UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO

PAULO CÉSAR ARANTES

EFEITO CRÔNICO DE ESTERÓIDES ANABÓLICOS SOBRE AS

CORRENTES ICa,L E Ito E A MOBILIZAÇÃO DE CÁLCIO EM MIÓCITOS

VENTRICULARES DE RATOS

DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO

DE JANEIRO VISANDO À OBTENÇÃO DO GRAU DE

MESTRE EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – FISIOLOGIA

Rio de Janeiro 2014

PAULO CÉSAR ARANTES

EFEITO CRÔNICO DE ESTERÓIDES ANABÓLICOS SOBRE AS

CORRENTES ICa,L E Ito E A MOBILIZAÇÃO DE CÁLCIO EM MIÓCITOS

VENTRICULARES DE RATOS

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Fisiologia)

Orientador: Jose Hamilton Matheus Nascimento

Professor Associado do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

Co-orientadora: Cristiane del Corsso

Professor Associado do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

Rio de Janeiro 2014

FICHA CATALOGRÁFICA

Efeito Crônico de Esteróides Anabólicos Sobre a Corrente ICa,L e Ito e a Mobilização de Cálcio em Miócitos Ventriculares / Paulo César Arantes. Rio de Janeiro. UFRJ / IBCCF, 2014.

Dissertação (Mestrado em Fisiologia) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Pós-Graduação em Fisiologia, 2014. Orientador: José Hamilton Matheus Nascimento Co-orientadora: Cristiane del Corsso 1. Eletrofisiologia Cardíaca. 2. Decanoato de Nadrolona. 3. Corrente de Cálcio – Teses. I. Nascimento, José Hamilton Matheus (Orientador). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho IBCCF. III. Titulo: Efeito Crônico de Esteróides Anabólicos Sobre a Corrente ICa,L e Mobilização de Cálcio em Miócitos Ventriculares

CDD: Paulo César Arantes

EPÍGRAFE

“A fisiologia é, na verdade, uma explicação da vida. Quem, seja um teólogo, um jurista, um doutor, um físico, sabe mais do que você, um fisiologista, sobre a vida? Que outro assunto é mais fascinante, mais excitante, ou mais belo do que a vida?”

Physiology, a Beauty and a Philosophy. Guyton, 1975.

DEDICATÓRIA

Especialmente à minha família e minha namorada pelo apoio e compreensão dos momentos de ausência e desespero ao longo destes 2 anos.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente quero agradecer a Deus por me conceber o dom da vida

e por estar comigo a cada passo que eu dou em minha carreira.

Agradeço à minha mãe, Maria Lucia Arantes, por todo carinho, amor e

dedicação, estando sempre disposta a me ajudar nos momentos mais difíceis,

e com seu temperamento forte e um pouco de rigidez educacional me fez um

filho mais educado. Ao meu pai, António Clarete Arantes, sempre presente

transmitindo além de seu amor, muita confiança, respeito e calma mesmo em

meio às dificuldades. À minha irmã e ao meu irmão, Ana Clara Maria Arantes e

Emerson Clayton Arantes, pela cumplicidade, amizade e pelas muitas brigas,

cujos motivos nunca me lembro. Aos meus avôs, meus tios e tias por ajudarem

em minha criação, ajudando a construir as bases morais que regem minha

vida, pelos momentos fraternos vividos, pelos conselhos, amor, carinho e

dedicação e até mesmo pelas discussões. Enfim, agradeço a todos os meus

familiares que contribuem para minha formação e me dão forças para seguir

lutando a cada dia.

Agradeço a meus amigos sinceros pelos momentos de alegria nos quais

compartilhamos muitas risadas, estórias, longas conversas, conselhos e acima

de tudo agradeço pelo companheirismo, dedicação e respeito e pelo imenso

privilégio de suas companhias. Agradeço a cada dia pelo apoio de meus

amigos, pois rico é aquele que tem amigos, estes corroboram para a formação

de um Paulo melhor. Particularmente, agradeço ao Voltaço, Dudu, Fernando,

Estefani, Luana, Camila, Fred, André.

Agradeço principalmente à minha namorada Camila pelo apoio, amor,

carinho e compreensão, estando sempre ao meu lado.

Ao meu orientador, José Hamilton Matheus Nascimento, pela

dedicação ao projeto, pelos conselhos, pela base do pensamento científico e

pela imensa compreensão na difícil tarefa que é conciliar um curso de biofísica

com o desenvolvimento da pesquisa no laboratório. E a professora Cristiane

como coorientadora e professora, por ajudar a agregar a meu conhecimento

cientifico.

Enfim, aos amigos do Laboratório de Eletrofisiologia Cardíaca Antônio

Paes de Carvalho: Leo, Mara, Manu, Thais, Aina, Jamil, Pedro, Edila e

Dahienne

Agradeço a meus colegas de trabalho que estão dispostos a ajudar caso

seja necessário.

Por fim, agradeço a todos que contribuíram para a realização desse

trabalho. Muito obrigado pelo apoio de familiares, amigos e colegas de

trabalho.

E aos doutores formados pelo laboratório ao longo destes anos que

contribuíram muito com belíssimas discussões científicas, parcerias em

experimentos, além de FeSBEs e cervejas às sextas após o trabalho. E ao

professor Emiliano Medei, sempre disposto a colaborar em nosso crescimento

acadêmico e científico.

RESUMO

ARANTES, Paulo César. Efeito crônico de esteróides anabólicos sobre as

correntes ICa,L e Ito e a mobilização de cálcio em miócitos ventriculares de

ratos. Rio de Janeiro, 2014. Dissertação (Mestrado em Ciências - Fisiologia) -

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Rio de Janeiro, 2014.

Esteroides anabólicos (EAs) são derivados sintéticos da testosterona utilizados

ilicitamente por atletas e não atletas, em doses supra-fisiológicas, para

promover ganho de massa muscular, força e resistência ou para fins estéticos.

Os EAs causam efeitos colaterais, dentre eles alterações cardiovasculares,

como hipertensão arterial, hipertrofia cardíaca, arritmias e infarto do miocárdio.

Este estudo objetivou investigar o remodelamento elétrico cardíaco e sua

repercussão no acoplamento excitação-contração, induzido pela administração

crônica de EAs. Ratos sedentários foram administrados por 8 semanas com 10

mg/kg/sem. (i.m.) de decanoato de nandrolona (Deca) ou veículo (Ctrl). Na

avaliação dos parâmetros de repolarização ventricular, o grupo Deca

apresentou aumento do intervalo QT (70,50 ± 2,70 ms vs Ctrl: 59,58 ± 1,16 ms,

N=6, p<0,001) e QTc (179,9 ± 6,79 ms vs Ctrl: 149,87 ± 3,14 ms, N=6,

p<0,001), sem alteração da frequência cardíaca; aumento na duração do

potencial de ação a 30% (15,9 ± 0,36 mV, N=10 vs Ctrl: 8,9 ± 0,27 mV, N=11;

p<0,001) e a 90% (124,4 ± 3,86 mV, N=10 vs Ctrl: 58,4 ± 1,81mV, N=11;

p<0,001) da repolarização máxima; e aumento da triangulação do potencial de

ação (108,5 ± 3,73 mV, N=10 vs Ctrl: 49,5 ± 1,75 mV, N=11; p<0,001). A

amplitude de Ito nas camadas endocárdica (60 mV: 8,7 ± 0,71 pA/pF, N=5 vs.

Ctrl: 16,0 ± 2,07 pA/pF, N=13; p<0,05) e epicárdica (60 mV: 10,2 ± 1,00 pA/pF,

N=4 vs Ctrl: 20,9 ± 1,86 pA/pF, N=13; p<0,001) do ventrículo esquerdo foi

menor, enquanto a amplitude da ICa,L (10 mV: -10,4 ± 1,44 pA/pF, N=17 vs Ctrl:

-7,7 ± 0,48 pA/pF, N=36; p<0.01) foi maior no grupo Deca. Na avaliação do

acoplamento excitação-contração, as medidas de tensão isométrica em fibra

cardíaca desnuda mostraram que o grupo Deca desenvolve maior tensão nos

pCa 6,0; 5,6; e 4,8 (pCa 6: 10,65 ± 1,93 mN/mm2 vs Ctrl: 2,48 ± 1,02 mN/mm2;

N=5, p<0,001) e maior sensibilidade ao Ca2+ (pCa50%: 6,1± 0,05 vs Ctrl: 5,8 ±

0,06 p<0,01; slope: -57,1 ± 12,6 vs Ctrl: -24.4 ± 4,3 mN/mm2, p<0,05). O grupo

Deca apresentou menor resposta contrátil a diferentes concentrações de

cafeína após tempo fixo (3 min) de carregamento de Ca2+ (5 mM de cafeína: 19

± 8%, N=5 Deca vs Ctrl: 52 ± 6 %, N=4, p<0,001) e a 20 mM de cafeína após 1,

3 e 5 min de carregamento do reticulo sarcoplasmático (1min: 16 ± 8% vs Ctrl:

40 ± 7%, N=5 cada, p<0,001). Concluímos que a administração crônica com

decanoato de nandrolona causou remodelamento elétrico cardíaco nas

amplitudes de ICa,L e Ito, que refletiram no acoplamento excitação-contração,

causando menor mobilização e maior sensibilidade ao Ca2+.

ABSTRACT

ARANTES, Paulo César. Chronic effect of anabolic steroids on ICa,L and Ito

currents and calcium mobilization in ventricular myocytes. Rio de Janeiro,

2014. Dissertação (Mestrado em Ciências - Fisiologia) - Instituto de Biofísica

Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,

2014.

Anabolic steroids (ASs) are synthetic derivatives of testosterone illicitly used by

athletes and non-athletes at supra-physiological doses, to promote muscle

mass gain, strength and resistance or even for an esthetic purpose. The ASs

cause side effects, among them cardiovascular changes, such as arterial

hypertension, cardiac hypertrophy, arrhythmias and myocardial infarction. This

study aimed to investigate the cardiac electrical remodelling and its

repercussion on excitation-contraction coupling induced by chronic

administration of ASs. Sedentary rats were administrated for 8 weeks with 10

mg/kg/week of nandrolone decanoate (Deca) or vehicle (Ctrl). Assessing

ventricular repolarization parameters, the Deca group showed an increase in

the QT (70.50 ± 2.70 ms vs. Ctrl: 59.58 ± 1.16 ms, N=6, p<0.001) and QTc

(179.9 ± 6.79 ms vs. Ctrl: 149.87 ± 3.14 ms, N=6, p<0.001) intervals, without

changes in heart rate; an increase in the duration of the action potential at 30%

(15.9 ± 0.366 mV, N=10 vs. Ctrl: 8.9 ± 0.27 mV, N=11; p<0.001) and 90%

(124.4 ± 3.86 mV, N=10 vs. Ctrl: 58.4 ± 1.81 mV, N=11; p<0.001) of the

maximum repolarization; and increased triangulation of the action potential

(108.5 ± 3.73 mV, N=10 vs. Ctrl: 49.5 ± 1.75 mV, N=11; p<0.001). Ito amplitude

in the endocardial (60 mV: 8.7 ± 0.71 pA/pF, N=5 vs. Ctrl: 16.0 ± 2,07 pA/pF,

N=13; p<0.05) and epicardial (60 mV: 10.2 ± 1.00 pA/pF, N=4 vs. Ctrl: 20.9 ±

1.86 pA/pF, N=13; p<0.001) layers of the left ventricle were lower while the ICa,L

amplitude (10 mV: -10.4 ± 1.44 pA/pF, N=17 vs. Ctrl: -7.7 ± 0.48 pA/pF, N=36;

p<0.01) was higher in the Deca group. The evaluation of excitation-contraction

coupling, showed that the measures of isometric tension in denuded cardiac

fiber was greater in Deca group in pCa 6.0; 5.6; and 4.8 (pCa 6: 10.65 ± 1.93

mN/mm2 vs. Ctrl: 2.48 ± 1.02; mN/mm2; N=5, p<0.001), which also shows a

greater sensitivity to Ca2+ (pCa50%: 6.1 ± 0.05 vs. Ctrl: 5.8 ± 0.06 p<0.01; slope:

-57.1 ± 12.6 vs. Ctrl: -24.4 ± 4.3 mN/mm2 p<0.05). Deca group showed lower

contractile response to different concentrations of caffeine after 3 min of loading

time (5 mM of caffeine: 19 ± 8%, N=5 Deca vs. Ctrl: 52 ± 6 %, N=4, p<0.001)

and to 20 mM caffeine after 1, 3 and 5 min of reticulum sarcoplasmic loading

times (1 min: 16 ± 8%, vs. Ctrl: 40 ± 7%, N=5 each, p<0.001). We conclude that

the chronic administration of nandrolone decanoate caused cardiac electrical

remodelling and that changes in the amplitudes of ICa,L and Ito were reflected in

excitation-contraction coupling, causing lower mobilization and increased

sensitivity to Ca2+.

