Universidade do Minho
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica
Laboratórios de Tecnologia Alimentar
Trabalho realizado por: Ana Teixeira nº 52488
João Sousa nº 52489
Marina Oliveira nº 55520
Teresa Conde nº 55511
Índice
1. Introdução ........................................................................................................................ 3
2. Materiais e métodos ......................................................................................................... 5
2.1. Materiais e reagentes ..................................................................................................... 5
2.2. Procedimento ............................................................................................................ 5
2.2.1. Extracção da catalase ......................................................................................... 5
2.2.2. Curva de calibração do substrato ....................................................................... 6
2.2.3. Concentração de proteína pelo método de Bradford .......................................... 6
2.2.3. Determinação da actividade enzimática ............................................................. 7
2.2.4. Efeito da temperatura na actividade enzimática................................................. 7
2.2.5. Efeito da concentração de substrato na actividade enzimática ........................... 8
2.2.6. Efeito da concentração da catalase na actividade enzimática ............................. 8
3. Resultados ........................................................................................................................ 9
4. Discussão de resultados .................................................................................................. 12
5. Conclusões ...................................................................................................................... 14
6. Bibliografia ...................................................................................................................... 15
7. Anexos ............................................................................................................................ 16
7.1. Método de Bradford ..................................................................................................... 16
7.2. Espectrofotometria ...................................................................................................... 16
7.3. Michaelis-Menten ........................................................................................................ 17
7.4. Exemplos de cálculo ..................................................................................................... 18
7.5. Curva de calibração do substrato .................................................................................. 19
7.6. Curva de calibração do Método de Bradford................................................................. 20
Sumário
Esta actividade experimental tem como principais objectivos a identificação da actividade
enzimática da catalase e o efeito da temperatura, pH, concentração de substrato (peróxido de
hidrogénio) e concentração de catalase nesta e, ainda, a identificação da cinética de Michaelis-
Menten.
Na determinação da actividade enzimática recorre-se à espectrofotometria e na
quantificação da catalase utiliza-se o método de Bradford.
Os principais resultados desta actividade indicam uma concentração de catalase próxima
de 0,219g/L para a diluição de 1:2 e 0,257g/L para a diluição de 1:3; para uma temperatura de
4oC a concentração de peróxido de hidrogénio varia entre 0,046 e 0,004 g/L, já para a
temperatura ambiente a variação situa-se entre os 0,024 e os 0,002 g/L; no meio em que se
adicionaram 4 mL de peróxido de hidrogénio os valores variam entre os 0,036 e os 0,003 g/L e
no meio em que se adicionaram 10 mL de peróxido de hidrogénio obtém-se valores entre os
0,019 e os 0,005 g/L e, tanto no meio sem diluição como no meio com diluição de 1:2, os
valores da concentração de peróxido de hidrogénio variam entre 0,024 e 0,003 g/L.
As conclusões mais relevantes desta actividade são que a temperatura e a concentração
de peróxido de hidrogénio (substrato) afectam a actividade enzimática. Já a concentração de
catalase, desde que o substrato esteja presente em excesso, não afecta a actividade
enzimática. Verifica-se também que a actividade enzimática é maior à temperatura ambiente,
pois esta é mais próxima da temperatura óptima. No caso da solução em que são adicionados
10 mL de peróxido de hidrogénio obtém-se uma maior actividade enzimática, sendo que a
partir de um determinado momento diminui, pois os locais activos da catalase estão todos
ocupados.
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1. Introdução
A acumulação de oxigénio na atmosfera terrestre marcou um ponto de viragem na
evolução. A formação da camada de ozono na estratosfera veio a favorecer a evolução dos
seres vivos para o meio terrestre e a utilização deste gás no metabolismo como aceitador final
dos electrões da cadeia respiratória mitocondrial marcou um melhoramento substancial no
rendimento energético, tornando-o imprescindível para a maioria das espécies actuais [1].
