UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO
PAULO CÉSAR ARANTES
EFEITO CRÔNICO DE ESTERÓIDES ANABÓLICOS SOBRE AS
CORRENTES ICa,L E Ito E A MOBILIZAÇÃO DE CÁLCIO EM MIÓCITOS
VENTRICULARES DE RATOS
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO
DE JANEIRO VISANDO À OBTENÇÃO DO GRAU DE
MESTRE EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – FISIOLOGIA
Rio de Janeiro 2014
PAULO CÉSAR ARANTES
EFEITO CRÔNICO DE ESTERÓIDES ANABÓLICOS SOBRE AS
CORRENTES ICa,L E Ito E A MOBILIZAÇÃO DE CÁLCIO EM MIÓCITOS
VENTRICULARES DE RATOS
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Fisiologia)
Orientador: Jose Hamilton Matheus Nascimento
Professor Associado do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Co-orientadora: Cristiane del Corsso
Professor Associado do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Rio de Janeiro 2014
FICHA CATALOGRÁFICA
Efeito Crônico de Esteróides Anabólicos Sobre a Corrente ICa,L e Ito e a Mobilização de Cálcio em Miócitos Ventriculares / Paulo César Arantes. Rio de Janeiro. UFRJ / IBCCF, 2014.
Dissertação (Mestrado em Fisiologia) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Pós-Graduação em Fisiologia, 2014. Orientador: José Hamilton Matheus Nascimento Co-orientadora: Cristiane del Corsso 1. Eletrofisiologia Cardíaca. 2. Decanoato de Nadrolona. 3. Corrente de Cálcio – Teses. I. Nascimento, José Hamilton Matheus (Orientador). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho IBCCF. III. Titulo: Efeito Crônico de Esteróides Anabólicos Sobre a Corrente ICa,L e Mobilização de Cálcio em Miócitos Ventriculares
CDD: Paulo César Arantes
EPÍGRAFE
“A fisiologia é, na verdade, uma explicação da vida. Quem, seja um teólogo, um jurista, um doutor, um físico, sabe mais do que você, um fisiologista, sobre a vida? Que outro assunto é mais fascinante, mais excitante, ou mais belo do que a vida?”
Physiology, a Beauty and a Philosophy. Guyton, 1975.
DEDICATÓRIA
Especialmente à minha família e minha namorada pelo apoio e compreensão dos momentos de ausência e desespero ao longo destes 2 anos.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente quero agradecer a Deus por me conceber o dom da vida
e por estar comigo a cada passo que eu dou em minha carreira.
Agradeço à minha mãe, Maria Lucia Arantes, por todo carinho, amor e
dedicação, estando sempre disposta a me ajudar nos momentos mais difíceis,
e com seu temperamento forte e um pouco de rigidez educacional me fez um
filho mais educado. Ao meu pai, António Clarete Arantes, sempre presente
transmitindo além de seu amor, muita confiança, respeito e calma mesmo em
meio às dificuldades. À minha irmã e ao meu irmão, Ana Clara Maria Arantes e
Emerson Clayton Arantes, pela cumplicidade, amizade e pelas muitas brigas,
cujos motivos nunca me lembro. Aos meus avôs, meus tios e tias por ajudarem
em minha criação, ajudando a construir as bases morais que regem minha
vida, pelos momentos fraternos vividos, pelos conselhos, amor, carinho e
dedicação e até mesmo pelas discussões. Enfim, agradeço a todos os meus
familiares que contribuem para minha formação e me dão forças para seguir
lutando a cada dia.
Agradeço a meus amigos sinceros pelos momentos de alegria nos quais
compartilhamos muitas risadas, estórias, longas conversas, conselhos e acima
de tudo agradeço pelo companheirismo, dedicação e respeito e pelo imenso
privilégio de suas companhias. Agradeço a cada dia pelo apoio de meus
amigos, pois rico é aquele que tem amigos, estes corroboram para a formação
de um Paulo melhor. Particularmente, agradeço ao Voltaço, Dudu, Fernando,
Estefani, Luana, Camila, Fred, André.
Agradeço principalmente à minha namorada Camila pelo apoio, amor,
carinho e compreensão, estando sempre ao meu lado.
Ao meu orientador, José Hamilton Matheus Nascimento, pela
dedicação ao projeto, pelos conselhos, pela base do pensamento científico e
pela imensa compreensão na difícil tarefa que é conciliar um curso de biofísica
com o desenvolvimento da pesquisa no laboratório. E a professora Cristiane
como coorientadora e professora, por ajudar a agregar a meu conhecimento
cientifico.
Enfim, aos amigos do Laboratório de Eletrofisiologia Cardíaca Antônio
Paes de Carvalho: Leo, Mara, Manu, Thais, Aina, Jamil, Pedro, Edila e
Dahienne
Agradeço a meus colegas de trabalho que estão dispostos a ajudar caso
seja necessário.
Por fim, agradeço a todos que contribuíram para a realização desse
trabalho. Muito obrigado pelo apoio de familiares, amigos e colegas de
trabalho.
E aos doutores formados pelo laboratório ao longo destes anos que
contribuíram muito com belíssimas discussões científicas, parcerias em
experimentos, além de FeSBEs e cervejas às sextas após o trabalho. E ao
professor Emiliano Medei, sempre disposto a colaborar em nosso crescimento
acadêmico e científico.
RESUMO
ARANTES, Paulo César. Efeito crônico de esteróides anabólicos sobre as
correntes ICa,L e Ito e a mobilização de cálcio em miócitos ventriculares de
ratos. Rio de Janeiro, 2014. Dissertação (Mestrado em Ciências - Fisiologia) -
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro, 2014.
Esteroides anabólicos (EAs) são derivados sintéticos da testosterona utilizados
ilicitamente por atletas e não atletas, em doses supra-fisiológicas, para
promover ganho de massa muscular, força e resistência ou para fins estéticos.
Os EAs causam efeitos colaterais, dentre eles alterações cardiovasculares,
como hipertensão arterial, hipertrofia cardíaca, arritmias e infarto do miocárdio.
Este estudo objetivou investigar o remodelamento elétrico cardíaco e sua
repercussão no acoplamento excitação-contração, induzido pela administração
crônica de EAs. Ratos sedentários foram administrados por 8 semanas com 10
mg/kg/sem. (i.m.) de decanoato de nandrolona (Deca) ou veículo (Ctrl). Na
avaliação dos parâmetros de repolarização ventricular, o grupo Deca
apresentou aumento do intervalo QT (70,50 ± 2,70 ms vs Ctrl: 59,58 ± 1,16 ms,
N=6, p<0,001) e QTc (179,9 ± 6,79 ms vs Ctrl: 149,87 ± 3,14 ms, N=6,
p<0,001), sem alteração da frequência cardíaca; aumento na duração do
potencial de ação a 30% (15,9 ± 0,36 mV, N=10 vs Ctrl: 8,9 ± 0,27 mV, N=11;
p<0,001) e a 90% (124,4 ± 3,86 mV, N=10 vs Ctrl: 58,4 ± 1,81mV, N=11;
p<0,001) da repolarização máxima; e aumento da triangulação do potencial de
ação (108,5 ± 3,73 mV, N=10 vs Ctrl: 49,5 ± 1,75 mV, N=11; p<0,001). A
amplitude de Ito nas camadas endocárdica (60 mV: 8,7 ± 0,71 pA/pF, N=5 vs.
Ctrl: 16,0 ± 2,07 pA/pF, N=13; p<0,05) e epicárdica (60 mV: 10,2 ± 1,00 pA/pF,
N=4 vs Ctrl: 20,9 ± 1,86 pA/pF, N=13; p<0,001) do ventrículo esquerdo foi
menor, enquanto a amplitude da ICa,L (10 mV: -10,4 ± 1,44 pA/pF, N=17 vs Ctrl:
-7,7 ± 0,48 pA/pF, N=36; p<0.01) foi maior no grupo Deca. Na avaliação do
acoplamento excitação-contração, as medidas de tensão isométrica em fibra
cardíaca desnuda mostraram que o grupo Deca desenvolve maior tensão nos
pCa 6,0; 5,6; e 4,8 (pCa 6: 10,65 ± 1,93 mN/mm2 vs Ctrl: 2,48 ± 1,02 mN/mm2;
N=5, p<0,001) e maior sensibilidade ao Ca2+ (pCa50%: 6,1± 0,05 vs Ctrl: 5,8 ±
0,06 p<0,01; slope: -57,1 ± 12,6 vs Ctrl: -24.4 ± 4,3 mN/mm2, p<0,05). O grupo
Deca apresentou menor resposta contrátil a diferentes concentrações de
cafeína após tempo fixo (3 min) de carregamento de Ca2+ (5 mM de cafeína: 19
± 8%, N=5 Deca vs Ctrl: 52 ± 6 %, N=4, p<0,001) e a 20 mM de cafeína após 1,
3 e 5 min de carregamento do reticulo sarcoplasmático (1min: 16 ± 8% vs Ctrl:
40 ± 7%, N=5 cada, p<0,001). Concluímos que a administração crônica com
decanoato de nandrolona causou remodelamento elétrico cardíaco nas
amplitudes de ICa,L e Ito, que refletiram no acoplamento excitação-contração,
causando menor mobilização e maior sensibilidade ao Ca2+.
ABSTRACT
ARANTES, Paulo César. Chronic effect of anabolic steroids on ICa,L and Ito
currents and calcium mobilization in ventricular myocytes. Rio de Janeiro,
2014. Dissertação (Mestrado em Ciências - Fisiologia) - Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,
2014.
Anabolic steroids (ASs) are synthetic derivatives of testosterone illicitly used by
athletes and non-athletes at supra-physiological doses, to promote muscle
mass gain, strength and resistance or even for an esthetic purpose. The ASs
cause side effects, among them cardiovascular changes, such as arterial
hypertension, cardiac hypertrophy, arrhythmias and myocardial infarction. This
study aimed to investigate the cardiac electrical remodelling and its
repercussion on excitation-contraction coupling induced by chronic
administration of ASs. Sedentary rats were administrated for 8 weeks with 10
mg/kg/week of nandrolone decanoate (Deca) or vehicle (Ctrl). Assessing
ventricular repolarization parameters, the Deca group showed an increase in
the QT (70.50 ± 2.70 ms vs. Ctrl: 59.58 ± 1.16 ms, N=6, p<0.001) and QTc
(179.9 ± 6.79 ms vs. Ctrl: 149.87 ± 3.14 ms, N=6, p<0.001) intervals, without
changes in heart rate; an increase in the duration of the action potential at 30%
(15.9 ± 0.366 mV, N=10 vs. Ctrl: 8.9 ± 0.27 mV, N=11; p<0.001) and 90%
(124.4 ± 3.86 mV, N=10 vs. Ctrl: 58.4 ± 1.81 mV, N=11; p<0.001) of the
maximum repolarization; and increased triangulation of the action potential
(108.5 ± 3.73 mV, N=10 vs. Ctrl: 49.5 ± 1.75 mV, N=11; p<0.001). Ito amplitude
in the endocardial (60 mV: 8.7 ± 0.71 pA/pF, N=5 vs. Ctrl: 16.0 ± 2,07 pA/pF,
N=13; p<0.05) and epicardial (60 mV: 10.2 ± 1.00 pA/pF, N=4 vs. Ctrl: 20.9 ±
1.86 pA/pF, N=13; p<0.001) layers of the left ventricle were lower while the ICa,L
amplitude (10 mV: -10.4 ± 1.44 pA/pF, N=17 vs. Ctrl: -7.7 ± 0.48 pA/pF, N=36;
p<0.01) was higher in the Deca group. The evaluation of excitation-contraction
coupling, showed that the measures of isometric tension in denuded cardiac
fiber was greater in Deca group in pCa 6.0; 5.6; and 4.8 (pCa 6: 10.65 ± 1.93
mN/mm2 vs. Ctrl: 2.48 ± 1.02; mN/mm2; N=5, p<0.001), which also shows a
greater sensitivity to Ca2+ (pCa50%: 6.1 ± 0.05 vs. Ctrl: 5.8 ± 0.06 p<0.01; slope:
-57.1 ± 12.6 vs. Ctrl: -24.4 ± 4.3 mN/mm2 p<0.05). Deca group showed lower
contractile response to different concentrations of caffeine after 3 min of loading
time (5 mM of caffeine: 19 ± 8%, N=5 Deca vs. Ctrl: 52 ± 6 %, N=4, p<0.001)
and to 20 mM caffeine after 1, 3 and 5 min of reticulum sarcoplasmic loading
times (1 min: 16 ± 8%, vs. Ctrl: 40 ± 7%, N=5 each, p<0.001). We conclude that
the chronic administration of nandrolone decanoate caused cardiac electrical
remodelling and that changes in the amplitudes of ICa,L and Ito were reflected in
excitation-contraction coupling, causing lower mobilization and increased
sensitivity to Ca2+.
