UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
BARBARA LUIZA CARDANHA
ELEMENTOS ALU E O SEU PAPEL COMO MARCADORES MOLECULARES.
SÃO PAULO
2016
UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Barbara Luiza Cardanha
ELEMENTOS ALU E O SEU PAPEL COMO MARCADORES MOLECULARES.
Trabalho de conclusão de curso submetido à Universidade Presbiteriana Mackenzie como parte dos requisitos necessários para a obtenção do Grau de Bacharel em Ciências Biológicas. Sob a orientação da Professora Ana Paula Pimentel Costa.
São Paulo 2016
Agradecimentos
Agradeço a Universidade Presbiteriana Mackenzie e ao Centro de Ciências
Biológicas e da Saúde por ter possibilitado meu aprimoramento e aprendizado ao
longo desses quatro anos.
A minha orientadora Profª. Drª Ana Paula Pimentel Costa por todo seu suporte,
apoio, atenção e tranquilidade nos meus momentos de ansiedade e medo, por sempre
estar disponível para esclarecimento de dúvidas e me ajudando para que este trabalho
fosse realizado da melhor forma possível.
A todos os professores do curso de Ciências Biológicas por participarem da
minha formação.
A minha família, que me apoia desde sempre, mesmo quando mudei de ideia
quanto a faculdade que cursaria. Minha mãe, Virginia Fabrão, que nunca deixou que
eu desistisse do que eu queria e do que é melhor para mim até quando eu mesma
não sabia pelo o que lutar, sempre incentivando a minha decisão de qual faculdade
cursar. Meu pai, Claudio Cardanha, que me incentivou a manter os estudos como
prioridade. Meu irmão, Arthur Cardanha, que proporcionou momentos para relaxar e
descansar das tarefas da faculdade, evitando que eu enlouquecesse durante o curso.
Ao meu namorado, Guilherme Cremonesi, que esteve do meu lado me
encorajando e ouvindo pacientemente, aconselhando e sempre procurando fazer de
tudo para manter o meu bem-estar. Ao Ricardo Di Natale que me chamava para irmos
no bairro Liberdade e tomar chá gelado com pobá e comer lamen.
A minha turma maravilhosa, unida e com momentos únicos. Ao Roni Garcia,
com suas piadas sempre alegrando as aulas, principalmente quando começamos a
estudar no período da manhã. Ao Icaro Novo, Marllos Brandão e Juan Garutti pelas
conversas descontraídas e sobre diversos assuntos, trabalhos feitos e horas de
estudo para as provas, me ajudando a entender as matérias.
A Flávia Martins, primeira pessoa que conheci na faculdade, Ingrid Stanize e
Daniela Chierighini pelos momentos de alegria e ansiedade que vivemos juntas, por
não terem desistido da minha amizade quando eu estava insuportável, pelas noites
em claro estudando e fazendo trabalhos, pelas irritações e momentos de tensão umas
com as outras que sempre foram superados.
A Carolina Nakamura, que entrou no laboratório de genética comigo, Victória
Oda, Gabrielly Souza e Débora Nagano pelo estágio obrigatório proporcionando
momentos inesquecíveis com muita risada, mesmo que não tenhamos passado muito
tempo do curso juntas, esses meses já valeram por todos os anos de curso. Todas
me ajudando com as matérias, dando dicas e me mantendo tranquila para tudo, pelos
almoços em conjunto e sorteios desnecessários no estágio, pois sempre realizávamos
os mesmos exames.
Ao Carlos Eduardo Fuzaro, pelos gritos, questões no meio das apresentações
e risadas depois do estágio, pelo vasto conhecimento, não só analítico, e apoio. Por
sempre esperar alguns chocolates e ficar feliz com um simples pedaço de brownie.
Ao Murilo, Cassio e Evaldo pelo estágio mais prático e cheio de trabalho que
sentirei falta todos os dias e se pudesse passaria o dia inteiro, com muita microbiologia
passei a amar. São pessoas atenciosas que me ajudaram quando tinha dúvidas, não
foram poucas, pelas risadas que tornaram o estágio o melhor possível.
As minhas amigas de infância Julia Pessolato e Carolina Marques,
acompanhando de camarote a minha formação e stress com a faculdade, me
chamando para relaxar assistindo um filme, comendo hambúrguer, além de conversas
longas que nunca são suficientes.
Sumário
Resumo ......................................................................................................................................6
Abstract .....................................................................................................................................7
Introdução .................................................................................................................................8
Classificação dos TEs ............................................................................................................9
Os elementos Alu ..................................................................................................................10
Elementos Alu como marcadores moleculares .............................................................13
Os elementos Alu em estudos de ancestralidade. ........................................................15
Primeiro estudo de ancestralidade ...................................................................................16
Segundo estudo de ancestralidade ..................................................................................19
Terceiro estudo de ancestralidade ...................................................................................20
Quarto estudo de ancestralidade ......................................................................................21
Conclusão ...............................................................................................................................23
Referências bibliográficas ..................................................................................................23
6
Elementos Alu e o seu papel como marcadores moleculares.
Barbara Luiza Cardanha¹* Ana Paula Pimentel Costa¹
¹Universidade Presbiteriana Mackenzie. *A identificação do autor, formatação do artigo e referências bibliográficas foram feitas segundo a revista Genetics and Molecular Biology.
