UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

BARBARA LUIZA CARDANHA

ELEMENTOS ALU E O SEU PAPEL COMO MARCADORES MOLECULARES.

SÃO PAULO

2016

UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Barbara Luiza Cardanha

ELEMENTOS ALU E O SEU PAPEL COMO MARCADORES MOLECULARES.

Trabalho de conclusão de curso submetido à Universidade Presbiteriana Mackenzie como parte dos requisitos necessários para a obtenção do Grau de Bacharel em Ciências Biológicas. Sob a orientação da Professora Ana Paula Pimentel Costa.

São Paulo 2016

Agradecimentos

Agradeço a Universidade Presbiteriana Mackenzie e ao Centro de Ciências

Biológicas e da Saúde por ter possibilitado meu aprimoramento e aprendizado ao

longo desses quatro anos.

A minha orientadora Profª. Drª Ana Paula Pimentel Costa por todo seu suporte,

apoio, atenção e tranquilidade nos meus momentos de ansiedade e medo, por sempre

estar disponível para esclarecimento de dúvidas e me ajudando para que este trabalho

fosse realizado da melhor forma possível.

A todos os professores do curso de Ciências Biológicas por participarem da

minha formação.

A minha família, que me apoia desde sempre, mesmo quando mudei de ideia

quanto a faculdade que cursaria. Minha mãe, Virginia Fabrão, que nunca deixou que

eu desistisse do que eu queria e do que é melhor para mim até quando eu mesma

não sabia pelo o que lutar, sempre incentivando a minha decisão de qual faculdade

cursar. Meu pai, Claudio Cardanha, que me incentivou a manter os estudos como

prioridade. Meu irmão, Arthur Cardanha, que proporcionou momentos para relaxar e

descansar das tarefas da faculdade, evitando que eu enlouquecesse durante o curso.

Ao meu namorado, Guilherme Cremonesi, que esteve do meu lado me

encorajando e ouvindo pacientemente, aconselhando e sempre procurando fazer de

tudo para manter o meu bem-estar. Ao Ricardo Di Natale que me chamava para irmos

no bairro Liberdade e tomar chá gelado com pobá e comer lamen.

A minha turma maravilhosa, unida e com momentos únicos. Ao Roni Garcia,

com suas piadas sempre alegrando as aulas, principalmente quando começamos a

estudar no período da manhã. Ao Icaro Novo, Marllos Brandão e Juan Garutti pelas

conversas descontraídas e sobre diversos assuntos, trabalhos feitos e horas de

estudo para as provas, me ajudando a entender as matérias.

A Flávia Martins, primeira pessoa que conheci na faculdade, Ingrid Stanize e

Daniela Chierighini pelos momentos de alegria e ansiedade que vivemos juntas, por

não terem desistido da minha amizade quando eu estava insuportável, pelas noites

em claro estudando e fazendo trabalhos, pelas irritações e momentos de tensão umas

com as outras que sempre foram superados.

A Carolina Nakamura, que entrou no laboratório de genética comigo, Victória

Oda, Gabrielly Souza e Débora Nagano pelo estágio obrigatório proporcionando

momentos inesquecíveis com muita risada, mesmo que não tenhamos passado muito

tempo do curso juntas, esses meses já valeram por todos os anos de curso. Todas

me ajudando com as matérias, dando dicas e me mantendo tranquila para tudo, pelos

almoços em conjunto e sorteios desnecessários no estágio, pois sempre realizávamos

os mesmos exames.

Ao Carlos Eduardo Fuzaro, pelos gritos, questões no meio das apresentações

e risadas depois do estágio, pelo vasto conhecimento, não só analítico, e apoio. Por

sempre esperar alguns chocolates e ficar feliz com um simples pedaço de brownie.

Ao Murilo, Cassio e Evaldo pelo estágio mais prático e cheio de trabalho que

sentirei falta todos os dias e se pudesse passaria o dia inteiro, com muita microbiologia

passei a amar. São pessoas atenciosas que me ajudaram quando tinha dúvidas, não

foram poucas, pelas risadas que tornaram o estágio o melhor possível.

As minhas amigas de infância Julia Pessolato e Carolina Marques,

acompanhando de camarote a minha formação e stress com a faculdade, me

chamando para relaxar assistindo um filme, comendo hambúrguer, além de conversas

longas que nunca são suficientes.

Sumário

Resumo ......................................................................................................................................6

Abstract .....................................................................................................................................7

Introdução .................................................................................................................................8

Classificação dos TEs ............................................................................................................9

Os elementos Alu ..................................................................................................................10

Elementos Alu como marcadores moleculares .............................................................13

Os elementos Alu em estudos de ancestralidade. ........................................................15

Primeiro estudo de ancestralidade ...................................................................................16

Segundo estudo de ancestralidade ..................................................................................19

Terceiro estudo de ancestralidade ...................................................................................20

Quarto estudo de ancestralidade ......................................................................................21

Conclusão ...............................................................................................................................23

Referências bibliográficas ..................................................................................................23

6

Elementos Alu e o seu papel como marcadores moleculares.

Barbara Luiza Cardanha¹* Ana Paula Pimentel Costa¹

¹Universidade Presbiteriana Mackenzie. *A identificação do autor, formatação do artigo e referências bibliográficas foram feitas segundo a revista Genetics and Molecular Biology.