LISTA DE ABREVIATURAS e SIGLAS

AMPc : Adenosina monofosfato cíclico

ATP: Adenosina trifosfato

CaMKII : Ca2+ Calmodulina dependente de proteína cinase II

COB: Comitê Olímpico Brasileiro

Ctrl: controle

CREB: Elemento responsivo à ligação do AMPc

Deca: decanoato de nandrolona

DNA: Ácido desoxirribonucléico

DPA: duração do potencial de ação celular

DPA 30: duração do potencial de ação medido a 30% da repolarização

DPA 90: duração do potencial de ação medido a 90% da repolarização

ECG: eletrocardiograma

EGTA : Etilenoglicol-bis(2aminoetilèter)-N,N,N’,N’- tetraacético

ERK : Cinase de regulação extracelular

FC: freqüência cardíaca

GTP: guanosina trifosfato

G: Giga Ohms

HEPES: ácido 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico

HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana

I/V: relação corrente/voltagem

ICa: corrente de cálcio

IK: corrente de potássio retificadora retardada

IK1: corrente de potássio retificadora de influxo

IK,Ach: corrente de potássio retificadora de influxo ativada por acetilcolina

IK,ATP: corrente de potássio retificadora de influxo ativada por ATP

IKr: corrente de potássio retificadora retardada de componente rápido

IKs: corrente de potássio retificadora retardada de componente lento

INa: corrente de sódio

Ito: corrente transiente de saída de potássio

Kv: isoforma predominante da subunidade α da corrente IK

KB: Kraft-Brühe

MAPK: proteína cinase ativada por mitógeno

N: número de animais ou células do experimento

NIDA: National Institute on Drug Abuse

PA: potencial de ação

PKA: proteína cinase dependente de AMPc

PI3K : fosfoinositídeo 3-cinase

QTc: intervalo QT corrigido pela frequência cardíaca

QTd: dispersão do intervalo QT do eletrocardiograma

RS: retículo sarcoplasmático

TdP: Torsade de pointes

TEA-Cl: cloreto de tetraetilamônio

V1/2 : voltagem correspondente à metade da ativação ou inativação

Vh: potencial holding, no qual a célula é mantida para estudo eletrofisiológico

LISTA DE FIGURAS

1 Biossíntese e metabolismo de esteróides endógenos. 5

2 Estrutura molecular da testosterona e do decanoato de nandrolona. 7

3 Esquema das vias de sinalização ativadas por hormônios esteróides. 8

4 Relação entre o eletrocardiograma (ECG), o potencial de ação

ventricular (PA) e arritmias ventriculares.

11

5 Esquema ilustrativo da cuba experimental. 21

6 Esquema ilustrativo do protocolo para avaliação da permeabilização

do feixe de fibras cardíacas, da integridade das proteínas contráteis e

do retículo sarcoplasmático.

23

7 Esquema ilustrativo do protocolo para a avaliação da captação de

Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático.

24

8 Esquema ilustrativo do protocolo para a avaliação da liberação de

Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático.

25

9 Esquema ilustrativo do protocolo para a avaliação da liberação de

Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático.

26

10 Efeito da administração crônica de decanoato de nadrolona sobre a

massa corporal (g) ao longo de 8 semanas de tratamento.

27

11 Peso do coração absoluto e relativo. 28

12 ECG representativo Ctrl e Deca (A), frequência cardíaca (B), intervalo

QT (C) e intervalo QT corrigido pela frequência cardíaca (D).

29

13 Traçados representativos de potenciais de ação. 30

14 Potencial de repouso e amplitude do potencial de ação 31

15 Duração do potencial de ação a 30% e 90% da repolarização máxima. 31

16 Relação corrente/voltagem de ICa,L. 33

17 Curva de dependência de voltagem da ativação de ICa,L. 34

18 Curva de dependência de voltagem da inativação steady-state de ICa,L 35

19 Curva de recuperação da inativação de ICa,L. 36

20 Ito em células da camada subepicárdica e relação corrente/voltagem

de Ito.

37

21 Ito em cardiomiócitos da camada subendocárdica e relação

corrente/voltagem de Ito.

38

22 Curva de dependência de voltagem da inativação steady-state de Ito. 39

23 Resposta contrátil à cafeína em diferentes tempos de carregamento

do RS.

40

24 Resposta contrátil à diferentes concentrações de cafeína. 41

25 Tensão isométrica em fibra cardíaca desnuda em diferentes pCa. 42

26 Tensão isométrica em fibra cardíaca desnuda em diferentes pCa e

sensibilidade (pCa50% e slope).

43

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Composição das soluções W e R utilizadas nos experimentos

com fibras desnudas.

20

Tabela 2 Composição das soluções de pCa utilizadas nos experimentos

com fibras desnudas.

22

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 1

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

2

3

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

3.6.1

3.6.2

3.7

4

4.1

4.2

Abuso de esteróides anabólicos

Efeitos colaterais do consumo abusivo de esteróides anabólicos

Uso clínico de esteróides anabólicos

Testosterona

Esteróides Anabólicos

Decanoato de Nandrolona

Mecanismos de Ação

Bases Eletrofisiológicas

OBJETIVOS

MATERIAIS E MÉTODOS

Animais

Tratamento

Registro eletrocardiográfico in vivo

Registro intracelular do potencial de ação

Correntes iônicas

Avaliação da regulação de Ca2+ intracelular

Captação e liberação de Ca2+ pelo RS

Função contrátil e sensibilidade ao Ca2+

Análise estatística

RESULTADOS

Biometria

Efeito do tratamento crônico com decanoato de nandrolona sobre a

1

2

4

4

5

6

7

8

14

15

15

15

15

16

17

20

22

25

26

27

27

28

4.3

4.4

4.5

4.6

4.6.1

4.6.2

5

6

7

8

frequência cardíaca e intervalo QT

Efeito do tratamento crônico com decanoato de nandrolona sobre o

potencial de ação ventricular

Efeito do tratamento crônico com decanoato de nandrolona sobre a

corrente de Ca2+ tipo L

Efeito do tratamento crônico com decanoato de nandrolona sobre a

corrente transiente de efluxo de K+ (Ito)

Efeito do tratamento crônico com decanoato de nandrolona sobre a

regulação do Ca2+ intracelular

Captação e liberação de Ca2+ intracelular pelo RS

Função contrátil e sensibilidade ao Ca2+

DISCUSSÃO

CONCLUSÃO

PERSPECTIVAS PARA O DOUTORADO

REFERÊNCIAS

29

32

36

39

40

41

44

50

51

52

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Abuso de esteroides anabólicos

A busca pela vitória, seja em guerras ou em competições esportivas, veio a

estimular a busca por melhora do desempenho de alto rendimento, tanto de

soldados quanto de atletas. Visando-se aumentar o desempenho físico, substâncias

estimulantes e anabólicas foram e ainda são desenvolvidas e consumidas (De Rose,

2008).

Os chineses, há 4 mil anos, conheciam os efeitos do chá da planta chamada

“machuang”, que continham efedrina (um estimulante, não esteroidal) em altas

doses e era utilizada para aumentar a capacidade de trabalho. Nos primeiros jogos

olímpicos da Era Moderna já havia relatos do uso de estimulantes (Correia, 2009).

Após a Segunda Guerra Mundial, as anfetaminas e os esteroides anabólicos

tornaram-se as principais drogas de abuso entre atletas. O mais antigo relato de

abuso de esteroide anabólico data do ano de 1954, tendo sido documentado em

atletas soviéticos (De Rose, 2008). Os esteroides anabólicos, dentre outras

substâncias, são consideradas substâncias proibidas pelo Código Mundial

Antidoping e classificadas como doping (COB, 2012).

O uso de esteroides anabólicos se destacou principalmente no meio

esportivo, devido às propriedades anabólicas que promovem o aumento de massa

muscular, do desenvolvimento de força, da velocidade de recuperação da

musculatura, a diminuição da gordura corporal e o aumento da eritropoiese,

melhorando o desempenho físico (Evans, 2004).

A dosagem utilizada no consumo abusivo de esteroides anabólicos é de 10 a

100 vezes superior à dose terapêutica, sendo tomada por um período de 4 a 18

semanas, seguida por um período de descanso variável de 1 a 12 meses. Os

esteroides anabólicos podem ser utilizados por via oral ou intramuscular

dependendo do anabólico em questão. O ciclo de uso mais comum é o piramidal

que consiste no aumento gradual da dose e da frequência do esteroide anabólico

até se atingir o pico, depois do pico ocorre o processo inverso, há a diminuição

gradual da droga (Hall, 2005; NIDA, 2006). O decanoato de nandrolona é um dos

principais esteroides anabólicos de usados ilicitamente (NIDA, 2006).

2

Segundo levantamento da NIDA (National Institute on Drug Abuse), em

2013, o percentual de estudantes americanos que fizeram uso de esteroides

anabólicos ao menos uma vez foi de 1,1 % na 8ª série, 1,3 % na 10º série, e 2,1 %

na 12º série (NIDA; 2014). Outra estimativa do uso de esteroides anabólicos nos

Estados Unidos mostrou que há mais de 3 milhões de usuários e que 2,7-2,9% dos

adultos jovens já utilizaram esteroides anabólicos ao menos uma vez na vida

(Evans, 2004). Entre praticantes de exercícios em academias, o número de usuários

varia de 15 e 30% (Evans, 2004). Há também os usuários de esteroides anabólicos

que não são atletas, e consomem esteroides com fins recreacionais e estético. Entre

adolescentes americanos, estima-se que 3% a 12% dos jovens e 0,5% a 2% das

jovens já fizeram uso de esteroides anabólicos (Evans, 2004). O número crescente

de usuários de esteroides anabólicos pode se tornar um problema de saúde publica

em médio prazo, devido aos efeitos colaterais decorrentes do abuso destas drogas

(Evans, 2004). Entre estudantes europeus, dados levantados recentemente pelo

Projeto ESPAD (Andersson et al., 2007) apontam prevalência de 2 a 3% para o

abuso de esteroides anabólicos.

No Brasil, alguns dados já mostraram o uso de esteroides anabólicos por

jovens, sendo que em um levantamento realizado entre estudantes da área da

saúde da Universidade Federal do Amazonas, em Manaus, estimou prevalência de

2,1% para o abuso de esteroides anabólicos durante a vida (Lucas et al. 2006).

Resultados similares foram encontrados por Canuto et al. (2006), os quais

estimaram ser de 2,7% a prevalência entre calouros da Universidade Federal de

Goiás, em Goiânia. Em São Paulo estima-se que entre os praticantes de atividade

físicas nas academias 19% fazem ou fizeram uso de esteroides anabólicos (Silva e

Moreau, 2003). Assim, tanto internacionalmente quanto no âmbito nacional podemos

ver que o abuso de esteroides anabólicos torna-se um problema de saúde pública,

devido os seus efeitos colaterais.

1.2. Efeitos colaterais do consumo abusivo de esteroides anabólicos

Os efeitos colaterais do abuso dos esteroides anabólicos são muitos,

normalmente relacionado à estimulação excessiva dos alvos da testosterona. No

3

homem, o abuso dessas substâncias pode promover uma inibição do eixo

hipotálamo – hipófise – gônadas, devido à retroalimentação negativa causada pelas

elevadas concentrações de andrógenos exógenos, diminuindo as concentrações do

hormônio luteinizante (LH) e folículo estimulante (FSH). A diminuição desses

hormônios leva à supressão da produção endógena de andrógenos nos testículos e

consequentemente, a casos de hipogonadotrofismo, impotência sexual, atrofia

testicular e alterações na quantidade e mobilidade do esperma (Bickelman et al.,

1995; Bahrke e Yesalis, 2004; Evans, 2004). Nas mulheres, ocorrem efeitos

masculinizantes, com aumento de pelos faciais, engrossamento de voz, redução do

volume dos seios, diminuição do índice de gordura corporal, hipertrofia do clitóris,

ginecomastia, perda de cabelo (calvície) e hirsutismo (Evans, 2004; Maravelias et

al., 2005). No sistema músculo-esquelético, o abuso de esteroide anabólico pode

levar à maior ocorrência de lesões músculo-tendinosas, por aumentar a rigidez dos

tendões em conseqüência da diminuição da produção de elastina. Se consumido por

jovens em idade pré-púbere, pode induzir o fechamento epifisário precoce, levando

à baixa estatura permanente (Strauss & Yesalis, 1991; Evans, 2004). Na pele, o

abuso de esteroides anabólicos está associado a acnes, dermatites, aumento da

oleosidade da pele e dos cabelos, icterícia, estrias, calvície masculina (alopecia)

(Evans, 2004). Os esteroides anabólicos podem induzir o aumento de enzimas

hepáticas, como alanina e asparagina-aminotransferases, lactato desidrogenase,

dentre outras. Adicionalmente, podem induzir o surgimento de tumores malignos e

benignos no fígado. O hepatocarcinoma tem sido associado a esteroides como

oximetalona e metil–testosterona (Maravelias et al., 2005).

O abuso de esteroides anabólicos tem sido associado a efeitos psicológicos,

tais como, depressão, alterações de humor agressividade, além de síndromes

afetivas e psicóticas (Bahrke e Yesalis, 2004). Os efeitos negativos do abuso de

esteroides anabólicos no sistema cardiovascular são muitos, dentre eles podemos

citar: hipertrofia ventricular, hipertensão arterial, disfunção diastólica, dislipidemia,

arterosclerose, trombose, vasoespasmo, insuficiência cardíaca, infarto agudo do

miocárdio, cardiomiopatia, arritmias ventriculares e morte súbita (Fineschi et al.,

2001; Evans, 2004; Hartgens et al., 2004; Fineschi et al., 2007; Bispo et al., 2009;

Van Amsterdam et al., 2010). É definida como morte súbita cardíaca a morte por

causa cardíaca (taquiarritmia/fibrilação ventricular, assistolia ou evento de origem

4

não arrítmica), que ocorra fora do ambiente hospitalar, subitamente, ou em um

período igual ou menor que uma hora a partir do aparecimento de sintomas

(Goldberger et al., 2008). Dentre os distúrbios anteriormente citados, as arritmias

ventriculares são um dos principais fatores que podem levar à morte súbita. Há

vários relatos de casos de usuários que faziam uso abusivo de esteroides

anabólicos e morreram por morte súbita cardiaca. A análise histopatológica, após o

óbito, encontrou hipertrofia ventricular, com remodelamento morfológico; intensa

deposição de colágeno, que pode levar a distúrbios de condução elétrica gerando

arritmias e diminuição da complacência (Fineschi et al., 2007; Montisci et al., 2012).