LISTA DE ABREVIATURAS e SIGLAS
AMPc : Adenosina monofosfato cíclico
ATP: Adenosina trifosfato
CaMKII : Ca2+ Calmodulina dependente de proteína cinase II
COB: Comitê Olímpico Brasileiro
Ctrl: controle
CREB: Elemento responsivo à ligação do AMPc
Deca: decanoato de nandrolona
DNA: Ácido desoxirribonucléico
DPA: duração do potencial de ação celular
DPA 30: duração do potencial de ação medido a 30% da repolarização
DPA 90: duração do potencial de ação medido a 90% da repolarização
ECG: eletrocardiograma
EGTA : Etilenoglicol-bis(2aminoetilèter)-N,N,N’,N’- tetraacético
ERK : Cinase de regulação extracelular
FC: freqüência cardíaca
GTP: guanosina trifosfato
G: Giga Ohms
HEPES: ácido 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico
HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana
I/V: relação corrente/voltagem
ICa: corrente de cálcio
IK: corrente de potássio retificadora retardada
IK1: corrente de potássio retificadora de influxo
IK,Ach: corrente de potássio retificadora de influxo ativada por acetilcolina
IK,ATP: corrente de potássio retificadora de influxo ativada por ATP
IKr: corrente de potássio retificadora retardada de componente rápido
IKs: corrente de potássio retificadora retardada de componente lento
INa: corrente de sódio
Ito: corrente transiente de saída de potássio
Kv: isoforma predominante da subunidade α da corrente IK
KB: Kraft-Brühe
MAPK: proteína cinase ativada por mitógeno
N: número de animais ou células do experimento
NIDA: National Institute on Drug Abuse
PA: potencial de ação
PKA: proteína cinase dependente de AMPc
PI3K : fosfoinositídeo 3-cinase
QTc: intervalo QT corrigido pela frequência cardíaca
QTd: dispersão do intervalo QT do eletrocardiograma
RS: retículo sarcoplasmático
TdP: Torsade de pointes
TEA-Cl: cloreto de tetraetilamônio
V1/2 : voltagem correspondente à metade da ativação ou inativação
Vh: potencial holding, no qual a célula é mantida para estudo eletrofisiológico
LISTA DE FIGURAS
1 Biossíntese e metabolismo de esteróides endógenos. 5
2 Estrutura molecular da testosterona e do decanoato de nandrolona. 7
3 Esquema das vias de sinalização ativadas por hormônios esteróides. 8
4 Relação entre o eletrocardiograma (ECG), o potencial de ação
ventricular (PA) e arritmias ventriculares.
11
5 Esquema ilustrativo da cuba experimental. 21
6 Esquema ilustrativo do protocolo para avaliação da permeabilização
do feixe de fibras cardíacas, da integridade das proteínas contráteis e
do retículo sarcoplasmático.
23
7 Esquema ilustrativo do protocolo para a avaliação da captação de
Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático.
24
8 Esquema ilustrativo do protocolo para a avaliação da liberação de
Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático.
25
9 Esquema ilustrativo do protocolo para a avaliação da liberação de
Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático.
26
10 Efeito da administração crônica de decanoato de nadrolona sobre a
massa corporal (g) ao longo de 8 semanas de tratamento.
27
11 Peso do coração absoluto e relativo. 28
12 ECG representativo Ctrl e Deca (A), frequência cardíaca (B), intervalo
QT (C) e intervalo QT corrigido pela frequência cardíaca (D).
29
13 Traçados representativos de potenciais de ação. 30
14 Potencial de repouso e amplitude do potencial de ação 31
15 Duração do potencial de ação a 30% e 90% da repolarização máxima. 31
16 Relação corrente/voltagem de ICa,L. 33
17 Curva de dependência de voltagem da ativação de ICa,L. 34
18 Curva de dependência de voltagem da inativação steady-state de ICa,L 35
19 Curva de recuperação da inativação de ICa,L. 36
20 Ito em células da camada subepicárdica e relação corrente/voltagem
de Ito.
37
21 Ito em cardiomiócitos da camada subendocárdica e relação
corrente/voltagem de Ito.
38
22 Curva de dependência de voltagem da inativação steady-state de Ito. 39
23 Resposta contrátil à cafeína em diferentes tempos de carregamento
do RS.
40
24 Resposta contrátil à diferentes concentrações de cafeína. 41
25 Tensão isométrica em fibra cardíaca desnuda em diferentes pCa. 42
26 Tensão isométrica em fibra cardíaca desnuda em diferentes pCa e
sensibilidade (pCa50% e slope).
43
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composição das soluções W e R utilizadas nos experimentos
com fibras desnudas.
20
Tabela 2 Composição das soluções de pCa utilizadas nos experimentos
com fibras desnudas.
22
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
2
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.6.1
3.6.2
3.7
4
4.1
4.2
Abuso de esteróides anabólicos
Efeitos colaterais do consumo abusivo de esteróides anabólicos
Uso clínico de esteróides anabólicos
Testosterona
Esteróides Anabólicos
Decanoato de Nandrolona
Mecanismos de Ação
Bases Eletrofisiológicas
OBJETIVOS
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais
Tratamento
Registro eletrocardiográfico in vivo
Registro intracelular do potencial de ação
Correntes iônicas
Avaliação da regulação de Ca2+ intracelular
Captação e liberação de Ca2+ pelo RS
Função contrátil e sensibilidade ao Ca2+
Análise estatística
RESULTADOS
Biometria
Efeito do tratamento crônico com decanoato de nandrolona sobre a
1
2
4
4
5
6
7
8
14
15
15
15
15
16
17
20
22
25
26
27
27
28
4.3
4.4
4.5
4.6
4.6.1
4.6.2
5
6
7
8
frequência cardíaca e intervalo QT
Efeito do tratamento crônico com decanoato de nandrolona sobre o
potencial de ação ventricular
Efeito do tratamento crônico com decanoato de nandrolona sobre a
corrente de Ca2+ tipo L
Efeito do tratamento crônico com decanoato de nandrolona sobre a
corrente transiente de efluxo de K+ (Ito)
Efeito do tratamento crônico com decanoato de nandrolona sobre a
regulação do Ca2+ intracelular
Captação e liberação de Ca2+ intracelular pelo RS
Função contrátil e sensibilidade ao Ca2+
DISCUSSÃO
CONCLUSÃO
PERSPECTIVAS PARA O DOUTORADO
REFERÊNCIAS
29
32
36
39
40
41
44
50
51
52
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Abuso de esteroides anabólicos
A busca pela vitória, seja em guerras ou em competições esportivas, veio a
estimular a busca por melhora do desempenho de alto rendimento, tanto de
soldados quanto de atletas. Visando-se aumentar o desempenho físico, substâncias
estimulantes e anabólicas foram e ainda são desenvolvidas e consumidas (De Rose,
2008).
Os chineses, há 4 mil anos, conheciam os efeitos do chá da planta chamada
“machuang”, que continham efedrina (um estimulante, não esteroidal) em altas
doses e era utilizada para aumentar a capacidade de trabalho. Nos primeiros jogos
olímpicos da Era Moderna já havia relatos do uso de estimulantes (Correia, 2009).
Após a Segunda Guerra Mundial, as anfetaminas e os esteroides anabólicos
tornaram-se as principais drogas de abuso entre atletas. O mais antigo relato de
abuso de esteroide anabólico data do ano de 1954, tendo sido documentado em
atletas soviéticos (De Rose, 2008). Os esteroides anabólicos, dentre outras
substâncias, são consideradas substâncias proibidas pelo Código Mundial
Antidoping e classificadas como doping (COB, 2012).
O uso de esteroides anabólicos se destacou principalmente no meio
esportivo, devido às propriedades anabólicas que promovem o aumento de massa
muscular, do desenvolvimento de força, da velocidade de recuperação da
musculatura, a diminuição da gordura corporal e o aumento da eritropoiese,
melhorando o desempenho físico (Evans, 2004).
A dosagem utilizada no consumo abusivo de esteroides anabólicos é de 10 a
100 vezes superior à dose terapêutica, sendo tomada por um período de 4 a 18
semanas, seguida por um período de descanso variável de 1 a 12 meses. Os
esteroides anabólicos podem ser utilizados por via oral ou intramuscular
dependendo do anabólico em questão. O ciclo de uso mais comum é o piramidal
que consiste no aumento gradual da dose e da frequência do esteroide anabólico
até se atingir o pico, depois do pico ocorre o processo inverso, há a diminuição
gradual da droga (Hall, 2005; NIDA, 2006). O decanoato de nandrolona é um dos
principais esteroides anabólicos de usados ilicitamente (NIDA, 2006).
2
Segundo levantamento da NIDA (National Institute on Drug Abuse), em
2013, o percentual de estudantes americanos que fizeram uso de esteroides
anabólicos ao menos uma vez foi de 1,1 % na 8ª série, 1,3 % na 10º série, e 2,1 %
na 12º série (NIDA; 2014). Outra estimativa do uso de esteroides anabólicos nos
Estados Unidos mostrou que há mais de 3 milhões de usuários e que 2,7-2,9% dos
adultos jovens já utilizaram esteroides anabólicos ao menos uma vez na vida
(Evans, 2004). Entre praticantes de exercícios em academias, o número de usuários
varia de 15 e 30% (Evans, 2004). Há também os usuários de esteroides anabólicos
que não são atletas, e consomem esteroides com fins recreacionais e estético. Entre
adolescentes americanos, estima-se que 3% a 12% dos jovens e 0,5% a 2% das
jovens já fizeram uso de esteroides anabólicos (Evans, 2004). O número crescente
de usuários de esteroides anabólicos pode se tornar um problema de saúde publica
em médio prazo, devido aos efeitos colaterais decorrentes do abuso destas drogas
(Evans, 2004). Entre estudantes europeus, dados levantados recentemente pelo
Projeto ESPAD (Andersson et al., 2007) apontam prevalência de 2 a 3% para o
abuso de esteroides anabólicos.
No Brasil, alguns dados já mostraram o uso de esteroides anabólicos por
jovens, sendo que em um levantamento realizado entre estudantes da área da
saúde da Universidade Federal do Amazonas, em Manaus, estimou prevalência de
2,1% para o abuso de esteroides anabólicos durante a vida (Lucas et al. 2006).
Resultados similares foram encontrados por Canuto et al. (2006), os quais
estimaram ser de 2,7% a prevalência entre calouros da Universidade Federal de
Goiás, em Goiânia. Em São Paulo estima-se que entre os praticantes de atividade
físicas nas academias 19% fazem ou fizeram uso de esteroides anabólicos (Silva e
Moreau, 2003). Assim, tanto internacionalmente quanto no âmbito nacional podemos
ver que o abuso de esteroides anabólicos torna-se um problema de saúde pública,
devido os seus efeitos colaterais.
1.2. Efeitos colaterais do consumo abusivo de esteroides anabólicos
Os efeitos colaterais do abuso dos esteroides anabólicos são muitos,
normalmente relacionado à estimulação excessiva dos alvos da testosterona. No
3
homem, o abuso dessas substâncias pode promover uma inibição do eixo
hipotálamo – hipófise – gônadas, devido à retroalimentação negativa causada pelas
elevadas concentrações de andrógenos exógenos, diminuindo as concentrações do
hormônio luteinizante (LH) e folículo estimulante (FSH). A diminuição desses
hormônios leva à supressão da produção endógena de andrógenos nos testículos e
consequentemente, a casos de hipogonadotrofismo, impotência sexual, atrofia
testicular e alterações na quantidade e mobilidade do esperma (Bickelman et al.,
1995; Bahrke e Yesalis, 2004; Evans, 2004). Nas mulheres, ocorrem efeitos
masculinizantes, com aumento de pelos faciais, engrossamento de voz, redução do
volume dos seios, diminuição do índice de gordura corporal, hipertrofia do clitóris,
ginecomastia, perda de cabelo (calvície) e hirsutismo (Evans, 2004; Maravelias et
al., 2005). No sistema músculo-esquelético, o abuso de esteroide anabólico pode
levar à maior ocorrência de lesões músculo-tendinosas, por aumentar a rigidez dos
tendões em conseqüência da diminuição da produção de elastina. Se consumido por
jovens em idade pré-púbere, pode induzir o fechamento epifisário precoce, levando
à baixa estatura permanente (Strauss & Yesalis, 1991; Evans, 2004). Na pele, o
abuso de esteroides anabólicos está associado a acnes, dermatites, aumento da
oleosidade da pele e dos cabelos, icterícia, estrias, calvície masculina (alopecia)
(Evans, 2004). Os esteroides anabólicos podem induzir o aumento de enzimas
hepáticas, como alanina e asparagina-aminotransferases, lactato desidrogenase,
dentre outras. Adicionalmente, podem induzir o surgimento de tumores malignos e
benignos no fígado. O hepatocarcinoma tem sido associado a esteroides como
oximetalona e metil–testosterona (Maravelias et al., 2005).
O abuso de esteroides anabólicos tem sido associado a efeitos psicológicos,
tais como, depressão, alterações de humor agressividade, além de síndromes
afetivas e psicóticas (Bahrke e Yesalis, 2004). Os efeitos negativos do abuso de
esteroides anabólicos no sistema cardiovascular são muitos, dentre eles podemos
citar: hipertrofia ventricular, hipertensão arterial, disfunção diastólica, dislipidemia,
arterosclerose, trombose, vasoespasmo, insuficiência cardíaca, infarto agudo do
miocárdio, cardiomiopatia, arritmias ventriculares e morte súbita (Fineschi et al.,
2001; Evans, 2004; Hartgens et al., 2004; Fineschi et al., 2007; Bispo et al., 2009;
Van Amsterdam et al., 2010). É definida como morte súbita cardíaca a morte por
causa cardíaca (taquiarritmia/fibrilação ventricular, assistolia ou evento de origem
4
não arrítmica), que ocorra fora do ambiente hospitalar, subitamente, ou em um
período igual ou menor que uma hora a partir do aparecimento de sintomas
(Goldberger et al., 2008). Dentre os distúrbios anteriormente citados, as arritmias
ventriculares são um dos principais fatores que podem levar à morte súbita. Há
vários relatos de casos de usuários que faziam uso abusivo de esteroides
anabólicos e morreram por morte súbita cardiaca. A análise histopatológica, após o
óbito, encontrou hipertrofia ventricular, com remodelamento morfológico; intensa
deposição de colágeno, que pode levar a distúrbios de condução elétrica gerando
arritmias e diminuição da complacência (Fineschi et al., 2007; Montisci et al., 2012).