Resumo

Cerca de 98% do genoma humano é composto por sequências que não codificam proteínas, sendo 42% composto por sequências genéticas moveis, conhecidas como elementos de transposição (TE). Os TEs foram descobertos por Barbara McClinton, em 1940. Eram considerados DNA lixo (junk DNA), entretanto hoje já se sabe que esses elementos são capazes de provocar efeitos no genoma. Diversos elementos de transposição foram descobertos e classificados em duas classes, classe I e classe II. A classe II possui elementos sem LTRs, divididos em LINE e SINE que aparecem antes da radiação humano-chimpanzé estando no genoma de mamíferos a cerca de 100 milhões de anos. Dentro dos elementos SINEs há as sequências Alu e SVA. Os Alu constituem-se de 80 a 300 pares de bases,

existem mais de 1 milhão dessas sequências e essa família representa os elementos de retrotranposição mais comuns em primatas, constituindo aproximadamente 13 % do genoma humano. As diferentes inserções destes elementos no genoma podem ser utilizadas como marcadores de DNA em estudos de análises genéticas populacionais e filogenéticas, desastre em massa, teste de paternidade e criminalística, estudos de origem, história evolutiva e variação gênica em humanos, criar novos kits de marcadores moleculares e observar novos locais de inserção das sequências. O dimorfismo da inserção Alu torna possível a análise por ausência ou presença da inserção. Os marcadores de loci polimórficos das inserções Alu são

caracterizados como informativos de ancestralidade por apresentarem alto diferencial de frequência entre as populações. Sendo o objetivo analisar os TEs como marcadores moleculares. Concluindo, os elementos são eficientes para estudos de evolução, que mostraram serem úteis para identificação da ancestralidade de indivíduos e grupos populacionais, sendo necessário: um conjunto desses elementos para realizar o estudo e outros estudos para identificar novas inserções.

Palavras-chave: Alu, marcador molecular, polimorfismo, ancestralidade, elemento de transposição.

7

Abstract

About 98% of the human genome consists of sequences which don’t encode proteins, composed of 42% mobile genetic sequences, known as transposable elements (TE). TEs were discovered by Barbara McClinton, in 1940. They were considered junk DNA, but today it is known that these elements are capable of causing effects in the genome. Many transposable elements were discovered and classified into two classes, class I and class II. Class II include elements without LTRs divided into SINE and LINE that appeared before the human-chimpanzee radiation being in the genome of mammalian about 100 million years. Within the SINEs elements there are Alu and SVA sequences. The Alu constitute between 80 and 300 base pairs, there are over 1 million of these sequences and this is the most common family retrotranposon elements in primates, constituting approximately 13% of the human genome. The different inserts these elements within the genome can be used as DNA markers in studies of population and phylogenetic, genetic analysis, mass disaster, paternity testing and forensics, source studies, evolutionary history and genetic variation in human, create new molecular markers Kits and watch new places of insertion sequences. The Alu insertion

dimorphism makes possible the analysis of presence or absence of the insert. Markers of polymorphic loci of Alu insertions are characterized as informative of ancestry for their high differential frequency between populations. The aim is analyze TEs as molecular markers. In conclusion, the elements are effective for evolution studies, which have shown to be useful for identification of ancestry of individuals and population groups, requiring a set of these elements to carry out the study and other studies to identify new insertions.

Keywords: Alu, molecular marker, polymorphism, ancestry, transposition element.

8

Introdução

Cerca de 98% do genoma hu-

mano é composto por sequências

que não codificam proteínas. Deste

total, 42% é composto por sequên-

cias genéticas moveis, conhecidas

como elementos de transposição

(TEs) (RAY e BATZER, 2011; ULE,

2013) Estes elementos têm profun-

dos efeitos na estrutura e funciona-

mento do genoma. Os elementos de

transposição são responsáveis, em

parte, por gerar variabilidade gené-

tica. Variabilidade esta gerada como

consequência da capacidade intrín-

seca de mudar de lugar nos geno-

mas em que se encontram associa-

dos (VENNER et al, 2009).

Os TEs foram primeiramente

descobertos por Barbara McClintock

em um estudo analisando o cromos-

somo 9 de milho (Zea mays ssp.

mays), em 1940. Anos após essa

descoberta, com o avanço da tecno-

logia criando a possibilidade de ma-

nipular genes e cromossomos em la-

boratório, estudos aprofundados so-

bre o genoma dos organismos suce-

deram várias descobertas, entre elas

que os TEs também se encontravam

em organismos procariotos (VARANI

et al., 2015).

Segundo Ray e Batzer (2011),

assim como em humanos, estudos

com outros organismos usando o

TE, mais especificamente os retro-

elementos, também começaram,

mesmo que o DNA mitocondrial, mi-

crossatélites e RFLP sejam normal-

mente mais usados. Em plantas, os

retroelementos são muito abundan-

tes podendo chegar, em gramíneas,

a 90% do genoma. Entender a distri-

buição dos TEs nas plantas permite

utilizá-los como marcadores informa-

tivos sobre a diversidade genética

em programas de melhoramento ge-

nético (YADAV et al., 2014)

Inicialmente, os TEs eram

considerados “DNA lixo” (junk DNA)

(DRIDI, 2012) que estavam sendo

transmitidos de geração a geração,

pois não haviam evidências de que

essas sequências exerciam alguma

função útil, portanto pensava-se que

o objetivo das sequências era so-

breviver no genoma hospedeiro.

