
altamente eficiente e um dos mais importantes da levedura P. pastoris,
cuja indução ocorre em presença de metanol, mas não de outras fontes de
carbono. A expressão foi feita durante um período de 96 h a 30 °C.
A atividade procoagulante da proteína recombinante obtida em cada
uma das 5 culturas foi avaliada através do ensaio de hidrólise da
protrombina em presença do substrato cromogênico S-2238 (Figura 15).
Das 5 culturas avaliadas, em apenas 1 não foi observada a atividade
enzimática do rLopap. Na cultura-controle, que não continha inserto do
rLopap, também não foi observada atividade ativadora de protrombina,
como esperado. O clone que apresentou maior atividade (C2) foi
selecionado para expressão em escala maior.
RESULTADOS 105
Figura 15 - Atividade ativadora de protrombina de diferentes clones (C1 a C5) de Pichia pastoris transformada para expressão do rLopap. Como controle (Co) foi utilizada uma cultura expressando proteína distinta do rLopap. Este teste foi realizado com 70 µL do meio de cultivo concentrado 20x e dialisado contra solução salina. A 405 nm corresponde à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 (40 µM) pela trombina gerada a partir da hidrólise da protrombina (90 pM) pelo rLopap. As amostras foram pré-incubadas com a protrombina a 37° C por 20 min e as leituras foram obtidas 20 min após adição do S-2238.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
C1 C2 C3 C4 C5 Co
Culturas
A 4
05
nm
RESULTADOS 106
4.2.2 Expressão do rLopap em meio complexo (BMGY/BMMY)
No período de 24 h após o início da incubação em meio de
crescimento BMGY, o cultivo apresentou uma DO600nm entre 1,0 e 2,0. A
Tabela 4 mostra os valores da concentração de proteínas totais no meio
de cultivo durante a fase de indução da expressão da proteína
recombinante em meio BMMY. Os dados correspondem à média de 4
cultivos independentes. Este meio apresenta em sua formulação proteínas
e hidrolisado protéico provenientes do extrato de levedura e peptona.
Observou-se uma diferença de aproximadamente 16% entre a
concentração de proteínas totais solúveis no meio obtida ao final do
processo de expressão e a concentração no início da indução da expressão
da proteína recombinante. Descontando-se as proteínas do meio de
cultura e considerando apenas a quantidade de proteínas que foram
expressas antes e após a indução, observa-se um aumento de 62% na
concentração de proteínas após 72 h de indução. Neste período de
indução foi obtido um total de aproximadamente 15 mg/L de proteínas
totais expressas no meio.
O material obtido após o período de indução da expressão foi
concentrado e dialisado contra salina. Após centrifugação, filtração, diálise
e liofilização foi recuperado 57% (22,23 mg/L) do total de proteínas
obtido (39 mg/L). Este material foi submetido à cromatografia de
afinidade em resina Benzamidina-Sepharose, sendo a fração 1 (não-retida
na coluna) eluída no tampão de equilíbrio Tris-HCl 50 mM, 500 mM NaCl,
pH 7,5, e a fração 2 (retida por afinidade) eluída em 50 mM de glicina pH
3,0. A benzamidina é um inibidor competitivo e reversível de serino
proteases. Portanto, formas enzimaticamente ativas do rLopap ao
passarem pela coluna, ligam-se pelo sítio ativo à benzamidina,
mimetizando uma ligação enzima-substrato. Com a mudança brusca de
pH, essa ligação se desfaz, eluindo a serino protease (rLopap).
RESULTADOS 107
Tabela 4 - Concentração de proteínas no meio de cultivo durante a expressão do rLopap em P. pastoris em meio complexo BMMY.
Tempo de
indução (h)
Concentração de
proteínas (mg/ml)*
Concentração de proteínas
descontando-se o valor do
meio de cultura (mg/ml)*
0 0,091 0,024
24 0,090 0,023
48 0,099 0,032
72 0,106 0,039
*Estimado pela dosagem de Bradford, média calculada utilizando os dados de 4 cultivos independentes. Durante as 72 h de indução o total de proteínas produzido foi de 15 mg/L.
Após purificação em coluna de afinidade Benzamidina-Sepharose
(Figura 16), a atividade ativadora de protrombina foi observada na fração
2, e foi ausente na fração 1 (Tabela 5). Na fração 2 (ativa) foi recuperado
um total de 1,76 mg/L de proteínas, que correspondeu a
aproximadamente 8% do total de proteínas aplicado na coluna. Observou-
se que após o processo de purificação a resina da coluna de purificação
apresentou mudança de cor provavelmente por oxidação, perdendo parte
de sua funcionalidade. Isto indicou que a amostra utilizada danifica a
resina.
A Figura 17 mostra o perfil eletroforético do material proveniente da
expressão do rLopap em P. pastoris utilizando meio complexo BMMY e
após a purificação por cromatografia de afinidade em coluna de
Benzaminida-Sepharose. Observa-se que a fração 2 apresentou uma
banda predominante de aproximadamente 20 kDa que corresponde à
forma monomérica do rLopap.
RESULTADOS 108
Figura 16 - Cromatografia em coluna de afinidade Benzamidina-Sepharose. Tampão de equilíbrio: Tris-HCl 50 mM pH 7,5, tampão de eluição: glicina 50 mM pH 3,0, fluxo: 1 ml/min. Amostra: meio de cultivo de P. pastoris em meio BMMY após expressão do rLopap.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 5 10 15 20 25
Volume (ml)
A2
80
nm
Glicina 50 mM, pH 3,0
PI
PII
Fração 1
Fração 2
RESULTADOS 109
Figura 17 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) do material obtido após expressão do rLopap em Pichia pastoris em meio complexo BMMY e após purificação em Benzamidina-Sepharose. LMWM: marcadores de massa molecular (“low molecular weight marker” – GE Healthcare). Foram aplicados 6 µg de cada amostra. Gel: 12,5% de acrilamida, corado com azul de Coomassie.
RESULTADOS 110
Tabela 5 - Atividade ativadora de protrombina das frações da cromatografia em Benzamindina-Sepharose.
Amostra (4 µg) A 405 nm*
Fração 1 0,003
Fração 2 0,222
*Correspondente à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 pela trombina gerada a partir da ativação da protrombina pelo rLopap.
A fração ativa (P2) (rLopap purificado por cromatografia em
Benzamidina-Sepharose) também apresentou atividade procoagulante no
teste de recalcificação com plasma humano normal citratado (Tabela 6). O
tempo médio de coagulação do plasma humano normal após recalcificação
na ausência da proteína foi de 330 seg, enquanto que em presença do
rLopap (4 µg), o tempo médio de coagulação foi de 120 seg. Portanto,
observou-se uma redução de 64% do tempo de coagulação em relação ao
controle. Com a fração 1, o tempo de coagulação foi próximo ao do
controle (300 seg).
Tabela 6 - Atividade procoagulante do rLopap sobre plasma humano normal citratado.
rLopap (P2)1 redução do tempo de coagulação*
0 µg 0%
2 µg 23%
4 µg 64%
*Tempo de coagulação após recalcificação do plasma. A redução foi calculada a partir da média dos tempos de coagulação para cada dose (duplicata) considerando como 100% o tempo de coagulação na ausência do rLopap (controle). 1Obtido após cromatografia em Benzamidina-Sepharose.
RESULTADOS 111
A proteína recombinante obtida também apresentou atividade
antiapoptótica em cultura de HUVECs. A Tabela 7 mostra o resultado do
ensaio de viabilidade celular após tratamento da cultura de células
endoteliais com o rLopap (10 µg/ml) por 48 h. O controle positivo (10%
SFB) foi cultivado em uma condição ideal de crescimento e o controle
negativo (1% SFB) foi submetido a uma condição proapoptótica por
deprivação de soro. Nesta condição, o rLopap foi capaz de aumentar a
viabilidade celular, protegendo as células de morte por apoptose.
Tabela 7 – Efeito citoprotetor do rLopap em HUVECs.
Teste A 550 nm* Viabilidade celular
(%)
Controle positivo (SFB 10%) 0,079 ± 0,003 100
Controle negativo (SFB 1%) 0,035 ± 0,008 44,3
10 µg/ml rLopap (SFB 1%) 0,098 ± 0,020 125,3
*Leitura da reação colorimétrica do ensaio de viabilidade pelo método do MTT, média ± erro padrão de medidas em triplicata.
4.2.3 Expressão do rLopap em meio mínimo (BMG/BMM)
Durante a fase de crescimento em meio BMG, a DO600nm observada
foi de aproximadamente 9,0 após 24 h do início do cultivo e de
aproximadamente 30,0 após 48 h do início do cultivo. A Figura 18 mostra
a curva de crescimento de P. pastoris recombinante durante a fase de
expressão do rLopap em meio BMM nas três condições de pH testadas, à
temperatura de 25 °C. Observou-se pouca diferença de crescimento da
levedura em pH 6,0 e 7,0 e um crescimento mais lento em pH 5,0.
A Tabela 8 mostra a concentração de proteínas totais solúveis no
meio de cultivo ao final da expressão e a atividade ativadora de
RESULTADOS 112
protrombina. Estes resultados indicam que a expressão em pH 5,0 é a
mais adequada para a obtenção do rLopap ativo.
Tabela 8 - Concentração de proteínas e atividade ativadora de protrombina ao final da expressão do rLopap em P. pastoris em meio mínimo BMM.
pH do meio Concentração de
proteínas
(mg/ml)*
A 405 nm1 na
presença de Ca2+
A 405 nm1 na
ausência de Ca2+
pH 5,0 0,046 0,037 0,021
pH 6,0 0,045 0,024 0,010
pH 7,0 0,043 0,011 0,010
*Estimado pela dosagem de Bradford. 1Correspondente à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 pela trombina gerada a partir da ativação da protrombina pelo rLopap. O ensaio foi realizado com amostras de 70 µL do sobrenadante do cultivo.
A Figura 19 mostra o perfil eletroforético do material obtido após
expressão do rLopap em meio BMM nos diferentes pHs. Estas amostras
foram precipitadas com metanol/clorofórmio antes de serem submetidas à
eletroforese. No perfil eletroforético das amostras obtidas durante a
expressão em pH 5,0, observa-se um aumento na intensidade de
proteínas com massa molecular entre 30 e 50 kDa, que podem
corresponder a formas diméricas e glicosiladas do rLopap. Nas amostras
obtidas durante a expressão em pH 7,0 observa-se pouca alteração do
perfil eletroforético durante a indução.
RESULTADOS 113
Figura 18 - Curva de crescimento de Pichia pastoris expressando
rLopap em meio mínimo BMM com diferentes pHs. Uma unidade de absorbância (DO600nm=1) equivale a 5 x 107 células/ml. A fase de indução da expressão foi realizada durante 107 h, a 25 °C, 250 rpm, adicionando-se diariamente 0,5-1,0% de metanol.
0
10
20
30
40
50
60
0 20 40 60 80 100 120
tempo (h)
DO
60
0 n
m
pH 5,0
pH 6,0
pH 7,0
RESULTADOS 114
O material obtido após expressão em meio mínimo pH 5,0 foi
submetido à cromatografia em coluna de afinidade Benzamidina-
Sepharose. Foram aplicados na coluna aproximadamente 50 ml do
sobrenadante do meio de cultivo em pH 5,0, correspondendo a um total
de 1,9 mg de proteínas. Na fração 2 foram eluídos aproximadamente 0,3
mg de proteínas (15% do total). Figura 20 o perfil do imunobloting com o
anticorpo anti-Lopap das amostras obtidas antes e após a purificação do
rLopap, utilizando como controle o extrato das cerdas de L. obliqua, que
contém o Lopap nativo. Obserou-se uma banda mais intensa de
aproximadamente 40 kDa na fração ativa eluída da cromatografia. As
bandas de alto peso molecular devem corresponder a aglomerados da
proteína. A Figura 21 mostra a atividade ativadora de protrombina do
rLopap expresso em pH 5,0 e purificado em coluna de Benzamidina-
Sepharose.