Resumo
Cerca de 98% do genoma humano é composto por sequências que não codificam proteínas, sendo 42% composto por sequências genéticas moveis, conhecidas como elementos de transposição (TE). Os TEs foram descobertos por Barbara McClinton, em 1940. Eram considerados DNA lixo (junk DNA), entretanto hoje já se sabe que esses elementos são capazes de provocar efeitos no genoma. Diversos elementos de transposição foram descobertos e classificados em duas classes, classe I e classe II. A classe II possui elementos sem LTRs, divididos em LINE e SINE que aparecem antes da radiação humano-chimpanzé estando no genoma de mamíferos a cerca de 100 milhões de anos. Dentro dos elementos SINEs há as sequências Alu e SVA. Os Alu constituem-se de 80 a 300 pares de bases,
existem mais de 1 milhão dessas sequências e essa família representa os elementos de retrotranposição mais comuns em primatas, constituindo aproximadamente 13 % do genoma humano. As diferentes inserções destes elementos no genoma podem ser utilizadas como marcadores de DNA em estudos de análises genéticas populacionais e filogenéticas, desastre em massa, teste de paternidade e criminalística, estudos de origem, história evolutiva e variação gênica em humanos, criar novos kits de marcadores moleculares e observar novos locais de inserção das sequências. O dimorfismo da inserção Alu torna possível a análise por ausência ou presença da inserção. Os marcadores de loci polimórficos das inserções Alu são
caracterizados como informativos de ancestralidade por apresentarem alto diferencial de frequência entre as populações. Sendo o objetivo analisar os TEs como marcadores moleculares. Concluindo, os elementos são eficientes para estudos de evolução, que mostraram serem úteis para identificação da ancestralidade de indivíduos e grupos populacionais, sendo necessário: um conjunto desses elementos para realizar o estudo e outros estudos para identificar novas inserções.
Palavras-chave: Alu, marcador molecular, polimorfismo, ancestralidade, elemento de transposição.
7
Abstract
About 98% of the human genome consists of sequences which don’t encode proteins, composed of 42% mobile genetic sequences, known as transposable elements (TE). TEs were discovered by Barbara McClinton, in 1940. They were considered junk DNA, but today it is known that these elements are capable of causing effects in the genome. Many transposable elements were discovered and classified into two classes, class I and class II. Class II include elements without LTRs divided into SINE and LINE that appeared before the human-chimpanzee radiation being in the genome of mammalian about 100 million years. Within the SINEs elements there are Alu and SVA sequences. The Alu constitute between 80 and 300 base pairs, there are over 1 million of these sequences and this is the most common family retrotranposon elements in primates, constituting approximately 13% of the human genome. The different inserts these elements within the genome can be used as DNA markers in studies of population and phylogenetic, genetic analysis, mass disaster, paternity testing and forensics, source studies, evolutionary history and genetic variation in human, create new molecular markers Kits and watch new places of insertion sequences. The Alu insertion
dimorphism makes possible the analysis of presence or absence of the insert. Markers of polymorphic loci of Alu insertions are characterized as informative of ancestry for their high differential frequency between populations. The aim is analyze TEs as molecular markers. In conclusion, the elements are effective for evolution studies, which have shown to be useful for identification of ancestry of individuals and population groups, requiring a set of these elements to carry out the study and other studies to identify new insertions.
Keywords: Alu, molecular marker, polymorphism, ancestry, transposition element.
8
Introdução
Cerca de 98% do genoma hu-
mano é composto por sequências
que não codificam proteínas. Deste
total, 42% é composto por sequên-
cias genéticas moveis, conhecidas
como elementos de transposição
(TEs) (RAY e BATZER, 2011; ULE,
2013) Estes elementos têm profun-
dos efeitos na estrutura e funciona-
mento do genoma. Os elementos de
transposição são responsáveis, em
parte, por gerar variabilidade gené-
tica. Variabilidade esta gerada como
consequência da capacidade intrín-
seca de mudar de lugar nos geno-
mas em que se encontram associa-
dos (VENNER et al, 2009).
Os TEs foram primeiramente
descobertos por Barbara McClintock
em um estudo analisando o cromos-
somo 9 de milho (Zea mays ssp.
mays), em 1940. Anos após essa
descoberta, com o avanço da tecno-
logia criando a possibilidade de ma-
nipular genes e cromossomos em la-
boratório, estudos aprofundados so-
bre o genoma dos organismos suce-
deram várias descobertas, entre elas
que os TEs também se encontravam
em organismos procariotos (VARANI
et al., 2015).
Segundo Ray e Batzer (2011),
assim como em humanos, estudos
com outros organismos usando o
TE, mais especificamente os retro-
elementos, também começaram,
mesmo que o DNA mitocondrial, mi-
crossatélites e RFLP sejam normal-
mente mais usados. Em plantas, os
retroelementos são muito abundan-
tes podendo chegar, em gramíneas,
a 90% do genoma. Entender a distri-
buição dos TEs nas plantas permite
utilizá-los como marcadores informa-
tivos sobre a diversidade genética
em programas de melhoramento ge-
nético (YADAV et al., 2014)
Inicialmente, os TEs eram
considerados “DNA lixo” (junk DNA)
(DRIDI, 2012) que estavam sendo
transmitidos de geração a geração,
pois não haviam evidências de que
essas sequências exerciam alguma
função útil, portanto pensava-se que
o objetivo das sequências era so-
breviver no genoma hospedeiro.