Com o avanço da tecnologia, avan-

ços no conhecimento dos genomas,

tanto de procariontes como de euca-

riontes, e a possibilidade sequenciar

genoma completos facilitaram ava-

9

liar a contribuição dos TEs para o ge-

noma (DIAS; CARARETO, 2015).

Hoje em dia já se sabe que essas se-

quências contribuem para a evolu-

ção dos organismos (NAHUM, 2012)

e para o aumento da complexidade

do genoma, influenciando no número

de genes e vias de regulação gênica.

Esses elementos são capa-

zes de provocar efeitos no genoma,

como recombinação entre cromáti-

des irmãs, cromossomos homólogos

e não homólogos causando dele-

ções, duplicações, inversões e trans-

locações, agindo como elementos

reguladores de transcrição e sítios

de poliadenilação (NAHUM, 2012)

sem necessidade de se moverem

para provocar algum efeito, eles tam-

bém são importantes para a evolu-

ção. Já foram descritos eventos de

impacto nos genes através de vias

alternativas de regulação, exons e

splicing (DIAS; CARARETO, 2015;

Jurka, 1995; Speek, 2001; Nigumann

et al., 2002; Kazazian, 2004;

Peaston et al., 2004; Matlik et al.,

2006; Babushok et al., 2007; Hasler

et al., 2007 apud RAY e BATZER,

2011).

Apesar de poderem causar

tantos problemas, a facilidade de se

adaptarem impede que os TEs se-

jam completamente eliminados e já

se sabe que eles possuem um papel

importante na variabilidade genética,

na qual a seleção natural consegue

atuar (RAY; BATZER, 2011).

Neste contexto, o objetivo

deste trabalho é analisar o papel dos

TEs, como marcadores moleculares,

tendo como exemplo os elementos

Alu.

Classificação dos TEs

Diversos elementos de trans-

posição foram descobertos e classi-

ficados em duas classes. A classe I

também chamados de retrotrans-

ponsons ou retroelementos, que de-

pende do RNA para serem copiados

e se inserirem em um novo local no

genoma, e a classe II também deno-

minados como transponsons ou

transponsons de DNA, que depen-

dem do DNA. Os retroelementos po-

dem apresentar ou não longas termi-

nações repetidas diretas em suas

terminações (do inglês Long Termi-

nal Repeat – LTRs) (VARANI et al.,

2015) (Figura 1).

10

Figura 1. Esquema dos elementos de transposição mediados por DNA e RNA, com e sem LTR. Adaptado de Feschotte; Jiang; Wessler (2002).

Os elementos sem LTRs são

divididos em elementos nucleares in-

terdispersos longos ou curtos (do in-

glês, LINE – Long Interspersed Nu-

clear Element e SINE – Short Inters-

persed Nuclear Element, respectiva-

mente), sendo que ambos apresen-

tam uma sequência poli-A em uma

de suas terminações e aparecem an-

tes da radiação humano-chimpanzé

estando no genoma de mamíferos a

cerca de 100 milhões de anos

(GARCIA; GAIESKY, 2015). Esses

elementos sem LTRs possuem se-

quências que são recentes e, por

isso, consideradas polimórficas.

Além disso, são específicas de hu-

manos, o que os tornam potenciais

marcadores moleculares (RAY e

BATZER, 2011).

Os elementos SINEs são pe-

quenos, compostos de 80 a 500 pa-

res de bases, e os exemplos encon-

trados no genoma humana são as

sequências Alu e SVA (VARANI et

al., 2015).

Os elementos Alu

Os elementos Alu constituem-

se de 80 a 300 pares de bases, não

são codificadoras, possuindo uma

taxa de 1 a cada 50 meioses, por-

tanto existem mais de 1 milhão de

sequências Alu no genoma humano

(MEDINA; CARARETO, 2015), essa

família representa os elementos de

retrotransposição mais comuns em

primatas, constituindo aproximada-

mente 13% do genoma humano.

Acredita-se que as primeiras inser-

ções destes elementos no genoma

de primatas tenham ocorrido a 65 mi-

lhões de anos (CORDAUX et al.,

2004), tornando-se o mais bem-su-

cedido elemento móvel do genoma

humano (CORDAUX et al., 2004 e

MEDINA; CARARETO, 2015).

11

Sabe-se que os elementos

Alu são constituídos de um monô-

mero esquerdo com 100 nucleotí-

deos e um direito com 200 nucleotí-

deos, que se mantem juntos por uma

sequência rica em adenosina e ter-

minando com uma cauda poli-A,

sendo que cada subunidade se origi-

nou das terminações 5’ e 3’ do 7SL

RNA (DRIDI, 2012), este dímero

contribuiu para a origem dos prima-

tas (GARCIA; GAIESKY, 2015). Es-

ses elementos não são autônomos,

isto é, dependem de enzimas que os

elementos LINEs, geralmente da fa-

mília L1 (GARCIA; GAIESKY, 2015),

codificam para poderem realizar a

transposição (VARANI et al., 2015).

