Aus dem Medizinis logie d
Geschäftsfüh
UntersuchVermehru
zur Erlangu
ded
chen Zentrum für Hygiene und Infektionsbioer Philipps-Universität Marburg
Institut für Virologie render Direktor: Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk
ungen zur Rolle des VP24 im ngszyklus des Marburgvirus
Inaugural-Dissertation ng des Doktorgrades der Humanbiologie
(Dr. rer. physiol.)
m Fachbereich Humanmedizin er Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Sandra Bamberg aus Koblenz
Marburg, August 2004
Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von Januar 2001 bis Juli 2004
am Institut für Virologie des Medizinischen Zentrums für Hygiene und
Infektionsbiologie unter der Leitung von Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk durchgeführt.
Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg am Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs. Dekan: Herr Prof. Dr. Bernhard Maisch Referent: Herr Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk Koreferent: Herr Prof. Dr. Jacob
Inhaltsverzeichnis 1
Inhaltsverzeichnis 1
1 Einleitung 7
1.1 Taxonomie und Epidemiologie der Filoviren 7
1.2 Klinik und Pathogenese der MARV-Infektion 10
1.3 Morphologie des Marburgvirus 12
1.4 Genomstruktur des Marburgvirus 13
1.5 Die viralen Proteine 13
1.6 Der Replikationszyklus des Marburgvirus 17
1.7 Die Funktion der Matrixproteine bei Mononegavirales und Retroviren 18
1.8 RNA Interferenz (RNAi) 19
1.9 Fragestellung 21
2 Material 22
2.1 Chemikalien 22
2.2 Verbrauchsmaterialien 24
2.3 Kits 25
2.4 Geräte 25
2.5 Puffer und Lösungen 27
2.5.1 Puffer 27
2.5.2 Lösungen 31
2.6 Wachstumsmedien 32
2.6.1 Wachstumsmedien für Bakterien 32
2.6.2 Wachstumsmedien für Säugerzellen 32
2.7 Nukleinsäuren und Nukleotide 33
2.7.1 Nukleinsäuren als Größenmarker 33
2.7.2 Sonstige Nukleinsäuren und Nukleotide 33
2.7.3 siRNA-Sequenzen 33
2.7.4 DNA-Oligonukleotide (Primer) 34
2.8 Vektoren und rekombinante Plasmide 35
Inhaltsverzeichnis 2
2.8.1 Vektoren 35
2.8.2 Rekombinante Plasmide 35
2.9 Proteine 36
2.9.1 Enzyme 36
2.9.2 Antikörper 37
2.9.3 Proteine, Peptide und Aminosäuren 38
2.10 Radioaktiv markierte Substanzen 38
2.11 Zellen und Viren 38
2.11.1 Prokaryotische Zellen 38
2.11.2 Eukaryotische Zellen 38
2.11.3 Viren 38
3 Methoden 39
3.1 Molekularbiologische Methoden 39
3.1.1 Isolierung und Reinigung von DNA 39
3.1.1.1 Reinigung von DNA-Fragmenten >100 bp 39
3.1.1.2 Isolierung von DNA aus Agarosegelen 39
3.1.1.3 Ethanolfällung 39
3.1.2 Analyse von DNA 40
3.1.2.1 Elektrophoretische Auftrennung 40
3.1.2.1.1 Präparative DNA-Agarosegele 40
3.1.2.1.2 Analytische DNA-Agarosegele 40
3.1.2.2 Quantifizierung von DNA 40
3.1.2.3 Sequenzanalyse mit dem ABI PrismTM 377 DNA Sequencer 41
3.1.3 Klonierung und Mutagenese von DNA 42
3.1.3.1 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen 42
3.1.3.2 Dephosphorylierung linearisierter DNA 43
3.1.3.3 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen mittels Polymerase-
Ketten-Reaktion (PCR)
44
Inhaltsverzeichnis 3
3.1.3.4 Ligation von DNA-Fragmenten in linearisierte Vektoren 45
3.1.3.5 Ortsgerichtete Mutagenese von Plasmid-DNA 46
3.1.3.6 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA 47
3.1.4 Vervielfältigung von DNA 47
3.1.4.1 Plasmidpräparation im kleinen Maßstab (Miniprep) 47
3.1.4.2 Plasmidpräparation im großen Maßstab (Maxiprep) 47
3.1.5 Reinigung und Analyse von RNA 48
3.1.5.1 Reinigung von viraler RNA aus Zellkulturüberstand 48
3.1.5.2 Quantifizierung von RNA und siRNAs 48
3.1.6 Real-time RT-PCR Analyse mittels SYBR Green dye I 48
3.2 Zellbiologische Methoden 49
3.2.1 Kultivierung von HeLa-, HEK293- und Vero-Zellen 49
3.2.2 Transfektion von HEK293-Zellen mit Lipofectamine PlusTM 50
3.2.3 Zellernte für Flotationsanalysen und Triton X-114 Phasen
Partitionierung
51
3.2.4 Ernte und Aufreinigung von Zellkulturüberstand zur Analyse
freigesetzter Proteine in Form von virusähnlichen Partikeln (VLPs)
51
3.2.5 Transfektion von Vero-Zellen mit LipofectamineTM 2000 52
3.2.6 Transfektion von siRNAs in MARV-infizierte Vero-Zellen 52
3.2.7 Ernte von Vero-Zellen sowie Zellkulturüberständen nach siRNA-
Behandlung
53
3.2.8 Das Vaccinia-Virus-Expressionssystem 54
3.2.8.1 Infektion und Transfektion von HeLa-Zellen 54
3.2.8.2 Fixierung von Zellen durch Paraformaldehyd und Permeabilisierung
mittels Triton X-100
54
3.3 Biochemische und immunologische Methoden 55
3.3.1 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen und deren
Visualisierung
55
3.3.1.1 SDS-PAGE 55
Inhaltsverzeichnis 4
3.3.1.2 Coomassie-Färbung 56
3.3.1.3 Autoradiographie 56
3.3.1.4 Elektrotransfer von Proteinen (Western Blot) 56
3.3.1.5 Entfernung von gebundenen Antikörpern von bereits analysierten
PVDF-Membranen
58
3.3.2 Indirekte Immunfluoreszenzanalyse 58
3.3.3 In vitro Translation 59
3.3.4 Immunpräzipitation 60
3.3.5 Behandlung von VLPs mit Proteinase K 61
3.3.6 Untersuchungen zur Membranassoziation von Proteinen 62
3.3.6.1 Flotationsanalyse im nichtlinearen Saccharose-Gradienten 62
3.3.6.2 Charakterisierung der Membranassoziation 62
3.3.6.3 Triton X-114 Phasenpartitionierung 63
3.3.7 Bakterielle Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen 64
3.3.7.1 Klonierung und bakterielle Expression von GST-VP24 64
3.3.7.2 Kopplung des GST-VP24 an Glutathion-Sepharose 65
3.3.8 Immunisierung von Kaninchen und Meerschweinchen 65
3.3.8.1 Präparation des GST-VP24-Fusionsproteins 65
3.3.8.2 Immunisierung 66
3.3.8.3 Aufbereitung der Seren und Antikörpernachweis 66
3.3.9 Affinitätsreinigung des VP24-Antikörpers 67
4 Ergebnisse 68
4.1 Immunfluoreszenzanalysen zur intrazellulären Lokalisation von
VP24
68
4.1.1 Klonierung Epitop-markierter VP24-Mutanten 68
4.1.2 Immunfluoreszenzanalysen der Epitop-markierten VP24-Mutanten 70
4.1.3 Herstellung und Aufreinigung von VP24-spezifischen Antikörpern 71
4.1.4 Immunfluoreszenzanalyse des VP24 72
Inhaltsverzeichnis 5
4.2 Untersuchungen zur Membranassoziation von VP24 73
4.2.1 Interaktion von VP24 mit zellulären Membranen 73
4.2.2 Charakterisierung der Membraninteraktion 75
4.2.3 Membranassoziation von VP24 in Anwesenheit von VP40 oder GP 76
4.2.3 Untersuchungen zur Membranintegration des VP24 77
4.3 Bildung von virusähnlichen Partikeln (VLPs) 79
4.3.1 Bildung von VLPs durch Einzelexpression von VP40, GP und VP24 80
4.3.2 Koexpression von VP24, VP40 und GP in äquivalenten Mengen zur
Virusinfektion
82
4.3.2.1 Einfluss des VP24 auf die Expression von VP40 und GP 82
4.3.2.2 Expression von VP24, VP40 und GP in äquivalenten Mengen zur
MARV-Infektion
83
4.3.3 Rekrutierung von VP24 in von VP40 bzw. GP gebildete VLPs 84
4.3.4 Einfluss des VP24 auf die Bildung von virusähnlichen Partikeln 85
4.3.5 Einfluss des Late-Domain-Motivs PPPY des MARV-VP40 auf den
Einbau von VP24
87
4.3.6 Einbau von NP in die VLPs 89
4.4 Interaktion des VP24 mit viralen Proteinen 90
4.4.1 Lokalisation des VP24 in MARV-infizierten Vero-Zellen 90
4.4.2 Interaktion von VP24 und NP in der Immunfluoreszenzanalyse 92
4.4.3 Interaktion von VP24 und VP40 94
4.4.3.1 Koimmunpräzipitation von VP24 und VP40 94
4.4.3.2 Kolokalisation von VP24 und VP40 in der Immunfluoreszenzanalyse 95
4.5 Abschalten der MARV VP24-Expression durch RNAi 97
4.5.1 Auswahl geeigneter siRNA-Sequenzen aus der Ziel-mRNA-Sequenz 97
4.5.2 Abschalten der transienten VP24-Expression durch siRNAs 98
4.5.3 Abschalten der VP24-Expression in der Virusinfektion durch RNAi 100
4.5.4 Freisetzung reifer Viruspartikel von siRNA-behandelten Zellen 103
Inhaltsverzeichnis 6
5 Diskussion 105
6 Zusammenfassung 113
7 Literaturverzeichnis 114
8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 127
9 Abkürzungsverzeichnis 129
10 Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen 131
11 Curriculum Vitae 133
12 Verzeichnis der akademischen Lehrer 134
13 Danksagung 135
14 Ehrenwörtliche Erklärung 136
1 Einleitung 7
1 Einleitung
1.1 Taxonomie und Epidemiologie der Filoviren
Das Marburgvirus (MARV) und das Ebolavirus (EBOV) bilden aufgrund ihrer
fadenförmigen Gestalt (lat.: filum = der Faden) sowie serologischer, biochemischer und
molekularbiologischer Eigenschaften die Familie der Filoviridae (Kiley et al., 1982).
Hierbei handelt es sich um hochpathogene Erreger, die sowohl bei menschlichen als
auch nichtmenschlichen Primaten schwere, oft tödliche Erkrankungen mit
hämorrhagischer Diathese verursachen.
Aufgrund ihres nichtsegmentierten, negativsträngigen RNA-Genoms (NNS-RNA) bilden
die Filoviren gemeinsam mit den Virusfamilien der Rhabodoviridae, Paramyxoviridae
und Bornaviridae die Ordnung der Mononegavirales (Abbildung 1). Sequenzvergleiche
der Genome der Mononegavirales zeigten, dass die Filoviridae den Paramyxoviridae
evolutiv am nächsten stehen (Mühlberger et al., 1992; Sanchez et al., 1992).
Erstmals wurde 1967 eine von Filoviren ausgelöste Epidemie beschrieben (Siegert,
1967), die zeitgleich in Marburg, Frankfurt a.M. und Belgrad auftrat. Bei den infizierten
Personen handelte es sich hauptsächlich um Laborarbeiter und Tierpfleger, die Kontakt
zu Blut oder Organen von grünen Meerkatzen (Cercopithecus aethiops) hatten, welche
zuvor aus Uganda importiert worden waren. Das neu entdeckte Marburgvirus erhielt
den Namen der Stadt, in der es identifiziert wurde.
Abbildung 1: Taxonomie der Filoviren. In Anlehnung an van Regenmortel et al. (2000), ICTVdB Management (2003)
Mononegavirales
Paramyxoviridae Filoviridae BornaviridaeRhabdoviridae
Ordnung
Familie
Genus
Spezies
Marburgvirus (MARV)
Ebolavirus (EBOV)
MarburgvirusIvory Coast Ebolavirus (CIEBOV)
Reston Ebolavirus (REBOV)
Sudan Ebolavirus (SEBOV)
Zaire Ebolavirus
(ZEBOV)
1 Einleitung 8
Das Ebolavirus trat erstmals im Jahre 1976 während zweier annähernd zeitgleich
verlaufender, aber voneinander unabhängiger Epidemien in Zaire und Sudan in
Erscheinung. Mehrere hundert Menschen erkrankten an einem schweren hämorr-
hagischen Fieber. Das Virus wurde nach einem Fluss, der sich in der Nähe der Epi-
demiegebiete befindet, benannt (Johnson et al., 1977; Murphy et al., 1978). Morpho-
logisch war das neuentdeckte EBOV dem MARV sehr ähnlich, ließ sich jedoch sero-
logisch unterscheiden. (Bowen et al., 1977; Pattyn et al., 1977). Nach 1967 bzw. 1976
kam es gelegentlich zu kleineren Ausbrüchen durch MARV und EBOV (Tabelle 1).
Virus Genus Jahr Ort humane
Krankheitsfälle (Todesfälle)
Isolat
Marburg 1967 Deutschland /
Jugoslawien
32 (7) Rataycak / Popp
1975 Zimbabwe 3 (1) Ozolin
1980 Kenia 2 (1) Musoke
1987 Kenia 1 (1) Ravn
seit 1998 Republik Kongo >90 (>50) ?
Ebola Sudan 1976 Sudan 284 (141) Boniface
Zaire 1976 Zaire 318 (280) Mayinga
Zaire 1977 Zaire 1 (1) Bonduni
Sudan 1979 Sudan 34 (22) Maleo
Reston 1989 USA 4 (0) Philippines
Reston 1992 Philippinen 0 Philippines
Reston 1992 Italien 0 Siena
Zaire 1994 Gabun 49 (29) Gabon
Ivory Coast 1994 Elfenbeinküste 1 (0) Cote d’Ivoire
Zaire 1995 Zaire 315 (243) Kikwit
Zaire 1996 Gabun 31 (21) Gabon
Zaire 1996 Gabun 60 (45) Gabon
Reston 1996 USA 0 Pennsylvania
Sudan 2000-1 Uganda 425 (224) ?
Zaire 2001-2 Gabun/Kongo 122 (110) ?
Zaire 2003 Republik Kongo 143 (128) ?
Zaire 2003-4 Republik Kongo 35 (29) ?
Sudan 2004 Süd-Sudan 25 (6) ?
Tabelle 1: Ausbrüche von Filovirus-Infektionen. In Anlehnung an Feldmann et al., 1996b; WHO 1978a, 1978b, 1992, 1996, 1997, 1999,2000, 2001, 2002, 2003a, 2003b, 2004a, 2004b; CDC, 1996. DRC = DemokratischeRepublik Kongo.
1 Einleitung 9
1995 erfolgte ein weiterer größerer Ausbruch von hämorrhagischem Fieber in Kikwit
(Zaire), ausgelöst vom Subtyp Zaire des Ebolavirus, bei dem von 315 infizierten
Menschen 244 starben (CDC, 1995).
Ein neuer EBOV-Subtyp wurde 1989 in Reston (Virginia/USA) aus Cynomogolus-Affen
(Macaca fascicularis) isoliert, die von den Philippinen in die USA importiert worden
waren (Jahrling et al., 1990). Dieses als Reston Ebolavirus (REBOV) bezeichnete Virus
scheint nicht oder nur schwach humanpathogen zu sein. Es konnten bisher nur
symptomlose Infektionen beim Menschen nachgewiesen werden. Für Affen ist REBOV
jedoch hochpathogen.
Seit Ende 1998 traten gehäuft Fälle von MARV-Infektionen im östlichen Teil der
Demokratischen Republik Kongo (ehemaliges Zaire) um die Stadt Durba auf (Bertherat
et al., 1999; WHO, 1999). Die hier dokumentierten Fälle scheinen auf den Aufenthalt
der infizierten Personen in einer nahegelegenen Goldmine zurückzugehen. Im
Gegensatz zu den bisher beobachteten, sporadisch in verschiedenen Regionen
aufgetretenen MARV-Infektionen sind sie in Durba seit 1998 regelmäßig dokumentiert.
Der natürliche Wirt der Filoviren ist trotz intensiver Untersuchungen bis heute
unbekannt. Zwar spielen Affen bei der Verbreitung der Viren oft eine entscheidende
Rolle, doch können sie als das Reservoir der Viren nahezu ausgeschlossen werden,
da experimentell infizierte Affen ausnahmslos an der Infektion versterben (Fisher-Hoch
et al., 1992; Fisher-Hoch and McCormick, 1999; Ryabchikova et al., 1999; Simpson,
1977). Sie stellen wahrscheinlich nur einen Zwischenwirt in der Infektionskette von
Filovirusinfektionen dar. Als ein möglicher Wirt werden u.a. Fledermäuse betrachtet, da
diese nach einer Infektion das Virus mit dem Kot ausscheiden, jedoch keine Anzeichen
einer Erkrankung aufweisen (Swanepoel et al., 1996). Auch Arthropoden können nicht
ausgeschlossen werden, da gezeigt werden konnte, dass MARV in Mosquitos der
Spezies Aedes aegypti mehrere Wochen persistieren kann (Monath et al., 1999; Kunz
et al., 1968), jedoch scheint dieser Übertragungsweg aufgrund des seltenen Auftretens
von filoviralem hämorrhagischen Fieber als eher unwahrscheinlich.
Umfangreiche serologische Studien haben ergeben, dass Filoviren in Teilen
Zentralafrikas, dem sogenannten Ebola-Gürtel, häufiger vertreten sind als die seltenen
bekannt gewordenen Ausbrüche vermuten lassen. Bei bis zu 10 % der untersuchten
Personen konnten Antikörper gegen eines der bekannten Filoviren nachgewiesen
werden (Slenczka et al., 1984; Hughes et al., 1986). Dieses Ergebnis legt nahe, dass
Filovirusinfektionen unter Umständen klinisch inapparent verlaufen können und somit
unerkannt bleiben. Untersuchungen im Rahmen des EBOV-Ausbruchs in Gabun 1996
bestätigten, dass es asymptomatische Verläufe der EBOV-Erkrankung geben kann
(Baize et al., 1999; Leroy et al., 2000).
1 Einleitung 10
Serologische Studien auf anderen Kontinenten ergaben, dass auch hier eine gewisser
Prozentsatz der untersuchten Seren von Menschen, die keine Anamnese für
hämorrhagische Fieber hatten, Filovirus-spezifische Antikörper besaßen (Becker et al.,
1992). Mögliche Erklärungen für diese Ergebnisse wären, dass es sich hierbei um
unspezifische Kreuzreaktionen der Antikörper handelt, oder dass Filoviren mit
niedrigem pathogenen Potential in weiten Teilen der Welt kursieren.
Die Übertragung der Filoviren von Mensch zu Mensch erfolgt über kontaminierte
Körperflüssigkeiten wie Blut, Speichel und Sperma. Als Eintrittspforten in den Körper
dienen kleine Haut- und Schleimhautläsionen (Simpson et al., 1977). Daher gehören
zu den am meisten gefährdeten Personen während einer Epidemie v.a. das
Pflegepersonal und die nächsten Angehörigen der Erkrankten. Um eine Eindämmung
von Epidemien zu erreichen, ist der besondere Schutz dieser Personen beim Umgang
mit Erkrankten absolut erforderlich. Umstritten ist, inwieweit Filoviren über Aerosole
übertragen werden können. Eine aerogene Übertragung konnte bei MARV bisher nur
im Tierexperiment nachgewiesen werden, gilt aber unter natürlichen Bedingungen als
unwahrscheinlich (Pokhodiaev et al., 1991). Auch im Falle des EBOV ist eine aerogene
Übertragung prinzipiell möglich. Sie konnte z. B. während des EBOV Reston
Ausbruchs bei Affen nicht völlig ausgeschlossen werden, wurde beim Menschen
jedoch nicht nachgewiesen (Johnson et al., 1995; Jaax et al., 1995).
1.2 Klinik und Pathogenese der MARV-Infektion
MARV verursacht beim Menschen und bei nichtmenschlichen Primaten ein schweres
hämorrhagisches Fieber. Nach einer Inkubationszeit von fünf bis neun Tagen beginnt
die Krankheit plötzlich mit schwerem Krankheitsgefühl, hohem Fieber, Kopf- und
Gliederschmerzen sowie Erbrechen und wässriger, nichtblutiger Diarrhoe (Martini et
al., 1968b). Teilweise kommt es schon im Anfangsstadium zu neurologischen Begleit-
symptomen, wie Verwirrtheitszuständen und Bewusstseinstrübungen bis hin zur
Bewusstlosigkeit. In der ersten Krankheitswoche entwickelt sich ein charakteristisches
makulopapulöses Exanthem, das nach Abklingen in eine Hautschuppung übergeht.
Daneben werden Konjunktividen und Lymphknotenschwellungen beschrieben. Im
Verlauf der Krankheit tritt ein obligatorischer Thrombozytenabfall ein, welcher mit der
hämorrhagischen Diathese (Blutungen der Nasenschleimhaut, des Gaumens und des
gesamten Gastrointestinaltrakts) korreliert. Der Verlauf der Erkrankung wird vom
Ausmaß der Hämorrhagien bestimmt. Bei letal endenden Fällen tritt der Tod zwischen
dem achten und zehnten Krankheitstag aufgrund von hämorrhagischem Schock,
Verbrauchskoagulopathie und Multiorganversagen ein. Die Letalitätsrate betrug
während des Ausbruches 1967 in Marburg ca. 25 %, in Durba ca. 50%. Hierbei muss
1 Einleitung 11
berücksichtigt werden, dass die Letalitätsrate entscheidend von der medizinischen
Betreuung der erkrankten Personen und deren allgemeinen Gesundheitszustand
abhängt und daher in Entwicklungsländern, wo eine intensivmedizinische Betreuung
nicht möglich ist, höher liegt. Bei Überlebenden dauert die Krankheit 12 bis 22 Tage an
(Martini et al., 1968b; Stille and Böhme, 1971). Die Rekonvaleszenz dauert fünf
Wochen und länger und ist gekennzeichnet durch Erschöpfung, Gewichtsverlust und
Amnesie in Bezug auf die akute Krankheitsphase. MARV kann bis drei Monate nach
der Infektion in der Samenflüssigkeit nachgewiesen werden (Martini et al., 1968a).
Es wird angenommen, dass die Viren nach der Infektion zunächst in die lokalen
Lymphknoten transportiert werden und dass die primären Ziele der Virusinfektion
Zellen des monozytären phagozytischen Systems (MPS) sind (Feldmann et al., 1996a;
Ströher et al., 2001). Die Virusausbreitung durch infizierte Monozyten erfolgt über das
lymphatische System und das Blutgefäßsystem. Im Frühstadium sind vor allem die
Lymphknoten, Milz und Leber betroffen (Feldmann et al., 1996b; Peters et al., 1996).
Im Spätstadium der Infektion findet man histopathologisch in fast allen Organen
Nekrosen, besonders ausgeprägt treten sie in Leber, Niere und Lunge auf (Rippey et
al., 1984; Zaki and Peters, 1997). Eine erhöhte Durchlässigkeit der Endothelien scheint
für die Schock-Symptomatik und das Auftreten von Hämorrhagien im terminalen
Stadium der Infektion verantwortlich zu sein. Dabei ist interessant, dass infizierte
Makrophagen mit einer erhöhten Ausschüttung von Zytokinen reagieren (Ströher et al.,
2001), darunter der Tumor Nekrose Faktor α (TNFα), der als Auslöser der Schock-
Symptomatik gilt. Die Ausschüttung von TNFα erhöht vermutlich die Permeabilität der
Endothelien, ohne das eine direkte Infektion der Endothelzellen vorliegen muss
(Schnittler et al., 1993; Strieter et al., 1993; Feldmann et al., 1996a). Ablagerungen von
Fibrin und Fibrinspaltprodukten in den Nierentubuli weisen auf eine generelle Störung
der Blutgerinnung hin (Martini et al., 1971).
Eine kausale Therapie gegen MARV existiert bisher nicht. Die Behandlung beschränkt
sich, sofern möglich, auf eine intensivmedizinische symptomatische Therapie des
hämorrhagischen Schocks und der Verbrauchskoagulopathie. Der Einsatz von
Rekonvaleszentenserum scheint jedoch einen positiven Einfluss auf den
Krankheitsverlauf zu haben (Mupapa et al., 1999). Bei EBOV-Infektionen zeigen
Inhibitoren der S-Adenosylhomocystein-Hydrolase im Tierversuch einen guten
therapeutischen Effekt (Bray et al., 2000; Bray et al., 2002; Huggins et al., 1999).
Ferner zeigte die Behandlung von EBOV-infizierten Makaken mit einem rekombinanten
Inhibitor des Gewebefaktors VIIa (rNAPc2) einen positiven Effekt auf den
Krankheitsverlauf der Tiere. Die Anzahl überlebender Tiere stieg von 0 auf 33 %
(Geisbert et al., 2003).
1 Einleitung 12
Die Prävention beschränkt sich vor allem auf Hygienemaßnahmen und Absonderung
infizierter Personen zur Unterbrechung der Infektionskette. Eine Impfung ist zur Zeit
nicht verfügbar und auch schwierig einsetzbar, da man aufgrund fehlender
Informationen über den eigentlichen Wirtsorganismus die gefährdete und damit zu
impfende Population nicht eingrenzen kann. Allerdings gibt es für das EBOV im
Tiermodell erste Erfolge mit DNA-Vaccinen bzw. rekombinanten Adenoviren (Baize et
al. 2001; Sullivan et al., 2000).
1.3 Morphologie des Marburgvirus
Marburgvirus-Partikel zeigen ein pleomorphes Erscheinungsbild. Sie sind fadenförmig,
manchmal verzweigt, zirkularisiert oder in Form eines U oder einer 6 gebogen
(Feldmann et al., 1993; 1999). Der Durchmesser der Partikel beträgt 80 nm, ihre Länge
ist variabel und liegt durchschnittlich bei 1µm, kann aber bis zu 14 µm betragen. In die
das Virion umgebende Hüllmembran sind Spikes von ungefähr 7 nm Länge
eingelagert. Abbildung 2 zeigt den schematischen Aufbau (A) sowie die
elektronenmikroskopische Aufnahme (B) eines MARV-Partikels.
MARV besteht aus sieben Strukturproteinen. Im Zentrum der Viruspartikel liegt das
Nukleokapsid, oder auch Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex, welches aus dem viralen
RNA-Genom (vRNA) und den Proteinen NP, VP35, VP30 und L besteht. Im
Oberflächenprotein GP
Ribonukleoproteinkomplex(vRNA, NP, VP35, VP30 und L)
MatrixVP40 und VP24
1 µm
80 nmA B
Abbildung 2: Struktur des Marburgvirus. A: Schematische Darstellung eines MARV-Partikels. B: ElektronenmikroskopischeAufnahme des MARV, Negativkontrastierung mit Phosphorwolframsäure. Vergrößerung:50000fach. Zur Verfügung gestellt von Dr. Larissa Kolesnikova
1 Einleitung 13
Matrixraum zwischen dem RNP-Komplex und der Hüllmembran liegen die Proteine
VP40 und VP24 (Becker et al., 1998; Kiley et al., 1988). In die Hüllmembran, die von
Membranen der Wirtszelle abstammt, ist das einzige Oberflächenprotein GP in Form
von Homotrimeren eingelagert (Feldmann et al., 1991).
1.4 Genomstruktur des Marburgvirus
Das MBGV besitzt ein einzelsträngiges, nichtsegmentiertes RNA-Genom negativer
Polarität, dessen Länge 19,1 kb beträgt. Die genomische RNA per se ist nicht infektiös.
Sie enthält sieben offene Leserahmen, die für die viralen Strukturproteine kodieren
(Abbildung 3).
Am 3’- und 5’-Ende der RNA befinden sich nichttranskribierte Bereiche, der 3’-Leader
und der 5’-Trailer, deren Enden komplementär zueinander sind und möglicherweise
stabile Sekundärstrukturen bilden können (Peters, 1996). Leader und Trailer enthalten
Signale zur Initiation der Replikation und der Enkapsidierung des Genoms durch das
NP (Mühlberger et al., 1996; 1998). Die offenen Leserahmen der einzelnen Gene sind
von nichttranslatierten Sequenzen flankiert, die hochkonservierte Signale für
Transkriptionsstart und -stop enthalten (Mühlberger et al., 1996). Zwischen den
einzelnen Genen befinden sich intergenische Sequenzen, die nicht transkribiert
werden. Zwischen VP30 und VP24 überlappen die intergenischen Sequenzen
(Feldmann et al., 1992).
1.5 Die viralen Proteine
NP Das Nukleoprotein ist das Produkt des ersten Gens und umfasst 695
Aminosäuren bei einem Molekulargewicht von 94 kD. Es enkapsidiert die virale RNA
und spielt eine zentrale Rolle bei Replikation und Transkription (Becker et al., 1998;
Mühlberger et al., 1998; Kolesnikova et al., 2000; Mavrakis et al., 2003).