1.3. Uso clínico de esteroides anabólicos
Os diversos efeitos benéficos da testosterona levaram à produção de
análogos sintéticos com fins terapêuticos, visando potencializar os efeitos
anabólicos. Inicialmente, o uso de esteroides anabólicos, em doses terapêuticas, foi
aplicado em tratamentos clínicos de doenças, como anemia, osteoporose e hepatite
alcoólica, e no tratamento de traumas e queimaduras. Atualmente há uma variedade
de aplicações clinicas para o uso dos esteroides, tais como reposição hormonal em
homens com baixos níveis hormonais ou com idade mais avançada, para ganho de
força muscular e aumento da densidade óssea em pacientes com caquexia
secundária ao HIV, e em doenças crônicas diversas, tais como a cirrose hepática,
insuficiência renal crônica e câncer (Basaria et al., 2002; Evans, 2004).
1.4. Testosterona
A testosterona é o principal hormônio sexual masculino produzido nos
testículos, sendo classificada como andrógeno devido aos seus efeitos
masculinizantes. Os andrógenos são hormônios esteroides normalmente
sintetizados a partir do colesterol que é sintetizado a partir da acetilcoenzima A
(Figura 1). A testosterona circula no sangue ligada a proteínas plasmáticas, como a
albumina e a β-globulina permanecendo na circulação por alguns minutos ou
algumas horas. Uma parte da testosterona que permeia os tecidos é convertida em
5
um metabólito mais ativo, a 5α-diidrotestosterona, pela enzima 5α-redutase (Figura
1). A testosterona livre pode ser degradada rapidamente no fígado em androsterona
e desidroepiandrosterona, e conjugada com glicuronídeos ou sulfatos para serem
excretados na bile ou na urina (Guyton, 2006).
Fig 1. Biossíntese e metabolismo de esteróides endógenos (Marques et al., 2002).
1.5. Esteroides Anabólicos
Os esteroides anabólicos sintéticos definem-se como substâncias análogas
à testosterona, obtidas a partir de modificações em sua estrutura molecular, visando
à potencialização de seus efeitos anabólicos, aliada à redução dos efeitos
androgênicos. Em geral, é descrito que os esteroides anabólicos sintéticos são
capazes de apresentar maior resistência à metabolização, em comparação à
testosterona (Strauss & Yesalis, 1991). Os andrógenos têm várias funções
fisiológicas importantes no desenvolvimento humano. Inicialmente no
6
desenvolvimento da genitália externa masculina (pênis, uretra, escroto) e dos ductos
de Wolff (epidídimo, canal deferente, vesículas seminais, ductos ejaculatórios). Nos
homens, durante a puberdade a produção de andrógenos aumenta, levando ao
crescimento dos órgãos sexuais e no aparecimento das características sexuais
secundárias, como crescimento de pêlos (púbicos, axilares, no rosto, podendo
aparecer em outras regiões), engrossamento da voz, crescimento ósseo,
crescimento muscular, aumento da atividade das glândulas sebáceas e ação no
sistema nervoso central, aumentando a libido e a agressividade. Além disso, os
andrógenos exercem funções em outros tecidos do corpo como tecido adiposo,
hepático, renal e sistemas hematopoiético, imune e nervoso (Kicman, 2008).
1.6. Decanoato de Nandrolona
A nandrolona (19-nortestosterona; IUPAC: 17 α-Hidroxi-4-estren-3-ona) é
um dos mais populares esteroides anabólicos. A síntese laboratorial da nandrolona
foi inicialmente descrita no ano de 1950 por Birch, tendo sido resintetizada em 1953
por Wilds e Nelson (Shahidi, 2001; Bricout e Wright, 2004). A nandrolona é obtida a
partir da remoção do radical metil da posição 19 da molécula de testosterona. Isso
torna a nandrolona mais resistente à metabolização e à aromatização, e aumenta a
afinidade do receptor andrógeno pela molécula (Kuhn, 2002; Shahidi, 2001). No
entanto, contrariamente ao que ocorre com a testosterona, a 5α-redução da
nandrolona reduz a afinidade do receptor androgênico pela molécula (Bergink et al.,
1985). Tal fato explica o potente efeito da nandrolona em tecidos desprovidos de
atividade da 5α-redutase, como é o caso do tecido muscular, e o efeito reduzido nos
tecidos com alta atividade da 5α-redutase, como na próstata. A nandrolona, assim
como a testosterona, é metabolizada no fígado, sendo os seus principais metabólitos
a 19-norandrosterona (19-NA), 19-noretiocolanolona (19-NE) e 19-
norepiandrosterona (19-NEA) (Bricout e Wright, 2004).
Todos os esteroides anabólicos possuem tanto a ação andrógena quanto a
anabólica. A diferença é que alguns são mais seletivos a uma determinada ação. A
testosterona tem razão anabólica:andrógena = 1. O decanoato de nandrolona (Deca)
apresenta razão igual a 10, enquanto em outro anabólico, o estanozolol, a razão é
7
30. Os esteroides são mais comumente usados por via oral (esteroides derivados da
testosterona devido à 17α-alcalinização) ou intramuscular (esteroides derivados da
testosterona devido à 17α-esterificação). A nandrolona é administrada por via
intramuscular (Kunh, 2002).
A nandrolona é comercializada, principalmente sob a forma de seu éster
decanoato (decanoato de nandrolona, Deca Durabolin®; fórmula empírica: C28H44O3;
peso molecular: 428,65). No Brasil a Deca é vendida diluída em um veículo oleoso,
sendo que a composição do veículo é de 90% de óleo de amendoim / 10% de álcool
benzílico. A figura 2 ilustra a estrutura molecular da testosterona e do decanoato de
nandrolona.
Figura 2. Estrutura molecular da testosterona e do decanoato de nandrolona, os traços em vermelho
indicam onde a testosterona foi modificada à decanoato de nandrolona (Modificado de Shahidi, 2001).
1.7. Mecanismos de Ação
O mecanismo clássico de ação dos esteroides anabólicos é a ação
genômica. Quando nos tecidos, eles atravessam a membrana plasmática e se ligam
ao seu receptor andrógeno no citoplasma, sendo o complexo hormônio-receptor
translocado ao núcleo, onde interage com o DNA, ligando a região promotora de
genes-alvo e, consequentemente, alterando a síntese de proteínas. A ação
genômica dos esteroides normalmente leva algumas horas ou até dias para
manifestar seu efeito. Por exemplo, o ganho de massa muscular só é percebido
após alguns dias ou semanas (Losel e Wehling, 2003; Losel et al., 2003).
8
Os mecanismos não clássicos ou não genômicos estão relacionados a
respostas rápidas através de receptores de membrana acoplados a vias de
sinalização através de proteínas cinases como ERK, MAPK e PI3K ou do aumento
intracelular de AMPc e/ou aumento do [Ca++]i. Estes mensageiros intracelulares
atuam diretamente em proteínas efetoras, desencadeando respostas intracelulares
e/ou indiretamente promovendo ação genômicas via fosforilação de algumas
proteínas cinases que ativam fatores de transcrição gênica, como por exemplo,
CREB (Figura 3) (Losel e Wehling, 2003).
Figura 3. Esquema das vias de sinalização ativadas por hormônios esteroides (Adaptada de Losel e
Wehling, 2003).
1.8. Bases Eletrofisiológicas
Para compreender a gênese de arritmias cardíacas, muitas vezes
decorrentes do abuso de esteroide anabólicos, é necessário entender como a
membrana celular funciona. Para isso devem-se conhecer conceitos de potencial de
membrana, de gradiente eletroquímico e de canais iônicos. O potencial de
membrana ou transmembrana é a diferença de potencial entre as duas faces da
membrana. Ele depende das concentrações dos vários íons nas duas faces e das
condutâncias da membrana a estes íons a cada momento. O potencial de equilíbrio
de um íon (E), K+ como exemplo, é calculado conforme a equação de Nernst : EK =
(RT / zF)* ln([K+]int / [K+]ext), no qual EK depende, da constante universal dos gases R,
9
da temperatura T, o numero de elétrons transferidos F, da carga z , e do logaritmo
natural ln das concentrações interna sobre a externa do K+. Assim o potencial de
repouso da membrana é dependente dos potenciais de equilíbrios dos íons mais
abundantes no lado interno e externo da membrana e da condutância da membrana
a estes (Na+, K+, Ca2+ e Cl-) (Aires et al., 2008).
A bomba Na+-K+ mantém a diferença de gradiente químico da membrana, ao
manter os gradientes eletroquímicos de Na+ e K+ da célula, pois mantém alta
concentração intracelular de K+ e baixa no meio extracelular, e alta concentração
extracelular de Na+ e baixa no meio intracelular. Essas concentrações são mantidas
através do transporte ativo de dois íons K+ para dentro da célula e três íons Na+ para
fora pela Na+-K+-ATPase, assim favorece que a face interna da membrana fique
negativa e, em condições de repouso, a maior permeabilidade relativa da membrana
ao K+ faz o potencial de membrana ficar próximo ao potencial de equilíbrio do K+
(Aires et al., 2008).
Canais iônicos são proteínas integrais de membrana inseridas na bicamada
lipídica, que formam poros seletivos a íons específicos. Quando há abertura destes
canais, íons permeantes fluem passivamente através do poro a favor do gradiente
eletroquímico, gerando correntes iônicas que são a base dos processos de gênese e
condução da atividade elétrica celular. Estes canais iônicos podem ser regulados por
diferentes processos de sinalização como: mudança de potencial elétrico da
membrana (dependentes de voltagem), ligação de íons ou moléculas a sitio do canal
(canais ativados por ligantes) e estimulação mecânica (canais mecano-ativados). No
coração a grande maioria dos canais é dependente de voltagem (Aires et al., 2008).
O potencial de ação (PA) é uma à resposta regenerativa da membrana, com
despolarização inicial, onde há um influxo de cargas positivas de maneira passiva
pela membrana, normalmente Na+ e Ca2+, seguida da repolarização, onde o
potencial de membrana volta ao valor de repouso devido principalmente à saída de
K+ a favor do gradiente eletroquímico. O potencial de ação cardíaco, tipo rápido, é
característico do miocárdio atrial e ventricular, feixe de His e fibras de Purkinje. Estes
tecidos exibem um potencial de repouso (ou potencial diastólico máximo) da
membrana de aproximadamente –80 mV, determinado pela maior permeabilidade ao
K+ durante o potencial de repouso. O potencial de ação cardíaco rápido é dividido
10
em fases (Figura 4): Fase 0: Fase de despolarização rápida do potencial de ação, na
qual canais de Na+ sensíveis à voltagem se abrem frente a um estimulo elétrico,
promovendo a entrada passiva de Na+. A grande densidade da corrente de Na+ (INa)
é fundamental para a propagação do PA. Nessa fase, o canal de potássio retificador
de influxo tem baixa condutância devido à retificação em potenciais mais positivos.
Fase 1: Nesta fase ocorre uma rápida e transitória repolarização associada à
abertura do canal de potássio transiente de efluxo (Ito1) ativado por despolarização.
Há evidencias de uma corrente de influxo de Cl- (Ito2) nesta fase ao longo da
repolarização. Fase 2: Corresponde ao platô do PA, no qual há um balanço entre
correntes despolarizantes e repolarizantes, as despolarizantes são as corrente de
cálcio tipo L (ICa,L) e uma pequena contribuição da INa, e as correntes repolarizantes
de efluxo de K+ e influxo de Cl- . A ICa,L é a principal responsável pela longa duração
do PA cardíaco. O canal de cálcio tipo L é ativado em voltagens menos negativas a
partir de -30 mV. Nesta fase também há a contribuição do trocado Na/Ca
contribuindo para a despolarização da membrana. A Na-K-ATPase contribui para a
repolarização da membrana ao longo de todo o ciclo cardíaco por ser eletrogenica.
Fase 3: Corresponde a repolarização final caracterizada pelo predomínio de
correntes de efluxo de K+. Nessa fase, a ativação dos canais de potássio
retificadores retardados (IKr e IKs) gera corrente de efluxo de K+, que repolariza a
membrana. As correntes IKr e IKs são as principais responsáveis pela repolarização
da fase 3, com uma menor contribuição da corrente IKur. Fase 4: Nessa fase a
corrente retificadora de influxo de potássio (IK1) é responsável por manter o potencial
de repouso em valores próximos ao do potencial de equilíbrio do K+ (Aires et al.,
2008).
Alterações nas correntes que compõem o potencial de ação podem alterar
as suas características (forma, amplitude, duração, etc.). As alterações nas
correntes iônicas podem ocorrer por mutações nas subunidades que compõem os
canais ou por efeitos de fármacos ou mudança na expressão das subunidades dos
canais. As alterações que diminuem as correntes repolarizantes (Ito, IKr, IKs) ou que
aumentem as correntes despolarizantes (INa e ICa) levam ao aumento da duração do
potencial de ação e podem desencadear pós-potenciais precoces ou tardios
(potenciais anômalos, acoplados aos normais, que surgem no final ou ao longo da
repolarização), aumentando os riscos de arritmias ventriculares (Aires et al., 2008).