Por causa das diferenças que

ocorreram nas sequências mestres

durante a evolução, foram criadas fa-

mílias (Old, Intermediate e Young) e

subfamílias. A família Young (Y) é a

que contem mais sequências

inseridas recentemente, não fixadas,

específicas de humanos. O

polimorfismo dessa família é

apresentado como alelos, sendo que

a falta da inserção corresponde ao

estado ancestral. Portanto, as inser-

ções presentes em indivíduos dife-

rentes demostram que, provavel-

mente, eles possuem o mesmo an-

cestral, no qual ocorreu a inserção,

pois a probabilidade de dois elemen-

tos independentes se inserirem no

mesmo local no genoma é pratica-

mente nulo (TERREROS, et al.,

2009).

As diferentes inserções des-

tes elementos no genoma geraram

diferentes polimorfismos, que podem

ser utilizados como marcadores de

DNA em estudos de populações hu-

manas (AYARPADIKANNAN, et al,

2014) por causa de sua mobilização

conservativa, sendo mais estável,

portanto útil como marcador molecu-

lar (KUROKI; SETTA, 2015). Anali-

sando o polimorfismo da inserção

Alu é possível estudar a diversidade,

origem e estrutura do genoma da

população mundial (BATZER;

DEININGER, 2002), assim como es-

tudar doenças ligadas aos genes

(CHEN et al., 2005 apud CORDAUX

et al., 2007).

As inserções de novas se-

quências têm se mostrado constante

ao longo da evolução humana,

sendo possível obter diferentes com-

preensões sobre a história evolutiva

dos humanos dependendo da idade

da inserção. Há estudos que discu-

tem questões filogenéticas populaci-

onais globais e regionais, demons-

trando que as sequências Alu são

12

ótimos marcadores para a reconstru-

ção da história evolutiva das popula-

ções, o que levou a uma forte crença

de que a origem dos seres humanos

atuais veio da África (TERREROS, et

al., 2009).

Esses elementos também

possuem o potencial de intervir na

expressão dos genes humanos de

várias formas, podendo contribuir

para rearranjos cromossômicos cau-

sando deleções, inversões e duplica-

ções através da recombinação de

elementos de transposição homólo-

gos em regiões diferentes nos cro-

mossomos. Apesar do impacto posi-

tivo na evolução que os elementos

de transposição provocaram, a inser-

ção em uma região pode afetar a ex-

pressão do gene. Mesmo que

poucas inserções Alu sejam

encontradas na região 5’ não

codificante ou nos éxos de genes,

evidenciando que essas sequências

nesses locais são prejudiciais as fun-

ções dos genes, sabe-se que 60 do-

enças são associadas as sequências

Alu, sendo que uma dessas doenças

é o câncer (MEDINA; CARARETO,

2015).

Existe relação dessas se-

quências com a recombinação ho-

mologa, tanto intracromossômica

quanto intercromossômica; com a

expansão do genoma, pois as se-

quências Alu estão presentes em

maior número de cópias no genoma

do que as sequências L1 (GARCIA;

GAIESKY, 2015). Também estão

presentes em regiões promotoras de

genes, assim como podem ser uma

proteção para os genes contra a

cromatina condensada adjacente

(DIAS; CARARETO, 2015).

Os retroelementos Alu têm se-

quências que podem ser sítios de

splice que, se reconhecidos pelas

enzimas que realizam o splicing, se

tornam um splicing alternativo se es-

tiverem inseridos em um gene. Os

Alu podem afetar a expressão gênica

de várias formas, entre elas há a adi-

ção de Alu exônicos em regiões co-

dificantes que servem como fonte de

diversidade de proteínas funcionais

e a função de controle de qualidade

em que a edição de IRAlus (Alus pre-

sentes em transcritos de mRNA em

orientação invertida) previne que

RNAs mal editados cheguem ao

citoplasma (DIAS; CARARETO,

2015).

13

Elementos Alu como marcadores

moleculares

Em geral, os TEs podem ser

utilizados como marcadores molecu-

lares para estudos de análises gené-

ticas populacionais e filogenéticas,

desastre em massa, teste de pater-

nidade e criminalística, estudos de

origem e variação gênica em huma-

nos, principalmente em relação aos

retroelementos. O polimorfismo das

inserções dos TEs permite que o

pesquisador tenha uma maior preci-

são do que com outros marcadores

genéticos como polimorfismos de um

único nucleotídeo (em inglês: single

nucleotide polymorphisms – SNPs),

microssatélites, polimorfismo do

DNA mitocondrial (RAY; BATZER,

2011) e short tandem repeats (STRs)

(Mamedov et al., 2010). Além de

usar essas sequências para estudos

populacionais, elas também são uti-

lizadas nas análises forenses para a

identificação de um indivíduo ou de

um grupo. Há estudos, como os de

Bamshad et al. (2003), Witherpoon

et al. (2006) e Watkins et al. (2003)

(apud RAY e BATZER, 2011), que

utilizam os retrotransponsos para

agrupar populações, pesquisar as

origens humanas e migrações; ou-

tros pesquisadores tem feito a geno-

tipagem de indivíduos desconheci-

dos identificando sua ancestrali-

dade, o que pode ser útil para inves-

tigações criminais.