Abbildung 3: Genomstruktur des Marburgvirus. Ausgehend vom 3’ Leader werden auf der genomischen RNA die Proteine NP, VP35, VP40,GP, VP30, VP24 und L kodiert, gefolgt von dem 5’ Trailer. Zwischen den einzelnen Genebefinden sich nichttranskribierte intergenische Sequenzen, die zwischen VP30 und VP24überlappen.
TrailerLeader
LNP VP35 GP VP24VP40'3’ 5’VP30
1 Einleitung 14
Anhand von Hydrophobizitätsplots läßt sich NP in eine hydrophile Carboxy (C)-
terminale und eine hydrophobe Amino (N)-terminale Domäne einteilen. Der N-
Terminus zeigt Sequenzhomologien zu den Nukleoproteinen anderer NNS-RNA-Viren
(Sanchez et al., 1992), während der saure C-Terminus hochvariabel ist. Das NP zeigt
eine starke Phosphorylierung und liegt in virusinfizierten Zellen als phosphoryliertes (94
kD) und nicht-phosphoryliertes NP (92 kD) vor. Jedoch wird nur die phosphorylierte
Form des NP in Virionen eingebaut (Becker et al., 1994), was eine entscheidende
Rolle dieser posttranslationalen Modifikation im MARV-Vermehrungszyklus vermuten
lässt. Die Phosphorylierung findet in der C-terminalen Domäne an Serin- und
Threoninresten statt und umfasst sieben Regionen (I-VII) (Lötfering et al., 1999).
VP35 Das VP35 interagiert mit NP und L, wirkt als Kofaktor der RNA-abhängigen
RNA-Polymerase L und wird, trotz seiner vergleichsweise schwachen Phos-
phorylierung, als Analogon der P-Proteine der Rhabdo- und Paramyxoviridae
angesehen (Becker et al., 1998; Mühlberger et al., 1998; 1999). VP35 (35 kD) wird, wie
das P-Protein der Rhabdo- und Paramyxoviridae, vom zweiten Gen des Genoms
kodiert und spielt eine essentielle Rolle bei der viralen Transkription und Replikation
(Mühlberger et al., 1998). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass VP35 des EBOV
ein Typ I Interferonantagonist ist und so die unspezifischen zellulären Abwehr-
mechanismen gegen eine Virusinfektion schwächt (Basler et al., 2000, 2003a).
VP40 VP40, das im Virion neben dem NP mengenmäßig am stärksten vertretene
Protein der Filoviren (Elliot et al., 1985) besteht aus 303 AS. Es läuft in der SDS-PAGE
als Doppelbande bei 37 und 39 kD, wobei es sich bei der größeren Form
wahrscheinlich um eine posttranslationale Modifizierung handelt, die jedoch bisher
nicht näher beschrieben ist. Bei VP40 handelt es sich um ein Analogon der M-Proteine
anderer Mononegavirales. Salz-Dissoziationsuntersuchungen zeigten, dass VP40
zwischen Nukleokapsid und Virushülle lokalisiert ist (Becker er al., 1998; Elliott et al.,
1985). Untersuchungen zur Membranassoziation des VP40 ergaben, dass es stark mit
Membranen interagiert und sich als peripheres Membranprotein verhält (Ruigrok et al.,
2000; Kolesnikova et al., 2002). VP40 assoziiert sehr schnell zu 80 % mit Membranen
und nur ein kleiner Teil assoziiert mit den Nukleokapsiden (Kolesnikova et al., 2002;
Geisbert et al., 1995). Durch Röntgen-Kristallographie konnte die Struktur des EBOV-
VP40 aufgeklärt werden. Dabei zeigte sich, dass der C-Terminus des VP40, der für
eine Membranbindung notwendig ist, hydrophobe Bereiche enthält, die wahrscheinlich
für die Interaktion mit der Lipidmembran verantwortlich sind (Dessen et al., 2000a;
2000b). MARV-VP40 ist in diesem Bereich stark homolog. Für das VP40 des MARV ist
1 Einleitung 15
gezeigt, dass es mit multivesikulären Membranstrukturen des späten endosomalen
Kompartiments, sog. „multivesicular bodies“ (MVB), interagiert (Kolesnikova et al.,
2002; 2004a). Außerdem ist es in der Lage, bei solitärer Expression, seine Freisetzung
als virusähnliche Partikel („virus-like partikles“, VLPs) zu vermitteln (Timmins et al.,
2001; Swenson et al., 2004; Kolesnikova et al., 2004b), wobei für EBOV gezeigt wurde,
dass ein prolinreiches Motiv PTAPPEY am N-Terminus des Proteins, eine sog. Late-
Domain, für diesen Vorgang essentiell ist (Licata et al., 2003; Martin-Serrano et al.,
2004). MARV-VP40 besitzt im N-Terminus ebenfalls das Motiv einer Late-Domain
(PPPY), deren Funktion jedoch bisher nicht näher untersucht ist.
GP GP ist als einziges Oberflächenprotein des MARV als Homotrimer in die
Virushülle inseriert (Feldmann et al., 1991). Es besteht aus 681 AS und wird in eine C-
terminal gelegene cytoplasmatische Domäne (11 AS), eine Transmembrandomäne
(29 AS) und eine N-terminale luminale Domäne (643 AS) gegliedert. Es wird als
klassisches Typ-I-Membranprotein in einem einzigen offenen Leserahmen kodiert (Will
et al., 1993), während für die Expression des Volle-Länge EBOV-GP ein RNA-Editing
benötigt wird (Sanchez et al., 1996; Volchkov et al., 1995). Der hydrophobe N-
Terminus dient als Signalpeptid und wird nach Synthese und Translokation ins
endoplasmatische Retikulum abgespalten (Will et al., 1993). GP wird stark N- und O-
glykosyliert, wobei die fast fehlende Sialylierung auffällt (Geyer et al., 1992).
Stattdessen besitzt GP endständig Galaktosereste. Weitere posttranslationale
Modifikationen sind Acylierung und Phosphorylierung (Funke et al., 1995; Sänger et al.,
2002). Im Trans-Golgi-Netzwerk wird GP von der Prohormonkonvertase Furin
gespalten (Volchkov et al., 2000a), was eventuell zu einer Aktivierung einer
Fusionsdomäne führt (Weissenhorn et al., 1998). Die beiden entstehenden Fragmente
bleiben über Disulfidbrücken miteinander verbunden. GP1 (luminale Domäne) stellt sich
im SDS-Gel bei 170 kD dar, GP2 (Membrananker und cytoplasmatischer Anteil) bei 45
kD. Untersuchungen zum vektoriellen Transport des GP in polarisierten Zellen
ergaben, dass GP während der Virusinfektion zum größten Teil an die apikale
Membran transportiert wird, während die Virusfreisetzung ausschließlich basolateral
stattfindet. Man nimmt an, dass für den vektoriellen Transport und die Virusfreisetzung
andere Faktoren als das GP eine Rolle spielen (Sänger et al., 2001).
VP30 VP30 besteht aus 281 AS (33 kD), ist stark phosphoryliert und Bestandteil des
Nukleokapsidkomplexes. (Becker et al., 1998; Mühlberger et al., 1998; Modrof et al.,
2002). Es stellt in der Ordnung der Mononegavirales eine Besonderheit dar, da es als
viertes Nukleokapsidprotein nur bei der Familie der Filoviridae vorkommt. Das bei den
1 Einleitung 16
Pneumovirinae ebenfalls als viertes Nukleokapsidprotein gefundene M2-Protein
(Huang et al. 1985; Collins et al., 1996; Garcia et al., 1993) stellt aufgrund der
unterschiedlichen Lokalisation seines Gens auf dem Virusgenom vermutlich kein
Analogon zum VP30 dar. Die Funktion des MARV-VP30 ist bislang unbekannt. In
einem artifiziellen Replikations- und Transkriptionssystem (Mühlberger et. al., 1999)
konnte gezeigt werden, dass das EBOV-VP30 essentiell für die virale Transkription
jedoch nicht für die Replikation ist. MARV-VP30 war für keinen der beiden Vorgänge
notwendig. Allerdings ist es im artifiziellen EBOV-System möglich, EBOV-VP30
funktionell durch MARV-VP30 zu ersetzen (Mühlberger et al., 1999). VP30 ist
außerdem in der Lage mit NP zu interagieren (Becker et al., 1998).
VP24 VP24 (253 AS, 28 kD) ist wie das VP40 im Matrixraum der Virionen zwischen
dem Nukleokapsid und der Hüllmembran lokalisiert und wird als ein zweites
Matrixprotein angesehen (Becker et al., 1998; Elliott et al., 1985). VP24 stellt ebenso
wie das VP30 eine Besonderheit in der Ordnung der Mononegavirales dar, da kein
anderer Vertreter dieser Ordnung ein entsprechendes Protein besitzt. Die Funktion des
VP24 ist unbekannt. Bisher konnte eine Interaktion mit der zytoplasmatischen Domäne
des GP und mit negativ geladenen Membranen gezeigt werden (Sänger et al., 1998;
Bamberg, 2000). Für EBOV wurde postuliert, dass VP24 für die Bildung von
Nukleokapsiden notwendig ist (Huang et al., 2002). Außerdem ist EBOV-VP24 nach
solitärer Expression teilweise membran-assoziiert und scheint zur Bildung von
virusähnlichen Partikeln in der Lage zu sein, allerdings in wesentlich geringerem Maße
als VP40 (Han et al., 2003). Des Weiteren wird VP24 als Pathogenitätsfaktor in der
filoviralen Infektion diskutiert. EBOV erzeugt zunächst keine letalen Infektionen im
Meerschweinchen, während es nach mehreren Passagen zum Auftreten von
hochpathogenen Varianten kommt. Sequenzanalysen der an Meerschweinchen
adaptierten EBOV-Varianten ergaben, dass diese Mutationen im VP24-Gen besaßen,
die zu AS-Austauschen führten. Es wird angenommen, dass diese Mutationen sowohl
für die Adaptation als auch Veränderungen in der Virulenz verantwortlich sind
(Volchkov et al., 2000b). Außerdem wird vermutet, dass EBOV-VP24 die IFNβ-
vermittelte Induktion von ISRE-Reportergenen inhibieren kann und somit die
Siganlkaskade der Interferonantwort bei Virusinfektionen beeinflusst (Basler and
Palese, 2003). Für MARV sind ähnliche Mechanismen bisher jedoch nicht beschrieben.
L Das L-Protein umfasst 2331 AS (220 kD) und ist somit das größte Protein des
MARV. Es handelt sich bei diesem Protein um den katalytischen Teil der RNA-
abhängigen RNA-Polymerase. Es zeigt Homologien zu den L-Proteinen anderer
1 Einleitung 17
Mononegavirales, insbesondere der Paramyxoviren, und weist drei bei den
Mononegavirales konservierte Polymerase-Motive auf (Mühlberger et al., 1992;
Volchkov et al., 1999; Poch et al., 1990).
1.6 Der Replikationszyklus des Marburgvirus
Der Eintritt des Virus in die Zelle wird durch das einzige Oberflächenprotein GP
vermittelt, welches die zentrale Rolle bei der Erkennung von zellulären Rezeptoren
spielt. Bisher ist nur der Asialoglykoprotein-Rezeptor als möglicher Rezeptorkandidat
für die Infektion von Hepatozyten beschrieben (Becker et al., 1995). Der Folat-
rezeptor-α wurde als Kofaktor für den Eintritt von EBOV beschrieben (Chan et al.,
2001), wobei jedoch gezeigt werden konnte, dass er beim Eintritt in primäre Zelllinien
keine Rolle spielt (Simmons et al., 2003b; Sinn et al., 2003). Die C-Typ Lektine DC-
SIGN und DC-SIGNR, welche unter anderem auf Makrophagen und dentritischen
Zellen exprimiert werden, wurden ebenfalls als mögliche Kofaktoren der EBOV-
Infektion beschrieben (Simmons et al., 2003a; Lin et al., 2003). Die Aufnahme der
Viren erfolgt durch rezeptorvermittelte Endozytose (Mar’iankova et al., 1993). Nach
Fusion der Virushülle mit der endosomalen Membran kommt es zur Freisetzung der
Nukleokapside in das Zytoplasma der Zelle, wo Transkription (Synthese
virusspezifischer mRNA) und Replikation (Vervielfältigung des Virusgenoms) der
viralen RNA stattfindet. Zunächst werden monocistronische, polyadenylierte, nicht-
enkapsidierte mRNAs der einzelnen Strukturproteine synthetisiert (Feldmann et al.,
1992; Sanchez et al., 1993; Mühlberger et al., 1996). Diese Transkripte enthalten
lange, nicht-translatierte Bereiche, die regulatorische Funktionen bei der
Proteinsynthese ausüben (Mühlberger et al., 1996; Weik et al., 2002). Die mRNAs
werden von der zellulären Translationsmaschinerie in Proteine übersetzt. Wie die
Transkription findet die Replikation nur an enkapsidierter RNA statt. Dabei wird die
genomische (-)-Strang RNA zunächst vollständig in antigenomische (+)-Strang RNA
umgeschrieben, welche dann als Matrize zur Synthese neuer, viraler Genome dient.
Sowohl Genom als auch Antigenom liegen in enkapsidierter Form vor. Welcher
molekulare Mechanismus für den Wechsel zwischen Transkription und Replikation
verantwortlich ist, ist bisher nicht bekannt. Die neusynthetisierten Nukleokapside
erscheinen etwa zehn bis zwölf Stunden nach Infektion in typischen
intrazytoplasmatischen Einschlusskörpern, welche vermutlich die Syntheseorte der
Nukleokapside darstellen (Kolesnikova et al., 2000). Reife Nukleokapsidkomplexe
wandern zur Zelloberfläche und nehmen über die Matrixproteine Kontakt zu den
Ausschleusungspunkten an der Plasmamembran auf, in die das GP eingelagert ist. Die
Freisetzung von MARV-Partikeln erfolgt etwa 22 Stunden nach Infektion.
1 Einleitung 18
1.7 Die Funktion der Matrixproteine bei Mononegavirales und Retroviren
Der Zusammenbau umhüllter Viren umfasst vier wesentliche Schritte (Lenard et al.,
1996):
1.) Enkapsidierung der genomischen RNA und Bildung der viralen
Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexe (Nukleokapside).
2.) Reifung der RNP-Komplexe und Transport zu den Orten der
Viruszusammensetzung.
3.) Umhüllung der reifen RNP-Komplexe durch Zellmembranbereiche, in denen
virale Glykoproteine angereichert sind.
4.) Abschnürung und Freisetzung der reifen Viruspartikel von der Zelle.
Die Matrixproteine der Mononegavirales und die MA-Proteine der Retroviren zeigen
einige Gemeinsamkeiten. Sie sind mengenmäßig mit am häufigsten in den Virionen
vertreten und binden an Membranen. Diese Bindung kann jedoch unterschiedlich stark
ausgeprägt sein. So liegt zum Beispiel das M-Protein von VSV zu 90 % in löslicher
Form und zu 10 % in membrangebundener Form vor (Chong et al., 1993a), während
das VP40 des MARV zu 80 % Membranbindung aufweist (Kolesnikova et al., 2002).
Für den Zusammenbau der Virionen ist die Interaktion zwischen den
Oberflächenproteinen und den zytoplasmatischen viralen Komponenten von zentraler
Bedeutung. Bei den negativsträngigen RNA-Viren wird diese Interaktion durch die
Matrixproteine vermittelt. Viele Matrixproteine sind in der Lage, spezifisch mit den
viralen Oberflächenproteinen zu interagieren. Für das Rabies-Virus (Rhabdoviridae)
und das Sendai-Virus (Paramyxoviridae) wurde eine Interaktion der entsprechenden
Matrixproteine einerseits mit dem viralen Nukleokapsid und andererseits mit der
zytoplasmatischen Domäne der viralen Oberflächenproteine gezeigt (Sanderson et al.,
1993; Mebatsion et al., 1999).
Die solitäre Expression von Matrixproteinen führt, auch in Abwesenheit anderer viraler
Proteine, zur Abschnürung von sog. virusähnlichen Partikeln (VLPs), die strukturell
reifen Viruspartikeln ähneln (Gonzales et al., 1993; Justice et al., 1995; Coronel et al.,
1999; Timmins et al., 2001). Eine Koexpression mit viralen Glykoproteinen führt zu
einer gemeinsamen Freisetzung in Form der VLPs (Swenson et al., 2004; Schmitt et
al., 2002).
Die Matrixproteine der Filoviridae sowie der Rhabdo- und Retroviridae enthalten
sogenannte Late-Domain-Motive, von denen bekannt ist, dass sie eine wesentliche
Rolle bei der Abschnürung viraler Partikel spielen. Late-Domain-Motive zeichnen sich
durch hoch konservierte kurze Peptidsequenzen aus, die der Protein-Protein
1 Einleitung 19
Interaktion dienen. Bisher sind verschiedene Late-Domain-Motive bekannt: u.a. PTAP,
PPxY und Yxxθ (Freed, 2002; Pelchen-Matthews et al., 2004), wobei x für jede
beliebige AS und θ für große hydrophobe AS-Reste steht. Entdeckt wurden diese
Motive aufgrund der Beobachtung, dass C-terminale Deletionen beim HIV-1 gag-
Protein zu Virionen führen, welche sich nicht von der Plasmamembran ablösen
können, sondern durch einen schmalen Faden mit ihr verbunden bleiben (Gottlinger et
al., 1991). Die Funktion dieser Late-Domain-Motive scheint in der Interaktion mit
Wirtszellproteinen zu liegen. So konnte für das Motiv PTAPPEY des EBOV-VP40 eine
Interaktion mit der Ubiquitin-Ligase Nedd4 und Tsg101 gezeigt werden, welche beide
in der Sortierung von Proteinen in den endosomalen Stoffwechselweg eine Rolle
spielen. Die Mutation oder Deletion dieser Late-Domain-Motive führt zu einer
drastischen Reduktion der Freisetzung von VLPs bzw. reifer Viruspartikel von
infizierten Zellen (Harty et al., 1999; Licata et al., 2003; Gottwein et al., 2003).
1.8 RNA Interferenz (RNAi)
Der Begriff der RNA Interferenz (RNAi) beschreibt den Gebrauch von doppelsträngiger
RNA, mir deren Hilfe sequenzspezifisch mRNAs abgebaut werden können und somit
die Expression des entsprechenden Gens unterdrückt werden kann. RNAi ist eines
mehrerer sogenannter „post-transcriptional gene silencing“ (PTGS) Phänomene, die
bisher in Pflanzen, Pilzen und tierischen Zellen beobachtet wurden (Elbashir et al.,
2001, Hammond et al., 2001, Tuschl, 2001, Cogoni and Macino, 2000).
Der RNAi-Mechanismus Durch das Einbringen von sogenannten „small interfering RNAs“ (siRNAs), kurzen,
doppelsträngigen Nukleotidfragmenten mit einer Länge von 21 bp, kann in
Säugerzellen die Expression von Proteinen durch spezifischen Abbau ihrer mRNA
verhindert werden (Elbashir et al., 2001). Die siRNAs weisen dabei 3’-Überhänge von
zwei Nukleotiden auf. Diese siRNAs werden im Folgenden von dem sogenannten
„RNA-induced silencing complex“, kurz RISC, erkannt und gebunden. Für die
Aktivierung von RISC ist zunächst eine ATP-abhängige Entwindung der siRNA
notwendig, der dann die Basenpaarung der gebundenen siRNA mit der homologen
mRNA-Zielsequenz folgt. Der aktivierte RISC-Komplex ist nun in der Lage die mRNA
zu spalten und somit die Expression des entsprechenden Proteins zu verhindern.
Anwendung der RNAi-Technologie In der kurzen Zeit nach ihrer Entdeckung haben sich in sehr vielen Bereichen der
biomedizinischen Grundlagenforschung Anwendungsmöglichkeiten für die RNAi-
1 Einleitung 20
Technologie ergeben. Es besteht die Möglichkeit durch Einführung der siRNAs in
Säugerzellen die Expression spezifischer Proteine posttranskriptionell abzuschalten,
ohne das Wirtsgenom zu beeinflussen (z.B. durch knock-out Mutanten). Besondere
Bedeutung gewinnt der RNAi-Mechanismus in der antiviralen Therapie. Hier konnte
bereits eine Replikationsinhibition verschiedener Viren durch siRNAs gezeigt werden
(Saksela, 2003). Bisher ist es jedoch beim Menschen noch nicht möglich siRNAs
therapeutisch zur Bekämpfung von viralen Infektionen einzusetzen, da sich die
Moleküle schnell im Körper abbauen, und nur schwer in Zellen einzubringen und auf
ein spezielles Zielgewebe auszurichten sind. Jedoch konnten Influenza-spezifische
siRNAs mithilfe von Polymeren in die Lungen infizierter Mäuse gebracht werden,
wodurch die Zahl der Grippeviren bei den Tieren um mehr als das Tausendfache
gesenkt werden konnte (Ge et al., 2004).
Abbildung 4: Der RNAi-Mechanismus. (Hannon, 2002) Die siRNAs werden von einer Multikomponenten-Nuklease, RISC (grün), erkannt. Es wirdvermutet, dass RISC zunächst von einer latenten Form, welche die doppelsträngige siRNAenthält, in eine aktive Form, RISC*, durch Entwinden der siRNAs überführt werden muss(ATP-abhängig). RISC* nutzt dann die entwundene siRNA, um an das entsprechendeSubstrat (mRNA) zu binden und dieses abzubauen.
Aktivierungdurch ATP
mRNA-Zielsequenz
RISC
RISC* m7G
siRNAs
1 Einleitung 21
1.9 Fragestellung Für das VP24 des MARV ist bisher keine Funktion bekannt. Durch Salz-
Dissoziationsstudien konnte gezeigt werden, dass es in den Viruspartikeln wie das
Matrixprotein VP40 zwischen dem RNP-Komplex und der Hüllmembran lokalisiert ist
(Becker et al., 1998; Elliot et al., 1985). Es wird daher als zweites Matrixprotein der
Filoviren angesehen, was eine Besonderheit in der Ordnung der Mononegavirales
darstellt, da hier üblicherweise nur ein Matrixprotein vorhanden ist. Die vorliegende
Arbeit beschäftigt sich mit der näheren Charakterisierung des MARV-VP24.
Hierbei stand zunächst die Fragestellung im Mittelpunkt, ob VP24 in der Lage ist, mit
zellulären Membranen zu interagieren und ob es die Bildung von virusähnlichen
Partikeln (VLPs) induziert. Es konnte bereits mithilfe von Liposomen und in vitro
translatiertem VP24 eine Tendenz zur Interaktion mit negativ geladenen Membranen
gezeigt werden (Bamberg, 2000), die jedoch in einem zellulären Hintergrund näher
untersucht werden sollte. Des Weiteren galt es, die intrazelluläre Lokalisation von
singulär exprimiertem VP24 sowie von VP24 im Hintergrund einer MARV-Infektion
durch Immunfluoreszenzanalysen aufzudecken. Ferner stand die Untersuchung von
möglichen Interaktionen mit anderen viralen Proteinen im Vordergrund.
Um die Funktion des VP24 in der Replikation und Morphogenese während der
Virusinfektion zu untersuchen, wurde der Einsatz der RNAi-Technologie gewählt.
Hierbei sollte die Proteinexpression von VP24 mithilfe der RNA Interferenz
abgeschaltet und die Auswirkungen der vermindertenn VP24-Expression auf andere
virale Proteine sowie die Ausschleusung reifer Partikel untersucht werden.
2 Material 22
2 Material
2.1 Chemikalien Aceton Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Agarose, ultrarein BRL, Neu-Isenburg
Agarose, NA Amersham Pharmacia Biotech Europe
GmbH, Freiburg
Alconox Sigma-Aldrich, Deisenhofen
6-Amino-n-Capronsäure Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Ammoniumchlorid Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Ammoniumhydrogenkarbonat Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Ammoniumpersulfat (APS) Biorad, Richmond (USA)
Ampicillin (Natriumsalz) Serva, Heidelberg
Bacto-Agar Difco Lab., Detroit (USA)
Borsäure Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Bovines Serumalbumin (BSA) Serva, Heidelberg
Bromphenolblau (BPB) Serva, Heidelberg
Calciumchlorid (CaCl2) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
CompleteTM (Proteasen-Inhibitor-Cocktail) Roche, Mannheim
Coomassie Brillant Blue R250 Serva, Heidelberg
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-phenylindol) Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Dextranblau Amersham Pharmacia Biotech Europe
GmbH, Freiburg
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Dinatriumcarbonat (Na2CO3) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Dinatriummethylendiamintetraacetat
(EDTA)
Roth, Karlsruhe
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Dithiothreitol (DTT) Biorad, Richmond (USA)
Essigsäure (HAc) Riedel-de-Haën, Seelze
Ethanol (abs.) EtOH Riedel-de-Haën, Seelze
Ethidiumbromid Roche, Mannheim
Ethylacetat Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Fluoprep bioMérieux, Nürtingen
Formamid BRL, Neu-Isenburg
2 Material 23
Freundsches Adjuvants, komplett Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Freundsches Adjuvants, inkomplett Sigma-Aldrich, Deisenhofen
L-Glutamin 200 mM (100×) Gibco BRL, Karlsruhe
Glycerol BRL, Neu-Isenburg
Glycin Riedel-de-Haën, Seelze
Glycogen (20 µg / µl) Roche, Mannheim
Harnstoff (ultrarein) BRL, Neu-Isenburg
Hefeextrakt Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Isopropanol Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid
(IPTG)
Roth, Karlsruhe
Kaliumchlorid (KCl) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Lipofectin-Reagenz Invitrogen, Karlsruhe
LipofectamineTM 2000 Invitrogen, Karlsruhe
LipofectamineTM Invitrogen, Karlsruhe
Magermilchpulver Töpfer, Dietmannsried
Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl2 × 6H2O) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Magnesiumsulfat (MgSO4) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
β-Mercaptoethanol Serva, Heidelberg
Methanol (MeOH) Riedel-de-Haën, Seelze
Natriumacetat Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Natriumazid (NaN3) J.T. Baker B.V., Deventer (Holland)
Natriumchlorid (NaCl) Roth, Karlsruhe
Natriumdodecylsulfat (SDS) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Natriumfluorid (NaF) Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Natriumhydroxid (NaOH) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Natrium-o-Vanadat (NaV) Sigma-Aldrich, Deisenhofen
N(onidet)P40 Amersham Pharmacia Biotech Europe
GmbH, Freiburg
Paraformaldehyd (PFA) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Penicillin/Streptomycin 5000 IU/ml Gibco BRL, Karlsruhe
Pepton Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Roche, Mannheim
PlusTM-Reagenz Invitrogen, Karlsruhe
2 Material 24
Polyacrylamid-Lösung (29:1) Biorad, Richmond (USA)
rotiphorese Gel 30 Roth, Karlsruhe
Saccharose Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Salzsäure (HCl) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt
Stickstoff (99,996 %) Messer-Griesheim, Siegen
SuperSignal Ultra® West Dura Extended
Duration Substrate
Pierce, Rockford (USA)
SuperSignal® West Femto Maximum
Sensitivity Substrate
Pierce, Rockford (USA)
Tetracyclin Serva, Heidelberg
N, N, N´, N´, -
Tetramethylethylethylendiamin (TEMED)
Biorad, Richmond (USA)
Trishydroxymethylaminomethan (Tris-Base) Roth, Karlsruhe
Triton X-100 Serva, Heidelberg
Triton X-114 Serva, Heidelberg
Tween 20 Serva, Heidelberg
Wasser, nukleasefrei Ambion, Austin (USA)
2.2 Verbrauchsmaterialien
9 cm Zellkulturschalen Greiner, Nürtingen
6 well-, 12 well-, 24 well-Zellkulturplatten Greiner, Nürtingen
75 cm2 Zellkulturflaschen Costar, Cambridge (USA)
162 cm2 Zellkulturflaschen Costar, Cambridge (USA)
Bio-Image Screen: Imaging plate 2040S Fuji, Kanagawa (Japan)
Blottingpapier GB 002 (Whatman 3MM) Whatman, New Jersey (USA)
Gefrierfolie Krups, Solingen
Gewebekulturröhrchen Greiner, Nürtingen
Immobilon™ P, PVDF-Membran Millipore, Eschborn
Kapillarspitzen 200 µl Biozym Diagnostik, Hess. Oldendorf
Nitrocelluloseacetatfolie (NTA) Schleicher & Schuell, Dassel
Objektträger Menzel GmbH, Braunschweig
Parafilm Pechiney Plastic Packaging, Neenah (USA)
PCR-tubes, 0,2 ml Biozym, Hess. Oldendorf
Petrischalen Greiner, Nürtingen
Pipetten 2 + 10 ml, Cellstar® bio-one Greiner, Nürtingen
Pipetten 5 ml, serological pipette Sarstedt, Nümbrecht
2 Material 25
Pipettenspitzen, oberflächenoptimiert Nerbe Plus, Winsen/Luhe
Polypropylen-Reaktionsgefäße (15 ml, 50 ml) Greiner, Solingen
Polaroidfilm 667 Professional Polaroid, Cambridge (USA)
Reaktionsgefäße 1,5 / 2 ml Eppendorf, Hamburg
Präzisions-Küvetten aus Quarzglas Hellma, Müllheim
Röntgenfilme (BiomaxTM MR) Kodak, Rochester (USA)
Feather-Skalpell PfM AG, Köln
Ultraclear™-Zentrifugenröhrchen SW41 Beckmann, Palo Alto (USA)
Zellschaber, greiner bio-one Greiner, Nürtingen
2.3 Kits
ABI Prism™ Dye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit
Perkin Elmer Cetus, Norwalk (USA)
DIG Glycan Differentiation Kit Roche, Mannheim
E.Z.N.A.® Plasmid Miniprep Kit I Peqlab, Erlangen
Gene Amp™ PCR Reagent Kit Perkin Elmer Cetus, Norwalk (USA)
HiSpeed Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden
QIAamp® Viral RNA Mini Kit Qiagen, Hilden
QIAfilter® Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden
QIAprep® Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden
QIAquick® Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden
QIAquick® PCR Purification Kit Qiagen, Hilden
QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis
Kit
Stratagene, Heidelberg
RNeasy®Mini Kit Qiagen, Hilden
SuperScriptTM One-Step RT-PCR with
Platinum Taq
Invitrogen, Karlsruhe
SYBR Green I Dye Invitrogen, Karlsruhe
TNT® T7 Quick Coupled
Transcription/Translation Kit
Promega GmbH, Mannheim
Z-Competent E.coli Transformation Kit™
and Buffer Set
Zymo Research, Orange (USA)
2.4 Geräte
ABI PRISMTM377 DNA Sequenzer Perkin-Elmer Cetus, Norwalk (USA)
2 Material 26
Biofuge A Heraeus Sepatech GmbH, Osterode
Biofuge 13 Heraeus Sepatech GmbH, Osterode
Bio-Imager Analyser BAS-1000 Fuji, Kanagawa (Japan)
Branson Sonifier 450 Heinemann, Schwäbisch Gmünd
Brutschrank 6000 Heraeus Instruments, Hanau
DNA Thermal Cycler TC1 Perkin-Elmer Cetus, Norwalk (USA)
Elektronenmikroskop Zeiss 109 Zeiss, Jena
Eppendorf Kühlzentrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg
Eppendorf Reference Pipetten
(0,1-2,5 µl; 0,5-10 µl; 10-100 µl; 100-1.000 µl)
Eppendorf, Hamburg
Eppendorf Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg
Eppendorf-Tischzentrifuge 5145 Eppendorf, Hamburg
Fastblot B34 Biometra, Göttingen
Feinwaage Sartorius, Göttingen
Fluoreszenzmikroskop Zeiss, Jena
Geiger-Müller-Zähler Berthold, Wildbad
GelDoc 2000 Biorad, Richmond (USA)
Genequant II DNA / RNA Calculator Amersham Pharmacia Biotech Europe
GmbH, Freiburg
Horizontalschüttler HS 250 Basis IKA Labortechnik, Staufen
J2 21 Zentrifuge Beckmann, Palo Alto (USA)
Keutz®-Gel-Trocken-Rahmen von Keutz, Reiskirchen
Keutz®-Minigelkammer von Keutz, Reiskirchen
Kippschüttler von Keutz, Reiskirchen
Krups Vakupack plus Krups, Solingen
LightCycler Roche, Mannheim
MegaBACETM 1000 Amersham Pharmacia Biotech Europe
GmbH, Freiburg
Megafuge 1.0R Heraeus Instruments, Hanau
Metallblockthermostat TCS Lab Tech Barkey, Bielefeld
Microcomputer Electrophoresis, Power
supply Consort
von Kreutz, Reiskirchen
Mikrowellengerät Bosch
Minifuge RF Heraeus Sepatech GmbH, Osterode
Optimax 2010 Protec Medizintechnik GmbH,
Oberstenfeld
2 Material 27
pH-Meter CG 832 Schott Laborgeräte
pipetus® akku Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt
Polaroid MP4 Land Camera Polaroid, Cambridge (USA)
Primus Thermocycler MWG Biotech AG, Ebersberg
Protean II Gelkammer Biorad, Richmond (USA)
Rotavapor Büchi, Schweiz
Sicherheitswerkbank Heraeus Instruments, Hanau
Spot Kamera, Version 3.1.2 Diagnostic Instruments, Michigan (USA)
Überkopfrotierer Heidolph, Schwabach
UV-Durchflußphotometer Uvicord® SII Amersham Pharmacia Biotech Europe
GmbH, Freiburg
UV-Schirm 302 nm Bachofer, Reutlingen
Vakuum-Geltrockner von Keutz, Reiskirchen
Vakuum-Zentrifuge (Speed-vac) von Keutz, Reiskirchen
Waage Sartorius, Göttingen
Wasserbad mwg lauda MT
2.5 Puffer und Lösungen
2.5.1 Puffer
Blockierungs-Puffer für
Immunfluoreszenzen
2 %
5 %
0,2 %
0,05 %
BSA
Glycerol
Tween 20
NaN3
in PBSdef.
