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ELAINE CRISTINA KORMANN
SÍNTESE DE DERIVADOS TIAZOLIDINODIÔNICOS E
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA
E EFEITO ANTITUMORAL NO CÂNCER DE MAMA
TRIPLO-NEGATIVO
Itajaí
2017
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ELAINE CRISTINA KORMANN
SÍNTESE DE DERIVADOS TIAZOLIDINODIÔNICOS E
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA
E EFEITO ANTITUMORAL NO CÂNCER DE MAMA
TRIPLO-NEGATIVO
Tese submetida à Universidade do Vale
do Itajaí como parte dos requisitos para a
obtenção do grau de Doutor em Ciências
Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Fátima de
Campos Buzzi.
Co-orientador: Prof. Dr. Rogério Corrêa.
Itajaí,
Setembro/2017
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Catalogação na fonte pela Bibliteca Universitária
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Dedico este trabalho aos meus pais Edson Kormann
e Lourdes Kormann, pelos ensinamentos, incentivos,
apoio, dedicação e por me ensinarem a importância da
família e o caminho da honestidade e persistência.
Pelo amor verdadeiro que sempre foi e será muito
importante para que eu continue minha caminhada.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pois sem ele eu não teria chego
até aqui.
Aos meus pais, Lourdes e Edson pelo amor incondicional, apoio e
incentivo em todos os meus sonhos e decisões. Eu amo vocês!!!
A minha querida orientadora, Fátima de Campos Buzzi, por estar
ao meu lado desde o meu trabalho de graduação, acompanhando meu
crescimento acadêmico e agora finalizando comigo este trabalho de
Doutorado. Obrigada por tudo, quero que saibas que te admiro muito!!!
Ao meu orientador de Salamanca (Espanha), Atanasio Pandiella
Alonso, e toda sua equipe por terem me acolhido e orientado com tanto
carinho no período em que estive fazendo intercâmbio. Já sinto saudades de
todos!!!
Ao meu co-orientador Rogério Corrêa, pelo convívio diário, apoio
e observações prestadas neste trabalho. Estendo o agradecimento a
professora Luisa Mota da Silva, por toda a orientação nos testes
farmacológicos, e a sua equipe, Lincon, Luisa e Camile meus sinceros
agradecimentos.
Aos meus colegas de laboratório, Ana Carolina, Anelise, Bianca,
Bruna, Camila, Camile, Daiane, Dorimar, Eduardo, Jonathan, Luciana,
Marcel, Nayara, Thairinne, e Thaís, que fizeram os meus dias muito mais
alegres.
Ao professor e coordenador do Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas, Clóvis, por permitir através do programa de pós
graduação que eu realizasse um intercâmbio de doutorado sanduiche.
Ao professor Valdir Cechinel Filho, obrigada por toda ajuda nos
trâmites para que eu conseguisse a bolsa de doutorado sanduiche. Tivesse
grande participação nessa minha trajetória.
Aos demais professores, que de alguma forma ajudaram na
realização deste trabalho, meu muito obrigada a todos!!!
Por fim, a CAPES e ao programa Ciências sem Fronteiras pelo
apoio financeiro.
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SÍNTESE DE DERIVADOS TIAZOLIDINODIÔNICOS E
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA
E EFEITO ANTITUMORAL NO CÂNCER DE MAMA
TRIPLO-NEGATIVO
Autor: Elaine Cristina Kormann
Setembro/2017
Orientador: Fátima de Campos Buzzi, Doutora.
Co-orientador: Rogério Corrêa, Doutor.
Número de Páginas: 297
Os fragmentos biologicamente ativos como o heterocíclo 2,4-tiazolidinodiona e o
grupo sulfonamida tem ganhado grande importância devido as suas diversas
atividades terapêuticas. Este trabalho teve como objetivo unir os fragmentos 2,4-
tiazolidinodiona e sulfonamida e avaliar o efeito antitumoral em células de câncer de
mama triplo negativo e a atividade gastroprotetora. Foram síntetizadas 6 séries (A-F)
de compostos, totalizando 37 derivados, sendo 28 inéditos. As séries de A a E foram
feitas em três etapas: formação do núcleo benzilidenotiazolidinodiona,
clorossufonação e substituições nucleofílicas. Já os derivados da série F, além das
três etapas mencionadas anteriormente, foi realizada uma nova substituição
nucleofílica apartir dos compostos A1, D1, D2, D3, e D4. Os compostos foram
purificados e caracterizados por ponto de fusão e métodos espectroscópicos usuais.
Os rendimentos foram satisfatórios, variando de 18% a 93,76%. A análise
computacional foi avaliada através da “regra dos 5” estabelecida por Lipinski, a fim
de avaliar a biodisponibilidade por via oral dos compostos sintetizados. Já as
propriedades relativas às características de fármaco e toxicidade foram calculadas a
partir do programa OSIRIS property Explorer. Os compostos demonstraram boa
biodisponibilidade por via oral. Além disso, todos apresentaram características de
fármacos e o teste de toxicidade mostrou que a maioria dos compostos não
apresentou nenhum risco tóxico. Os testes farmacológicos “in vitro” foram
realizados com células de câncer de mama triplo negativo (MDAMB-231). Para a
avaliação do efeito antitumoral foram realizados ensaios de citotoxicidade celular
através do método de MTT, efeito na apoptose e no ciclo celular e avaliação das
proteinas envolvidas no ciclo celular por Western Blot. O composto F1 foi o que
apresentou melhor atividade citotóxica, com valores de CI50 de 5,11μM, no peírodo
de 72h de incubação. Os demais testes foram realizados somente com o composto
F1, por ter sido o mais citotóxico. No entanto, não apresentou atividade relacionada
com a apoptose e sim retardo nas fases G1/S e G2/M do ciclo celular. Para a
atividade gastroprotetora foram realizados os testes em modelo de úlcera induzida
por etanol, quantificação de muco aderido a mucosa gástrica, quantificação dos
níveis de GSH através de ensaio bioquímico, avaliação da atividade da H+,
K+ATPase in vitro e avaliação da participação do óxido nítrico, grupo sulfidrílicos
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não proteicos, prostaglandinas e receptores PPARƴ no efeito gastroprotetor. Para
esta análise os compostos testados foram o A1, C1, D1 e F1, sendo o A1 o mais
ativo, apresentando atividade gastroprotetora na dose de 3 mg/Kg. Em suma, os
compostos F1 e A1 apresentaram os resultados mais promissores, com efeito
antitumoral e atividade gastroprotetora, respectivamente, sendo de grande relevância
a continuidade de novos estudos para estes derivados a fim de se obter futuramente
fármacos mais ativos com menos efeitos adversos.
Palavras-chave: tiazolidinodiona. gastroproteção. câncer.
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SYNTHESIS OF THIAZOLIDINEDIONIC
DERIVATIVES AND EVALUATION OF
GASTROPROTECTION ACTIVITY AND ANTITUMOR
EFFECT IN TRIPLE-NEGATIVE BREAST CÂNCER
Author: Elaine Cristina Kormann September /2017 Supervisor: Fátima de Campos Buzzi, Dra.
Co-supervisor : Rogério Corrêa, Dr.
Number of pages: 297
Biologically active fragments such as the heterocycle 2,4-thiazolidinedione and the
sulfonamide group have been increasing in importance due to their various
therapeutic activities. This study aimed to connect the 2,4-thiazolidinedione and
sulfonamide fragments, in order to evaluate antitumor effect in triple-negative breast
cancer cells and gastroprotective activity. Six series (A-F) of compounds were
synthesized, with a total of 37 compounds, of which 28 were new. Series A and E
were performed in three stages: formation of the benzylidenethiazolidinodione,
chlorossufonation and nucleophilic substitutions. In the derivatives of series F,
besides the three steps mentioned above, a new nucleophilic substitution was
performed from compounds A1, D1, D2, D3 and D4. The compounds were purified
and characterized by melting point and the usual spectroscopic methods. The yields
were satisfactory, ranging from 18% to 93.76%. The computational analysis was
evaluated using the "rule of five" established by Lipinski, in order to evaluate the
oral bioavailability of the compounds synthesized. The properties related to drug
characteristics and toxicity were calculated from the OSIRIS property Explorer
program. The compounds showed good oral bioavailability. In addition, all of them
presented drug characteristics, and the toxicity test showed that most of the
compounds did not present any toxic risk. Pharmacological tests "in vitro" were
performed with triple-negative breast cancer cells (MDAMB-231). To evaluate the
antitumor effect, cell cytotoxicity assays were performed using the MTT method,
effect on apoptosis and cell cycle and evaluation of the proteins involved in the cell
cycle by Western Blot. Compound F1 showed the best cytotoxic activity, with a IC50
value of 5.11 µM at 72h of incubation. The other tests were performed only with
compound F1, as this was the most cytotoxic one. However, it did not present
apoptosis-related activity but delayed the G1/S and G2/M phases of the cell cycle.
For the gastroprotective activity, tests were performed using the ethanol-induced
ulcer model, quantification of mucus adhered to gastric mucosa, quantification of
GSH levels by biochemical assay, evaluation of H +, K + ATPase activity “in vitro”,
and evaluation of the participation of nitric oxide, non-protein sulfhydryl groups,
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prostaglandins and PPARƴ receptors in the gastroprotective effect. The compounds
tested were A1, C1, D1 and F1, with A1 being the most active, presenting
gastroprotective activity at the dose of 3 mg/kg. In summary, compounds F1 and A1
presented the most promising results in relation to antitumor effect and gastro
protective activity. Further studies on these derivatives are needed, to obtain more
active new drugs with fewer side effects.