Com o avanço da tecnologia, avan-
ços no conhecimento dos genomas,
tanto de procariontes como de euca-
riontes, e a possibilidade sequenciar
genoma completos facilitaram ava-
9
liar a contribuição dos TEs para o ge-
noma (DIAS; CARARETO, 2015).
Hoje em dia já se sabe que essas se-
quências contribuem para a evolu-
ção dos organismos (NAHUM, 2012)
e para o aumento da complexidade
do genoma, influenciando no número
de genes e vias de regulação gênica.
Esses elementos são capa-
zes de provocar efeitos no genoma,
como recombinação entre cromáti-
des irmãs, cromossomos homólogos
e não homólogos causando dele-
ções, duplicações, inversões e trans-
locações, agindo como elementos
reguladores de transcrição e sítios
de poliadenilação (NAHUM, 2012)
sem necessidade de se moverem
para provocar algum efeito, eles tam-
bém são importantes para a evolu-
ção. Já foram descritos eventos de
impacto nos genes através de vias
alternativas de regulação, exons e
splicing (DIAS; CARARETO, 2015;
Jurka, 1995; Speek, 2001; Nigumann
et al., 2002; Kazazian, 2004;
Peaston et al., 2004; Matlik et al.,
2006; Babushok et al., 2007; Hasler
et al., 2007 apud RAY e BATZER,
2011).
Apesar de poderem causar
tantos problemas, a facilidade de se
adaptarem impede que os TEs se-
jam completamente eliminados e já
se sabe que eles possuem um papel
importante na variabilidade genética,
na qual a seleção natural consegue
atuar (RAY; BATZER, 2011).
Neste contexto, o objetivo
deste trabalho é analisar o papel dos
TEs, como marcadores moleculares,
tendo como exemplo os elementos
Alu.
Classificação dos TEs
Diversos elementos de trans-
posição foram descobertos e classi-
ficados em duas classes. A classe I
também chamados de retrotrans-
ponsons ou retroelementos, que de-
pende do RNA para serem copiados
e se inserirem em um novo local no
genoma, e a classe II também deno-
minados como transponsons ou
transponsons de DNA, que depen-
dem do DNA. Os retroelementos po-
dem apresentar ou não longas termi-
nações repetidas diretas em suas
terminações (do inglês Long Termi-
nal Repeat – LTRs) (VARANI et al.,
2015) (Figura 1).
10
Figura 1. Esquema dos elementos de transposição mediados por DNA e RNA, com e sem LTR. Adaptado de Feschotte; Jiang; Wessler (2002).
Os elementos sem LTRs são
divididos em elementos nucleares in-
terdispersos longos ou curtos (do in-
glês, LINE – Long Interspersed Nu-
clear Element e SINE – Short Inters-
persed Nuclear Element, respectiva-
mente), sendo que ambos apresen-
tam uma sequência poli-A em uma
de suas terminações e aparecem an-
tes da radiação humano-chimpanzé
estando no genoma de mamíferos a
cerca de 100 milhões de anos
(GARCIA; GAIESKY, 2015). Esses
elementos sem LTRs possuem se-
quências que são recentes e, por
isso, consideradas polimórficas.
Além disso, são específicas de hu-
manos, o que os tornam potenciais
marcadores moleculares (RAY e
BATZER, 2011).
Os elementos SINEs são pe-
quenos, compostos de 80 a 500 pa-
res de bases, e os exemplos encon-
trados no genoma humana são as
sequências Alu e SVA (VARANI et
al., 2015).
Os elementos Alu
Os elementos Alu constituem-
se de 80 a 300 pares de bases, não
são codificadoras, possuindo uma
taxa de 1 a cada 50 meioses, por-
tanto existem mais de 1 milhão de
sequências Alu no genoma humano
(MEDINA; CARARETO, 2015), essa
família representa os elementos de
retrotransposição mais comuns em
primatas, constituindo aproximada-
mente 13% do genoma humano.
Acredita-se que as primeiras inser-
ções destes elementos no genoma
de primatas tenham ocorrido a 65 mi-
lhões de anos (CORDAUX et al.,
2004), tornando-se o mais bem-su-
cedido elemento móvel do genoma
humano (CORDAUX et al., 2004 e
MEDINA; CARARETO, 2015).
11
Sabe-se que os elementos
Alu são constituídos de um monô-
mero esquerdo com 100 nucleotí-
deos e um direito com 200 nucleotí-
deos, que se mantem juntos por uma
sequência rica em adenosina e ter-
minando com uma cauda poli-A,
sendo que cada subunidade se origi-
nou das terminações 5’ e 3’ do 7SL
RNA (DRIDI, 2012), este dímero
contribuiu para a origem dos prima-
tas (GARCIA; GAIESKY, 2015). Es-
ses elementos não são autônomos,
isto é, dependem de enzimas que os
elementos LINEs, geralmente da fa-
mília L1 (GARCIA; GAIESKY, 2015),
codificam para poderem realizar a
transposição (VARANI et al., 2015).