11
O eletrocardiograma (ECG) é o registro da variação do potencial elétrico
produzido pela excitação cardíaca detectado na superfície do corpo. O traçado do
ECG é composto por ondas que correspondem às atividades de despolarização dos
átrios (onda P), despolarização (complexo QRS) e repolarização (onda T) dos
ventrículos. O intervalo QT do ECG representa a duração da despolarização e
repolarização ventricular. A duração do intervalo QT é um parâmetro utilizado para
avaliar mudanças na repolarização ventricular. O aumento na duração do intervalo
QT está normalmente associado ao aumento na duração do PA, que pode
desencadear pós-potenciais precoces ou tardios e a gênese de arritmias (Belardinelli
et al., 2003) (figura 4).
Figura 4: Relação entre o eletrocardiograma (ECG), o potencial de ação ventricular (PA) e arritmias
ventriculares. O aumento do intervalo QT do ECG está relacionado ao aumento da duração do PA,
que pode desencadear pós-potenciais precoces e arritmias ventriculares (Modificado de Belardinelli,
2003).
12
O processo da arritmogênese pode decorrer do remodelamento elétrico
cardíaco, que é compreendido por mudanças complexas nas propriedades elétricas
do miocárdio e pode ser evidenciado por mudanças no eletrocardiograma, no
potencial de ação e nas correntes iônicas. Essas alterações podem ser evidenciadas
em diferentes condições, como na hipertrofia ventricular e insuficiência cardíaca
(Bacharova, 2007; Aiba e Tomaselli, 2010).
O perfil do potencial de ação ventricular varia bastante entre diferentes
espécies, bem como em diferentes regiões ventriculares. A parede do miocárdio
pode ser dividida em três subcamadas com perfis diferentes quanto ao potencial de
ação, em consequência da expressão heterogênea dos canais iônicos nas
subcamadas, sendo denominadas: endocárdio (parte interna da parede),
mesocárdico (porção intermediária) e epicárdico (porção mais externa) (Li et al.,
1998).
A Ito é uma das correntes repolarizantes cardíaca, sendo determinante na
repolarização inicial do potencial de ação cardíaco. A contribuição desta corrente
varia conforme a espécie animal em questão, devido à variação na expressão do
canal e das subunidades que compõem o poro do canal (Kv4.2, Kv4.3, Kv1.4) ou por
variação da expressão da subunidade β acessória do canal (KChIP2) (Sah et al.,
2003; Medei et al., 2010). Os cardiomiócitos de ratos apresentam grande densidade
de Ito, o que minimiza os efeitos despolarizantes da ICa,L, fazendo com que nestes
animais não haja uma fase de platô bem definida no PA. Diferentemente em coelho,
cachorro e humanos a Ito é menos dominante permitindo um balanço entre as
correntes Ito, Ikr, Iks com a ICa, determinando assim uma platô bem definido no PA
(Sah et al., 2003).
Em modelo experimental de insuficiência cardíaca foi demonstrada
arritmogênese associada ao prolongamento do PA e presença de pós-potenciais
precoces (Aiba e Tomaselli, 2010). Nesse estudo, o prolongamento do PA foi
associado à diminuição da amplitude de Ito, devido principalmente à diminuição da
expressão da subunidade α Kv4.3 do canal de Ito (Kaab et al., 1998; Aiba e
Tomaselli, 2010). Em modelos de hipertrofia cardíaca, o prolongamento do PA
também está associado com a redução da amplitude de Ito, pela redução da
expressão do canal (Tomaselli e Marban, 1999).
13
O aumento da amplitude da ICa,L também contribui para o aumento da
duração do PA. Um estudo em modelo de infarto do miocárdio mostrou aumento da
duração do PA que estava relacionado à diminuição da amplitude de Ito e aumento
de ICa,L. As mudanças em ICa,L e Ito estavam associadas ao aumento da expressão
da subunidade α Cav1.2 do canal de Ca2+ tipo L e diminuição da subunidade Kv4.2
do canal de K+ transiente de efluxo, respectivamente (Perrier et al., 2004).
O Ca2+ é o elemento responsável pelo acoplamento entre a excitação
elétrica (potencial de ação) e a contração da célula muscular. O mecanismo aceito
para o acoplamento excitação-contração cardíaca é a liberação de Ca2+ do retículo
sarcoplasmático estimulada pelo influxo de Ca2+ através de canais tipo L. A
amplitude e cinética do sinal de Ca2+ determina a fração de Ca2+ liberado e cinética
do transiente de Ca2+, consequentemente, a amplitude e cinética da contração
(Bassani e Bassani, 2005). Durante o potencial de ação, há sobreposição parcial de
ICa,L e Ito, o que significa que esta corrente repolarizante pode modular a corrente de
influxo de Ca2+ e o acoplamento excitação-contração cardíaca.
Assim como já há relatos de casos na literatura de usuários de esteróides
anabólicos que vieram a óbito por morte súbita cardíaca, no qual existiam
modificações estruturais (grande hipertrofia, fibrose e até cardiopatias dilatadas) e
normalmente associadas a essas modificações encontram-se alterações elétrica, no
qual poderiam ser verificas alterações devido o aumento do intervalo QT do
eletrocardiograma decorrente do aumento da duração potencial de ação ventricular
em decorrência da diminuição das correntes repolarizantes de K+ e aumento das
correntes despolarizantes de Na+ e Ca2+ (Montisci et al., 2012). Além disso, uma
maior entrada de Ca2+ favorece a sobrecarga de Ca2+ no citoplasmático, o que já é
bem relacionado a uma maior predisposição arrítmica e a alterações no
acoplamento excitação contração cardíaco (Bassani e Bassani, 2005; Bacharova,
2007; Aiba e Tomaselli, 2010; Montisci et al., 2012).
Portanto elaboramos a hipótese de que a administração crônica de dose
suprafisiológica de esteróide anabólico por 8 semanas pode induzir remodelamento
elétrico, com diminuição da corrente repolarizante (Ito) e aumento da corrente
despolarizante (ICa,L), alterando o acoplamento excitação-contração cardíaco.
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2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Investigar o remodelamento elétrico induzido pela administração crônica de
esteroide anabólico e repercussões no acoplamento excitação-contração.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar as alterações induzidas pela administração crônica de decanoato de
nandrolona em ratos sobre:
a) os parâmetros de repolarização cardíaca por eletrocardiograma;
b) amplitude e duração do potencial de ação ventricular;
c) as correntes iônicas ICa,L e Ito
d) sistema de mobilização do cálcio
e) e função contrátil
15
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos com massa corporal inicial entre 200 e
250 g (10-12 semanas de idade). Os animais foram mantidos em caixas de
polipropileno, forradas com maravalha esterilizada, com ração e água ad libidum.
Foram respeitados os preceitos do “Guia para o Uso de Cuidado de Animais de
Laboratório” (Publicação do NIH Nº 85-23, revisada em 1985, USA) e os protocolos
foram submetidos à aprovação pela Comissão de Avaliação do Uso de Animais em
Pesquisa da Instituição (IBCCF 006).
3.2. Tratamento
Os animais foram distribuídos em dois grupos: Controle (Ctrl, n = 25) e
administrados com o esteroide anabólico decanoato de nandrolona (Deca-
Durabolin®, Organon, Brasil) (Deca, n = 24), injetado semanalmente no músculo
glúteo médio (alternando os lados direito e esquerdo a cada semana), na
concentração de 10 mg/kg, durante 8 semanas. Os animais não tratados receberam
injeções de volume equivalente do veículo (óleo de amendoim diluído em álcool
benzílico a 10%), na mesma periodicidade e localizações especificadas para os
animais tratados. Semanalmente os animais eram pesados para averiguar ganho ou
perca de peso e ao final do tratamento para se estabelecer índices de hipertrofia
cardíaca, após a eutanásia dos animais, o coração dos ratos de ambos os grupos
eram então pesados e então normalizados pelo peso corporal ou pelo comprimento
da tíbia.
3.3. Registro eletrocardiográfico in vivo
O estudo eletrofisiológico do remodelamento elétrico do coração, induzido
pela administração crônica de esteroide anabólico, foi efetuado in vivo pela análise
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do eletrocardiograma (ECG) e ex vivo pelas análises do potencial de ação e
correntes iônicas do ventrículo esquerdo. Os registros eletrocardiográficos foram
obtidos dos animais acordados, mediante eletródios permanentes previamente
implantados antes do início dos protocolos de tratamento. Sob anestesia (30
quetamina/5 xilazina mg/kg, i.p.), três eletródios constituídos de fio de aço inoxidável
(diâmetro: 0,4 mm) foram inseridos subcutaneamente (tipo anel de piercing) na
região dorsal do membro anterior esquerdo e direito e posterior esquerdo, para
obtenção do ECG na derivação DII do plano frontal. Os registros de ECG nos
animais acordados ocorreram semanalmente, sendo o primeiro após 24 horas do
implante dos eletródios. Para isso, os ratos foram colocados em caixas individuais
forradas com maravalha, nas quais tinham livre movimentação. Fios flexíveis com
"jacarés" na ponta permitiram a conexão dos eletródios subcutaneos às entradas do
amplificador de ECG (Differential A/C Amplifier 1700, A-M Systems) conectado a um
computador por uma interface analógica-digital (DIGIDATA 1440A, Molecular
Devices, USA), sob comando do programa Axoscope 10 (mOlecular Devices, USA).
A análise dos registros foi realizada com o programa LabChart 7.0 (AD Instruments,
Australia). Os parâmetros analisados foram a frequência cardíaca, a duração do
intervalo QT e intervalo QTc (intervalo QT corrigido pela frequência cardíaca, pela
equação de Bazzet: QTc = QT/RR, onde RR é o intervalo entre duas ondas R
consecutivas).
3.4. Registro intracelular do potencial de ação
Ao término do período de tratamento, os animais foram heparinizados (500
UI/kg de peso do animal), e eutanasiados por inalação de CO2 e deslocamento
cervical. Os corações foram retirados, lavados em solução Tyrode (em mM); NaCl
140; KCl 5,4; HEPES 10; MgCl2 1,8; glicose 11,0; CaCl2 2,0 e pH 7,4 (titulado com
NaOH); e dissecados para obtenção dos músculos papilares e fatias da parede livre
do ventrículo esquerdo. Estes foram fixados com pequenos alfinetes de aço
inoxidável à camada de Sylgard® no fundo de uma cuba de acrílico (volume de
aprox. 3 ml), mantendo a superfície endocárdica para cima, e perfundidos
continuamente com solução de Tyrode saturada com oxigênio (100% O2) e
17
temperatura de 37 ºC. O fluxo foi mantido constante em 5 ml/min por uma bomba
peristáltica (Gilson MiniPuls 3).
Para o registro intracelular do potencial transmembrana, foram utilizados
microeletródios convencionais de vidro, com resistência de ponta entre 10 e 20 MΩ
DC, produzidos pelo estiramento de capilares de vidro borosilicato de 1,2 mm de
diâmetro em um estirador vertical (PP-83, Narishige). De cada capilar, produzia-se
duas micropipetas, que eram preenchidas com solução de KCl 3 M, na qual se
inseria um fio de Ag/AgCl conectado ao estágio de entrada de um pré-amplificador
de alta impedância (MEZ-7200, Nihon-Kohde). O eletrodo de referência era formado
por um fio de Ag/AgCl mergulhado diretamente no banho e conectado à entrada
“terra” do pré-amplificador. Um manipulador mecânico (Narishige) permitia o
deslocamento micrométrico do microeletródio em aproximação à superfície do tecido
isolado fixado no fundo da cuba, permitindo a inserção intracelular de sua ponta.
Foram considerados válidos apenas os registros intracelulares com potencial de
membrana estável igual ou maior que -70 mV. Os potenciais de ação foram
estimulados por pulsos retangulares de corrente, com duração de 0,5 a 3 ms e
intensidade cerca de duas vezes o valor limiar determinado para cada músculo,
aplicados através de um par de eletrodos de prata cloretada (Ag/AgCl) conectados a
um estimulador (DS2, Digitimer). A frequência dos estímulos (1 Hz) foi controlada
por um gerador de frequência (Digitimer D4030). O sinal obtido na saída do pré-
amplificador foi digitalizado por um sistema de aquisição de dados (interface A/D
DIGIDATA 1440A e programa Axoscope, Molecular Devices, USA), controlado por
um microcomputador onde os sinais foram armazenados para posterior análise.
Foram medidos o potencial de repouso (PR), a amplitude do potencial de ação
(APA), e a duração do potencial de ação aos níveis de 30% (DPA30) e 90%
(DPA90) da repolarização máxima.