1.3. Uso clínico de esteroides anabólicos

Os diversos efeitos benéficos da testosterona levaram à produção de

análogos sintéticos com fins terapêuticos, visando potencializar os efeitos

anabólicos. Inicialmente, o uso de esteroides anabólicos, em doses terapêuticas, foi

aplicado em tratamentos clínicos de doenças, como anemia, osteoporose e hepatite

alcoólica, e no tratamento de traumas e queimaduras. Atualmente há uma variedade

de aplicações clinicas para o uso dos esteroides, tais como reposição hormonal em

homens com baixos níveis hormonais ou com idade mais avançada, para ganho de

força muscular e aumento da densidade óssea em pacientes com caquexia

secundária ao HIV, e em doenças crônicas diversas, tais como a cirrose hepática,

insuficiência renal crônica e câncer (Basaria et al., 2002; Evans, 2004).

1.4. Testosterona

A testosterona é o principal hormônio sexual masculino produzido nos

testículos, sendo classificada como andrógeno devido aos seus efeitos

masculinizantes. Os andrógenos são hormônios esteroides normalmente

sintetizados a partir do colesterol que é sintetizado a partir da acetilcoenzima A

(Figura 1). A testosterona circula no sangue ligada a proteínas plasmáticas, como a

albumina e a β-globulina permanecendo na circulação por alguns minutos ou

algumas horas. Uma parte da testosterona que permeia os tecidos é convertida em

5

um metabólito mais ativo, a 5α-diidrotestosterona, pela enzima 5α-redutase (Figura

1). A testosterona livre pode ser degradada rapidamente no fígado em androsterona

e desidroepiandrosterona, e conjugada com glicuronídeos ou sulfatos para serem

excretados na bile ou na urina (Guyton, 2006).

Fig 1. Biossíntese e metabolismo de esteróides endógenos (Marques et al., 2002).

1.5. Esteroides Anabólicos

Os esteroides anabólicos sintéticos definem-se como substâncias análogas

à testosterona, obtidas a partir de modificações em sua estrutura molecular, visando

à potencialização de seus efeitos anabólicos, aliada à redução dos efeitos

androgênicos. Em geral, é descrito que os esteroides anabólicos sintéticos são

capazes de apresentar maior resistência à metabolização, em comparação à

testosterona (Strauss & Yesalis, 1991). Os andrógenos têm várias funções

fisiológicas importantes no desenvolvimento humano. Inicialmente no

6

desenvolvimento da genitália externa masculina (pênis, uretra, escroto) e dos ductos

de Wolff (epidídimo, canal deferente, vesículas seminais, ductos ejaculatórios). Nos

homens, durante a puberdade a produção de andrógenos aumenta, levando ao

crescimento dos órgãos sexuais e no aparecimento das características sexuais

secundárias, como crescimento de pêlos (púbicos, axilares, no rosto, podendo

aparecer em outras regiões), engrossamento da voz, crescimento ósseo,

crescimento muscular, aumento da atividade das glândulas sebáceas e ação no

sistema nervoso central, aumentando a libido e a agressividade. Além disso, os

andrógenos exercem funções em outros tecidos do corpo como tecido adiposo,

hepático, renal e sistemas hematopoiético, imune e nervoso (Kicman, 2008).

1.6. Decanoato de Nandrolona

A nandrolona (19-nortestosterona; IUPAC: 17 α-Hidroxi-4-estren-3-ona) é

um dos mais populares esteroides anabólicos. A síntese laboratorial da nandrolona

foi inicialmente descrita no ano de 1950 por Birch, tendo sido resintetizada em 1953

por Wilds e Nelson (Shahidi, 2001; Bricout e Wright, 2004). A nandrolona é obtida a

partir da remoção do radical metil da posição 19 da molécula de testosterona. Isso

torna a nandrolona mais resistente à metabolização e à aromatização, e aumenta a

afinidade do receptor andrógeno pela molécula (Kuhn, 2002; Shahidi, 2001). No

entanto, contrariamente ao que ocorre com a testosterona, a 5α-redução da

nandrolona reduz a afinidade do receptor androgênico pela molécula (Bergink et al.,

1985). Tal fato explica o potente efeito da nandrolona em tecidos desprovidos de

atividade da 5α-redutase, como é o caso do tecido muscular, e o efeito reduzido nos

tecidos com alta atividade da 5α-redutase, como na próstata. A nandrolona, assim

como a testosterona, é metabolizada no fígado, sendo os seus principais metabólitos

a 19-norandrosterona (19-NA), 19-noretiocolanolona (19-NE) e 19-

norepiandrosterona (19-NEA) (Bricout e Wright, 2004).

Todos os esteroides anabólicos possuem tanto a ação andrógena quanto a

anabólica. A diferença é que alguns são mais seletivos a uma determinada ação. A

testosterona tem razão anabólica:andrógena = 1. O decanoato de nandrolona (Deca)

apresenta razão igual a 10, enquanto em outro anabólico, o estanozolol, a razão é

7

30. Os esteroides são mais comumente usados por via oral (esteroides derivados da

testosterona devido à 17α-alcalinização) ou intramuscular (esteroides derivados da

testosterona devido à 17α-esterificação). A nandrolona é administrada por via

intramuscular (Kunh, 2002).

A nandrolona é comercializada, principalmente sob a forma de seu éster

decanoato (decanoato de nandrolona, Deca Durabolin®; fórmula empírica: C28H44O3;

peso molecular: 428,65). No Brasil a Deca é vendida diluída em um veículo oleoso,

sendo que a composição do veículo é de 90% de óleo de amendoim / 10% de álcool

benzílico. A figura 2 ilustra a estrutura molecular da testosterona e do decanoato de

nandrolona.

Figura 2. Estrutura molecular da testosterona e do decanoato de nandrolona, os traços em vermelho

indicam onde a testosterona foi modificada à decanoato de nandrolona (Modificado de Shahidi, 2001).

1.7. Mecanismos de Ação

O mecanismo clássico de ação dos esteroides anabólicos é a ação

genômica. Quando nos tecidos, eles atravessam a membrana plasmática e se ligam

ao seu receptor andrógeno no citoplasma, sendo o complexo hormônio-receptor

translocado ao núcleo, onde interage com o DNA, ligando a região promotora de

genes-alvo e, consequentemente, alterando a síntese de proteínas. A ação

genômica dos esteroides normalmente leva algumas horas ou até dias para

manifestar seu efeito. Por exemplo, o ganho de massa muscular só é percebido

após alguns dias ou semanas (Losel e Wehling, 2003; Losel et al., 2003).

8

Os mecanismos não clássicos ou não genômicos estão relacionados a

respostas rápidas através de receptores de membrana acoplados a vias de

sinalização através de proteínas cinases como ERK, MAPK e PI3K ou do aumento

intracelular de AMPc e/ou aumento do [Ca++]i. Estes mensageiros intracelulares

atuam diretamente em proteínas efetoras, desencadeando respostas intracelulares

e/ou indiretamente promovendo ação genômicas via fosforilação de algumas

proteínas cinases que ativam fatores de transcrição gênica, como por exemplo,

CREB (Figura 3) (Losel e Wehling, 2003).

Figura 3. Esquema das vias de sinalização ativadas por hormônios esteroides (Adaptada de Losel e

Wehling, 2003).

1.8. Bases Eletrofisiológicas

Para compreender a gênese de arritmias cardíacas, muitas vezes

decorrentes do abuso de esteroide anabólicos, é necessário entender como a

membrana celular funciona. Para isso devem-se conhecer conceitos de potencial de

membrana, de gradiente eletroquímico e de canais iônicos. O potencial de

membrana ou transmembrana é a diferença de potencial entre as duas faces da

membrana. Ele depende das concentrações dos vários íons nas duas faces e das

condutâncias da membrana a estes íons a cada momento. O potencial de equilíbrio

de um íon (E), K+ como exemplo, é calculado conforme a equação de Nernst : EK =

(RT / zF)* ln([K+]int / [K+]ext), no qual EK depende, da constante universal dos gases R,

9

da temperatura T, o numero de elétrons transferidos F, da carga z , e do logaritmo

natural ln das concentrações interna sobre a externa do K+. Assim o potencial de

repouso da membrana é dependente dos potenciais de equilíbrios dos íons mais

abundantes no lado interno e externo da membrana e da condutância da membrana

a estes (Na+, K+, Ca2+ e Cl-) (Aires et al., 2008).

A bomba Na+-K+ mantém a diferença de gradiente químico da membrana, ao

manter os gradientes eletroquímicos de Na+ e K+ da célula, pois mantém alta

concentração intracelular de K+ e baixa no meio extracelular, e alta concentração

extracelular de Na+ e baixa no meio intracelular. Essas concentrações são mantidas

através do transporte ativo de dois íons K+ para dentro da célula e três íons Na+ para

fora pela Na+-K+-ATPase, assim favorece que a face interna da membrana fique

negativa e, em condições de repouso, a maior permeabilidade relativa da membrana

ao K+ faz o potencial de membrana ficar próximo ao potencial de equilíbrio do K+

(Aires et al., 2008).

Canais iônicos são proteínas integrais de membrana inseridas na bicamada

lipídica, que formam poros seletivos a íons específicos. Quando há abertura destes

canais, íons permeantes fluem passivamente através do poro a favor do gradiente

eletroquímico, gerando correntes iônicas que são a base dos processos de gênese e

condução da atividade elétrica celular. Estes canais iônicos podem ser regulados por

diferentes processos de sinalização como: mudança de potencial elétrico da

membrana (dependentes de voltagem), ligação de íons ou moléculas a sitio do canal

(canais ativados por ligantes) e estimulação mecânica (canais mecano-ativados). No

coração a grande maioria dos canais é dependente de voltagem (Aires et al., 2008).

O potencial de ação (PA) é uma à resposta regenerativa da membrana, com

despolarização inicial, onde há um influxo de cargas positivas de maneira passiva

pela membrana, normalmente Na+ e Ca2+, seguida da repolarização, onde o

potencial de membrana volta ao valor de repouso devido principalmente à saída de

K+ a favor do gradiente eletroquímico. O potencial de ação cardíaco, tipo rápido, é

característico do miocárdio atrial e ventricular, feixe de His e fibras de Purkinje. Estes

tecidos exibem um potencial de repouso (ou potencial diastólico máximo) da

membrana de aproximadamente –80 mV, determinado pela maior permeabilidade ao

K+ durante o potencial de repouso. O potencial de ação cardíaco rápido é dividido

10

em fases (Figura 4): Fase 0: Fase de despolarização rápida do potencial de ação, na

qual canais de Na+ sensíveis à voltagem se abrem frente a um estimulo elétrico,

promovendo a entrada passiva de Na+. A grande densidade da corrente de Na+ (INa)

é fundamental para a propagação do PA. Nessa fase, o canal de potássio retificador

de influxo tem baixa condutância devido à retificação em potenciais mais positivos.

Fase 1: Nesta fase ocorre uma rápida e transitória repolarização associada à

abertura do canal de potássio transiente de efluxo (Ito1) ativado por despolarização.

Há evidencias de uma corrente de influxo de Cl- (Ito2) nesta fase ao longo da

repolarização. Fase 2: Corresponde ao platô do PA, no qual há um balanço entre

correntes despolarizantes e repolarizantes, as despolarizantes são as corrente de

cálcio tipo L (ICa,L) e uma pequena contribuição da INa, e as correntes repolarizantes

de efluxo de K+ e influxo de Cl- . A ICa,L é a principal responsável pela longa duração

do PA cardíaco. O canal de cálcio tipo L é ativado em voltagens menos negativas a

partir de -30 mV. Nesta fase também há a contribuição do trocado Na/Ca

contribuindo para a despolarização da membrana. A Na-K-ATPase contribui para a

repolarização da membrana ao longo de todo o ciclo cardíaco por ser eletrogenica.

Fase 3: Corresponde a repolarização final caracterizada pelo predomínio de

correntes de efluxo de K+. Nessa fase, a ativação dos canais de potássio

retificadores retardados (IKr e IKs) gera corrente de efluxo de K+, que repolariza a

membrana. As correntes IKr e IKs são as principais responsáveis pela repolarização

da fase 3, com uma menor contribuição da corrente IKur. Fase 4: Nessa fase a

corrente retificadora de influxo de potássio (IK1) é responsável por manter o potencial

de repouso em valores próximos ao do potencial de equilíbrio do K+ (Aires et al.,

2008).

Alterações nas correntes que compõem o potencial de ação podem alterar

as suas características (forma, amplitude, duração, etc.). As alterações nas

correntes iônicas podem ocorrer por mutações nas subunidades que compõem os

canais ou por efeitos de fármacos ou mudança na expressão das subunidades dos

canais. As alterações que diminuem as correntes repolarizantes (Ito, IKr, IKs) ou que

aumentem as correntes despolarizantes (INa e ICa) levam ao aumento da duração do

potencial de ação e podem desencadear pós-potenciais precoces ou tardios

(potenciais anômalos, acoplados aos normais, que surgem no final ou ao longo da

repolarização), aumentando os riscos de arritmias ventriculares (Aires et al., 2008).