Por causa das diferenças que
ocorreram nas sequências mestres
durante a evolução, foram criadas fa-
mílias (Old, Intermediate e Young) e
subfamílias. A família Young (Y) é a
que contem mais sequências
inseridas recentemente, não fixadas,
específicas de humanos. O
polimorfismo dessa família é
apresentado como alelos, sendo que
a falta da inserção corresponde ao
estado ancestral. Portanto, as inser-
ções presentes em indivíduos dife-
rentes demostram que, provavel-
mente, eles possuem o mesmo an-
cestral, no qual ocorreu a inserção,
pois a probabilidade de dois elemen-
tos independentes se inserirem no
mesmo local no genoma é pratica-
mente nulo (TERREROS, et al.,
2009).
As diferentes inserções des-
tes elementos no genoma geraram
diferentes polimorfismos, que podem
ser utilizados como marcadores de
DNA em estudos de populações hu-
manas (AYARPADIKANNAN, et al,
2014) por causa de sua mobilização
conservativa, sendo mais estável,
portanto útil como marcador molecu-
lar (KUROKI; SETTA, 2015). Anali-
sando o polimorfismo da inserção
Alu é possível estudar a diversidade,
origem e estrutura do genoma da
população mundial (BATZER;
DEININGER, 2002), assim como es-
tudar doenças ligadas aos genes
(CHEN et al., 2005 apud CORDAUX
et al., 2007).
As inserções de novas se-
quências têm se mostrado constante
ao longo da evolução humana,
sendo possível obter diferentes com-
preensões sobre a história evolutiva
dos humanos dependendo da idade
da inserção. Há estudos que discu-
tem questões filogenéticas populaci-
onais globais e regionais, demons-
trando que as sequências Alu são
12
ótimos marcadores para a reconstru-
ção da história evolutiva das popula-
ções, o que levou a uma forte crença
de que a origem dos seres humanos
atuais veio da África (TERREROS, et
al., 2009).
Esses elementos também
possuem o potencial de intervir na
expressão dos genes humanos de
várias formas, podendo contribuir
para rearranjos cromossômicos cau-
sando deleções, inversões e duplica-
ções através da recombinação de
elementos de transposição homólo-
gos em regiões diferentes nos cro-
mossomos. Apesar do impacto posi-
tivo na evolução que os elementos
de transposição provocaram, a inser-
ção em uma região pode afetar a ex-
pressão do gene. Mesmo que
poucas inserções Alu sejam
encontradas na região 5’ não
codificante ou nos éxos de genes,
evidenciando que essas sequências
nesses locais são prejudiciais as fun-
ções dos genes, sabe-se que 60 do-
enças são associadas as sequências
Alu, sendo que uma dessas doenças
é o câncer (MEDINA; CARARETO,
2015).
Existe relação dessas se-
quências com a recombinação ho-
mologa, tanto intracromossômica
quanto intercromossômica; com a
expansão do genoma, pois as se-
quências Alu estão presentes em
maior número de cópias no genoma
do que as sequências L1 (GARCIA;
GAIESKY, 2015). Também estão
presentes em regiões promotoras de
genes, assim como podem ser uma
proteção para os genes contra a
cromatina condensada adjacente
(DIAS; CARARETO, 2015).
Os retroelementos Alu têm se-
quências que podem ser sítios de
splice que, se reconhecidos pelas
enzimas que realizam o splicing, se
tornam um splicing alternativo se es-
tiverem inseridos em um gene. Os
Alu podem afetar a expressão gênica
de várias formas, entre elas há a adi-
ção de Alu exônicos em regiões co-
dificantes que servem como fonte de
diversidade de proteínas funcionais
e a função de controle de qualidade
em que a edição de IRAlus (Alus pre-
sentes em transcritos de mRNA em
orientação invertida) previne que
RNAs mal editados cheguem ao
citoplasma (DIAS; CARARETO,
2015).
13
Elementos Alu como marcadores
moleculares
Em geral, os TEs podem ser
utilizados como marcadores molecu-
lares para estudos de análises gené-
ticas populacionais e filogenéticas,
desastre em massa, teste de pater-
nidade e criminalística, estudos de
origem e variação gênica em huma-
nos, principalmente em relação aos
retroelementos. O polimorfismo das
inserções dos TEs permite que o
pesquisador tenha uma maior preci-
são do que com outros marcadores
genéticos como polimorfismos de um
único nucleotídeo (em inglês: single
nucleotide polymorphisms – SNPs),
microssatélites, polimorfismo do
DNA mitocondrial (RAY; BATZER,
2011) e short tandem repeats (STRs)
(Mamedov et al., 2010). Além de
usar essas sequências para estudos
populacionais, elas também são uti-
lizadas nas análises forenses para a
identificação de um indivíduo ou de
um grupo. Há estudos, como os de
Bamshad et al. (2003), Witherpoon
et al. (2006) e Watkins et al. (2003)
(apud RAY e BATZER, 2011), que
utilizam os retrotransponsos para
agrupar populações, pesquisar as
origens humanas e migrações; ou-
tros pesquisadores tem feito a geno-
tipagem de indivíduos desconheci-
dos identificando sua ancestrali-
dade, o que pode ser útil para inves-
tigações criminais.