Contudo, e apesar dos extraordinários melhoramentos em termos de evolução do
metabolismo, viver com o oxigénio é perigoso, uma vez que este é um gás tóxico, mutagénico
e, por conseguinte, altamente prejudicial para os seres vivos que dele se servem [1][3]. A sua
toxicidade está, actualmente, relacionada com a produção de espécies reactivas de oxigénio
(ROS), cuja formação ocorre maioritariamente na mitocôndria [1]. O termo ROS implica uma
produção intracelular de intermediários de oxigénio que ameaçam a integridade de várias
biomoléculas incluindo proteínas, lípidos e DNA [1]. Para reagir à formação de ROS, a
mitocôndria possui várias defesas antioxidantes destinadas à eliminação tanto do anião
superóxido (O2•⁻) como do peróxido de hidrogénio (H2O2) [1].
O peróxido de hidrogénio é uma das formas de ROS intracelulares mais comuns e, embora
não seja um radical livre, tem um papel muito importante devido à sua capacidade para
penetrar nas membranas biológicas. Este intervém na formação de radicais livres funcionando
como um intermediário na formação de ROS. Assim, o peróxido de hidrogénio é um
bioproduto tóxico, altamente reactivo, resultante de reacções metabólicas, que pode danificar
as células se não for removido, causando a oxidação de constituintes celulares, principalmente
lípidos e, em última instância provocar a morte celular [1][2][3].
Para manter as concentrações de ROS dentro dos níveis fisiológicos, o organismo produz
catalase (EC 1.11.1.6) [1][2]. A catalase “patrulha” as células de forma a neutralizar a produção
constante de peróxido de hidrogénio e mantê-lo a um nível seguro [1][2][3]. Esta está presente
nos peroxissomas de praticamente todas as células aeróbias e protege a célula dos efeitos
tóxicos do peróxido de hidrogénio, catalisando a sua decomposição em oxigénio molecular e
água, inofensivos ao organismo, sem a produção de radicais livres [1][2][3]. A catalase é uma
molécula tetramérica, constituída por quatro cadeias polipeptídicas com quatro grupos
prostéticos hema com Fe(III) nos locais activos da enzima que se oxida a Fe(IV) [2]. O
mecanismo de catálise não está totalmente elucidado, mas a reacção geral é dada pela
equação 1 e é ilustrada pela figura 1 [2]:
2 H2O2 → 2 H2O + O2 equação 1
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Figura 1. Mecanismo de catálise da catalase [1].
Como foi dito anteriormente, a química de catálise da catalase não foi completamente
esclarecida mas pensa-se que esta ocorre em duas etapas, ilustradas pelas equações 2 e 3:
H2O2 + Fe (III)-E → H2O + O = Fe (IV)-E equação 2
H2O2 + O = Fe (IV)-E → H2O + Fe (III)-E equação 3
onde Fe-E representa o centro de ferro do heme ligado ao resto da enzima (E) [2].
O objectivo deste trabalho experimental visa a avaliação da influência de parâmetros
físicos (temperatura) e químicos (concentração do substrato, concentração da enzima e pH) na
actividade enzimática e estabilidade desta enzima de defesa anti-oxidante – a catalase (figura
2). A sua actividade varia significativamente de uma fonte para outra [1] e algumas fontes
desta enzima são: cebolas, cenouras, espinafres, rebentos, nabos, rabanetes, damascos,
brócolos, bananas, sangue, fígado e leite cru. Os frutos têm geralmente menor actividade da
catalase talvez devido à sua maior acidez [1]. Neste trabalho utilizar-se-á o extracto da
beterraba crua como fonte de catalase que, segundo a literatura, possui cerca de 3 g de
proteínas por cada 100 g de beterraba [4].
Figura 2. Estrutura de tetrâmero da catalase [3].