RESULTADOS 115
Figura 19 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) do sobrenadante do meio
de cultivo durante a expressão do rLopap em Pichia pastoris em meio mínimo BMM. Marcadores de massa molecular (kDa) “low molecular weight marker” (GE Healthcare). Foi aplicada a quantidade de proteínas correspondente a 1 ml de cada amostra obtida durante a fase de indução da expressão, nos intervalos de tempo indicados, precipitado com metanol/clorofórmio. Gel: 15% de acrilamida, corado com azul de Coomassie.
RESULTADOS 116
Figura 20 - Imunodetecção do rLopap expresso em pH 5,0 purificado por cromatografia em Benzamidina-Sepharose. Foi utilizado anticorpo primário anti-Lopap e anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina. Imunobloting revelado com substrato para fosfatase alcalina. Linha 1: 7,5 µL do marcador de massa molecular pré-corado (Kaleidoscopic, BioRad); linhas 2 e 3: extrato bruto das cerdas de L. obliqua (600 e 200 ng); linhas 4-6 (600 ng cada): expressão do rLopap em meio BMM, fração 1 não-ativa não-retida na coluna Benzamidina-Sepharose (linha 4), material antes da purificação (linha 5), fração 2 ativa eluída da coluna (linha 6).
1 2 3 4 5 6
RESULTADOS 117
Figura 21 - Atividade ativadora de protrombina do rLopap expresso em pH 5,0 purificado por cromatografia em Benzamidina-Sepharose. A 405 nm corresponde à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 (40 µM) pela trombina gerada a partir da ativação da protrombina (90 pM) pelo rLopap (4 µg). A amostra foi pré-incubada com a protrombina (rLopap+FII) a 37° C por 20 min e as leituras foram obtidas 20 min após adição do S-2238. Para os controles negativos, foram aplicadas as mesmas quantidades dos reagentes, adicionando-se apenas a protrombina (FII) na ausência do rLopap, e as mesmas quantidades dos reagentes e amostra (rLopap), omitindo-se a protrombina. O branco do ensaio foi obtido na ausência tanto do rLopap quanto de FII.
RESULTADOS 118
4.2.4 Expressão do rLopap em biorreator
Ao final de 48 h de incubação, os cultivos preparados para inocular o
fermentador apresentaram uma DO600nm média de 16,0. A fase de
crescimento em processo de batelada no biorreator teve duração de
aproximadamente 19 h e a fase de crescimento em processo de batelada
alimentada (fed-batch) teve duração de aproximadamente 4 h. Isto
demonstrou um bom desempenho e adaptação do clone de P. pastoris
recombinante no crescimento em biorreator com alta densidade celular. A
Tabela 9 mostra os principais parâmetros obtidos durante o processo de
fermentação, em intervalos de 24 h. A Figura 22 mostra a curva de
crescimento da levedura.
Na Tabela 10, pode-se observar o aumento da concentração de
proteínas solúveis no meio de cultivo durante a fase de indução da
expressão da proteína recombinante em fermentador, sob condições de
alta densidade celular. Ao final do processo, a concentração de proteínas
solúveis totais no sobrenadante do meio de cultivo (após centrifugação e
microfiltração) estimada pelo método de Bradford foi de 553 µg/ml.
Comparando-se estes resultados com os obtidos em cultivo sem o uso de
biorreator, observa-se que ao final do processo de expressão em
fermentador foi obtida uma quantidade de proteínas 14 vezes maior que a
obtida em meio complexo e 12 vezes maior que a obtida em meio mínimo.
A atividade específica do rLopap aumentou no decorrer do período de
indução, indicando que a proteína recombinante foi produzida com
atividade nesta fase.
RESULTADOS 119
Tabela 9 - Parâmetros do processo de cultivo de P. pastoris em biorreator para expressão do rLopap.
Tempo (h) Aeração
(L/min)
Agitação
(rpm)
OD
(%)
DO
600 nm
Massa celular
(g/L)
0 5,0 300 88,7 1,1 -
24 5,0 1000 20,4 166,0 41,95
48 14,6 1200 22,3 334,0 72,75
72 10,0 1200 22,4 469,0 106,7
96 10,0 1200 23,2 572,5 114,2
Tabela 10 - Concentração de proteínas e atividade ativadora de protrombina durante a fase de indução da expressão do rLopap em biorreator.
Tempo (h) Concentração de
proteínas (mg/ml)*
A 405 nm1
0 0,101 0
3 0,128 0
24 0,177 0
48 0,265 0
56 0,319 0,013
70 0,495 0,041
*Estimado pela dosagem de Bradford. 1Correspondente à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 pela trombina gerada a partir da ativação da protrombina pelo rLopap. O ensaio foi realizado com amostras de 70 µL do sobrenadante do cultivo.
RESULTADOS 120
0
20
40
60
80
100
120
140
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (h)
Bio
mas
sa (
g/L)
0
100
200
300
400
500
600
700
D.O
. (60
0nm
)
X(g/L) D.O. (600nm)início fed-batch glicerol
início fed-batchmetanol
Figura 22 - Curva de crescimento de Pichia pastoris em biorreator para
expressão do rLopap. O crescimento foi medido pela DO600nm e através da biomassa que correspondeu à massa seca (X) em g/L. Processo realizado em 3 fases: 1) batelada, 2) batelada alimentada (fed-batch) com glicerol, 3) batelada alimentada com metanol. A terceira fase correspondeu à fase de expressão da proteína recombinante. Ensaio realizado em biorreator de 14 L, com volume inicial ≈ 5 L e volume final ≈ 8 L.
RESULTADOS 121
Uma fração do material obtido no processo de fermentação (2 L) foi
clarificado através do sistema de filtração em fibras ocas. O restante do
material obtido ao final do processo de fermentação (aproximadamente 6
L dos 8 L obtidos) foi centrifugado e microfiltrado para remoção dos
resíduos celulares, obtendo-se aproximadamente 3,5 litros de
sobrenadante. A Tabela 11 mostra a recuperação de proteínas nestes dois
processos. Observou-se menor perda de proteína no processo de
centrifugação.
Tabela 11 - Recuperação de proteínas solúveis após clarificação do material obtido em biorreator.
Antes da clarificação Após clarificação
Método de
clarificação
Volume
inicial
(L)
Volume
final
(L)
Concentração
de proteínas
(mg/L)
Total de
proteínas
(mg)
Recuperação
(mg/L)*
centrifugação 6,00 3,50 553 1935 322
filtração em
membrana de
1,00 1,98 78 154
189
fibra oca 1,00 1,68 133 224
*Em relação ao volume inicial (total de proteínas dividido pelo volume inicial).
4.2.5 Testes de estabilidade
Amostras do rLopap expresso em biorreator foram testadas em
diferentes condições para avaliação da estabilidade da proteína e das
condições de processamento do material após expressão, observando-se
como parâmetros a solubilidade da proteína e sua atividade enzimática
específica sobre a protrombina. A proteína mostrou-se estável em água e
nos tampões Tris-HCl, fosfato e acetato, com concentração mínima de 0,1
RESULTADOS 122
M de NaCl. Em concentrações menores de NaCl ocorreu precipitação de
proteínas. A concentração máxima de proteínas solúveis atingida foi de
600 µg/ml em tampão Tris-HCl com NaCl 150 mM, 400 µg/ml em fosfato
de potássio com NaCl 150 mM, e 200 µg/ml em tampão fosfato de sódio
com NaCl 150 mM.
A Figura 23 mostra a atividade ativadora de protrombina do rLopap
medida em ensaio com substrato cromogênico após incubação em
diferentes temperaturas. Após 2 h de incubação, observou-se apenas uma
sutil diferença de atividade nas amostras, indicando que a atividade do
rLopap é estável, por curtos períodos de tempo, em uma faixa de
temperatura de até 37 °C. Após 24 h de incubação, observou-se perda
substancial na atividade da amostra incubada a 37 °C e uma sutil redução
na atividade da amostra incubada à temperatura ambiente (25 °C). Após
120 h de incubação, houve também perda significativa na atividade da
amostra incubada à temperatura ambiente e uma sutil redução na
atividade da amostra incubada à -20 °C. Os resultados também
demonstraram que o processo de liofilização não implica em perda de
atividade do rLopap.
A Figura 24 mostra a atividade ativadora de protrombina do rLopap
medida em ensaio com substrato cromogênico após diálise e incubação
em diferentes pHs. As amostras em pH 7,0 apresentaram atividade em
todos os períodos de incubação testados, enquanto em pH 5,0 foi
observada atividade apenas após 48 h de incubação, indicando a
necessidade de um longo período para conformação adequada da
molécula neste pH. Quando re-dialisada em pH 7,0, esta amostra
apresentou maior atividade. Nos pHs 8,0 e 9,0, a atividade enzimática foi
reduzida substancialmente, efeito que não foi revertido quando estas
amostras foram re-dialisadas para pH 7,0. Estes resultados indicam que o
rLopap é estável em pH neutro e ligeiramente ácido, e instável em pH
alcalino, causando provavelmente alterações irreversíveis na conformação
da molécula.
RESULTADOS 123
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
-80 -20 4 8 25 37 L/25 L/-80 C/4
Condição de incubação (temperatura oC)
A 4
05
nm
2h
24h
120h
Figura 23 - Efeito da temperatura na estabilidade da atividade ativadora de protrombina de amostras contendo rLopap expresso em Pichia pastoris.
As amostras em solução salina ou liofilizadas (L) foram incubadas por 2, 24 e 120 h em diferentes temperaturas, conforme indicado, e em seguida testadas no ensaio de ativação da protrombina. A 405 nm corresponde à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 pela trombina gerada a partir da ativação da protrombina pelo rLopap. As amostras (20 µg) foram pré-incubadas com a protrombina (90 pM) a 37° C por 20 min e as leituras foram obtidas 20 min após adição do S-2238 (40 µM). Para os controles negativos (C/4), foram aplicadas as mesmas quantidades de amostra (pré-incubadas 4 °C nos diferentes intervalos de tempo) e dos reagentes, omitindo-se a protrombina.
°
RESULTADOS 124
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
5 7 8 9
pH de incubação
A 4
05n
m
24 h pH teste
48 h pH teste
24h pH teste + 24h pH7,0
Figura 24 - Efeito do pH na estabilidade da atividade ativadora de protrombina de amostras contendo rLopap expresso em Pichia pastoris.
As amostras foram dialisadas em tampões com diferentes pHs, conforme indicado, e incubadas por 24 e 48 h a temperatura ambiente. Após as primeiras 24 h de incubação uma alíquota de cada amostra nos diferentes pHs foi dialisada novamente em pH 7,0. A 405 nm corresponde à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 pela trombina gerada a partir da ativação da protrombina pelo rLopap. As amostras (12 µg) foram pré-incubadas com a protrombina (90 pM) a 37° C por 20 min e as leituras foram obtidas 20 min após adição do S-2238 (40 µM).
RESULTADOS 125
A Figura 25 mostra o perfil eletroforético das amostras incubadas
por 24 h nos diferentes pHs. Observou-se que a intensidade da banda de
aproximadamente 30 kDa é proporcional à atividade ativadora de
protrombina medida nestas amostras, sendo ambas acentuadas em pH
7,0. O aumento na intensidade desta banda, deve corresponder ao
monômero do rLopap, e coincide com a diminuição na intensidade da
banda de aproximadamente 60 kDa, que pode corresponder a multímeros
ou agregados desta molécula. Estes resultados sugerem que a
conformação ativa do rLopap corresponde à sua forma monomérica.