Apesar dos estudos serem
promissores, a quantidade de poli-
morfismo na população dificulta a
identificação das inserções. Entre-
tanto, pesquisas como a de Ewing e
Kazazian (2010) (apud RAY e
BATZER, 2011) têm identificado e
mapeado novas inserções.
Cada Alu é proveniente de um
único evento de retrotranposição que
ocorreu nos primatas. Depois dessa
transposição inicial, as sequências
são herdadas segundo padrão men-
deliano. A maioria das inserções Alu
aconteceu há milhões de anos e es-
tão fixadas, isso significa que, em um
locus em particular, todos os prima-
tas têm a sequência Alu em cada um
dos pares de cromossomos. Entre-
tanto, centenas de Alu tem se inse-
rido no genoma desde a evolução de
primatas para os humanos, conse-
quentemente algumas inserções não
são fixadas, o que significa que se
pode ter ou não a presença da se-
quência em cada um dos pares de
cromossomos, dessa forma cria-se
dois possíveis alelos (presença [+]
e/ou ausência [-]) (DEININGER;
14
BATZER, 1999). Essa forma de ana-
lisar, pela presença e ausência da
sequência em um determinado lo-
cus, permite estudar a descendência
por causa dos potenciais locais para
a inserção dessa sequência e por-
que se sabe que no ancestral antigo
o estado da inserção é a sua ausên-
cia (Figura 2) (RAY; BATZER, 2011).
Figura 2. Ilustração da presença e ausência da inserção Alu. Maternal – cromossomo com a inserção; Paternal – cromossomo sem a inserção; Setas pretas indicando como o resultado do gel da eletroforese é analisado. Adaptado de Dna Kit Learning Center (2006).
Assim esse dimorfismo da in-
serção Alu, em um estudo feito por
Batzer et al. (1994) usando quatro
loci polimórficos das inserções Alu
(TPA25, ACE, APO, PV92), onde
eram analisadas ausência ou pre-
sença da inserção, demonstrou que
este polimorfismo era útil para o es-
tudo genético de populações. Ray et
al. (2005) analisou 100 loci polimórfi-
cos da inserção Alu, para determinar
a ancestralidade das amostras de
DNA de 18 pessoas geografica-
mente aleatórias, classificando es-
sas amostras em quatro grandes
grupos populacionais do mundo. Um
estudo feito na Rússia pelo
Solovieva et al. (2009) foi usado
cinco loci polimórficos (ACE,
APOA1, B65, PV 92, TPA25) das in-
serções Alu para se determinar a fre-
quência das inserções na população
russa e determinar a ancestralidade
de 10 populações de diferentes par-
tes da Rússia. Foram observadas di-
ferentes frequências dos alelos nas
diferentes populações, indicando
que as inserções Alu são ótimos
marcadores para se estudar a evolu-
ção humana e a migração. Vários
trabalhos têm demonstrado a aplica-
bilidade das inserções Alu neste tipo
de estudo.
No Brasil, Marrero et al.
(2007) realizou estudos usando a
sequência Alu para investigar a his-
tória evolutiva de uma população do
sul do país (os habitantes da região
15
do Pampa em comparação com po-
pulações correspondentes da Argen-
tina e Uruguai). Em um estudo ante-
rior, Cotrim et al. (2004) analisou
quatro loci polimórficos Alu (APO,
ACE, TPA25 e FXIIIB) para
caracterizar grupos de quilombolas
do Vale do Ribeira. No trabalho de
Mendes-Junior e Simões (2001), fo-
ram analisadas as inserções de 3
loci polimórficos (TPA25, PV 92,
APO) de inserção Alu em uma
população urbana do sudeste do
Brasil para caracterizar a
composição étnica dessa população.
Deste modo, o polimorfismo
da inserção Alu mostrou-se como um
importantíssimo marcador nos estu-
dos de populações em escalas glo-
bais (BATZER et al., 1996;
STONEKING et al., 1997; CARROLL
et al., 2001; ROY-ENGEL et al.,
2001) e regionais (BATTILANA et al.,
2006; NASIDZE et al., 2001; XIAO et
al., 2002; KHUSAINOVA et al., 2004;
SOLOVIEVA et al., 2009), assim
como é útil para teste de paternidade
(NOVICK et al., 1995; Mamedov et
al., 2010) e para análises forenses
(NOVICK et al., 1993;RAY et al.,
2005). Dessa forma, é importante co-
nhecer as inserções que são dividi-
das entre indivíduos de uma ou mais
populações para aplicações científi-
cas.
A população brasileira consti-
tui um dos grupos mais heterogê-
neos do mundo, como resultado de
cruzamentos interétnicos entre euro-
peus, africanos, ameríndios e asiáti-
cos (ALVES-SILVA et al, 2000). As-
sim a pesquisa dos polimorfismos
das inserções Alu mostra-se
bastante relevante, pois resulta em
dados importantes sobre a ances-
tralidade genética e a contribuição
de cada grupo étnico na formação da
nossa população.
Os elementos Alu em estudos de
ancestralidade.