11

O eletrocardiograma (ECG) é o registro da variação do potencial elétrico

produzido pela excitação cardíaca detectado na superfície do corpo. O traçado do

ECG é composto por ondas que correspondem às atividades de despolarização dos

átrios (onda P), despolarização (complexo QRS) e repolarização (onda T) dos

ventrículos. O intervalo QT do ECG representa a duração da despolarização e

repolarização ventricular. A duração do intervalo QT é um parâmetro utilizado para

avaliar mudanças na repolarização ventricular. O aumento na duração do intervalo

QT está normalmente associado ao aumento na duração do PA, que pode

desencadear pós-potenciais precoces ou tardios e a gênese de arritmias (Belardinelli

et al., 2003) (figura 4).

Figura 4: Relação entre o eletrocardiograma (ECG), o potencial de ação ventricular (PA) e arritmias

ventriculares. O aumento do intervalo QT do ECG está relacionado ao aumento da duração do PA,

que pode desencadear pós-potenciais precoces e arritmias ventriculares (Modificado de Belardinelli,

2003).

12

O processo da arritmogênese pode decorrer do remodelamento elétrico

cardíaco, que é compreendido por mudanças complexas nas propriedades elétricas

do miocárdio e pode ser evidenciado por mudanças no eletrocardiograma, no

potencial de ação e nas correntes iônicas. Essas alterações podem ser evidenciadas

em diferentes condições, como na hipertrofia ventricular e insuficiência cardíaca

(Bacharova, 2007; Aiba e Tomaselli, 2010).

O perfil do potencial de ação ventricular varia bastante entre diferentes

espécies, bem como em diferentes regiões ventriculares. A parede do miocárdio

pode ser dividida em três subcamadas com perfis diferentes quanto ao potencial de

ação, em consequência da expressão heterogênea dos canais iônicos nas

subcamadas, sendo denominadas: endocárdio (parte interna da parede),

mesocárdico (porção intermediária) e epicárdico (porção mais externa) (Li et al.,

1998).

A Ito é uma das correntes repolarizantes cardíaca, sendo determinante na

repolarização inicial do potencial de ação cardíaco. A contribuição desta corrente

varia conforme a espécie animal em questão, devido à variação na expressão do

canal e das subunidades que compõem o poro do canal (Kv4.2, Kv4.3, Kv1.4) ou por

variação da expressão da subunidade β acessória do canal (KChIP2) (Sah et al.,

2003; Medei et al., 2010). Os cardiomiócitos de ratos apresentam grande densidade

de Ito, o que minimiza os efeitos despolarizantes da ICa,L, fazendo com que nestes

animais não haja uma fase de platô bem definida no PA. Diferentemente em coelho,

cachorro e humanos a Ito é menos dominante permitindo um balanço entre as

correntes Ito, Ikr, Iks com a ICa, determinando assim uma platô bem definido no PA

(Sah et al., 2003).

Em modelo experimental de insuficiência cardíaca foi demonstrada

arritmogênese associada ao prolongamento do PA e presença de pós-potenciais

precoces (Aiba e Tomaselli, 2010). Nesse estudo, o prolongamento do PA foi

associado à diminuição da amplitude de Ito, devido principalmente à diminuição da

expressão da subunidade α Kv4.3 do canal de Ito (Kaab et al., 1998; Aiba e

Tomaselli, 2010). Em modelos de hipertrofia cardíaca, o prolongamento do PA

também está associado com a redução da amplitude de Ito, pela redução da

expressão do canal (Tomaselli e Marban, 1999).

13

O aumento da amplitude da ICa,L também contribui para o aumento da

duração do PA. Um estudo em modelo de infarto do miocárdio mostrou aumento da

duração do PA que estava relacionado à diminuição da amplitude de Ito e aumento

de ICa,L. As mudanças em ICa,L e Ito estavam associadas ao aumento da expressão

da subunidade α Cav1.2 do canal de Ca2+ tipo L e diminuição da subunidade Kv4.2

do canal de K+ transiente de efluxo, respectivamente (Perrier et al., 2004).

O Ca2+ é o elemento responsável pelo acoplamento entre a excitação

elétrica (potencial de ação) e a contração da célula muscular. O mecanismo aceito

para o acoplamento excitação-contração cardíaca é a liberação de Ca2+ do retículo

sarcoplasmático estimulada pelo influxo de Ca2+ através de canais tipo L. A

amplitude e cinética do sinal de Ca2+ determina a fração de Ca2+ liberado e cinética

do transiente de Ca2+, consequentemente, a amplitude e cinética da contração

(Bassani e Bassani, 2005). Durante o potencial de ação, há sobreposição parcial de

ICa,L e Ito, o que significa que esta corrente repolarizante pode modular a corrente de

influxo de Ca2+ e o acoplamento excitação-contração cardíaca.

Assim como já há relatos de casos na literatura de usuários de esteróides

anabólicos que vieram a óbito por morte súbita cardíaca, no qual existiam

modificações estruturais (grande hipertrofia, fibrose e até cardiopatias dilatadas) e

normalmente associadas a essas modificações encontram-se alterações elétrica, no

qual poderiam ser verificas alterações devido o aumento do intervalo QT do

eletrocardiograma decorrente do aumento da duração potencial de ação ventricular

em decorrência da diminuição das correntes repolarizantes de K+ e aumento das

correntes despolarizantes de Na+ e Ca2+ (Montisci et al., 2012). Além disso, uma

maior entrada de Ca2+ favorece a sobrecarga de Ca2+ no citoplasmático, o que já é

bem relacionado a uma maior predisposição arrítmica e a alterações no

acoplamento excitação contração cardíaco (Bassani e Bassani, 2005; Bacharova,

2007; Aiba e Tomaselli, 2010; Montisci et al., 2012).

Portanto elaboramos a hipótese de que a administração crônica de dose

suprafisiológica de esteróide anabólico por 8 semanas pode induzir remodelamento

elétrico, com diminuição da corrente repolarizante (Ito) e aumento da corrente

despolarizante (ICa,L), alterando o acoplamento excitação-contração cardíaco.

14

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Investigar o remodelamento elétrico induzido pela administração crônica de

esteroide anabólico e repercussões no acoplamento excitação-contração.

2.2 Objetivos Específicos

Avaliar as alterações induzidas pela administração crônica de decanoato de

nandrolona em ratos sobre:

a) os parâmetros de repolarização cardíaca por eletrocardiograma;

b) amplitude e duração do potencial de ação ventricular;

c) as correntes iônicas ICa,L e Ito

d) sistema de mobilização do cálcio

e) e função contrátil

15

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Animais

Foram utilizados ratos Wistar machos com massa corporal inicial entre 200 e

250 g (10-12 semanas de idade). Os animais foram mantidos em caixas de

polipropileno, forradas com maravalha esterilizada, com ração e água ad libidum.

Foram respeitados os preceitos do “Guia para o Uso de Cuidado de Animais de

Laboratório” (Publicação do NIH Nº 85-23, revisada em 1985, USA) e os protocolos

foram submetidos à aprovação pela Comissão de Avaliação do Uso de Animais em

Pesquisa da Instituição (IBCCF 006).

3.2. Tratamento

Os animais foram distribuídos em dois grupos: Controle (Ctrl, n = 25) e

administrados com o esteroide anabólico decanoato de nandrolona (Deca-

Durabolin®, Organon, Brasil) (Deca, n = 24), injetado semanalmente no músculo

glúteo médio (alternando os lados direito e esquerdo a cada semana), na

concentração de 10 mg/kg, durante 8 semanas. Os animais não tratados receberam

injeções de volume equivalente do veículo (óleo de amendoim diluído em álcool

benzílico a 10%), na mesma periodicidade e localizações especificadas para os

animais tratados. Semanalmente os animais eram pesados para averiguar ganho ou

perca de peso e ao final do tratamento para se estabelecer índices de hipertrofia

cardíaca, após a eutanásia dos animais, o coração dos ratos de ambos os grupos

eram então pesados e então normalizados pelo peso corporal ou pelo comprimento

da tíbia.

3.3. Registro eletrocardiográfico in vivo

O estudo eletrofisiológico do remodelamento elétrico do coração, induzido

pela administração crônica de esteroide anabólico, foi efetuado in vivo pela análise

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do eletrocardiograma (ECG) e ex vivo pelas análises do potencial de ação e

correntes iônicas do ventrículo esquerdo. Os registros eletrocardiográficos foram

obtidos dos animais acordados, mediante eletródios permanentes previamente

implantados antes do início dos protocolos de tratamento. Sob anestesia (30

quetamina/5 xilazina mg/kg, i.p.), três eletródios constituídos de fio de aço inoxidável

(diâmetro: 0,4 mm) foram inseridos subcutaneamente (tipo anel de piercing) na

região dorsal do membro anterior esquerdo e direito e posterior esquerdo, para

obtenção do ECG na derivação DII do plano frontal. Os registros de ECG nos

animais acordados ocorreram semanalmente, sendo o primeiro após 24 horas do

implante dos eletródios. Para isso, os ratos foram colocados em caixas individuais

forradas com maravalha, nas quais tinham livre movimentação. Fios flexíveis com

"jacarés" na ponta permitiram a conexão dos eletródios subcutaneos às entradas do

amplificador de ECG (Differential A/C Amplifier 1700, A-M Systems) conectado a um

computador por uma interface analógica-digital (DIGIDATA 1440A, Molecular

Devices, USA), sob comando do programa Axoscope 10 (mOlecular Devices, USA).

A análise dos registros foi realizada com o programa LabChart 7.0 (AD Instruments,

Australia). Os parâmetros analisados foram a frequência cardíaca, a duração do

intervalo QT e intervalo QTc (intervalo QT corrigido pela frequência cardíaca, pela

equação de Bazzet: QTc = QT/RR, onde RR é o intervalo entre duas ondas R

consecutivas).

3.4. Registro intracelular do potencial de ação

Ao término do período de tratamento, os animais foram heparinizados (500

UI/kg de peso do animal), e eutanasiados por inalação de CO2 e deslocamento

cervical. Os corações foram retirados, lavados em solução Tyrode (em mM); NaCl

140; KCl 5,4; HEPES 10; MgCl2 1,8; glicose 11,0; CaCl2 2,0 e pH 7,4 (titulado com

NaOH); e dissecados para obtenção dos músculos papilares e fatias da parede livre

do ventrículo esquerdo. Estes foram fixados com pequenos alfinetes de aço

inoxidável à camada de Sylgard® no fundo de uma cuba de acrílico (volume de

aprox. 3 ml), mantendo a superfície endocárdica para cima, e perfundidos

continuamente com solução de Tyrode saturada com oxigênio (100% O2) e

17

temperatura de 37 ºC. O fluxo foi mantido constante em 5 ml/min por uma bomba

peristáltica (Gilson MiniPuls 3).

Para o registro intracelular do potencial transmembrana, foram utilizados

microeletródios convencionais de vidro, com resistência de ponta entre 10 e 20 MΩ

DC, produzidos pelo estiramento de capilares de vidro borosilicato de 1,2 mm de

diâmetro em um estirador vertical (PP-83, Narishige). De cada capilar, produzia-se

duas micropipetas, que eram preenchidas com solução de KCl 3 M, na qual se

inseria um fio de Ag/AgCl conectado ao estágio de entrada de um pré-amplificador

de alta impedância (MEZ-7200, Nihon-Kohde). O eletrodo de referência era formado

por um fio de Ag/AgCl mergulhado diretamente no banho e conectado à entrada

“terra” do pré-amplificador. Um manipulador mecânico (Narishige) permitia o

deslocamento micrométrico do microeletródio em aproximação à superfície do tecido

isolado fixado no fundo da cuba, permitindo a inserção intracelular de sua ponta.

Foram considerados válidos apenas os registros intracelulares com potencial de

membrana estável igual ou maior que -70 mV. Os potenciais de ação foram

estimulados por pulsos retangulares de corrente, com duração de 0,5 a 3 ms e

intensidade cerca de duas vezes o valor limiar determinado para cada músculo,

aplicados através de um par de eletrodos de prata cloretada (Ag/AgCl) conectados a

um estimulador (DS2, Digitimer). A frequência dos estímulos (1 Hz) foi controlada

por um gerador de frequência (Digitimer D4030). O sinal obtido na saída do pré-

amplificador foi digitalizado por um sistema de aquisição de dados (interface A/D

DIGIDATA 1440A e programa Axoscope, Molecular Devices, USA), controlado por

um microcomputador onde os sinais foram armazenados para posterior análise.

Foram medidos o potencial de repouso (PR), a amplitude do potencial de ação

(APA), e a duração do potencial de ação aos níveis de 30% (DPA30) e 90%

(DPA90) da repolarização máxima.