RESULTADOS 126
Figura 25 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) de amostras contendo rLopap expresso em Pichia pastoris incubadas em diferentes pHs para teste de estabilidade. MW: marcadores de massa molecular “low molecular weight marker” (GE Healthcare). A fração solúvel (20 µl = 5 µg) e o precipitado (pellet 5 µl) das amostras foram analisados 24 h após a diálise nos diferentes tampões (tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0 com 50 mM de NaCl, tampão Tris-HCl 20 mM com 50 mM de NaCl pH 7,0, 8,0 ou 9,0), e aplicados nesta ordem, respectivamente, conforme indicado na figura. AD (antes da diálise): amostra não-dialisada. Gel: 15% de acrilamida, corado com azul de Coomassie.
MW (kDa)
97
66
45 30
20
5,0 7,0 8,0 9,0 AD
pH
RESULTADOS 127
4.2.6 Purificação do rLopap
A Tabela 12 mostra de forma sucinta os resultados do screening de
colunas de troca iônica e interação hidrofóbica, para purificação do
rLopap. De forma geral, obteve-se desempenho semelhante com as
colunas de troca aniônica, nas quais a fração ativa foi eluída antes do
início do gradiente de NaCl. Nas colunas de troca catiônica, a fração ativa
foi recuperada após o início do gradiente de NaCl, mas não foi obtida uma
boa eficiência de separação e recuperação. Nas colunas de interação
hidrofóbica não houve recuperação de fração ativa, o que se deve,
provavelmente, a uma interação muito forte da proteína recombinante
com a coluna, mesmo quando utilizadas as menores concentrações de
NaCl (0,5-3,0 M) ou sulfato de amônio (0,3-2,0 M) no tampão de
equilíbio.
A Figura 26 mostra o perfil cromatográfico obtido na primeira etapa
de purificação em coluna Hiprep QFF, utilizando método otimizado com
gradiente não linear (step wise). Foram aplicados 20 ml de amostra por
corrida, e as frações foram eluídas em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,3,
com gradiente de 0,15 e 1 M de NaCl. A fração ativa (P1 QFF) foi
recuperada no primeiro pico (P1 QFF) no tampão de equilíbrio (150 mM de
NaCl). Esta fração (50 ml) foi concentrada por ultrafiltração e alíquotas
desta fração foram aplicadas em coluna de gel filtração Superose 12. A
Figura 27 mostra o perfil cromatográfico obtido na cromatografia de gel
filtração. A fração ativa recuperada correspondeu ao último pico (P1 QFF/
P4 Sup). O perfil eletroforético destas amostras está mostrado nas Figuras
26 e 27. A Tabela 13 mostra o rendimento e a atividade do rLopap nas
durante as etapas de purificação.
RESULTADOS 128
Tabela 12 - Eficiência de colunas de troca iônica e interação hidrofóbica para purificação do rLopap expresso em P. pastoris.
Troca iônica Eficiência3
Colunas/tipo de troca Aniônica1 Catiônica1
Q Sepharose FF* S +++
Q Sepharose XL S +++
DEAE Sepharose FF W +++
ANX Sepharose 4 FF (high sub) W ++
SP Sepharose Fast Flow S ++
SP Sepharose XL S +
CM Sepharose Fast Flow W +
Interação hidrofóbica Eficiência2
Colunas Hidrofobicidade2
Phenyl Sepharose 6 FF (high sub) H 0
Phenyl Sepharose 6 FF (low sub) H 0
Phenyl Sepharose HP# H −
Octyl Sepharose 4 FF M-H 0
Butyl Sepharose 4 FF M 0
Butyl Sepharose HP M −
Butyl-S Sepharose 6 FF L 0
*Fast Flow; #High Performance 1S: trocador forte, W: trocador fraco; 2L: baixa, M: média, H: alta; 3boa (+++), regular (++), ruim (+), nula (0) não houve recuperação, não foi testada (−).
RESULTADOS 129
QFF Hiprep Step linda001:10_UV1_280nm QFF Hiprep Step linda001:10_Conc QFF Hiprep Step linda001:10_Fractions
0
200
400
600
800
mAU
0 50 100 150 200 250 300 ml
F2 A2 A3 A4 A5 A6F2 A9 A10 A11 A12 B12 B10 B9 B8 B7 B6 B5 B4 B3 B2 B1 C1 Waste
Figura 26 - Perfil cromatográfico em coluna HiPrep QFF do material
obtido no processo de cultivo de Pichia pastoris em biorreator para expressão do rLopap. Cromatografia de troca aniônica, utilizada como primeira etapa de purificação. Foram aplicados 20 ml de amostra e coletadas frações de 10 ml com gradiente não linear de 0,15 e 1 M de NaCl em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,3. Coluna: HiPrep 16/10 Q-Sepharose Fast Flow (20 ml), fluxo: 5 ml/min. No quadro ao lado direito, perfil eletroforético da fração ativa P1QFF, eluída no primeiro pico.
P1QFF
kDa MW P1QFF
97 66
45
30 20
14
RESULTADOS 130
Superose 12 linda v2006:10_UV1_280nm Superose 12 linda v2006:10_Fractions
0.0
5.0
10.0
15.0
mAU
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 ml
F2 A2 A4 A6 A8 A10A12B11 B9 B7 B5 B3 B1 C2 C4 C6 C8 C10C12D11 D9 D7 D5 D3 D1 E2 E4 E6 E8 E10E12F11 F9 F7 F5 F3
Figura 27 - Perfil cromatográfico em coluna Superose 12 da fração ativa obtida na primeira etapa de purificação (P1 QFF). Cromatografia de gel filtração, utilizada como segunda etapa de purificação. Foram aplicados 0,5 ml de amostra em coluna Superose 12 10/300 GL (24 ml) e as frações (0,5 ml) foram eluídas em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,3 com 150 mM de NaCl, fluxo de 0,5 ml/min. No quadro ao lado direito, perfil eletroforético da fração ativa P1QFF/P4 Sup, eluída no último pico.
P1 QFF/ P4 Sup kDa MW P4 Sup
66
45
30
20
14
RESULTADOS 131
Tabela 13 - Purificação parcial do rLopap expresso em P. pastoris.
Fração Vol
(ml)
Total
ptn
(mg)
A
(U/ml)
AT
(U x ml)
AE
(U/mg)
FP Recuperação1
(%)
Clarif 20 5,960 160,9 3218,4 540 1 100
P1-QFF* 5 1,270 480,1 2400,3 1890 3,5 74,58
P4-Sup# 3 0,084 554,4 1663,2 19800 36,7 51,68
Vol: volume, ptn: proteína, A: atividade, AT: atividade total, AE: atividade específica, FP: fator de purificação; clarif: sobrenadante do cultivo em biorreator. 1Com base na atividade total. *concentrado 10x em amicon NMWC 5k, #concentrado 5x em amicon NMWC 5k.
A atividade citoprotetora do rLopap obtido após a primeira (P1 QFF)
e a segunda etapa de purificação (P1 QFF/P4 Sup) foi avaliada em células
endoteliais tEND, que tiveram apoptose induzida por TNF-α. Conforme
mostrado na Figura 28, a porcentagem de células viáveis nas culturas
tratadas com rLopap foi mantida próxima ao das células sem estímulo
apoptótico (sem TNF-α), cultivadas com 0% e 1% de SFB.
RESULTADOS 132
Figura 28 - Viabilidade de células endoteliais (tEND) com apoptose
induzida por TNF-αααα e tratadas com rLopap. Células cultivadas com 0% e 1% de SFB em meio RPMI, na presença de TNF-α (0,05 µg/ml) e tratadas com as frações cromatográficas obtidas no processo de purificação do rLopap (1 µg/ml de P1QFF – 1ª etapa purificação, 0,3 µg/ml de P4Sup – 2ª etapa de purificação). O controle corresponde a culturas sem tratamento. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A porcentagem de células viáveis foi calculada em relação a células cultivadas com 10% de SFB. Cada coluna representa a média ± erro padrão (SEM). ###p<0,001 em relação ao controle sem TNF-α, ***p<0,001 em relação ao controle com TNF-α.
RESULTADOS 133
4.3 Efeitos do rLopap em animais previamente tratados com
heparina (enoxaparina)
As Figuras 29 e 30 mostram, respectivamente, as medidas do tempo
de sangramento e do tempo de coagulação (TTPa) em coelhos
anticoagulados com heparina de baixo peso molecular (enoxaparina) e
tratados com protamina (inibidor ou antídoto de heparina), rLopap ou
salina em relação a um grupo controle, que não foi anticoagulado com
enoxaparina. O administração do rLopap em coelhos heparinizados, na
dose de 1 µg/kg reverteu parcialmente a incoagulabilidade destes
animais. O tempo de sangramento, mas não o TTPa destes animais
atingiu os valores basais em aproximadamente 20 min de forma
semelhante à protamina. Também foi observada redução no volume de
sangramento dos animais tratados com rLopap, após a incisão para
medida do tempo de sangramento (dados não mostrados). Não foi
observada alteração na concentração de fibrinogênio no plasma dos
animais tratados com rLopap na dose utilizada.
RESULTADOS 134
Figura 29 - Tempo de sangramento em coelhos heparinizados tratados com rLopap. Grupos: controle não heparinizado (GC), anticoagulados com enoxaparina 20 mg/kg e tratados após 10 min com salina (GSP), protamina (GP) ou rLopap 1 µg/kg (LG). O tempo de sangramento foi medido alternadamente nas orelhas esquerda e direita dos animais de cada grupo (n=5), após incisão de 5 mm, nos tempos indicados no gráfico.
RESULTADOS 135
Figura 30 - Tempo de coagulação (TTPa) em coelhos heparinizados tratados com rLopap. Grupos: controle não heparinizado (GC), anticoagulados com enoxaparina 20 mg/kg e tratados após 10 min com salina (GSP), protamina (GP), ou rLopap 1 µg/kg (LG). O TTPa foi medido no plasma de amostras de sangue coletadas dos animais de cada grupo (n=5), nos tempos indicados no gráfico.
RESULTADOS 136
4.4 Identificação e caracterização da seqüência do Lopap
envolvida na modulação da sobrevivência celular
4.4.1 Obtenção e avaliação de peptídeos sintéticos derivados do Lopap
Quatro peptídeos derivados da seqüência primária do Lopap (P1, P2,
P3 e P4) foram obtidos na forma sintética. O desenho destes peptídeos foi
baseado nos domínios conservados característicos de lipocalinas (motifs)
encontrados na seqüência primária do Lopap (Figura 31). As propriedades
dos peptídeos obtidos como massa molecular, número de resíduos de
aminoácidos e sua posição na seqüência da molécula original estão
mostradas na Tabela 14.
Tabela 14 - Propriedades dos peptídeos sintéticos derivados da seqüência do Lopap.
Peptídeo Massa
molecular
N° resíduos de
aminoácidos
Posição na seqüência
primária do Lopap
Pureza
(HPLC)
P1 2452,8 20 5-24 >90%
P2 2165,4 19 97-115 >90%
P3 2305,7 20 128-147 >90%
P4 1310,5 11 109-119 >95%
RESULTADOS 137
Figura 31 - Seqüência de aminoácidos dos peptídeos sintéticos
desenhados a partir da seqüência primária do Lopap. A) Posição dos peptídeos em relação aos motifs 1-3 na seqüência primária do Lopap. Os motifs estão indicados abaixo da seqüência de aminoácidos sublinhada; os números à esquerda e à direita indicam a posição na seqüência; os três aminoácidos dentro dos quadros pretos correspondem a tríade catalítica de serino protease predita; as seqüências demarcadas com cinza ou delimitadas no quadro preto correspondem às sequências dos peptídeos obtidos, conforme indicado. B) Seqüência de cada peptídeo P1-P4.