3.5. Correntes iônicas
Para o registro das correntes iônicas, cardiomiócitos ventriculares foram
dissociados enzimaticamente. Os animais foram sacrificados por inalação de CO2 e
toracotomizados. O coração foi extraído rapidamente e canulado pela artéria aorta,
18
pela qual foi perfundido inicialmente com solução Tyrode (em mM): NaCl 140; KCl
5,4; HEPES 10; MgCl2 1,8; glicose 11,0; CaCl2 2,0 e pH 7,4 (titulado com NaOH),
sob fluxo constante de 8 ml/min, temperatura de 35 ºC e borbulhadas continuamente
com oxigênio a 100%. Após a lavagem de todo resíduo de sangue do coração, este
foi perfundido com solução Tyrode sem cálcio por 5 minutos. Após a assistolia, o
coração foi perfundido com solução Tyrode sem cálcio contendo 200 UI/ml de
colagenase tipo II (Worthington, USA) por um período variável de 10 a 20 min,
recirculando a solução até que o coração apresentasse aparência translúcida na
junção interventricular e o ápice fosse facilmente perfurado com uma pinça. Em
seguida, o coração foi novamente perfundido com solução Tyrode sem cálcio por 10
min, com objetivo de lavar a colagenase residual. Ao término da lavagem, o coração
foi colocado em uma placa de Petri contendo solução Tyrode sem cálcio e o
ventrículo esquerdo e septo foram dissecados, cortados em pequenos pedaços e
colocados cada um deles em poços de uma placa de cultura contendo solução KB
(Kraft-Brühe) modificada (em mM): KCl 30; Ácido glutâmico 70; HEPES 10; MgCl2 1;
glicose 10; Taurina 20; KH2PO4 10; EGTA (etilenoglicol-bis(-aminoetileter)-
N,N,N´,N´-ácido tetraacético) 0,3; pH 7,3 (titulado com KOH). Em cada poço da
placa os cardiomiócitos foram dispersos mecanicamente usando-se uma pipeta
Pasteur.
As células foram colocadas em solução Tyrode e utilizadas durante o
período de 1 a 8 horas após a dissociação para o registro das correntes iônicas ICa,L
e Ito utilizando a técnica de patch clamp, na configuração whole cell. A técnica
consiste em aderir a ponta de uma micropipeta à membrana de uma célula, no caso,
o cardiomiócito, e depois romper a membrana, permitindo a continuidade elétrica
entre o meio intracelular e a solução intrapipeta, em contato com um eletrodo de
prata cloretada. Dessa forma, podemos registrar a corrente iônica da célula ativada
por estímulos despolarizantes, podendo se analisar o fluxo de íons através dos
diferentes canais iônicos dessa célula. A solução de pipeta para registro da ICa,L
continha (em mM): CsCl 110, TEA-Cl 30, ATP-Mg 5, EGTA 10, GTP-Na 0,1 e pH 7,2
(titulado com CsOH). A solução da pipeta para registro da Ito continha (em mM): KCl
125, NaCl 10, MgCl2 5, HEPES 10 e EGTA 5 e pH 7,2 (titulado com KOH).
19
Para o registro de ICa,L foram utilizadas micropipetas de sucção com
resistência de ponta de 3 a 5 M, confeccionadas em tubos de vidro de
borossilicato, utilizando um estirador horizontal (P-97, Sutter Instruments Co.). O
protocolo de voltagem consistiu em aplicar, a partir de um potencial fixo (holding) de
-50 mV, pulsos despolarizantes de amplitude crescente, variando de 10 em 10 mV,
até +60 mV. A amplitude da corrente ICa,L foi medida como a diferença entre o pico e
a corrente ao final do pulso. A densidade de corrente, calculada como a amplitude
da corrente normalizada pela capacitância da célula, foi expressa graficamente em
função do potencial dos pulsos, para obter a curva corrente/voltagem (I/V). A curva
de dependência de voltagem da ativação estacionária de ICa,L foi obtida da relação
I/V, plotando a condutância (G), normalizada em função do potencial de membrana.
G foi calculada em cada potencial, dividindo a amplitude de ICa,L pela diferença entre
o potencial de cada pulso e o potencial de reversão de ICa,L. Uma função sigmóide
(Boltzmann) foi ajustada aos pontos experimentais para determinação dos
parâmetros V½ (potencial de membrana no qual ocorre 50% da ativação máxima) e
slope (sensibilidade à voltagem). Para a obtenção da curva de dependência de
voltagem da inativação estacionária (steady-state) foi utilizado um protocolo de duplo
pulso, no qual um pulso de potencial fixo (0 mV) era precedido por pré-pulsos de
1000 ms de duração e potencial variando, a intervalos de 10 mV, de -70 a +40 mV. A
amplitude de ICa,L, normalizada pelo valor máximo, foi expressa graficamente em
função do potencial do pré-pulso. Uma função sigmóide (Boltzmann) foi ajustada aos
pontos experimentais para determinação de V½ e o fator k para a inativação
dependente de voltagem. A curva de reativação (recuperação da inativação) de ICa,L
foi obtida também com um protocolo de duplos pulsos. A partir do potencial holding,
foram aplicados dois pulsos despolarizantes para 0 mV, com intervalo variável (10,
20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 2500 e 3000 ms) entre os
dois pulsos. A amplitude da corrente do segundo pulso foi dividida pela da corrente
do primeiro pulso e expressa graficamente em função dos intervalos inter-pulsos.
Uma função exponencial de primeira ordem foi ajustada aos pontos experimentais
para determinação da constante temporal de reativação (). Para ativar Ito o protocolo de voltagem consistiu em aplicar, a partir de um
potencial fixo (holding) de -60 mV com pré pulso a -40 mV (para inativar INa e ICa,T),
pulsos subsequentes despolarizantes de amplitude crescente a partir de -50 mV,
20
variando de 10 em 10 mV, até atingir +60 mV. A amplitude da corrente Ito foi medida
como a diferença entre o pico e a corrente ao final do pulso. A densidade de
corrente, calculada como a amplitude da corrente normalizada pela capacitância da
célula, foi expressa graficamente em função do potencial dos pulsos, para obter a
curva corrente/voltagem (I/V). Para a obtenção da curva de dependência de
voltagem da inativação estacionária (steady-state), foi utilizado um protocolo de
duplo pulso, no qual um pulso de potencial fixo (+60 mV) era precedido por pré-
pulsos de 1000 ms de duração e potencial variando, a intervalos de 10 mV, de -70 a
+50 mV.
3.6. Avaliação da regulação de Ca2+ intracelular
A avaliação da regulação do Ca2+ intracelular foi realizada em fibras
desnudas, segundo técnica primeiramente proposta por Fabiato e Fabiato (1979).
Esta técnica, mediante a análise da resposta contrátil de fibras cardíacas permite
inferir a variação da concentração do Ca2+ citoplasmático na fibra cardíaca desnuda,
sem que seja necessário desmembramento do maquinário contrátil, como acontece,
por exemplo, no isolamento de frações do retículo sarcoplasmático. Isso possibilita a
manutenção das estruturas intracelulares, reduzindo possíveis distorções na
interpretação dos mecanismos moduladores que podem ocorrer quando as
estruturas são isoladas. A técnica de fibras desnudas ainda oferece a vantagem de
possibilitar a avaliação direta da força de contração exercida pelo tecido,
correlacionando-a com a mobilização de Ca2+ e a viabilizando análise do estado
contrátil da célula.
Tabela 1. Composição das soluções W e R utilizadas nos experimentos com fibras desnudas.
Substâncias Solução W (mM) Solução R (mM)
Proprionato de potássio 185,0 185,0
Acetato de magnésio 2,5 2,5
Proprionato de imidazol 10,0 10,0
K2 ATP ou Na2ATP 5,0 5,0
K2EGTA - 5,0
Ambas soluções W e R ajustada ao pH 7,0 com KOH.
21
Feixes de fibras ventriculares quimicamente desnudas foram utilizadas para
investigar a regulação da mobilização de Ca2+ intracelular no coração de rato tratado
com decanoato de nandrolona por 8 semanas. Os animais de cada grupo
experimental foram eutanasiados e em seguida seus corações retirados e
mergulhados em solução livre de Ca2+. Feixes de aproximadamente 10 mm de
comprimento e 300–400 μm de diâmetro foram então removidos do sub-endocárdio
do ventrículo esquerdo à temperatura ambiente e posicionados em uma cuba
experimental de 1 ml de volume interno, preenchida com solução R de relaxamento
(Tabela 1). As extremidades dos feixes foram presas a duas garras localizadas
horizontalmente, sendo que uma delas encontrava-se conectada ao
micromanipulador (Narishige mod. 3) e a outra ao transdutor de tensão isométrica
(Grass, modelo FT03). Em seguida, as fibras foram estiradas para 120% do seu
comprimento inicial, através da visualização em estereomicroscópio binocular (Zeiss)
provido de uma escala na ocular. Em todos os experimentos, a temperatura da cuba
foi continuamente monitorada e mantida a 20,0 ± 1,0 ºC. O registro da tensão
isométrica foi feito em polígrafo (Grass mod. 7400). Para a permeabilização da
membrana celular e consequente livre acesso das substâncias ao meio intracelular,
os feixes foram submetidos ao tratamento com saponina diluída em solução R (0,5%
v/v) durante cinco minutos. O sucesso do desnudamento foi confirmado
comparando-se a amplitude da contratura em reposta à exposição do feixe a uma
solução cujo log[Ca2+] correspondia ao pCa 4,8 (Tabela 2 e pH 7,0 ajustada com
KOH) antes e após o uso da saponina. A tensão máxima desenvolvida pelas fibras
cardíacas desnudas foi determinada pela exposição à solução pCa 4,8. A Figura 5
mostra o esquema ilustrativo da cuba experimental utilizada acoplada a um
transdutor de tensão e este a um osciloscópio. Foram utilizados três protocolos
experimentais para a análise dos processos de captação e liberação de Ca2+ pelo
retículo sarcoplasmático e da sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+.
22
Figura 5. Esquema ilustrativo da cuba experimental. Feixes de fibras musculares do
ventrículo esquerdo foram fixados pelas extremidades a uma haste fixa e a um transdutor de
força.
Tabela 2. Composição das soluções de pCa utilizadas nos experimentos com fibras desnudas
pCa CaEGTA (µM) K2EGTA(mM) MgAc(mM) Prop de K (mM) Prop de imidazol (mM) Na2 ou K2 ATP (mM)
7,4 0,03981 4,65 2,5 185 10 5
7,0 0,1 4,25 2,5 185 10 5
6,8 0,1585 3,85 2,5 185 10 5
6,6 0,2511 3,4 2,5 185 10 5
6,4 0,3981 2,85 2,5 185 10 5
6,2 0,6309 2,28 2,5 185 10 5
6,0 1 1,74 2,5 185 10 5
5,6 2,511 0,86 2,5 185 10 5
5,0 10 0,22 2,5 185 10 5
4,8 15,84 0,11 2,5 185 10 5
Todas os pCa foram ajustados para o pH 7, com KOH
3.6.1. Captação e liberação de Ca2+ pelo RS
Antes do início de cada protocolo, a permeabilidade da membrana e a
integridade das proteínas contráteis das fibras cardíacas foram avaliadas pelo
registro da resposta contrátil máxima (P0) induzida por uma solução de pCa 4,8
(15,85 µM Ca2+). Em seguida, a viabilidade do retículo sarcoplasmático foi avaliada,
como ilustrado na Figura 6, na parte invariável do protocolo, sendo a porção variável
23
destacada na figura 6. Após a lavagem das fibras com a solução W, o esvaziamento
do Ca2+ do retículo sarcoplasmático foi induzido com cafeína (20 mM) diluída em
solução R durante um minuto. Em seguida, o carregamento do retículo
sarcoplasmático foi obtido pela exposição das fibras a uma solução de pCa 7,4 (0,04
μM) durante três minutos. Após o carregamento, foi induzida a contratura com uma
solução de cafeína (20 mM) diluída em solução W e a integridade do retículo
sarcoplasmático foi aceita quando a tensão isométrica gerada fosse ≥ 60% do P0. O
relaxamento da fibra após a contratura, estimulada por Ca2+ ou cafeína, foi induzido
com a aplicação da solução R na cuba experimental. A captação de Ca2+ foi
analisada pela avaliação da curva de tensão isométrica em função do tempo de
carregamento do retículo sarcoplasmático com Ca2+. Diversos ciclos de contração-
relaxamento foram obtidos em cada feixe de fibras musculares, usando-se tempos
crescentes de carregamento (1, 3 e 5 minutos) com concentração constante de Ca2+
em pCa 7,4 (Figura 7). Ao final do protocolo experimental, uma nova contratura com
solução de pCa 4,8 foi gerada para confirmar a integridade das fibras. Caso a
resposta contrátil fosse menor que 70% do P0 inicial, o experimento era descartado.
Figura 6. Esquema ilustrativo do protocolo para avaliação da permeabilização do feixe de
fibras cardíacas, da integridade das proteínas contráteis e do retículo sarcoplasmático. Após
24
as contraturas induzidas por Ca2+ e cafeína, a solução R foi adicionada à cuba experimental
para induzir o relaxamento das fibras. A solução W era aplicada para lavagem da cuba.
Figura 7. Esquema ilustrativo do protocolo para a avaliação da captação de Ca2+ pelo
retículo sarcoplasmático. Diferentes tempos de carregamento (1, 3 e 5 min.) foram utilizados
antes da indução da contratura por 20 mM de cafeína. Após as contraturas, a solução R foi
adicionada à cuba experimental para induzir o relaxamento das fibras. A solução W era
aplicada para lavagem da cuba.
A liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático foi avaliada de maneira
similar à captação, no entanto, obteve-se uma curva da resposta contrátil em função
de diferentes concentrações de cafeína (3, 5 e 20 mM). Neste protocolo, tanto a
concentração de Ca2+ (pCa 7,4), quanto o tempo de carregamento do retículo
sarcoplasmático (3 minutos) foram constantes. Da mesma maneira que descrito
anteriormente, ao final do experimento, as fibras que apresentaram, resposta
contrátil menor que 70% do P0 inicial, quando expostas à solução pCa 4,8, também
foram excluídas (Figura 8).