3.5. Correntes iônicas

Para o registro das correntes iônicas, cardiomiócitos ventriculares foram

dissociados enzimaticamente. Os animais foram sacrificados por inalação de CO2 e

toracotomizados. O coração foi extraído rapidamente e canulado pela artéria aorta,

18

pela qual foi perfundido inicialmente com solução Tyrode (em mM): NaCl 140; KCl

5,4; HEPES 10; MgCl2 1,8; glicose 11,0; CaCl2 2,0 e pH 7,4 (titulado com NaOH),

sob fluxo constante de 8 ml/min, temperatura de 35 ºC e borbulhadas continuamente

com oxigênio a 100%. Após a lavagem de todo resíduo de sangue do coração, este

foi perfundido com solução Tyrode sem cálcio por 5 minutos. Após a assistolia, o

coração foi perfundido com solução Tyrode sem cálcio contendo 200 UI/ml de

colagenase tipo II (Worthington, USA) por um período variável de 10 a 20 min,

recirculando a solução até que o coração apresentasse aparência translúcida na

junção interventricular e o ápice fosse facilmente perfurado com uma pinça. Em

seguida, o coração foi novamente perfundido com solução Tyrode sem cálcio por 10

min, com objetivo de lavar a colagenase residual. Ao término da lavagem, o coração

foi colocado em uma placa de Petri contendo solução Tyrode sem cálcio e o

ventrículo esquerdo e septo foram dissecados, cortados em pequenos pedaços e

colocados cada um deles em poços de uma placa de cultura contendo solução KB

(Kraft-Brühe) modificada (em mM): KCl 30; Ácido glutâmico 70; HEPES 10; MgCl2 1;

glicose 10; Taurina 20; KH2PO4 10; EGTA (etilenoglicol-bis(-aminoetileter)-

N,N,N´,N´-ácido tetraacético) 0,3; pH 7,3 (titulado com KOH). Em cada poço da

placa os cardiomiócitos foram dispersos mecanicamente usando-se uma pipeta

Pasteur.

As células foram colocadas em solução Tyrode e utilizadas durante o

período de 1 a 8 horas após a dissociação para o registro das correntes iônicas ICa,L

e Ito utilizando a técnica de patch clamp, na configuração whole cell. A técnica

consiste em aderir a ponta de uma micropipeta à membrana de uma célula, no caso,

o cardiomiócito, e depois romper a membrana, permitindo a continuidade elétrica

entre o meio intracelular e a solução intrapipeta, em contato com um eletrodo de

prata cloretada. Dessa forma, podemos registrar a corrente iônica da célula ativada

por estímulos despolarizantes, podendo se analisar o fluxo de íons através dos

diferentes canais iônicos dessa célula. A solução de pipeta para registro da ICa,L

continha (em mM): CsCl 110, TEA-Cl 30, ATP-Mg 5, EGTA 10, GTP-Na 0,1 e pH 7,2

(titulado com CsOH). A solução da pipeta para registro da Ito continha (em mM): KCl

125, NaCl 10, MgCl2 5, HEPES 10 e EGTA 5 e pH 7,2 (titulado com KOH).

19

Para o registro de ICa,L foram utilizadas micropipetas de sucção com

resistência de ponta de 3 a 5 M, confeccionadas em tubos de vidro de

borossilicato, utilizando um estirador horizontal (P-97, Sutter Instruments Co.). O

protocolo de voltagem consistiu em aplicar, a partir de um potencial fixo (holding) de

-50 mV, pulsos despolarizantes de amplitude crescente, variando de 10 em 10 mV,

até +60 mV. A amplitude da corrente ICa,L foi medida como a diferença entre o pico e

a corrente ao final do pulso. A densidade de corrente, calculada como a amplitude

da corrente normalizada pela capacitância da célula, foi expressa graficamente em

função do potencial dos pulsos, para obter a curva corrente/voltagem (I/V). A curva

de dependência de voltagem da ativação estacionária de ICa,L foi obtida da relação

I/V, plotando a condutância (G), normalizada em função do potencial de membrana.

G foi calculada em cada potencial, dividindo a amplitude de ICa,L pela diferença entre

o potencial de cada pulso e o potencial de reversão de ICa,L. Uma função sigmóide

(Boltzmann) foi ajustada aos pontos experimentais para determinação dos

parâmetros V½ (potencial de membrana no qual ocorre 50% da ativação máxima) e

slope (sensibilidade à voltagem). Para a obtenção da curva de dependência de

voltagem da inativação estacionária (steady-state) foi utilizado um protocolo de duplo

pulso, no qual um pulso de potencial fixo (0 mV) era precedido por pré-pulsos de

1000 ms de duração e potencial variando, a intervalos de 10 mV, de -70 a +40 mV. A

amplitude de ICa,L, normalizada pelo valor máximo, foi expressa graficamente em

função do potencial do pré-pulso. Uma função sigmóide (Boltzmann) foi ajustada aos

pontos experimentais para determinação de V½ e o fator k para a inativação

dependente de voltagem. A curva de reativação (recuperação da inativação) de ICa,L

foi obtida também com um protocolo de duplos pulsos. A partir do potencial holding,

foram aplicados dois pulsos despolarizantes para 0 mV, com intervalo variável (10,

20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, 2000, 2500 e 3000 ms) entre os

dois pulsos. A amplitude da corrente do segundo pulso foi dividida pela da corrente

do primeiro pulso e expressa graficamente em função dos intervalos inter-pulsos.

Uma função exponencial de primeira ordem foi ajustada aos pontos experimentais

para determinação da constante temporal de reativação (). Para ativar Ito o protocolo de voltagem consistiu em aplicar, a partir de um

potencial fixo (holding) de -60 mV com pré pulso a -40 mV (para inativar INa e ICa,T),

pulsos subsequentes despolarizantes de amplitude crescente a partir de -50 mV,

20

variando de 10 em 10 mV, até atingir +60 mV. A amplitude da corrente Ito foi medida

como a diferença entre o pico e a corrente ao final do pulso. A densidade de

corrente, calculada como a amplitude da corrente normalizada pela capacitância da

célula, foi expressa graficamente em função do potencial dos pulsos, para obter a

curva corrente/voltagem (I/V). Para a obtenção da curva de dependência de

voltagem da inativação estacionária (steady-state), foi utilizado um protocolo de

duplo pulso, no qual um pulso de potencial fixo (+60 mV) era precedido por pré-

pulsos de 1000 ms de duração e potencial variando, a intervalos de 10 mV, de -70 a

+50 mV.

3.6. Avaliação da regulação de Ca2+ intracelular

A avaliação da regulação do Ca2+ intracelular foi realizada em fibras

desnudas, segundo técnica primeiramente proposta por Fabiato e Fabiato (1979).

Esta técnica, mediante a análise da resposta contrátil de fibras cardíacas permite

inferir a variação da concentração do Ca2+ citoplasmático na fibra cardíaca desnuda,

sem que seja necessário desmembramento do maquinário contrátil, como acontece,

por exemplo, no isolamento de frações do retículo sarcoplasmático. Isso possibilita a

manutenção das estruturas intracelulares, reduzindo possíveis distorções na

interpretação dos mecanismos moduladores que podem ocorrer quando as

estruturas são isoladas. A técnica de fibras desnudas ainda oferece a vantagem de

possibilitar a avaliação direta da força de contração exercida pelo tecido,

correlacionando-a com a mobilização de Ca2+ e a viabilizando análise do estado

contrátil da célula.

Tabela 1. Composição das soluções W e R utilizadas nos experimentos com fibras desnudas.

Substâncias Solução W (mM) Solução R (mM)

Proprionato de potássio 185,0 185,0

Acetato de magnésio 2,5 2,5

Proprionato de imidazol 10,0 10,0

K2 ATP ou Na2ATP 5,0 5,0

K2EGTA - 5,0

Ambas soluções W e R ajustada ao pH 7,0 com KOH.

21

Feixes de fibras ventriculares quimicamente desnudas foram utilizadas para

investigar a regulação da mobilização de Ca2+ intracelular no coração de rato tratado

com decanoato de nandrolona por 8 semanas. Os animais de cada grupo

experimental foram eutanasiados e em seguida seus corações retirados e

mergulhados em solução livre de Ca2+. Feixes de aproximadamente 10 mm de

comprimento e 300–400 μm de diâmetro foram então removidos do sub-endocárdio

do ventrículo esquerdo à temperatura ambiente e posicionados em uma cuba

experimental de 1 ml de volume interno, preenchida com solução R de relaxamento

(Tabela 1). As extremidades dos feixes foram presas a duas garras localizadas

horizontalmente, sendo que uma delas encontrava-se conectada ao

micromanipulador (Narishige mod. 3) e a outra ao transdutor de tensão isométrica

(Grass, modelo FT03). Em seguida, as fibras foram estiradas para 120% do seu

comprimento inicial, através da visualização em estereomicroscópio binocular (Zeiss)

provido de uma escala na ocular. Em todos os experimentos, a temperatura da cuba

foi continuamente monitorada e mantida a 20,0 ± 1,0 ºC. O registro da tensão

isométrica foi feito em polígrafo (Grass mod. 7400). Para a permeabilização da

membrana celular e consequente livre acesso das substâncias ao meio intracelular,

os feixes foram submetidos ao tratamento com saponina diluída em solução R (0,5%

v/v) durante cinco minutos. O sucesso do desnudamento foi confirmado

comparando-se a amplitude da contratura em reposta à exposição do feixe a uma

solução cujo log[Ca2+] correspondia ao pCa 4,8 (Tabela 2 e pH 7,0 ajustada com

KOH) antes e após o uso da saponina. A tensão máxima desenvolvida pelas fibras

cardíacas desnudas foi determinada pela exposição à solução pCa 4,8. A Figura 5

mostra o esquema ilustrativo da cuba experimental utilizada acoplada a um

transdutor de tensão e este a um osciloscópio. Foram utilizados três protocolos

experimentais para a análise dos processos de captação e liberação de Ca2+ pelo

retículo sarcoplasmático e da sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+.

22

Figura 5. Esquema ilustrativo da cuba experimental. Feixes de fibras musculares do

ventrículo esquerdo foram fixados pelas extremidades a uma haste fixa e a um transdutor de

força.

Tabela 2. Composição das soluções de pCa utilizadas nos experimentos com fibras desnudas

pCa CaEGTA (µM) K2EGTA(mM) MgAc(mM) Prop de K (mM) Prop de imidazol (mM) Na2 ou K2 ATP (mM)

7,4 0,03981 4,65 2,5 185 10 5

7,0 0,1 4,25 2,5 185 10 5

6,8 0,1585 3,85 2,5 185 10 5

6,6 0,2511 3,4 2,5 185 10 5

6,4 0,3981 2,85 2,5 185 10 5

6,2 0,6309 2,28 2,5 185 10 5

6,0 1 1,74 2,5 185 10 5

5,6 2,511 0,86 2,5 185 10 5

5,0 10 0,22 2,5 185 10 5

4,8 15,84 0,11 2,5 185 10 5

Todas os pCa foram ajustados para o pH 7, com KOH

3.6.1. Captação e liberação de Ca2+ pelo RS

Antes do início de cada protocolo, a permeabilidade da membrana e a

integridade das proteínas contráteis das fibras cardíacas foram avaliadas pelo

registro da resposta contrátil máxima (P0) induzida por uma solução de pCa 4,8

(15,85 µM Ca2+). Em seguida, a viabilidade do retículo sarcoplasmático foi avaliada,

como ilustrado na Figura 6, na parte invariável do protocolo, sendo a porção variável

23

destacada na figura 6. Após a lavagem das fibras com a solução W, o esvaziamento

do Ca2+ do retículo sarcoplasmático foi induzido com cafeína (20 mM) diluída em

solução R durante um minuto. Em seguida, o carregamento do retículo

sarcoplasmático foi obtido pela exposição das fibras a uma solução de pCa 7,4 (0,04

μM) durante três minutos. Após o carregamento, foi induzida a contratura com uma

solução de cafeína (20 mM) diluída em solução W e a integridade do retículo

sarcoplasmático foi aceita quando a tensão isométrica gerada fosse ≥ 60% do P0. O

relaxamento da fibra após a contratura, estimulada por Ca2+ ou cafeína, foi induzido

com a aplicação da solução R na cuba experimental. A captação de Ca2+ foi

analisada pela avaliação da curva de tensão isométrica em função do tempo de

carregamento do retículo sarcoplasmático com Ca2+. Diversos ciclos de contração-

relaxamento foram obtidos em cada feixe de fibras musculares, usando-se tempos

crescentes de carregamento (1, 3 e 5 minutos) com concentração constante de Ca2+

em pCa 7,4 (Figura 7). Ao final do protocolo experimental, uma nova contratura com

solução de pCa 4,8 foi gerada para confirmar a integridade das fibras. Caso a

resposta contrátil fosse menor que 70% do P0 inicial, o experimento era descartado.

Figura 6. Esquema ilustrativo do protocolo para avaliação da permeabilização do feixe de

fibras cardíacas, da integridade das proteínas contráteis e do retículo sarcoplasmático. Após

24

as contraturas induzidas por Ca2+ e cafeína, a solução R foi adicionada à cuba experimental

para induzir o relaxamento das fibras. A solução W era aplicada para lavagem da cuba.

Figura 7. Esquema ilustrativo do protocolo para a avaliação da captação de Ca2+ pelo

retículo sarcoplasmático. Diferentes tempos de carregamento (1, 3 e 5 min.) foram utilizados

antes da indução da contratura por 20 mM de cafeína. Após as contraturas, a solução R foi

adicionada à cuba experimental para induzir o relaxamento das fibras. A solução W era

aplicada para lavagem da cuba.

A liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático foi avaliada de maneira

similar à captação, no entanto, obteve-se uma curva da resposta contrátil em função

de diferentes concentrações de cafeína (3, 5 e 20 mM). Neste protocolo, tanto a

concentração de Ca2+ (pCa 7,4), quanto o tempo de carregamento do retículo

sarcoplasmático (3 minutos) foram constantes. Da mesma maneira que descrito

anteriormente, ao final do experimento, as fibras que apresentaram, resposta

contrátil menor que 70% do P0 inicial, quando expostas à solução pCa 4,8, também

foram excluídas (Figura 8).