Blockierungspuffer für Western
Blots
10 g
ad 100 ml
Magermilchpulver
PBSdef
6x DNA-Probenpuffer 0,25 %
40 %
10 %
Bromphenolblau
Saccharose
Glycerol
Glycin-Puffer, sauer 100 mM Glycin, pH 2,5
2 Material 28
Karbonatpuffer I
Karbonatpuffer II
Karbonatpuffer pH11
100 mM
100 mM
Na2CO3
NaHCO3
Mischung von I+II 20:1
KoIP-Puffer (∅ BSA)
(Koimmunpräzipitations-Puffer)
20 mM
100 mM
5 mM
1 %
Tris/HCl, pH 7,6
NaCl
EDTA
NP40
Lysispuffer für Flotationen 10 mM
250 mM
1 mM
1 mM
200 µM
Tris/HCl, pH 7,5
Saccharose
EDTA
PMSF
Natrium-o-Vanadat
PBSdef, pH 7.5
(Phosphatpuffer deficient)
8 g
0,2 g
1,15 g
0,2 g
ad 1 l
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4
dH2O
10× Proteingellaufpuffer 10 g
30 g
250 g
ad 1 l
SDS
Tris-Base
Glycin
dH2O
4× Proteinprobenpuffer 10 ml
10 ml
15 ml
12,5 ml
1,25 ml
ad 50 ml
Glycin
ß-Mercaptoethanol
40 % SDS
3 M Tris-Base
gesättigte BPB-Lösung in dH2O
dH2O
4× Probenpuffer für Sequenzgele 500 µl
100 µl
50 mg / ml
deionisiertes Formamid
25 mM EDTA, pH 8,0
Dextranblau
2 Material 29
Saccharoselösungen für
Flotationen (90 %, 45 %, 10 %)
X %
10 mM
1 mM
Saccharose (w/v)
Tris/HCl, pH 7,5
EDTA, pH 8,0
20 %ige Saccharose für VLP-
Reinigung
20 %
10 mM
1 mM
Saccharose (w/v)
Tris/HCl, pH 7,5
EDTA, pH 8,0
SDS-PAGE -Sammelgelpuffer 2,52 ml
0,1 ml
0,5 M Tris/HCl, pH 6,8
10 % SDS
SDS-PAGE- Trenngelpuffer 2,5 ml
0,1 ml
2,5 M Tris/HCl, pH 8,8
10 % SDS
Sequenzier-Probenpuffer 1 %
5 mM
80 %
Dextranblau
EDTA, pH 8,0
Formamid
siRNA-Lysispuffer 50 mM
150 mM
1 %
1×
Tris/HCl, pH 7.5
150 mM NaCl
NP40
CompleteTM
Stripping-Puffer 62,5 mM
2 %
1 mM
Tris/HCl, pH 6,8,
SDS
β-Mercaptoethanol
50× TAE, pH 8,0 242 g
57,1 g
100 ml
ad 1 l
Tris-Base
Essigsäure
0,5 M EDTA, pH 8,0
dH2O
10× TBE, pH 8,0 108 g
55 g
40 ml
ad 1 l
Tris-Base
Borsäure
0,5 M EDTA, pH 8,0
dH2O
2 Material 30
TBS
(Affinitätsreinigung von AK)
500 mM
20 mM
0,05 %
NaCl
Tris/HCl, pH 7,4
Tween 20 (v/v)
TBS-B 500 mM
20 mM
0.05 %
3 %
NaCl
Tris/HCl, pH 7,4
Tween 20 (v/v)
BSA (w/v)
TE-Puffer 10 ml
2 ml
ad 1 l
1 M Tris/HCl, pH 7,5
0,5 M EDTA, pH 8,0
dH2O
Tris/KCl-Puffer 10 mM
150 mM
0,1 %
3 %
Tris/HCl, pH 8,0
KCl
NP40
BSA
Tris/KCl-Waschpuffer Wie Tris/KCl-Puffer, jedoch ohne
BSA
Triton X-114-Lysispuffer 10 mM
150 mM
1 mM
200 µm
Tris/HCl, pH 7,5
NaCl
PMSF
Natrium-o-Vanadat
Triton X-114-Saccharose-Kissen 6 %
10 mM
150 mM
0,06 %
Saccharose (w/v)
Tris/HCl, pH 7,5
NaCl
Triton X-114 (v/v)
AK-Verdünnungspuffer Western
Blot
1 %
0,1 %
in
Magermilchpulver
Tween 20
PBSdef
Waschpuffer Western Blot 0,1 %
in
Tween 20
PBSdef
2 Material 31
Western Blot Anodenpuffer I 36,34 g
200 ml
ad 1 l
Tris-Base
Ethanol
dH2O
Western Blot Anodenpuffer II 3,04 g
200 ml
ad 1 l
Tris-Base
Ethanol
dH2O
Western Blot Kathodenpuffer 5,25 g
3,03 g
200 ml
ad 1 l
6-Amino-N-Capronsäure
Tris-Base
Ethanol
dH2O
2.5.2 Lösungen
Ampicillin-Stammlösung 100 mg
ad 1 ml
Ampicillin
dH2O
Coomassie®-Färbelösung Wie Fixierer/Entfärber für Proteingele, jedoch mit
0,05 % Coomassie® Brillant Blue R250
Fixierer/Entfärber für Proteingele 300 ml
100 ml
600 ml
Ethanol
Essigsäure
dH2O
100 mM IPTG 1,41 g
ad 50 ml
Isopropyl-β-D-
Thiogalactopyranosid
dH2O
100 mM Orthovanadat, pH 10 368 g
ad 20 ml
Natrium-o-Vanadat
dH2O
100 mM PMSF 360 mg
ad 21 ml
PMSF
Isopropanol
2 Material 32
Tetracyclin-Stammlösung 20 mg
ad 1 ml
Tetracyclin
Ethanol
2.6 Wachstumsmedien
2.6.1 Wachstumsmedien für Bakterien
2YT-Medium 5 g
10 g
16 g
ad 1 l
NaCl
Hefeextrakt
Pepton
dH20
LB-Agar (1,5 %) 3,75 g
ad 250 ml
Bacto-Agar
LB-Medium
LB-Medium 10 g
5 g
10 g
ad 1 l
NaCl
Hefeextrakt
Pepton
dH20
SOB-Medium 20 g
5 g
0,58 g
0,19 g
10 ml
10 ml
ad 1 l
Pepton
Hefeextract
NaCl
KCl
1 M MgCl2
1 M MgSO4
dH20
2.6.2 Wachstumsmedien für Säugerzellen
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco BRL, Karlsruhe
DMEM(+++) 500 ml
50 ml
5 ml
5 ml
DMEM
FCS (Fetales Kälberserum)
L-Glutamin 200 mM (100x)
Penicillin/Streptomycin 5000 IU / ml
2 Material 33
DMEM(+ Q) 500 ml
5 ml
DMEM
L-Glutamin 200 mM (100x)
Fetales Kälberserum (FCS) Whittaker, Heidelberg
Opti-MEM I Gibco BRL, Karlsruhe
Trypsin/EDTA Gibco BRL, Karlsruhe
2.7 Nukleinsäuren und Nukleotide
2.7.1 Nukleinsäuren als Größenmarker
DNA Größenmarker III (λ-DNA EcoRI, HindIII verdaut) Roche, Mannheim
MassRuler™ DNA-ladder High range MBI-Fermentas, St.Leon-Rot
2.7.2 Sonstige Nukleinsäuren und Nukleotide
dATP 2’-Desoxyadenosin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln
dCTP 2’-Desoxycytidin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln
dGTP 2’-Desoxyguanosin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln
dTTP 2’-Desoxythymidin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln
rATP Adenosin 5’-Triphosphat 10 mM Roche, Mannheim
2.7.3 siRNA Sequenzen
VP24 Nr. 1 sense-Strang: 5’ -CCGUUUUUGGCCCUGAGGAdTdT- 3’
antisense-Strang: 5’ -UCCUCAGGGCCAAAAACGGdTdT- 3’
20 µM Dr. Michael Krause,
IMT, Marburg
VP24 Nr. 2 sense-Strang: 5’ -CCUUGCUGUGGUGAGACAGdTdT- 3’ antisense-Strang: 5’ -CUGUCUCACCACAGCAAGGdTdT- 3’
20 µM Dr. Michael Krause,
IMT, Marburg
VP35 sense-Strang: 5’ -UAGGCAGAUAUCAGACAUUdTdT- 3’
antisense-Strang: 5’ –AAUGUCUGAUAUCUGCCUdTdT- 3’
20 µM Qiagen, Hilden
VP30 sense-Strang: 5’ -UAGAGAUCAUGACCUUGAUdTdT- 3’
antisense-Strang: 5’ -AUCAAGGUCAUGAUCUCUAdTdT- 3’
20 µM Qiagen, Hilden
2 Material 34
NP sense-Strang: 5’ -CAGUUCUCGAGUUCAUCUUdTdT- 3’
antisense-Strang: 5’ -AAGAUGAACUCGAGAACUGdTdT- 3’
20 µM Qiagen, Hilden
X sense-Strang: 5’ -UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT- 3’
antisense-Strang: 5’ -ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT- 3’
20 µM Qiagen, Hilden
2.7.4 DNA-Oligonukleotide (Primer)
MARV-spezifische Vorwärtsprimer
Nr. Name Sequenz
116 NPv 2515-Bam CAG GGA TCC CAT GAC TTG ATT CAA AGA ATA TAC
718 VP24Flag/mutF
CGA TGA CAA GTA ACT GCA GCT CG
958 VP40-PPxA+ GAA CCC CCC TCC TGC TGC TGA TCA CGG TGC
1086 MGP-SmaI f
CAG CCC GGG ATG AAG ACC ACA TGT TTC C
1089 MVP24-SmaI f
CAG CCC GGG ATG GCA GAA TTA TCA ACG CG
1091 MVP40-SmaII f
CAG CCC GGG ATG GCC AGT TCC AGC AAT TAC
1107 VP24-Flag-N+
CGG GAT CCA CCA TGG ACT ACA AGG ACG ACG ATG
ACA AGG CAG AAT TAT CAA CGC GTT AC
1108 VP24-HA-N+
CGG GAT CCA CCA TGG CTT ACC CTT ACC CTT ATG
ATG TGC CGG ATT ATG CCG CAG AAT TAT CAA CGC
GTT AC
1109 VP24-myc-N+
CGG GAT CCA CCA TGG AAC AAA AAC TCA TCT CAG
AAG AGG ATC TGG CAG AAT TAT CAA GCC GTT AC
MARV-spezifische Rückwärtsprimer
138 NP 43.1 Acc R CCT CAT ATC TGT TAT CAT CTA
435 VP24 - Flag
(Pst I)
CTG CAG TTA GTT GTC ATC GTC GTC CTT GTA GTC
CAT TAT AGC AAT TTT GCT GTT C
719 VP24Flag/mutR CGA GCT GCA GTT ACT TGT CAT CGT CG
959 VP40-PPxA- GCA CCG TGA TCA GCA GCA GGA GGG GGG TTC
1085 MGP-NotI r GTC GCG GCC GCT TAT CCG ATA TAT TTA GTA AAG
1088 MVP24-NotI r GTC GCG GCC GCT TAT ATA GCA ATT TTG CTG
1092 MVP40-NotI r GTC GCG GCC GCT CAA ACG GCA CTG AGC G
1110 VP24-HA-C- CGG GAT CCT TAG GCA TAA TCC GGC ACA TCA TAA
2 Material 35
GGG TAT ATA GCA ATT TTG CTG TTC ATG
1111 VP24-myc-C- CGG GAT CCT TAC AGA TCC TCT TCT GAG ATG AGT
TTT TGT TCT ATA GCA ATT TTG CTG TTC ATG
Vektorspezifische Primer
125 pTM1-F ATT GTA TGG GAT CTG ATC TGG
174 pTM1-R GCC AAC TCA GCT TCC TTT CGG
600 pGEX-F GCA GGG CTG GAC AGC CAC GTT TGG TGG TGG CG
601 pGEX-R CCG TCT CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG
1233 pCAGGS-forw CCT TCT TCT TTT TCC TAC AG
1234 pCAGGS-rev CCT TTA TTA GCC AGA AGT CAG
Die Schnittstellen von Restriktionsendonukleasen wurden unterstrichen.
Nukleotidaustausche wurden durch Fett-Druck hervorgehoben. Die Primer #125 bis
#435 wurden von Dr. M. Krause am Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung
in Marburg synthetisiert. Die Primer #718 bis #1234 wurden von der Firma MWG
Biotech in München synthetisiert.
2.8 Vektoren und rekombinante Plasmide
2.8.1 Vektoren
pTM1 B. Moss, NIH, Bethesda (USA)
pCAGGS-MCS-5 Institut für Virologie, Marburg
pGEX-6P1 Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg
2.8.2 Rekombinante Plasmide
pTM1-MARV-VP24 Institut für Virologie, Marburg
pTM1-MARV-NP Institut für Virologie, Marburg
pTM1-MARV-GP Institut für Virologie, Marburg
pTM1-MARV-VP40 Institut für Virologie, Marburg
2 Material 36
kloniertes Plasmid
Matrizen-DNA Oligonukleotide Klonierungs-strategie
Zielvektor
pTM1-Flag-VP24 pTM1-VP24 #1107 / #174 PCR + RL pTM1
pTM1-HA-VP24 pTM1-VP24 #1108 / #174 PCR + RL pTM1
pTM1-myc-VP24 pTM1-VP24 #1109 / #174 PCR + RL pTM1
pTM1-VP24-Flag pTM1-VP24 #125 / #435
#718 / #719
PCR, IVM pTM1
pTM1-VP24-HA pTM1-VP24 #125 / #1110 PCR + RL pTM1
pTM1-VP24-myc pTM1-VP24 #125 / #1111 PCR + RL pTM1
pGEX-6P1-VP24 pTM1-VP24 RL: BamHI pGEX-
6P1
pCAGGS-VP24 pTM1-VP24 #1088 / #1089 PCR + RL pCAGGS
pCAGGS-HA-VP24 pTM1-VP24 RL: EcoRI, XhoI pCAGGS
pCAGGS-VP40 pTM1-VP24 #1091 / #1092 PCR + RL pCAGGS
pCAGGS-VP40-
PPPA
pTM1-VP24 #958 / #959
#1091 / #1092
IVM, PCR + RL pCAGGS
pCAGGS-GP pTM1-GP #1085 / #1086 PCR + RL pCAGGS
pCAGGS-NP pTM1-NP RL: EcoRI pCAGGS
2.9 Proteine
2.9.1 Enzyme
Alkalische Phosphatase,
Calf Intestinal Phosphatase (CIP) (10 U / µl)
New England Biolabs GmbH,
Frankfurt
Pfu-TurboTM DNA-Polymerase (2.5 U / µl) Stratagene, Heidelberg
Proteinase K, lyophilisiert Sigma-Aldrich, Deisenhofen
SAWADY PWO DNA-Polymerase (1U / µl) Peqlab Biotechnologie GmbH,
Erlangen
Restriktionsendonukleasen:
BamHI (20 U / µl), DpnI (20 U / µl),
EcoRI (20 U / µl), PstI (20 U / µl), SacI (20 U / µl),
SmaI (20 U / µl), StuI (20 U / µl), XhoI (20 U / µl)
New England Biolabs GmbH,
Frankfurt
RNase A Qiagen, Hilden
Tabelle 2: Für Klonierungen verwendete DNA-Matrizen und Oligonukleotide. Die Bezeichnung der Oligonukleotide erfolgte mit der internen Labornummer (#n), deren genaue Bezeichnung und Sequenz unter 2.7.4 verzeichnet ist. PCR: Polymerase-Ketten-Reaktion (3.1.3.3), RL: Restriktionsverdau (3.1.3.1) mit anschließender Ligation (3.1.3.4); IVM: in vitro Mutagenese (3.1.3.5).
2 Material 37
RNase-Inhibitor (RNasin) aus humaner Plazenta Roche, Mannheim
T4-DNA-Ligase (4 U / µl) New England Biolabs GmbH,
Frankfurt
2.9.2 Antikörper
α GST-MARV-VP24, Kaninchen (27.06.2002) Institut für Virologie, Marburg
α MARV-VP24, Kaninchen (17.08.94) Institut für Virologie, Marburg
α MARV-NC, Kaninchen (1 M NaCl, 11.06.1996) Institut für Virologie, Marburg
α MARV-GP, Kaninchen (glykosyliert, 3/95,
11.09.1996)
Institut für Virologie, Marburg
α MARV-GP, Kaninchen (nicht glykosyliert, 3/95,
11.09.1996)
Institut für Virologie, Marburg
α MARV-NP 2B10, Maus, monoklonal Institut für Virologie, Marburg
α MARV-VP40, Maus, monoklonal CDC, Atlanta (USA)
α MARV-VP35/2, Meerschweinchen (16.04.1998) Institut für Virologie, Marburg
α MARV-VP30 #249, Meerschweinchen Institut für Virologie, Marburg
α HA 11 16B12, Maus, monoklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc.,
Heidelberg
α α-tubulin, Maus, monoklonal Sigma-Aldrich, Deisenhofen
α FlagTM M2, Maus, monoklonal Sigma-Aldrich, Deisenhofen
α FlagTM, Kaninchen Sigma-Aldrich, Deisenhofen
α c-myc sc-789, Kaninchen Santa Cruz Biotechnology, Inc.,
Heidelberg
α Lamp-1, Maus, monoklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc.,
Heidelberg
α Lamin A/C sc-7292, Maus, monoklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc.,
Heidelberg
Ziege α Maus, Rhodamin-gekoppelt Dianova, Hamburg
Esel α Kaninchen, FITC-gekoppelt Dianova, Hamburg
Ziege α Maus FITC-gekoppelt Dianova, Hamburg
Ziege α Kaninchen, Rhodamin-gekoppelt Dianova, Hamburg
Ziege α Maus, POD DAKO-Diagnostika GmbH,
Hamburg
Ziege α Meerschweinchen, POD DAKO-Diagnostika GmbH,
Hamburg
Ziege α Kaninchen, POD Dianova, Hamburg
2 Material 38
2.9.3 Proteine, Peptide und Aminosäuren
Glutathion, gebunden an Sepharose CL-4B Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Protein A, gebunden an Sepharose CL-4B Sigma-Aldrich, Deisenhofen
RainbowTM Protein Molecular Weight Marker
14,3 - 220 kD
Amersham Pharmacia Biotech
Europe GmbH, Freiburg
2.10 Radioaktiv markierte Substanzen
[14C] RainbowTM Protein Molecular Weight Marker
14,3 - 200 kDa
Amersham Pharmacia Biotech
Europe GmbH, Freiburg
[35S]-PromixTM Redivue, 14,3 mCi / ml
(Methionin 10 mCi / ml)
Amersham Pharmacia Biotech
Europe GmbH, Freiburg
2.11 Zellen und Viren
2.11.1 Prokaryotische Zellen
E. coli Stamm BL-21 Amersham Pharmacia Biotech
Europe GmbH, Freiburg Genotyp: B F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal, dcm
E. coli Stamm XL1-Blue Stratagene, Heidelberg
Genotyp: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F‘ proAB laclqZ∆M15 Tn10
(Tetr)]
2.11.2 Eukaryotische Zellen
HeLa-Zellen (humane epitheliale Zervixkarzinomzellen): ATCC Klon CCL-2
HEK 293-Zellen (humane, embryonale Nierenzellen)
Vero-Zellen (Nierenzellen der affrikanischen Meerkatze)
2.11.3 Viren
rekombinantes Vacciniavirus MVA-T7 Sutter et al., 1995 Marburg-Virus (MARV-Musoke) Institut für Virologie, Marburg
3 Methoden 39
3 Methoden
3.1 Molekularbiologische Methoden
3.1.1 Isolierung und Reinigung von DNA
DNA, die in molekularbiologische Experimente eingesetzt wird, darf keine
Verunreinigungen enthalten. Phenol, Chloroform, Ethanol, EDTA, Detergenzien, Salze
oder Proteine greifen negativ in den Verlauf nachfolgender biochemischer Reaktionen
ein.
3.1.1.1 Reinigung von DNA-Fragmenten > 100 bp
Die DNA wurde mit dem QIAquick PCR Purification Kit über eine Säulenmatrix
gereinigt, wobei die Durchführung laut beiliegendem Protokoll erfolgte. Die gereinigte
DNA wurde in 30 - 50 µl dH2O von der Säulenmatrix eluiert. Diese Reinigung wurde
nach der Durchführung einer PCR (3.1.3.3) bzw. nach einem Restriktionsverdau
(3.1.3.1) durchgeführt.
3.1.1.2 Isolierung von DNA aus Agarosegelen
Zur Extraktion von DNA aus präparativen Agarosegelen wurde das QIAquick Gel
Extraction Kit entsprechend der beiliegenden Arbeitsanleitung verwendet. Die DNA
wurde über eine Säulenmatrix gereinigt und in 30 µl dH2O eluiert. Ein Zehntel des
Eluats wurde zur Kontrolle der Präparation auf einem analytischen Agarosegel
(3.1.2.1.2) aufgetrennt.
3.1.1.3 Ethanolfällung
Mittels Ethanolfällung kann DNA gereinigt und ankonzentriert werden.
Ansatz: x µl DNA-Lösung
1 µl Glykogen (20 µg / µl)
x/10 µl 3 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,2
ad 2,5fache des bisherigen Volumens 100 % Ethanol
Die Präzipitation erfolgte durch Vortexen bei Raumtemperatur (RT). Das Präzipitat
wurde 30 Minuten bei 13.000 UpM abzentrifugiert. Das durch die Verwendung von
Glykogen gut sichtbare Pellet wurde mit 300 µl 70 % Ethanol gewaschen, weitere 15
Minuten bei 13.000 UpM abzentrifugiert und das DNA-Pellet bei RT getrocknet. Diese
Art der Reinigung wurde nach DNA-Sequenzierung (3.1.2.3) durchgeführt.
3 Methoden 40
3.1.2 Analyse von DNA
3.1.2.1 Elektrophoretische Auftrennung
DNA kann unter nativen Bedingungen entsprechend ihrer Molekülgröße in einer
Agarosegelmatrix elektrophoretisch aufgetrennt werden. Die Nukleinsäuren bewegen
sich aufgrund ihrer negativen Ladung in einem elektrischen Feld in Richtung der Anode
(⊕-Pol), wobei kleinere Fragmente schneller wandern als große. Präparative Gele
dienen der Reinigung, analytische der Größenbestimmung von Nukleinsäuren nach
enzymatischen Reaktionen.
3.1.2.1.1 Präparative DNA-Agarosegele
Agarosegel: 1 % (w/v) Agarose NA in 1x TAE-Puffer gelöst
Laufpuffer: 1x TAE-Puffer, pH 8,0
Die Agarose wurde durch Erhitzen in TAE-Puffer gelöst und in einen Gelschlitten
gegossen. Die DNA-Proben wurden nach Erstarren des Gels mit 1/6 Volumen 6x DNA-
Probenpuffer versetzt und anschließend zusammen mit einem DNA-Längenstandard
aufgetrennt. Die Auftrennung erfolgte bei einer konstanten Stromstärke von 60 mA bei
maximaler Spannung. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel für 20
Minuten in einer wässrigen Ethidiumbromidlösung (1 µg / ml) gefärbt und die DNA
unter UV-Beleuchtung von 302 nm Wellenlänge sichtbar gemacht. Die gewünschten
DNA-Banden wurden auf dem UV-Schirm einzeln mit einem Skalpell ausgeschnitten
und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt.
3.1.2.1.2 Analytische DNA-Agarosegele
Agarosegel: 1 % (w/v) Agarose, ultrarein in 1x TBE-Puffer gelöst
Laufpuffer: 1x TBE-Puffer, pH 8,0
Aufbau- und Elektrophoresebedingungen entsprechen denen präparativer Agarosegele
(3.1.2.1.1). Nach Färbung der DNA wurde diese mithilfe des Geldokumenta-
tionssystems GelDoc 2000 visualisiert.
3.1.2.2 Quantifizierung von DNA
Zur Bestimmung der Konzentration von wässrigen DNA-Lösungen wurde deren
Absorptionsvermögen photometrisch mithilfe des GeneQuant II bei einer Wellenlänge
von 260 nm in einer Quarzküvette mit 1 cm Lichtweg analysiert. Eine Absorption von 1
entsprach dabei einer Konzentration von 50 µg / ml für doppelsträngige (ds) DNA.