25
Figura 8. Esquema ilustrativo do protocolo para a avaliação da liberação de Ca2+ pelo
retículo sarcoplasmático. Diferentes concentrações de cafeína foram utilizadas e a resposta
contrátil analisada. Após as contraturas induzidas por cafeína, a solução R foi adicionada à
cuba experimental para induzir o relaxamento das fibras. A solução W era aplicada para
lavagem da cuba.
3.6.2. Função contrátil e sensibilidade ao Ca2+
A avaliação da sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+ foi realizada
em fibras cardíacas desnudas sem o retículo sarcoplasmático funcional. A exposição
prévia das fibras ao Triton X-100 (2%) durante trinta minutos, após o primeiro teste
de contração, destrói o retículo sarcoplasmático sem alterar o funcionamento das
proteínas contráteis. Dessa maneira, foi avaliada a resposta contrátil das fibras na
presença de cafeína após o uso do Triton X-100. A ausência de resposta contrátil
confirmava a ruptura completa da membrana do retículo sarcoplasmático. Em
seguida, as fibras foram submetidas ao protocolo de avaliação da sensibilidade das
proteínas contráteis ao Ca2+. Como ilustrado na Figura 9, este protocolo consistiu na
geração de uma curva de tensão isométrica em função de concentrações crescentes
de Ca2+ (pCa 7,4; 7,0; 6,8; 6,6; 6,4; 6,2; 6,0; 5,6; 5,0; 4,8). Ao final do experimento,
as fibras que apresentaram resposta ao pCa 4.8 abaixo de 70% do P0 inicial foram
descartadas. A partir das curvas de pCa, foi realizada uma regressão não linear com
26
a equação de Hill, para obter os parâmetros sensibilidade ao Ca2+ slope e pCa50%
([Ca2+] necessária para atingir 50% da tensão máxima).
Figura 9. Esquema ilustrativo do protocolo para a avaliação da sensibilidade das proteínas
contráteis ao Ca2+. Após permeabilização do retículo sarcoplasmático com triton X-100 a
2%, diferentes concentrações de Ca2+ (pCa: 7,4; 7,0; 6,8; 6,6; 6,4; 6,2; 6,0; 5,6; 5,0 e 4,8)
foram utilizadas e a resposta contrátil analisada. Após cada contratura, foi adicionada à cuba
experimental a solução R para induzir o relaxamento das fibras e a solução W para
lavagem.
3.7. Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas com o programa GraphPad Prism
5,0 (GraphPad, USA), usando teste t não pareado para a comparação entre as
médias dos dois grupos. Análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas foi
utilizado na comparação longitudinal (análise bivariada, com pós-teste de
Bonferroni). Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média e
as diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.
27
4. RESULTADOS
4.1. Biometria
A figura 10 apresenta o curso temporal do peso corporal dos animais
durante o período experimental. Os animais administrados com decanoato de
nandrolona mostraram uma menor massa corpórea em comparação ao grupo
controle a partir da 5º semana (Ctrl: 317,1 ± 8,3 g; Deca: 272,2 ± 14,8 g; p < 0,05, 7º
semana Ctrl: 318,9 ± 8,2 g; Deca: 279,3 ± 15,5 g; p < 0,05, e 8º semana Ctrl: 334,7 ±
6,8 g; Deca: 297,7 ± 4,7 g; p < 0,001).
0 1 2 3 4 5 6 7 80
200200
220
240
260
280
300
320
340
360Ctrl
*****
Deca
Tempo em semanas
Pes
o c
orp
ora
l (g
)
Figura 10. Efeito da administração crônica de decanoato de nadrolona sobre a massa
corporal (g) ao longo de 8 semanas de administração. Ctrl (n = 21): grupo controle não
tratado, Deca (n = 21): grupo admistrado com decanoato de nandrolona (10 mg/kg/semana).
Valores expressos em média erro padrão da média. *p < 0,05 e ***p < 0,001 vs. Ctrl.
O peso do coração foi medido ao final do protocolo experimental (Figura
11A) e expresso como valor normalizado pelo peso corporal (Figura 11B) e
comprimento da tíbia (Figura 11C). Apenas a relação peso do coração/peso corporal
apresentou diferença significativa entre os grupos (4,7 ± 0,089 vs 4,3 ± 0,098 em
g/kg, p < 0,05).
28
Ctrl Deca
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Pe
so
ab
so
luto
do
co
raç
ão
(g
)
Ctrl Deca0
2
4
6
**
Pe
so
do
co
raç
ão
/ P
es
o c
orp
ora
l (g
/kg
)Ctrl Deca
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Pe
so
do
co
raç
ão
/co
mp
rim
en
to d
a t
ibia
(g
/cm
)
A B
C
Figura 11. Peso do coração. A, peso úmido absoluto (Ctrl: n = 21; Deca: n = 20). B, peso
relativo do coração (g/kg). O peso relativo do coração normalizado pelo comprimento da
tíbia (g/cm) (n = 16 para ambos os grupos). C, peso úmido do coração foi normalizado pelo
peso corporal (Ctrl, n = 21; Deca, n = 20). Valores expressos como média erro padrão da
média. **p < 0,01 vs. Ctrl.
4.2. Efeito da administração crônica de decanoato de nandrolona sobre a
frequência cardíaca e intervalo QT
A figura 12 mostra a frequência cardíaca (12A), duração do intervalo QT
(12B) e duração do intervalo QT corrigida pela frequência cardíaca (12C), medidos
no início (S0) e na 8ª semana (S8) de administração, em ratos dos grupos
administrado (Deca) e controle (Ctrl). No início do administração, os valores médios
29
do intervalo QT, QTc e frequência cardíaca (FC) não apresentaram diferenças
significativas entre os grupos. Ao final da 8ª semana de administração, o grupo Deca
apresentou intervalos QT e QTc significativamente maiores que os do grupo Ctrl (p
< 0,001). Não foram observadas diferenças significativas entre os valores médios da
FC dos grupos e em relação aos valores médios do início do tratamento.
S0 S80
20
40
60
80 ***
QT
(ms)
S0 S80
50
100
150
200CtrlDeca
***
QTc
(m
s)
S0 S80
100
200
300
400
500
FC
(b
pm
)
A B
C
Ctrl (n=6)
Deca (n=6)100 ms
0.02 mV
D
Figura 12. ECG representativo Ctrl e Deca (A), frequência cardíaca (B), intervalo QT (C) e
intervalo QT corrigido pela frequência cardíaca (D) medidos nos registros
eletrocardiográficos obtidos antes (S0) e ao final do período de administração (S8, 8ª
semana). O intervalo QT corrigido (QTc) foi calculado pela equação de Bazzet. Valores
expressos em média erro padrão da média. ***p < 0,001 vs. Ctrl. n = 6 em cada grupo.
4.3. Efeito da administração crônica de decanoato de nandrolona sobre o
potencial de ação ventricular
30
A figura 13 ilustra os potenciais de ação registrados em fatias de miocárdio
isoladas do ventrículo esquerdo de ratos controle (Ctrl) e administrado com
decanoato de nandrolona (Deca). A figura mostra claramente que a administração
crônica de decanoato de nandrolona induziu o prolongamento da duração do
potencial de ação ventricular.
Figura 13. Traçados representativos de potenciais de ação registrados em tecidos
musculares isolados do ventrículo esquerdo de ratos não admistrados (Ctrl) e administrados
com decanoato de nandrolona (Deca).
A figura 14 mostra os efeitos da administração crônica com decanoato de
nandrolona sobre o potencial de membrana no repouso (Figura 14A) e amplitude do
potencial de ação (Figura 14B). Em ambos os parâmetros, não foram observadas
diferenças significativas entre os dois grupos. A duração dos potenciais de ação do
ventrículo esquerdo foi prolongada nos ratos administrados com decanoato de
nandrolona, tanto ao nível de 30% (DPA30) quanto em 90% (DPA90) da
repolarização máxima (Figuras 15A e 15B). A triangulação do potencial de ação, um
índice preditor de risco arrítmico, foi maior nos animais administrados com
decanoato de nandrolona em comparação ao grupo controle (figura 15C).
31
Ctrl Deca
-90
-60
-30
0Po
ten
cial
de
rep
ou
so
(mV
)
Ctrl Deca0
20
40
60
80
100
120
Am
plit
ud
e d
o P
ot.
açã
o (
mV
)
A B
Figura 14. Efeito da administração crônica de decanoato de nandrolona sobre o potencial
de repouso (A) e a amplitude do potencial de ação (B). n = 11 e n = 10 células, Ctrl e Deca
respectivamente. Valores expressos em média erro padrão da média.
Ctrl Deca
0
5
10
15
20
***
DP
A30
(m
s)
Ctrl Deca
0
20
40
60
80
100
120
140 ***D
PA
90 (
ms)
Ctrl Deca
0
20
40
60
80
100
120 ***
DP
A90
- D
PA
30 (
ms)
A B
C
Figura 15. Efeito da administração crônica com decanoato de nandrolona sobre a duração
do potencial de ação a 30% (A) e 90% (B) da repolarização máxima, em potenciais de ação
registrados sob frequência de estimulação de 1,0 Hz. C, triangulação do potencial de ação,
definida como o tempo de repolarização entre DPA 30 e DPA 90. n = 11 e n = 10 células,
Ctrl e Deca respectivamente. Valores expressos como média ± erro padrão da média. ***p <
0,001 vs. Ctrl.
32
4.4. Efeito da administração crônica de decanoato de nandrolona sobre a
corrente de Ca2+ tipo L.
Para avaliar se o prolongamento da duração do potencial de ação (DPA30)
induzido pela administração crônica com esteroide anabólico estaria associado a
alterações na corrente de cálcio tipo L (ICa,L), esta foi analisada em cardiomiócitos
ventriculares do ventrículo esquerdo de ratos tratados com decanoato de
nandrolona.
A capacitância média dos cardiomiócitos foi 112,2 ± 6,3 pF no grupo Ctrl (n =
62 células) e 117,4 ± 34,1 pF no grupo Deca (n = 26 células). A figura 16 mostra a
relação corrente/voltagem para ICa,L. O gráfico expressa a amplitude de ICa,L em
valores de densidade de corrente, que é a amplitude da corrente (em pA)
normalizada pela capacitância da célula (em pF). Em ambos os grupos, ICa,L foi
ativada em -30 mV, atingiu o valor máximo em +10 mV e reverteu em
aproximadamente +60 mV (potencial no qual o Ca2+ deixa de entrar na célula e
começa a sair). A densidade de ICa,L foi significativamente maior nos cardiomiócitos
do grupo Deca nos potenciais 0, +10, +20 e +30 mV, em comparação ao grupo Ctrl.
33
Figura 16. Relação corrente/voltagem de ICa,L. A, esquema do protocolo de voltagem e
traçados representativos de ICa,L de cardiomiócitos dos grupos Ctrl e Deca. O protocolo de
voltagem para obter a curva I-V consistiu de pulsos despolarizantes a partir de -40 mV para
potenciais entre -50 e +60 mV, em incrementos de 10 mV. B, Curva I-V de ICa,L de
cardiomiócitos do ventrículo esquerdo de ratos controles (Ctrl, n = 36 células) e ratos
administrados com decanoato de nandrolona (Deca, n = 17 células). Valores expressos
como média ± erro padrão da média. *p < 0,05 e **p < 0,01 vs. Ctrl.
34
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
CtrlDeca
mV
G/G
max
Figura 17. Curva de dependência de voltagem da ativação de ICa,L em cardiomiócitos do
ventrículo esquerdo de ratos dos grupos Ctrl (V½ = -5,6 ± 0.35 mV; slope = 7,1 ± 0,31; n =
36 células) e Deca (V½ = -6,0 ± 0,64 mV; slope = 7,2 ± 0,56; n = 17 células). A condutância
G está normalizada pela Gmax. Valores expressos como média ± erro padrão da média.
A figura 17 mostra as curvas de dependência de voltagem da ativação de
ICa,L em cardiomiócitos ventriculares dos grupos Ctrl e Deca. Não foram observadas
diferenças significativas entre os valores de V1/2 e slope das curvas dos dois grupos
experimentais.
A figura 18 mostra as curvas de dependência de voltagem da inativação
steady-state de ICa,L de cardiomiócitos tratados e não-tratados com decanoato de
nandrolona. Não foram observadas diferenças significativas entre os valores de V1/2
e slope das curvas dos dois grupos experimentais.
35
-80 -60 -40 -20 0 20 40
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
CtrlDeca
mVI/I
max
Figura 18. Curva de dependência de voltagem da inativação steady-state de ICa,L em
cardiomiócitos do ventrículo esquerdo de ratos dos grupos Ctrl (V½ = -28,6 ± 0,64 mV; slope
=-6,69 ± 0,57; n = 36 células) e Deca (V½ = -25,8 ± 1,53 mV; slope =-6,61 ± 1,34; n = 17
células). O protocolo de voltagem consistiu na aplicação de pré-pulsos com potencial entre -
70 e +40 mV, variando de 10 em 10 mV, seguido de um pulso para 0 mV. Valores expressos
como média ± erro padrão da média.
As curvas de recuperação da inativação de ICa,L dos cardiomiócitos dos
ventrículos esquerdos de ratos Ctrl e Deca são mostradas na figura 19. A constante
temporal de reativação () foi menor (p < 0,001) no grupo Deca (369,9 ± 18,22 ms, n
= 9 células) comparado ao grupo Ctrl (478,9 ± 23,38 ms, n = 12 células), mostrando
assim uma aceleração na reativação do canal de Ca2+ .