Apesar dos estudos serem

promissores, a quantidade de poli-

morfismo na população dificulta a

identificação das inserções. Entre-

tanto, pesquisas como a de Ewing e

Kazazian (2010) (apud RAY e

BATZER, 2011) têm identificado e

mapeado novas inserções.

Cada Alu é proveniente de um

único evento de retrotranposição que

ocorreu nos primatas. Depois dessa

transposição inicial, as sequências

são herdadas segundo padrão men-

deliano. A maioria das inserções Alu

aconteceu há milhões de anos e es-

tão fixadas, isso significa que, em um

locus em particular, todos os prima-

tas têm a sequência Alu em cada um

dos pares de cromossomos. Entre-

tanto, centenas de Alu tem se inse-

rido no genoma desde a evolução de

primatas para os humanos, conse-

quentemente algumas inserções não

são fixadas, o que significa que se

pode ter ou não a presença da se-

quência em cada um dos pares de

cromossomos, dessa forma cria-se

dois possíveis alelos (presença [+]

e/ou ausência [-]) (DEININGER;

14

BATZER, 1999). Essa forma de ana-

lisar, pela presença e ausência da

sequência em um determinado lo-

cus, permite estudar a descendência

por causa dos potenciais locais para

a inserção dessa sequência e por-

que se sabe que no ancestral antigo

o estado da inserção é a sua ausên-

cia (Figura 2) (RAY; BATZER, 2011).

Figura 2. Ilustração da presença e ausência da inserção Alu. Maternal – cromossomo com a inserção; Paternal – cromossomo sem a inserção; Setas pretas indicando como o resultado do gel da eletroforese é analisado. Adaptado de Dna Kit Learning Center (2006).

Assim esse dimorfismo da in-

serção Alu, em um estudo feito por

Batzer et al. (1994) usando quatro

loci polimórficos das inserções Alu

(TPA25, ACE, APO, PV92), onde

eram analisadas ausência ou pre-

sença da inserção, demonstrou que

este polimorfismo era útil para o es-

tudo genético de populações. Ray et

al. (2005) analisou 100 loci polimórfi-

cos da inserção Alu, para determinar

a ancestralidade das amostras de

DNA de 18 pessoas geografica-

mente aleatórias, classificando es-

sas amostras em quatro grandes

grupos populacionais do mundo. Um

estudo feito na Rússia pelo

Solovieva et al. (2009) foi usado

cinco loci polimórficos (ACE,

APOA1, B65, PV 92, TPA25) das in-

serções Alu para se determinar a fre-

quência das inserções na população

russa e determinar a ancestralidade

de 10 populações de diferentes par-

tes da Rússia. Foram observadas di-

ferentes frequências dos alelos nas

diferentes populações, indicando

que as inserções Alu são ótimos

marcadores para se estudar a evolu-

ção humana e a migração. Vários

trabalhos têm demonstrado a aplica-

bilidade das inserções Alu neste tipo

de estudo.

No Brasil, Marrero et al.

(2007) realizou estudos usando a

sequência Alu para investigar a his-

tória evolutiva de uma população do

sul do país (os habitantes da região

15

do Pampa em comparação com po-

pulações correspondentes da Argen-

tina e Uruguai). Em um estudo ante-

rior, Cotrim et al. (2004) analisou

quatro loci polimórficos Alu (APO,

ACE, TPA25 e FXIIIB) para

caracterizar grupos de quilombolas

do Vale do Ribeira. No trabalho de

Mendes-Junior e Simões (2001), fo-

ram analisadas as inserções de 3

loci polimórficos (TPA25, PV 92,

APO) de inserção Alu em uma

população urbana do sudeste do

Brasil para caracterizar a

composição étnica dessa população.

Deste modo, o polimorfismo

da inserção Alu mostrou-se como um

importantíssimo marcador nos estu-

dos de populações em escalas glo-

bais (BATZER et al., 1996;

STONEKING et al., 1997; CARROLL

et al., 2001; ROY-ENGEL et al.,

2001) e regionais (BATTILANA et al.,

2006; NASIDZE et al., 2001; XIAO et

al., 2002; KHUSAINOVA et al., 2004;

SOLOVIEVA et al., 2009), assim

como é útil para teste de paternidade

(NOVICK et al., 1995; Mamedov et

al., 2010) e para análises forenses

(NOVICK et al., 1993;RAY et al.,

2005). Dessa forma, é importante co-

nhecer as inserções que são dividi-

das entre indivíduos de uma ou mais

populações para aplicações científi-

cas.

A população brasileira consti-

tui um dos grupos mais heterogê-

neos do mundo, como resultado de

cruzamentos interétnicos entre euro-

peus, africanos, ameríndios e asiáti-

cos (ALVES-SILVA et al, 2000). As-

sim a pesquisa dos polimorfismos

das inserções Alu mostra-se

bastante relevante, pois resulta em

dados importantes sobre a ances-

tralidade genética e a contribuição

de cada grupo étnico na formação da

nossa população.

Os elementos Alu em estudos de

ancestralidade.