Keywords: thiazolidinedione. Gastroprotection. Câncer.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Estrutura dos heterocíclos: (A) tiazolidina, (B)
tiazolidinona e (C) tiazolidinodiona.................................... 39
Figura 2- Diferentes mecanismos de aquecimento: convencional e
por micro-ondas…………………………………………... 42
Figura 3- Diferentes mecanismos de aquecimento: convencional e
por micro-ondas…………………………………………... 44
Figura 4- Comportamento das células cancerosas.............................. 45
Figura 5- Receptores que caracterizam as células de câncer de
mama. Receptores de estrogênio (A), receptores de
progesterona (B) e receptores HER2 (C)............................. 50
Figura 6- Quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer de
mama................................................................................... 52
Figura 7- Fases do ciclo celular........................................................... 54
Figura 8- Principais reguladores do ciclo celular................................ 55
Figura 9- Principais “Checkpoints” responsáveis pela regulação do
ciclo celular.......................................................................... 56
Figura 10- Controle da progressão do ciclo celular da fase G1 para a
fase S……………………………………………………… 57
Figura 11- Mecanismo de ação das TZDs............................................. 61
Figura 12- Esquema geral de reação de síntese dos derivados
tiazolidinodiônicos............................................................... 63
Figura 13- Esquema geral de reação de síntese dos derivados da série
F........................................................................................... 76
Figura 14- Estrutura geral dos compostos planejados como novos
protótipos de fármacos gastroprotetores e antitumorais...... 97
Figura 15- Mecanismo de condensação da tiazolidinodiona com
benzaldeído seguido de eliminação..................................... 99
Figura 16- Mecanismo de substituição eletrofílica aromática para a
formação do cloreto de 4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-
5-lideno)metil]benzenosulfo- nila (BTZDCl)..................... 100
Figura 17- Proposta de mecanismo de substituição nucleofílica
bimolecular para a formação dos derivados
tiazolidinodiônicos............................................................... 102
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Figura 18- Espectro de IV do composto B7 (KBr, cm-1
)...................... 109
Figura 19- Espectro de RMN 1H do composto B7 (CDCl3/ 300
MHz).................................................................................... 110
Figura 20- Espectro de RMN 13
C do composto B7 (CDCl3/ 300
MHz).................................................................................... 111
Figura 21- Mecanismo de substituição nucleofílica bimolecular para
os derivados da série F......................................................... 136
Figura 22- Espectro de IV do composto F1 (KBr, cm-1
)....................... 138
Figura 23- Espectro de RMN 1H do composto F1 (CDCl3/ 300
MHz).................................................................................... 139
Figura 24- Espectro de RMN 13
C do composto F1 (CDCl3/ 300
MHz).................................................................................... 140
Figura 25- Estrutura química do composto 2-[4-[(2,4-dioxotiazolidin-
5-Ilideno)me- til]fenoxi]-N-[3-(triflurometil)fenil]aceta-
mida..................................................................................... 167
Figura 26- Estruturas dos compostos: (A) 5-[2-cloro-3-(4-nitrofenil)-
2-propenilide- no]-2-(3-hidroxifenilamino)tiazol-4(5H)-
ona e (B) 5-(4-clorobenzilideno)-2-(4-hidroxifenilamino)-
tiazol-4- (5H)-ona................................................................ 167
Figura 27- Estrutura química da (Z)-5-(4-((E)-3-oxo-3-(tiofen-2-il)-
prop-1-enil)benzilideno)-1,3-tiazolidino-2,4-diona)........... 168
Figura 28- Estruturas dos compostos: (A) 2-(2,4-dioxo-tiazolidin-5-
il)-N-(4-sulfa-moil-fenil)-acetamida, (B) 2-[5-(4-dimetil-
amino-benzilideno)-2,4-dioxo-tiazolidin-3-il]-N-(2-triflu-
orometil-fenil)-acetamida e (C) 2-[5-(4-cloro-benzili-
deno)-2,4-dioxo-imidazolin-3-il]-N-(2-trifluoro-metil-
fenil)-acetamida................................................................... 169
Figura 29- Estrutura química do composto OSU-CG5......................... 170
Figura 30- Estruturas dos compostos: (A) 2-bromo-N-{3-[(Z)-{2,4-
dioxo-3-[4-(trifluorometil)benzil]-1,3-tiazolidino-5-
ilideno}metil]fenil}prop-2-enamida, (B) 2-bromo-N-(3-
{(Z)-[3-(4-clorobenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-
ilideno]-metil}fenil)prop-2-enamida e (C) 2-bromo-N-(3-
{(Z)-[3-(4-fluorobenzil)-2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-
ilideno]metil}fenil)prop-2-enamida.................................... 170
Figura 31- Estruturas dos compostos: (5Z)-5-[(1-metil-1H-benzimi-
dazol-2-il)metilideno]-1,3-tiazolidino-2,4-diona-6,7- 171
17
dimetoxi-3,4-dihidroisoquinolona-2(1-H)-carbaldeído
(A), (5Z)-5-[(1-etil-1H-benzimidazol-2-il)metilideno]-1,3-
tiazolidino-2,4-diona-6,7-dimetoxi-3,4-dihidroiso-quino-
lona-2(1-H)-carbaldeído, (B) (5Z)-5-[(1-metil-1H-benzi-
midazol-2-il)metilideno]-1,3-tiazolidino-2,4-diona-N-[4-
(1,3-tiazolidino-4-il)fenil]formamida (C) e (5Z)-5-[(1-
metil-1H-benzimidazol-2-il)metilideno]-1,3-tiazolidino-
2,4-diona-N-(5-tert-butilfurano-2-il)formamida (D)...........
Figura 32- Efeito do composto F1 em apoptose na linhagem celular
MDAMB-231, na concentração de 10µM durante 24h
(A), 48h (B) e 72h (C), e posteriormente marcadas com
Anxina V-FITC e IP para sua analise mediante FACS....... 173
Figura 33- Efeito do composto F1 sobre o ciclo celular na linhagem
celular MDAMB-231, na concentração de 10µM durante
24h, 48h e 72h, e posteriormente marcadas com IP para
sua analise mediante FACS (A). Representação em
porcentagem das distintas fases do ciclo celular em
função do seu conteúdo de DNA após o tratamento com o
composto F1 a 10µM (B).................................................... 174
Figura 34- Princípio do método colorimétrico de BrdU....................... 175
Figura 35- Sincronização com nocodazol para analisar a transição da
fase G1/S.............................................................................. 178
Figura 36- Sincronização com timidina para analisar a transição da
fase G2/M............................................................................ 186
Figura 37- Estrutura química dos compostos A1, C1, D1 e F1………. 198
Figura 38- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto A1………… 229
Figura 39- Espectro de Infravermelho do composto A1 (KBr, cm-1
)... 230
Figura 40- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto A2………… 231
Figura 41- Espectro de Infravermelho do composto A2 (KBr, cm-1
)... 232
Figura 42- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto A3………… 233
Figura 43- Espectro de Infravermelho do composto A3 (KBr, cm-1
)... 234
Figura 44- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto A4………… 235
Figura 45- Espectro de Infravermelho do composto A4 (KBr, cm-1
)... 236
Figura 46- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto A5………… 237
18
Figura 47- Espectro de Infravermelho do composto A5 (KBr, cm-1
)... 238
Figura 48- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto B1…………. 239
Figura 49- Espectro de Infravermelho do composto B1 (KBr, cm-1
)... 240
Figura 50- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto B2…………. 241
Figura 51- Espectro de Infravermelho do composto B2 (KBr, cm-1
)... 242
Figura 52- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto B3…………. 243
Figura 53- Espectro de Infravermelho do composto B3 (KBr, cm-1
)... 244
Figura 54- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto B4…………. 245
Figura 55- Espectro de Infravermelho do composto B4 (KBr, cm-1
)... 246
Figura 56- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto B5…………. 247
Figura 57- Espectro de Infravermelho do composto B5 (KBr, cm-1
)... 248
Figura 58- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto B7…………. 249
Figura 59- Espectro de Infravermelho do composto B7 (KBr, cm-1
)... 250
Figura 60- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto B8…………. 251
Figura 61- Espectro de Infravermelho do composto B8 (KBr, cm-1
)... 252
Figura 62- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto B9………… 253
Figura 63- Espectro de Infravermelho do composto B9 (KBr, cm-1
)... 254
Figura 64- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto B10………... 255
Figura 65- Espectro de Infravermelho do composto B10
(KBr, cm-1
).......................................................................... 256
Figura 66- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto B12………. 257
Figura 67- Espectro de Infravermelho do composto B12
(KBr, cm-1
)……………………………………………….. 258
Figura 68- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto C1…………. 259
Figura 69- Espectro de Infravermelho do composto C1 (KBr, cm-1
)... 260
Figura 70- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto C2…………. 261
Figura 71- Espectro de Infravermelho do composto C2 (KBr, cm-1
)... 262
Figura 72- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto C3…………. 263
Figura 73- Espectro de Infravermelho do composto C3 (KBr, cm-1
)... 264
19
Figura 74- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto C4…………. 265
Figura 75- Espectro de Infravermelho do composto C4 (KBr, cm-1
)... 266
Figura 76- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto C5…………. 267
Figura 77- Espectro de Infravermelho do composto C5 (KBr, cm-1
)... 268
Figura 78- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto C6…………. 269
Figura 79- Espectro de Infravermelho do composto C6 (KBr, cm-1
)... 270
Figura 80- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto D2………… 271
Figura 81- Espectro de Infravermelho do composto D2 (KBr, cm-1
)... 272
Figura 82- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto D3………… 273
Figura 83- Espectro de Infravermelho do composto D3 (KBr, cm-1
)... 274
Figura 84- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto D4……….... 275
Figura 85- Espectro de Infravermelho do composto D4 (KBr, cm-1
)... 276
Figura 86- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto E1…………. 277
Figura 87- Espectro de Infravermelho do composto E1
(KBr, cm-1
)………………….............................................. 278
Figura 88- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto E2…………. 279
Figura 89- Espectro de Infravermelho do composto E2
(KBr, cm-1
)……………………………………………….. 280
Figura 90- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto E3…………. 281
Figura 91- Espectro de Infravermelho do composto E3 (KBr, cm-1
)... 282
Figura 92- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto E4…………. 283
Figura 93- Espectro de Infravermelho do composto E4
(KBr, cm-1
)…………………............................................... 284
Figura 94- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto E5…………. 285
Figura 95- Espectro de Infravermelho do composto E5
(KBr, cm-1
)……………………………….………………. 286
Figura 96- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto E6…………. 287
Figura 97- Espectro de Infravermelho do composto E6 (KBr, cm-1
)... 288
Figura 98- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto F1…………. 289
20
Figura 99- Espectro de Infravermelho do composto F1
(KBr, cm-1
)……………………………………………….. 290
Figura100- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto F2…………. 291
Figura101- Espectro de Infravermelho do composto F2 (KBr, cm-1
)… 292
Figura102- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto F3…………. 293
Figura103- Espectro de Infravermelho do composto F3 (KBr, cm-1
)… 294
Figura104- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto F4…………. 295
Figura105- Espectro de Infravermelho do composto F4 (KBr, cm-1
)… 296
Figura106- Espectros de RMN de 1H e
13C do composto F5…………. 297
Figura107- Espectro de Infravermelho do composto F5 (KBr, cm-1
)… 298
21
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Estimativas para o ano de 2016/2017 das taxas brutas de incidência por 100 mil
habitantes e de número de casos novos de
câncer, segundo sexo e localização
primária.......................................................