36
0 1000 2000 30000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
CtrlDeca
Intervalo entre pulsos (ms)
Co
rren
te r
elat
iva
Figura 19. Curva de recuperação da inativação de ICa,L. Curvas de reativação de ICa,L em
cardiomiócitos do ventrículo esquerdo de ratos Controle (n = 12 células) e Deca (n = 9
células). Valores expressos como média ± erro padrão da média.
4.5. Efeito da administração crônica de decanoato de nandrolona sobre a
corrente transiente de efluxo de K+ (Ito)
Os animais administrados com decanoato de nandrolona mostraram uma
acentuada redução da densidade de Ito em células da camada subepicárdica do
ventrículo esquerdo em comparação ao controle, em potenciais de membrana de
+30 a +60 mV (Figura 20). Nas células da camada subendocárdica do ventrículo
esquerdo (Figura 21) também mostramos redução da amplitude de Ito nos potenciais
de +50 e +60 mV, em comparação ao controle.
37
Figura 20. A, registro representativo da Ito em células da camada subepicárdica. B, relação
corrente/voltagem de Ito em cardiomiócitos da camada subepicárdica do ventrículo esquerdo
(Ctrl: n = 13 e Deca: n = 4 células). O protocolo consistiu de pulsos despolarizantes a partir
de -60 mV, com pré pulso a -40 mV, seguidos de pulsos entre -50 e +60 mV, em intervalos
de 10 mV. Valores expressos como média ± erro padrão da média. *p < 0,05, **p < 0,01 e
***p < 0,001 vs. Ctrl.
38
-60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60
3
6
9
12
15
18
21
Ctrl
Deca
pA/pF
mV
**
Ctrl DecaA
B
Figura 21. A, registros representativos de Ito em cardiomiócitos da camada subendocárdica
do ventrículo esquerdo. B, relação corrente/voltagem de Ito em cardiomiócitos camada
subendocárdica do ventrículo esquerdo dos grupos Ctrl (n = 13) e Deca (n = 5). O protocolo
consistiu de pulsos despolarizantes a partir de -60 mV, com pré pulso a -40 mV, seguidos de
pulsos entre -50 e +60 mV, em intervalos de 10 mV. Valores expressos como média ± erro
padrão da média.*p < 0,05 vs. Ctrl.
39
A figura 22 mostra a curva de dependência de voltagem da inativação
steady-state de Ito de cardiomiócitos epicardiais tratados e não-tratados com
decanoato de nandrolona. O V1/2 de inativação do grupo Deca estava deslocado (p <
0,05) para potencial menos despolarizado (-55,71 ± 0,31 mV, n = 4 células)
comparado ao grupo Controle (-49,89 ± 0,55 mV, n = 13 células), e o slope que
indica a inclinação da curva de inativação dependente de voltagem estava maior no
grupo Deca (slope = 4,27± 0,23, vs Ctrl: -5,6 ± 0,49; p < 0,05), assim mais sensível à
variação de voltagem. Nas células do endocárdio, não foi observada diferença
significativa nos parâmetros de V1/2 e slope do Ctrl (V½ = -46,55 ± 1,34 mV; slope =
10,21 ± 1,14; n = 13 células) e Deca (V½ = -51,20 ± 4,036 mV; slope = 11,11± 3,15;
n = 4 células).
Figura 22. Curva de dependência de voltagem da inativação steady-state de Ito em
cardiomiócitos da camada subepicárdica (A) (Ctrl: V½ = -49,89 ± 0,55 mV, slope = -5,6 ±
0,49, n = 14 células; Deca: V½ = -55,71± 0,31 mV, slope = 4,27± 0,23, n = 4 células) e
subendocárdica (B) (Ctrl: V½ = -46,55 ± 1,34 mV, slope = 10,21 ± 1,14, n = 13 células;
Deca: V½ = -51,20 ± 4,036 mV, slope = 11,11 ± 3,15, n = 4 células) em ventrículo esquerdo
de ratos. O protocolo de voltagem consistiu na aplicação de pré-pulsos com potencial entre -
80 e +40 mV, variando de 10 em 10 mV, seguido de um pulso para 0 mV. Valores expressos
como média ± erro padrão da média.
-80 -60 -40 -20 0 20 40
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0CtrlDeca
ASubepicárdica
mV
I/
Imax
-80 -60 -40 -20 0 20 40
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0CtrlDeca
B
mV
I/Im
ax
Subendocárdica
40
4.6. Efeito da administração crônica de decanoato de nandrolona sobre a
regulação do Ca2+ intracelular
4.6.1. Captação de Ca2+ intracelular pelo reticulo sarcoplasmático
Ao avaliarmos a mobilização do Ca2+ intracelular pelo método de tensão
isométrica de fibra desnuda nos animais administrados e nos controles, verificamos
que o tempo de carregamento de 1, 3 e 5 min do reticulo sarcoplasmático não gerou
uma reposta crescente da tensão em função do aumento do tempo de
carregamento, após um estimulo de 20 mM de cafeína em ambos os grupos. Isso
mostra que aparentemente o reticulo é recarregado rapidamente (tempo para o
carregamento máximo do reticulo ≤ 1min). Mas a tensão desenvolvida nos animais
controles era maior do que nos animais do grupo Deca (Figura 23).
Tempo de Carregamento de Ca2+
1 min 3 min 5 min0.0
0.2
0.4
0.6CtrlDeca
*** *** ***
Tempo
Ten
são
rel
ativ
a
Figura 23. Resposta contrátil a cafeína em fibras cardíacas desnudas expostas a diferentes
tempos de carregamento com solução pCa 7,4. O valor de tensão isométrica medido após o
estimulo com 20 mM cafeína foi normalizado pelo valor de tensão inicial ou tensão máxima
(P0 = tensão no pCa 4,8). n = 5 em ambos os grupos. p < 0,001 vs Ctrl.
Quando avaliamos a tensão em função da liberação de Ca2+ do reticulo com
diferentes concentrações de cafeína nas concentrações 3, 5 e 20 mM, não notamos
diferença significativa entre as tensões em função do aumento da concentração de
41
cafeína, mas novamente verificou-se que o grupo administrado com decanoato de
nandrolona tinha uma menor tensão em relação ao grupo controle. Esta menor
resposta pode ser devida a uma redução do conteúdo de Ca2+ do reticulo
sarcoplasmático (Figura 24).
Liberação de Ca2+
3 mM 5 mM 20 mM0.0
0.2
0.4
0.6
0.8CtrlDeca
*********
[Cafeína]
Ten
são
rel
ativ
a
Figura 24. Resposta contrátil a diferentes concentrações de cafeína em fibras cardíacas
desnudas previamente expostas a solução pCa 7,4 por tempo de carregamento fixo de 3
minutos. O valor de tensão medido após o estímulo de cafeína foi normalizado pelo valor de
tensão inicial ou tensão máxima (P0 = tensão no pCa 4,8). Grupos Ctrl (n = 4) e Deca (n =
5). ***p < 0,001 vs Ctrl.
4.6.2. Função contrátil e sensibilidade ao Ca2+
Ao avaliarmos a sensibilidade das proteínas contráteis à concentração
crescente de Ca2+ em fibras desnudas cardíacas, mostramos que os animais
administrados tinham uma maior sensibilidade e maior resposta contrátil ao Ca2+. A
maior contratilidade pode ser visualizada para os pCa: 6.0; 5.6; e 4,8 (2,48 ± 1,02;
6,33 ± 1,20; 8,97 ± 1,02 mN/mm2 vs Deca: 10,65 ± 1,93; 10,74 ± 1,51; e 14,07 ± 1,48
42
mN/mm2, p < 0,001, p < 0,05 e p < 0,05 vs. Ctrl) pelo aumento da tensão ativa em
resposta ao Ca2+ (Figura 25).
Tensão ativa pCa
4.85.25.66.06.46.87.20
4
8
12
16
CtrlDeca
*** *
*
pCa
Ten
são
(m
N/m
m2 )
Figura 25. Tensão isométrica em fibra cardíaca desnuda em diferentes pCa, os dados foram
ajustados pela equação de Hill (Y=Ymax * [Ca2+]Slope/(pCa50%slope + [Ca2+]slope, onde Y é
ligação do Ca2+ ao sítio especifico, sendo esta resposta traduzida aqui como tensão) (n = 5
para ambos os grupos). *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 vs Ctrl.
O aumento da sensibilidade ao Ca2+ é evidenciado pelo deslocamento da
curva de pCa para a esquerda (Figura 26A). Com a curva de pCa podemos
determinar então o pCa50% (Figura 26B), ou seja, a concentração de Ca2+ livre
necessária para atingir 50% da tensão máxima (50% da ligação do Ca2+ as fibras
contráteis) e o slope (Figura 26C), que é o fator de inclinação da curva. O grupo
Deca apresentou maior pCa50% (6,1± 0,05 vs Ctrl: 5,8 ± 0,06 ) e menor slope (-57,08
± 12,62 vs Ctrl: -24,43 ± 4,33).
43
Curva de pCa
4.85.25.66.06.46.87.20.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
CtrlDeca
pCa
Te
ns
ão
re
lati
va
pCa50%
Ctrl Deca
5.2
5.6
6.0
6.4**
pC
a
Ctrl Deca
-80
-60
-40
-20
0
*
Slo
pe
A
B C
Figura 26. A) Tensão isométrica relativa em fibra cardíaca desnuda em diferentes pCa
(valor de tensão normalizado pelo valor máximo obtido no pCa 4,8) (n = 5 para ambos os
grupos). B) pCa50%, pCa onde se atingiu 50% da tensão máxima. C) Slope, fator de
inclinação da curva. Os dados foram ajustados pela equação de Hill (Y=Ymax *
[Ca2+]Slope/(pCa50%slope + [Ca2+]slope, onde Y é ligação do Ca2+ ao sítio específico, sendo esta
resposta traduzida aqui como tensão) *p < 0,05 e **p < 0,01 vs Ctrl.
44
5. DISCUSSÃO
O presente estudo investigou o remodelamento elétrico cardíaco em ratos
sedentários tratados com dose suprafisiológica do esteroide anabólico decanoato de
nandrolona (Deca). Os nossos dados mostram que o tratamento crônico com
decanoato de nandrolona produz anormalidades na repolarização ventricular, com
aumento na duração do intervalo QT e dos potenciais de ação ventriculares. Estas
alterações induzidas pelo tratamento com o esteroide anabólico podem ser
atribuídas ao aumento da corrente despolarizante ICa,L e redução da corrente
repolarizante Ito. As alterações em ICa,L e Ito podem ser responsáveis pelas
alterações no acoplamento excitação-contração observadas nas fibras cardíacas de
ratos tratados com o esteroide anabólico.
Em nosso estudo, os animais tratados com dose suprafisiológica de esteroide
anabólico apresentaram menor massa corpórea ao final do período de tratamento,
em comparação aos animais não tratados. Esta diminuição do peso corporal do
grupo Deca pode ser devida a menor massa de tecido adiposo observada
previamente em ratos tratados com decanoato de nandrolona (Medei et al. 2010). A
massa cardíaca foi similar nos dois grupos, mas a razão entre a massa do coração e
massa corpórea estava aumentada no grupo Deca em comparação ao grupo Ctrl.
Entretanto, dado que o grupo Deca apresentou menor massa corpórea, pode ser
que este índice de hipertrofia cardíaca esteja superestimado. Quando analisado o
outro índice de hipertrofia cardíaca, que é a razão entre a massa cardíaca e o
comprimento da tíbia, não foi encontrada diferença entre os grupos. Outros estudos
com esteroide anabólico também mostraram resultados discrepantes, tais como
aumento da razão peso do coração sobre o peso corporal, mas não a do peso
absoluto do coração (Chaves et al., 2006; Fortunato et al., 2006; Pereira-Junior et
al., 2006; Rocha et al., 2007), aumento de ambos, peso absoluto e peso do coração
normalizado pela massa corpórea (Andrade et al., 2008), ou mesmo ausência de
diferença significativa entre grupos, tanto no peso absoluto quanto no peso relativo
do coração (Medei et al. 2010). Nesse estudo (Medei et al. 2010) não foi encontrada
diferença em relação ao grupo controle, tanto no peso absoluto quanto no peso
relativo do coração de ratos tratados com decanoato de nandrolona. Entretanto, a
45
análise morfométrica do miocárdio sugeriu hipertrofia cardíaca, visto que havia
diminuição do número de núcleos por área e aumento do diâmetro dos núcleos dos
cardiomiócitos. No estudo de Rocha e colaboradores (2007), não foi observada
diferença no diâmetro dos cardiomiócitos, embora tenha sido encontrada diferença
entre os pesos relativos dos corações dos grupos não-tratado e tratado com
decanoato de nandrolona.
Nosso estudo mostrou que mesmo sem evidência macroscópica de hipertrofia
cardíaca, os corações dos ratos tratados com esteroide anabólico apresentaram
alterações características de remodelamento elétrico cardíaco. O prolongamento do
intervalo QT no ECG de ratos tratados com esteroide anabólico pode ser associado
ao aumento na duração dos potenciais de ação do ventrículo esquerdo e corrobora
dados prévios de nosso laboratório (Medei et al. 2010). Os nossos resultados
mostraram aumento significativo na duração dos potenciais de ação do ventrículo
esquerdo dos animais tratados com decanoato de nandrolona ao nível de 30% e
90% da repolarização máxima. No potencial de ação ventricular de rato não há uma
definição clara entre as fases 2 e 3. Desta forma, o prolongamento do potencial de
ação ao nível de 30% sugere incremento de correntes despolarizantes e ao nível de
90% sugere uma diminuição da densidade das correntes repolarizantes.