A
B
RESULTADOS 138
Os peptídeos obtidos foram testados quanto à atividade
procoagulante em teste de recalcificação com plasma humano normal e
em ensaio de ativação da protrombina. Nenhum dos peptídeos apresentou
efeito sobre o tempo de coagulação e tampouco foi capaz de ativar a
protrombina (dados não mostrados). Por outro lado, dois peptídeos (P2 e
P4), que estão relacionados ao motif 2 do Lopap, apresentaram efeito
citoprotetor em células endoteliais induzidas à apoptose por deprivação de
soro (Figura 32). A Figura 33 mostra os resultados obtidos em culturas de
células endoteliais estimuladas com diferentes concentrações dos
peptídeos P2 e P4. Estes resultados mostraram que P2 e P4 atuam
igualmente aumentando a viabilidade celular por inibição de apoptose. A
maior porcentagem de células viáveis foi observada com a menor
concentração utilizada de ambos os peptídeos.
RESULTADOS 139
Figura 32 - Efeito de peptídeos sintéticos derivados da seqüência do Lopap sobre a viabilidade de células endoteliais. As células endoteliais (HUVECs) foram cultivadas em meio RPMI com 1% de SFB (condição proapoptótica) e tratadas com os peptídeos P1 a P4 na concentração de 5 µg/ml durante 72 h O controle corresponde a culturas sem tratamento. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A porcentagem de células viáveis foi calculada em relação a células cultivadas com 10% de SFB. Cada coluna representa a média ± SEM. ***p<0,001 em relação ao controle.
RESULTADOS 140
Figura 33 - Efeito de diferentes concentrações dos peptídeos P2 e P4 na viabilidade de células endoteliais. Células endoteliais (HUVECs) foram incubadas com diferentes concentrações de P2 e P4 (0,35-5 µg/ml) em meio RPMI com 1% de SFB (condição proapoptótica) durante 120 h. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A porcentagem de células viáveis foi calculada em relação a células cultivadas com 10% de SFB.
RESULTADOS 141
4.4.2 Efeito de inibidores de serino proteases sobre a atividade
antiapoptótica de peptídeo derivado do Lopap
Este ensaio foi realizado para avaliar o envolvimento do resíduo de
serina na atividade antiapoptótica do Lopap. Visto que ambos os peptídeos
P2 e P4 foram igualmente ativos na citoproteção de células endoteliais,
sendo capazes de reverter o estímulo apoptótico nestas células cultivadas
em condição de deprivação de soro, o P2 foi utilizado neste teste por
apresentar na seqüência dois resíduos de serina, e dentre estes o resíduo
de serina reativa da tríade catalítica predita do Lopap. Além disso, o P2
tem maior massa molecular em relação a P4, o que torna mais eficiente a
etapa de recuperação do peptídeo após tratamento com o inibidor por
técnicas que se baseiam no diferencial de massa molecular. Conforme
mostrado na Figura 34, nenhum dos inibidores, aprotinina ou PMSF,
interferiu na atividade antiapoptótica do P2, demonstrando que sua ação
não é dependente do resíduo de serina. Não foi observada diferença
estatística significante entre as culturas de HUVECs tratadas com o P2,
pré-incubado ou não com PMSF e na presença ou ausência de aprotinina
no meio de cultura. Por outro lado, em todas estas condições as células
tratadas por P2 apresentaram viabilidade significativamente maior em
relação ao controle.
RESULTADOS 142
Figura 34 - Efeito de inibidores de serino protease sobre a atividade antiapoptótica de P2. Células endoteliais (HUVECs) cultivadas em meio RPMI com 1% de SFB (condição proapoptótica), tratadas com o peptídeo P2 (0,3 µg/ml) durante 120 h na presença ou ausência de aprotinina (3 µg/ml), na presença ou ausência de P2 (0,3 µg/ml), e com P2 (0,3 µg/ml) pré-incubado ou não com PMSF (5 mM). O controle corresponde a culturas sem tratamento. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A porcentagem de células viáveis foi calculada em relação a células cultivadas com 10% de SFB. Cada coluna representa a média ± SEM. ***p<0,001 em relação ao controle.
RESULTADOS 143
4.4.3 Análise estrutural e caracterização da seqüência do Lopap envolvida
na modulação celular
Os peptídeos ativos, P2 e P4 apresentam seqüência parcialmente
coincidente, que corresponde a uma região conservada em lipocalinas
(motif 2), previamente descrita (Reis et al., 2006, Figura 6). A Figura 35
mostra a região na estrutura terciária do Lopap onde se localiza a
seqüência destes peptídeos, indicando também sua posição em relação ao
provável sítio ativo da molécula, constituído pelos aminoácidos Ser119,
His168 e Glu171, os quais formam uma tríade catalítica do tipo serino
protease. A seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4 localiza-se na
folha β-7 ou β-H.
A busca por domínios de outras proteínas com seqüências similares
aos peptídeos citoprotetores derivados do Lopap, mostrou que esta
seqüência faz parte de um motif altamente conservado em vários grupos
de lipocalinas, caracterizado como seqüência-assinatura. A Tabela 15
mostra os resultados obtidos utilizando a ferramenta “Motif Search”. A
busca e alinhamento da seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4 com
domínios conservados de seqüências de proteínas no banco de dados do
NCBI utilizando a ferramenta CDART mostrou que a seqüência analisada
apresenta identidade com diversas lipocalinas, de diferentes origens
animais, dentre estas a apolipoproteína D, retinol-binding protein,
prostaglandina D sintase e a purpurina (Tabela 16). Muitas destas
lipocalinas são descritas pelo envolvimento na modulação da
sobrevivência celular e em processos de desenvolvimento e regeneração.
Por outro lado, a busca e alinhamento da seqüência comum entre os
peptídeos P2 e P4 com seqüências no banco de dados do NCBI utilizando a
ferramenta blastp (Tabela 17) mostrou a presença desta seqüência em
organismos de ampla gama de variação filogenética, deste vírus,
archeobactérias, bactérias, parasitas, fungos, insetos (incluindo
lepidópteros) e outros animais, incluindo muitas proteínas hipotéticas,
cuja função ainda não é conhecida.
RESULTADOS 144
Figura 35 - Localização da seqüência dos peptídeos P2 e P4 na
estrutura tridimensional do Lopap. Seqüência dos peptídeos em vermelho, tríade catalítica predita em azul ou verde. A) P4, B) P2, C-F) região comum entre P2 e P4. Visualização pelo programa RasMol, a partir do modelo da estrutura terciária do Lopap (Reis et al., 2006).
RESULTADOS 145
Tabela 15 - Domínios de proteínas com seqüências similares a P2 e P4 identificados pela busca no Motif Search Library.
Proteína Seqüência Banco de dados: número de acesso
Lopap
(P2-P4)*
YAIGYSC -
ICP YAIGYSC Blocks: IPB003057D, Prints: INVTBRTCOLOR4
RBP YAI-YSC Blocks: IPB002449F, Prints: RETINOLBNDNG6
ApoD YAI-YSC Blocks: IPB002969E, Prints: APOLIPOPROTD5
Lip YAIGY-- Blocks: IPB002345B, Prints: LIPOCALIN2
DUF52 Y--GYSC Blocks: IPB002737G
Triab YA--Y-C Pfam_fs: Triabin
*Seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4. ICP: invertebrate colouration protein signature, RBP: retinol binding protein signature, ApoD: apolipoprotein D signature, Lip: Lipocalin signature, DUF52: protein of unknown function DUF52, Triab: Triabin 7.1 0.12 1.
A localização e o padrão estrutural observado para o motif 2 do
Lopap (relacionado com os peptídeos P2 e P4) e para seqüências
similares na purpurina e na prostaglandina D sintase, que são lipocalinas
antiapoptóticas, foram semelhantes. A figura 36A mostra o alinhamento
da estrutura em folha β deste motif nestas lipocalinas, considerando-se
esta região como parte da estrutura terciária completa dos modelos do
Lopap, purpurina (P08938) e prostaglandina D sintase (P41222),
respectivamente. Os parâmetros relativos de acessibilidade ao solvente,
polaridade e hidropaticidade de cada um dos sete resíduos de aminoácidos
comuns na seqüência de P2 e P4 das seqüências correspondentes na
purpurina e prostaglandina D sintase também apresentaram um padrão
semelhante entre estas proteínas (Figura 36B).
RESULTADOS 146
Tabela 16 - Alinhamento dos resultados de busca por domínios conservados (CDART) relacionados com a seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4.
N° acesso Descrição Seqüência
59709575 Lobl|Lopap YAIGYSC
34810781 Pbra|Lipocalin_Flua YIIGYSC
74933972 Scyn|BBP-I YAVSYSC
267584 Omyk|Plasma-RBP1 YAIHYSC
82247601 Saur|RBP YAIHYSC
74894593 Msex|Insecticyanin_a YAINYNC
74894890 Gmel|Gallerin YAIAYTC
74938181 Bmor|Bombyrin YAIAYNC
74866083 Dmel|RE67583p YAVVYSC
1703341 Cpor|ApoD YALVYSC
157835127 Hsap|ApoD_1 YALVYSC
131649 Ggal|Purpurin YAITYAC
132408 Xlae|Plasma_RBP YAITYAC
114034 Hsap|ApoD_2 YALVYSC
114035 Rnor|ApoD YALVYSC
809399 Btau|RBP FAVQYSC
15988271 Hgam|Alpha-CRCN YACLYSC
74933973 Scyn|BBP-II YSIVFSC
23200069 Hgam|Beta-CRCN YSCVYSC
1346419 Same|Lazarillo YSIVWSC
74934096 Hcun|Hyphantrin YAVMWAC
82216128 Ggal|CALII YAIVYSQ
2497698 Fcat|PGDI YALLYTA
730305 Hsap|PGDI YALLYSQ
34811381 Ccot|Lipocalin YAVIYAT
82215065 Drer|PGDS YAIFHTI
2497699 Mmus|PGDI YALLFSR
116666961 Mmus|PGDS YALLFSR
20178282 Ggal|FABP YAVIFAT
3914330 Btau|PGDI YALLYTE
75067994 Ocun|PGDS FALLYSE
82217528 Xlae|Cpl-1_protein YILMYTV
3121746 Clup|Allergen-2 YLILYMI
20177989 Mmus|ESL-9 YIIFYMQ
172046756 Mmus|A1MG YAIFLTK
122801 Hsap|A1MG YAIFLTK
2506821 Btau|A1MG YAIFLTK
544480 Ppla|A1MG YAIIIMS
(continua)
RESULTADOS 147
Tabela 16 - (continuação).