47
Tabela 2 - Ordem de potência para diversos parâmetros físico-químicos proposta por
Topliss......................................................... 79 Tabela 3 - Proposta de Topliss para a seleção de
novos substituintes em função dos
prováveis parâmetros mais ativos............... 80 Tabela 4 - Estrutura, tempo reacional, rendimento,
índice de refração e ponto de fusão das
substâncias BTZD, BTZDCl e da série A,
realizadas sob agitação a temperatura
ambiente...................................................... 104 Tabela 5 - Estrutura, tempo reacional, rendimento,
índice de refração e ponto de fusão da série
B contendo diferentes átomos ligados ao
anel aromático em diferentes posições,
realizado sob agitação a temperatura
ambiente...................................................... 105 Tabela 6 - Estrutura, tempo reacional, rendimento,
índice de refração e ponto de fusão da série
C contendo diferentes heterocíclos,
realizadas sob agitação a temperatura
ambiente...................................................... 107 Tabela 7 - Estrutura, tempo reacional, rendimento,
fator de retenção e ponto de fusão da série
D contendo diferentes tamanhos de
espaçadores realizadas sob agitação a
temperatura ambiente.................................. 108
Tabela 8 - Estrutura, tempo reacional, rendimento, 109
22
índice de refração e ponto de fusão da série
E contendo diferentes fenilhidrazinas
realizadas sob agitação a temperatura
ambiente......................................................
Tabela 9 - Estrutura, tempo reacional, rendimento,
índice de refração e ponto de fusão das
substâncias da série F, por irradiação em
micro-ondas................................................. 137
Tabela 10 - Parâmetros físico-químico dos derivados
da série A..................................................... 145
Tabela 11 - Parâmetros físico-químico dos derivados
da série B..................................................... 146
Tabela 12 - Parâmetros físico-químico dos derivados
da série C..................................................... 147
Tabela 13 - Parâmetros físico-químico dos derivados
da série D..................................................... 148
Tabela 14 - Parâmetros físico-químico dos derivados
da série E..................................................... 149
Tabela 15 - Parâmetros físico-químico dos derivados
da série F..................................................... 150
Tabela 16- Triagem de viabilidade celular
determinada pelo método MTT após
incubação por 72 horas com os derivados
da serie A e o composto BTZDCl............... 158
Tabela 17 - Triagem de viabilidade celular
determinada pelo método MTT após
incubação por 72 horas com os derivados
da serie B..................................................... 159
Tabela 18 - Triagem de viabilidade celular
determinada pelo método MTT após
incubação por 72 horas com os derivados
da serie C..................................................... 161
Tabela 19 - Triagem de viabilidade celular
determinada pelo método MTT após
incubação por 72 horas com os derivados
da serie D..................................................... 162
Tabela 20- Triagem de viabilidade celular 163
23
determinada pelo método MTT após
incubação por 72 horas com os derivados
da serie E.....................................................
Tabela 21 - Triagem de viabilidade celular
determinada pelo método de MTT após
incubação por 72 horas com os derivados
da série F..................................................... 164
Tabela 22 - Viabilidade celular dos compostos F1 e F3
em diferentes linhagens celulares................ 165
24
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1- Proliferação celular na fase S por BrdU....................... 175
Gráfico 2- Análise de expressão e quantificação densidométrica
da proteína Fosfohistona-H3 implicada no
mecanismo de retardo da fase G1/S induzida pelo
composto F1 na concentração de 10 µM…………….. 179
Grafico 3- Análise de expressão e quantificação densidométrica
da Ciclina B (A) e CDK1 (B) implicadas no
mecanismo de retardo da fase G1/S induzida pelo
composto F1 na concentração de 10 µM…………….. 181
Gráfico 4- Análise de expressão e quantificação densidométrica
da proteína pRbSer780
implicada no mecanismo de
retardo da fase G1/S induzida pelo composto F1 na
concentração de 10 µM................................................ 182
Gráfico 5- Análise de expressão e quantificação densidométrica
da Ciclina E (A) e do pRbSer807/811
(B) implicados no
mecanismo de retardo da fase G1/S induzido pelo
composto F1 na concentração de 10 µM...................... 183
Gráfico 6- Análise de expressão e quantificação densidométrica
da Ciclina A implicada no mecanismo de retardo da
fase G1/S induzido pelo composto F1 na
concentração de 10 µM................................................ 184
Gráfico 7- Análise de expressão e quantificação densidométrica
das proteínas p27 (A) e p53 (B) implicadas no
mecanismo de retardo da fase G1/S induzido pelo
composto F1 na concentração de 10 µM...................... 185
Gráfico 8- Análise de expressão e quantificação da Ciclina E
implicada no mecanismo de retardo da fase G2/M
induzida pelo composto F1 na concentração de 10
µM................................................................................ 187
Gráfico 9- Análise de expressão e quantificação da Ciclina A
(A) e da CDK2 (B) implicadas no mecanismo de
retardo da fase G2/M induzida pelo composto F1 na
concentração de 10 µM................................................ 188
25
Gráfico 10- Análise de expressão e quantificação da Ciclina B
(A) e da CDK1 (B) implicadas no mecanismo de
retardo da fase G2/M induzida pelo composto F1 na
concentração de 10 µM................................................ 188
Gráfico 11- Análise de expressão e quantificação da proteína Wee
1 implicada no mecanismo de retardo da fase G2/M
induzida pelo composto F1 na concentração de 10
µM…………………………………………………… 190
Gráfico 12- Efeito do tratamento com os compostos A1, C1, D1 e
F1 sobres as lesões gástricas induzidas pelo etanol..... 193
Grafico 13- Avaliação do efeito do composto A1 em modelo de
úlcera induzida por etanol............................................ 194
Grafico 14- Avaliação do efeito do composto C1 em modelo de
úlcera induzida por etanol............................................ 195
Grafico 15- Avaliação do efeito do composto D1 em modelo de
úlcera induzida por etanol............................................ 196
Grafico 16- Avaliação do efeito do composto F1 em modelo de
úlcera induzida por etanol............................................ 197
Gráfico 17- Avaliação do efeito do composto A1 (3mg/Kg) nos
níveis de muco aderido a mucosa gástrica de animais
expostos ao etanol........................................................ 199
Gráfico 18- Avaliação do efeito do composto A1 nos níveis de
GSH após indução de úlcera aguda induzida por
etanol............................................................................ 200
Gráfico 19- Avaliação do efeito do composto A1 sobre a
atividade da enzima H+K
± ATPase............................... 201
Gráfico 20- Avaliação do efeito gastroprotetor do composto A1
em animais pré-tratados com Ioimbina (10 mg/Kg,
v.IP, painel A), GW9660 (10 mg/Kg, v.IP, painel
B), NEM (10 mg/Kg, v.IP, painel C) e L-NAME (70
mg/Kg, v.IP, painel D)................................................ 202
26
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Anticorpos primários utilizados............................................ 82
Quadro 2- Anticorpos secundários utilizados........................................ 82
Quadro 3- Avaliação da toxicidade da BTZDCl e dos derivados da
série A...................................................................................
152
Quadro 4- Avaliação da toxicidade dos derivados da série B................ 154
Quadro 5- Avaliação da toxicidade dos derivados da série C................ 155
Quadro 6- Avaliação da toxicidade dos derivados da série D............... 155
Quadro 7- Avaliação da toxicidade dos derivados da série E................ 156
Quadro 8- Avaliação da toxicidade dos derivados da série F................ 156
27
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADMET: Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade
AMPK: Proteína quinase ativada por adenosina monofosfato
Ar: Aromático
ATC: Ácido tricloroacético
ATP: Trifosfato de adenosina
BrdU: 5-bromo-2-deoxiuridina
BT474: Linhagem celular de câncer de mama
BT549: Linhagem celular de câncer de mama
BTZD: ((5-Z)-5-benzilideno-1,3-tiazolidino-2,4-diona)
BTZDCl: Cloreto de 4-[(Z)-(2,4-dioxo-1,3-tiazolidino-5-
lideno)metil]benzenosul- fonila
CBX: Carbenoxolona
CCD: Cromatografia em Camada Delgada
CDKs: Quinases dependentes de ciclinas
CHK1: Quinase 1
CI50: Concentração inibitória de 50%
CMTN: Câncer de mama triplo negativo
CONCEA: Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
d: Dupleto
dd: Duplo-dupleto
DNA: Ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid)
DTIC: Dacarbazina
DTNB: 5,5‟-ditiobis-2-ácido-nitrobenzóico
DL: Drug Likeness
DMEM: Meio de cultura Eagle modificado por Dulbecco
DMF: Dimetilformamida
DMSO: Dimetilsulfóxido
DS: Drug Score
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético (ethylenediamine tetraacetic
acid)
EROS: Espécies reativas de oxigênio
Es: Parâmetro estéreo
Et: Etano
FACS: Separador celular ativado por fluorescência.