Um Extinktionen im linearen Bereich (zwischen 0,1 und 0,8) zu erhalten, wurden die
Proben entsprechend in dH2O verdünnt.
3 Methoden 41
Der Quotient OD260/OD280 erlaubt eine Aussage über die Reinheit von
Nukleinsäurepräparationen. Reine Lösungen sind durch Quotienten zwischen 1,8 und
2,0 charakterisiert. Verunreinigungen durch Proteine ergeben einen Wert kleiner als
1,8, Kontaminationen durch Phenol oder RNA ergeben deutlich höhere Quotienten.
3.1.2.3 Sequenzanalyse mit dem ABI PrismTM 377 DNA Sequencer
Das Prinzip dieser Sequenzierung beruht auf der Kettenabbruchmethode nach Sanger
und Coulson (Sanger and Coulson, 1975). Bei der hier verwendeten Modifikation der
Methode wird die zu sequenzierende DNA durch PCR amplifiziert. Neben den
Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTPs) dATP, dCTP, dGTP und dTTP befinden sich
im Reaktionsgemisch geringe Konzentrationen der unterschiedlich fluoreszenz-
markierten Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTPs) ddATP, ddCTP, ddGTP und
ddTTP. Die Sequenzierung kann bei diesem System in einem Reaktionsgefäß
erfolgen. Während der Synthesereaktion kommt es durch den Einbau der ddNTPs zu
statistisch verteilten Abbrüchen der Komplementärstrangsynthese. Die Abbruch-
fragmente werden über ein Harnstoff-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Der untere Rand
des Gels wird durch einen Argon-Laser abgetastet. Seine Hauptemission liegt bei
Wellenlängen von 488 nm und 514,5 nm. Die Fluoreszenzfarbstoffe werden durch den
Laser angeregt und senden spezifische Fluoreszenzstrahlung aus. Diese wird über
eine CCD-Kamera digitalisiert, auf den Computer übertragen und durch spezielle
Software analysiert.
Die Sequenzierung erfolgte mit dem ABI Prism™ 377 DNA Sequencer und dem ABI
Prism™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit von Perkin Elmer. Zur
Synthese der DNA wurde die im Kit enthaltene AmpliTaq DNA-Polymerase FS
eingesetzt. Diese Polymerase baut im Gegensatz zur Taq DNA-Polymerase verstärkt
Didesoxynukleotide ein.
Reaktionsansatz: 1 µl DNA (1 µg / µl)
1 µl Primer (5 µM)
4 µl Terminations-Mix
ad 20 µl dH2O
Programm: Zyklen Temperatur Zeit
Denaturierung 1 95 °C 30 sec
Denaturierung 25 95 °C 30 sec
Annealing 50 °C 15 sec
Synthese 60 °C 4 min
Ende der Synthese 1 4 °C ∞
3 Methoden 42
Anschließend wurde die amplifizierte DNA durch Ethanolfällung (3.1.1.3) gereinigt, das
Pellet in 4 µl Sequenzier-Probenpuffer resuspendiert und drei Minuten bei 95 °C
denaturiert. Auf das Harnstoff-Polyacrylamidgel wurden 2 µl der Probe aufgetragen.
Sequenzgel: 5 % Polyacrylamidgel / 7 M Harnstoff
21,0 g Harnstoff
8,4 ml 30 % Polyacrylamid-Lösung (29:1)
6,0 ml 10× TBE
20,0 ml dH2O
Die Gellösung wurde 45 Minuten gerührt, bis der Harnstoff vollständig gelöst war.
Anschließend wurde sie über eine 0,2 µm Membran filtriert und fünf Minuten entgast.
Während dieser Zeit konnte die Gelapparatur aufgebaut werden, wobei darauf zu
achten war, dass die Glasscheiben vorher gründlich mit dem Detergenz Alconox, dH2O
und 90 % Isopropanol gereinigt wurden.
Die Polymerisation des Gels wurde durch Zugabe von APS und TEMED gestartet.
300 µl 10 % (w/v) APS
20 µl TEMED
Die Auftrennung der Proben erfolgte elektrophoretisch in TBE-Puffer (pH 8,0) bei 48 W
über einen Zeitraum von acht Stunden.
3.1.3 Klonierung und Mutagenese von DNA
3.1.3.1 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Restriktionsendonukleasen sind Enzyme bakteriellen Ursprungs, welche die
Phosphordiesterbindungen beider Stränge eines DNA-Moleküls an spezifschen
Erkennungssequenzen hydrolytisch spalten. Man kann sie präparativ zum
Herausschneiden eines Inserts aus einem Vektor oder zur Analyse von DNA
verwenden, wobei zwei DNA-Moleküle, die sich in Anzahl oder Position der
Erkennungsstellen unterscheiden, nach einem analytischen Restriktionsverdau und
Gelelektrophorese im Gel verschiedene Bandenmuster erzeugen.
Beim Verdau mittels Restriktionsendonukleasen muss darauf geachtet werden, dass
die Reaktionsbedingungen dem jeweiligen Restriktionsenzym optimal angepasst
werden. Temperatur, Pufferzusammensetzung und Zusatz von BSA richten sich nach
den Angaben des Herstellers. Bei einem Doppelverdau durch zwei Restriktionsenzyme
kann dies gleichzeitig in einem Ansatz geschehen, sofern die Enzyme die gleichen
3 Methoden 43
Reaktionsbedingungen benötigen. Ansonsten muss die DNA nach dem ersten Verdau
mittels QIAquick™ PCR Purification Kit gereinigt werden (3.1.1.1), bevor sie mit dem
zweiten Enzym verdaut werden kann.
Der Restriktionsverdau wurde für einen möglichst vollständigen Verdau je nach Enzym
2 bis 16 Stunden inkubiert.
Ansatz für analytischen Verdau: 0,2 - 1 µg DNA
1 µl 10x Puffer nach Herstellerangaben
(1 µl 10 % BSA, falls notwendig)
1 - 5 U Restriktionsendonuklease A
(0,5 – 2,5 U bei Doppelverdau)
(0,5 – 2,5 U Restriktionsendonuklease
B bei Doppelverdau)
ad 10 µl
(ad 20 µl
dH2O
dH2O, wenn mit 2 Enzymen verdaut
wurde)
Anschließend wurde der Verdau mit einem analytischen Agarosegel (3.1.2.1.2)
überprüft.
Ansatz für präparativen Verdau: 2 - 10 µg DNA
10 µl 10x Puffer
(10 µl 10 % BSA, falls notwendig)
10 - 30 U Restriktionsendonuklease A (5 - 15 U
bei Doppelverdau)
(5 - 15 U Restriktionsendonuklease B
bei Doppelverdau)
ad 100 µl dH2O
Wenn die DNA in weiteren Reaktionen verwendet werden soll, muss sie nach dem
Verdau entweder mithilfe des PCR-Purification-Kit (3.1.1.1) oder über ein präparatives
Gel (3.1.2.1.1) mit anschließender Gelextraktion (3.1.1.2) aufgereinigt werden.
3.1.3.2 Dephosphorylierung linearisierter DNA
Um die Religation linearisierter Vektoren zu verhindern, werden die 5’-
Phosphatgruppen der verdauten Plasmide durch die Behandlung mit alkalischer
Phosphatase (calf intestinal phosphatase, CIP) entfernt. Dazu wurde nach dem
Restriktionsverdau 1 µl CIP in den Ansatz gegeben und eine Stunde bei 37°C
inkubiert. Da die alkalische Phosphatase in den meisten Restriktionspuffern aktiv ist, ist
3 Methoden 44
eine vorherige Reinigung im Allgemeinen nicht notwenig. Die Inaktivierung der CIP
erfolgte durch Zugabe von 0,5 µl einer 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0) für 10 min bei
72 °C. Die DNA wurde anschließend mit dem QIAquick PCR Purification Kit der Firma
Qiagen (Hilden) gereinigt und in 30 µl dH2O aufgenommen (3.1.1.1).
3.1.3.3 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Mittels PCR können spezifische DNA-Abschnitte vermehrt werden. Für jede Reaktion
benötigt man zwei verschiedene Primer, die an jeweils einen DNA-Strang binden. Der
Vorwärts-Primer enthält die ersten 15 bis 25 Nukleotide der zu amplifizierenden
Sequenz, der Rückwärts-Primer die letzten 15 bis 25 Nukleotide des komplementären
Stranges. Je nach Klonierungsstrategie können Primer im 5’-Bereich zusätzliche
Sequenzen, z.B. Schnittstellen für Restriktionsenzyme, enthalten (Abbildung 5).
Im ersten Schritt des Reaktionszyklus (Denaturierung) wird die DNA-Matrize durch
Erhitzen in ihre Einzelstränge zerlegt. Im zweiten Schritt (Annealing) erniedrigt man die
Temperatur entsprechend der Basenzusammensetzung und Länge der Primer, damit
diese an die komplementären Sequenzabschnitte der einzelsträngigen DNA-Matrize
binden können. Anschließend erfolgt die Synthese des Doppelstranges ausgehend
vom 3’-Ende des jeweiligen Primers. Die dafür verwendete hitzestabile PWO DNA-
Polymerase ist durch eine hohe Lesegenauigkeit und Korrekturlesefunktion (3’-5’-
Exonukleaseaktivität) ausgezeichnet. Der Reaktionszyklus wird mehrfach wiederholt,
wobei die zu amplifizierende DNA im Reaktionsgemisch exponentiell angereichert wird.
Abbildung 5: Prinzip einer PCR. Der vergrößerte DNA-Abschnitt soll amplifiziert werden. Gleiche Linien stehen fürgleiche Sequenzen, gestrichelte und gepunktete Bereiche, sofern sie einandergegenüberliegen, sind komplementär. Die Synthese erfolgt in 5’-3’-Richtung.
dsDNA
Rückwärts-Primer
5’3’
5’ 3’
3’
5’
3’
5’
Vorwärts-Primer
3 Methoden 45
Reaktionsansatz: 10 ng DNA
30 µM Vorwärts-Primer
30 µM Rückwärts-Primer
je 1,5 µl 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
10 µl 10× Puffer für PWO DNA-Polymerase (komplett)
ad 99,5 µl dH2O
0,5 µl PWO DNA-Polymerase
Programm: Zyklen Temperatur Zeit
Denaturierung 1 95 °C 5 min
Denaturierung 35 95 °C 1 min
Annealing 50 – 60 °C 1 min
Synthese 72 °C 2 min + 5 sec pro
Zyklus
Nach Durchlaufen der Zyklen wurden 5 µl des Reaktionsansatzes auf einem
analytischen Agarosegel (3.1.2.1.2) überprüft. Anschließend wurde das entstandene
DNA-Fragment mittels eines präparativen Agarosegels (3.1.2.1.1) aufgetrennt und
durch Gelextraktion (3.1.1.2) gereinigt.
3.1.3.4 Ligation von DNA-Fragmenten in linearisierte Vektoren
Bei der Ligation von DNA-Fragmenten in einen zuvor mit geeigneten
Restriktionsendonukleasen geschnittenen Vektor katalysiert die DNA-Ligase die
Bildung von Phosphodiesterbrücken zwischen freien 5’-Phosphatgruppen eines DNA-
Stranges mit den freien 3’-OH-Gruppen eines zweiten Stranges.
Insertions- und Vektor-DNA wurden in einem Verhältnis von 7,5:1 eingestetzt.
Ansatz: 20 - 200 ng verdaute, gereinigte Insert-DNA (3.1.3.1, 3.1.1.1)
25 - 50 ng linearisierte, gereinigte Vektor-DNA (3.1.3.1, 3.1.1.1)
1 µl 10x Ligationspuffer mit rATP
0,5 µl T4-DNA-Ligase (4 U / µl)
ad 10 µl dH2O
Zur Abschätzung des Verhältnisses von religierten Plasmiden zu Plasmiden mit
Insertionen wurde eine Religationskontrolle mitgeführt, in der das zu klonierende Insert
durch dH2O ersetzt wurde. Als Ligationskontrolle diente ein phosphoryliertes
linearisiertes Plasmid, das nur mit einem Restriktionsenzym geschnitten wurde.
3 Methoden 46
Der Ansatz wurde eine Stunde bei RT inkubiert und anschließend in Z-kompetente
XL1-blue Zellen transformiert (3.1.3.6).
3.1.3.5 Ortsgerichtete Mutagenese von Plasmid-DNA
Mittels in vitro Mutagenese ist es möglich, Punktmutationen, Deletionen und
Insertionen in Plasmid-DNA einzubringen. Die Methode beruht auf einer Polymerase-
Ketten-Reaktion (PCR) mit speziell entworfenen, zueinander komplementären Primern,
welche die gewünschte Mutation enthalten.
Die Plasmid-DNA wurde mit den entsprechenden Primern durch rekombinante
PfuTurboTM-DNA-Polymerase amplifiziert, wobei die Amplifikate die durch die Primer
eingeführten Mutationen enthalten. Anschließend wurde der PCR-Ansatz drei Stunden
bei 37 °C nach Zugabe von 1 µl DpnI inkubiert, ein Restriktionsenzym, welches
methylierte DNA vollständig in kleinste Fragmente verdaut. Dadurch wurde die
methylierte Ausgangs-DNA abgebaut, während die nicht methylierte, neu synthetisierte
DNA intakt blieb. 10 µl des Amplifikationsansatzes wurden direkt in XL1-Blue Zellen
transformiert (3.1.3.6). Zur Kontrolle wurden außerdem 5 µl des Reaktionsproduktes
mit einem analytischen Agarosegel (3.1.2.1.2) dargestellt.
Ansatz der PCR: 50 ng DNA
125 ng Vorwärts-Primer
125 ng Rückwärts-Primer
je 1 µl 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
5 µl 10x Puffer für die PfuTurboTM-DNA-Polymerase
ad 49 µl dH2O
1 µl PfuTurboTM-DNA-Polymerase (2,5 U / µl)
Programm: Zyklen Temperatur Zeit
Denaturierung 1 95 °C 30 sec
Denaturierung 16 95 °C 30 sec
Annealing 55 °C 1 min
Synthese 68 °C 2 min / kb Plasmidlänge
Ende der Synthese 1 4 °C ∞
3 Methoden 47
3.1.3.6 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA
Rekombinante Plasmide werden in vivo durch Replikation und Teilung transformierter
Bakterienzellen vermehrt. Um DNA in Bakterienzellen zu transformieren, ist es
notwendig, die Bakterien der Wahl kompetent, sie also aufnahmefähig für DNA zu
machen.
Mit dem Z-Competent E. coli Transformation KitTM and Buffer Set wurden E. coli-Zellen
laut beiliegendem Protokoll behandelt, aliquotiert und bei –80 °C gelagert.
Vor einer Transformation wurden die Z-kompetenten E. coli-Zellen zügig in der Hand
aufgetaut. Nach der Zugabe von 100 µl Zellsuspension zur DNA-Lösung (z.B. 10 µl
Ligationsansatz) erfolgte eine Inkubation der Zellen für eine Stunde auf Eis. Schließlich
wurde der komplette Ansatz auf LB-Agarplatten mit Ampicillin (100 µg / ml) ausge-
strichen und über Nacht (ÜN) bei 37 °C inkubiert. Die transformierten Bakterien
verfügen durch die aufgenommenen Plasmide über ein Ampicillin-Resistenzgen und
können deshalb auf den ampicillinhaltigen Agarplatten wachsen.
3.1.4 Vervielfältigung von DNA
3.1.4.1 Plasmidpräparation im kleinen Maßstab (Miniprep)
Mit Plasmidpräparationen kleinen Maßstabs können rekombinante Plasmide aus
Bakterien isoliert und anschließend charakterisiert werden. Dies geschah unter Ver-
wendung des QIAprep® Spin Miniprep Kits bzw. des E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit I.
Die Funktionsweise der Kits beruht auf der Adsorption der DNA an eine in Säulen
verpackte Silicagel-Matrix, wobei Waschung und Elution der gebundenen DNA durch
Zentrifugation erfolgt. Eine einzelne Bakterienkolonie wurde in 4 ml 2YT-Medium mit
100 µg / ml Ampicillin resuspendiert und über Nacht bei 37 °C auf einem Schüttler
inkubiert. Von dieser Bakterien-Übernachtkultur (ÜNK) wurden 2 ml entsprechend den
beiliegenden Arbeitsprotokollen zur Präparation der DNA bearbeitet. Die DNA wurde in
50 µl dH2O eluiert. 5 µl des gewonnenen Eluats wurden zur Analyse mit geeigneten
Restriktionsendonukleasen verdaut (3.1.3.1) und auf einem analytischen Gel
(3.1.2.1.2) aufgetrennt.
3.1.4.2 Plasmidpräparation im großen Maßstab (Maxiprep)
Eine Plasmidpräparation großen Maßstabs erfolgte unter Verwendung des QIAfilter
Plasmid Maxi Kits bzw. des HiSpeed Plasmid Maxi Kits. Beide Anwendungen basieren
auf einer alkalischen Lyse von Bakterienzellen (Sambrook et al., 1989) mit
anschließender Adsorption der Plasmid-DNA an eine Anionenaustauscher-Matrix. Als
Ausgangsmaterial wurden 100 µl einer ÜNK (3.1.4.1) des gewünschten Bakterienklons
3 Methoden 48
in 100 ml LB-Medium mit 100 µg / ml Ampicillin überführt und 16 bis 20 Stunden bei 37
°C auf einem Schüttler inkubiert. Die Präparation wurde anhand des mitgelieferten
Handbuches durchgeführt und die gereinigte DNA schließlich in 500 µl dH2O
aufgenommen. Mithilfe eines Photometers wurde die DNA-Konzentration bestimmt
(3.1.2.2) und einheitlich auf 1 µg / µl eingestellt.
3.1.5 Reinigung und Analyse von RNA
3.1.5.1 Reinigung von viraler RNA aus Zellkulturüberstand
Zur Aufreinigung viraler RNA aus Zellkulturüberstand wurde das QIAamp® Viral RNA
Mini Kit entsprechend der beiliegenden Arbeitsanleitung verwendet. Die RNA wurde
über eine Säulenmatrix gereinigt, in 30 µl nukleasefreiem dH2O eluiert und die RNA-
Konzentration photometrisch bestimmt (3.1.5.2).
3.1.5.2 Quantifizierung von RNA und siRNAs
Zur Bestimmung der RNA-Konzentration einer wässrigen Lösung wurde deren
Absorption bei einer Wellenlänge von λ=260 nm UV-photometrisch gemessen. Eine
Absorption von 1 entspricht dabei einer Konzentration von 40 µg RNA / ml.
Zur Quantifizierung von synthetischen siRNAs wurde die gelieferte Lösung 1:10 in
dH2O verdünnt und deren Absorption bei λ=260 nm UV-photometrisch mithilfe einer
Mikroküvette gemessen. Zur Berechnung der siRNA-Konzentration wurden folgende
Formeln verwendet:
OD260 ∗ Verdünnung ∗ 40 µg siRNA / ml pro OD-Einheit = siRNA-Konzentration µg / ml
Die molare Konzentration der siRNA in µM bestimmt man durch die Formel:
x µg / ml siRNA-Konzentration ÷ 14 µg siRNA / nmol siRNA = X µM siRNA
3.1.6 Real-time RT-PCR Analyse mittels SYBR Green dye I
Die Real-time RT-PCR mit der LightCycler-Technologie ist derzeit die exakteste
Methode zur quantitativen und gleichzeitig auch qualitativen Erfassung der
Genexpression in einem einzigen Reaktionsansatz. Bei diesem Verfahren wird die
Amplifikation mit der qualitativen Detektion unmittelbar kombiniert. Dies geschieht mit
einem Fluoreszenzfarbstoff (SYBR Green), der sich in die sogenannte "Minor Groove"
(„kleine Furche“) von doppelsträngiger DNA einlagert. Durch diese Bindung wird die
emittierte Fluoreszenz von SYBR Green um ein vielfaches verstärkt und man erhält ein
Signal, dessen Intensität direkt proportional zu der Zahl und Größe der vorhandenen
Doppelstränge ist. Im LightCycler wird diese emittierte Fluoreszenz nach jedem Zyklus
(Verdoppelung der Menge an doppelsträngiger DNA) gemessen. Nach einer
3 Methoden 49
bestimmten Zahl von Zyklen (abhängig von der Zahl der Ausgangskopien) wird die
Fluoreszenz schließlich messbar. Dieses Signal ist direkt proportional zur Menge an
gebildeter DNA und steigt exponentiell bis zum Erreichen eines Maximums an.
Der hier gewählte Versuchsansatz diente nicht der absoluten Messung der RNA-
Konzentration, sondern der vergleichenden Darstellung in verschiedenen Ansätzen.
Für die Real-time RT-PCR wurde das SuperScriptTM One-Step RT-PCR with Platinum
Taq Kit verwendet.
Ansatz der PCR: 5 µl virale RNA aus Zellkulturüberstand
10 µl 2x Reaktionspuffer
1 µl Vorwärts-Primer #116 (10 µM)
1 µl Rückwärts-Primer #138 (10 µM)
0,2 µl 100x SYBR-Green
0,8 µl SuperScript II / Taq-Enzym-Mix
ad 20 µl nukleasefreises dH2O
Programm: Zyklen Temperatur Zeit
Reverse Transkription 1 45 °C 30 min
PCR
Denaturierung 50 95 °C 5 sec
Annealing 60 °C 10 sec
Synthese 72 °C 20 sec
Die PCR sowie Quantifizierung und Digitalisierung wurden automatisch durch den
LightCycler (Roche) durchgeführt und die erhaltenen Daten wurden mithilfe der
LightCycler Software ausgewertet.
3.2 Zellbiologische Methoden
3.2.1 Kultivierung von HeLa-, HEK293- und Vero-Zellen
Diese permanenten Zelllinien wurden in 162 cm2 Zellkulturflaschen in Dulbecco’s
Modified Eagle‘s Medium (DMEM) in Gegenwart von 10 % FCS, L-Glutamin und
Penicillin/Streptomycin kultiviert. Bei 37 °C und unter 5 % CO2-Begasung bildeten die
Zellen nach 3 bis 4 Tagen einen geschlossenen Zellrasen. Die Zellen wurden unter
einer Sicherheitswerkbank passagiert. Dazu wurden DMEM(+++), PBSdef und
Trypsin/EDTA auf 37 °C erwärmt. Altes Medium wurde entfernt und der Zellrasen nach
zweimaligem Waschen mit PBSdef durch Zugabe von 2 ml Trypsin/EDTA abgelöst.
3 Methoden 50
Dieser Vorgang dauert bei den verschiedenen Zelllinien unterschiedlich lange.
Während sich HEK293-Zellen bereits nach wenigen Sekunden ablösen, dauert dies bei
Vero-Zellen mitunter bis zu 20 Minuten. Daher müssen die Zellen während dieser
Behandlung ständig mikroskopisch kontrolliert werden. Hatten sich alle Zellen gelöst,
wurde die Reaktion mit 8 ml Wachstumsmedium gestoppt, die Zellen durch Pipettieren
resuspendiert und in der gewünschten Menge in neue Zellkulturflaschen bzw. -platten
mit DMEM(+++) überführt.
3.2.2 Transfektion von HEK293-Zellen mit Lipofectamine PlusTM
Um DNA in Zellen einzubringen, wird deren negative Ladung durch Komplexbildung
mit kationischen Lipiden maskiert. In dieser Form können die DNA-Lipidkomplexe sich
an die Zellmembran anlagern und diese passieren. Die HEK293-Zellen wurden einen
Tag vor Transfektion so umgesetzt, dass sie zum Transfektionszeitpunkt eine Dichte
von 50 bis 70 % aufwiesen. Die Transfektionsansätze wurden entsprechend den
Empfehlungen des Herstellers angesetzt.
pro well einer 6 well-
Platte
pro well einer 12 well-
Platte
5 cm-Schale
Ansatz I 4 µl LipofectamineTM
100 µl DMEM(+Q)
2 µl LipofectamineTM
50 µl DMEM(+Q)
9,1 µl LipofectamineTM
230 µl DMEM(+Q)
Ansatz II 1 - 10 µg DNA
100 µl DMEM(+Q)
6 - 10 µl Plus-ReagentTM
0,5 - 5 µg DNA +
50 µl DMEM(+Q)
5 µl Plus-ReagentTM
2,3 µg DNA
230 µl DMEM(+Q)
13,7 µl Plus-ReagentTM
Die Ansätze I und II wurden getrennt jeweils für 15 Minuten bei RT inkubiert,
miteinander vereinigt, durch Schütteln per Hand gründlich gemischt und für weitere 15
Minuten bei RT inkubiert. Währenddessen wurde das FCS-haltige Medium von den zu
transfizierenden Zellen abgenommen. Da sich HEK293-Zellen sehr leicht vom Boden
ablösen, wurden diese Zellen nicht mit DMEM(+Q) gewaschen. Anschließend wurden
auf ein well einer 6 well-Platte 800 µl, auf ein well einer 12-well-Platte 450 µl
DMEM(+Q) bzw 1,85 ml auf einer 5 cm-Schale vorgelegt. Nach Ablauf der
Inkubationszeit wurden die Gemische des Transfektionsansatzes zugesetzt. Nach
einer Inkubationszeit von drei Stunden bei 37 °C im Brutschrank wurde das
Transfektionsmedium vollständig abgenommen und durch 2 ml (6 well), 1 ml (12 well)
bzw. 5 ml (5 cm-Schale) DMEM(+++) ersetzt.
3 Methoden 51
3.2.3 Zellernte für Flotationsanalysen und Triton X-114 Phasen-partitionierung
HEK293-Zellen wurden für die Durchführung von Flotationsanalysen sowie Triton X-
114 Phasenpartitionierungen 24 Stunden nach Transfektion geerntet. Die Zellernte
erfolgte auf Eis, Zentrifugen und Puffer wurden auf 4 °C gekühlt. Für die
Flotationsanalysen wurden pro Ansatz 3 wells einer 6 well-Platte bearbeitet, für die
Phasenpartitionierung eine 5 cm-Schale.
Da HEK293-Zellen nur schwach am Boden der Zellkulturschalen haften, wurden sie
zunächst mithilfe einer Pipette im Medium vom Boden abgespült, in ein 15 ml
Reaktionsröhrchen überführt und die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 UpM und
4 °C in einer Heraeus-Zentrifuge pelletiert. Anschließend erfolgte das Waschen der
Zellen jeweils einmal mit 5 ml PBSdef und 5 ml Lysispuffer für Flotationen bzw. Triton X-
114 Lysispuffer mithilfe von Zentrifugation. Das Zellpellet wurde mit 300 µl Lysispuffer
für Flotationen versetzt und die Zellen mittels 10fachem Passagieren durch eine 22G-
Kanüle aufgeschlossen und homogenisiert. Die Zellkerne konnten durch fünfminütige
Zentrifugation bei 830 x g pelletiert werden und der postnukleäre Überstand wurde im
Weiteren für die Flotationsanalysen (3.3.6.1) bzw. die Phasenpartitionierung (3.3.6.3)
eingesetzt.
3.2.4 Ernte und Aufreinigung von Zellkulturüberstand zur Analyse freigesetzter Proteine in Form von virusähnlichen Partikeln (VLPs)
VLPs wurden durch Zentrifugation des Überstandes über ein Saccharose-Kissen
aufgereinigt. Pro Ansatz wurde eine 6 well-Platte mit den entsprechenden Plasmiden
wie unter 3.2.2 beschrieben, transfiziert und der Überstand sowie die Zellen 48
Stunden später geerntet.
Hierzu wurde das Medium von einer 6 well-Platte abgenommen, in ein 15 ml Reak-
tionsröhrchen überführt und, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen, bei 5000 UpM
und 4 °C in einer Heraeus-Zentrifuge zentrifugiert.
In UltraClearTM-Zentrifugenröhrchen für SW41-Rotoren wurden 2 ml 20 %ige
Saccharoselösung vorgelegt und vorsichtig mit dem zuvor zentrifugierten
Zellkulturüberstand überschichtet. Es folgte ein Ultrazentrifugations-Schritt für drei
Stunden bei 35.000 UpM und 4 °C in einem SW41 Rotor. Der Überstand wurde
dekantiert, die Röhrchen vorsichtig trocken gewischt, ohne den Boden zu berühren,
und das Pellet in 65 µl PBSdef resuspendiert. Anschließend wurde ein Proteinase K-
Verdau durchgeführt (3.3.5).
3 Methoden 52
Die Zellen wurden in PBSdef abgespült, in ein 15 ml Reaktionsröhrchen überführt und
durch Zentrifugation bei 1500 UpM und 4°C pelletiert. Das Pellet wurde in 800 µl
PBSdef resuspendiert und mit 400 µl 4x Proteinprobenpuffer versetzt.
3.2.5 Transfektion von Vero-Zellen mit LipofectamineTM 2000
Das Funktionsprinzip des Transfektionsreagents LipofectamineTM 2000 ist ähnlich dem
von Lipofectamine PlusTM (3.2.2), jedoch hat sich gezeigt, dass sich dieses Reagenz
besser zur Transfektion von chemisch synthetisierten siRNAs in Vero-Zellen eignet.