Segundo a literatura, muitos

dos marcadores de loci polimórficos

das inserções Alu são caracteriza-

dos como informativos de ancestrali-

dade por apresentarem alto diferen-

cial de frequência entre as popula-

ções. Com a formação de uma popu-

lação miscigenada, espera-se que a

frequência de qualquer locus, defini-

dos como marcadores que apresen-

tam frequências extremas e distinti-

vas entre populações diferenciadas

por fatores étnicos ou geográficos,

atinja valores diferentes ao encon-

trado nas populações parentais

(TELÓ, 2010).

16

Destacamos a seguir, quatro

trabalhos que utilizam as sequências

Alu, para assim exemplificar seu

emprego em estudos de ances-

tralidade.

Primeiro estudo de ancestrali-

dade

Em seu estudo, Terreros et al.

(2009) tem o objetivo de analisar o

perfil genético de seis populações

africanas, quatro asiáticas e duas

europeias utilizando 27 polimorfis-

mos Alu para entender a história

evolutiva dos humanos. Eles tam-

bém usaram marcadores de ances-

tralidade, conhecidos como alelos

específicos das populações, capa-

zes de diferenciar populações, po-

dendo ser úteis para determinar a

ancestralidade biogeográfica de gru-

pos e indivíduos. Levou em conta

que essas 12 populações represen-

tam os três grandes grupos étnicos

mundiais.

Foram coletadas 563 amos-

tras de sangue das seguintes popu-

lações: Norte da África, África Orien-

tal, Centro da África, África Ociental,

Ásia e Europa. A ancestralidade foi

rastreada até duas gerações.

Os resultados mostram que

os loci são polimórficos nas popula-

ções, com algumas exceções como

no caso da inserção APO, cuja pre-

sença está fixada na população de

Marrocos e Ami, e A25 e TCR que a

ausência está fixada na população

de Ami. Com relação a heterozigose,

o maior valor encontrado foi na África

(0.309), seguida da Ásia (0.288) e

Europa (0.268). O grupo de cientis-

tas também construíram uma árvore

filogenética (Figura 3) que coincide

com a distribuição geográfica das

populações estudadas.

17

Figura 3. Árvore filogenética baseada em 1000 repetições. Mostrando a distância genética, em porcentagem nos nódulos, entre as populações de acordo com as 27 inserções estudadas. Grupo subsaariano – CAM (Camarões), BEN (Benin), RWA (Ruanda), KEN (Quênia); AMI (Ami); MAD (Madras); Grupo formado com as demais populações – EGY (Egito), GAL (Galicia), MOR (Marrocos), OMN (Omã), GEO (Georgia) e UAE (Emirados Árabes). Adaptado de Terreros et al. (2009).

Na árvore é possível perceber

que os grupos populacionais subsa-

arianos possuem poucas diferenças

geográficas e genéticas estando se-

parados do resto das populações.

Quando se analisa as populações de

Galicia, Marrocos, Emirados Árabes,

Omã, Egito, Georgia e Madras, ob-

serva-se uma proximidade genética

maior que a esperada considerando

o modelo de isolamento por distân-

cia. Já a população Ami se mostra

afastada das demais populações,

18

provavelmente por causa do isola-

mento e tamanho da população, acu-

mulando frequências alélicas com

tendência para fixação.

A diferença entre os grupos

do norte da África e a África subsa-

ariana deve-se, provavelmente, a

presença do deserto do Saara, que

atua como uma provável barreira fí-

sica para o fluxo gênico, diferenci-

ando a composição genética do con-

tinente africano. Por isso a proximi-

dade das populações europeia, asiá-

tica e do norte da África é evidenci-

ada no estudo, que provavelmente

se deve ao efeito de homogeneiza-

ção do fluxo gênico causado pela co-

nexão do corredor de Levantine e do

Corno da África, usadas para migra-

ção humana. Além disso, o norte da

África, a Península Arábica e a re-

gião do Cáucaso se mostram como

ponto chave para a dispersão gênica

e migração do homem para a África

e Eurásia, dando suporte a teoria de

origem do homem moderno ter vindo

da África.

Analisando a média das fre-

quências, em porcentagem, dos ale-

los entre os grupos das populações

subsaariana, europeia e asiática ob-

serva-se que a diferença entre as po-

pulações subsaariana e asiática é de

15,9%, entre a europeia e subsaari-

ana é de 16,3% e entre a asiática e

europeia é de 6,1%.

Os dados mostram que a vari-

ação tende a ser geográfica que en-

tra em acordo com padrões históri-

cos de fluxo gênico e deriva gené-

tica, que são dois fatores importan-

tes para a composição genética dos

grupos principalmente por causa do

isolamento parcial e a migração, e

consequentemente mistura, que a

população humana sofreu ao longo

da história evolutiva, esse estudo re-

vela que os marcadores são sensí-

veis a esses eventos.

Os polimorfismos dos alelos

A25, APO, COL3A1, NBC4, Sb19.3

e NBC6 podem distinguir subsaaria-

nos de asiáticos e de europeus;

Sb19.10, F13B, HS4.32 e HS4.75

são uteis para comparar subsaaria-

nos e asiáticos e o PV92 para dife-

renciar asiáticos de europeus. Entre-

tanto, alguns valores baixos do teste

de fixação mostram que nem todas

as inserções são aconselháveis para

estudos nas populações, como é o

caso das inserções HS469 e NB60.