28
GHz: Gigahertz
GSH: Glutationa reduzida
GSSG: Glutationa na sua forma oxidada
GURAV: Linhagem celular de câncer na cavidade oral
HER2: Fator de crescimento epidérmico
HPV: Virus do papiloma humano (Human papilomavirus)
Hz: Hertz
INCA: Instituto Nacional do Câncer
IP: Via intraperitoneal
IV: Infra Vermelho
J: Constante de acoplamento
K562: Linhagem celular de células leucêmicas
KB: Linhagem celular de células nasofaríngeas
L-Name: NG-Nitro-L-argininametilesterhidroclorida
LogP: Logaritmo do coeficiente de partição
LogS: Logarítmo de solubilidade aquosa
m: Multipleto
MCF7: Linhagens celulares de câncer de mama
MDAMB-231: Linhagens celulares de câncer de mama triplo negativo
MHz: Megahertz
MM: Massa Molar
MTT: brometo de 3-[4,5-dimetiazol-2-il]2,5-difeniltetrazólio
nAT: Número de átomos
NEM: N-etillmaleimida
NHA: Número de aceptores de ligação hidrogênio
NHD: Número de doadores de ligação hidrogênio
nm: Nanometro
nR: Número de ligações rotacionais
OMS: Organização Mundial da Saúde
PBS: Tampão fosfato salino (phosphate buffered saline)
PC3: Linhagem celular de câncer de próstata
PF: Ponto de fusão
PF. R: Ponto de fusão do composto recristalizado
PI: Iodeto de propídio
Pi: Fósforo inorgânico
PPARs: Receptores ativados do peroxisomo proliferador (peroxisome
proliferator-activated receptors)
29
PS: Fosfatildiserina
QV: Química verde
Rb: Retinoblastoma
RE: Receptores hormonais de estrogênio
REND. R: Rendimento do composto recristalizado
Rf: Fator de retenção
RNA: Ácido ribonucleico (ribonucleic acid)
RNAm: Ácido ribonucleico mensageiro
RP: Receptores de progesterona
s: Simpleto
SFB: Soro fetal bovino
SKBr3: Linhagem celular de cancer de mama
t: Tripleto
TPSA: Área de superfície polar topográfica
TRH: Terapia de reposição hormonal
TZD: 2,4-Tiazolidinodiona
UV: Ultravioleta
VHB: Vírus da hepatite B
VIOL.: Violações
VOL: Volume
W: Watz
: Estiramento
σ: Constante sigma referente aos parâmetros eletrônicos
π: Constante pi referente aos parâmetros hidrofóbicos
α: Alfa
ƴ: Gama
Δ: Delta
30
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO……………………………………………………..... 33 2. OBJETIVOS………………………………………………………….. 36 2.1 Objetivo geral……………………………………………………....... 36 2.2 Objetivos específicos…………………………………………………....... 36 3. REVISÃO DA LITERATURA……………………………………… 38 3.1 QUÍMICA...................................................................................... ...... 38 3.1.1 QUÍMICA MEDICINAL.................................................................. 38 3.1.2 O USO DO MICRO-ONDAS NA QUÍMICA VERDE………….... 41
3.2 CÂNCER............................................................................................. 44
3.2.1 CÂNCER DE MAMA……………………………………………... 48
3.2.2 CICLO CELULAR………………………………………………… 52
3.3 ÚLCERA GÁSTRICA……………………………………………... 58
3.4 TIAZOLIDINODIONAS E SEU MECANISMO DE AÇAO……. 59
4 MATERIAL E MÉTODOS………………………………………...... 62
4.1 QUÍMICA............................................................................................ 62
4.1.1 Rota sintética dos derivados tiazolidinodiônicos……………........... 62
4.1.2 Susbtituição nucleofílica com aminas aromáticas contendo os
substituintes propostos por Topliss............................................................. 64
4.1.3 Susbtituição nucleofílica com diferentes aminas aromáticas…….... 66
4.1.4 Susbtituição nucleofílica com diferentes aminas contendo
heterocíclos…………………………….....................................................
70
4.1.5 Susbtituição nucleofílica com diferentes aminas alifáticas............... 72
4.1.6 Susbtituição nucleofílica com diferentes fenil hidrazinas................. 74
4.1.7 Substituição nucleofílica com cloreto de benzila sobre o núcleo
TZD............................................................................................................. 76
4.1.8 Purificação e caracterização estrutural…………………………….. 78
4.1.9 Análise “In silico”: Cálculos teóricos computacionais...................... 79
4.1.10 Relação Estrutura-Atividade - Método de Topliss……………...... 79
4.2 ATIVIDADE BIOLÓGICA“IN VITRO”......................................... 81
4.2.1 Reagentes e materiais………………………………………………. 81
4.2.2 Anticorpos………………………………………………………….. 81
4.2.3 Cultivo celular.................................................................................... 82
31
4.2.4 Preservação das linhagens celulares.................................................. 83
4.2.5 Amostras…………………………………………………………… 83
4.2.6 Ensaio da viabilidade celular………………………………………. 83
4.2.7 Análise da apoptose........................................................................... 84
4.2.8 Análise de proliferação de células através do método de BrdU........ 85
4.2.9 Análise do ciclo celular...................................................................... 86
4.2.10 Preparação de extratos celulares (extratos proteicos)…………….. 87
4.2.11 Eletroforese e Western Blot............................................................. 88
4.2.12 Sincronização com Nocodazol para a avaliação da fase G1/S....... 88
4.2.13 Sincronização com Timidina para a avaliação da fase G2/M.......... 90
4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA............ 90
4.3.1 Animais.............................................................................................. 91
4.3.2 Modelo de úlcera induzida por Etanol............................................... 91
4.3.3 Quantificação de muco aderido na mucosa gástrica.......................... 92
4.3.4 Preparação da fração subcelular gástrica........................................... 92
4.3.5 Quantificação dos níveis de glutationa reduzida (GSH).................... 93
4.3.6 Avaliação da atividadeda H+, K
+ ATPase in vitro............................. 93
4.3.7 Avaliação da participação do óxido nítrico, grupo sulfidrilicos não
proteicos, prostaglandinas e receptores PPAR-gamma no efeito
gastroprotetor.............................................................................................. 95
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA................................................................. 95
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................... 97
5.1 QUÍMICA............................................................................................ 97
5.1.1 Análise computacional……………………………………………... 145
5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL....................... 158
5.2.1 Avaliação da Viabilidade Celular – MTT…….................................. 158
5.2.2 Efeito na apoptose e no ciclo celular……………............................. 173
5.2.3 Avaliação da proliferação celular por pelo método de BrdU…….... 176
5.2.4 Sincronicação com nocodazol para avaliar o efeito do composto F1
na transição da fase G1/S……………………………………………….... 178
5.2.5 Sincronicação com timidina para avaliar o efeito do composto F1
na transição da fase G2/M……………………………………….............. 186
5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA............ 192
5.3.1 Efeito gastroprotetor dos compostos A1, C1, D1 e F1 em modelo
de úlcera induzida por etanol...................................................................... 192
6. CONCLUSÕES..................................................................................... 206
7. REFERÊNCIAS.................................................................................... 199
32
APÊNDICE I............................................................................................. 218
APÊNDICE II........................................................................................... 220
33
1 INTRODUÇÃO
Em vista da necessidade de novos medicamentos que sejam mais
ativos e com menos efeitos adversos para as diversas doenças, um dos
principais objetivos da química orgânica e medicinal é o desenvolvimento,
síntese e produção de moléculas com atividades terapêuticas, destacando-se
os heterocíclos tiazolidina, 4-tiazolidinona e a 2,4-tiazolidinodiona (TZD)
(MALIK; UPADHYAYA; MIGLANI, 2011). Quimicamente, o núcleo
TZD possui dois grupos carbonilas nas posições 2 e 4, além de um
nitrogênio, um enxofre e um grupo metileno, podendo ser estruturamente
modificado para o desenvolvimento de diversos análogos (CHADHA et al.,
2015).
Várias pesquisas revelam que a TZD é um importante sistema de
anel heterocíclico terapeuticamente utilizado como antidiabético,
antiinflamatório, antioxidante, antimicrobiano, anticonvulsivante,
antitumoral e gastroprotetor (ASATI; MAHAPATRA; BHARTI, 2014).
Além das TZDs, estruturas sulfonamídicas também têm demonstrado amplo
espectro de atividades biológicas, não estando somente relacionada a
atividade antimicrobiana, mas também como a atividade oncostática e
gastrica (MACHADO et al., 2011).
Câncer é o nome dado a um conjunto de doenças que têm em
comum o crescimento desordenado de células, que invadem tecidos e
órgãos (INCA, 2017), tornando-se um desafio neste presente cenário e
levando a morbidade e mortalidade em todo o mundo (POLKAM et al.,
2016), sendo o câncer de mama o mais frequente entre as mulheres
(ZHANG et al., 2016).
Ao longo dos últimos anos a taxa de sobrevivência do câncer de
mama em países desenvolvidos tem melhorado em pelo menos 30%, devido
à detecção precoce e melhores tratamentos (ZDENKOWSKI et al., 2016).