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2. Materiais e métodos
2.1. Materiais e reagentes
Balões volumétricos;
Banhos termostatizados;
Tubos de ensaio;
Pipetas volumétricas;
Varetas de vidro;
Balança analítica;
Faca;
Suporte de tubos de ensaio;
Coador;
Gaze;
Furador de papéis;
Cronómetro;
Papel de alumínio;
Ralador;
Goblés;
Pompete;
Micropipeta;
Espectrofotómetro;
Cuvete de quartzo;
Vórtex;
Beterraba;
Peróxido de hidrogénio;
Água destilada;
Reagente de Bradford;
Solução de BSA;
Solução tampão fosfato
(pH=7).
2.2. Procedimento
2.2.1. Extracção da catalase
Descascar, cortar e pesar cerca de 100g de beterraba (anotar o valor da massa
pesada);
Rapidamente colocar a amostra num recipiente de plástico com 100 mL de tampão
fosfato a 4oC. Colocar o recipiente num banho frio (arrefecido com gelo) e
homogeneizar a amostra durante 30s a 1min;
Colocar um balão de Erlenmeyer num banho frio e filtrar o extracto de beterraba com
gaze. Transferir o filtrado para um balão volumétrico e acertar o volume a 200 mL com
tampão fosfato a 4oC. Preservar o extracto no banho frio até ser utilizado. Este
extracto irá conter a catalase e será designado por “extracto-mãe”.
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2.2.2. Curva de calibração do substrato
Num balão volumétrico de 100 mL adicionar 10 mL de peróxido de hidrogénio a 30% e
perfazer com água destilada de forma a obter peróxido de hidrogénio a 3%;
Num balão volumétrico de 50 mL, preparar uma solução contendo 0,5 mL de peróxido
de hidrogénio (3% v/v);
Perfazer a solução com tampão fosfato (pH 7);
A partir desta solução realizar várias diluições;
Ajustar o espetrofótometro para 240 nm e ler as absorvâncias de todas as soluções.
Nota: Realizar todas as leituras em triplicado.
2.2.3. Concentração de proteína pelo método de Bradford
2.2.3.1. Curva de calibração
Preparar as soluções indicadas na Tabela 1:
Tabela 1. Quantidades necessárias para a preparação das soluções para a curva de calibração
de Bradford.
[BSA] (mg/L) BSA (mL) Tampão fosfato (mL)
0 (branco) 0,0 10,0
400 0,4 9,6
800 0,8 9,2
1200 1,2 8,8
1600 1,6 8,4
2000 2,0 8,0
Em seguida, adicionam-se 3 mL de solução de Bradford a 100 L de amostra, em tubos de
ensaio;
Colocar as soluções no escuro e aguardar 10 minutos para que ocorra a reacção;
Retirar 200 L de cada solução para uma placa ELISA, em triplicado;
Ler a absorvância a 240 nm.
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2.2.3.2. Quantificação da catalase
Preparar uma diluição de 1:2 e de 1:3 do “extracto-mãe”;
Em seguida, adicionam-se 3 mL de solução de Bradford a 100 L de amostra, em tubos
de ensaio;
Colocar as soluções no escuro e aguardar 10 minutos para que ocorra a reacção;
Retirar 200 L de cada solução para uma placa ELISA, em triplicado;
Ler a absorvância a 240 nm.
2.2.3. Determinação da actividade enzimática
Proceder a diluições do “extracto-mãe” de catalase de 1:2 e mantê-las à temperatura
ambiente;
Adicionam-se 6 mL de peróxido de hidrogénio (H2O2);
Utiliza-se como branco uma solução contendo 2 mL de extracto e 2 mL de tampão
fosfato (pH=7);
Ler absorvância a 240 nm;
Repetir a leitura de 1 em 1 minutos até a absorvância estabilizar.