Todas essas sequências podem ser

usadas como marcadores molecula-

res de ancestralidade (AIM). As se-

quências F13B, Sb19.10 e NBC6

19

mostram maiores diferenças nas fre-

quências alélicas entre as popula-

ções por causa do alto valor de

fixação, portanto os marcadores

Sb19.10 e NBC6 podem ser inclusos

na lista de AIM.

Segundo estudo de ancestrali-

dade

Mamedov et al. (2010) desen-

volveu um novo conjunto de mar-

cadores moleculares para identifica-

ção humana baseados em retroele-

mentos polimórficos, usando 32 ele-

mentos da família Alu Y, sendo que

o resultado a ser analisado é a pre-

sença e ausência da inserção.

O polimorfismo Alu pode apre-

sentar diferente distribuição na popu-

lação humana segundo a etnia ou

estar presente em vários grupos ét-

nicos. Em seu estudo, Mamedov et

al. (2010) usa os resultados encon-

trados comparando-os com um

banco de dados, criado pelos auto-

res, que contém informações das in-

serções encontradas neste estudo e

em outros realizados em outros paí-

ses, contendo informações da locali-

zação, frequência na população e re-

ferências das sequências Alu Y.

Para selecionar as inserções

Alu foram utilizados critérios como

existir em um loci com pouca distri-

buição em outras regiões do ge-

noma, pouca ou nenhuma repetição

perto da inserção escolhida e fre-

quência intermediária na população,

no final foram 18 elementos escolhi-

dos do cromossomo 1 ao 9, um do

cromossomo 10 ao 22 e um mesmo

elemento no cromossomo X e Y. A

figura quatro mostra um exemplo do

gel de eletroforese de um indivíduo

utilizando os 32 primers.

Figura 4. Gel de eletroforese da PCR dos 32 pri-mers do genoma de um indivíduo. Setas pretas – presença da inserção; Seta branca – ausência da inserção. Adaptado de Mamedov et al. (2010).

20

Os autores analisaram as inserções

de 90 indivíduos russos (Ucrania,

Mordóvia, República da Kalmykia,

República de Komi e Moscou) sem

relação de parentesco e geografica-

mente distantes. Os resultados mos-

traram variação na frequência da

presença e ausência da inserção de

0.29: 0.71 e 0.74: 0.26, respectiva-

mente, porém para cada população

a variação foi de 0.075: 0.925 e 0.8:

0.2 evidenciando que cada popula-

ção tem as suas particularidades.

Isso mostra que esse conjunto de se-

quências Alu são funcionais para a

identificação de indivíduos. Além

disso, foram realizados teste de

paternidade com 6 famílias com

variação da probabilidade entre

99.9571% e 99.4655%, mostrando

que esses retroelementos também

podem ser usados nesse teste.

Terceiro estudo de ancestralidade

Em seu trabalho, Pereira et al.

(2006) analisou uma inserção Alu

presente dentro de uma inserção

LINE-1 no cromossomo X. As amos-

tras foram fornecidas pela Founda-

tion Jean Dausset, Paris, França. As

684 amostras, todas de homens, re-

presentam os cinco continentes a

partir de sete grupos regionais

(África, Oceania, América, Europa,

Oriente Médio, Ásia Central e do Sul)

e 34 amostras de Ameríndios (25

Ticuna do Brasil e 9 Muskoke dos

Estados Unidos) fornecidas pelo Dr.

Judith Kidd da Universidade de Yale,

em 2006. A família Alu utilizada foi a

Ya5/8, sendo a família mais polimór-

fica descrita, a identificação é pela

presença e ausência.

As amostras da África, Brasil

e Ásia a inserção é de 454bp e a au-

sência é de 142bp, enquanto que as

amostras dos nativos americanos

não apresentam a inserção da se-

quência. Uma questão interessante

apresentada foi a presença de duas

bandas em algumas amostras

(Figura 5), por serem todas de indiví-

duos do sexo masculino e só apre-

sentam um cromossomo X, prova-

velmente a presença da segunda

banda se dá por causa da sequência

Alu estar inserida em um retroele-

mento L1. Com a PCR, os primers

usados possivelmente amplificam

outra sequência homologa da L1

presente no genoma, o que se torna

uma dificuldade para diferenciar as

amostras femininas homozigotas

com a inserção das heterozigotas

utilizando a PCR convencional, en-

tretanto a PCR em tempo real pode

distinguir as amostras quantitativa-

mente.

21

Figura 5. Gel de eletroforese mostrando as duas bandas evidenciadas nas amostras de homens. 1 – Marcador; 4 – Negativo; 8, 9, 12, 14, 16, e 17 – Duas bandas amplificadas; 2, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 13, 15, 18, 19 – apenas uma banda amplificada. 454 bp – inserção; 142 bp – sem a inserção. Adaptado de Pereira et al. (2006).