Já as úlceras gástricas constituem um dos principais transtornos
gástricos atraindo atenção global em cuidados de saúde. Cerca de 4 milhões
de pessoas são afetadas pela úlcera gástrica em todo o mundo. Além disso,
cerca de 10% a 20% desenvolvem complicações sérias devido a essa doença
(STEVEN et al., 2016).
34
Devido a isto, este trabalho propôs desenhar e sintetizar novas
moléculas a partir do núcleo TZD e da sulfonamida, unindo fragmentos
biologicamente ativos, na busca de substâncias com potencial atividade
gastroprotetora e antitumoral.
35
36
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Sintetizar derivados tiazolidinodiônicos e avaliar indícios de
relação estrutura-atividade e efeitos gastroprotetor e antitumoral no câncer
de mama triplo-negativo.
2.2 Objetivos Específicos:
Sintetizar diferentes séries de moléculas contendo o núcleo TZD;
Avaliar a biodisponibilidade por via oral e a permeabilidade dos
compostos sintetizados de acordo com os parâmetros estipulados na regra
dos 5 de Lipinski “in silico”;
Avaliar as possíveis características á fármacos e os efeitos de
toxicidade dos compostos “in silico”;
Avaliar a citotoxicidade dos compostos sintetizados em células de
câncer de mama triplo negativo (MDAMB-231).
Avaliar o efeito do composto mais ativo na apoptose e no ciclo
celular através de citometria de fluxo;
Avaliar a expressão de proteínas envolvidas nas fases do ciclo
celular; Avaliar o potencial gastroprotetor dos compostos no modelo de
úlcera induzida por etanol e quantificar os níveis de GSH e muco aderido à
mucosa gástrica;
Avaliar o efeito in vitro de alguns compostos sintetizados na
atividade da enzima H+, K
+- ATPase.
37
38
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 QUÍMICA
3.1.1 QUÍMICA MEDICINAL
A química medicinal engloba a invenção, descoberta,
planejamento, identificação e preparação de substâncias biologicamente
ativas (CAMPOS-BUZZI; CECHINEL-FILHO; CORRÊA, 2010),
centrando-se nas propriedades moleculares físico-químicas para o
desenvolvimento de fármacos com características mais favoráveis, como
por exemplo a área topológica superficial polar (TPSA), massa molécular e
LogP (MUNSON et al., 2015).
Neste contexto, os heterocíclos ocupam uma posição central na
química medicinal por estarem envolvidos no desenvolvimento de novas
moleculas farmacologicamente ativas para a indústria farmacêutica
(SHAMSUZZAMAN, 2015), através de modificações estruturais
(SHAIKH; HONG, 2016), principalmente os que contém átomos de
oxigênio e nitrogênio (DONGAMANTI et al., 2015).
Para a síntese de heterociclos as reações de Knoevenagel e de
Perkin são as mais conhecidas e utilizadas. A reação de Knoevenagel é uma
condensação, realizada através de ligações carbono-carbono, sendo muito
utilizada entre carbonilas, aldeídos, cetonas e compostos metileno ativo, na
presença de diferentes catalizadores como os ácidos de Lewis, tais como
piperidina (CASILDA et al., 2016). Já a reação de Perkin é uma
condensação catalisada por base de um aldeído aromático com um anidrido
de ácido carboxílico, formando um ácido carboxílico α,β- insaturado
(MAYO; PIKE; FORBES, 2010).
Segundo Shamsuzzaman (2015), os heterociclos estão prevalentes
em 60% dos principais fármacos de varejo, os quais apresentam pelo menos
um núcleo heterocíclico como parte da topografia global do composto.
Além disso, compostos que contém porções heterocíclicas frequentemente
39
apresentam melhor solubilidade e podem facilitar a produção na sua forma
de sal, propriedades conhecidas por serem importantes para a absorção oral
e biodisponibilidade (SHAMSUZZAMAN, 2015).
Entre estes heterocíclos incluem a tiazolidina (A), que apresenta
um anel de cinco membros, contendo dois heteroátomos, um átomo de
enxofre e um átomo de nitrogênio nas posições 1 e 3 do anel. Na presença
de uma carbonila na posição 4 do anel tem-se a 4-tiazolidinona (B) e na
presença de duas carbonilas na posição 2 e 4 a 2,4-tiazolidinodiona (TZD)
(C) (Figura 1) (MALIK; UPADHYAYA; MIGLANI, 2011).
Figura 1 - Estrutura dos heterocíclos: (A) tiazolidina, (B) tiazolidinona e (C)
tiazolidinodiona.
5
4
S1
NH3
2
5
4
S1
NH3
2
O
2
S1
NH35
4
O
O
(A) (B) (C)
A TZD é um fragmento muito importante devido a muitos
fármacos conterem na sua estrutura este núcleo, apresentando diversas
atividades farmacológicas tais como cardiotônica, anticonvulsivante,
neuroprotetora, gastroprotetora, antifúngica, anti-hipertensiva (SWATHI et
al., 2013), antiviral, antiproliferativa, antiinflamatória (SWATHI et al.,
2013; SHARMA et al., 2015), hipoglicêmica, antibacteriana, antiarrítmica e
antitumoral (CHADHA et al., 2015).
Para a síntese orgânica a TZD é considerada um bom substrato
para reações de Knoevenagel (SWATHI et al., 2013). Além disso, a
introdução de fragmentos biologicamente ativos neste núcleo, tal como as
sulfonamidas, que têm demonstrado além da atividade antibacteriana
também atividade antitumoral e gastroprotetora (LAL et al., 2013), torna de
grande interesse as sínteses de novas moléculas.
40
Como estratégia para o direcionamento da síntese de novas
moléculas utiliza-se o método manual de Topliss, o qual é fundamentado
para a obtenção de 5 derivados contendo os seguintes substituintes: H, 4-Cl,
3,4-Cl2, 4-CH3, 4-OCH3, escolhidos devido à acessível obtenção sintética e
utilizados como ponto de partida. Em seguida avalia-se a ordem de potência
destes substituintes em relação aos parâmetros π (hidrofóbicos), Es
(estéreos) e σ (eletrônicos) (CAMPOS-BUZZI; CECHINEL-FILHO;
CORRÊA, 2010). A partir da análise do comportamento destes compostos
pode-se propor novos substituintes a fim de otimizar a atividade biológica
dos compostos em estudo (YUNES et al., 2002).
No entanto, nem todos os compostos sintetizados apresentam
características a futuros fármacos. Devido a isto, estratégias de screening
pré-clínicos, como por exemplo, ADMET (absorção, distribuição,
metabolismo, excreção e toxicidade) são consideradas uma importante
ferramenta para a identificação precoce de moléculas candidatas a futuros
fármacos no processo de desenvolvimento de medicamentos (BASANT;
GUPTA; SINGH., 2016).
Uma das características físico-químicas mais importantes a serem
avaliadas no desenvolvimento de novos fármacos é a lipofilia, por que
permite prever a permeabilidade e biodisponibilidade do fármaco no meio
aquoso extracelular ou nos tecidos celulares (NOGUEIRA et al, 2008).
Neste contexto, a “regra dos 5” de Lipinski atua como um filtro,
pois é utilizada para avaliar as propriedades moleculares, a fim de obter
compostos que sejam potentes e ativos por via oral. Neste caso a Massa
Molecular (MM) (não deve exceder a 500 g/mol), LogP (valor limite é 5),
grupos doadores de hidrogênio (valor limite é 5) e grupos aceptores de
hidrogênio (valor limite é 10) (POLKAM et al., 2016).
Além da “regra dos 5” de Lipinski, calcula-se a porcentagem de
absorção das moléculas, sendo analisados também outros parâmetros
moleculares como a solubilidade, Drug likeness, Drug score e toxicidade
para avaliar a biodisponibilidade das moléculas candidatas a fármacos.
Estes parâmetros são calculados através de software específicos
(Molinspiration e OSIRIS) (HASSAN et al., 2015).
41
3.1.2 O USO DO MICRO-ONDAS NA QUÍMICA VERDE
A química tem uma grande participação em inúmeros produtos
fundamentais à humanidade. A sua presença pode ser destacada desde
diversos combustíveis aos mais complexos medicamentos. Porém, a
produção química também gera inúmeros inconvenientes, como a formação
de subprodutos tóxicos e a contaminação do ambiente e do próprio homem
exposto a estes xenobióticos (PRADO, 2003).
Com a crescente conscientização das questões ambientais a
necessidade de reduzir o uso de substâncias químicas nocivas aos produtos
químicos vem aumentando, considerando seus efeitos e consequentemente o
risco para a saúde humana. Devido a isto, nos últimos anos a química verde
(QV) têm sido uma fascinante área de pesquisa química (KHANDELWAL;
TAILOR; KUMAR, 2016).
A escolha de solventes, reagentes e catalisadores são necessários
para o âmbito econômico, para uma química mais verde e para um ambiente
sustentável, reduzindo os resíduos químicos nocivos á saúde humana e ao
meio ambiente (RATHI et al., 2015).
Segundo Khandelwal e colaboradores (2016), a QV tem como
objetivo conceber ambientalmente processos químicos benignos e
metodologias sintéticas visando à eliminação ou redução de produtos
químicos perigosos e tóxicos em qualquer fase da produção industrial ou
laboratorial.
Em 1998 foram formulados os 12 principios da QV, a fim de
atender as necessidades da química sintética sendo eles: prevenção,
economia de átomos, síntese de compostos de menor toxicidade,
desenvolvimento de compostos seguros, diminuição de solventes e
auxiliares, eficiência energética, uso de substâncias recicladas, redução de
derivativos, catálise, desenvolvimento de compostos para degradação,
análise em tempo real para a prevenção da poluição e química segura para a
prevenção de acidentes (GALUSZKA; MIGASZEWSKI; NAMIESNIK,
2013).