N° acesso Descrição Seqüência
56554584 Hsap|Tear_Lipocalin HYIFYSE
81904828 Mmus|Lipocalin FALVLSL
266472 Bmar|Lipocalin YTLMHTI
82217483 Ssal|A1MG YAIVMLS
2497700 Sscr|PGDS YALLHTE
21730727 Hsap|C8gamma_compl FAVLYLE
82214882 Ggal|PGDS YALVATQ
21465464 Sscr|Salivary_Lipocalin YVILHLV
3913984 Tvul|BLG YILGCLE
20139234 Hsap|OBP-2b HYIFYCK
5822450 Rnor|A2MG YVMFHLI
81886784 Cpor|A1MG YATVLTK
401346 Hsap|VEGP HYIFYCE
62286940 Mmus|ESL-13 HYIFYCE
82191279 Xlae|A1MG YVIMQMR
112725 Mmus|NGAL FAMVFFR
127528 Mmus|MUP-4 YIMFHLI
81884017 Rnor|OBP_1 HYIFYIK
62286893 Mmus|ESL-8 YTILKLT
137823 Rnor|VEGP-1 HYIFYYE
3123036 Mmus|VSP-2 HYIIYCE
129095 Rpip|Olfactory_prot FLMEFTK
127532 Mmus|MUP-3 YIMIHLI
1718160 Sscr|VEGP HYILYCE
3121745 Clup|Allergen-1 HYILYCE
159162204 Mmus|MUP FLMAHLI
7245434 Hsap|NGAL HAMVFFK
81908474 Mmus|ME-RABP YTVIDIT
160877764 Tvul|Trichosurin_1 YAKFIFY
125950 Meug|LLP-A YWILSCV
6226255 Tvul|Trichosurin_2 YAKFIFY
75039539 Ecab|Uterocalin FVIFCAH
20141968 Mmus|VSP-1 HYMLYCD
462472 Clup|BLG1 YLFFCEM
129658 Rnor|Probasin LLFDYFN
112880 Ocun|Orosomucoid LLVFFAG
2194089 Btau|BLG YLLFCME
6225831 Mmus|Probasin LLFHYFN
(continua)
RESULTADOS 148
Tabela 16 - (continuação).
N° acesso Descrição Seqüência
125916 Mgig|BLG YFLFCLY
27923795 Meug|LLP-B HWILFCE
125905 Fcat|BLG2 YMFFCME
125904 Easi|BLG2 YMFFCVG
125913 Easi|BLG1 YLFLCMK
75058963 Fcat|BLG YLFFCLE
12084621 Sscr|OBP LIISNIN
231458 Hsap|Orosomucoid-2 MFGSYLD
82071154 Zviv|ARESP SISFFTS
75052482 Sscr|Alpha-1_acid_GP MLINSLH
3122324 Tvul|LLP HWILVCP
75058766 Pcyn|BLG-I YLFLCLE
75047049 Emax|OBP LLIHAIN
11513708 Sscr|BLG HLLLCME
81861688 Mmus|OBP-Ia LTFYSEN
130701 Hsap|Glycodelin FLFLCLQ
5107505 Btau|Allergen LVTYVEN
81916647 Maur|Female-SLP MTFHNVN
15826043 Maur|Aphrodisin IFFTNKN
37926392 Btau|OBP LVAHNIN
112881 Rnor|Orosomucoid MLAFNLT
129023 Rnor|OBP_2 IFFHNVN
81905017 Mmus|OBP-1F LFFHNVN
2497693 Mmus|Orosomucoid-3 MLFFDLK
112879 Mcar|Orosomucoid-1 MLAFDLK
(conclusão)
RESULTADOS 149
Tabela 17 - Alinhamento dos resultados de busca pelo blastp com a seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4.
N° acesso Descrição Seqüência Identidade
59709575 Lobl|Lopap YAIGY-SC -
16082396 Taci|hyp_Ta1424 YAIGY-SC 7/7
169659135 Lmaj|hyp YSIGY-SC 6/7
146097075 Linf|hyp YAIGY-TC 6/7
154343547 Pxut|BBP-1 YAIGY-TC 6/7
157874363 Lbra|hyp YAIGY-TC 6/7
118367871 Nvit|hyp_sugar_trans YAISY-SC 6/7
156550211 Robe|hyp_RUMOBE FAIGY-SC 6/7
220907990 Csp |DAG_transferase YAIAY-SC 6/7
153810865 Tthe|hyp_TTHERM_1 YAISY-SC 6/7
187936685 Aalc|OSBP YAIGY-RC 6/7
7228546 Sazo|hyp_SULAZ_1 YAIGY-S- 6/6
7228558 Sazo|hyp_SULAZ_2 YAIGY-S- 6/6
7228562 Nmen|hyp_autotransp YAIGY-S- 6/6
7228574 Sazo|hyp_SULAZ_3 YAIGY-S- 6/6
7228584 Dole|hyp_Dole YAIGY-S- 6/6
7228596 Sput|hyp_Sputcn32 YAIGY-S- 6/6
12958107 Hpar|VtaA15 YAIGY-S- 6/6
14578009 Iloi|OMP YAIGY-S- 6/6
14578013 Deth|hyp_DET1386 YAIGY-S- 6/6
14578015 Abau|hyp_ACICU YAIGY-S- 6/6
14578021 Mpal|APRT YAIGY-S- 6/6
14578023 Maer|hyp_MAE YAIGY-S- 6/6
194246023 Ssp |HMG-I_-Y_DBD YAIGY-S- 6/6
195728929 Tsp |GtrA YAIGY-S- 6/6
195728943 Arad|hyp_Arad_1 YAIGY-S- 6/6
195728950 Daci|FB-OMUP YAIGY-S- 6/6
195729051 Nmen|Surf_fibril_prot YAIGY-S- 6/6
195729077 Ccel|unknown YAIGY-S- 6/6
195729136 Dhaf|hyp_DSY3482 YAIGY-S- 6/6
195729159 Ssat|hyp_GCWU000342 YAIGY-S- 6/6
195729205 Fsp |TRP_transp_1 YAIGY-S- 6/6
195729228 Fsp |TRP_transp_2 YAIGY-S- 6/6
195729249 Obac|LacI-regulator YAIGY-S- 6/6
195729273 Ncin|hyp_NEICINOT YAIGY-S- 6/6
195729298 Osin|Na+_symporter YAIGY-S- 6/6
41023310 Aexc|MFS-1 YAIGY-S- 6/6
119668690 Fsuc|MET-A_transf YAIGY-S- 6/6
254669756 Fnuc|Na+_symporter YAIGY-S- 6/6
(continua)
RESULTADOS 150
Tabela 17 - (continuação).
N° acesso Descrição Seqüência Identidade
62859005 Fsp |TRP_transp_3 -AIGY-SC 6/6
15676883 Abau|hyp_AbauAB YAIGY-S- 6/6
15920898 Amin|autotransporter YAIGY-S- 6/6
19705249 Pmer|hyp_PARMER -AIGY-SC 6/6
118347720 Fbac|hyp_FBALC1_1 -AIGY-SC 6/6
121718889 Hpar|hyp_HPS YAIGY-S- 6/6
145507488 Ssp |biogenesis_prot -AIGY-SC 6/6
149632119 Hnep|hyp_HNE YAIGY-S- 6/6
157103159 Psp |hyp__OMP YAIGY-S- 6/6
164426363 Pjoh|hyp_PRABACTJOHN YAIGY-S- 6/6
167377802 Nfla|hyp_NEIFLAOT -AIGY-SC 6/6
167536578 Nlac|hyp_NEILACOT -AIGY-SC 6/6
189208392 Hpar|adhesin YAIGY-S- 6/6
219122238 Hpar|possible_OMP YAIGYYSC 6/6
219406496 Bple|hyp_BACPLE YAIGY-S- 6/6
145595383 Hpar|VtaA16 YQIGY-SC 6/6
146294596 Hpar|VtaA9 YAIGY-S- 6/6
158522009 Nmen|OMPGNA992_1 -AIGY-SC 6/6
160901366 Dvar|microsomal_GST YAIGY-S- 6/6
161869903 Hpar|VtaA14 YAIGY-S- 6/6
166367169 Hpar|VtaA3 -AIGY-SC 6/6
167039972 Hpar|VtaA6 -AIGY-SC 6/6
184159783 Hpar|VtaA5 YAIGY-S- 6/6
188996289 Hpar|VtaA2 YAIGY-S- 6/6
219851059 Hpar|VtaA1 YAIGY-S- 6/6
220930600 Hpar|VtaA8_1 YAIGY-S- 6/6
222086264 Nmen|OMPGNA992_2 YAIGY-S- 6/6
225848234 Nmen|OMPGNA992_3 YAIGY-S- 6/6
225848596 Nmen|OMPGNA992_4 YAIGY-S- 6/6
225848891 Nmen|OMPGNA992_5 YAIGY-S- 6/6
254804880 Nmen|OMPGNA992_6 YAIGY-S- 6/6
56461371 Nmen|NhhA_OMP_1 YAIGY-S- 6/6
57233874 Nmen|NhhA_OMP_2 YAIGY-S- 6/6
89896228 Nmen|NhhA_OMP_3 YAIGY-S- 6/6
113955230 Nmen|OMP YAIGY-S- 6/6
114798255 Nmen|NhhA_OMP_4 YAIGY-S- 6/6
149278835 Fvir|hyp_ankyrin-rep YAIGY-S- 6/6
154489870 Oana|hyp_VMOL-1 YAIGY-S- 6/6
163787197 Aaeg|hyp_AaeL YAIGY-S- 6/6
(continua)
RESULTADOS 151
Tabela 17 - Alinhamento dos resultados de busca pelo blastp com a seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4.
N° acesso Descrição Seqüência Identidade
167854694 Ncra|hyp_NCU10458 YAIGY-S- 6/6
167856866 Tthe|hyp_TTHERM_2 YAIGY-S- 6/6
167856898 Acla|DnaJ_domain YAIGY-S- 6/6
198274525 Ptet|hyp_1 -AIGY-SC 6/6
218258313 Ptri|hyp_2 YAIGY-S- 7/8
225076833 Bflo|hyp_BRAFLDRAFT YAIGY-S- 6/6
225154717 Stro|hyp_Strop YAIGY-S- 6/7
225156041 Edis|hyp_W760. -AIGY-SC 6/6
225365175 Mbre|hyp YAIGY-S- 6/6
227874522 Ptri|hyp -AIGY-SC 6/6
229828030 Saur|hyp_SaPI1_ORF8 -AIGY-SC 6/6
237739676 Nmen|hyp -AIGY-SC 6/6
237741427 Nmen|NhhA_OMP_5 -AIGY-SC 6/6
237743706 Hpar|VtaA7 -AIGY-SC 6/6
239503892 Nmen|adhesin YAIGY-S- 6/6
240949829 Stok|CytC_oxidase-I YAIGY-S- 6/6
241771701 Fnuc|Na+_dep_W_transp -AIGY-SC 6/6
241901251 Hpar|VtaA4_precursor YAIGY-S- 6/6
254302194 Xtro|angel_homolog_1 -AIGY-SC 6/6
195729159b Fbac|hyp_FBALC1_2 -AIGY-S- 5/6
163787197b Hpar|VtaA8_2 YATGY-S- 5/5
222086264b Arad|hyp_Arad_2 YAVGY--- 4/5
(conclusão)
RESULTADOS 152
Figura 36 - Comparação das propriedades físicas e estruturais da região do Lopap envolvida na modulação celular e a região correspondente em lipocalinas antiapoptóticas. A) Alinhamento estrutural da seqüência referente ao motif 2 do Lopap (verde) com seqüências correspondentes da purpurina (rosa) e prostaglandina D sintase (cinza). B) curvas dos valores relativos de hidropaticidade (H), polaridade (P) e acessibilidade ao solvente (RSA) considerando cada aminoácido da seqüência comum entre os peptídeos citoprotetores derivados do Lopap P2 e P4.