25

Figura 8. Esquema ilustrativo do protocolo para a avaliação da liberação de Ca2+ pelo

retículo sarcoplasmático. Diferentes concentrações de cafeína foram utilizadas e a resposta

contrátil analisada. Após as contraturas induzidas por cafeína, a solução R foi adicionada à

cuba experimental para induzir o relaxamento das fibras. A solução W era aplicada para

lavagem da cuba.

3.6.2. Função contrátil e sensibilidade ao Ca2+

A avaliação da sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+ foi realizada

em fibras cardíacas desnudas sem o retículo sarcoplasmático funcional. A exposição

prévia das fibras ao Triton X-100 (2%) durante trinta minutos, após o primeiro teste

de contração, destrói o retículo sarcoplasmático sem alterar o funcionamento das

proteínas contráteis. Dessa maneira, foi avaliada a resposta contrátil das fibras na

presença de cafeína após o uso do Triton X-100. A ausência de resposta contrátil

confirmava a ruptura completa da membrana do retículo sarcoplasmático. Em

seguida, as fibras foram submetidas ao protocolo de avaliação da sensibilidade das

proteínas contráteis ao Ca2+. Como ilustrado na Figura 9, este protocolo consistiu na

geração de uma curva de tensão isométrica em função de concentrações crescentes

de Ca2+ (pCa 7,4; 7,0; 6,8; 6,6; 6,4; 6,2; 6,0; 5,6; 5,0; 4,8). Ao final do experimento,

as fibras que apresentaram resposta ao pCa 4.8 abaixo de 70% do P0 inicial foram

descartadas. A partir das curvas de pCa, foi realizada uma regressão não linear com

26

a equação de Hill, para obter os parâmetros sensibilidade ao Ca2+ slope e pCa50%

([Ca2+] necessária para atingir 50% da tensão máxima).

Figura 9. Esquema ilustrativo do protocolo para a avaliação da sensibilidade das proteínas

contráteis ao Ca2+. Após permeabilização do retículo sarcoplasmático com triton X-100 a

2%, diferentes concentrações de Ca2+ (pCa: 7,4; 7,0; 6,8; 6,6; 6,4; 6,2; 6,0; 5,6; 5,0 e 4,8)

foram utilizadas e a resposta contrátil analisada. Após cada contratura, foi adicionada à cuba

experimental a solução R para induzir o relaxamento das fibras e a solução W para

lavagem.

3.7. Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas com o programa GraphPad Prism

5,0 (GraphPad, USA), usando teste t não pareado para a comparação entre as

médias dos dois grupos. Análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas foi

utilizado na comparação longitudinal (análise bivariada, com pós-teste de

Bonferroni). Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média e

as diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.

27

4. RESULTADOS

4.1. Biometria

A figura 10 apresenta o curso temporal do peso corporal dos animais

durante o período experimental. Os animais administrados com decanoato de

nandrolona mostraram uma menor massa corpórea em comparação ao grupo

controle a partir da 5º semana (Ctrl: 317,1 ± 8,3 g; Deca: 272,2 ± 14,8 g; p < 0,05, 7º

semana Ctrl: 318,9 ± 8,2 g; Deca: 279,3 ± 15,5 g; p < 0,05, e 8º semana Ctrl: 334,7 ±

6,8 g; Deca: 297,7 ± 4,7 g; p < 0,001).

0 1 2 3 4 5 6 7 80

200200

220

240

260

280

300

320

340

360Ctrl

*****

Deca

Tempo em semanas

Pes

o c

orp

ora

l (g

)

Figura 10. Efeito da administração crônica de decanoato de nadrolona sobre a massa

corporal (g) ao longo de 8 semanas de administração. Ctrl (n = 21): grupo controle não

tratado, Deca (n = 21): grupo admistrado com decanoato de nandrolona (10 mg/kg/semana).

Valores expressos em média erro padrão da média. *p < 0,05 e ***p < 0,001 vs. Ctrl.

O peso do coração foi medido ao final do protocolo experimental (Figura

11A) e expresso como valor normalizado pelo peso corporal (Figura 11B) e

comprimento da tíbia (Figura 11C). Apenas a relação peso do coração/peso corporal

apresentou diferença significativa entre os grupos (4,7 ± 0,089 vs 4,3 ± 0,098 em

g/kg, p < 0,05).

28

Ctrl Deca

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

Pe

so

ab

so

luto

do

co

raç

ão

(g

)

Ctrl Deca0

2

4

6

**

Pe

so

do

co

raç

ão

/ P

es

o c

orp

ora

l (g

/kg

)Ctrl Deca

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Pe

so

do

co

raç

ão

/co

mp

rim

en

to d

a t

ibia

(g

/cm

)

A B

C

Figura 11. Peso do coração. A, peso úmido absoluto (Ctrl: n = 21; Deca: n = 20). B, peso

relativo do coração (g/kg). O peso relativo do coração normalizado pelo comprimento da

tíbia (g/cm) (n = 16 para ambos os grupos). C, peso úmido do coração foi normalizado pelo

peso corporal (Ctrl, n = 21; Deca, n = 20). Valores expressos como média erro padrão da

média. **p < 0,01 vs. Ctrl.

4.2. Efeito da administração crônica de decanoato de nandrolona sobre a

frequência cardíaca e intervalo QT

A figura 12 mostra a frequência cardíaca (12A), duração do intervalo QT

(12B) e duração do intervalo QT corrigida pela frequência cardíaca (12C), medidos

no início (S0) e na 8ª semana (S8) de administração, em ratos dos grupos

administrado (Deca) e controle (Ctrl). No início do administração, os valores médios

29

do intervalo QT, QTc e frequência cardíaca (FC) não apresentaram diferenças

significativas entre os grupos. Ao final da 8ª semana de administração, o grupo Deca

apresentou intervalos QT e QTc significativamente maiores que os do grupo Ctrl (p

< 0,001). Não foram observadas diferenças significativas entre os valores médios da

FC dos grupos e em relação aos valores médios do início do tratamento.

S0 S80

20

40

60

80 ***

QT

(ms)

S0 S80

50

100

150

200CtrlDeca

***

QTc

(m

s)

S0 S80

100

200

300

400

500

FC

(b

pm

)

A B

C

Ctrl (n=6)

Deca (n=6)100 ms

0.02 mV

D

Figura 12. ECG representativo Ctrl e Deca (A), frequência cardíaca (B), intervalo QT (C) e

intervalo QT corrigido pela frequência cardíaca (D) medidos nos registros

eletrocardiográficos obtidos antes (S0) e ao final do período de administração (S8, 8ª

semana). O intervalo QT corrigido (QTc) foi calculado pela equação de Bazzet. Valores

expressos em média erro padrão da média. ***p < 0,001 vs. Ctrl. n = 6 em cada grupo.

4.3. Efeito da administração crônica de decanoato de nandrolona sobre o

potencial de ação ventricular

30

A figura 13 ilustra os potenciais de ação registrados em fatias de miocárdio

isoladas do ventrículo esquerdo de ratos controle (Ctrl) e administrado com

decanoato de nandrolona (Deca). A figura mostra claramente que a administração

crônica de decanoato de nandrolona induziu o prolongamento da duração do

potencial de ação ventricular.

Figura 13. Traçados representativos de potenciais de ação registrados em tecidos

musculares isolados do ventrículo esquerdo de ratos não admistrados (Ctrl) e administrados

com decanoato de nandrolona (Deca).

A figura 14 mostra os efeitos da administração crônica com decanoato de

nandrolona sobre o potencial de membrana no repouso (Figura 14A) e amplitude do

potencial de ação (Figura 14B). Em ambos os parâmetros, não foram observadas

diferenças significativas entre os dois grupos. A duração dos potenciais de ação do

ventrículo esquerdo foi prolongada nos ratos administrados com decanoato de

nandrolona, tanto ao nível de 30% (DPA30) quanto em 90% (DPA90) da

repolarização máxima (Figuras 15A e 15B). A triangulação do potencial de ação, um

índice preditor de risco arrítmico, foi maior nos animais administrados com

decanoato de nandrolona em comparação ao grupo controle (figura 15C).

31

Ctrl Deca

-90

-60

-30

0Po

ten

cial

de

rep

ou

so

(mV

)

Ctrl Deca0

20

40

60

80

100

120

Am

plit

ud

e d

o P

ot.

açã

o (

mV

)

A B

Figura 14. Efeito da administração crônica de decanoato de nandrolona sobre o potencial

de repouso (A) e a amplitude do potencial de ação (B). n = 11 e n = 10 células, Ctrl e Deca

respectivamente. Valores expressos em média erro padrão da média.

Ctrl Deca

0

5

10

15

20

***

DP

A30

(m

s)

Ctrl Deca

0

20

40

60

80

100

120

140 ***D

PA

90 (

ms)

Ctrl Deca

0

20

40

60

80

100

120 ***

DP

A90

- D

PA

30 (

ms)

A B

C

Figura 15. Efeito da administração crônica com decanoato de nandrolona sobre a duração

do potencial de ação a 30% (A) e 90% (B) da repolarização máxima, em potenciais de ação

registrados sob frequência de estimulação de 1,0 Hz. C, triangulação do potencial de ação,

definida como o tempo de repolarização entre DPA 30 e DPA 90. n = 11 e n = 10 células,

Ctrl e Deca respectivamente. Valores expressos como média ± erro padrão da média. ***p <

0,001 vs. Ctrl.

32

4.4. Efeito da administração crônica de decanoato de nandrolona sobre a

corrente de Ca2+ tipo L.

Para avaliar se o prolongamento da duração do potencial de ação (DPA30)

induzido pela administração crônica com esteroide anabólico estaria associado a

alterações na corrente de cálcio tipo L (ICa,L), esta foi analisada em cardiomiócitos

ventriculares do ventrículo esquerdo de ratos tratados com decanoato de

nandrolona.

A capacitância média dos cardiomiócitos foi 112,2 ± 6,3 pF no grupo Ctrl (n =

62 células) e 117,4 ± 34,1 pF no grupo Deca (n = 26 células). A figura 16 mostra a

relação corrente/voltagem para ICa,L. O gráfico expressa a amplitude de ICa,L em

valores de densidade de corrente, que é a amplitude da corrente (em pA)

normalizada pela capacitância da célula (em pF). Em ambos os grupos, ICa,L foi

ativada em -30 mV, atingiu o valor máximo em +10 mV e reverteu em

aproximadamente +60 mV (potencial no qual o Ca2+ deixa de entrar na célula e

começa a sair). A densidade de ICa,L foi significativamente maior nos cardiomiócitos

do grupo Deca nos potenciais 0, +10, +20 e +30 mV, em comparação ao grupo Ctrl.

33

Figura 16. Relação corrente/voltagem de ICa,L. A, esquema do protocolo de voltagem e

traçados representativos de ICa,L de cardiomiócitos dos grupos Ctrl e Deca. O protocolo de

voltagem para obter a curva I-V consistiu de pulsos despolarizantes a partir de -40 mV para

potenciais entre -50 e +60 mV, em incrementos de 10 mV. B, Curva I-V de ICa,L de

cardiomiócitos do ventrículo esquerdo de ratos controles (Ctrl, n = 36 células) e ratos

administrados com decanoato de nandrolona (Deca, n = 17 células). Valores expressos

como média ± erro padrão da média. *p < 0,05 e **p < 0,01 vs. Ctrl.

34

-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

CtrlDeca

mV

G/G

max

Figura 17. Curva de dependência de voltagem da ativação de ICa,L em cardiomiócitos do

ventrículo esquerdo de ratos dos grupos Ctrl (V½ = -5,6 ± 0.35 mV; slope = 7,1 ± 0,31; n =

36 células) e Deca (V½ = -6,0 ± 0,64 mV; slope = 7,2 ± 0,56; n = 17 células). A condutância

G está normalizada pela Gmax. Valores expressos como média ± erro padrão da média.

A figura 17 mostra as curvas de dependência de voltagem da ativação de

ICa,L em cardiomiócitos ventriculares dos grupos Ctrl e Deca. Não foram observadas

diferenças significativas entre os valores de V1/2 e slope das curvas dos dois grupos

experimentais.

A figura 18 mostra as curvas de dependência de voltagem da inativação

steady-state de ICa,L de cardiomiócitos tratados e não-tratados com decanoato de

nandrolona. Não foram observadas diferenças significativas entre os valores de V1/2

e slope das curvas dos dois grupos experimentais.

35

-80 -60 -40 -20 0 20 40

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

CtrlDeca

mVI/I

max

Figura 18. Curva de dependência de voltagem da inativação steady-state de ICa,L em

cardiomiócitos do ventrículo esquerdo de ratos dos grupos Ctrl (V½ = -28,6 ± 0,64 mV; slope

=-6,69 ± 0,57; n = 36 células) e Deca (V½ = -25,8 ± 1,53 mV; slope =-6,61 ± 1,34; n = 17

células). O protocolo de voltagem consistiu na aplicação de pré-pulsos com potencial entre -

70 e +40 mV, variando de 10 em 10 mV, seguido de um pulso para 0 mV. Valores expressos

como média ± erro padrão da média.

As curvas de recuperação da inativação de ICa,L dos cardiomiócitos dos

ventrículos esquerdos de ratos Ctrl e Deca são mostradas na figura 19. A constante

temporal de reativação () foi menor (p < 0,001) no grupo Deca (369,9 ± 18,22 ms, n

= 9 células) comparado ao grupo Ctrl (478,9 ± 23,38 ms, n = 12 células), mostrando

assim uma aceleração na reativação do canal de Ca2+ .