Segundo Silva e colaboradores (2005), uma área importante da QV
está na investigação do meio reacional. Um dos principais problemas da
indústria química está relacionado com a utilização de solventes orgânicos
42
(voláteis ou não) em seus processos, já que, dependendo do solvente
utilizado, sua manufatura, transporte, estoque, manuseio e descarte
representam aspectos que demandam cuidados e custos.
A química orgânica assistida por micro-ondas tem sido bem
reconhecida como uma das ferramentas mais eficazes e sustentáveis na
síntese de compostos químicos e tem atraído muita atenção devido as suas
características específicas, como regulação da temperatura, homogeneidade
da reação, e possível modificação de seus parâmetros como potência e
tempo (RATHI et al., 2015).
As micro-ondas são ondas eletromagnéticas não ionizantes, com
frequências que se encontram entre 300 MHz e 30 GHz, as quais
correspondem a comprimentos de onda de 1mm a 1m. A região de micro-
ondas situa-se entre a região de infra-vermelho (IV) e ondas de rádio no
espectro eletromagnético conforme ilustrado na Figura 2 (BRAGA;
SIMÕES; GAMA, 2012).
Figura 2 - Localização da região de micro-ondas no espectro eletromagnético.
Fonte: Eletromagnetismo. Disponível em: http://imanesmedea.weebly.com/a-
teoria.html
http://imanesmedea.weebly.com/a-teoria.htmlhttp://imanesmedea.weebly.com/a-teoria.html
43
A tecnologia de irradiação por micro-ondas começou a ser
desenvolvida na década de 40, possuindo um campo de aplicação bastante
restrito, sendo utilizada principalmente na indústria de alimentos e
polímeros. A sua utilização como ferramenta pelos químicos orgânicos só
aconteceu em meados da década de 80, sendo utilizado o micro-ondas
doméstico. Já no meio da década de 90, a entrada no mercado de aparelhos
de micro-ondas desenvolvidos especificamente para a síntese orgânica
permitiu ao químico orgânico sintético controle de todos os parâmetros
reacionais (temperatura, pressão, potência) e com isso, maior
reprodutibilidade e segurança nos experimentos realizados (SOUZA;
MIRANDA, 2011).
Entre uma variedade de abordagens, a utilização deste método tem
sido amplamente analisada ao longo de muitos anos, e agora está
posicionada como uma das mais poderosas ferramentas na área da síntese
orgânica. Na última década seu uso atraiu muita atenção devido ao baixo
custo e simplicidade de reação. Além disso, o rendimento dos compostos
produzidos é mais elevado, ao mesmo tempo o solvente utilizado
desempenha um papel importante na reação, podendo muitas vezes estar
ausente (VIJILA et al., 2016).
Segundo Rathi e colaboradores (2015), as sínteses por micro-ondas
não são somente aplicadas para a criação ou transformação de uma
molécula simples, mas também é relevante para o desenvolvimento de
moléculas bioativas desejadas e cada vez mais se torna uma ferramenta
fundamental de escolha para a otimização de passos chaves na síntese de
compostos para a descoberta de novos medicamentos.
As sínteses realizadas através de aquecimento por micro-ondas
apresentam maior vantagem devido as micro-ondas atuarem diretamente em
moléculas dipolos ou iônicas presentes na mistura reacional, ocorrendo
transferência de energia em menos de um nanosegundo (10-9
S), culminando
em rápida ascenção da temperatura. Em contraste, os reagentes utilizados
nas reações por aquecimento convencional são ativados lentamente por
condução, o que explica o método ser relativamente lento e ineficiente para
a transferência de energia para o sistema de reação (Figura 3). Além disso,
os tempos de reação através de aquecimento por micro-ondas são mais
curtos, os produtos formados são mais puros e apresentam maiores
rendimentos (RATHI et al., 2015).
44
Figura 3 - Diferentes mecanismos de aquecimento: convencional e por micro-
ondas.
Fonte: RATHI et al., 2015.
Devido os heterocíclos possuírem grande destaque na área de
química medicinal, o conhecimento de metodologias de síntese para a
obtenção destes compostos é de grande interesse e a irradiação por micro-
ondas é uma ferramenta que tem crescente destaque neste campo
(DUARTE; SANGI; CORRÊA, 2010). Além disso, o uso da irradiação por
micro-ondas permite sínteses mais rápidas e eficientes de compostos
heterocíclos. Nesse contexto, várias abordagens sintéticas já conhecidas
para heterocíclos contendo enxofre, oxigênio e nitrogênio vêm sendo
desenvolvidas (RATHI et al., 2015).
3.2 CÂNCER
A palavra câncer é de origem latina, significando “caranguejo”,
empregada em analogia ao modo de crescimento infiltrante comparado as
pernas do crustáceo, que as introduz na areia ou lama para fixar e dificultar
sua remoção. Infelizmente, espera-se que para as próximas duas décadas
mais de 8 milhões de casos de câncer sejam diagnosticados (OATLEY;
FRY; MULLEN, 2016).
45
Os tumores são diferenciados em sólidos e não sólidos. As células
neoplásicas sólidas multiplicam-se de maneira descontrolada, possuem a
capacidade de formar novos vasos sanguíneos que as nutrirão e são
geralmente menos especializadas, fazendo com que os órgãos invadidos por
elas percam suas funções. Porém, nem todos os tumores geram metástase,
sendo os metastáticos originados por células tumorais que invadem tecidos
vizinhos, podendo chegar ao interior de um vaso sanguíneo ou linfático e
através desses disseminarem-se, chegando a órgãos distantes do local onde
o tumor iniciou. Já as células neoplásicas não sólidas dão origem aos
cânceres de sangue, também conhecidos como hematopoiéticos, ou
chamados de leucemia (Figura 4) (INCA, 2017).
A leucemia se caracteriza pela produção anormal dos leucócitos
que ocorre na medula óssea, representando um grupo heterogêneo de
células malignas, sendo classificadas em mielóide ou linfóide, dependendo
de quais leucócitos foram afetados (RABATI et al., 2017).
Figura 4: Comportamento das células cancerosas.
Fonte: INCA. Como se comportam as células cancerosas. Disponível em:
http://www1.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=318
http://www1.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=318
46
A metástase é vista como uma cascata sequencial de eventos,
partindo de um tumor primário e levando a formação de novos tumores em
locais distintos. (BOUYSSOU et al., 2014). Para que ocorra metástase e
invasão as células tumorais requerem alteração da sua capacidade de adesão
para aderirem às células vizinhas e a matriz extracelular (LUO, GUAN,
2010).
Geralmente, considera-se que a disseminação metastática ocorra
tardiamente durante a progressão do tumor, no momento em que o tumor
primário já se encontra em um tamanho considerável, de fato, para a
maioria dos tipos de câncer o volume do tumor primário representa um fator
de risco para a progressão de uma metástase: quanto maior for o volume,
maior é o risco (LORUSSO; RUEGG, 2012). Segundo Steichen e
colaboradores (2012), durante as fases iniciais do crescimento do tumor as
células dependem unicamente da difusão para obter nutrientes, limitando
seu tamanho em aproximadamente 2 mm3.
No Brasil, as estimativas para o ano de 2016/2017 apontam para a
ocorrência de aproximadamente 596.070 casos novos de câncer, incluindo
os casos de pele não melanoma, reforçando a magnitude do problema do
câncer no país (Tabela 1). É esperado um total de 295.200 casos novos para
o sexo masculino e 300.870 para o sexo feminino (INCA, 2017).
47
Tabela 1 - Estimativas para o ano de 2016/2017 das taxas brutas de incidência por
100 mil habitantes e de número de casos novos de câncer, segundo sexo e
localização primária.
Homens Mulheres
Localização Primária Casos
novos
Localização Primária Casos
novos
Próstata 61.200 Mama feminina 7.960
Traqueia,pulmão,brônquio
Cólon e Reto
Estômago
17.330
16.660
12.920
Cólon e Reto
Colo de Útero
Traqueia,pulmão,brônquio
17.620
16.340
10.890
Cavidade oral
Esôfago
Bexiga
Laringe
11.140
7.950
7.200
6.360
Estômago
Corpo do útero
Ovário
Glândula Tireoide
7.600
6.950
6.150
5.870
Leucemias
SNC
Linfoma não Hodgkin
Pele melanoma
Linfoma de Hodgkin
Glândula Tireoide
Neoplasias sem pele
Todas as neoplasias
5.540
5.440
5.210
3.000
1.460
1.90
214.350
295.200
Linfoma não Hodgkin
SNC
Leucemias
Cavidade oral
Esôfago
Pele melanoma
Bexiga
Linfoma de Hodgkin
Laringe
Neoplasias sem pele
Todas as neoplasia
5.030
4.830
4.530
4.350
2.860
2.670
2.470
1.010
990
205.960
300.870
Fonte: INCA. 27 de Novembro – Dia Nacional do Combate ao Câncer. Estimativas
2016/2017. Disponível em: http://www.inca.gov.br/wcm/dncc/2015/por-sexo.asp
De acordo com estimativas da Organização Mundial da Saúde
(OMS), 8,2 milhões de mortes por câncer foram registradas em 2012 e esse
número deverá aumentar para 13,1 milhões até 2030 (POLKAM et al.,
2016).
O desenvolvimento do câncer está relacionado a causas externas
e/ou internas ao organismo, estando ambas inter-relacionadas. As causas
internas são, na maioria das vezes, geneticamente pré-determinadas, estão
ligadas à capacidade do organismo se defender das agressões externas. As
http://www.inca.gov.br/wcm/dncc/2015/por-sexo.asp
48
causas externas referem-se ao meio ambiente e aos hábitos ou costumes
próprios de um ambiente social e cultural. Estes fatores causais podem
interagir de várias formas, aumentando a probabilidade de transformações
malignas nas células normais. De todos os casos, 80% a 90% dos cânceres
estão associados a fatores ambientais, que são tabagismo, hábitos
alimentares, alcoolismo, hábitos sexuais (HPV), medicamentos, fatores
ocupacionais e radiação solar (INCA, 2017).