A B
RESULTADOS 153
4.5 Efeito de peptídeo sintético derivado do Lopap sobre a síntese
de proteínas de matriz extracelular in vitro e in vivo
4.5.1 Aumento da síntese de proteínas de matriz extracelular em cultura
de fibroblastos
Dentre os peptídeos ativos (P2 e P4), o P4 foi escolhido para
continuidade dos ensaios por ter menor tamanho em relação ao P2 e
assim, apresentar menor custo para a obtenção por síntese química e uma
seqüência mais delimitada a ser investigada. Culturas primárias de
fibroblastos humanos foram incubadas com o P4 nas concentrações de
0,35 µg e 5 µg por 4 dias. Os resultados da imunofluorescência obtidos
mostraram que houve um aumento significativo na síntese de colágeno,
fibronectina e tenascina pelos fibroblastos tratados com o peptídeo, sendo
maior o efeito na concentração de 0,35 µg de P4 (Figura 37).
RESULTADOS 154
Figura 37 - Imunofluorescência para fibronectina, tenascina e
procolágeno em cultura fibroblastos tratados com P4. A) controle (salina). B) 0,35 µg de P4. C) 5 µg de P4. Gráficos de Box Plot: quantidades de cada molécula produzida na ausência e presença de P4 (0,35 e 5,0 µg) analisadas estatisticamente. Eixo y= %, ou seja, a fração de área da molécula produzida.
0
2
4
6
8
10
12
0
5
10
15
20
25
30
0
10
20
30
40
50
60
70 70
60
50
40
30
20
10
0
30
25
20
15
10
5
0
12
10
8
6
4
2
0 controle controle controle P4 0,35µµµµg P4 0,35µµµµg P4 0,35µµµµg P4 5,0µµµµg P4 5,0µµµµg P4 5,0µµµµg
Fibronectina Tenascina Procolágeno
A A A
B B B
C C C
RESULTADOS 155
4.5.2 Aumento da síntese de colágeno na derme de camundongos
Para avaliar se o aumento da síntese de proteínas de matriz
extracelular induzido pelo peptídeo sintético derivado do Lopap (P4),
observado in vitro em cultura de fibroblastos, é reprodutível em modelo
animal, a síntese de colágeno foi avaliada na derme de camundongos
tratados localmente (via intradérmica) com este peptídeo. Foi observado o
efeito do tratamento com diferentes doses e em diferentes intervados de
tempo após o tratamento. Comparando-se os valores da percentagem de
colágeno na região da derme de camundongos tratada com a dose de 0,3
µg do P4 e a região controle do mesmo animal, tratada com salina, pelo
teste T pareado, foi observada quantidade significativamente maior de
colágeno na área tratada com P4 (P=0,018), em todos os animais
avaliados de 1 a 12 semanas após o tratamento (Figura 38). Confrontando
os valores de fração de área (porcentagem) de colágeno na derme nos
diferentes tempos de observação, houve uma correlação negativa linear
significante (P=0,035) entre a porcentagem de colágeno e o tempo de
tratamento com o peptídeo.
Com o objetivo de construir curva dose-resposta, o efeito de
diferentes doses do P4 (0,04–25,00 µg/animal) sobre o ganho de
colágeno na derme tratada foi avaliado 1 e 4 semanas após o tratamento.
Comparando-se os valores da porcentagem de colágeno na derme tratada
com P4 e os valores dos seus respectivos controles, pelo teste T pareado,
foi observada quantidade significativamente maior de colágeno na região
tratada com o peptídeo, tanto após 1 semana (P=0,002), quanto após 4
semanas (P=0,001). Confrontando os valores de fração de área de
colágeno na derme destes animais com as doses aplicadas não houve
correlação significante entre a dose e a resposta, tanto após 1 semana,
como após 4 semanas. As curvas dose-resposta estão mostradas na
Figura 39.
RESULTADOS 156
Figura 38 - Aumento de colágeno na derme de camundongos tratados
com P4. Cortes histológicos mostrando as fibras colágenas (coloração pelo vermelho Picrosirius), representativo de um animal. A) área da derme controle (tratada com salina), destacando: colágeno (C), folículo capilar (F) e epiderme (E); B) área tratada com P4 (0,3 µg i.d.).
E
F
C
B
A
RESULTADOS 157
0,04
0,2
1 5
25
0
5
10
15
20
0,01 0,1 1 10 100
dose P4 (ug)
gan
ho
de c
olá
gen
o (
%)
0,04
0,2
1
5
25
0
5
10
15
20
0,01 0,1 1 10 100
dose P4 (ug)
gan
ho
de c
olá
gen
o (
%)
Figura 39 - Ganho de colágeno na derme de camundongos tratados com
diferentes doses de P4. A) após 1 semana do tratamento (i.d.), B) após 4 semanas. Ganho de colágeno correspondente à diferença entre a porcentagem de colágeno na área tratada em relação à área controle (tratada com salina) no mesmo animal.
A
B
RESULTADOS 158
Com o objetivo de avaliar o efeito de doses cumulativas de P4 sobre
o ganho de colágeno na derme dos animais e a duração do tratamento, a
fração de área de colágeno na derme foi quantificada nos animais tratados
com até 4 doses (0,3 µg/dose) do peptídeo, 1 e 12 semanas após o último
tratamento. A Figura 40 mostra a diferença de colágeno presente na área
dos animais tratados com doses cumulativas de P4 em relação a seus
valores basais (controle). Com a dose cumulativa de 0,60 µg de P4, o
efeito do tratamento no ganho de colágeno persistiu por mais de 3 meses,
sendo observada quantidade significativamente maior (P=0,011) de
colágeno após 12 semanas do tratamento. Confrontando os valores de
fração de área de colágeno na derme destes animais com os diferentes
tempos de observação, não houve correlação significante (P=0,706) entre
a porcentagem de colágeno e o tempo de tratamento.
Os resultados demonstraram que o tratamento in vivo com P4 por
via intradérmica promove o aumento de colágeno na derme, e que este
efeito não é dose dependente. No tratamento com única dose houve
correlação negativa entre a porcentagem de colágeno dérmico e o tempo
decorrido após o tratamento. Por outro lado, quando 2 doses cumulativas
foram administradas em intervalo de 1 semana, o aumento de colágeno
se mantém por pelo menos até 3 meses do início do tratamento.
Os resultados obtidos de grupos de animais tratados com P4 quanto
à hemostasia global, hemograma, peso corporal, alterações macroscópicas
na área tratada e no comportamento dos animais foram semelhantes ao
observados nos grupos controle, onde os animais foram tratados apenas
com salina. Não foi observada alteração significativa em nenhum dos
parâmetros avaliados, indicando que o P4 não apresentou efeito sobre a
hemostasia dos animais e tampouco toxicidade.
RESULTADOS 159
Figura 40 - Ganho de colágeno na derme de camundongos tratados com
doses cumulativas de P4. A fração de área de colágeno na derme dos animais foi avaliada 1 e 12 semanas após o último tratamento com 1-4 doses de 0,3 µg i.d. de P4. Ganho de colágeno correspondente à diferença entre a porcentagem de colágeno na área tratada em relação à área controle (tratada com salina) no mesmo animal. Cada coluna representa a média ± SEM.
DISCUSSÃO 160
5 DISCUSSÃO
5.1 Proposta do trabalho
Este trabalho tem duas vertentes, uma focada na pesquisa básica e
outra focada na pesquisa aplicada. Tendo em vista os usos do Lopap como
ativador de protrombina e como proteína antiapoptótica, sob proteção
patentária (Chudzinski-Tavassi e Reis, 2002; Chudzinski-Tavassi et al.,
2004, 2005), estudos in vitro e in vivo, além de contribuírem para
esclarecimento dos mecanismos de ação envolvidos nos efeitos
observados para o Lopap, têm importância como prova de conceito para
indicações de uso desta molécula. Na vertente da pesquisa aplicada e
desenvolvimento biotecnológico, os resultados apresentados neste
trabalho são interessantes, primeiramente porque o Lopap se trata de
uma molécula nova do ponto de vista bioquímico e farmacológico, com
várias aplicações potenciais. Em segundo lugar, porque atualmente,
muitos agentes hemostáticos e reagentes de kits diagnósticos
comercializados ainda dependem de sua obtenção na forma nativa de
fontes naturais, como plasma animal e venenos de serpentes (Marsh,
2001; Schöni, 2005; Yu et al., 2007; Ofosu et al., 2008), as quais, além
das dificuldades técnicas devido à limitada disponibilidade e a
heterogeneidade das matérias primas e, muitas vezes, altos custos de
obtenção, estão sujeitas à presença de contaminantes biológicos (Ofosu et
al., 2008).
Na vertente da pesquisa básica, um dos principais objetivos deste
trabalho é contribuir para a caracterização do Lopap, visto que é cada vez
mais evidente ser uma das principais toxinas ativas do veneno de L.
obliqua, cujo mecanismo de ação diverge daqueles de ativadores de
protrombina conhecidos, consistindo numa importante ferramenta para
estudos do processo hemostático. Muitas propriedades do Lopap também
divergem das observadas em membros da família das lipocalinas e ao
mesmo tempo de serino proteases, pois até o momento, esta proteína é o
DISCUSSÃO 161
único membro da família das lipocalinas que apresenta atividade
proteolítica. Desta forma, o Lopap poderá compor uma nova classe ou
subclasse de proteínas. Por outro lado, o Lopap apresenta muitas
características comuns a membros da família das lipocalinas, como a
estrutura típica de β-barril, a presença dos três SCRs ou motifs na
seqüência de aminoácidos, e a capacidade de modulação da sobrevivência
celular.
Partindo deste fato, nos propusemos a pesquisar a importância
destes motifs nas atividades do Lopap e na vinculação de propriedades
comuns com outras lipocalinas, lançando mão do compartilhamento
destas propriedades estruturais. Assumindo que as lipocalinas, além de
apresentar características estruturais semelhantes, podem também
apresentar efeitos biológicos comuns, avaliamos o efeito do Lopap na
modulação da síntese de moléculas de matriz extracelular, visto que
muitos trabalhos têm reportado o envolvimento de lipocalinas em
processos de desenvolvimento, remodelamento e regeneração tecidual
(Rassart et al., 2000; Pagano et al., 2002, 2003).
Tendo em vista as limitações de obtenção do Lopap pelo processo de
expressão em E. coli BL21 estabelecido, este trabalho também teve a
proposta de implementar um processo de obtenção desta proteína na
forma recombinante (rLopap) em levedura, que fosse padronizado e
escalonável, visando a obtenção da proteína recombinante sem cauda de
poli-His, com enovelamento e atividade enzimática mais próximos da
proteína nativa, e melhor estabilidade. Desta forma, investimos na
clonagem, e expressão do rLopap em biorreator, utilizando sistema de
expressão em levedura metilotrófica Pichia pastoris (Cregg et al., 1985)
com vetor de expressão pPIC9k. Este vetor insere um peptídeo sinal na
seqüência de leitura do inserto recombinante, para que a proteína
expressa seja secretada na forma solúvel para o meio extracelular
(Cereghino e Cregg, 2000). A levedura P. pastoris tem se mostrado como
um sistema de expressão conveniente na produção de proteínas
recombinantes eucarióticas, inclusive com finalidade terapêutica
DISCUSSÃO 162
(Gellissen, 2000; Cereghino e Cregg, 2000), pois pode produzir proteínas
recombinantes muito similares à sua forma nativa (Chen et al., 2004).