2.2.4. Efeito da temperatura na actividade enzimática
Proceder a diluições do “extracto-mãe” de catalase de 1:2 e mantê-las a duas
temperaturas distintas, uma à temperatura ambiente e outra em gelo;
Adicionam-se 6 mL de peróxido de hidrogénio (H2O2);
Preparar uma solução contendo 2 mL de extracto e 2 mL de tampão, que foi utilizada
como branco;
Ler absorvância a 240 nm;
Repetir a leitura de 1 em 1 minutos até a absorvância estabilizar.
Nota: A temperatura óptima da catalase situa-se entre 20oC e os 50 oC, daí as temperaturas escolhidas estarem
dentro deste intervalo [5].
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2.2.5. Efeito da concentração de substrato na actividade enzimática
Proceder a diluições do “extracto-mãe” de catalase de 1: 2 à temperatura ambiente;
Adicionam-se 4 mL e 10 mL de peróxido de hidrogénio (H2O2);
Preparar uma solução contendo 2 mL de extracto e 2 mL de tampão, que foi utilizada
como branco;
Ler absorvância a 240 nm;
Repetir a leitura de 1 em 1 minutos até a absorvância estabilizar.
2.2.6. Efeito da concentração da catalase na actividade enzimática
Proceder a diluições do “extracto-mãe” de catalase de 1: 2 e de 1:5, à temperatura
ambiente;
Adicionam-se 6 mL de peróxido de hidrogénio (H2O2);
Preparar uma solução contendo 2 mL de extracto e 2 mL de tampão, que foi utilizada
como branco;
Ler absorvância a 240 nm;
Repetir a leitura de 1 em 1 minutos até a absorvância estabilizar.
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3. Resultados
Na tabela 2 podem observar-se os valores obtidos de concentração de catalase para uma
diluição de 1:2 e de 1:3, que são aproximadamente iguais.
Na figura 3 nota-se um decréscimo da concentração de peróxido de hidrogénio (H2O2) ao
longo do tempo, tanto no ensaio à temperatura ambiente como no realizado a 4oC,
verificando-se que à temperatura ambiente a concentração de peróxido de hidrogénio é
menor do que à temperatura de 4oC.
Na figura 4 verifica-se uma diminuição da concentração de peróxido de hidrogénio ao
longo do tempo, sendo que, até aos 5 minutos, observa-se que a curva respectiva à adição de
10 mL de peróxido de hidrogénio tem concentrações inferiores de peróxido de hidrogénio, em
relação à curva na qual foram adicionados apenas 4 mL de peróxido de hidrogénio. Entre os 5
e os 7 minutos nota-se uma concentração aproximadamente igual e a partir dos 7 minutos
observa-se um aumento da concentração de peróxido de hidrogénio na solução com 10 mL de
peróxido de hidrogénio.
Na figura 5 também é observada uma diminuição da concentração de peróxido de
hidrogénio ao longo do tempo, sendo que a concentração de peróxido de hidrogénio é
próxima no meio com diluição de 1:2 e no meio com o extracto sem qualquer diluição.
Tabela 2. Valores de concentração obtidos para a catalase.
Amostra Diluição [catalase] (g/L)
1 1:2 0,219
2 1:3 0,257
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Figura 3. Representação gráfica do efeito da temperatura na actividade enzimática da catalase.
Figura 4. Representação gráfica do efeito da concentração de peróxido de hidrogénio
(substrato) na actividade enzimática da catalase.
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
0,045
0,050
0 2 4 6 8
[H2O
2] (g
.L-1
)
tempo (min)
Ambiente (25 ºC)
Frio (4 ºC)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
0 2 4 6 8 10
[H2O
2] (g
.L-1
)
tempo (min)
4 mL de peróxido de hidrogénio
10 mL de peróxido de hidrogénio
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Figura 5. Representação gráfica do efeito da concentração de catalase (proteína) na actividade
enzimática.