Segundo a literatura, muitos
dos marcadores de loci polimórficos
das inserções Alu são caracteriza-
dos como informativos de ancestrali-
dade por apresentarem alto diferen-
cial de frequência entre as popula-
ções. Com a formação de uma popu-
lação miscigenada, espera-se que a
frequência de qualquer locus, defini-
dos como marcadores que apresen-
tam frequências extremas e distinti-
vas entre populações diferenciadas
por fatores étnicos ou geográficos,
atinja valores diferentes ao encon-
trado nas populações parentais
(TELÓ, 2010).
16
Destacamos a seguir, quatro
trabalhos que utilizam as sequências
Alu, para assim exemplificar seu
emprego em estudos de ances-
tralidade.
Primeiro estudo de ancestrali-
dade
Em seu estudo, Terreros et al.
(2009) tem o objetivo de analisar o
perfil genético de seis populações
africanas, quatro asiáticas e duas
europeias utilizando 27 polimorfis-
mos Alu para entender a história
evolutiva dos humanos. Eles tam-
bém usaram marcadores de ances-
tralidade, conhecidos como alelos
específicos das populações, capa-
zes de diferenciar populações, po-
dendo ser úteis para determinar a
ancestralidade biogeográfica de gru-
pos e indivíduos. Levou em conta
que essas 12 populações represen-
tam os três grandes grupos étnicos
mundiais.
Foram coletadas 563 amos-
tras de sangue das seguintes popu-
lações: Norte da África, África Orien-
tal, Centro da África, África Ociental,
Ásia e Europa. A ancestralidade foi
rastreada até duas gerações.
Os resultados mostram que
os loci são polimórficos nas popula-
ções, com algumas exceções como
no caso da inserção APO, cuja pre-
sença está fixada na população de
Marrocos e Ami, e A25 e TCR que a
ausência está fixada na população
de Ami. Com relação a heterozigose,
o maior valor encontrado foi na África
(0.309), seguida da Ásia (0.288) e
Europa (0.268). O grupo de cientis-
tas também construíram uma árvore
filogenética (Figura 3) que coincide
com a distribuição geográfica das
populações estudadas.
17
Figura 3. Árvore filogenética baseada em 1000 repetições. Mostrando a distância genética, em porcentagem nos nódulos, entre as populações de acordo com as 27 inserções estudadas. Grupo subsaariano – CAM (Camarões), BEN (Benin), RWA (Ruanda), KEN (Quênia); AMI (Ami); MAD (Madras); Grupo formado com as demais populações – EGY (Egito), GAL (Galicia), MOR (Marrocos), OMN (Omã), GEO (Georgia) e UAE (Emirados Árabes). Adaptado de Terreros et al. (2009).
Na árvore é possível perceber
que os grupos populacionais subsa-
arianos possuem poucas diferenças
geográficas e genéticas estando se-
parados do resto das populações.
Quando se analisa as populações de
Galicia, Marrocos, Emirados Árabes,
Omã, Egito, Georgia e Madras, ob-
serva-se uma proximidade genética
maior que a esperada considerando
o modelo de isolamento por distân-
cia. Já a população Ami se mostra
afastada das demais populações,
18
provavelmente por causa do isola-
mento e tamanho da população, acu-
mulando frequências alélicas com
tendência para fixação.
A diferença entre os grupos
do norte da África e a África subsa-
ariana deve-se, provavelmente, a
presença do deserto do Saara, que
atua como uma provável barreira fí-
sica para o fluxo gênico, diferenci-
ando a composição genética do con-
tinente africano. Por isso a proximi-
dade das populações europeia, asiá-
tica e do norte da África é evidenci-
ada no estudo, que provavelmente
se deve ao efeito de homogeneiza-
ção do fluxo gênico causado pela co-
nexão do corredor de Levantine e do
Corno da África, usadas para migra-
ção humana. Além disso, o norte da
África, a Península Arábica e a re-
gião do Cáucaso se mostram como
ponto chave para a dispersão gênica
e migração do homem para a África
e Eurásia, dando suporte a teoria de
origem do homem moderno ter vindo
da África.
Analisando a média das fre-
quências, em porcentagem, dos ale-
los entre os grupos das populações
subsaariana, europeia e asiática ob-
serva-se que a diferença entre as po-
pulações subsaariana e asiática é de
15,9%, entre a europeia e subsaari-
ana é de 16,3% e entre a asiática e
europeia é de 6,1%.
Os dados mostram que a vari-
ação tende a ser geográfica que en-
tra em acordo com padrões históri-
cos de fluxo gênico e deriva gené-
tica, que são dois fatores importan-
tes para a composição genética dos
grupos principalmente por causa do
isolamento parcial e a migração, e
consequentemente mistura, que a
população humana sofreu ao longo
da história evolutiva, esse estudo re-
vela que os marcadores são sensí-
veis a esses eventos.
Os polimorfismos dos alelos
A25, APO, COL3A1, NBC4, Sb19.3
e NBC6 podem distinguir subsaaria-
nos de asiáticos e de europeus;
Sb19.10, F13B, HS4.32 e HS4.75
são uteis para comparar subsaaria-
nos e asiáticos e o PV92 para dife-
renciar asiáticos de europeus. Entre-
tanto, alguns valores baixos do teste
de fixação mostram que nem todas
as inserções são aconselháveis para
estudos nas populações, como é o
caso das inserções HS469 e NB60.