Dentre as vantagens deste sistema pode-se citar a estabilidade da
transformação da levedura com o gene recombinante, pois o plasmídeo
linearizado se insere no DNA genômico da levedura, eliminando o risco de
perda plasmidial e a necessidade de novas transformações (Cereghino e
Cregg, 2000). Outras vantagens são o baixo custo relativo do processo de
produção, a facilidade de escalonamento, a composição química definida
do meio de cultura, e a realização de modificações pós-traducionais na
proteína recombinante como enovelamento, glicosilação e secreção para o
meio extracelular (Romanos, 1995; Nico-Farber et al., 1995; Cereghino e
Cregg, 2000; Macauley-Patrick et al., 2005; Jahic et al., 2006), que não
ocorrem em organismos procarióticos. Estas modificações pós-
traducionais ocorrem em sistemas celulares compartimentalizados
(Damasceno et al., 2007), e com a participação de proteínas
especializadas como chaperonas e a dissulfeto isomerase (Inan et al.,
2006; Gasser et al., 2007; Huo et al., 2007). Desta forma, um número
crescente de proteínas recombinantes tem sido obtido utilizando este
sistema, dentre estas, o fator de crescimento insulina-like (IGF),
antígenos vacinais da hepatite B e a albumina sérica humana (Gellissen,
2000; Kobayashi, 2006; Gurramkonda et al., 2009; Liu et al., 2009), além
de diversas enzimas (Cereghino e Cregg, 2000; Chen et al., 2004;
Macauley-Patrick et al., 2005; Lattard et al., 2006; Ali et al., 2007).
A expressão do rLopap em E. coli Origami foi realizada
paralelamente a obtenção do rLopap em P. pastoris, com o objetivo de
comparar propriedades como estabilidade e atividade específica de ambas
as proteínas. Com a metodologia utilizada, obtivemos a proteína
recombinante na forma solúvel, mas enzimaticamente inativa. O ambiente
citoplasmático menos redutor, que diferencia esta cepa de bactéria da E.
coli BL21 através expressão das enzimas tioredoxina redutase (trxB) e
glutationa redutase (gor) (Xiong et al., 2005), parece não ser ainda
DISCUSSÃO 163
suficiente para favorecer a obtenção do rLopap na forma enzimaticamente
ativa.
5.2 Obtenção do rLopap em Pichia pastoris
Os ativadores de protrombina descritos na literatura são, em sua
maioria, toxinas de venenos de serpentes, com atividade do tipo
metaloprotease ou serino protease (Kini et al., 2001). Várias destas
proteínas contêm muitos resíduos de cisteína e são altamente glicosiladas
(Kornalik e Blomback, 1975; Silva et al., 2003), o que dificulta a obtenção
de recombinantes enzimaticamente ativos. Além disso, o domínio
proteinase destas proteínas tem se mostrado instável, podendo sofrer
autólise (Fox e Serrano, 2005). Há muitos trabalhos na literatura
descrevendo a identificação, a classificação, a clonagem e o isolamento
destas proteínas (Yamada et al., 1997; Zhang et al., 1998; Hasson et al.,
2003; Modesto et al., 2005; Kini, 2005), mas poucos descrevem sua
obtenção na forma recombinante, como Filippovich et al. (2005), que
reportaram a expressão e purificação parcial de uma toxina FXa-like do
veneno de serpente da família Elapidae, classificada no grupo C de
ativadores de protrombina, utilizando sistema de expressão em células de
mamífero. Desta forma, o desenvolvimento de um processo de obtenção
do Lopap tem importância, tanto para pesquisa básica, quanto para
futuras aplicações biotecnológicas desta proteína.
Da mesma forma, apesar do veneno de L. obliqua ser composto por
diversas proteínas com uma ampla gama de atividades preditas através
de estudos transcriptômicos e proteômicos (Veiga et al., 2005; Ricci-Silva
et al., 2008), poucas proteínas nativas foram purificadas até o momento,
as quais envolveram várias etapas de purificação (Reis et al., 2001b;
Seibert et al., 2006; Alvarez Flores et al., 2006). A maioria dos estudos
publicados foi realizada com o extrato bruto das cerdas de L. obliqua
(Veiga et al., 2003; Castro Bastos et al., 2004; Silva et al., 2004; Ramos
et al., 2004; Gouveia et al., 2005; Bohrer et al., 2006; Pinto et al., 2006;
DISCUSSÃO 164
Pinto et al., 2008). Até o momento, o Lopap é a única toxina de L. obliqua
obtida na forma recombinante, para o qual foi utilizado sistema de
expressão em E. coli (rLopap E) (Reis et al., 2006). No entanto, como
discutido anteriormente, este sistema apresentou limitações quanto ao
refolding, estabilidade, reprodutibilidade do processo e atividade específica
da proteína recombinante, a qual foi obtida após purificação em coluna de
Ni-Sepharose, com rendimento variando de aproximadamente 1 a 3 mg/L
de meio de cultivo. Esta proteína (rLopap E) apresentou tendência de
precipitação em concentrações maiores que 0,2 mg/ml e em temperaturas
extremas (<20 °C e >37 °C), perdendo atividade inclusive após processo
de liofilização. O rLopap E apresentou baixa atividade específica (1800)
em relação à proteína nativa purificada a partir do extrato das cerdas de
L. obliqua (3000) (Reis, 2002), considerando-se os mesmos parâmetros e
metodologia para avaliação de atividade (AE: mAU405nm/min/mg) descritos
neste trabalho (item 3.8.1).
Conforme os resultados apresentados, neste trabalho,
desenvolvemos um processo de obtenção do rLopap, utilizando sistema de
expressão em P. pastoris (rLopap P). Este processo foi delineado,
utilizando tecnologias atuais e passíveis de escalonamento e
automatização, embora ajustes ainda necessitem ser realizados, e envolve
as etapas de: 1) fermentação com alta densidade celular, com fase de
batelada e batelada alimentada; 2) processamento (downstream) do meio
fermentado com fases de clarificação e concentração; 3) purificação do
rLopap por cromatografia líquida em duas etapas. O rLopap P obtido deve
apresentar estrutura tridimensional adequada, uma vez que foi observada
alta atividade específica sobre a protrombina (19800). Com o processo de
produção padronizado até o momento, conseguiu-se obter
aproximadamente 5 L de material fermentado livre de células, por cada
processo fermentativo com alta densidade celular de até 10 L. O
rendimento de proteína recombinante ativa recuperada ao final do
processo foi de aproximadamente 4 mg/L. Apesar de não se ter obtido
alta produtividade da proteína recombinante no processo, os resultados
DISCUSSÃO 165
são animadores, em vista da alta atividade específica e melhor
estabilidade apresentada pelo rLopap expresso em P. pastoris, e a
reprodutibilidade do processo. De acordo com os dados reportados na
literatura, não há uma uniformidade na produtividade da proteína
recombinante no sistema de expressão em levedura P. pastoris. A
recuperação da proteína recombinante varia, em geral, de microgramas a
gramas por litro de sobrenadante da cultura, dependendo da proteína que
está sendo expressa (Cereghino e Cregg, 2000; Macauley-Patrick et al.,
2005). Vários trabalhos têm reportado a obtenção de proteínas por este
sistema, em especial de enzimas, com rendimentos próximos ou menores
que o obtido para o rLopap neste trabalho (Guo et al., 1995; Rosenfeld et
al., 1996; Liao et al., 1996; Mozley et al., 1997; Morel e Massoulié, 1997;
Sun et al., 1997; Thomas e Crawford, 1998; Vandersall-Nairn et al.,
1998; Heimo et al., 1998; Nourizad et al., 2003).
Sabe-se que proteínas recombinantes obtidas em P. pastoris podem
apresentar diferentes padrões de glicosição com cadeias oligossacarídicas
de diversos tamanhos, constituídas principalmente por resíduos de
manose (Macauley-Patrick et al., 2005). Isto pode resultar da alteração da
massa molecular da proteína, observando-se, em muitos casos, diferentes
bandas da proteína no perfil eletroforético (Porres et al., 2002; Brucato et
al., 2002; Kamei et al., 2003). O diferencial de massa molecular da
proteína observado nos perfiz eletroforéticos das amostras analisadas nas
diferentes etapas de produção podem ser resultantes da glicosilação do
rLopap, assim como da formação de complexos desta proteína com outras
moléculas, ou da ocorrência de formas multiméricas do rLopap (dímeros,
trímeros, tetrâmeros). O tratamento das amostras com enzimas
deglicosilases, como a endoglycosidase H, poderá esclarecer esta questão.
Amostras com rLopap mostraram inicialmente uma tendência de
precipitação. Contudo, as condições experimentais que induziam à
instabilidade do rLopap foram investigadas e definidas a partir dos
resultados obtidos, permitindo assim a otimização do processo e a
obtenção da proteína na forma solúvel e ativa. Além disso, os testes de
DISCUSSÃO 166
estabilidade realizados com rLopap P, geraram uma série de informações
práticas relevantes a respeito das propriedades bioquímicas e biofísicas
desta molécula, por exemplo, a solubilidade dependente de concentração
salina, a atividade pH-dependente e a estabilidade em relação à
temperaturas. Após 2 h de incubação, foi observada apenas uma sutil
diferença de atividade entre amostras incubadas a 37 °C e nas demais
temperaturas, indicando que a atividade do rLopap é estável, por curtos
períodos de tempo, em uma faixa de temperatura compatível com a
temperatura corporal de animais, o que é um dado interessante para uma
aplicação in vivo.
Os ensaios em cultura de células endoteliais realizados
demonstraram que rLopap P também apresenta atividade citoprotetora de
forma semelhante à observada para o Lopap nativo. Estes resultados
abrem perspectivas para a realização de estudos futuros para esclarecer
aspectos quando ao mecanismo de ação do Lopap na modulação celular. A
avaliação do efeito do rLopap sobre o ciclo celular por técnicas de
citometria de fluxo, e das vias de sinalização de morte celular, utilizando
inibidores específicos, poderá contribuir para esclarecimento do
mecanismo da ação desta proteína em células.
5.3 Efeito do rLopap in vivo
Os acidentes com a lagarta Lonomia obliqua são caracterizados por
incoagulabilidade sanguínea e síndrome hemorrágica, devido à ação
procoagulante do veneno de L. obliqua (Prezoto et al., 2002; Zannin et
al., 2003; Chudzinski-Tavassi e Carrijo-Carvalho, 2006). O Lopap tem sido
proposto como a principal toxina envolvida nos efeitos do envenenamento
(Carrijo-Carvalho e Chudzinski-Tavassi, 2007), através de seu
envolvimento na coagulopatia de consumo com a geração de trombina e a
formação de microtrombos em vasos de pequeno calibre (Reis et al.,
1999; Reis et al., 2001a).
DISCUSSÃO 167
Neste trabalho, a atividade procoagulante do rLopap P foi avaliada
utilizando como modelo animal coelhos anticoagulados com enoxaparina.
O tratamento dos animais com o rLopap P confirmou que esta proteína
atua in vivo como um agente procoagulante, pois em baixas doses (1
µg/kg) o rLopap P foi capaz de reverter parcialmente a incoagulabilidade
sanguínea causada pela heparina de baixo peso molecular, conforme
observado através da redução do tempo de sangramento nestes animais.
A enoxaparina atua como anticoagulante potencializando o efeito da
antitrombina III, que é o inibidor endógeno da trombina e dos fatores IX e
X, e também através da ação inibitória direta sobre o fator Xa (Carter et
al., 2008). A princípio, o mecanismo pelo qual o Lopap reverte o efeito da
heparina é através da geração de trombina ativa no sistema, que
contrapõe a trombina que está sendo inibida pela ligação à antitrombina
III, e contorna a ação inibitória da enoxaparina sobre o fator Xa na
cascata de coagulação, pois age como ativador direto da protrombina em
lugar do FXa. O sulfato de protamina é o único medicamento antagonista
do efeito anticoagulante da heparina descrito na literatura até o momento
(Byun et al., 2000). Contudo, além dos efeitos colaterais indesejados, que
restringem seu uso a muitos pacientes, como hipotensão,
broncoconstrição e hipertensão pulmonar, este medicamento é pouco
efetivo para heparina de baixo peso molecular, que é mais utilizada pelas
vantagens sobre a heparina não-fracionada, pela maior facilidade de
administração e monitoramento nos pacientes (Hunt, 1998), sendo
necessário o uso de altas doses. Os dados obtidos até o momento
apontam o Lopap como um possível antagonista (indireto) a ser utilizado
no controle emergencial de sangramento decorrente da anticoagulação
com heparina de baixo peso molecular, com perspectivas de uso em
pacientes com problemas de coagulação ou que requeiram rápida
neutralização do efeito da terapia anticoagulante. Por exemplo, pode ser
útil para reverter altas doses de heparina administradas em pacientes
submetidos a cirurgias cardíacas.