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0 2 4 6 8 10
[H2O
2] (g
.L-1
)
tempo (min)
sem diluição
Diluição 1:2
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4. Discussão de resultados
Na determinação da concentração de catalase pelo método de Bradford verifica-se que a
concentração de catalase é aproximadamente a mesma para as duas diluições efectuadas, isto
é, na diluição 1:2 obteve-se uma concentração de 0,219 g/L e na diluição 1:3 obteve-se uma
concentração de 0,257 g/L. Tal era esperado pois as amostras foram retiradas do mesmo
“extracto-mãe”, logo apresentam a mesma concentração de catalase.
Com base na análise gráfica da figura 3 pode-se concluir que a concentração de peróxido
de hidrogénio é maior à temperatura de 4oC, onde os valores variam entre 0,045 e 0,004 g/L,
quando comparado com a temperatura ambiente, onde os valores variam entre 0,024 e 0,002
g/L, uma vez que, a esta temperatura a actividade da catalase vai ser menor, não convertendo
tanto substrato em produto e, por conseguinte existe maior concentração de peróxido de
hidrogénio na amostra. Dado que a temperatura óptima encontrada na literatura se situa
entre os 20oC e os 50oC, era de esperar que à temperatura ambiente se obtivesse maior
actividade enzimática, dado o facto de a catalase estar num meio a uma temperatura mais
próxima da sua temperatura óptima [5][6].
Analisando a figura 4 verifica-se que para o meio onde foram adicionados 4 mL de
peróxido de hidrogénio os valores situam-se entre os 0,036 e os 0,003 g/L, enquanto no meio
onde se adicionaram 10 mL de peróxido de hidrogénio os valores variam entre 0,019 e 0,005
g/L, regista-se inicialmente uma menor concentração de peróxido de hidrogénio na solução à
qual foram adicionados 10 mL de peróxido de hidrogénio até aos 5 minutos de reacção.
Seguidamente, entre os 5 e os 7 minutos de reacção, ambas as curvas se encontram, sendo
que a partir dos 7 minutos, a curva ilustrativa da amostra à qual foram adicionados 4 mL de
peróxido de hidrogénio apresenta menor concentração de peróxido de hidrogénio. Assim, a
actividade enzimática foi maior primeiramente para a amostra onde existia maior
concentração de substrato e, a partir dos 7 minutos, para a amostra contendo menor
concentração de substrato. Tal pode ser explicado pelo facto de a velocidade da reacção
aumentar mais rapidamente quando a concentração de substrato é maior, mas somente até
um valor máximo, em que todas as enzimas disponíveis estão saturadas, isto é, recrutadas
para a formação do complexo enzima-substrato [7].
Pela análise da figura 5 verifica-se que não há grande variação entre as duas curvas
correspondentes à não diluição e à diluição de 1:2 do extracto de catalase. Assim, tanto na
curva do meio sem diluição como na curva do meio com diluição de 1:2 os valores de
concentração de peróxido de hidrogénio variam entre os 0,024 e os 0,003 g/L. Ora, tal facto
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indica que a concentração de catalase não influencia a sua actividade enzimática, isto é,
variando a concentração de catalase, desde de que exista uma concentração de substrato
suficiente, este liga-se à enzima formando o complexo enzima-substrato indiscriminadamente
[7].
Devido ao atraso da actividade prática e ao esgotar do tampão não foi possível realizar a
actividade prática referente ao efeito do pH na actividade enzimática e o estudo da cinética de
Michaelis-Menten. Contudo, esperava-se que a actividade enzimática fosse maior a um pH
próximo do pH óptimo da catalase que se situava entre o 7,0 e os 9,0 [5]. Quanto à cinética de
Michaelis-Menten a literatura refere um Km da catalase igual a 1,1 M, pelo que se esperava
encontrar uma constante cinética de Michaelis-Menten próxima deste valor [8].
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5. Conclusões
As conclusões mais relevantes que podem ser retiradas deste trabalho são que a
actividade enzimática é afectada pela temperatura e pela concentração de peróxido de
hidrogénio (substrato), mas não pela concentração de catalase desde que o substrato esteja
presente na solução em excesso.