Todas essas sequências podem ser
usadas como marcadores molecula-
res de ancestralidade (AIM). As se-
quências F13B, Sb19.10 e NBC6
19
mostram maiores diferenças nas fre-
quências alélicas entre as popula-
ções por causa do alto valor de
fixação, portanto os marcadores
Sb19.10 e NBC6 podem ser inclusos
na lista de AIM.
Segundo estudo de ancestrali-
dade
Mamedov et al. (2010) desen-
volveu um novo conjunto de mar-
cadores moleculares para identifica-
ção humana baseados em retroele-
mentos polimórficos, usando 32 ele-
mentos da família Alu Y, sendo que
o resultado a ser analisado é a pre-
sença e ausência da inserção.
O polimorfismo Alu pode apre-
sentar diferente distribuição na popu-
lação humana segundo a etnia ou
estar presente em vários grupos ét-
nicos. Em seu estudo, Mamedov et
al. (2010) usa os resultados encon-
trados comparando-os com um
banco de dados, criado pelos auto-
res, que contém informações das in-
serções encontradas neste estudo e
em outros realizados em outros paí-
ses, contendo informações da locali-
zação, frequência na população e re-
ferências das sequências Alu Y.
Para selecionar as inserções
Alu foram utilizados critérios como
existir em um loci com pouca distri-
buição em outras regiões do ge-
noma, pouca ou nenhuma repetição
perto da inserção escolhida e fre-
quência intermediária na população,
no final foram 18 elementos escolhi-
dos do cromossomo 1 ao 9, um do
cromossomo 10 ao 22 e um mesmo
elemento no cromossomo X e Y. A
figura quatro mostra um exemplo do
gel de eletroforese de um indivíduo
utilizando os 32 primers.
Figura 4. Gel de eletroforese da PCR dos 32 pri-mers do genoma de um indivíduo. Setas pretas – presença da inserção; Seta branca – ausência da inserção. Adaptado de Mamedov et al. (2010).
20
Os autores analisaram as inserções
de 90 indivíduos russos (Ucrania,
Mordóvia, República da Kalmykia,
República de Komi e Moscou) sem
relação de parentesco e geografica-
mente distantes. Os resultados mos-
traram variação na frequência da
presença e ausência da inserção de
0.29: 0.71 e 0.74: 0.26, respectiva-
mente, porém para cada população
a variação foi de 0.075: 0.925 e 0.8:
0.2 evidenciando que cada popula-
ção tem as suas particularidades.
Isso mostra que esse conjunto de se-
quências Alu são funcionais para a
identificação de indivíduos. Além
disso, foram realizados teste de
paternidade com 6 famílias com
variação da probabilidade entre
99.9571% e 99.4655%, mostrando
que esses retroelementos também
podem ser usados nesse teste.
Terceiro estudo de ancestralidade
Em seu trabalho, Pereira et al.
(2006) analisou uma inserção Alu
presente dentro de uma inserção
LINE-1 no cromossomo X. As amos-
tras foram fornecidas pela Founda-
tion Jean Dausset, Paris, França. As
684 amostras, todas de homens, re-
presentam os cinco continentes a
partir de sete grupos regionais
(África, Oceania, América, Europa,
Oriente Médio, Ásia Central e do Sul)
e 34 amostras de Ameríndios (25
Ticuna do Brasil e 9 Muskoke dos
Estados Unidos) fornecidas pelo Dr.
Judith Kidd da Universidade de Yale,
em 2006. A família Alu utilizada foi a
Ya5/8, sendo a família mais polimór-
fica descrita, a identificação é pela
presença e ausência.
As amostras da África, Brasil
e Ásia a inserção é de 454bp e a au-
sência é de 142bp, enquanto que as
amostras dos nativos americanos
não apresentam a inserção da se-
quência. Uma questão interessante
apresentada foi a presença de duas
bandas em algumas amostras
(Figura 5), por serem todas de indiví-
duos do sexo masculino e só apre-
sentam um cromossomo X, prova-
velmente a presença da segunda
banda se dá por causa da sequência
Alu estar inserida em um retroele-
mento L1. Com a PCR, os primers
usados possivelmente amplificam
outra sequência homologa da L1
presente no genoma, o que se torna
uma dificuldade para diferenciar as
amostras femininas homozigotas
com a inserção das heterozigotas
utilizando a PCR convencional, en-
tretanto a PCR em tempo real pode
distinguir as amostras quantitativa-
mente.
21
Figura 5. Gel de eletroforese mostrando as duas bandas evidenciadas nas amostras de homens. 1 – Marcador; 4 – Negativo; 8, 9, 12, 14, 16, e 17 – Duas bandas amplificadas; 2, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 13, 15, 18, 19 – apenas uma banda amplificada. 454 bp – inserção; 142 bp – sem a inserção. Adaptado de Pereira et al. (2006).