Die Zellen wurden 1 Tag vor Transfektion so umgesetzt, dass sie zum
Transfektionszeitpunkt eine Dichte von 50 bis 70 % aufwiesen. Sollte eine Immun-
fluoreszenzanalyse durchgeführt werden, wurden die Zellen auf Deckgläschen
ausgesät. Die Transfektionsansätze wurden entsprechend der Empfehlungen des
Herstellers angesetzt.
pro well einer 6 well-Platte pro well einer 24 well-Platte
Ansatz I 10 µl LipofectaminTM 2000
250 µl Opti-MEM I
2 µl LipofectaminTM 2000
50 µl Opti-MEM I
Ansatz II x µg DNA
100 µl Opti-MEM I
x µg DNA
x ng siRNA
50 µl Opti-MEM I
Die Ansätze I und II wurden getrennt jeweils für fünf Minuten bei RT inkubiert,
miteinander vereinigt, durch Schütteln per Hand gründlich gemischt und für weitere 30
Minuten bei RT inkubiert. Die Zellen wurden unterdessen 2x mit DMEM(+Q)
gewaschen. In den Zellkulturschalen wurden 2 ml (6 well) bzw. 0,5 ml (24 well)
DMEM(+Q) vorgelegt und nach Ablauf der Inkubationszeit mit den entsprechenden
Transfektionsgemischen versetzt. Nach einer vierstündigen Inkubationszeit bei 37 °C
im Brutschrank wurde das Transfektionsmedium abgenommen und durch 2 ml (6 well)
bzw. 0,5 ml (24 well) DMEM(+++) ersetzt. Die Zellernte erfolgte bei Immunfluoreszenz-
analysenen 24 Stunden nach Transfektion (p.t.), bei siRNA-Untersuchungen 48
Stunden p.t..
3.2.6 Transfektion von siRNAs in MARV-infizierte Vero-Zellen
Die Vero-Zellen wurden einen Tag vor der ersten Transfektion in 6 well-Platten
umgesetzt, sodass sie zum Transfektionszeitpunkt eine Dichte von 50 bis 70 %
aufwiesen.
3 Methoden 53
ein well einer 6 well-Platte
Ansatz I 10 µl LipofectamineTM 2000
250 µl Opti-MEM I
Ansatz II 1543 ng siRNA (= 44 nM)
250 µl Opti-MEM I
Die Transfektionsbedingungen entsprachen denen, die unter 3.2.5. beschrieben
wurden. Vier Stunden nach der ersten Transfektion wurde das Medium nach
zweimaligem Waschen durch 2 ml DMEM(+Q) mit 2,5 % FCS ersetzt und für weitere
vier Stunden inkubiert. Acht Stunden nach der ersten Transfektion fand die Infektion
der Vero-Zellen mit Marburgvirus (Stamm Musoke) mit einer m.o.i von ungefähr 1 p.f.u.
im Sicherheitslabor des Instituts für Virologie in Marburg statt. Die Inkubationszeit der
Viren auf den Zellen betrug eine Stunde. Durch zweimaliges Waschen wurden nicht
gebundene Viruspartikel entfernt und im direkten Anschluss fand eine zweite siRNA-
Transfektion, wie zuvor beschrieben, statt. Vier Stunden nach dieser zweiten Trans-
fektion wurden die Zellen nach zweimaligem Waschen mit DMEM(+++) für weitere 20
Stunden mit 2 ml DMEM(+++) bei 37 °C inkubiert. Die Ernte der Zellen und
Zellkulturüberstände fand 24 Stunden nach der Virusinfektion statt.
3.2.7 Ernte von Vero-Zellen sowie Zellkulturüberständen nach siRNA-Behandlung
Die Zellernte erfolgte auf Eis, Zentrifugen und Puffer wurden auf 4 °C gekühlt.
1,2 ml des Überstandes der MARV-infizierten Zellkulturplatten wurden abgenommen,
in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und Zellen sowie Zelltrümmer durch zwei-
minütige Zentrifugation bei 10.000 UpM entfernt. Der Überstand wurde für die
Isolierung viraler RNA mit AVL-Puffer (3.1.5.1) bzw. für Western Blot Analysen mit 4x
Proteinprobenpuffer versetzt.
Der Zellrasen wurden 1x mit PBSdef gewaschen und dann durch Zugabe von 500 µl
Trypsin / EDTA vom Boden der Zellkulturplatten abgelöst. Die Reaktion wurde durch
Zugabe von 700 µl DMEM(+++) gestoppt, die Zellen gründlich abgespült und in ein
1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Pelletierung der Zellen erfolgte durch eine fünf-
minütige Zentrifugation bei 1500 UpM in einer Eppendorf-Kühlzentrifuge. Nach dem
Waschen des Pellets mit 1 ml PBSdef wurden die Zellen in 100 bis 200 µl siRNA-
Lysispuffer resuspendiert, mit 4x Proteinprobenpuffer versetzt und für 10 Minuten bei
95 °C erhitzt. Die Proben wurden mittels Western Blot (3.3.1.4) analysiert.
3 Methoden 54
3.2.8 Das Vaccinia-Virus-Expressionssystem
Mit diesem System ist es möglich, Fremdgene in Zellen rekombinant zu exprimieren.
Die Zellen werden mit dem rekombinanten, modifizierten Vaccinia-Virus Ankara T7
(MVA-T7) infiziert (Sutter et al., 1995). Infizierte Zellen exprimieren dann die
viruskodierte DNA-abhängige-RNA-Polymerase des Phagen T7. Anschließend werden
die Zellen mit Plasmiden transfiziert, welche die zu exprimierenden Fremdgene unter
Kontrolle eines T7-Promotors enthalten. Durch die T7-RNA-Polymerase wird das
Fremdgen transkribiert und es kommt zu dessen Expression durch die zelluläre
Translationsmaschinerie.
3.2.8.1 Infektion und Transfektion von HeLa-Zellen
Zur Durchführung von Immunfluoreszenzanalysen wurden HeLa-Zellen auf runden
Deckgläsern (12 mm) in 6 well-Zellkulturplatten angezüchtet. Bei einer Konfluenz von
40 bis 60 % wurden die Zellen einmal mit vorgewärmtem DMEM(+Q) gewaschen. Die
Infektion erfolgte in einem Gesamtvolumen von 500 µl pro well, wobei 100 µl MVA-T7
mit der entsprechenden Menge DMEM(+Q) versetzt wurde. Dies entspricht ungefähr
einer Infektionsdosis von drei infektiösen Einheiten / Zelle. Anschließend fand eine ein-
stündige Inkubation bei 37 °C im Brutschrank auf einem Kippschüttler statt.
Für die DNA-Transfektion wurde Lipofectin®-Reagent verwendet, welches mit der DNA
spontan Lipid-DNA-Komplexe bildet. Für die Transfektion wurden zwei Ansätze (I und
II) in Polystyrolröhrchen vorbereitet:
I: 5 µl Lipofectin® Reagent II: 1 – 2 µg DNA
1 ml DMEM(+Q) 1 ml DMEM(+Q)
Nach einer 20-minütigen Inkubation der Ansätze I und II bei RT wurden diese vereinigt,
durch Vortexen gemischt und nochmals für 15 Minuten bei RT inkubiert. Das
Transfektionsvolumen für ein well einer 6 well-Platte betrug somit 2 ml. Vor Zugabe
des Transfektionsansatzes wurden die infizierten HeLa-Zellen einmal mit DMEM(+Q)
gewaschen. Die Transfektion erfolgte für 8 bis 14 Stunden bei 37 °C in einem
Brutschrank. Im Anschluss wurden die exprimierten Fremdgene durch
Immunfluoreszenzanalysen sichtbar gemacht.
3.2.8.2 Fixierung von Zellen durch Paraformaldehyd und Permeabilisierung mittels Triton X-100
Die Zellen wurden zunächst zweimal mit PBSdef gewaschen und anschließend mit 3 %
Paraformaldehyd in PBSdef für 15 Minuten bei RT fixiert. Nach der Fixierung folgte
3 Methoden 55
zweimaliges Waschen mit PBSdef und eine Inkubation der Zellen mit 0,1 M Glycin für
10 Minuten bei RT. Nach zwei weiteren Waschschritten mit PBSdef erfolgte die
Permeabilisierung der Zellen mit 0,1 % Triton X-100 in PBSdef für 10 Minuten bei RT.
Die Zellen wurden erneut gewaschen und für mindestens 10 Minuten mit
Blockierungspuffer überschichtet. Im Anschluss erfolgte die Immunfluoreszenzanalyse
(3.3.2).
3.3 Biochemische und immunologische Methoden
3.3.1 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen und deren Visualisierung
3.3.1.1 SDS-PAGE
Proteine werden unter reduzierenden Bedingungen durch diskontinuierliche SDS-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt (Laemmli, 1970). Die Proteine
werden dabei mit SDS komplexiert und dadurch negativ geladen. Die negativen SDS-
Protein-Komplexe wandern in einem Polyacrylamid-Gel nach Anlegen einer Spannung
in Richtung Anode (⊕-Pol) und trennen sich entsprechend ihrer Molekülgröße auf, da
kleinere Proteine schneller wandern als große. Das Gel besteht aus einem 4-%igen
Sammelgel und, je nach Größe der Proteine, einem höherprozentigen Trenngel.
Sammelgel: Trenngel:
4 % 12 %
dH2O 3,4 ml 3,3 ml
30 % Polyacrylamid-Lösung
(rotiphorese® Gel 30)
830 µl 4,0 ml
PAGE-Sammelgelpuffer 680 µl -
PAGE-Trenngelpuffer - 2,6 ml
10 % APS 50 µl 100 µl
TEMED 5 µl 4 µl
Den aufzutrennenden Proteinen wurde eine entsprechende Menge an 4x
Proteinprobenpuffer zugegeben und die Proben für fünf Minuten bei 95 °C inkubiert. Es
folgte die Beladung des SDS-Gels. Als Größenmarker wurden auf jedes Gel 1 bis 2 µl
RainbowTM Protein Molecular Weight Marker in 15 µl 4x Proteinprobenpuffer
3 Methoden 56
aufgetragen. Die Gelelektrophorese erfolgte in einer von Keutz-Minigelkammer mit 1x
Proteingellaufpuffer bei 25 mM pro Gel bei maximaler Spannung.
3.3.1.2 Coomassie-Färbung
Die mittels SDS-PAGE aufgetrennten Proteine können mit Coomassie® Brillant Blue
R250 direkt angefärbt werden. Dazu wurde das Gel 20 Minuten bei RT in Coomassie®-
Färbelösung auf dem Schüttler inkubiert und anschließend in Fixierer/Entfärber-Lösung
bis zum gewünschten Grad entfärbt, sodass nur die Proteinbanden sichtbar blieben.
Das Gel konnte im Folgenden mithilfe des GelDoc 2000 analysiert und digitalisiert
werden und die Proteinmengen der jeweiligen Spuren konnten im Vergleich zu
mitgeführten Standards (unterschiedliche Mengen an BSA) mit dem Programm
TINA2.0 quantifiziert werden.
3.3.1.3 Autoradiographie
Radioaktiv markierte Proteine können nach ihrer Auftrennung mittels SDS-PAGE
mithilfe einer Bio-Imager-Platte sichtbar und quantifizierbar gemacht werden. Durch
radioaktive Strahlung werden Elektronen in der Platte angeregt. Beim Einlesen im Bio-
Imager Analyzer wird die Platte mit einem Helium-Neon-Laser abgetastet, wodurch die
bereits angeregten Elektronen zusätzlich angeregt werden und dann unter Emission
von Licht in ihren ursprünglichen Energiezustand zurückfallen. Die Daten werden
digitalisiert und am Computer mithilfe der Software TINA2.0 ausgewertet.
Nach der SDS-PAGE wurde das Gel 15 Minuten bei RT in Fixierer/Entfärber-Lösung
auf dem Schüttler inkubiert und anschließend unter Vakuum auf Whatmann-Papier
getrocknet. Das getrocknete Gel wurde dann auf eine Bio-Imager-Platte aufgelegt und
nach einer angemessenen Expositionszeit im Bio-Imager eingelesen und ausgewertet.
Die Expositionszeit variierte zwischen 30 Minuten und mehreren Tagen.
3.3.1.4 Elektrotransfer von Proteinen (Western Blot)
Der Western Blot ermöglicht den spezifischen Nachweis von Proteinen nach einer
SDS-PAGE (3.3.1.1) bis zu einer Nachweisgrenze von 1 pg. Dabei werden die
Proteine irreversibel auf eine PVDF-Membran übertragen und anschließend mithilfe
von Antikörpern nachgewiesen.
Zur Durchführung eines Semi-Dry-Blots (Khyse-Andersen et al., 1984) wurden je drei
Blatt Whatman-Papier (6 x 9 cm) mit Anodenpuffer I, Anodenpuffer II bzw.
Kathodenpuffer befeuchtet. Eine 6 x 9 cm große PVDF-Membran wurde zunächst in
Methanol gegeben, um sie benetzbar zu machen, dann wurde das Methanol durch
Einlegen in dH2O verdrängt und die Membran anschließend in Anodenpuffer II
3 Methoden 57
äquilibriert. Der Western Blot zeigte folgenden Aufbau in einer Fastblot-Apparatur
(Biometra):
Anode (⊕-Pol)
3x Whatman-Papier getränkt mit Anodenpuffer I
3x Whatman-Papier getränkt mit Anodenpuffer II
PVDF-Membran
SDS-PAGE-Gel
3x Whatman-Papier getränkt mit Kathodenpuffer
Kathode ( -Pol)
Durch Überrollen mit einer Pipette wurden Luftblasen entfernt, anschließend erfolgte
der Blot für 105 Minuten bei 0,8 mA / cm2. Zur Absättigung unspezifischer Bindungs-
stellen wurde die Membran in Blockierungspuffer mindestens eine Stunde bei RT oder
über Nacht bei 4 °C inkubiert. Daran schloss sich nach kurzem Waschen der Membran
in PBSdef / 0,1 % Tween 20 eine einstündige Inkubation mit dem spezifischen
Erstantikörper bei RT auf einem Schüttler an, gefolgt von drei Waschschritten à 10
Minuten in PBSdef / 0,1 % Tween 20. Im nächsten Schritt wurde die Membran für eine
Stunde mit einem POD-gekoppelten Zweitantikörper inkubiert und anschließend 2 x 10
Minuten mit PBSdef / 0,1 % Tween 20 und 4 x 10 Minuten mit PBSdef auf dem Schüttler
bei RT gewaschen. Die Detektion des POD-gekoppelten Zweitantikörpers erfolgte
durch Chemiluminiszenz. Dazu wurde die Membran auf Folie gelegt, pro Blot 500 µl
SuperSignal, bei sehr schwachen Signalen 500 µl FemtoSignal, und 500 µl Luminol /
Enhancer-Lösung gemischt, auf der Membran verteilt und diese mit einer zweiten Folie
bedeckt. Nach fünf Minuten Inkubation bei RT wurden überschüssige Flüssigkeit und
Luftblasen entfernt und der Blot in der Folie eingeschweißt. In der Dunkelkammer
wurde die Membran für fünf Sekunden bis zu einer Stunde je nach Signalstärke auf
einem Röntgenfilm exponiert, anschließend fand die Entwicklung des Filmes mithilfe
des Optimax 2010 statt.
Folgende Antikörperverdünnungen wurden in dieser Arbeit für Western Blot Analysen
verwendet:
α MARV-VP24, Kaninchen, affinitätsgereinigt (3.3.9) 1:10
α MARV-NC, Kaninchen (1 M NaCl, 11.06.1996) 1: 2000
α MBGV-GP, Kaninchen (nicht glykosyliert, 3/95,
11.09.1996)
1:1000
-
3 Methoden 58
α MARV-VP40, Maus, monoklonal 1:2000
α MARV-NP 2B10, Maus, monoklonal 1:1000
α MARV-VP35/2, Meerschweinchen (16.04.1998) 1:5000
α MARV-VP30 #249, Meerschweinchen 1:100
α HA 11 16B12, Maus, monoklonal 1:10.000
α α-tubulin, Maus, monoklonal 1:1000
α Lamin A/C sc-7292, Maus, monoklonal 1:500
α Lamp1, Maus, monoklonal 1:100
Ziege α Maus, POD 1:40.000
Ziege α Kaninchen, POD 1:20.000
Ziege α Meerschweinchen, POD 1:20.000
3.3.1.5 Entfernung von gebundenen Antikörpern von bereits analysierten PVDF-Membranen
Sollen PVDF-Membranen ein zweites Mal mit einem anderen Antikörper inkubiert
werden, müssen die bereits zuvor gebundenen Antikörper der ersten Inkubation
entfernt werden, wodurch jedoch auch ein Teil des Proteins auf der Membran verloren
geht.
10 ml des Stripping-Puffers werden frisch mit 68,2 µl β-Mercaptoethanol versetzt und
die PVDF-Membran darin für 30 bis 45 Minuten bei 50 °C im Wasserbad geschwenkt.
Anschließend wurde die Membran 2x fünf Minuten im Waschpuffer für Western Blot
gewaschen. Nach Absättigung unspezifischer Bindungen mit Blockierungspuffer für
eine Stunde war die PVDF-Membran dann zur erneuten Färbung bereit.
3.3.2 Indirekte Immunfluoreszenzanalyse
Mithilfe der Immunfluoreszenzanalyse kann die intrazelluläre Lokalisation von
Proteinen dargestellt werden. Diese Methode beruht auf zwei Antigen-Antikörper-
Reaktionen. Der Erstantikörper erkennt und bindet das Zielprotein. Der Zweitantikörper
ist gegen den Erstantikörper gerichtet und trägt zusätzlich einen Fluoreszenzfarbstoff.
Dieser wird durch das UV-Licht des Fluoreszenzmikroskopes angeregt, wodurch die
Lokalisation des Proteins angezeigt wird.
Für Immunfluoreszenzanalysen wurden zum einen MARV-infizierte Vero-Zellen, zum
anderen HeLa-Zellen benutzt, welche die entsprechenden Proteine mithilfe des
Vaccinia-Virus-Expressionssystems exprimierten (3.2.8). Dazu wurden die Zellen auf
runden Deckgläsern (12 mm) in 6 well-Zellkulturschalen angezüchtet und mit MARV
(3.2.6) bzw. mit MVA-T7 infiziert und dem entsprechenden Plasmid transfiziert. 24
3 Methoden 59
Stunden nach MARV-Infektion bzw. 8 bis 12 Stunden nach der Transfektion wurden
die Zellen fixiert und permeabilisiert (3.2.8.2).
Inkubation mit Antikörpern
Nach einer Permeabilisierung der Zellen durch Triton X-100 erfolgte die Färbung mit
den entsprechenden Antikörpern, verdünnt in Blockierungspuffer.
Zur Inkubation wurden 25 µl des verdünnten Erstantikörpers tropfenförmig auf Parafilm
gegeben und das Deckglas mit der zellbewachsenen Seite nach unten daraufgelegt.
Die Inkubation fand in einer feuchten dunklen Kammer für 1 Stunde statt. Anschließend
wurden die Deckgläser 3x 5 Minuten mit PBSdef gewaschen und für 1 Stunde mit 25 µl
des verdünnten Zweitantikörpers wie oben beschrieben inkubiert. Nach erneutem
dreimaligen Waschen in PBSdef wurden die Deckgläser kurz in dH2O getaucht und mit
der zellbewachsenen Seite nach unten mittels Fluoprep auf einem Objektträger
eingedeckt. Nach einer Stunde Trocknen konnten die Zellen mithilfe des Fluoreszenz-
mikroskopes untersucht werden.
Folgende Antikörperverdünnungen wurden in dieser Arbeit verwendet:
α MARV-VP24, Kaninchen, affinitätsgereinigt 1:2
α HA 11 16B12, Maus, monoklonal 1:1000
α FlagTM M2, Maus, monoklonal 1:50
α c-myc sc-789, Kaninchen 1:100
Ziege α Maus, Rhodamin-gekoppelt 1:100
Esel α Kaninchen, FITC-gekoppelt 1:100
Ziege α Maus FITC-gekoppelt 1:100
Ziege α Kaninchen, Rhodamin-gekoppelt 1:100
DAPI 1:100
3.3.3 In vitro Translation
Unter Verwendung von Plasmid-DNA und des TNT® T7 Quick Coupled
Transcription/Translation Kit können Proteine im zellfreien System synthetisiert und
dabei mit [35S]-PromixTM Redivue markiert werden. Das im TNT® T7 Quick Master Mix
enthaltene Kaninchen-Retikulozytenlysat und die T7-RNA-Polymerase vermitteln
sowohl Transkription als auch die Translation von Genen, die unter Kontrolle eines
ein T7-Promotors stehen.
3 Methoden 60
Ansatz: 2 µg Plasmid-DNA mit T7-Promotor
40 µl TNT® T7 Quick Master Mix
2 µl [35S]-PromixTM Redivue (14,3 mCi / ml)
ad 50 µl nukleasefreies dH2O
Der Reaktionsansatz wurde auf Eis zusammen pipettiert und 90 Minuten bei 30 °C
inkubiert. Die radioaktiv markierten Proteine wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und
mittels Bio-Imager-Analyse (3.3.1.1, 3.3.1.3) visualisiert.
3.3.4 Immunpräzipitation
Mittels Immunpräzipitation und Koimmunpräzipitation werden Proteine durch die
Kopplung von Antigen-Antikörper-Komplexen an Protein-A-Sepharose gefällt.
Äquilibrierung von Protein-A-Sepharose:
250 mg Protein-A-Sepharose wurden mit 4 ml Präzipitationspuffer (z.B. KoIP-Puffer)
aufgenommen, gut gemischt und für eine Stunde bei RT inkubiert. Die gequollene
Sepharose wurde anschließend eine Minute bei 5000 UpM pelletiert und dreimal mit je
1 ml Präzipitationspuffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde die
Protein-A-Sepharose in 1 Volumenteil entsprechendem Puffer aufgenommen und bei
4 °C gelagert.
Präadsorption
5 µl in vitro Translat wurden zunächst in 500 µl Präzipitationspuffer aufgenommen und
für 30 Minuten bei 4 °C und 13.000 UpM zentrifugiert. Um den Hintergrund an
unspezifischen Proteinen möglichst gering zu halten, wurden die Überstände in neue
1,5 ml-Reaktionsgefäße überführt und mit 25 µl Protein-A-Sepharose versetzt. Die
Präinkubation erfolgte bei 4 °C für eine Stunde auf dem Überkopfrotierer (ÜKR). Nach
einer zweiminütigen Zentrifugation bei 10.000 UpM wurden die Überstände wiederum
in neue Reaktionsgefäße überführt.
Spezifische Antigen-Antikörper-Reaktion
Die Überstände wurden bei 4 °C für eine Stunde mit dem / den spezifischen
Antikörper(n) auf dem ÜKR inkubiert.
Eingesetzte Antikörperverdünnungen für die Immunpräzipitation:
α FlagTM M2, Maus, monoklonal 1:500
α VP40, Maus, monoklonal 1:1000
3 Methoden 61
Präzipitation der Antigen-AK-Komplexe durch Kopplung an Protein-A-Sepharose
Die Ansätze wurden nach Zugabe von 25 µl Protein-A-Sepharose bei 4 °C für eine
Stunde auf dem ÜKR inkubiert. Die an Protein-A-Sepharose gebundenen
Immunkomplexe wurden für zwei Minuten bei 3000 UpM abzentrifugiert. Nach
Absaugen der Überstände wurde das Pellet noch zweimal mit 800 µl
Präzipitationspuffer gewaschen und nach der letzten Zentrifugation mit 25 µl 4x
Proteinprobenpuffer versetzt. Die Analyse der Immunpräzipitate erfolgte mittels SDS-
PAGE (3.3.1.1) und dem Bio-Imager (3.3.1.3).
3.3.5 Behandlung von VLPs mit Proteinase K
Um festzustellen, ob Proteine in membranumhüllter Form von Zellen in den
Zellkulturüberstand abgegeben werden, z.B. als virusähnliche Partikel (VLPs), kann
nach Aufreinigung dieser Proteine (3.2.4) ein Proteinase K-Verdau durchgeführt
werden. Proteinase K ist eine sehr reaktive, stabile Serinprotease der Subtilisin-Familie
und in einem breiten Spektrum von Versuchsbedingungen (verschiedene pH-Werte,
Salze, Detergentien und Temperaturen) aktiv. Proteinase K hat ein breites
Spezifitätsspektrum und spaltet Peptidbindungen C-terminal von aliphatischen,
aromatischen oder hydrophoben Aminosäuren. Liegen Proteine membranumhüllt vor,
sind sie für Proteinase K nicht zugänglich, während freie Proteine durch Proteinase K
verdaut werden können.
15 µg der lyophilisierten Proteinase K wurden auf einer Feinwaage eingewogen und in
1 ml PBSdef resuspendiert. Diese Lösung wurde nochmals 1:10 in PBSdef verdünnt,
sodass man eine Endkonzentration von 1,5 µg Proteinase K / ml erhielt. Diese wurde
dann für den Verdau eingesetzt.
Die unter 3.2.4 gereinigten VLPs wurden im Anschluss an die Zentrifugation in PBSdef
resuspendiert und einem Proteinase K-Verdau unterzogen. Dabei wurden 3 Ansätze
pipettiert:
Ansatz I Ansatz II Ansatz II
20 µl VLPs 20 µl VLPs 20 µl VLPs
4,6 µl PBSdef 2,2 µl PBSdef 2,2 µl PBSdef / 1 % Triton X-100
2,4 µl Proteinase K
(c = 1,5 µg/ml)
2,4 µl Proteinase K
(c = 1,5 µg/ml)
Ansatz I wurde nicht Proteinase K behandelt und erhielt somit alle pelletierten Proteine,
freie sowie membranumhüllte. Die Ansätze II und III wurden Proteinase K behandelt,
wobei in Ansatz II ausschließlich nicht umhüllte Proteine angreifbar waren, während in
3 Methoden 62
Ansatz III durch Zusatz von Triton X-100 membranumhüllte Proteine freigelegt wurden
und somit für Proteinase K zugänglich waren. Aufgrund der Vergleichbarkeit wurden
alle Ansätze für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Proteinase K wurde durch
anschließende Zugabe von 1 µl PMSF (100 mM) inaktiviert und die Proben mit 9 µl 4x
Proteinprobenpuffer versetzt. Die so behandelten VLPs wurden mittels Western Blot
(3.3.1.4) analysiert.
3.3.6 Untersuchungen zur Membranassoziation von Proteinen
3.3.6.1 Flotationsanalyse im nichtlinearen Saccharose-Gradienten
Die Flotationsanalyse ist eine Standardmethode, um membranassoziierte Proteine zu
charakterisieren (Bergmann et al., 1988; Chong und Rose, 1993; 1994). In dieser
Arbeit wurde ein nichtkontinuierlicher Saccharosegradient verwendet. HEK293-Zellen
wurden mit LipofectamineTM Plus transfiziert (3.2.2) und anschließend wie unter 3.2.3
beschrieben lysiert. 250 µl des so erhaltenen postnukleären Überstandes wurden mit
250 µl Lysispuffer für Flotationen versetzt und mit 1 ml 90-%iger Saccharoselösung
gemischt, sodass eine 60-%ige Probe entstand. Diese wurde in ein UltraClear-
Zentrifugenröhrchen für SW-60-Rotoren überführt und nacheinander mit 2,2 ml 45-
%iger und 500 µl 10-%iger Saccharoselösung überschichtet. Im Anschluss erfolgte
eine 18-stündige Zentrifugation bei 40.000 UpM und 4 °C. Nach der Zentrifugation
wurden von oben nach unten 9 Fraktionen à 300 µl und 2 Fraktionen à 750 µl
(Ladezone, entspricht der 60-%igen Probe) abgenommen. Die Fraktionen wurden mit
4x Proteinprobenpuffer versetzt und mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert
(3.3.1.1, 3.3.1.4).
3.3.6.2 Charakterisierung der Membranassoziation
Der postnukleäre Überstand (PNÜ) wurde wie unter 3.2.3 beschrieben gewonnen und
mit verschiedenen Reagentien behandelt:
Behandlung PNÜ zugesetzte Puffer Inkubationszeit
unbehandelt 250 µl 250 µl Lysispuffer 1 Stunde Eis
hohe Salzkonzentrationen 250 µl 250 µl 4 M KCl 1 Stunde RT
Chelatbildner 250 µl 200 µl Lysispuffer
50 µl 0,5 M EDTA, pH 8,0
1 Stunde RT
alkalischer pH 250 µl 200 µl Lysispuffer
50 µl Karbonatpuffer pH11
30 min Eis,
+ Puffer, 30 min Eis
3 Methoden 63
Die so behandelten Zelllysate wurden danach wie unter 3.3.6.1 beschrieben einer
Flotation unterzogen und analysiert.