O DXS225, nome da inserção

Alu, apareceu nas sete regiões ana-

lisadas. As frequências encontradas

pelos autores foram 0.256 na África,

0.407 no Oriente Médio, 0.347 na

Ásia Central, 0.257 na Oceania,

0.190 na Europa e 0.360 na América,

sendo que a frequência em cada

grupo também é apresentada no tra-

balho. Ao fazerem as análises esta-

tísticas, descobriram que 92,2% da

variabilidade é, provavelmente, entre

os indivíduos das populações, que

5% da variação dentro dos grupos

regionais se dá pela diferença entre

as populações e que 2,7% da varia-

ção pode ser justificado pela dife-

rença entre os grupos regionais. Já

nos ameríndios, somente nos

Karitiana que a inserção foi encon-

trada por causa do contato com eu-

ropeus e africanos, porém nas outras

quatro populações estudadas não se

observou a inserção, indicando que

essa sequência pode ser usada em

estudos de cruzamento de popula-

ções. Além disso, como a inserção

Alu está dentro de uma L1 e está cer-

cado por dois microssatélites que

não estão em equilíbrio, ela poderia

ser usada para estudos da evolução

humana.

Quarto estudo de ancestralidade

Rocañín-Arjó et al. (2013)

estudou o grupo Yakuts da Sibéria,

fornecendo novos dados genéticos

sobre a população analisando

sequências Alu de cromossomos

autossômicos e cromossomo X,

podendo avaliar a heterogeneidade

entre a região central e oeste da

população e comparar com os

siberianos e não siberianos, para

examinar a origem do grupo Yakuts.

Importante para entender o processo

migratório desse grupo.

Foram usados 12 inserções

em cromossomos autossômicos e 8

inserções no cromossomo X. O es-

tudo utilizou 161 amostras, sendo 35

do Centro e 126 do Oeste da

Yakutia. O DNA foi isolado de amos-

tras de sangue e saliva.

Em relação aos cromossomos

autossômicos, a comparação com

18 amostras da Eurásia agrupadas

em 4 regiões conforme a geografia e

origem: Sibéria, Ásia Central,

Cáucaso do Norte e Volga-Ural, foi

baseada em oito inserções Alu e a

comparação com o cromossomo X

foi feita com 10 populações mundiais

da Bolívia, Europa, Norte da África e

África subsaariana, também utili-

zando oito elementos.

Os pesquisadores observa-

ram uma homogeneidade genética

entre os Yakuts do Oeste e a Sibéria

(proximidade genética entre os gru-

pos Yakuts do Oeste e os Kalmykia)

através das sequências automossô-

micas, tornando difícil saber quanta

influencia a população estudada teve

do povo do Lago Baikal e/ou quanta

influencia veio da mistura de popula-

ções do Norte. Os dados encontra-

dos evidenciam maior contribuição

de Evenks comparado com Kazakhs,

Uyghurs e Uzbeks. Além disso, a dis-

tância genética entre Yakuts e os

grupos da montanha Altaian não

sustenta a hipótese de que a origem

da população Yakuts seja dessa po-

pulação [montanha Altaian]. Entre-

tanto, segundo Friedlandler et al.

(2008) (apud Rocañín-Arjó et al,

2013) poucas amostras, ou amostra-

gem inadequada, dificulta propor a

origem e relação genética da popu-

lação, por isso a população Evens,

que compartilha o território com

Evenks e Yakuts, e Tuvinians, grupo

turco que vive no sul da Sibéria,

acrescentariam importantes informa-

ções por estarem relacionadas com

Yakuts baseando-se nas análises de

DNA mitocondrial.

Em relação as inserções Alu

do cromossomo X, os resultados de-

vem ser analisados cuidadosa-

mente, pois a falta de dados dos gru-

pos geográficos e historicamente re-

lacionados impossibilita a correta in-

terpretação dos dados obtidos.

Dessa forma, seriam necessários

mais estudos para poder entender a

origem dessa população.

Conclusão

Portanto é possível concluir

que os elementos de transposição

têm se mostrado eficientes para es-

tudos de evolução, principalmente as

inserções Alu que mostraram serem

úteis para identificação da ancestra-

lidade de indivíduos e grupos popu-

lacionais, pois as diferentes frequên-

cias de cada inserção na população

ou se o indivíduo possui ou não a in-

serção condiz com uma origem dife-

rente. Além de estudos de perfil ge-

nético, origem demográfica e relação

entre as populações. A facilidade de

trabalhar com essas inserções,

sendo um método informativo e con-

fiável, tem levado os pesquisadores

a usa-las como alternativas para o

DNA mitocondrial, SNP, SRT e mi-

crossatélites. Tornando possível uti-

lizar essas sequências para análises

forenses e testes de paternidade.

Entretanto, é necessário um

conjunto desses elementos para rea-

lizar o estudo, pois somente uma

sequência não é suficiente para ana-

lisar a ancestralidade. Se o estudo ti-

ver o objetivo de caracterizar uma

população, também é importante ter

uma quantidade de amostras acima

de 100.

Ainda são necessários mais

estudos para a identificação de no-

vas sequências Alu, por causa da

sua mobilidade, novas sequências

se inserem em outros lugares no ge-

noma podendo agregar sequências

para estudos de ancestralidade ou

causar doenças como consequência

do rearranjo cromossômico que elas

podem provocar.

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