O DXS225, nome da inserção
Alu, apareceu nas sete regiões ana-
lisadas. As frequências encontradas
pelos autores foram 0.256 na África,
0.407 no Oriente Médio, 0.347 na
Ásia Central, 0.257 na Oceania,
0.190 na Europa e 0.360 na América,
sendo que a frequência em cada
grupo também é apresentada no tra-
balho. Ao fazerem as análises esta-
tísticas, descobriram que 92,2% da
variabilidade é, provavelmente, entre
os indivíduos das populações, que
5% da variação dentro dos grupos
regionais se dá pela diferença entre
as populações e que 2,7% da varia-
ção pode ser justificado pela dife-
rença entre os grupos regionais. Já
nos ameríndios, somente nos
Karitiana que a inserção foi encon-
trada por causa do contato com eu-
ropeus e africanos, porém nas outras
quatro populações estudadas não se
observou a inserção, indicando que
essa sequência pode ser usada em
estudos de cruzamento de popula-
ções. Além disso, como a inserção
Alu está dentro de uma L1 e está cer-
cado por dois microssatélites que
não estão em equilíbrio, ela poderia
ser usada para estudos da evolução
humana.
Quarto estudo de ancestralidade
Rocañín-Arjó et al. (2013)
estudou o grupo Yakuts da Sibéria,
fornecendo novos dados genéticos
sobre a população analisando
sequências Alu de cromossomos
autossômicos e cromossomo X,
podendo avaliar a heterogeneidade
entre a região central e oeste da
população e comparar com os
siberianos e não siberianos, para
examinar a origem do grupo Yakuts.
Importante para entender o processo
migratório desse grupo.
Foram usados 12 inserções
em cromossomos autossômicos e 8
inserções no cromossomo X. O es-
tudo utilizou 161 amostras, sendo 35
do Centro e 126 do Oeste da
Yakutia. O DNA foi isolado de amos-
tras de sangue e saliva.
Em relação aos cromossomos
autossômicos, a comparação com
18 amostras da Eurásia agrupadas
em 4 regiões conforme a geografia e
origem: Sibéria, Ásia Central,
Cáucaso do Norte e Volga-Ural, foi
baseada em oito inserções Alu e a
comparação com o cromossomo X
foi feita com 10 populações mundiais
da Bolívia, Europa, Norte da África e
África subsaariana, também utili-
zando oito elementos.
Os pesquisadores observa-
ram uma homogeneidade genética
entre os Yakuts do Oeste e a Sibéria
(proximidade genética entre os gru-
pos Yakuts do Oeste e os Kalmykia)
através das sequências automossô-
micas, tornando difícil saber quanta
influencia a população estudada teve
do povo do Lago Baikal e/ou quanta
influencia veio da mistura de popula-
ções do Norte. Os dados encontra-
dos evidenciam maior contribuição
de Evenks comparado com Kazakhs,
Uyghurs e Uzbeks. Além disso, a dis-
tância genética entre Yakuts e os
grupos da montanha Altaian não
sustenta a hipótese de que a origem
da população Yakuts seja dessa po-
pulação [montanha Altaian]. Entre-
tanto, segundo Friedlandler et al.
(2008) (apud Rocañín-Arjó et al,
2013) poucas amostras, ou amostra-
gem inadequada, dificulta propor a
origem e relação genética da popu-
lação, por isso a população Evens,
que compartilha o território com
Evenks e Yakuts, e Tuvinians, grupo
turco que vive no sul da Sibéria,
acrescentariam importantes informa-
ções por estarem relacionadas com
Yakuts baseando-se nas análises de
DNA mitocondrial.
Em relação as inserções Alu
do cromossomo X, os resultados de-
vem ser analisados cuidadosa-
mente, pois a falta de dados dos gru-
pos geográficos e historicamente re-
lacionados impossibilita a correta in-
terpretação dos dados obtidos.
Dessa forma, seriam necessários
mais estudos para poder entender a
origem dessa população.
Conclusão
Portanto é possível concluir
que os elementos de transposição
têm se mostrado eficientes para es-
tudos de evolução, principalmente as
inserções Alu que mostraram serem
úteis para identificação da ancestra-
lidade de indivíduos e grupos popu-
lacionais, pois as diferentes frequên-
cias de cada inserção na população
ou se o indivíduo possui ou não a in-
serção condiz com uma origem dife-
rente. Além de estudos de perfil ge-
nético, origem demográfica e relação
entre as populações. A facilidade de
trabalhar com essas inserções,
sendo um método informativo e con-
fiável, tem levado os pesquisadores
a usa-las como alternativas para o
DNA mitocondrial, SNP, SRT e mi-
crossatélites. Tornando possível uti-
lizar essas sequências para análises
forenses e testes de paternidade.
Entretanto, é necessário um
conjunto desses elementos para rea-
lizar o estudo, pois somente uma
sequência não é suficiente para ana-
lisar a ancestralidade. Se o estudo ti-
ver o objetivo de caracterizar uma
população, também é importante ter
uma quantidade de amostras acima
de 100.
Ainda são necessários mais
estudos para a identificação de no-
vas sequências Alu, por causa da
sua mobilidade, novas sequências
se inserem em outros lugares no ge-
noma podendo agregar sequências
para estudos de ancestralidade ou
causar doenças como consequência
do rearranjo cromossômico que elas
podem provocar.
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