3.3.6.3 Triton X-114 Phasenpartitionierung
Mithilfe einer Triton X-114 Phasenpartitionierung kann untersucht werden, ob ein
membranassoziiertes Protein das Verhalten eines peripheren oder integralen
Membranproteins zeigt (Bordier, 1981). Hierbei wird der postnukleäre Überstand
(3.2.3) mit dem nichtionischen Detergenz Triton X-114 behandelt. Dieses Detergenz
besitzt die Eigenschaft, bei 0 °C in einer Phase mit der wässrigen Umgebung vorzu-
liegen (klares Lysat), während es bei Erwärmung zu einer Separation des Triton X-114
von der wässrigen Umgebung kommt (Eintrübung des Lysats). Während dieses
Phasenübergangs transferiert das Detergenz alle integralen Membranproteine in die
sogenannte Detergentienphase, die von Triton X-114 gebildet wird, während alle
löslichen oder nur peripher an Membranen gebundene Proteine in der wässrigen
Phase verbleiben. Die Proteine des Zelllysats werden somit durch mehrfaches
Extrahieren mittels Triton X-114 in membranintegrierte und lösliche / peripher asso-
ziierte Proteine getrennt.
Für die Phasenpartitionierung wurden HEK293-Zellen in 5 cm-Schalen ausgesät, wie
unter 3.2.2 beschrieben transfiziert und die Zellen 24 Stunden nach der Transfektion in
250 µl Triton X-114-Lysispuffer geerntet (3.2.3). Der postnukleäre Überstand wurde mit
1 % Triton X-114 versetzt und auf Eis inkubiert bis die Lösung vollständig klar war.
Durch anschließende Zentrifugation bei 14.000 x g und 4 °C für 15 Minuten wurde
unlösliches Material pelletiert. Der Überstand wurde in frische Reaktionsgefäße
überführt und der Phasenpartitionierung unterzogen.
In ein 1,5 ml Reaktionsgefäß wurden 300 µl des Triton X-114-Saccharose-Kissens
vorgelegt und mit 200 µl des Lysats überschichtet. Durch Inkubation der Probe für drei
Minuten bei 30 °C kam es zur Eintrübung. Diese beruht auf der Trennung von
wässrigem Medium und Triton X-114 (Phasenseparation). Triton X-114 konnte
anschließend durch eine dreiminütige Zentrifugation bei 500 x g und RT pelletiert
werden. Die folgenden Zentrifugationsschritte dienten der vollständigen Trennung von
wässriger und Detergentienphase durch mehrmalige Extraktion.
Von oben wurden im Folgenden 200 µl der wässrigen Phase abgenommen, in einem
frischen 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 0,5 % Triton X-114 versetzt (Trübung bei RT), und
solange auf Eis inkubiert, bis die Lösung wieder klar wurde. Diese 200 µl wurden
erneut auf das zuvor verwendete Triton X-114-Saccharose-Kissen gegeben und wie
oben beschrieben behandelt. Wieder wurde von oben die wässrige Phase (200 µl)
abgenommen (Saccharose-Kissen zur Seite gestellt), mit 0,5 % Triton X-114 versetzt
3 Methoden 64
und auf Eis inkubiert. Anschließend fand eine erneute Zentrifugation, diesmal jedoch
über ein frisches Triton X-114-Saccharose-Kissen statt. Die oberen 200 µl wurden
wiederum abgenommen (Saccharose-Kissen wurde verworfen) und in einem frischen
1,5 ml Reaktionsgefäß mit 70 µl 4x Proteingelpuffer versetzt (wässrige Phase).
Zur Erlangung der Detergentienphase wurde das erste Triton X-114-Saccharose-
Kissen weiter bearbeitet. Dieses zeigte ein deutliches, öliges Pellet am Boden des
Gefäßes (ca. 20 µl). Der Überstand wurde komplett von diesem Pellet entfernt und
dieses dann in 180 µl Lysispuffer resuspendiert. Bis die Trübung verschwunden war
wurden die resultierenden 200 µl Probe erneut auf Eis inkubiert, auf ein frisches 300 µl
Triton X-114-Saccharose-Kissen geschichtet und weiterbehandelt wie oben be-
schrieben. Das resultierende ölige Pellet von ca. 20 µl wurde erneut durch Absaugen
vom Überstand befreit und in 180 µl Lysispuffer resuspendiert sowie mit 70 µl 4x
Proteinprobenpuffer versetzt (Detergentienphase). Die resultierende wässrige sowie
die Detergentienphase wurden mithilfe von Western Blot analysiert (3.3.1.4).
3.3.7 Bakterielle Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen
Mithilfe des Vektors pGEX-6P1, der das Gen für die Glutathion-S-Transferase (GST)
mit anschließender Polylinkerregion trägt, ist es möglich, Fusionsproteine zu
exprimieren, deren N-Terminus aus GST besteht an das sich eine beliebige Protein-
oder Peptidsequenz im C-terminalen Bereich anschließt. Diese Fusionsproteine
können in Bakterien in großem Maßstäben exprimiert und durch Affinitätsreinigung
über den GST-Anteil aufgereinigt werden.
3.3.7.1 Klonierung und bakterielle Expression von GST-VP24
Zur Klonierung eines GST-VP24-Fusionsproteins wurde die VP24-Sequenz mittels
Restriktionsverdau mit BamHI (3.1.3.1) aus dem Konstrukt pTM1-VP24 ausgeschnitten
und über BamHI in den ebenfalls durch Restriktionsverdau linearisierten Vektor pGEX-
6P1 kloniert. Die so hergestellten Plasmide wurden zunächst in E. coli BL21-Zellen
transformiert und auf Agarplatten ausgestrichen (3.1.3.6). Einzelkolonien wurden
mithilfe einer ÜNK vermehrt (3.1.4.1). Anschließend wurden 250 ml LB-Medium
(100 µg / ml Ampicillin) mit 2,5 ml dieser Kultur beimpft und der Ansatz für drei Stunden
bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Dann wurde die Expression der Fusionsproteine
durch die Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0,1 mM) induziert und der Ansatz für
zwei weitere Stunden bei 37 °C inkubiert. Im Folgenden wurde die
Bakteriensuspension 10 Minuten bei 4 °C mit 6.000 UpM zentrifugiert, der Überstand
verworfen und das Sediment in 12,5 ml PBSdef, versetzt mit den Complete Protease
Inhibitoren (Roche), aufgenommen. Die Bakterienzellen wurden durch Beschallung mit
3 Methoden 65
einem Branson Stab-Sonifizierer aufgeschlossen. Hierzu wurde die
Bakteriesuspension in einem 50 ml Reaktionsgefäß auf Eis platziert und sechs Mal für
jeweils 20 Sekunden mit einer Pause von 20 Sekunden beschallt. Die
Bakterientrümmer wurden anschließend durch eine zehnminütige Zentrifugation bei
6.000 UpM in einer Heraeus-Zentrifuge sedimentiert. Der Überstand enthielt das
exprimierte Protein und wurde im Weiteren durch Kopplung an Glutathion-Sepharose
aufgereinigt.
3.3.7.2 Kopplung des GST-VP24 an Glutathion-Sepharose
Das in BL21-Zellen exprimierte Fusionsprotein kann aus der Menge der Proteine des
Zelllysats mithilfe von an Sepharose gekoppeltem Glutathion gereinigt werden,
welches durch den GST-Anteil des Fusionsproteins gebunden wird.
Zunächst wurde die Glutathion-Sepharose entsprechend den Anweisungen des
Herstellers aufbereitet, sodass eine 50-%ige Glutathion-Sepharose-Lösung in PBSdef
entstand. 250 µl dieser Lösung wurde dem unter 3.3.7.1 erhaltenen Bakterienlysat
zugegeben und dieser Ansatz eine Stunde bei 4 °C auf dem ÜKR inkubiert.
Anschließend wurde die mit dem GST-Fusionsprotein beladene Sepharose 3x mit je 10
ml PBSdef gewaschen, wobei die Sepharose jeweils bei 500 x g sedimentiert wurde.
Zur Darstellung des gereinigten GST-Fusionsproteins wurde das Sepharose-Pellet mit
125 µl 4x Proteinprobenpuffer versetzt und das GST-Fusionsprotein durch
fünfminütiges Aufkochen bei 95 °C von der Sepharose abgelöst. Diese wurde im
Folgenden bei 14.000 UpM sedimentiert, der Überstand in ein frisches 1,5 ml
Reaktionsgefäß überführt und mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert
(3.3.1.2). Das im Probenpuffer vorliegende Fusionsprotein wurde im Folgenden für die
Immunisierung von Kaninchen und Meerschweinchen verwendet.
3.3.8 Immunisierung von Kaninchen und Meerschweinchen
3.3.8.1 Präparation des GST-VP24-Fusionsproteins
Bevor man das Fusionsprotein Tieren zur Produktion von Antikörpern spritzen kann,
muss es speziell aufbereitet werden, um das Versuchstier möglichst wenig mit
chemischen Substanzen zu belasten.
Das unter 3.3.7 erhaltene GST-VP24-Fusionsprotein wurde mithilfe eines präparativen
SDS-Gels aufgetrennt und anschließend auf Nitrozellulose geblottet (3.3.1.4).
Anschließend wurde das Fusionsprotein auf der Blotfolie durch Färbung mit
Ponceaurot (DIG Glycan Differentiation Kit) für fünf Minuten und Entfärbung in dH2O
sichtbar gemacht und mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die so erhaltenen Blotstreifen
3 Methoden 66
wurden für 30 Minuten auf einem Vakuum-Geltrockner vollständig getrocknet,
kleingeschnitten und in 2 ml Reaktionsgefäße überführt. Die Nitrozellulose mit
gebundenem Fusionsprotein wurde durch Zugabe von 500 µl DMSO und gründliches
vortexen gelöst.
3.3.8.2 Immunisierung
Die Immunisierung fand im direkten Anschluss an die Präparation des Antigens (GST-
VP24) statt. Für die erste Immunisierung (19.02.2002) wurde das in DMSO gelöste
Antigen nochmals 1:1 mit komplettem Freundschen Adjuvants versetzt, um eine
möglichst starke Immunreaktion bei den Tieren zu erreichen. Bei den
Folgeimmunisierungen wurde das in DMSO gelöste Antigen 1:1 mit inkomplettem
Freundschen Adjuvants versetzt, um eine erfolgte Immunantwort weiter zu boostern.
Es wurden ein Kaninchen sowie zwei Meerschweinchen nach folgendem Schema
immunisiert:
Datum Tier (Anzahl) Antigen GST-VP24 Blutentnahme AK-test
19.02.02 Kaninchen (1)
Meerschweinchen (2)
500 µl (DMSO + kompl. Adjuvans)
je 250 µl (DMSO + kompl. Adjuvans)
Ja, Präserum
Ja, Präserum
negativ
negativ
19.03.02 Kaninchen (1)
Meerschweinchen (2)
500 µl (DMSO + inkompl. Adjuvans)
je 250 µl (DMSO + inkompl. Adjuvans)
Nein
Nein
-
-
16.04.02 Kaninchen (1)
Meerschweinchen (2)
1000 µl (DMSO + inkompl. Adjuvans)
je 500 µl (DMSO + inkompl. Adjuvans)
Ja
Nein
negativ
-
29.04.02 Kaninchen (1)
Meerschweinchen (2) 1000 µl (DMSO + inkompl. Adjuvans)
je 500 µl (DMSO + inkompl. Adjuvans)
Ja
Ja
negativ
negativ
27.05.02 Kaninchen (1)
Meerschweinchen (2) 1000 µl (DMSO + inkompl. Adjuvans)
je 500 µl (DMSO + inkompl. Adjuvans)
Ja
Nein
schwach
-
03.06.02 Kaninchen (1) - Ja positiv
27.06.02 Kaninchen (1)
Meerschweinchen (2) -
-
Ausbluten
Ausbluten
positiv
negativ
3.3.8.3 Aufbereitung der Seren und Antikörpernachweis
Um festzustellen, ob die Immunisierung erfolgreich war und die behandelten Tiere
Antikörper gegen das verabreichte Antigen produzierten, wurde zu verschiedenen
Zeitpunkten Blut entnommen. Dieses wurde für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert und der
geronnene Blutkuchen anschließend für 15 Minuten bei 6000 UpM in einer Heraeus-
3 Methoden 67
Zentrifuge sedimentiert. Das Serum wurde abgenommen, aliquotiert und bei – 20 °C
gelagert.
Die Reaktivität der Seren gegenüber VP24 wurde mittels Western Blot getestet. Dazu
wurde MARV-Antigen mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF-Membran
geblottet. Der Blot wurde in ca. 0,5 cm breite Streifen geschnitten und diese mit
verschiedenen Verdünnungen des jeweiligen Serums inkubiert (3.3.1.4).
3.3.9 Affinitätsreinigung des VP24-Antikörpers
Um die unspezifische Bindung von Serumbestandteilen an andere Proteine und somit
den Hintergrund in Western Blot und Immunfluoreszenz zu verringern, wurde eine
Affinitätsreinigung durchgeführt. Hierbei wird aus dem Serum nur der gewünschte,
spezifische Antikörper aufgereinigt.
Zunächst wurde eine MARV-Präparation aus dem Sicherheitslabor mit MARV-Antigen
auf einem präparativen SDS-Gel aufgetrennt (3.3.1.1), auf eine PVDF-Membran
geblottet (3.3.1.4) und die einzelnen viralen Proteine mittels Ponceaurot sichtbar
gemacht. Die Bande des VP24 wurde ausgeschnitten und zur Fixierung der Proteine
bei RT vollständig getrocknet. Diese Blotstreifen konnten nach Bedarf direkt
weiterverwendet oder bei -20 °C gelagert werden.
Vor der Affinitätsreinigung wurden die Blotstreifen kurz in Methanol geschwenkt, um sie
für Wasser benetzbar zu machen und anschließend wurde unzureichend gebundenes
Protein durch fünfminütiges Waschen in saurem Glycin-Puffer entfernt. Nach
zweimaligem Waschen in TBS wurde die Membran durch eine einstündige Inkubation
in TBS-B bei RT blockiert, anschließend wiederum zweimal in TBS gewaschen und
kleingeschnitten in ein 15 ml Reaktionsgefäß überführt. 2 ml Kaninchenserum wurden
mit 8 ml TBS verdünnt, zu dem zerschnittenen Blotstreifen gegeben und mit diesen für
drei Stunden bei RT auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurde die Serum-
verdünnung abgenommen und zu 4 °C gestellt und es folgte 2x fünfminütiges Waschen
der Blotstücke in TBS und 2x fünf Minuten in PBSdef. Zur Elution der gebundenen
Antikörper wurden die Blotstücke für 10 Minuten in 1 ml saurem Glycin-Puffer bei RT
inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde der Glycin-Puffer abgenommen, in ein 1,5 ml
Reaktionsgefäß überführt und mit 1 M Tris/HCl, pH 8,0 auf einen pH-Wert von 7,0
neutralisiert. Der Elutionsschritt wurde ein zweites Mal wiederholt, die neutralisierten
Eluate vereinigt und mit BSA (Endkonzentration 1 mg / ml) sowie 5 mM NaN3 versetzt.
Anschließend konnte ein zweiter Aufreinigungsschritt mit der bei 4 °C gelagerten
Serum-TBS-Verdünnung durchgeführt werden. Der so gereinigte Antikörper wurde im
Folgenden für Western Blot und Immunfluoreszenzanalysen verwendet.
4 Ergebnisse 68
4 Ergebnisse
Ziel dieser Arbeit war es, das virale Protein VP24 des Marburgvirus zu charakterisieren
und dessen Rolle im viralen Vermehrungszyklus näher zu betrachten. Neben der
intrazellulären Lokalisation sowie Kolokalisation mit anderen Virusproteinen stand
außerdem die Untersuchung typischer Eigenschaften von Matrixproteinen im
Vordergrund. Mithilfe von RNA Interferenz sollte schließlich die Rolle von VP24 in der
Virusinfektion betrachtet werden.
4.1 Immunfluoreszenzanalyse zur intrazellulären Lokalisation von VP24
4.1.1 Klonierung Epitop-markierter VP24-Mutanten
Ein Antikörper zur immunologischen Detektion von VP24 in Western Blot- und
Immunfluoreszenzanalysen war zu Beginn dieser Arbeit nicht vorhanden. Durch die
Herstellung verschiedener Epitop-markierter Mutanten sollte VP24 mithilfe von
käuflichen Antikörpern detektiert werden.
VP24 wurde jeweils N- bzw. C-terminal mit einem Flag-, einem HA- oder einem myc-
Epitop versehen (Abbildung 6).
VP24Flag
VP24HA
VP24myc
VP24 Flag
VP24 HA
VP24 myc
Sequenzen der Epitope:Flag-tag: N‘-DYKDDDK-C‘ HA-tag: N‘-YPYDVPDYA-C‘ myc-Tag: N‘-EQKLISEEDL-C‘
*
Flag-VP24
HA-VP24
myc-VP24
VP24-Flag
VP24-HA
VP24-myc
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Epitop-markierten MARV-VP24-Mutanten.VP24 wurde zur immunologischen Detektion jeweils N- bzw. C-terminal mit einem Flag-, HA-oder myc-Epitop versehen. Die *-markierte Mutante VP24-Flag existierte bereits (Bamberg,2000). Die Aminosäuresequenzen der verschiedenen Epitope sind im unteren Teil derAbbildung vermerkt.
4 Ergebnisse 69
Die Grundlage für die Klonierung war das bereits vorhandene Plasmid pTM1-VP24,
welches die Sequenz des VP24 unter Kontrolle eines T7-Promotors enthält (Bamberg,
2000). Die eingesetzten Primer wurden so synthetisiert, dass sie neben der VP24-
spezifischen Sequenz außerdem die kodierende Sequenz des einzufügenden Epitops
enthielten sowie eine BamHI-Schnittstelle für die Klonierung. Abbildung 7 zeigt den
schematischen Verlauf der Klonierung.
Die Sequenz der Plasmide wurde durch Sequenzierung (3.1.2.3) verifiziert.
Abbildung 7: Klonierung der Epitop-markierten MARV-VP24-Mutanten. Durch die PCR-Amplifikation wurde VP24 entweder N- oder C-terminal mit den kodierendenSequenzen des Flag-, HA- bzw. myc-Epitops versehen. Die PCR-Fragmente sowie derZielvektor pTM1 wurden mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut. Nach Behandlung derVektor-DNA mit alkalischer Phosphatase (CIP) wurden die aufbereiteten PCR-Fragmentemit diesem ligiert.
PCR
pTM1
BamHIBamHI
pTM1
BamHIBamHI
BamHITag-VP24Tag-VP24
BamHI
Tag-VP24
pTM1pTM1
pTM1-tag-VP24
Tag-VP24Tag-VP24Tag-VP24
Ligation
BamHIBamHI
Vorwärtsprimer#1107, 1108, 1109, 125
5' 3' Rückwärtsprimer#174, 1110, 1111VP24
3' 5'
pTM1-VP24
Konstrukte:pTM1-Flag-VP24pTM1-HA-VP24pTM1-myc-VP24pTM1-VP24-HApTM1-VP24-myc
Verdau mit BamHICIP-
Behandlung
Verdau mit BamHI
4 Ergebnisse 70
4.1.2 Immunfluoreszenzanalysen der Epitop-markierten VP24-Mutanten
Die unter 4.1.1 erstellten VP24-Mutanten sowie pTM1-VP24-Flag wurden im
Folgenden auf ihre intrazelluläre Verteilung hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden
subkonfluente HeLa-Zellen mit dem Vaccinia-Virus MVA-T7 infiziert und eine Stunde
nach Infektion jeweils mit 1 µg der entsprechenden Plasmid-DNA (pTM1-Flag-VP24,
pTM1-HA-VP24, pTM1-myc-VP24, pTM1-VP24-Flag, pTM1-VP24-HA, pTM1-VP24-
myc) transfiziert (3.2.8.1). Die Zellen wurden 12 Stunden nach der Infektion fixiert,
permeabilisiert und mit den entsprechenden Antikörpern gefärbt (3.2.8.2, 3.3.2). Die
Mutanten wurden mit monoklonalen AK gegen das Flag-Epitop, das HA-Epitop oder
mittels eines polyklonalen α myc Kaninchen-AK markiert. Durch Inkubation mit
Rhodamin-gekoppelten α Maus- bzw. α Kaninchen-AK wurden die Proteine im
Fluoreszenzmikroskop detektierbar. Während der Inkubation mit dem Zweitantikörper
wurde der Zellkern zusätzlich durch eine DAPI-Färbung markiert.
Die Immunfluoreszenzanalysen der exprimierten VP24-Mutanten sind in Abbildung 8
dargestellt.
Mock WT VP24-Mutanten
Flag- VP24 VP24-Flag
HA- VP24 VP24-HA
myc- VP24 VP24-myc
A
B
C
WT
WT
WT
Mock
Mock
Mock
α Flag
α HA
αmyc
1 2 3 4
4 Ergebnisse 71
Vergleicht man die intrazelluläre Verteilung der VP24-Mutanten, so fällt auf, dass die
verschiedenen Epitope die zelluläre Lokalisation des VP24 unterschiedlich
beeinflussen. So zeigte die Expression des Flag-markierten VP24 (Abbildung 8, A3
und A4) eine eher netzartige, zytoplasmatische Verteilung, während das HA-markierte
VP24 eher zu punktförmigen Aggregaten im zellkernnahen Bereich neigte und weniger
strukturiert im Zytoplasma zu finden war (B3 und B4). Die Verteilung des myc-
markierten VP24 (C3 und C4) ähnelte wiederum eher der der Flag-markierten-
Mutanten, wobei es hier bei VP24-myc ebenfalls zur Ausbildung kleinerer Aggregate
kam, ähnlich denen der HA-markierten Mutanten. Nicht nur der Einsatz verschiedener
Epitope beeinflusste die Verteilung des VP24, sondern auch die Lokalisation des
Epitops im Protein selbst, d.h. ob es N- oder C-terminal vorlag. Dieser Einfluss wurde
vor allem im Unterschied zwischen HA-VP24 und VP24-HA deutlich. HA-VP24 zeigte
eine wesentlich stärker aggregierte Verteilung, während VP24-HA sowohl Aggregate
als auch eine homogene zytoplasmatische Verteilung aufwies. Unterschiede in der
Verteilung zeigten auch myc-VP24 und VP24-myc, wobei die C-terminale Markierung
kleine Aggregate aufwies, welche bei N-terminalem myc-Epitop nicht zu beobachten
waren. Durch die Verwendung von verschiedenen Epitopen am C- bzw. N-Terminus
des VP24 ist es daher schwierig auf die Verteilung des WT-VP24 zu schließen.
4.1.3 Herstellung und Aufreinigung von VP24-spezifischen Antikörpern
Um die intrazelluläre Verteilung von WT-VP24 sichtbar zu machen war ein spezifischer
AK gegen das VP24 notwendig. Durch Immunisierung eines Kaninchens (3.3.8) mit
einem bakteriell exprimierten Fusionsprotein aus Glutathion-S-Transferase (GST) und
VP24 (3.3.7) war es möglich, ein MARV-VP24-spezifisches Serum zu erhalten. Dieses
zeigte jedoch im Western Blot nur mäßige Ergebnisse aufgrund starker
Hintergrundfärbung (Abbildung 9 A) und in der Immunfluoreszenz keine bis schwache
VP24-spezifische Signale, ebenfalls mit hoher Hintergrundfärbung der Zellen. Daher
war es notwendig, den VP24-spezifischen Antikörper aufzureinigen. Hierzu wurde
MARV-VP24-Antigen aus Viruspartikeln mittels SDS-PAGE augetrennt und auf PVDF-
Membran geblottet. Durch Färbung mit Ponceaurot wurden die viralen Proteinbanden
Abbildung 8: Immunfluoreszenzanalyse der Epitop-markierten VP24-Mutanten. Subkonfluente HeLa-Zellen wurden mit MVA-T7 infiziert und mit den Plasmiden pTM1-Flag-VP24, pTM1-HA-VP24, pTM1-myc-VP24, pTM1-VP24-Flag, pTM1-VP24-HA oder pTM1-VP24-myc transfiziert. 12 h nach Infektion wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mitAntikörpern gefärbt. A: Expression der Flag-markierten VP24-Mutanten, Färbung mit demmonoklonalen α Flag-AK und Rhodamin-gekoppeltem α Maus-AK. B: Expression der HA-markierten VP24-Mutanten, Färbung mit dem monoklonalen α HA-AK und Rhodamin-gekoppeltem α Maus-AK. C: Expression der myc-markierten VP24-Mutanten, Färbung mitdem polyklonalen α myc-AK und Rhodamin-gekoppeltem α Kaninchen-AK.
4 Ergebnisse 72
sichtbar gemacht und nur die Bande des VP24 ausgeschnitten (3.3.1.4). Mithilfe der so
erhaltenen VP24-Blotstreifen konnten die VP24-Antikörper wie unter 3.3.9 beschrieben
aufgereinigt werden. Blotstreifen die das Fusionsprotein GST-VP24 trugen konnten
hierbei nicht verwendet werden, da die Möglichkeit bestand, neben den VP24-
spezifischen auch GST-Antikörper aufzureinigen, welche dann potentielle
Hintergrundfärbungen verursachen könnten.
Abbildung 9 zeigt die spezifische VP24-Färbung im Western Blot durch das
unbehandelte Kaninchenserum (A) im Vergleich zum affinitätsgereinigten VP24-AK (B).
Die Aufreinigung des VP24-AK zeigte eine deutliche Verminderung des Hintergrunds
im Western Blot und sollte im Folgenden auf die Funktionalität in der
Immunfluoreszenzanalyse hin untersucht werden.
4.1.4 Immunfluoreszenzanalyse des VP24
Um die intrazelluläre Verteilung von VP24 zu zeigen, wurden subkonfluente HeLa-
Zellen mit dem Vaccinia-Virus MVA-T7 infiziert und eine Stunde nach Infektion mit 1 µg
pTM1-VP24 transfiziert (3.2.8). Die Zellen wurden 12 Stunden nach der Infektion fixiert,
permeabilisiert (3.2.8.2) und mit dem affinitätsgereinigten VP24-Antikörper (3.3.9) in
einer Verdünnung von 1:2 angefärbt. Durch Inkubation mit einem Rhodamin-
Abbildung 9: Vergleich des VP24-spezifischen Kaninchenserum und desaffinitätsgereinigten VP24-AK. MARV-Antigen wurde mittels SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membran geblottet und dieMembran in Streifen geschnitten. Die Blotstreifen wurden im folgenden mit verschiedenen AK-Verdünnungen des VP24-spezifischen Kaninchenserums sowie des affinitätsgereinigtenVP24-AK gefärbt. Als Zweitantikörper diente ein POD-gekoppelter α Kaninchen-AK. A:Färbung mit einer 1:100 (1) und 1:500 Verdünnung (2) des VP24-spezifischen Kaninchen-serum. B: Färbung mit einer 1:50 (3) und 1:100 Verdünnung (4) des affinitätsgereinigtenVP24-AK.
A BVP24-spezifischesKaninchen-Serum
1:100 1:500
gereinigter VP24-AK
1:50 1:100
1 2 3 4
VP24 VP24
4 Ergebnisse 73
gekoppelten α Kaninchen-AK wurde VP24 sichtbar gemacht und mithilfe des
Fluoreszenzmikroskopes und der Spot-Kamera fotografiert.
Die intrazelluläre Verteilung von VP24 in Hela-Zellen ist in Abbildung 10 dargestellt.
VP24 zeigte eine punktförmige Aggregation in zellkernnahen Bereichen, jedoch nur
eine schwache Färbung des Zytoplasmas. Vergleicht man die Lokalisation von VP24
mit den unter 4.1.2 beschriebenen Epitop-markierten Mutanten, so fällt auf, dass die
Epitope einen deutlichen Einfluss auf die Lokalisation des VP24 haben und von der
Verteilung des WT-VP24 zum Teil stark abweichen. Lediglich die N-terminal mit HA-
markierte Mutante zeigte eine sehr ähnliche Verteilung in der Immunfluoreszenz und
wurde daher in weiteren Versuchen verwendet.
4.2 Untersuchungen zur Membranassoziation von VP24
Im Folgenden sollte untersucht werden, ob das VP24 mit intrazellulären Membranen
assoziiert vorliegt, und wenn ja, wie diese Interaktion beschaffen ist. Integrale
Membranproteine benötigen mindestens eine hydrophobe Transmembrandomäne in
der Polypeptidkette, mit der sie in der Membran verankert sind und können nur durch
die Behandlung mit Detergenzien aus der Membran isoliert werden. Periphere
Membranproteine lassen sich im Gegensatz dazu von der Membran dissoziieren, ohne
diese zu zerstören. Für das VP24 des MARV gibt es keine Hinweise auf eine
Transmembrandomäne.
4.2.1 Interaktion von VP24 mit zellulären Membranen
Die Flotationsanalyse ist eine Standardmethode, um membranassoziierte Proteine zu
charakterisieren (Bergmann and Fusco, 1988; Chong and Rose, 1993; 1994). Das
Prinzip der Flotationsanalyse beruht auf der Eigenschaft von Membranen, während
Abbildung 10: Immunfluoreszenzanalyse der Einzelexpression des WT-VP24. Subkonfluente HeLa-Zellen wurden mit MVA-T7 infiziert und dem Plasmid pTM1-VP24transfiziert. 12 h nach Infektion wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit demaffinitätsgereinigten α VP24-AK sowie einem Rhodamin-gekoppelten α Kaninchen-AKgefärbt. 1 + 2 zeigen die Hintergrundkontrollen, 3 + 4 die spezifische VP24-Färbung.
