Técnicas Laboratoriais para detecção de antígenos-anticorpos
INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO
Detecção, quantificação e caracterização dos
anticorpos e seu uso como ferramenta para pesquisa e
diagnóstico
RESPOSTA DE ANTICORPOS
EspecificidadeEspecificidadeHabilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag.
QuantidadeQuantidadeN° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção.
IsotipoIsotipoDetermina a persistência (meia vida in vivo diferente). A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados. AfinidadeAfinidadeForça de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário. Avidez:Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.
Avidez x Afinidade
MÉTODOS
1) Reagentes não marcados• Reação de precipitação• Reação de aglutinação
2) Reagentes marcados• RIA• ELISA • Imunofluorescência• Western Blotting
MÉTODOS
PRECIPITAÇÃOPRECIPITAÇÃO- Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese AGLUTINAÇÃOAGLUTINAÇÃO- Aglutinação direta e indireta- Inibição da aglutinação- Teste de Coombs IMUNOENSAIOSIMUNOENSAIOS- RIA- ELISA - Imunofluorescência e Citometria de Fluxo- Western Blotting
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
- - Pesquisa - Diagnóstico- Soroepidemiologia
PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
Precipitação:Precipitação:Formação de complexos Antígeno-Anticorpo.
Aglutinação:Aglutinação:É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de anticorpo que se ligam a antígeno na superfície de partículas adjacentes.
As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag
solúvel e particulado.
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO Interação entre Anticorpo e Antígeno solúvel Anticorpo precisa ser bivalente Antígeno precisa ser bi ou polivalente A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação
que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA
PRECIPITADOPRECIPITADO
É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações
dos mesmos. Observe abaixo:
Zona de excesso de anticorpo
Zona de equivalência
Zona de excesso de antígeno
+ - -+- -
Anticorpo livre
Antígeno livre 100%-- Percentual de complexo imune precipitado
Quantidade de antígeno adicionado
TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
IMUNODIFUSÃO
• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:
Imunodifusão Dupla:
• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:
Ac
IMUNODIFUSÃO DUPLA
Ac
Ag Ag
Ac
Ag Ag
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Ac
Ag Ag
Utilização: muito usada em pesquisa e diagnóstico de algumas doenças, como cisticercose
As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação:
Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante
Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo.
O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em torno do orifício.
IMUNODIFUSÃO RADIAL
Poços onde são colocados padrões e amostras a serem
dosados Agarose contendo anticorposanti-IgG humana
Halo de precipitação IgG – anti-IgG
Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas.
Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.
As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas.
Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. Ag e Ac formam arcos de precipitação.
IMUNOELETROFORESE
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+ -
Ag
Ag
1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna
canaleta
2- Anti-soro na canaleta
canaleta
3- Difusão e precipitação
Ac + Ag multivalente particulado Título: maior diluição que ainda causa aglutinação
(semi-quantitativo) Pó-zona: excesso de Ac Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga
elétrica (repulsão) Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
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2) Reagente (anticorpo anti A, B):
AGLUTINAÇÃO DIRETA
1) Amostra de sangue na placa teste:
Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação
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3) Controle negativo:
4) Mistura-se:
AGLUTINAÇÃO DIRETA
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5) Leitura do resultado:
Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.
negativo positivo
AGLUTINAÇÃO DIRETA
AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas:
• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa.
• O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa.
• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço.
Aglutinação Positiva
Negativa
Ag solúveis associados a outras superfícies(Partículas de látex ou superfície de hemácias)
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Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
+Soro anti - hCGUrina
São incubados e colocados numa placa
Adicionam-se Partículas revestidas com hCG
Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.
Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubação inicial
Resultado negativo:(ausência de hCG na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.
TESTE DE COOMBS Ac antiimunoglobulinas (Robert
Coombs); DHRN – mãe produz IgG anti-Rh; Não aglutinam os eritrócitos; Direto: Ac ligados aos
eritrócitos fetais; Indireto: Ac anti-Rh não
aglutinantes no soro materno. Permite detectar
incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN.
Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos)
Tipos:- RIA- ELISA- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO- WESTERN BLOTTING
IMUNOENSAIOS
Princípio da técnica:
Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível.
Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa.
A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência).
Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche.
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
Microscópio de fluorescência com epiluminação
luz UV atinge o ma- terial examinado
fluorescência emitida chega ao observador
TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
IFA direta:Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes,
em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.
IFA indireta:Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença
de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.
É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais
intensa) e especificidade.
APLICAÇÃO DA TÉCNICA
Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA
O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.
O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora).
A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro.
Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura.
Fosfatase alcalinaPeroxidase
B-galactosidase
TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto
DIRETO OU SANDUÍCHE
INDIRETO PLACA UTILIZADA
ELISA Indireto
ELISA Direto ou Sanduíche
Aplicações do ELISA: Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa
Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo
ELISA Competitivo
RADIOIMUNOENSAIO - RIA Marcações:
I125: emite raios gama H3: raios beta
Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g) Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo. Aplicações:
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,
proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa
WESTERN BLOTTING Eletroforese de
proteínas. Identifica
antígenos ou anticorpos.
WESTERN BLOTTING
WESTERN BLOTTING