Cerca de 1/3 das mortes por câncer são devido aos cinco principais
riscos comportamentais e alimentares, que são: índice de massa corporal
elevado; baixo consumo de frutas, legumes e verduras; falta de atividade
física; tabagismo e uso de álcool, sendo que o tabagismo é o fator de risco
mais importante, causando 20% das mortes por câncer e 70% das mortes
por câncer de pulmão no mundo. Além disso, em muitos países de baixa
renda, até 20% das mortes por câncer são devido á infecção pelo vírus da
hepatite B (VHB) e HPV (WHO, 2017).
Para a prevenção do câncer deve-se evitar contato com os fatores
de riscos, vacinar-se contra o HPV e VHB, controlar os riscos ocupacionais,
reduzir a exposição à luz solar e reduzir a exposição á radiação ionizante
(WHO, 2017).
As principais formas de tratamento do câncer são cirurgia,
radioterapia, quimioterapia ou transplante de medula óssea. Em muitos
casos é necessário combinar mais do que uma terapêutica (INCA, 2017).
Segundo Polkam e colaboradores (2016), existem quimioterápicos
que não são eficazes contra o câncer devido à resistência desenvolvida para
eles, existindo a necessidade de identificação e geração de novos agentes
para vencer os obstáculos no seu tratamento.
3.2.1 CÂNCER DE MAMA
O câncer de mama é o diagnóstico mais comum entre os tipos de
câncer na mulher e a principal causa de morte por câncer em mulheres em
todo o mundo (FABRY, LOMBAERT, LISON, 2016). Antes dos 35 anos é
49
considerado relativamente raro, porém acima desta idade sua incidência
cresce progressivamente, especialmente após os 50 anos (INCA, 2017).
Segundo Puglisi e colaboradores (2015), a OMS revelou que mais
de 508 mil mulheres morreram de câncer de mama no ano de 2011. Cerca
de 5% - 10% apresentam câncer de mama metastático (CMM) no momento
do diagnóstico, enquanto que 20% – 40% com câncer de mama vão
desenvolver CMM, sendo este uma doença incurável com uma sobrevida
média de 2 a 3 anos.
Os fatores de risco para a doença são exposição a estrogênio, idade
precoce para inicio do ciclo menstrual, idade tardia na primeira gravidez,
curto período de amamentação, menopausa tardia, uso de terapia de
reposição hormonal, IMC (Indice de massa corporal) elevado, baixa
atividade física e histórico familiar de câncer de mama. O consumo de
álcool e exposição á radiação estão também entre os fatores relatados
(FABRY, LOMBAERT, LISON, 2016).
Segundo o Instituto Nacional do Câncer (2017), a prevenção do
câncer de mama não é totalmente possível em função da multiplicidade de
fatores relacionados ao surgimento da doença e ao fato de vários deles não
serem modificáveis. Estima-se que por meio da alimentação, nutrição e
atividade física é possível reduzir em até 28% o risco de a mulher
desenvolver câncer de mama. Controlar o peso corporal e evitar a
obesidade, por meio da alimentação saudável e da prática regular de
exercícios físicos, e evitar o consumo de bebidas alcoólicas são
recomendações básicas para prevenir o câncer de mama. A amamentação
também é considerada um fator protetor. Além disso, a terapia de reposição
hormonal (TRH), quando estritamente indicada, deve ser feita sob rigoroso
controle médico e pelo mínimo de tempo necessário.
O câncer de mama é classificado de acordo com sua expressão de
receptores de estrogênio, progesterona e fator de crescimento epidérmico
(HER2) (Figura 5) (ZORDOKY et al., 2014), sendo que os agentes
quimioterápicos utilizados vem sendo desenvolvidos com base nas
características moleculares do tumor (PARK et al., 2016).
50
Figura 5: Receptores que caracterizam as células de câncer de mama. Receptores de
estrogênio (A), receptores de progesterona (B) e receptores HER2 (C).
Fonte: Para as figuras 5A e 5B adaptado em:
http://portaldocorticoide.blogspot.com.br/2010 /12/estrogenios.html. Para a figura
5C adaptado de LEITÃO, 2012.
Os receptores hormonais de estrogênio (RE) estão presentes em
aproximadamente 75% dos cânceres de mama. A presença destes receptores
torna-se um fator muito importante para o prognóstico (FRASOR et al.,
2015). Tumores RE-positivo tendem a ter melhor prognóstico (CHEN et al.,
2015), além disso, são dependentes de hormônio e propensos a responder a
terapias hormonais com inibidores da aromatase e tamoxifeno (FRASOR et
al., 2015), reduzindo a taxa de mortalidade em pacientes com RE-positivo
em mais de 30% (HAN, 2014).
A expressão de receptores de progesterona (RP) esta associada
com a expressão de RE, estando presentes em mais da metade dos tumores
RE-positivos. Tumores que apresentam RE e RP possuem parâmetros
patológico, prognóstico e resposta aos tratamentos hormonais mais
favoráveis. Além disso, pacientes com RE-positivo que possuem alto nível
de RP e que são tratados com tamoxifeno tendem a ter um resultado melhor
que os pacientes que possuem baixa expressão de RP. No entanto, pacientes
RE-positivo com RP-negativo ou com baixa expessão de RP estão mais
propensos a tumores agressivos e com taxas de proliferação mais altas,
resultando em pior prognóstico. O prognóstico de câncer de mama que
apresenta apenas RP não é bem claro (HAN, 2014).
O HER2 é um receptor de tirosina kinase transmembrana e um
alvo terapêutico bem estabelecido no câncer de mama (PARK et al., 2016).
Está envolvido em muitos efeitos oncogênicos como aumento da
http://portaldocorticoide.blogspot.com.br/2010%20/12/estrogenios.html
51
proliferação celular, redução da apoptose, aumento da motilidade da célula
tumoral e propensão para a disseminação metastática (ZARDAVAS,
FOUAD, PICCART., 2015). É sobre expresso em aproximadamente 20% a
25% dos tumores de câncer de mama, estando relacionado com o aumento
da agressividade do tumor e menor sobrevida dos pacientes em relação aos
pacientes com HER2 negativo (WAN et al., 2015).
Já o câncer de mama triplo negativo (CMTN) é definido como um
nível imunohistoquímico por não apresentar receptores hormonais (RE e
RP) e fator de crescimento epidérmico (HER2), e representa 15% dos casos
de câncer de mama (MONTERO et al., 2014).
Histologicamente, mais de 70% dos tumores triplonegativos
apresentam-se com grau elevado na sua fase inicial, não podendo ser
tratados com terapias anti-HER2 ou hormonais. Por conta do mau
prognóstico e falta de opções no tratamento o CMTN apresenta alta taxa de
mortalidade (CHANG et al., 2016). Além disso, é mais susseptivel a
metástase, o que torna seu prognóstico pior (ZORDOKY et al., 2014),
sendo que menos de 30% dos pacientes com metástase sobrevivem até 5
anos (CHANG et al., 2016).
As terapias utilizadas são baseadas em quimioterápicos como as
classes dos taxanos, vinerolbina e platina, eficazes neste tipo de tumor
devido a sua taxa de proliferação rápida e distúrbios frequentes no
mecanismo de reparação do DNA (Figura 6). Infelizmente, na fase inicial
do tratamento as resistências aos quimioterápicos são frequentes, sendo
estas, vistas no contexto metastático (MONTERO et al., 2014).
52
Figura 6 - Quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer de mama.
Apesar dos avanços globais nas áreas da biologia e oncologia, o
tratamento do CMTN tem permanecido um desafio, e o prognóstico para
pacientes com metástase é ruim, o que justifica as pesquisas com
substâncias farmacologicamente ativas (CHANG et al., 2016), tais como os
derivados tiazolidinodiônicos, com potencial atividade antitumoral.
3.2.2 CICLO CELULAR
O clico celular é dividido em duas fases distintas, chamadas de
intérfase e mitose (fase M). A intérfase combina a fase inicial de
crescimento (G1), síntese de DNA (fase S) e uma segunda fase de
crescimento (G2) que serve para expandir o volume da célula e assegurar
uma quantidade suficiente de organelas para serem partilhadas entre as
células filhas durante a divisão celular. Já as células que não se dividem
53
estão em uma fase de repouso pós-mitótico chamada de G0 (Figura 7)
(JONGSMA; BERLIN; NEEFJES, 2015).
A fase G1, também chamada de fase de crescimento, inicia-se logo
após o processo mitótico, a qual é caracterizada pela síntese de proteínas e
RNAm, levando a um aumento do citoplasma e consequentemente um
aumento do tamanho celular. Além disso pode ser dividida em G1-precoce e
G1-tardia, sendo que as células que estão na fase G1-tardia possuem maior
quantidade de RNA e proteínas quando comparadas a fase G1-precoce pós
mitóticas, podendo diretamente passar para a fase S, enquanto que as
células presentes na fase G1-precoce necessitam aumentar sua quantidade
de RNA para serem capazes de iniciar a replicação de DNA (BEDOLLA et
al, 2014).
Na seguinte fase, chamada de S, a célula é responsável pela
replicação do DNA, assim, ao término desta fase o dobro de DNA e de
cromossomos é produzido (BEDOLLA et al, 2014).