36

0 1000 2000 30000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

CtrlDeca

Intervalo entre pulsos (ms)

Co

rren

te r

elat

iva

Figura 19. Curva de recuperação da inativação de ICa,L. Curvas de reativação de ICa,L em

cardiomiócitos do ventrículo esquerdo de ratos Controle (n = 12 células) e Deca (n = 9

células). Valores expressos como média ± erro padrão da média.

4.5. Efeito da administração crônica de decanoato de nandrolona sobre a

corrente transiente de efluxo de K+ (Ito)

Os animais administrados com decanoato de nandrolona mostraram uma

acentuada redução da densidade de Ito em células da camada subepicárdica do

ventrículo esquerdo em comparação ao controle, em potenciais de membrana de

+30 a +60 mV (Figura 20). Nas células da camada subendocárdica do ventrículo

esquerdo (Figura 21) também mostramos redução da amplitude de Ito nos potenciais

de +50 e +60 mV, em comparação ao controle.

37

Figura 20. A, registro representativo da Ito em células da camada subepicárdica. B, relação

corrente/voltagem de Ito em cardiomiócitos da camada subepicárdica do ventrículo esquerdo

(Ctrl: n = 13 e Deca: n = 4 células). O protocolo consistiu de pulsos despolarizantes a partir

de -60 mV, com pré pulso a -40 mV, seguidos de pulsos entre -50 e +60 mV, em intervalos

de 10 mV. Valores expressos como média ± erro padrão da média. *p < 0,05, **p < 0,01 e

***p < 0,001 vs. Ctrl.

38

-60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60

3

6

9

12

15

18

21

Ctrl

Deca

pA/pF

mV

**

Ctrl DecaA

B

Figura 21. A, registros representativos de Ito em cardiomiócitos da camada subendocárdica

do ventrículo esquerdo. B, relação corrente/voltagem de Ito em cardiomiócitos camada

subendocárdica do ventrículo esquerdo dos grupos Ctrl (n = 13) e Deca (n = 5). O protocolo

consistiu de pulsos despolarizantes a partir de -60 mV, com pré pulso a -40 mV, seguidos de

pulsos entre -50 e +60 mV, em intervalos de 10 mV. Valores expressos como média ± erro

padrão da média.*p < 0,05 vs. Ctrl.

39

A figura 22 mostra a curva de dependência de voltagem da inativação

steady-state de Ito de cardiomiócitos epicardiais tratados e não-tratados com

decanoato de nandrolona. O V1/2 de inativação do grupo Deca estava deslocado (p <

0,05) para potencial menos despolarizado (-55,71 ± 0,31 mV, n = 4 células)

comparado ao grupo Controle (-49,89 ± 0,55 mV, n = 13 células), e o slope que

indica a inclinação da curva de inativação dependente de voltagem estava maior no

grupo Deca (slope = 4,27± 0,23, vs Ctrl: -5,6 ± 0,49; p < 0,05), assim mais sensível à

variação de voltagem. Nas células do endocárdio, não foi observada diferença

significativa nos parâmetros de V1/2 e slope do Ctrl (V½ = -46,55 ± 1,34 mV; slope =

10,21 ± 1,14; n = 13 células) e Deca (V½ = -51,20 ± 4,036 mV; slope = 11,11± 3,15;

n = 4 células).

Figura 22. Curva de dependência de voltagem da inativação steady-state de Ito em

cardiomiócitos da camada subepicárdica (A) (Ctrl: V½ = -49,89 ± 0,55 mV, slope = -5,6 ±

0,49, n = 14 células; Deca: V½ = -55,71± 0,31 mV, slope = 4,27± 0,23, n = 4 células) e

subendocárdica (B) (Ctrl: V½ = -46,55 ± 1,34 mV, slope = 10,21 ± 1,14, n = 13 células;

Deca: V½ = -51,20 ± 4,036 mV, slope = 11,11 ± 3,15, n = 4 células) em ventrículo esquerdo

de ratos. O protocolo de voltagem consistiu na aplicação de pré-pulsos com potencial entre -

80 e +40 mV, variando de 10 em 10 mV, seguido de um pulso para 0 mV. Valores expressos

como média ± erro padrão da média.

-80 -60 -40 -20 0 20 40

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0CtrlDeca

ASubepicárdica

mV

I/

Imax

-80 -60 -40 -20 0 20 40

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0CtrlDeca

B

mV

I/Im

ax

Subendocárdica

40

4.6. Efeito da administração crônica de decanoato de nandrolona sobre a

regulação do Ca2+ intracelular

4.6.1. Captação de Ca2+ intracelular pelo reticulo sarcoplasmático

Ao avaliarmos a mobilização do Ca2+ intracelular pelo método de tensão

isométrica de fibra desnuda nos animais administrados e nos controles, verificamos

que o tempo de carregamento de 1, 3 e 5 min do reticulo sarcoplasmático não gerou

uma reposta crescente da tensão em função do aumento do tempo de

carregamento, após um estimulo de 20 mM de cafeína em ambos os grupos. Isso

mostra que aparentemente o reticulo é recarregado rapidamente (tempo para o

carregamento máximo do reticulo ≤ 1min). Mas a tensão desenvolvida nos animais

controles era maior do que nos animais do grupo Deca (Figura 23).

Tempo de Carregamento de Ca2+

1 min 3 min 5 min0.0

0.2

0.4

0.6CtrlDeca

*** *** ***

Tempo

Ten

são

rel

ativ

a

Figura 23. Resposta contrátil a cafeína em fibras cardíacas desnudas expostas a diferentes

tempos de carregamento com solução pCa 7,4. O valor de tensão isométrica medido após o

estimulo com 20 mM cafeína foi normalizado pelo valor de tensão inicial ou tensão máxima

(P0 = tensão no pCa 4,8). n = 5 em ambos os grupos. p < 0,001 vs Ctrl.

Quando avaliamos a tensão em função da liberação de Ca2+ do reticulo com

diferentes concentrações de cafeína nas concentrações 3, 5 e 20 mM, não notamos

diferença significativa entre as tensões em função do aumento da concentração de

41

cafeína, mas novamente verificou-se que o grupo administrado com decanoato de

nandrolona tinha uma menor tensão em relação ao grupo controle. Esta menor

resposta pode ser devida a uma redução do conteúdo de Ca2+ do reticulo

sarcoplasmático (Figura 24).

Liberação de Ca2+

3 mM 5 mM 20 mM0.0

0.2

0.4

0.6

0.8CtrlDeca

*********

[Cafeína]

Ten

são

rel

ativ

a

Figura 24. Resposta contrátil a diferentes concentrações de cafeína em fibras cardíacas

desnudas previamente expostas a solução pCa 7,4 por tempo de carregamento fixo de 3

minutos. O valor de tensão medido após o estímulo de cafeína foi normalizado pelo valor de

tensão inicial ou tensão máxima (P0 = tensão no pCa 4,8). Grupos Ctrl (n = 4) e Deca (n =

5). ***p < 0,001 vs Ctrl.

4.6.2. Função contrátil e sensibilidade ao Ca2+

Ao avaliarmos a sensibilidade das proteínas contráteis à concentração

crescente de Ca2+ em fibras desnudas cardíacas, mostramos que os animais

administrados tinham uma maior sensibilidade e maior resposta contrátil ao Ca2+. A

maior contratilidade pode ser visualizada para os pCa: 6.0; 5.6; e 4,8 (2,48 ± 1,02;

6,33 ± 1,20; 8,97 ± 1,02 mN/mm2 vs Deca: 10,65 ± 1,93; 10,74 ± 1,51; e 14,07 ± 1,48

42

mN/mm2, p < 0,001, p < 0,05 e p < 0,05 vs. Ctrl) pelo aumento da tensão ativa em

resposta ao Ca2+ (Figura 25).

Tensão ativa pCa

4.85.25.66.06.46.87.20

4

8

12

16

CtrlDeca

*** *

*

pCa

Ten

são

(m

N/m

m2 )

Figura 25. Tensão isométrica em fibra cardíaca desnuda em diferentes pCa, os dados foram

ajustados pela equação de Hill (Y=Ymax * [Ca2+]Slope/(pCa50%slope + [Ca2+]slope, onde Y é

ligação do Ca2+ ao sítio especifico, sendo esta resposta traduzida aqui como tensão) (n = 5

para ambos os grupos). *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 vs Ctrl.

O aumento da sensibilidade ao Ca2+ é evidenciado pelo deslocamento da

curva de pCa para a esquerda (Figura 26A). Com a curva de pCa podemos

determinar então o pCa50% (Figura 26B), ou seja, a concentração de Ca2+ livre

necessária para atingir 50% da tensão máxima (50% da ligação do Ca2+ as fibras

contráteis) e o slope (Figura 26C), que é o fator de inclinação da curva. O grupo

Deca apresentou maior pCa50% (6,1± 0,05 vs Ctrl: 5,8 ± 0,06 ) e menor slope (-57,08

± 12,62 vs Ctrl: -24,43 ± 4,33).

43

Curva de pCa

4.85.25.66.06.46.87.20.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

CtrlDeca

pCa

Te

ns

ão

re

lati

va

pCa50%

Ctrl Deca

5.2

5.6

6.0

6.4**

pC

a

Ctrl Deca

-80

-60

-40

-20

0

*

Slo

pe

A

B C

Figura 26. A) Tensão isométrica relativa em fibra cardíaca desnuda em diferentes pCa

(valor de tensão normalizado pelo valor máximo obtido no pCa 4,8) (n = 5 para ambos os

grupos). B) pCa50%, pCa onde se atingiu 50% da tensão máxima. C) Slope, fator de

inclinação da curva. Os dados foram ajustados pela equação de Hill (Y=Ymax *

[Ca2+]Slope/(pCa50%slope + [Ca2+]slope, onde Y é ligação do Ca2+ ao sítio específico, sendo esta

resposta traduzida aqui como tensão) *p < 0,05 e **p < 0,01 vs Ctrl.

44

5. DISCUSSÃO

O presente estudo investigou o remodelamento elétrico cardíaco em ratos

sedentários tratados com dose suprafisiológica do esteroide anabólico decanoato de

nandrolona (Deca). Os nossos dados mostram que o tratamento crônico com

decanoato de nandrolona produz anormalidades na repolarização ventricular, com

aumento na duração do intervalo QT e dos potenciais de ação ventriculares. Estas

alterações induzidas pelo tratamento com o esteroide anabólico podem ser

atribuídas ao aumento da corrente despolarizante ICa,L e redução da corrente

repolarizante Ito. As alterações em ICa,L e Ito podem ser responsáveis pelas

alterações no acoplamento excitação-contração observadas nas fibras cardíacas de

ratos tratados com o esteroide anabólico.

Em nosso estudo, os animais tratados com dose suprafisiológica de esteroide

anabólico apresentaram menor massa corpórea ao final do período de tratamento,

em comparação aos animais não tratados. Esta diminuição do peso corporal do

grupo Deca pode ser devida a menor massa de tecido adiposo observada

previamente em ratos tratados com decanoato de nandrolona (Medei et al. 2010). A

massa cardíaca foi similar nos dois grupos, mas a razão entre a massa do coração e

massa corpórea estava aumentada no grupo Deca em comparação ao grupo Ctrl.

Entretanto, dado que o grupo Deca apresentou menor massa corpórea, pode ser

que este índice de hipertrofia cardíaca esteja superestimado. Quando analisado o

outro índice de hipertrofia cardíaca, que é a razão entre a massa cardíaca e o

comprimento da tíbia, não foi encontrada diferença entre os grupos. Outros estudos

com esteroide anabólico também mostraram resultados discrepantes, tais como

aumento da razão peso do coração sobre o peso corporal, mas não a do peso

absoluto do coração (Chaves et al., 2006; Fortunato et al., 2006; Pereira-Junior et

al., 2006; Rocha et al., 2007), aumento de ambos, peso absoluto e peso do coração

normalizado pela massa corpórea (Andrade et al., 2008), ou mesmo ausência de

diferença significativa entre grupos, tanto no peso absoluto quanto no peso relativo

do coração (Medei et al. 2010). Nesse estudo (Medei et al. 2010) não foi encontrada

diferença em relação ao grupo controle, tanto no peso absoluto quanto no peso

relativo do coração de ratos tratados com decanoato de nandrolona. Entretanto, a

45

análise morfométrica do miocárdio sugeriu hipertrofia cardíaca, visto que havia

diminuição do número de núcleos por área e aumento do diâmetro dos núcleos dos

cardiomiócitos. No estudo de Rocha e colaboradores (2007), não foi observada

diferença no diâmetro dos cardiomiócitos, embora tenha sido encontrada diferença

entre os pesos relativos dos corações dos grupos não-tratado e tratado com

decanoato de nandrolona.

Nosso estudo mostrou que mesmo sem evidência macroscópica de hipertrofia

cardíaca, os corações dos ratos tratados com esteroide anabólico apresentaram

alterações características de remodelamento elétrico cardíaco. O prolongamento do

intervalo QT no ECG de ratos tratados com esteroide anabólico pode ser associado

ao aumento na duração dos potenciais de ação do ventrículo esquerdo e corrobora

dados prévios de nosso laboratório (Medei et al. 2010). Os nossos resultados

mostraram aumento significativo na duração dos potenciais de ação do ventrículo

esquerdo dos animais tratados com decanoato de nandrolona ao nível de 30% e

90% da repolarização máxima. No potencial de ação ventricular de rato não há uma

definição clara entre as fases 2 e 3. Desta forma, o prolongamento do potencial de

ação ao nível de 30% sugere incremento de correntes despolarizantes e ao nível de

90% sugere uma diminuição da densidade das correntes repolarizantes.