DISCUSSÃO 168
Na literatura há diversos trabalhos focados na descoberta de novos
anticoagulantes (Turpie, 2007; Gross e Weitz, 2008; Haas, 2008), mas
poucos trabalhos têm sido focados no estudo de moléculas como
candidatos a medicamentos a serem utilizados para reversão da
incoagulabilidade induzida pelos anticoagulantes em uso (Chan et al.,
2003), por exemplo, para utilização em casos de sangramento durante
processos cirúrgicos (Warkentin e Crowther, 2002). Portanto, os
resultados obtidos abrem perspectivas, tanto quanto ao mecanismo de
ação do rLopap in vivo, quanto a uma nova aplicação terapêutica para
esta proteína.
5.4 Mapeamento peptídico do Lopap
Não há dados na literatura, relacionados ao mapeamento peptídico,
mutações sítio-dirigidas ou estudo de subunidades e/ou peptídeos
derivados de proteínas da família das lipocalinas, sendo direcionados ao
estudo dos motifs conservados característicos destas proteínas e o
compartilhamento de atividades biológicas comuns. A partir dos dados
obtidos do mapeamento peptídico dos motifs de lipocalina presentes na
seqüência primária do Lopap, através da obtenção de peptídeos sintéticos,
foi demonstrado que uma seqüência de sete aminoácidos, relacionada ao
motif 2, está envolvida na modulação da resposta celular, sendo
responsável pela atividade antiapoptótica do Lopap. Esta seqüência
corresponde à região coincidente entre os peptídeos sintéticos P2 e P4,
que apresentaram atividade citoprotetora em cultura de células
endoteliais, de forma semelhante ao Lopap, mas não apresentaram
atividade catalítica sobre a protrombina.
Diversas lipocalinas têm sido descritas com atividades
antiapoptóticas (Schubert et al., 1986; Berman et al., 1987; Taniike et al.,
2002; Tong et al., 2005; Iannetti et al., 2008), e alguns estudos tem
mostrado, de forma controversa, também efeitos proapoptóticos destas
proteínas (Maesaka et al., 2001; Yousefi e Simon, 2002), que, em certos
DISCUSSÃO 169
casos têm sido atribuídos a modificações pós-traducionais da proteína
(Ragolia et al., 2007). Os dados apresentados neste trabalho contribuem
para o esclarecimento destas questões, demonstrando que a atividade
antiapoptótica está estritamente ligada a uma seqüência de aminoácidos,
que deve corresponder, provavelmente, a uma “seqüência-assinatura”,
conferido propriedades biológicas comuns a diferentes lipocalinas. Desta
forma, é provável que lipocalinas antiapoptóticas desempenhem seus
papéis de citoproteção por um mecanismo semelhante.
Os resultados do alinhamento da seqüência dos peptídeos ativos
derivados do Lopap com seqüência de outras proteínas disponíveis em
bancos de dados dão suporte para esta hipótese. A partir destes dados,
poderão ser atribuídas funções para muitas proteínas hipotéticas de vários
organismos, que apresentaram alta similaridade com a seqüência de sete
aminoácidos envolvida na ação celular do Lopap. Além disso, o
alinhamento estrutural desta seqüência inserida do modelo da estrutura
tridimensional do Lopap com regiões correlacionadas nas lipocalinas
antiapoptóticas purpurina e prostaglandina D sintase, mostrou um padrão
semelhante assumido por estas “seqüências-assinaturas”. Da mesma
forma, a semelhança nas curvas de hidropaticidade, polaridade e
acessibilidade ao solvente de cada aminoácido da seqüência inserido na
estrutura terciária destas proteínas, reforça a proposta de que estas
proteínas promovem a citoproteção por um mecanismo semelhante. Os
baixos valores de acessibilidade ao solvente observados para a região
analisada sugerem que o mecanismo de ação não deve envolver
simplesmente a interação desta região com a superfície celular, mas
outros eventos devem ocorrer, como mudanças conformacionais
decorrentes de ligações proteína-proteína ou proteína-receptor e formação
de complexos moleculares, clivagem e/ou internalização da proteína.
A co-localização da seqüência de aminoácidos dos peptídeos ativos
derivados do Lopap com os resíduos de aminoácidos preditos na tríade
catalítica do Lopap, utilizando o modelo da estrutura terciária do Lopap
previamente descrito (Reis et al., 2006), assim a ausência de atividade
DISCUSSÃO 170
procoagulante nos peptídeos obtidos e a avaliação do efeito de inibidores
de serino protease sobre a atividade antiapoptótica de P2, indicam que a
atividade antiapoptótica do Lopap não é dependente e não está
relacionada à sua atividade enzimática. Em estudo semelhante, Liot et al.
(2006), demonstraram que a atividade antiapoptótica do ativador de
plasminogênio humano (tPA) ocorre de forma independente da sua
atividade proteolítica.
Os resultados obtidos com o tratamento do P4 em cultura de
fibroblastos e na derme de animais demonstraram funções anteriormente
desconhecidas do Lopap na modulação da expressão de proteínas de
matriz extracelular, cujo efeito pode ter envolvimento na promoção de
remodelamento e reparo tecidual. De fato, foi demonstrado recentemente
que o tratamento com o peptídeo P4 em modelo de lesão superficial
induzida na pele de ratos proporciona melhoria no reparo tecidual com o
correto remodelamento de fibras colágenas na derme destes animais,
diminuindo o tempo de reparo tecidual e inibindo a formação de quelóides
(Wlian, 2009). Estes dados são interessantes, pois demonstram um efeito
que não é comumente descrito para moléculas pró-coagulantes e outras
enzimas do tipo serino protease, que em geral degradam moléculas de
matriz extracelular (Lucena et al., 2006, 2008).
Os ensaios in vivo com o P4 foram realizados para investigar a
melhor forma de tratamento a fim de se obter um efeito sobre a síntese
de colágeno na derme. Vários esquemas de tratamento foram testados,
onde o P4 foi administrado localmente por via intradérmica em
camundongos e o aumento do colágeno da derme foi avaliado em
diferentes intervalos de tempo após o tratamento, com doses variadas,
cumulativas ou únicas. O aumento da expressão de colágeno foi
observado após o tratamento com baixas doses de P4, indicando que a
ação não é dose-dependente. Nos dados analisados, o tratamento mais
efetivo foi observado com a aplicação de duas doses cumulativas,
totalizando 0,6 µg do P4/animal, com aumento na fração de área de
colágeno após uma semana do tratamento que persistiu por todo o
DISCUSSÃO 171
período avaliado (aproximadamente três meses). Este efeito pode ser
devido ao aumento da síntese de colágeno por fibroblastos por indução
direta do P4. Outros mecanismos também têm sido relacionados ao
aumento de colágeno, como a inibição da degradação do colágeno por
metaloproteinases de matriz (Moon et al., 2005; Jurzak et al., 2008),
regulação gênica, ou modulação de fatores de crescimento (Bernstein e
Uitto, 1996). Os animais tratados com o peptídeo também foram
avaliados quanto a outros parâmetros indicativos de toxicidade e
alterações na hemostasia, mas não foi observada nenhuma alteração
evidente em relação aos grupos controle, tratados apenas com salina.
Estes dados sugerem que o peptídeo não apresenta toxicidade. Estes
resultados abrem perspectivas de uso para este peptídeo na área
cosmética/cosmecêutica, de modelagem e cicatrização tecidual, e em
disfunções que envolvam morte celular, de remodelamento e/ou perda de
colágeno.
5.5 Considerações finais
Um dos fatores limitantes para o estudo do Lopap era sua obtenção
na forma recombinante enzimaticamente ativa, por uma metodologia
passível de escalonamento. Os resultados obtidos neste projeto
permitiram este avanço no desenvolvimento desta molécula, sem cauda
de histidina, pela padronização do processo de obtenção em sistema
escalonável em leveduras. Por outro lado, a identificação da seqüência
peptídica envolvida na modulação da resposta celular, permitiu
desvincular esta atividade da atividade enzimática pela obtenção de um
peptídeo derivado, viabilizando também outra forma de obtenção, através
de síntese química, para aplicações exclusivamente dependentes de
resposta celular.
De forma geral, os ensaios realizados com peptídeos derivados do
Lopap forneceram dados que abrem perspectivas para o entendimento da
atividade, estrutura e mecanismos de ação celular de lipocalinas, em
DISCUSSÃO 172
especial do Lopap. Para L. obliqua, a seqüência identificada como
responsável pela ação do Lopap na modulação celular pode ter um papel
crucial em processos biológicos vitais para este inseto, como a
sobrevivência celular diante de situações de injúria e estresse e no
processo de metamorfose. A regulação endógena de apoptose na lagarta
pode ser crucial para garantir a sobrevivência de linhagens celulares
importantes para a fase seguinte do processo. Os dados apresentados
neste trabalho sugerem que a seqüência-assinatura identificada confere
uma propriedade conservada às lipocalinas, promovendo a ações na
modulação celular. Na molécula do Lopap, esta propriedade coexiste com
a atividade procoagulante, que aparentemente, não tem um papel
biológico em processos vitais da lagarta, mas pode corresponder a uma
especialização como mecanismo de defesa.
173
6 CONCLUSÕES
A metodologia utilizada permitiu a obtenção do rLopap na levedura
P. pastoris, com alta atividade específica, por um processo
escalonável e reprodutível;
O tratamento com o rLopap foi efetivo na diminuição do tempo de
sangramento em coelhos anticoagulados com enoxaparina;
A atividade procoagulante do Lopap foi desvinculada da atividade
antiapoptótica através da obtenção de peptídeos sintéticos
derivados da seqüência primária do Lopap;
Uma seqüência peptídica de sete aminoácidos foi identificada como
a região envolvida na ação do Lopap em células, promovendo a
sobrevivência celular e induzindo a síntese de proteínas de matriz
extracelular;
A seqüência peptídica identificada está presente em outras
lipocalinas e proteínas hipotéticas, as quais podem compartilhar
propriedades biológicas comuns.
174
*De acordo com: International Commitee of Medical Journal Editors. Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journal: Sample References. Available from: http://www.icmje.org [2007 May 22].
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APÊNDICE
Súmula Curricular
Patente
Chudzinski-Tavassi AM, Carrijo-Carvalho LC, Ventura JS, inventors. Peptide, compositions, and uses thereof. US patent application. 2008.
Artigos
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Capítulo de Livro
Chudzinski-Tavassi AM, Carrijo-Carvalho LC, Faria F, Alvarez Flores MP, Simons SM. Exogenous factors affecting hemostasis: therapeutic perspectives and biotechnological approaches. In: de Lima ME, Pimenta AMC, Martin-Eauclaire MF, Zingali RB, Rochat H. editors. Animal toxins: state of the art. Perspectives in health and biotechnology. Belo Horizonte: UFMG; 2009. p. 495-523.
Co-autoria em 14 resumos apresentados em Reuniões Científicas Internacionais e 12 resumos em Reuniões Científicas Nacionais.