A actividade enzimática foi maior para uma temperatura mais próxima da temperatura
óptima, ou seja, foi mais alta à temperatura ambiente. Para uma concentração de substrato
mais elevada foi obtida uma maior actividade enzimática, sendo que a partir de um
determinado momento diminui, uma vez que os locais activos da catalase estavam todos
ocupados a formar o complexo enzima-substrato.
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6. Bibliografia
[1] DOURADO, F.; ABRUNHOSA, L.; 2010/2011, Laboratórios de Tecnologias Alimentares,
Trabalhos Práticos;
[2]http://www.callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/catalase/cat
1.htm, consultado em 30/09/11;
[3] BRITO, A.; 2006; O Oxigénio no Mundo Vivo: dos melhoramentos extraordinários aos
efeitos deletérios, Adequação de protocolos para aplicação aos Ensinos Básico e Secundário;
[4] http://www.vidadequalidade.com.br/saude/beneficios-da-beterraba.html;
[5] Medeiros, I.;Bainy, A.; 2000, Otimização da metodologia de análise da enzimas catalase e
glutationa s-transferase para a glândula digestiva do mexilhão Perna perna;
[6] BARTOSZEK, M.; KŚCIUCZYK, M.; 2005, Study of the temperature influence on catalase
using spin labelling method, Journal of Molecular Structure, pp. 733-736;
[7] Schuller, D.; Bjӧrn, J.; 2009/2010, Laboratórios Integrados de Biologia, Guia de Laboratório;
[8] QUINTAS, A.; FREIRE, A.; HALPERN, M.; Bioquímica, Organização Molecular da Vida, 2008,
1ª edição, LIDEL, págs. 257, 274;
[9] SOUSA, D.; 2009/2010; Protocolos de Laboratórios de Bioprocessos;
[10]http://pt.scribd.com/doc/19825031/Analise-pelo-espectrofotometro-e-curva-
padrao, consultado em 7/10/11;
[11] http://c2o.pro.br/automacao/x1669.html, consultado em 7/10/11;
[12] http://cheirosdaterra.hd1.com.br/controle_qualidade_03.htm, consultado em 7/10/11
[13] http://gmein.uib.es/otros/enzimas/Jmoldesarrollo/textos/enzima5.html, consultado em
30/09/11;
[capa] http://csmres.jmu.edu/biology/bio380/web12/discussion%20proj2.htm, consultado em
20/10/11.
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7. Anexos
7.1. Método de Bradford
A quantificação da proteína solúvel presente nos extractos celulares foi efectuada pelo
método desenvolvido por Bradford (1976). Este método baseia-se na propriedade que o
corante azul de Coomassie tem em estabelecer ligações a proteínas pela sua parte cromófora.
Ao ligar-se à proteína, o corante muda de vermelho para azul. Assim, as soluções deste corante
apresentam um máximo de absorvência a 465 nm e 595 nm, na ausência e na presença,
respectivamente, de proteína em solução [9].
7.2. Espectrofotometria
Neste trabalho experimental recorre-se a uma técnica analítica que avalia a capacidade
que os solutos têm de absorver a luz em comprimentos de onda específicos – a
espectrofotometria. A medida da luz absorvida, isto é, a absorvância, possibilita a dedução da
concentração do soluto nas soluções [10]. Deste modo, pelo uso da espectrofotometria é
possível determinar a quantidade de luz absorvida por uma substância em solução, permitindo
assim calcular a sua concentração. Quando a luz com um determinado comprimento de onda
incide numa solução uma parte dessa luz é absorvida pelas moléculas em solução. Esta
absorvância segue a Lei de Beer-Lambert e é directamente proporcional à:
Concentração do soluto
Capacidade que a substância dissolvida tem de absorver a luz de um determinado
comprimento de onda
A distância percorrida pela luz através da solução (geralmente 1 cm)
Após a passagem pela solução, a energia luminosa detectada pelo fotodetector é expressa em
absorvância (A), calculada pela equação 4 e ilustrada pela Figura 2:
A (absorvância) = log(I0/It) equação 4
Onde I0 representa a intensidade da luz na fonte, antes de passar pela amostra (substância
dissolvida) e It representa a luz que passa através da amostra (substância dissolvida) [7].