α VP24α VP24 α VP24 α VP24α VP24 α VP24α VP24
Mock WT MARV-VP24
1 2 3 4
4 Ergebnisse 74
einer Gleichgewichtszentrifugation aufgrund ihrer Schwebedichte in einem
Stufengradienten (60 % - 45 % - 10 %) in die Interphase der hoch (45 %) und niedrig
(10 %) konzentrierten Gradienten-Medien zu flotieren. Lösliche Proteine verbleiben in
der 60-%igen Lösung.
Für diese Untersuchung wurden zunächst die kodierenden Sequenzen für das VP24
und das HA-VP24 durch Restriktionsverdau und Ligation (3.1.3.1, 3.1.3.4) aus dem
Vektor pTM1 in den Vektor pCAGGS übertragen. Die VP24-Sequenzen stehen im
pCAGGS-Vektor unter der Kontrolle des β-Chicken-Actin-Promotors, der eine
Expression dieser Proteine in Abwesenheit des Helfervirus MVA-T7 ermöglicht.
Für die Flotationsanalyse wurden HEK293-Zellen mit pCAGGS-VP24 bzw. pCAGGS-
HA-VP24 transfiziert (3.2.2) und 24 Stunden p.t. geerntet, lysiert und der postnukleäre
Überstand für die Flotationsanalyse eingesetzt (3.3.6.1). Der Gradient wurde nach der
Ultrazentrifugation fraktioniert und die einzelnen Fraktionen mithilfe von SDS-PAGE
und Western Blot analysiert (3.3.1.4).
Abbildung 11 zeigt die Membranassoziation von VP24 und HA-VP24. Als Kontrolle für
die Flotation der Membranen innerhalb des Gradienten wurde das integrale
Membranprotein Lamp-1 (lysosome-associated membrane protein 1) angefärbt
(Abbildung 11 A), welches, wie erwartet, gemeinsam mit den Membranen in die oberen
Fraktionen 2 und 3 flotierte. Das vorwiegend zytoplasmatisch lokalisierte Protein
Abbildung 11: Flotationsanalyse des WT-VP24 und HA-VP24. HEK293-Zellen wurden mit pCAGGS-VP24 bzw. pCAGGS-HA-VP24 transfiziert, 24h p.t.geerntet und einer Flotationsanalyse unterzogen. Darstellung der fraktionierten Gradientenvon oben nach unten (Fraktion 1 bis 11) durch SDS-PAGE und Western Blot. A: Färbung mitα Lamp-1-AK und POD-gekoppeltem α Maus-AK, B: Färbung mit α Annexin II-AK und POD-gekoppeltem α Maus-AK, C: Färbung mit dem affinitätsgereinigten VP24-AK und POD-gekoppletem α Kaninchen-AK, D: Färbung mit dem α HA-AK und POD-gekoppeltemα Maus-AK.
Lamp-1 110 kD
VP24 28 kD
29,8 kDHA-VP24
36 kDAnnexin II
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11oben unten
A
B
C
D
4 Ergebnisse 75
Annexin II diente als Kontrolle für ein lösliches Protein, welches nicht in der Lage ist zu
flotieren (Abbildung 11 B). Vergleicht man das Flotationsverhalten von VP24 und HA-
VP24, so sieht man, dass sich beide Proteine, wie auch in der Immunfluoreszenz,
ähnlich verhielten. Beide Proteine zeigten eine schwache Tendenz zur Interaktion mit
Membranen (Fraktionen 1 bis 4), der weitaus größere Anteil der Proteine lag jedoch in
löslicher Form vor (Fraktionen 9 bis 11). In diesem Verhalten unterscheidet sich VP24
deutlich von dem des Matrixproteins VP40, welches eine starke Membranassoziation
zeigt (Kolesnikova et al., 2002).
4.2.2 Charakterisierung der Membraninteraktion
Peripher assoziierte Membranproteine können durch verschiedene Behandlungen von
Membranen abgelöst werden. Ihr Verhalten lässt dabei einen Rückschluss auf die
Beschaffenheit der Membraninteraktion zu (Chong und Rose, 1993). Durch alkalischen
pH werden Membranvesikel in Membranblätter transformiert, wodurch lösliche Proteine
freigesetzt werden, die in den Vesikeln eingeschlossen waren (Fujiki et al., 1982).
Hohe Salzkonzentrationen schirmen Ladungen und schwache ionische
Wechselwirkungen ab, die periphere Proteine direkt oder indirekt über andere
Membranproteine an Membranen binden. Chelatbildner stören Membranassoziationen,
die durch divalente Kationen-Brücken vermittelt werden (Kretzschmar et al., 1996). Im
Folgenden sollte untersucht werden, wie die schwache Interaktion des VP24 mit
Membranen beschaffen ist. Da sich VP24 und HA-VP24 in der Flotationsanalyse gleich
verhielten, wurden die folgenden Experimente aufgrund der besseren Detektierbarkeit
mittels des monoklonalen HA-Antikörper mit HA-VP24 durchgeführt. Zur näheren
Charakterisierung der Membranassoziation wurde der postnukleäre Überstand von HA-
VP24-transfizierten HEK293-Zellen mit verschiedenen Lösungen (2 M KCl, 50 mM
EDTA bzw. Karbonatpuffer pH 11) behandelt (3.3.6.2) und einer Flotation unterzogen.
Zur Kontrolle wurde ein Ansatz nicht behandelt.
2 M KCl
50 mM EDTA
HA-VP24
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11oben unten
HA-VP24
HA-VP24 Karbonatpuffer pH11
HA-VP24 ∅A
B
C
D
4 Ergebnisse 76
Das unbehandelte HA-VP24 bindet, wie bereits unter 4.2.1 gezeigt, nur schwach an
Membranen und befindet sich vor allem als lösliches Protein im unteren Teil des
Gradienten (Abbildung 12 A). Durch die Behandlung mit 2 M KCl (B) und 50 mM EDTA
(C) lässt sich das VP24 nicht von der Membran ablösen, KCl scheint die Bindung eher
zu unterstützen. Die Inkubation mit Karbonatpuffer jedoch verringert den Anteil von
VP24 in den Membranfraktionen, was darauf hinweist, dass sich ein Teil des flotierten
VP24 eingeschlossen in Membranvesikeln befinden könnte und durch diese
Behandlung freigesetzt wird.
4.2.3 Membranassoziation von VP24 in Anwesenheit von VP40 oder GP
Wie unter 4.2.1 gezeigt, hat VP24 nur eine schwache Tendenz mit zellulären
Membranen zu interagieren, während das MARV-spezifische periphere
Membranprotein VP40 sowie das Oberfächenprotein GP als integrales
Membranprotein stark mit Membranen assoziiert vorliegen. Aufgrund der Lokalisation
des VP24 im Matrixraum der Virionen erschien eine Interaktion mit VP40 und GP
wahrscheinlich. Eine Interaktion von VP24 mit dem zytoplasmatischen Anteil des GP
konnte bereits in GST-Kosedimentationsexperimenten nachgewiesen werden
(Bamberg, 2000). Um zu untersuchen, ob VP24 durch die Anwesenheit von VP40 oder
GP an die Membranen rekrutiert werden kann, wurden diese Proteine jeweils in
HEK293-Zellen koexprimiert und wie zuvor beschrieben einer Flotationsanalyse
unterzogen.
Abbildung 12: Charakterisierung der Membranassoziation von HA-VP24. HEK293-Zellen wurden mit pCAGGS-HA-VP24 transfiziert, 24 h p.t. geerntet und der PNÜmit 2 M KCl, 50 mM EDTA bzw. Karbonatpuffer pH 11 behandelt. Anschließend wurde eineFlotationsanalyse durchgeführt. Darstellung der fraktionierten Gradienten von oben nachunten (Fraktion 1 bis 11) durch SDS-PAGE und Western Blot. Die Färbung erfolgte miteinem HA-AK sowie einem POD-gekoppelten α Maus-AK. A: unbehandelter PNÜ. B:Behandlung mit 2 M KCl. C: Behandlung mit 50 mM EDTA. D: Behandlung mitKarbonatpuffer pH 11.
Lamp-1 110 kD1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11oben unten
VP40 33,8 kD
29,8 kDHA-VP24
A
4 Ergebnisse 77
Abbildung 13 A zeigt die Verteilung von VP24 und VP40 im Gradienten nach der
Zentrifugation. Als Kontrollprotein für die Membranfraktionen diente wiederum Lamp-1.
VP40 zeigte die erwartete starke Assoziation mit den zellulären Membranen, während
sich das Membranbindungsverhalten von VP24 auch in Anwesenheit von VP40 nicht
veränderte. Daraus lässt sich schließen, dass VP40 nicht in der Lage ist, VP24 in
diesem Flotationsassay an zelluläre Membranen zu rekrutieren.
Die Koexpression von GP und HA-VP24 (Abbildung 13 B) zeigte die erwartete
Flotation des GP als integrales Membranprotein in die oberen Fraktionen (1 bis 4),
während HA-VP24 im Vergleich zur singulären Expression auch hier keine größere
Membranaffinität zeigte. GP scheint daher ebenfalls in der Flotation keinen Einfluss auf
die Interaktion des VP24 mit Membranen zu haben.
4.2.4 Untersuchungen zur Membranintegration des VP24
Durch eine Triton X-114 Phasenpartitionierung lässt sich unterscheiden, ob ein
membranassoziiertes Protein als peripheres oder integrales Membranprotein vorliegt
(3.3.6.3), da dieses Detergenz die Eigenschaft besitzt, bei 0 °C in einer Phase mit der
wässrigen Umgebung vorzuliegen, während es bei Erwärmung zu einer Separation des
Triton X-114 von der wässrigen Umgebung kommt. Während dieses Phasenübergangs
transferiert das Detergenz alle integralen Membranproteine in die sogenannte
Detergentienphase, die von Triton X-114 gebildet wird, während alle löslichen oder nur
peripher an Membranen gebundene Proteine in der wässrigen Phase verbleiben.
Für VP40 konnte bereits gezeigt werden, dass es sich um ein peripheres
Membranprotein handelt, welches sich ausschließlich in der wässrigen Phase der
Abbildung 13: Membranassoziation von HA-VP24 bei Koexpression von VP40 bzw. GP.HEK293-Zellen wurden mit 1 µg pCAGGS-HA-VP24 und 1 µg pCAGGS-VP40 bzw. 0,5 µgpCAGGS-GP transfiziert, 24 h p.t. geerntet und der PNÜ einer Flotationsanalyse unterzogen.Darstellung der fraktionierten Gradienten von oben nach unten (Fraktion 1 bis 11) durch SDS-PAGE und Western Blot. A: Flotation von VP40 und HA-VP24 nach Koexpression. B:Flotation von GP und HA-VP24 nach Koexpression.
B
GP1 160 kD
HA-VP24 29,8 kD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10oben unten
11
4 Ergebnisse 78
Partitionierung befindet (Kolesnikova et al., 2002). Das Verhalten von VP24 sollte hier
im Vergleich zu VP40 untersucht werden.
HEK293-Zellen wurden entweder mit pCAGGS-VP24, pCAGGS-VP40 oder mit beiden
Plasmiden im Verhältnis 1:1 transfiziert und 24 Stunden p.t. geerntet (3.2.2). Der PNÜ
wurde anschließend einer Triton X-114 Phasenpartitionierung unterzogen, wie sie
unter 3.3.6.3 beschrieben ist. Abbildung 14 zeigt die Western Blot Analyse der
wässrigen (W) sowie der Detergentienphase (D).
In Abbildung 14 A sind als zelluläre Kontrollproteine das Lamp-1 sowie Annexin II
gezeigt. Lamp-1 zeigte als integrales Membranprotein, wie erwartet, die vollständige
Anwesenheit in der Detergentienphase, während Annexin II als vorwiegend lösliches
Protein ausschließlich in der wässrigen Phase zu finden war. Betrachtet man nun die
Verteilung von VP24, so zeigte sich, dass es zu gleichen Teilen in der wässrigen als
auch in der Detergentienphase vertreten war. Abbildung 14 B zeigt zur Kontrolle die
Partitionierung des VP40, welches sich, wie bereits beschrieben, ausschließlich in der
wässrigen Phase wiederfand. Auch die Koexpression des VP24 gemeinsam mit dem
VP40 (C) änderte nichts an der Verteilung beider Proteine in der
Phasenpartitionierung. VP24 zeigte somit das Verhalten eines partiell
membranintegrierten Proteins, während die Sequenz des VP24 jedoch weder eine
Signalsequenz für die Translokation in das ER noch eine potentielle
Transmembrandomäne aufweist.
220 kD
66 kD
46 kD
30 kD
97 kD
Lamp-1
Annexin II
VP24
W D
Lamp-1
VP40
220 kD
66 kD
46 kD
30 kD
97 kD
W D220 kD
66 kD
46 kD
30 kD
97 kD
VP40
Lamp-1
VP24
W D
A B C
1 2 1 2 1 2
Abbildung 14: Triton X-114 Phasenpartitionierung von VP24 und VP40. HEK293-Zellen wurden einzeln und in Kombination mit pCAGGS-VP24 und pCAGGS-VP40transfiziert, 24 h p.t. geerntet und der PNÜ einer Phasenpartitionierung unterzogen.Darstellung der wässrigen (W) sowie der Detergentienphase (D) durch SDS-PAGE undWestern Blot. A: Partitionierung von singulär exprimiertem VP24. B: Partitionierung vonsingulär exprimiertem VP40. C: Partitionierung von VP24 und VP40 nach Koexpression.
4 Ergebnisse 79
Es stellte sich daher die Frage, ob diese potentiell membranintegrierte Form auch in
reifen MARV-Partikeln zu finden ist. Daher wurden aufgereinigte Marburgvirus-Partikel
im Sicherheitslabor ebenfalls einer Phasenpartitionierung (3.3.6.3) unterzogen und
mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert.
Die Phasenpartitionierung der MARV-Partikel (Abbildung 15) ergab, dass sich die
Virusproteine VP24 und VP40, welche mit reifen Partikeln ausgeschleust werden,
genauso verhielten wie die transient exprimierten Proteine. Offenbar werden beide
Formen des VP24, die lösliche sowie die tendenziell membranintegrierte bei der
Virusreifung eingebaut.
4.3 Bildung von virusähnlichen Partikeln (VLPs)
Für eine Reihe von Viren konnte bisher gezeigt werden, dass eine transiente
Expression von einzelnen oder mehreren viralen Proteinen zur Bildung von
virusähnlichen Partikeln, sogenannten „virus-like particles“ (VLPs) führt. Sie imitieren
strukturell reife virale Partikel, enthalten jedoch kein genomisches Material (Noad and
Roy, 2003). Bei vielen NNS-RNA-Viren führt die singuläre Expression der
Matrixproteine zu der Freisetzung von VLPs (Paramyxoviren [Takimoto et al., 2001;
Coronel et al., 1999]; Rhabdoviren [Li et al., 1993; Justice et al., 1995]; Retroviren
[Garnier et al., 1996]). Sowohl für das VP40 des Ebolavirus, als auch für das
Marburgvirus konnte bereits gezeigt werden, dass VP40 in der Lage ist, seine eigene
Freisetzung in Form von VLPs zu vermitteln, welche die typische filamentöse Gestalt
der reifen Filoviren zeigen. Auch GP ist bei singulärer Expression in der Lage, VLPs zu
bilden, allerdings handelt es sich hierbei um ca. 100 nm große, sphärische Partikel, die
220 kD
66 kD
46 kD
30 kD
97 kD
VP40
VP24
W D
Abbildung 15: Triton X-114 Phasenpartitionierung von MARV-Partikeln. Gereinigte MARV-Partikel wurden wie unter 3.3.6.3 beschrieben einer Phasenpartitionierungunterzogen. Darstellung der wässrigen (W) sowie der Detergentienphase (D) durch SDS-PAGE und Western Blot. Färbung der viralen Proteine VP24 und VP40.
4 Ergebnisse 80
das Oberfächenprotein GP tragen. Des Weiteren ist gezeigt, dass VP40 in der Lage ist
GP in die von VP40 gebildeten, filamentösen VLPs zu rekrutieren (Noda et al., 2002;
Swenson et al., 2004; Kolesnikova et al., 2004b).
4.3.1 Bildung von VLPs durch Einzelexpression von VP40, GP und VP24
Zunächst stellte sich die Frage, ob VP24 als potentielles zweites Matrixprotein der
Filoviren ebenfalls in der Lage ist, VLPs zu bilden, wie es für die Matrixproteine vieler
Vertreter der Mononegavirales gezeigt werden konnte. Für das EBOV-VP24 ist bereits
eine Freisetzung in membranumhüllter Form in den Zellkulturüberstand beschrieben
(Han et al., 2003). Um ein solches Verhalten für das MARV-VP24 zu untersuchen,
wurde WT-VP24 transient in HEK293-Zellen exprimiert und der Zellkulturüberstand 48
Stunden p.t. auf die Anwesenheit von VLPs hin untersucht. Hierzu wurde partikuläres
Material aus dem Überstand durch eine dreistündige Zentrifugation über ein
Saccharose-Kissen aufgereinigt (3.2.4). Um sicherzustellen, dass es sich bei den
pelletierten Proteinen wirklich um membranumhüllte VLPs handelte und nicht um
Membrandebris mit assoziierten Proteinen oder Proteinaggregate, wurde ein
Proteinase K-Verdau durchgeführt (3.3.5). Das resuspendierte Pellet wurde in drei
Ansätze geteilt, einer blieb unbehandelt (PBSdef), der zweite wurde mit Proteinase K
versetzt. Hier erwartet man den Abbau aller Proteine, die nicht durch eine Membran
geschützt vorliegen, und kann somit im Vergleich zum ersten Ansatz den Anteil an
pelletiertem Protein von membranumhülltem Protein unterscheiden. Als Kontrolle
wurde der dritte Ansatz neben Proteinase K zusätzlich mit dem Detergenz Triton X-100
versetzt, welches die Membranen zerstört und somit auch membranumhülltes Protein
der Protease zugänglich macht. Als Kontrollen für die Funktionalität der VLP-Reinigung
sowie des Proteinase K-Verdaus wurden VP40 bzw. GP parallel exprimiert. Die VLPs
wurden im Anschluss mithilfe von SDS-PAGE und Western Blot analysiert (3.3.1.1,
3.3.1.4).
Abbildung 16 zeigt die Ergebnisse der Aufreinigung der VLPs von VP40, GP und
VP24.
Die Einzelexpression von VP40 (Spur 4) führte, wie erwartet, zur Freisetzung von
VP40 in den Zellkulturüberstand (Abbildung 16 A, Spur 1). Die Behandlung mit
Proteinase K und zusätzlich Triton X-100 (Spuren 2 und 3) machte deutlich, das diese
Freisetzung in Form von membranumhüllten Partikeln stattfand. Das VLP-Pellet wurde
außerdem von Dr. Larissa Kolesnikova elektronenmikroskopisch untersucht und es
konnten die typischen, filamentösen Partikel dargestellt werden (Abbildung nicht
gezeigt).
4 Ergebnisse 81
Die Einzelexpression von GP (Abbildung 16 B, Spur 4) führte ebenfalls zu seiner
Freisetzung (B, Spur 1), jedoch konnte hier durch den Proteinase K-Verdau nicht
eindeutig festgestellt werden, ob dies tatsächlich in Form von VLPs geschah, da der
größte Anteil des Proteins (GP1 sowie Teile des GP2) aus der Membran herausragt und
somit auch ohne Triton X-100-Behandlung für die Proteinase K zugänglich ist.
Lediglich ein kleiner Anteil des GP2 war nach Proteinase K-Verdau noch detektierbar
(B, Spur 2). Die Einzelexpression von VP24 (Abbildung 16 C, Spur 4) führte nicht zu
einer Freisetzung von VP24 (C, Spur 1-3) in den Zellkulturüberstand. Die Proben
wurden nach der Ultrazentrifugation ebenfalls einer elektronenmikroskopischen
Untersuchung unterzogen, doch auch hier konnten keine membranumhüllten
Strukturen festgestellt werden (Abbildungen nicht gezeigt). Somit scheint das VP24
des Marburgvirus nicht in der Lage zu sein, seine eigene Freisetzung in Form von
membranumhüllten, virusähnlichen Partikeln zu vermitteln.
Abbildung 16: Bildung von virusähnlichen Partikeln durch Einzelexpression vonVP40, GP und VP24. HEK293-Zellen wurden mit jeweils 1 µg pCAGGS-VP24, pCAGGS-VP40 oder pCAGGS-GPtransfiziert und 48 h p.t. wurden Überstand und Zellen geerntet. Der Überstand wurde überein Saccharose-Kissen zentrifugiert, die pelletierten VLPs anschließend einem Proteinase K-Verdau unterzogen und die Proben mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert. A:Aufreinigung und Proteinase K-Verdau des Zellkulturüberstandes von VP40-transfiziertenZellen. Spur 1 zeigt das unbehandelte Pellet, Spur 2 die Behandlung mit Proteinase K (P.K)und Spur 3 die Behandlung mit Proteinase K sowie Triton X 100 (TX100). Spur 4 zeigt diezelluläre Expression. B: Darstellung der von GP erzeugten virusähnlichen Partikel. Spuren1-4 wie unter A beschrieben. C: Darstellung des Zellkulturüberstands von VP24-exprimierenden Zellen. Spuren 1-4 wie unter A beschrieben. * markiert ein bisherunbekanntes, zelluläres Protein.
66 kD
46 kD
30 kD
97 kD
T X100P.K -
-+ +- +
21 kD
Zelll
ysatÜberstand
VP24
1 2 3 4
C
66 kD
46 kD
30 kD
97 kD
21 kD
T X100
P.K -
-
+ +- + Ze
lllys
atÜberstand
VP40
1 2 3 4
A
66 kD
46 kD
30 kD
97 kD
21 kD
T X100P.K -
-+ +- + Ze
lllys
atÜberstand
GP1
GP2
1 2 3 4
B
GPER*
4 Ergebnisse 82
4.3.2 Koexpression von VP24, VP40 und GP in äquivalenten Mengen zur Virusinfektion
Bevor im Folgenden die Freisetzung von VP24 durch VP40 oder GP bzw. der Einfluss
des VP24 auf deren Freisetzung untersucht werden konnte, sollte zunächst betrachtet
werden, ob VP24 die Expression von GP oder VP40 beeinflussen kann und in
welchem Verhältnis die kodierenden Plasmide für VP24, VP40 und GP zueinander
transfiziert werden müssen, um eine der Virusinfektion entsprechende
Proteinexpression zu erhalten.
4.3.2.1 Einfluss des VP24 auf die Expression von VP40 und GP
Es wurde zunächst untersucht, ob die Koexpression von VP24 Einfluss auf die
Expression von VP40 bzw. GP nimmt. Ansteigende Mengen von pCAGGS-VP24
wurden mit 0,5 µg pCAGGS-VP40 bzw. 0,2 µg pCAGGS-GP in HEK293-Zellen
kotransfiziert (3.2.2). 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in PBSdef
geerntet, mit 4x-Proteinprobenpuffer versetzt und die synthetisierten Proteinmengen
mittels SDS-PAGE und Western Blot sichtbar gemacht und miteinander verglichen
(3.3.1.4).
Die Koexpression von VP24 und GP (Abbildung 17 A) zeigte kaum Einfluss auf die
Bildung und Spaltung von GP. Lediglich eine leichte Erhöhung der GP-Menge konnte
ab einer eingesetzten DNA-Konzentration von 0,6 µg des Vektors pCAGGS-VP24
festgestellt werden, was für eine potentielle Stabilisierung des GP durch VP24
220 kD
66 kD
46 kD
30 kD
97 kD
0
0,2
1,00,80,60,40,2pC-VP24 (µg)
0,20,20,20,20,2pC-GP (µg)
GP1
GP2
VP24
∗
220 kD
66 kD
46 kD
30 kD
97 kD
220 kD
66 kD
46 kD
30 kD
97 kD
0
0,2
1,00,80,60,40,2pC-VP24 (µg)
0,20,20,20,20,2pC-GP (µg)
GP1
GP2
VP24
∗ 46 kD
30 kD
VP40
VP24
0
0,5
0,80,60,40,20,1pC-VP24 (µg)
0,50,50,50,50,5pC-VP40 (µg)
46 kD
30 kD
46 kD
30 kD
VP40
VP24
0
0,5
0,80,60,40,20,1pC-VP24 (µg)
0,50,50,50,50,5pC-VP40 (µg)
BA
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
Abbildung 17: Einfluss des VP24 auf die Expression von VP40 bzw. GP. HEK293-Zellen wurden mit jeweils 0,2 µg pCAGGS-GP oder 0,5 µg pCAGGS-VP40 sowiemit verschiedenen Mengen an pCAGGS-VP24 transfiziert. 24 h p.t. wurden die Zellengeerntet und die Proteine im Western Blot sichtbar gemacht. A: Koexpression von GP ohneVP24 (Spur 1) sowie mit ansteigenden Mengen an VP24 (Spuren 2 bis 6). B: Koexpressionvon VP40 ohne VP24 (Spur 1) sowie mit ansteigenden Mengen an VP24 (Spuren 2 bis 6).* markiert ein bisher unbekanntes, zelluläres Protein.
4 Ergebnisse 83
sprechen könnte. Betrachtet man die Koexpression von VP24 und VP40 (Abbildung 17
B), so beobachtet man hier keinen Effekt des VP24 auf die in der Zelle vorliegende
VP40-Menge.
4.3.2.2 Expression von VP24, VP40 und GP in äquivalenten Mengen zur MARV-Infektion
Im Weiteren wurde ermittelt, welche Plasmidmengen eingesetzt werden müssen, um
bei der rekombinanten Expression der viralen Proteine ein Verhältnis zu erreichen, das
dem in MARV-infizierten Zellen entspricht. Ein der natürlichen Infektion
entsprechendes Bild bezüglich der Verhältnisse von VP40 und GP zeigte sich, wenn
sie im Verhältnis 1:0,2 transfiziert wurden (Berghöfer, 2003). VP24 ist in der
Virusinfektion mengenmäßig schwächer vertreten als das VP40, jedoch zeigt es ein
stärkeres Signal als GP. Aufgrund dieser Beobachtung wurden die drei viralen Proteine
im Verhältnis VP24:VP40:GP = 0,5:1:0,2 in HEK293-Zellen transfiziert und die
Proteinexpression 48 Stunden p.t. mit der Proteinexpression von MARV-infizierten
Vero-Zellen verglichen.
Abbildung 18 zeigt die Färbung von GP, VP40 und VP24 im Western Blot. Die Signale
der einzelnen Proteine machen deutlich, dass die Transfektion der drei Plasmide in
dem oben genannten Verhältnis eine Proteinexpression vermitteln, die der Expression
220 kD
97 kD
66 kD
45 kD
30 kD
GP1
VP40
VP24
MAR
V
GP +
VP4
0 +
VP24
Abbildung 18: Vergleich der Proteinmengen in MARV-infizierten Vero-Zellen undtransfizierten HEK293-Zellen. Vero-Zellen wurden 1 h mit MARV infiziert und 24 h p.i. geerntet. HEK293-Zellen wurden mit1 µg pCAGGS-VP40, 0,5 µg pCAGGS-VP24 und 0,2 µg pCAGGS-GP transfiziert, dieZelllysate 48 h p.t. geerntet und mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert.
4 Ergebnisse 84
von GP, VP40 und VP24 in virusinfizierten Zellen entspricht. Die folgenden
Kotransfektionen zur Untersuchung der VLPs wurden deshalb immer in diesem
Verhältnis durchgeführt.
4.3.3 Rekrutierung von VP24 in von VP40 bzw. GP gebildete VLPs
Da VP24 nicht in der Lage ist, virusähnliche Strukturen auszubilden, stellte sich im
Weiteren die Frage, ob VP24 in die von VP40- bzw. GP-gebildeten Partikel rekrutiert
werden kann.
Um dies zu untersuchen, wurde VP24 jeweils entweder mit VP40 oder GP koexprimiert
und die resultierenden VLPs auf den Einbau von VP24 hin untersucht. 0,5 µg
pCAGGS-VP24 wurde zusammen mit 1 µg pCAGGS-VP40 bzw. 0,2 µg pCAGGS-GP
in HEK293-Zellen kotransfiziert (3.2.2). 48 Stunden nach der Transfektion wurden die
Zellen sowie der Zellkulturüberstand geerntet und die gebildeten VLPs durch
Zentrifugation des Überstandes über ein Saccharose-Kissen aufgereinigt (3.2.4). Im
Anschluss wurde, wie bereits unter 4.3.1 beschrieben, ein Proteinase K-Verdau
durchgeführt, um membranumhüllte Proteine von freien Proteinen zu unterscheiden.