Na análise do potencial de ação, não foram observadas mudanças na

amplitude do potencial de ação e na velocidade da fase 0, sugerindo que o

tratamento com esteroide anabólico não afetou a corrente de influxo de Na+

dependente de voltagem (INa). Como estes canais se inativam rapidamente,

normalmente não são determinantes para o aumento da duração do potencial de

ação cardíaco. No entanto, quando há retardo da inativação por ação de fármacos

(ex. veratridina) ou por mutação no gene SCN5A que codifica a subunidade α do

canal de Na+ (ex. arritmia cardíaca congênita conhecida como síndrome do QT longo

do tipo 3), há um ganho na função desse canal, na qual a corrente despolarizante é

sustentada por um maior tempo (Kramer et al., 2011). Um estudo recente mostrou

que a Ca2+-calmodulina dependente de cinase II induz aumento da INa mais

tardiamente, por modificações na cinética de inativação e mudança na inativação

steady state, o que favoreceria um aumento na duração do potencial de ação

(Wagner et al., 2006; Aiba e Tomaselli, 2010).

46

O prolongamento da duração do potencial de ação ventricular tem sido

observado consistentemente em diferentes modelos experimentais de hipertrofia

cardíaca como, por exemplo, no diabetes (Shimoni et al., 1994; Wang et al., 1995) e

na sobrecarga de pressão (Cerbai et al., 1994; Tomita et al., 1994). Nesses estudos,

os autores observaram diminuição da amplitude e mudanças nas características da

corrente transiente de efluxo (Ito), associadas ao prolongamento do potencial de

ação ventricular.

A corrente Ito é uma das principais correntes repolarizantes em

cardiomiócitos ventriculares de ratos, tendo papel importante no controle da duração

do potencial de ação. Vários trabalhos relacionam a diminuição da amplitude de Ito

com o aumento da duração do potencial de ação cardíaco em modelos de hipertrofia

e insuficiência cardíaca, concomitantemente com uma menor expressão,

principalmente, das subunidades α Kv1.4, Kv4.2 e Kv4.3 e da subunidade β KChIP2

do canal de K+ transiente de efluxo nos cardiomiócitos (Kaab et al., 1998; Tomaselli

e Marban, 1999; Aiba e Tomaselli, 2010). Em estudo prévio de nosso laboratório, no

qual colaborei (Medei et al., 2010), observamos diminuição na amplitude de Ito no

ventrículo esquerdo de ratos sedentários tratados com decanoato de nandrolona. No

presente estudo, nossos resultados mostram que a amplitude de Ito está diminuída

tanto nas células da camada subepicárdica, quanto na camada subendocárdica do

ventrículo esquerdo dos ratos do grupo Deca. Assim o remodelamento elétrico

parece ocorrer em todo o tecido ventricular esquerdo. Estes dados corroboram os

dados prévios de nosso laboratório, que mostraram redução da amplitude de Ito

associada à redução da expressão gênica das subunidades α Kv1.4 e Kv4.3 e da

subunidade regulatória β KChIP2 em cardiomiócitos do ventrículo esquerdo de rato

tratado com esteroide anabólico (Medei et al., 2010). A redução da amplitude de Ito

mais acentuada na camada subepicárdica pode favorecer o aumento da

heterogeneidade da repolarização, levando ao aumento da dispersão da

repolarização ventricular, que é um fator de risco associado a eventos arrítmicos e

morte súbita (Kramer et al., 2011). Neste contexto, Maior e colaboradores (2010)

observaram, em indivíduos atletas usuários de esteroides anabólicos o aumento do

intervalo QTc em repouso e após atividade física. Além disso, verificou-se aumento

da dispersão do intervalo QT, o que indica maior heterogeneidade da repolarização

ventricular, considerada na clínica como fator de risco para distúrbios de reentrada e

47

desencadeamento de arritmias ventriculares graves, como as taquiarritmias

polimórficas (Torsade de pointes) e morte súbita (Kramer et al., 2011).

Outros estudos mostraram que o prolongamento do potencial de ação na

hipertrofia cardíaca pode estar associado também ao aumento da amplitude da

corrente e alterações na cinética do canal de Ca2+ tipo L (Wang et al., 2001; Perrier

et al., 2004; Wang et al., 2008; Martin-Fernandez et al., 2009). Assim, Wang e

colaboradores (2001) mostraram aumento da amplitude da corrente e aceleração da

reativação de ICa,L. Em 2008, Wang e colaboradores mostraram aumento da

expressão da subunidade Cav1.2 do canal Ca2+ tipo L, na mesma proporção, tanto

na camada endocárdica, quanto na camada epicárdica, porém a amplitude da ICa,L

estava aumentada apenas na camada epicárdica do ventrículo. O aumento de ICa,L

apenas na camada subepicárdica pode contribuir para o aumento da dispersão da

repolarização nas subcamadas da parede ventricular, devido a não homogeneidade

regional do aumento da duração do potencial de ação (Wang et al., 2001; Wang et

al., 2008; Toischer et al., 2010). No presente estudo, mostramos que há incremento

na amplitude da corrente de cálcio tipo L e aceleração da reativação de ICa,L, sem

alteração na dependência de voltagem da ativação e inativação steady state nos

cardiomiócitos ventriculares dos ratos tratados com decanoato de nandrolona. A

maior densidade da ICa,L já foi relacionada, em modelos de hipertrofia cardíaca, com

uma maior expressão e atividade da Ca2+-calmodulina dependente de proteína

cinase II (CaMKII). A CaMKII parece modular o canal de Ca2+ tipo L, pois, quando

inibida por um antagonista especifico, a densidade e a cinética da corrente foi similar

à do grupo controle (Wang et al., 2001; Wang et al., 2008; Toischer et al., 2010).

Além disso, a CaMKII também pode aumentar a atividade da Ca-ATPase do reticulo

sarcoplasmático (SERCA) por fosforilação da fosfolambam, que exerce modulação

inibitória sobre a SERCA (Kranias e Hajjar, 2012).

A tensão contrátil das fibras cardíacas do grupo Deca foi menor do que a do

controle, tanto em resposta a diferentes concentrações de cafeína, após um tempo

fixo de carregamento do retículo sarcoplasmático com Ca2+, quanto em resposta a

20 mM de cafeína após diferentes tempos de carregamento. Este resultado sugere

que há menor liberação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático. Entretanto, na

ausência do retículo sarcoplasmático, as fibras desnudas do grupo Deca

48

apresentavam maior tensão em resposta a diferentes pCa, isto é, a curva de pCa se

apresentava deslocada para a esquerda, em comparação ao grupo controle, e tinha

maior inclinação, sugerindo que as proteínas sarcoméricas apresentavam maior

sensibilidade ao Ca2+. Alterações nas correntes ICa,L e Ito produzem mudanças na

morfologia e duração do potencial de ação cardíaco. Essas mudanças afetam o

transiente de Ca2+ que estimula a liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático.

Kaprielan e colaboradores (1999) observaram que, após o infarto do miocárdio, o

prolongamento da duração do potencial de ação era acompanhado por aumento da

amplitude do transiente de Ca2+. Esses autores demonstraram que o efeito sobre o

transiente de Ca2+ era pouco dependente do conteúdo de Ca2+ do retículo

sarcoplasmático e mais dependente da morfologia do potencial de ação. A atividade

do canal de Ca2+ tipo L e do trocador Na-Ca depende do potencial de membrana. De

acordo, fatores que modulam a forma do potencial de ação, modulam o influxo de

Ca2+ que estimula a liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático, afetando a

cinética e a amplitude do transiente de Ca2+ e, portanto, a força contrátil (Bassani et

al., 1995; Sah et al., 2001).

Já foi demonstrado que o tratamento crônico com decanoato de nandrolona

induz ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona (Rocha et al. 2007;

Marques-Neto et al. 2013) e que a expressão dos receptores de angiotensina II

(AT1) e de aldosterona (MR) está aumentada no ventrículo esquerdo de ratos

tratados com este esteroide anabólico (Marques-Neto et al., 2014). Gómez e

colaboradores (2009) observaram em miócitos ventriculares de ratos adultos,

incubados por 48 horas em presença de 100 mM de aldosterona, que o conteúdo de

Ca2+ do retículo sarcoplasmático e a expressão do receptor de rianodina (RyR)

estavam inalterados, entretanto, a atividade do RyR estava aumentada, bem como a

frequência de sparks de Ca2+ espontâneos. A mudança na atividade do RyR foi

associada à menor expressão das proteínas regulatórias do RyR (FKBP12 e

FKBP12.6).

Vários estudos em modelos de insuficiência cardíaca mostram que há

aumento do vazamento de Ca2+ do reticulo sarcoplasmático durante a diástole, como

resultado de disfunção do receptor de rianodina (Shannon e Lew, 2009; Shan et al.,

2010). Os mecanismos propostos incluem: 1) aumento da atividade do RyR por

49

fosforilação pelas proteínas cinase A e/ou cinase dependente de calmodulina (Xiao

et al., 2005; Bers, 2006; Shannon e Lew, 2009); 2) aumento da sensibilidade do RyR

ao Ca2+ luminal (Kubalova et al., 2005; Shannon e Lew, 2009); e, 3) dissociação da

FKBP12.6, proteína regulatória do RyR. Esta proteína é necessária para estabilizar o

RyR no estado fechado, prevenindo o vazamento diastólico do Ca2+ (Brillantes et al.,

1994; Shannon e Lew, 2009; Marx e Marks, 2013). Assim, para explicar os nossos

resultados dos ensaios de carregamento e liberação de Ca2+ do retículo

sarcoplasmático podemos sugerir que o tratamento por 8 semanas com decanoato

de nandrolona possa ter causado alguma disfunção do RyR que resultou em

aumento do vazamento diastólico do Ca2+, portanto, menor conteúdo de Ca2+ do

retículo sarcoplasmático disponibilizado para liberação, contribuindo para a redução

do transiente de Ca2+ e da tensão contrátil.

Na análise do ECG não vimos diferença na frequência cardíaca dos dois

grupos experimentais. Entretanto, sabemos que o aumento da atividade do sistema

renina-angiotensina leva à ativação do sistema simpático (Zucker et al., 2009;

Dupont e Brouwers, 2010). De fato, estudos prévios de nosso laboratório mostram

que, em ratos tratados com decanoato de nandrolona, há diminuição da modulação

cardíaca pelo sistema parassimpático e predomínio do tônus simpático (Pereira-

Junior et al., 2006), sendo o efeito do esteroide anabólico sobre o balanço

autonômico prevenido pelo tratamento com bloqueadores do sistema renina-

angiotensina-aldosterona (Marques-Neto et al., 2013). Na insuficiência cardíaca, a

hiperativação simpática e aumento da fosforilação do RyR causa vazamento

diastólico de Ca2+ (Ather et al., 2013). Portanto, podemos sugerir que nos ratos

tratados com esteroide anabólico a hiperativação simpática pode causar nos

cardiomiócitos ventriculares disfunção do RyR e vazamento diastólico de Ca2+.

Nossos resultados dos ensaios de tensão x pCa sugerem que o tratamento

com decanoato de nandrolona aumentou a sensibilidade das proteínas contráteis ao

Ca2+. Podemos sugerir que houve resposta cardíaca adaptativa, na qual as fibras

contráteis tornaram-se mais sensíveis ao Ca2+ para compensar o menor transiente

de Ca2+ devido ao vazamento de cálcio dos estoques.

50

6. CONCLUSÃO

A nossa conclusão é que, em ratos sedentários, a administração crônica do

esteroide anabólico decanoato de nandrolona, em dose suprafisiológica, induziu:

1) remodelamento elétrico cardíaco, com prolongamento da duração do potencial de

ação ventricular e do intervalo QT em decorrência do aumento de ICa,L e redução de

Ito. 2) alteração do acoplamento excitação-contração, com menor carregamento e

liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático e maior sensibilidade das proteínas

contrateis ao Ca2+ .

51

7. PERSPECTIVAS PARA O DOUTORADO Investigar o remodelamento cardíaco e a repercussão funcional na

insuficiência cardíaca induzida por doses supra-fisiológicas de esteroide anabólico.

Para isso, propomos os seguintes objetivos específicos:

1. Avaliar os efeitos da administração de decanoato de nandrolona por 12 semanas

sobre:

a. a função ventricular sistólica e diastólica;

b. os parâmetros eletrocardiográficos e dos potenciais de ação

ventriculares;

c. a expressão e a atividade de canais iônicos responsáveis pela

eletrogênese cardíaca;

d. o acoplamento excitação-contração cardíaca e o sistema de

mobilização de Ca2+ (medida de transientes de cálcio);

e. a expressão e a atividade das proteínas envolvidas no acoplamento

excitação-contração cardíaca (canal de Ca2+ tipo L, trocador sódio-cálcio,

receptor de rianodina, SERCA2a, fosfolambam, e FKBP12.6 e

calsequestrina).

2. Avaliar se o tratamento com antagonistas do sistema renina-angiotensina-

aldosterona e beta-bloqueadores previnem o remodelamento cardíaco e a

insuficiência cardíaca induzidos pelo esteroide anabólico.

52

8. REFERÊNCIAS

AIBA, T.; TOMASELLI, G. F. Electrical remodeling in the failing heart. Curr Opin Cardiol, v. 25, n. 1, p. 29-36, Jan 2010.

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