A fase G2 é a segunda fase de crescimento do ciclo celular,
estando situada entre o final da síntese de DNA e início da fase M
(ZHANG; CHENG; LIEW., 2014). Ela dura até que a célula entra em
mitose e é caracterizada por um conteúdo de DNA não afetado e por uma
intensa atividade biosintética (BEDOLLA et al, 2014). Essa transição da
fase G2 para a fase M é muito importante na regulação da divisão celular,
pois se ocorre algum dano ao DNA a progressão celular é interrompida para
que este seja reparado antes de ser transmitido a outras células (ZHANG;
CHENG; LIEW., 2014).
Por fim, a mitose é um processo de divisão celular (LIU et al,
2014), possuindo quatro fases consecutivas (prófase, metafase, anáfase e
telofase) onde a membrana nuclear se desintegra, o DNA condensa e os
cromossomos são divididos em duas porções iguais (BEDOLLA et al,
2014), formando dois núcleos, os quais se separam resultando na produção
de duas células filhas, sendo estas idênticas a célula de origem (LIU et al,
2014).
54
Figura 7– Fases do ciclo celular.
Fonte: O controle do ciclo celular e a origem do câncer. Disponível em:
http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Citologia2/nucleo11.php
A progressão do ciclo celular é mediada por ciclinas e por cinases
dependentes de ciclinas (CDKs) que atuam em conjunto para induzir a
transição da fase G1 para a fase S e da fase G2 para a mitose (LIU et al.,
2015). Diferentes complexos ciclina-CDK fosforilam varios substratos,
como por exemplo a proteína retinoblastoma (Rb), desencadeando varios
eventos (RENZO et al., 2016). No entanto, este complexo ciclina-CDK é
negativamente regulado por inibidores do ciclo celular, tais como as
proteínas p21, p27 e p57 (LIU et al., 2015).
Existem 21 genes que codificam as CDKs e 29 que codificam as
ciclinas no genoma humano, sendo que as CDKs 1, 2, 4 e 6 e as ciclinas A,
B, D, e E são identificadas como as maiores reguladores do ciclo celular
(BRETONES et al, 2015) e as CDKs 7 e 9 são responsáveis pela regulação
da transcrição de genes (SCHMITZ; KRACHT, 2015).
Dois aspectos cruciais que estão envolvidos na regulação do ciclo
celular é a existência de pontos de verificação e de restrição (BERTOLI;
SKOTHEIM; BRUIN, 2013). Os pontos de verificação funcionam como um
http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Citologia2/nucleo11.php
55
bloqueio quando há um processamento anormal da replicação do DNA, a
fim de reparar este dano. Caso os danos ao DNA sejam reparados o ciclo
celular será reiniciado, caso contrário a célula entrará em apoptose (WANG
et al, 2015). Já o ponto de restrição está presente no final da fase G1, para
garantir que o DNA esteja intacto e que a célula esteja funcionando
normalmente e possa progredir para a fase S (figura 8) (BERTOLI;
SKOTHEIM; BRUIN, 2013).
Figura 8 – Principais reguladores do ciclo celular.
Fonte: Principais reguladores do ciclo celular. Disponível em:
https://www.studyblue.com/notes/note/n/neoplasia-vii-cancer-critical-genes-and-
familial-cancer-syndromes/deck/12635734
Os dois “checkpoints” mais estudados que inibem o ciclo celular
são a quinase 1 (CHK1) e a quinase Wee-1. Tanto a CHK1 quanto a Wee-1
medeiam a entrada do ciclo nas fases S e G2. A CHK1 fosforila e inibe a
CDC25, a qual inibe as CDK1/2, causando parada no ciclo celular,
https://www.studyblue.com/notes/note/n/neoplasia-vii-cancer-critical-genes-and-familial-cancer-syndromes/deck/12635734https://www.studyblue.com/notes/note/n/neoplasia-vii-cancer-critical-genes-and-familial-cancer-syndromes/deck/12635734
56
enquanto que a Wee-1 quando ativada fosforila e inibe diretamente as
CDK1 e CDK2 (WAHL; LAWRENCE., 2015).
Outra maneira de regular a progressão do ciclo celular se dá
através do gene p53, o qual atua como um protetor do DNA e também como
um indutor de apoptose. Ele bloqueia o ciclo celular na fase G1, através da
ativação do gene p21 o qual inibe os complexos ciclina D - CDK4/6 e
ciclina E – CDK2, quando iniciado um proceso de reparação ao DNA,
determinando assim o destino da célula (Figura 9) (ALAIZARI et al., 2015).
Figura 9 – Principais “Checkpoints” responsáveis pela regulação do ciclo celular.
Fonte: WAHL; LAWRENCE, 2015.
Na fase G1-precoce sinais mitogênicos são detectados primeiro e
integrados pela expressão das ciclinas D que se ligam preferencialmente as
CDK4 e CDK6 ativando-as e fosforilando a proteína retinoblastoma (Rb)
57
permitindo a acumulação do fator de transcrição E2F. Já na fase G1-tardia a
CDK2 é ativada pela ciclina E, formando outro complexo muito importante,
o qual hiperfosforila o Rb, permitindo que as células passem pelo ponto de
restrição liberando por completo o fator E2F, o qual codifica proteínas
necessárias para a progressão da fase G1 para a fase S. (Figura 10)
(BRETONES; DELGADO; LEÒN, 2015).
Figura 10 - Controle da progressão do ciclo celular da fase G1 para a fase S.
Fonte: WEINBERG, 2014.
Na fase S, existe um complexo entre a CDK2 e a ciclina A, que
permite que a célula progrida para a fase G2. Além disso a ciclina A é
importante na fase S por ser necessária para a replicação do DNA, sendo
expressa também na fase G2 (BRETONES; DELGADO; LEÒN, 2015).
Durante a fase G2, antes de entrar em mitose, a CDK1 fosforila
centenas de substratos que juntos dirigem-se para entrar na fase M, que é
uma fase condicionada pela ativação do compelxo entre a ciclina B e a
CDK1 (TAVERNIER; LABBÉ; PINTARD, 2015).
Segundo Tavernier e colaboradores (2015), antes de iniciar a fase
M a CDK1 é mantida inativada pela quinase Wee-1, porém quando a Cdc25
é desfosforilada esta ativa a CDK1 e inibe a quinase Wee-1, dando inicício
58
a mitose. Outra proteína específica no final da fase G2 e início da fase M é a
fosfohistona-H3, a qual está associada com a condensação da cromatina
(GINTER et al., 2016).
3.3 ÚLCERA GÁSTRICA
A mucosa gástrica é exposta continuamente á múltiplos fatores e
substâncias nocivas que podem vir dos alimentos, ou ainda da presença de
ácido gástrico, ácidos biliares, pepsina, produtos bacterianos e
medicamentos, podendo desencadear o aparecimento de úlceras gástricas
(STEVEN et al., 2016)
A úlcera gástrica constitui uma importante classe de desordens
gástricas, atraindo atenção global em cuidados á saúde (STEVEN et al.,
2016). São erosões que geralmente iniciam no revestimento da mucosa do
estômago, podendo penetrar nas camadas mais profundas do tecido de
revestimento do epitélio gástrico. Este processo ocorre quando a barreira da
mucosa gástrica é rompida, fazendo com que a pepsina e o HCl atuem no
epitélio gástrico (MARIANO, 2016).
Por muitas décadas foi identificada como uma lesão da parede da
mucosa gástrica, sendo a causa mais frequente de cirurgia, com alta taxa de
morbidade e mortalidade (BARKA et al., 2017). Cerca de 4 milhões de
pessoas são afetadas por esta doença em todo o mundo, sendo que destas,
aproximadamente 10% a 20% desenvolvem complicações (STEVEN et al.,
2016). Os sinais e sintomas podem apresentar um ou mais dos seguintes
itens: dor abdominal, inchaço, perda de apetite, perda de peso, náuseas ou
vômitos (LI et al., 2016).
Os principais fatores predisponentes incluem stress, infecção por
Helicobacter pylori, consumo de álcool, anti-inflamatórios não esteroidais
(BARKA et al., 2017) e tabagismo (LI et al., 2016), sendo identificados
como fatores importantes para o seu desenvolvimento, pois aumentam a
quantidade de pepsina e a secreção do ácido gástrico, suprimem a produção
das prostaglandinas, inibem a proliferação e crescimento das células da
mucosa e alteram a mobilidade gástrica. Estudos também sugerem que a
59
formação de espécies reativas de oxigênio (EROS), redução do fluxo
sanguíneo, infiltração de neutrófilos, secreção de citocinas pró-inflamatórias
desempenham papel significativo para a formação da ulcera gástrica (HUI;
FANGYU, 2017).
A fisiopatologia da úcera gástrica não é totalmente elucidada,
porém acredita-se que se deve ao desequilibrio de agentes agressivos (ácido
clorídrico (HCl), pepsina e estress oxidativo) e defensivos (secreção de
muco e bicarbonato, renovação celular, fluxo sanguíneo e antioxidantes)
resultando em lesões ulcerativas (ASHMAWY et al., 2016; BARKA et al.,
2017).
As principais estratégias terapêuticas propostas para a prevenção e
tratamento da doença é a redução da produção de ácido gástrico
(CHOUDHARY et al., 2016). Antagonistas dos receptores histaminérgicos
do tipo 2 e inibidores da bomba de prótons são habitualmente utilizados
como tratamento antiúlcera. No entanto, apesar da eficácia das terapias
atuais, alguns pacientes sofrem de recorrência da úlcera e/ou efeitos
adversos (RIBEIRO et al., 2016).
3.4 TIAZOLIDINODIONAS E SEU MECANISMO DE AÇÃO
As TZDs tornaram-se uma importante classe de compostos
heterocíclicos com atividade biológica desde a sua introdução na forma de
glitazonas (KUMAR et al, 2011), sendo conhecidas comercialmente como
Rosiglitazona (Avandia®), Pioglitazona (Actos®), Muraglitazona
(Pargluva®) (que não chegou a ser comer