Na análise do potencial de ação, não foram observadas mudanças na
amplitude do potencial de ação e na velocidade da fase 0, sugerindo que o
tratamento com esteroide anabólico não afetou a corrente de influxo de Na+
dependente de voltagem (INa). Como estes canais se inativam rapidamente,
normalmente não são determinantes para o aumento da duração do potencial de
ação cardíaco. No entanto, quando há retardo da inativação por ação de fármacos
(ex. veratridina) ou por mutação no gene SCN5A que codifica a subunidade α do
canal de Na+ (ex. arritmia cardíaca congênita conhecida como síndrome do QT longo
do tipo 3), há um ganho na função desse canal, na qual a corrente despolarizante é
sustentada por um maior tempo (Kramer et al., 2011). Um estudo recente mostrou
que a Ca2+-calmodulina dependente de cinase II induz aumento da INa mais
tardiamente, por modificações na cinética de inativação e mudança na inativação
steady state, o que favoreceria um aumento na duração do potencial de ação
(Wagner et al., 2006; Aiba e Tomaselli, 2010).
46
O prolongamento da duração do potencial de ação ventricular tem sido
observado consistentemente em diferentes modelos experimentais de hipertrofia
cardíaca como, por exemplo, no diabetes (Shimoni et al., 1994; Wang et al., 1995) e
na sobrecarga de pressão (Cerbai et al., 1994; Tomita et al., 1994). Nesses estudos,
os autores observaram diminuição da amplitude e mudanças nas características da
corrente transiente de efluxo (Ito), associadas ao prolongamento do potencial de
ação ventricular.
A corrente Ito é uma das principais correntes repolarizantes em
cardiomiócitos ventriculares de ratos, tendo papel importante no controle da duração
do potencial de ação. Vários trabalhos relacionam a diminuição da amplitude de Ito
com o aumento da duração do potencial de ação cardíaco em modelos de hipertrofia
e insuficiência cardíaca, concomitantemente com uma menor expressão,
principalmente, das subunidades α Kv1.4, Kv4.2 e Kv4.3 e da subunidade β KChIP2
do canal de K+ transiente de efluxo nos cardiomiócitos (Kaab et al., 1998; Tomaselli
e Marban, 1999; Aiba e Tomaselli, 2010). Em estudo prévio de nosso laboratório, no
qual colaborei (Medei et al., 2010), observamos diminuição na amplitude de Ito no
ventrículo esquerdo de ratos sedentários tratados com decanoato de nandrolona. No
presente estudo, nossos resultados mostram que a amplitude de Ito está diminuída
tanto nas células da camada subepicárdica, quanto na camada subendocárdica do
ventrículo esquerdo dos ratos do grupo Deca. Assim o remodelamento elétrico
parece ocorrer em todo o tecido ventricular esquerdo. Estes dados corroboram os
dados prévios de nosso laboratório, que mostraram redução da amplitude de Ito
associada à redução da expressão gênica das subunidades α Kv1.4 e Kv4.3 e da
subunidade regulatória β KChIP2 em cardiomiócitos do ventrículo esquerdo de rato
tratado com esteroide anabólico (Medei et al., 2010). A redução da amplitude de Ito
mais acentuada na camada subepicárdica pode favorecer o aumento da
heterogeneidade da repolarização, levando ao aumento da dispersão da
repolarização ventricular, que é um fator de risco associado a eventos arrítmicos e
morte súbita (Kramer et al., 2011). Neste contexto, Maior e colaboradores (2010)
observaram, em indivíduos atletas usuários de esteroides anabólicos o aumento do
intervalo QTc em repouso e após atividade física. Além disso, verificou-se aumento
da dispersão do intervalo QT, o que indica maior heterogeneidade da repolarização
ventricular, considerada na clínica como fator de risco para distúrbios de reentrada e
47
desencadeamento de arritmias ventriculares graves, como as taquiarritmias
polimórficas (Torsade de pointes) e morte súbita (Kramer et al., 2011).
Outros estudos mostraram que o prolongamento do potencial de ação na
hipertrofia cardíaca pode estar associado também ao aumento da amplitude da
corrente e alterações na cinética do canal de Ca2+ tipo L (Wang et al., 2001; Perrier
et al., 2004; Wang et al., 2008; Martin-Fernandez et al., 2009). Assim, Wang e
colaboradores (2001) mostraram aumento da amplitude da corrente e aceleração da
reativação de ICa,L. Em 2008, Wang e colaboradores mostraram aumento da
expressão da subunidade Cav1.2 do canal Ca2+ tipo L, na mesma proporção, tanto
na camada endocárdica, quanto na camada epicárdica, porém a amplitude da ICa,L
estava aumentada apenas na camada epicárdica do ventrículo. O aumento de ICa,L
apenas na camada subepicárdica pode contribuir para o aumento da dispersão da
repolarização nas subcamadas da parede ventricular, devido a não homogeneidade
regional do aumento da duração do potencial de ação (Wang et al., 2001; Wang et
al., 2008; Toischer et al., 2010). No presente estudo, mostramos que há incremento
na amplitude da corrente de cálcio tipo L e aceleração da reativação de ICa,L, sem
alteração na dependência de voltagem da ativação e inativação steady state nos
cardiomiócitos ventriculares dos ratos tratados com decanoato de nandrolona. A
maior densidade da ICa,L já foi relacionada, em modelos de hipertrofia cardíaca, com
uma maior expressão e atividade da Ca2+-calmodulina dependente de proteína
cinase II (CaMKII). A CaMKII parece modular o canal de Ca2+ tipo L, pois, quando
inibida por um antagonista especifico, a densidade e a cinética da corrente foi similar
à do grupo controle (Wang et al., 2001; Wang et al., 2008; Toischer et al., 2010).
Além disso, a CaMKII também pode aumentar a atividade da Ca-ATPase do reticulo
sarcoplasmático (SERCA) por fosforilação da fosfolambam, que exerce modulação
inibitória sobre a SERCA (Kranias e Hajjar, 2012).
A tensão contrátil das fibras cardíacas do grupo Deca foi menor do que a do
controle, tanto em resposta a diferentes concentrações de cafeína, após um tempo
fixo de carregamento do retículo sarcoplasmático com Ca2+, quanto em resposta a
20 mM de cafeína após diferentes tempos de carregamento. Este resultado sugere
que há menor liberação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático. Entretanto, na
ausência do retículo sarcoplasmático, as fibras desnudas do grupo Deca
48
apresentavam maior tensão em resposta a diferentes pCa, isto é, a curva de pCa se
apresentava deslocada para a esquerda, em comparação ao grupo controle, e tinha
maior inclinação, sugerindo que as proteínas sarcoméricas apresentavam maior
sensibilidade ao Ca2+. Alterações nas correntes ICa,L e Ito produzem mudanças na
morfologia e duração do potencial de ação cardíaco. Essas mudanças afetam o
transiente de Ca2+ que estimula a liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático.
Kaprielan e colaboradores (1999) observaram que, após o infarto do miocárdio, o
prolongamento da duração do potencial de ação era acompanhado por aumento da
amplitude do transiente de Ca2+. Esses autores demonstraram que o efeito sobre o
transiente de Ca2+ era pouco dependente do conteúdo de Ca2+ do retículo
sarcoplasmático e mais dependente da morfologia do potencial de ação. A atividade
do canal de Ca2+ tipo L e do trocador Na-Ca depende do potencial de membrana. De
acordo, fatores que modulam a forma do potencial de ação, modulam o influxo de
Ca2+ que estimula a liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático, afetando a
cinética e a amplitude do transiente de Ca2+ e, portanto, a força contrátil (Bassani et
al., 1995; Sah et al., 2001).
Já foi demonstrado que o tratamento crônico com decanoato de nandrolona
induz ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona (Rocha et al. 2007;
Marques-Neto et al. 2013) e que a expressão dos receptores de angiotensina II
(AT1) e de aldosterona (MR) está aumentada no ventrículo esquerdo de ratos
tratados com este esteroide anabólico (Marques-Neto et al., 2014). Gómez e
colaboradores (2009) observaram em miócitos ventriculares de ratos adultos,
incubados por 48 horas em presença de 100 mM de aldosterona, que o conteúdo de
Ca2+ do retículo sarcoplasmático e a expressão do receptor de rianodina (RyR)
estavam inalterados, entretanto, a atividade do RyR estava aumentada, bem como a
frequência de sparks de Ca2+ espontâneos. A mudança na atividade do RyR foi
associada à menor expressão das proteínas regulatórias do RyR (FKBP12 e
FKBP12.6).
Vários estudos em modelos de insuficiência cardíaca mostram que há
aumento do vazamento de Ca2+ do reticulo sarcoplasmático durante a diástole, como
resultado de disfunção do receptor de rianodina (Shannon e Lew, 2009; Shan et al.,
2010). Os mecanismos propostos incluem: 1) aumento da atividade do RyR por
49
fosforilação pelas proteínas cinase A e/ou cinase dependente de calmodulina (Xiao
et al., 2005; Bers, 2006; Shannon e Lew, 2009); 2) aumento da sensibilidade do RyR
ao Ca2+ luminal (Kubalova et al., 2005; Shannon e Lew, 2009); e, 3) dissociação da
FKBP12.6, proteína regulatória do RyR. Esta proteína é necessária para estabilizar o
RyR no estado fechado, prevenindo o vazamento diastólico do Ca2+ (Brillantes et al.,
1994; Shannon e Lew, 2009; Marx e Marks, 2013). Assim, para explicar os nossos
resultados dos ensaios de carregamento e liberação de Ca2+ do retículo
sarcoplasmático podemos sugerir que o tratamento por 8 semanas com decanoato
de nandrolona possa ter causado alguma disfunção do RyR que resultou em
aumento do vazamento diastólico do Ca2+, portanto, menor conteúdo de Ca2+ do
retículo sarcoplasmático disponibilizado para liberação, contribuindo para a redução
do transiente de Ca2+ e da tensão contrátil.
Na análise do ECG não vimos diferença na frequência cardíaca dos dois
grupos experimentais. Entretanto, sabemos que o aumento da atividade do sistema
renina-angiotensina leva à ativação do sistema simpático (Zucker et al., 2009;
Dupont e Brouwers, 2010). De fato, estudos prévios de nosso laboratório mostram
que, em ratos tratados com decanoato de nandrolona, há diminuição da modulação
cardíaca pelo sistema parassimpático e predomínio do tônus simpático (Pereira-
Junior et al., 2006), sendo o efeito do esteroide anabólico sobre o balanço
autonômico prevenido pelo tratamento com bloqueadores do sistema renina-
angiotensina-aldosterona (Marques-Neto et al., 2013). Na insuficiência cardíaca, a
hiperativação simpática e aumento da fosforilação do RyR causa vazamento
diastólico de Ca2+ (Ather et al., 2013). Portanto, podemos sugerir que nos ratos
tratados com esteroide anabólico a hiperativação simpática pode causar nos
cardiomiócitos ventriculares disfunção do RyR e vazamento diastólico de Ca2+.
Nossos resultados dos ensaios de tensão x pCa sugerem que o tratamento
com decanoato de nandrolona aumentou a sensibilidade das proteínas contráteis ao
Ca2+. Podemos sugerir que houve resposta cardíaca adaptativa, na qual as fibras
contráteis tornaram-se mais sensíveis ao Ca2+ para compensar o menor transiente
de Ca2+ devido ao vazamento de cálcio dos estoques.
50
6. CONCLUSÃO
A nossa conclusão é que, em ratos sedentários, a administração crônica do
esteroide anabólico decanoato de nandrolona, em dose suprafisiológica, induziu:
1) remodelamento elétrico cardíaco, com prolongamento da duração do potencial de
ação ventricular e do intervalo QT em decorrência do aumento de ICa,L e redução de
Ito. 2) alteração do acoplamento excitação-contração, com menor carregamento e
liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático e maior sensibilidade das proteínas
contrateis ao Ca2+ .
51
7. PERSPECTIVAS PARA O DOUTORADO Investigar o remodelamento cardíaco e a repercussão funcional na
insuficiência cardíaca induzida por doses supra-fisiológicas de esteroide anabólico.
Para isso, propomos os seguintes objetivos específicos:
1. Avaliar os efeitos da administração de decanoato de nandrolona por 12 semanas
sobre:
a. a função ventricular sistólica e diastólica;
b. os parâmetros eletrocardiográficos e dos potenciais de ação
ventriculares;
c. a expressão e a atividade de canais iônicos responsáveis pela
eletrogênese cardíaca;
d. o acoplamento excitação-contração cardíaca e o sistema de
mobilização de Ca2+ (medida de transientes de cálcio);
e. a expressão e a atividade das proteínas envolvidas no acoplamento
excitação-contração cardíaca (canal de Ca2+ tipo L, trocador sódio-cálcio,
receptor de rianodina, SERCA2a, fosfolambam, e FKBP12.6 e
calsequestrina).
2. Avaliar se o tratamento com antagonistas do sistema renina-angiotensina-
aldosterona e beta-bloqueadores previnem o remodelamento cardíaco e a
insuficiência cardíaca induzidos pelo esteroide anabólico.
52
8. REFERÊNCIAS
AIBA, T.; TOMASELLI, G. F. Electrical remodeling in the failing heart. Curr Opin Cardiol, v. 25, n. 1, p. 29-36, Jan 2010.
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