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Figura 6. Esquema ilustrativo do funcionamento do espetrofótometro [11].
Pela medição da absorvância é possível determinar a concentração de molécula em
solução que absorve luz de um determinado comprimento de onda. Todavia, as leituras das
absorvâncias apenas indicam concentrações relativas – uma absorvância mais elevada resulta
de uma concentração mais elevada. Nestes casos, a concentração pode ser estimada
recorrendo a uma curva de calibração.
A espectrofotometria possui como vantagem principal uma grande sensibilidade, uma vez
que, ao contrário dos métodos volumétricos onde é necessário uma concentração mínima de
0,1mg/ml da substância a ser analisada, enquanto na espectrofotometria, se pode analisar
soluções com concentrações até 0,001mg/ml, ou seja, o método é cerca de 100 vezes mais
sensível. As análises espectrofotométricas são ainda seguras, de fácil execução, rápidas e de
baixo custo. Contudo, esta técnica possui algumas desvantagens como: a falta de
especificidade, por ser baseado na quantidade de energia absorvida por uma substância num
comprimento de onda específico, tornando difícil a distinção da substância a ser analisada;
algumas substâncias não seguem a Lei de Beer-Lambert, não sendo possível determinar a sua
concentração em determinadas soluções [12].
7.3. Michaelis-Menten [13]
A cinética enzimática é o estudo do caminho mais provável para a definição da equação da
taxa da reacção de um sistema reaccional catalisado por enzimas. Medindo-se a concentração
do substrato com o decorrer do tempo, estas medições permitem a construção da curva da
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Figura 2, a qual traduz a variação da velocidade de reacção com o consumo de substrato
(formação do produto) com o tempo.
Um dos objectivos deste trabalho experimental prende-se com a utilização da cinética de
Michaelis-Menten para a determinação das constantes cinéticas Vmáx, Km e K2 da catalase:
][
][
0
0
0SKm
SVV máx
][ 02 EKVmáx
Onde, V0 é a velocidade inicial da reacção, [S0] é a concentração de substrato, [E0] é a
concentração de enzima inicial e Vmáx, Km e K2 são as constantes cinéticas.
Recorrendo ao ajuste não linear da representação gráfica da equação acima é possível
determinar as constantes cinéticas como mostra a figura 2:
Figura 7. Gráfico ilustrativo da cinética de Michaelis-Menten [13].
7.4. Exemplos de cálculo
Concentração de Peróxido de Hidrogénio:
equação 5
equação 6
2503,38
0198,022
absmédia
OH
Universidade do Minho
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica
Laboratórios de Tecnologia Alimentar
19
lg
OH 024,02503,38
0198,02
445,0421,0
][ 22
Concentração de Proteína:
l
g219,02
437,0
755,02
812,0763,0
Proteina
7.5. Curva de calibração do substrato
Figura 8. Curva de calibração do substrato (peróxido de hidrogénio – H2O2).
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030
Ab
sorv
ânci
a
Concentração (g.L-1)
y = 38,503 ± 10,031 x - 0,0198 ± 0,170 R² = 0,9803
2437,0
755,0Proteina
absmédia
Universidade do Minho
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica
Laboratórios de Tecnologia Alimentar
20
7.6. Curva de calibração do Método de Bradford
Figura 9. Curva de calibração do método de Bradford.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Ab
sorv
ânci
a
Concentração (g.L-1)
y = 0,437 ± 0,125 x + 0,7555 ± 0,151 R² = 0,9637