Die Einzelexpression von VP24 zeigte, wie erwartet, keine Freisetzung des
exprimierten VP24 (Abbildung 19 A), während die Koexpression mit VP40 dazu führte,
dass VP24 im Zellkulturüberstand detektierbar wurde (B, Spur 1). Dieser freigesetzte
Anteil an VP24 war zudem resistent gegen Proteinase K-Verdau (B, Spur 2), ebenso
wie das VP40, und wurde erst durch Anwesenheit des Triton X-100 für die Protease
angreifbar (B, Spur 3), was darauf hindeutet, dass VP24 in die von VP40 gebildeten
VLPs eingebaut und so in den Zellkulturüberstand abgegeben wurde. Somit ist eine
Interaktion zwischen VP24 und VP40 sehr wahrscheinlich.
T X100P.K -
-+ +- + Ze
lllys
at
Überstand
A
1 2 3 4
T X100P.K -
-+ +- + Ze
lllys
at
Überstand
B
1 2 3 4
P.K --
+ +- + Ze
lllys
at
Überstand
T X100
C
1 2 3 4
VP24
VP40
GP1
GP2
VP24
VP40
GP1
GP2
VP24
VP40
GP1
GP2
4 Ergebnisse 85
Im Gegensatz zu VP40 führte die Koexpression von GP und VP24 (Abbildung 19 C,
Spur 4) nicht zur Freisetzung von VP24 in den Zellkulturüberstand, während GP hier
jedoch detektiert werden konnte (C, Spur 1). GP scheint somit im Gegensatz zu VP40
nicht in der Lage zu sein, VP24 in die von GP gebildeten virusähnlichen Partikel zu
rekrutieren und in den Überstand freizusetzen. Die durch Koexpression von VP24 und
VP40 entstandenen Partikel wurden außerdem elektronenmikroskopisch von
Dr. Larissa Kolesnikova untersucht. Es zeigte sich (Abbildung 19 D), dass auch hier die
für VP40 typischen filamentösen VLPs gefunden wurden. Aufgrund der Umhüllung
durch die Membran waren die eingeschlossenen Proteine nicht für eine
Antikörperfärbung zugänglich (weder VP40, noch VP24), jedoch war in Bereichen, in
denen die Membran beschädigt zu sein schien, eine Färbung sowohl von VP24 (12 nm
Goldpartikel, Pfeil) als auch von VP40 (6 nm Goldpartikel, Pfeilkopf) möglich.
4.3.4 Einfluss des VP24 auf die Bildung von virusähnlichen Partikeln
Im Folgenden stellte sich die Frage, ob VP24 die Freisetzung von VP40 und GP
beeinflussen kann. Um diese Frage zu beantworten, wurden die drei Proteine jeweils
Abbildung 19: Rekrutierung von VP24 in virusähnliche Partikel. HEK293-Zellen wurden mit jeweils 0,5 µg pCAGGS-VP24 und 1 µg pCAGGS-VP40 oder0,2 µg pCAGGS-GP transfiziert und 48 h p.t. wurden Überstand und Zellen geerntet. DerÜberstand wurde über ein Saccharose-Kissen zentrifugiert und die pelletierten VLPsanschließend einem Proteinase K-Verdau unterzogen. Die Proben wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert. A: Aufreinigung und Proteinase K-Verdau desZellkulturüberstandes von VP24-transfizierten Zellen. Spur 1 zeigt das unbehandelte Pellet,Spur 2 die Behandlung mit Proteinase K (P.K) und Spur 3 die Behandlung mit Proteinase Ksowie Triton X-100 (TX100). Spur 4 zeigt die zelluläre Expression. B: Koexpression vonVP24 und VP40. Die Spuren 1 bis 3 zeigen den Proteinase K-Verdau, Spur 4 zeigt diezelluläre Expression. C: Koexpression von VP24 und GP. Die Spuren 1 bis 3 zeigen denProteinase K-Verdau, Spur 4 zeigt die zelluläre Expression. D: ElektronenmikroskopischeAufnahme von VLPs, enstanden durch Koexpression von VP24 und VP40, nachZentrifugation über ein Saccharose-Kissen. Gefärbt wurde mit α VP24- (Kaninchen) undα VP40- (Maus) Antikörpern. VP24 ist mit 12 nm Goldpartikeln (Pfeil) durch Verwendungeines Gold-markierten Esel α Kaninchen-Sekundärantikörpers markiert. VP40 ist durch 6 nmGoldpartikel (Pfeilkopf) durch Verwendung eines Gold-markierten Esel α Maus-Sekundärantikörpers markiert. 60000fach Vergrößerung. EM-Bild Dr. Larissa Kolesnikova.
D
4 Ergebnisse 86
einzeln (VP24, VP40, GP), in Zweierkombinationen (VP24 + VP40, VP24 + GP, VP40
+ GP) und zusammen in HEK293-Zellen exprimiert und die Freisetzung der
virusähnlichen Partikel miteinander verglichen. VP24, VP40 und GP wurden im
Verhältnis 0,5:1:0,2 transfiziert (s. 4.3.2.2). Um die transfizierten DNA-Mengen
vergleichbar zu halten wurde, wenn notwendig, mit Leervektor pCAGGS aufgefüllt. Der
Zellkulturüberstand wurde 48 Stunden p.t. geerntet, ebenso die Zellen (3.2.4).
Abbildung 20 zeigt die Darstellung der zellulären Expression der einzelnen Proteine (A)
sowie deren Freisetzung in den Zellkulturüberstand (B) mittels Western Blot Analysen
(3.3.1.4).
Vergleicht man zunächst die Einzelexpression von VP40 (B, Spur2) mit der
Koexpression von VP40 und VP24 (B, Spur 4) so fällt zum einen auf, dass es, wie
bereits gezeigt, zur Freisetzung von VP24 in Anwesenheit von VP40 kam. Außerdem
zeigte sich, dass sich die Menge an freigesetztem VP40 in Anwesenheit von VP24
nicht veränderte. VP24 scheint somit keinen Einfluss auf die Freisetzung des VP40 zu
haben. Auch die Freisetzung von GP wurde durch die Anwesenheit des VP24 nicht
beeinflusst (Vergleich Spur 3 und 5).
Abbildung 20: Einfluss des VP24 auf die Bildung virusähnlicher Partikel. HEK293-Zellen wurden entweder einzeln mit pCAGGS-VP24, pCAGGS-VP40 bzw.pCAGGS-GP transfiziert, oder in Zweier- und Dreierkombination kotransfiziert. DasVerhältnis der eingesetzten DNA VP24:VP40:GP betrug dabei immer 0,5:1:0,2. 48 h p.t.wurden die Zellen sowie der Zellkulturüberstand geerntet und die viralen Proteine mittelsSDS-PAGE und Western Blot sichtbar gemacht. A: Expression von VP24, VP40 und GP inHEK293-Zellen. B: Freisetzung der viralen Proteine VP24, VP40 und GP in den Überstand.
-+++-+--pC-GP
-++-+-+-pC- VP40
--+++--+pC-VP24
-+++-+--pC-GP
-++-+-+-pC- VP40
--+++--+pC-VP24
Zelllysat Überstand
GP1
GP2
VP40
VP24
A B
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
4 Ergebnisse 87
Vergleicht man jeweils die Einzelexpression von VP40 und GP (B, Spuren 2 + 3) mit
der Koexpression beider Proteine (Spur 7), so fällt auf, dass die Freisetzung beider
Proteine in den Zellkulturüberstand gegenüber der Einzelexpression erhöht war. Beide
Proteine schienen sich gegenseitig in der Freisetzung zu unterstützen. Es konnte
gezeigt werden, dass das GP bei Koexpression mit VP40 nicht verstärkt als Vesikel
freigesetzt wurde, sondern in die filamentösen, von VP40 gebildeten Partikel rekrutiert
wurde (Kolesnikova et al., 2004b).
Exprimierte man zusätzlich zu VP40 und GP das zweite Matrixprotein VP24 (B, Spur
6), sah man, dass die Menge an freigesetztem VP24 im Vergleich zur Koexpression
von VP24 und VP40 erhöht war. Diese Erhöhung war wahrscheinlich durch die
vermehrte Freisetzung von VP40 bedingt, welche wiederum durch die Koexpression
mit GP zustande kam. Allerdings war die Menge an freigesetztem GP im Vergleich zur
Koexpression von VP40 und GP in Anwesenheit von VP24 leicht verringert. VP24
scheint somit einen Einfluss auf den Einbau des GP in die von VP40 gebildeten
virusähnlichen Partikel zu haben.
4.3.5 Einfluss des Late-Domain-Motivs PPPY des MARV-VP40 auf den Einbau von VP24
Viele umhüllte Viren, darunter Vertreter der Familien der Retroviridae, Rhabdoviridae,
Arenaviridae und der Filoviridae kodieren in den viralen Strukturproteinen für
sogenannte Late-Domain-Motive. Diese kurzen Peptidmotive sind für den letzten
Schritt der Virusfreisetzung notwendig, wenn die Hüllmembran des Virus sich von der
Plasmamembran abschnürt. Für das Ebolavirus konnte bereits gezeigt werden, dass
die sich überlappenden Late-Domain-Motive PTAPPEY (bestehend aus PTAP und
PPEY) des VP40 eine zentrale Rolle in der Freisetzung von virusähnlichen Partikeln
aus VP40-transfizierten Zellen spielen (Licata et al., 2003; Martin-Serrano et al., 2004).
Das VP40 des MARV besitzt im N-terminalen Bereich ebenfalls ein klassisches Late-
Domain-Motiv PPPY (EMBL Nucleotide Sequence Database, accession number
Z12132; Nukleotide 4612 – 4623). Die Funktionalität eines solchen Motivs kann bereits
durch die Mutation des Tyrosin-Restes (Y) stark beeinträchtigt werden, wie es bereits
bei anderen viralen Matrixproteinen gezeigt wurde (Strecker et al., 2003; Jayakar et al.,
2000). Ein nicht mehr funktionelles Late-Domain-Motiv resultierte hier in der
verminderten oder vollständig gehemmten Freisetzung von virusähnlichen Partikeln.
Für MARV ist die Rolle des PPPY-Motivs des VP40 bei der Abschnürung viraler
Partikel bzw. VLPs bisher unbekannt, ebenso dessen Einfluss auf die Freisetzung des
VP24 in die VLPs. Daher wurde durch in vitro Mutagenese (3.1.3.5) der Tyrosin-Rest
gegen ein Alanin ausgetauscht und die so entstandene VP40-PPPA-Mutante im
4 Ergebnisse 88
Vergleich zum WT-VP40 auf ihre Fähigkeit hin untersucht, VLPs zu bilden sowie VP24
in die VLPs zu rekrutieren.
pCAGGS-VP40 oder pCAGGS-VP40-PPPA wurden in HEK293-Zellen transfiziert
(3.2.2) und 48 Stunden p.t. wurde der Zellkulturüberstand geerntet, einem Proteinase
K-Verdau unterzogen und mithilfe von SDS-PAGE und Western Blot auf die
Anwesenheit von VLPs überprüft (3.3.1.4). Zusätzlich wurden Zellen sowohl mit den
beiden VP40-Proteinen sowie dem VP24 im Verhältnis 1:0,5 kotransfiziert, um den
Einfluss des Late-Domain-Motivs auf die Ausschleusung von VP24 zu untersuchen.
Abbildung 21 zeigt, dass im Fall des MARV-VP40 eine Mutation des Late-Domain-
Motivs PPPY zu PPPA nicht zu einer verminderten Freisetzung des Proteins in den
Zellkulturüberstand führte (Abbildung 21, A + B) und dass die VP40-Mutante ebenso
wie das WT-Protein in membranumhüllter Form vorlag (A + B, Spuren 1 bis 3). Des
Weiteren lässt die Koexpression von VP24 erkennen, dass VP24 unabhängig von dem
PPPY-Motiv in die virusähnlichen Partikel rekrutiert wird (Abbildung 21, C + D).
+--TX100
+++P.K
Zelll
ysatÜberstand
+--+++P.K
Zelll
ysatÜberstand
TX100
+--TX100
+++P.K
Zelll
ysatÜberstand
+--TX100
+++P.K
Zelll
ysatÜberstand
VP24VP24
VP40-PPPA
VP40-PPPA
VP40
VP40
A B
C D
1 2 3 4 1 2 3 4
1 2 3 4 1 2 3 4
+--TX100
+++P.K
Zelll
ysatÜberstand
+--+++P.K
Zelll
ysatÜberstand
TX100
+--TX100
+++P.K
Zelll
ysatÜberstand
+--TX100
+++P.K
Zelll
ysatÜberstand
VP24VP24
VP40-PPPA
VP40-PPPA
VP40
VP40
A B
C D
1 2 3 4 1 2 3 4
1 2 3 4 1 2 3 4
Abbildung 21: Mutation des Late-Domain-Motivs PPPY des VP40 und sein Einfluss aufdie Freisetzung der VLPs sowie die Rekrutierung von VP24. HEK293-Zellen wurden entweder mit je 1 µg pCAGGS-VP40 bzw. pCAGGS-VP40-PPPAtransfiziert (A + B), oder zusätzlich mit 0,5 µg pCAGGS-VP24 (C + D). 48 h p.t. wurden dieZellen sowie der Zellkulturüberstand geerntet, und die VLPs mittels Zentrifugation über einSaccharose-Kissen aufgereinigt und einer Proteinase K-Behandlung unterzogen (3.3.5). Dieviralen Proteine wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot sichtbar gemacht. A:Freisetzung und Expression von VP40. B: Freisetzung und Expression von VP40-PPPA. C:Freisetzung von VP24 durch VP40. D: Freisetzung von VP24 durch VP40-PPPA.
4 Ergebnisse 89
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Late-Domain-Motiv PPPY des MARV-
VP40 nicht ausschlaggebend für die Freisetzung von virusähnlichen Partikeln von der
Zelloberfläche sowie die Rekrutierung von VP24 ist, sondern dass VP40 andere
Sequenzen enthalten muss, welche für die Abschnürung und Freisetzung der Partikel
eine Rolle spielen.
4.3.6 Einbau von NP in die VLPs
Zur Bildung reifer, infektiöser Virionen muss das im Zytoplasma reifende Nukleokapsid
mit einer Hüllmembran umschlossen werden, in welche die viralen Oberflächenproteine
inseriert sind. Die Matrixproteine gelten hierbei als Mediatoren der Interaktion zwischen
den RNP-Komplexen und der Plasmamembran mit den eingelagerten Hüllproteinen.
Es ist bekannt, dass das Nukleoprotein NP des MARV auch in Abwesenheit anderer
viraler Proteine durch singuläre Expression in der Lage ist, nukleokapsidähnliche
Strukturen und sog. Einschlusskörper zu bilden, die in ihrer Ultrastruktur denen in der
Virusinfektion sehr ähneln (Kolesnikova et al., 2000). Durch die Koexpression von NP
zusammen mit VP40 und/oder VP24 sollte überprüft werden, ob NP in die von VP40
gebildeten virusähnlichen Partikel rekrutiert werden kann.
Dazu wurde 1 µg pCAGGS-NP entweder alleine oder in Kombination mit pCAGGS-
VP24 und/oder pCAGGS-VP40 transfiziert. Der Zellkulturüberstand wurde 48 Stunden
p.t. geerntet, einem Proteinase K-Verdau unterzogen und mittels SDS-PAGE und
Western Blot analysiert. Abbildung 22 zeigt die Freisetzung von NP in den Überstand.
T X100P.K -
-+ +- +
Überstand
T X100P.K -
-+ +- +
Überstand
T X100P.K -
-+ +- +
Überstand
P.K --
+ +- +
Überstand
T X100P.K -
-+ +- +
Überstand
T X100P.K -
-+ +- +
Überstand
T X100P.K -
-+ +- +
Überstand
NP
VP40
VP24
A B C D
1 2 3 4
Zelll
ysat
Zelll
ysat
Zelll
ysat
Zelll
ysat
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
NP
VP40
VP24
NP
VP40
VP24
Abbildung 22: Einbau von NP in VLPs. HEK293-Zellen wurden mit pCAGGS-NP alleine oder in Kombination mit pCAGGS-VP24und/oder pCAGGS-VP40 transfiziert. 48 h p.t. wurden die Zellen sowie der Zellkultur-überstand geerntet, einem Proteinase K-Verdau unterzogen und die viralen Proteine mittelsSDS-PAGE und Western Blot sichtbar gemacht. A: Expression von NP. B: Expression vonNP und VP24. C: Expression von NP und VP40. D: Expression von NP, VP24 und VP40.
4 Ergebnisse 90
Die solitäre Expression von NP (Abbildung 22 A) führte nicht zu dessen Freisetzung in
den Überstand, ebenso wenig die Koexpression mit VP24 (22 B). Koexprimierte man
jedoch NP zusammen mit VP40, so war NP im Zellkulturüberstand detektierbar (22 C)
und dessen Freisetzung wurde durch die Anwesenheit von VP24 (22 D) noch einmal
signifikant verstärkt. Allerdings ließ sich durch den Proteinase K-Verdau zeigen, dass
die Freisetzung des NP nicht in einer membrangeschützten Form als VLP stattfand, da
NP auch in Abwesenheit eines Detergenz Proteinase K-sensitiv war (Spuren 1 + 2).
Untersuchungen der VLPs mithilfe des Elektronenmikroskopes ergaben, dass die
Expression von VP40 zur Bildung der erwarteten filamentösen VLPs führte, in welche
VP24 bei Koexpression eingebaut wurde. Das freigesetzte NP trat zwar in Assoziation
mit den VLPs auf, war jedoch außen und nicht, wie erwartet, innen an den VLPs zu
finden (Daten nicht gezeigt). Somit scheint die singuläre Expression von NP nicht
auszureichen, um Nukleokapsid-ähnliche Strukturen zu erzeugen, welche dann in die
von VP40 gebildeten VLPs eingebaut werden können.
4.4 Interaktion des VP24 mit viralen Proteinen
4.4.1 Lokalisation des VP24 in MARV-infizierten Vero-Zellen
Die Lokalisation von VP24 in MARV-infizierten Zellen ist bisher nicht beschrieben. Das
EBOV-VP24 liegt in infizierten Zellen perinukleär in größeren Aggregaten vor (Han et
al., 2003). Um die Verteilung des MARV-VP24 in der Virusinfektion zu untersuchen,
wurden Vero-Zellen 24 Stunden vor der Infektion auf Deckgläsern ausgesät und bei
einer Konfluenz von ca. 70 % mit einer m.o.i. von 1 mit Marburgvirus im
Sicherheitslabor infiziert. Eine Stunde nach der Infektion wurden die Zellen gewaschen
und mit DMEM(+Q, + 2 % FCS) versetzt. 24 Stunden p.i. wurden die Zellen mit 4 %
Paraformaldehyd in DMEM über Nacht fixiert, aus dem Sicherheitslabor ausgeschleust
und anschließend permeabilisiert (3.2.8.2). VP24 wurde mithilfe des
affinitätsgereinigten VP24-AK (3.3.2) in einer 1:2 Verdünnung markiert und
anschließend durch Inkubation mit einem Rhodamin-gekoppelten α Kaninchen-AK
sichtbar gemacht.
Abbildung 23 A zeigt die Verteilung von VP24 in MARV-infizierten Vero-Zellen. Hier fiel
auf, dass VP24 im Gegensatz zur transienten Einzelexpression des Proteins
(Abbildung 10) in großen Aggregaten in der perinukleären Region lokalisiert vorlag, die
in ihrer Form viralen Einschlusskörpern, den Reifungszentren der RNP-Komplexe,
ähneln. Außerdem zeigte VP24 eine granuläre Verteilung im Zytoplasma der Zelle,
jedoch keine Färbung der Plasmamembran. Zusätzlich wurde eine Kofärbung von
4 Ergebnisse 91
VP24 und dem Nukleoprotein NP, der Hauptkomponente der Einschlusskörper,
durchgeführt, um eine potentielle Kolokalisation zu ermitteln.
Abbildung 23 B zeigt deutlich, dass VP24 tatsächlich mit den Einschlusskörpern
kolokalisierte. Neben der Färbung der perinukleären Aggregate von NP und VP24 kann
man für beide Proteine außerdem eine eher körnige Struktur im Zytoplasma der Zellen
erkennen. In der Kofärbung von NP und VP24 fällt jedoch auf, das diese peripheren
Signale von VP24 und NP nicht kolokalisieren.
Ultrastrukturelle Untersuchungen der MARV-infizierten Zellen haben die Kolokalisation
mit den Einschlusskörpern bestätigt.
Abbildung 24 zeigt die elektronenmikroskopische Aufnahme eines Einschlusskörpers
im Zytoplasma MARV-infizierter Vero-Zellen. Die AK-Färbung mit dem
affinitätsgereinigten VP24-AK und 12 nm Goldpartikeln (Esel α Kaninchen-Sekundär-
Abbildung 23: Lokalisation des VP24 in Marburgvirus-infizierten Vero-Zellen. Vero-Zellen wurden mit einer m.o.i. von 1 mit MARV infiziert und 24 h p.i. fixiert undpermeabilisiert. VP24 wurde mit dem affinitätsgereinigten VP24-AK vom Kaninchenangefärbt und durch einen Rhodamin-gekoppelten α Kaninchen-AK detektiert, NP wurdedurch den monoklonalen α NP-AK 2B10 sowie einen FITC-gekoppelten α Maus-AK gefärbt.A: Färbung von VP24 in MARV-infizierten Vero-Zellen. B: Kofärbung von VP24 und NP inMARV-infizierten Vero-Zellen. C: Färbung nicht-infizierter Vero-Zellen.
α VP24 α NP Überlagerung
A
B
MARVMARV MARV
Mock Mock
MARV MARVMock
α VP24
1 2 3
C
4 Ergebnisse 92
antikörper) markiert deutlich die Lokalisation des VP24 in den elektronendichten
Strukturen der Einschlusskörper (Pfeile).
4.4.2 Interaktion von VP24 und NP in der Immunfluoreszenzanalyse
Die Kolokalisation des VP24 in den viralen Einschlusskörpern während der
Virusinfektion lässt die Frage aufkommen mit welchem viralen Protein der RNP-
Komplexe das VP24 interagiert. NP als Hauptkomponente der Einschlusskörper ist
dabei ein wahrscheinlicher Kandidat. Um eine mögliche Interaktion von VP24 mit NP
zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen auf Deckgläsern ausgesät, mit MVA-T7 infiziert
und im Anschluss mit je 1 µg pTM1-VP24 und/oder 1 µg pTM1-NP transfiziert (3.2.8.1).
12 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und entweder
mit dem affinitätsgereinigten VP24-AK, dem monoklonalen α NP-AK 2B10 oder mit
beiden Erstantikörpern inkubiert. Anschließend wurden VP24 und NP durch Inkubation
mit einem Rhodamin-gekoppelten α Kaninchen-AK bzw. einem FITC-gekoppelten α
Maus-AK sichtbar gemacht und mithilfe des Fluoreszenzmikroskopes und der Spot-
Kamera fotografiert (3.3.2).
Zunächst wurde die intrazelluläre Verteilung des VP24 und des NP durch
Einzelexpression der Proteine betrachtet. Abbildung 25 A1 zeigt die Lokalisation von
VP24, Abbildung 25 A2 das NP, das die typischen großen Aggregate im perinukleären
Abbildung 24: Lokalisation des VP24 in den Einschlusskörpern Marburgvirus-infizierter Vero-Zellen. Vero-Zellen wurden mit einer m.o.i. von 1 mit MARV infiziert und 24 h p.i. für dieElektronenmikroskopie vorbereitet. VP24 wurde mit dem affinitätsgereinigten α VP24-AKvom Kaninchen markiert und durch einen Gold-markierten Esel α Kaninchen-Sekundärantikörper (12 nm) detektiert. EM-Bild Dr. Larissa Kolesnikova, Vergrößerung60000fach.
4 Ergebnisse 93
Bereich erzeugte, welche den Einschlusskörpern in der viralen Infektion auch
strukturell stark ähneln (Kolesnikova et al., 2000).
Die Koexpression beider Proteine (B) führte zu einer Relokalisation des VP24 aus den
kleinen VP24-Aggregaten in die von NP gebildeten Einschlusskörper. Diese
Kolokalisation war vor allem in der Überlagerung beider Signale sichtbar. Diese
Ergebnisse machen deutlich, dass VP24 in der Lage ist, mit dem NP zu interagieren
und wahrscheinlich in der Virusinfektion aufgrund dieser Interaktion in die viralen
Einschlusskörper rekrutiert wird. Jedoch zeigt sich auch in der rekombinanten
Expression eine Kofärbung nur in den perinukleären Aggregaten, während keine
Kolokalisation in den peripheren NP-Signalen mit dem VP24 zu beobachten ist.
Abbildung 25: Immunfluoreszenzanalyse der Einzel- und Koexpression von VP24 undNP. Subkonfluente HeLa-Zellen wurden mit MVA-T7 infiziert und mit je 1 µg der Plasmide pTM1-VP24 und pTM1-NP einzeln oder kotransfiziert. 12 h p.i. wurden die Zellen fixiert,permeabilisiert und mit dem affinitätsgereinigten α VP24 AK bzw. dem monoklonalenα NP-AK sowie einem Rhodamin-gekoppeltem α Kaninchen-AK und einem FITC-gekoppelten α Maus-AK gefärbt. A: Einzelexpression von VP24 (A1) und NP (A2).B: Koexpression von VP24 (B1) und NP (B2), sowie Überlagerung der beiden Signale (B3).C: MVA-T7 infizierte HeLa-Zellen ohne Transfektion.
α VP24 α NP
VP24 NP
NP + VP24 NP + VP24 NP + VP24
MVA-T7 MVA-T7
A
B
C
1 2 3
Überlagerung
4 Ergebnisse 94
4.4.3 Interaktion von VP24 und VP40
VP24 und VP40 gelten als die zwei Matrixproteine der Filoviren, da sie beide im
Matrixraum der Virionen lokalisiert sind, wobei VP40 das funktionelle Homolog der
Matrixproteine der Ordnung Mononegavirales darstellt. Aufgrund ihrer Lokalisation in
den reifen Viruspartikeln sowie der hier vorliegenden Ergebnisse, dass VP40 in der
Lage ist, VP24 in die virusähnlichen Partikel zu rekrutieren, ließ sich vermuten, dass
VP40 und VP24 in der Lage sind, direkt miteinander zu interagieren.
4.4.3.1 Koimmunpräzipitation von VP24 und VP40
Mithilfe der Koimmunpräzipitation (KoIP) sollte eine mögliche Protein-Protein-
Interaktion zwischen beiden Matrixproteinen untersucht werden. Ausgehend von den
Plasmiden pTM1-VP24-Flag und pTM1-VP40 wurden die Proteine VP24-Flag und
VP40 entweder einzeln oder gemeinsam mit dem TNT T7 Quick Coupled
Transcription/Translation System in vitro translatiert und metabolisch mit [35S]-PromixTM
Redivue markiert (3.3.3). Für diese Untersuchungen konnte weder das WT-VP24 noch
das HA-markierte VP24 eingesetzt werden, da sowohl der affinitätsgereinigte VP24-AK
als auch der monoklonale HA-Antikörper eine Kreuzreaktivität mit dem VP40 aufwiesen
und somit für eine Koimmunpräzipitation nicht geeignet waren (Daten nicht gezeigt).
Für die KoIP wurden zwei verschiedene Puffersysteme benutzt, zum einen der KoIP-
Puffer, zum anderen der Tris-KCl-Puffer, welcher vor allem bei der Kopräzipitation von
VP35-Multimeren im Vergleich zum KoIP-Puffer bessere Ergebnisse erzielte, da er in
seinen Bedingungen weniger stringent ist. (Möller, 2002).
Das in vitro Translat wurde nach einer Präinkubation mit Protein-A-Sepharose mit
einem gegen das Flag-Epitop und einem gegen das VP40 gerichteten AK inkubiert und
anschließend über die Kopplung der AK an Protein-A-Sepharose präzipitiert (3.3.4).
Die Koimmunpräzipitate wurden mittels SDS-PAGE (3.3.1.1) aufgetrennt, das Gel
getrocknet und mit dem Bio-Imager und dem Computerprogramm TINA2.0 (3.3.1.3)
ausgewertet.
Abbildung 26 A zeigt zunächst die Einzelexpression der beiden Proteine sowie die
jeweilige Präzipitation in KoIP-Puffer mit dem Flag- sowie dem VP40-AK. Das Flag-
markierte VP24 wurde durch den Flag-AK erkannt und spezifisch präzipitiert (Spur 2),
während VP40 nicht erkannt wurde (Spur 3). Umgekehrt wurde das VP40 spezifisch
durch den VP40-AK erkannt (Spur 6), während VP24-Flag unerkannt blieb (Spur 5).
Damit waren die Voraussetzungen für eine Koimmunpräzipitationsanalyse gegeben.
Findet eine Interaktion der beiden Proteine statt, so müsste das VP40 nach
spezifischer Fällung des VP24-Flag mit dem Flag-AK kosedimentieren und umgekehrt.
4 Ergebnisse 95
Abbildung 26 B zeigt die Kopräzipitation von VP24-Flag und VP40 in KoIP-Puffer
(Spuren 2 + 3) sowie in Tris-KCl-Puffer (Spuren 4 + 5). Als Hintergrundkontrolle diente
die Expression und Präzipitation des Leervektors pTM1 mit den entsprechenden AK in
KoIP-Puffer.
Die Spuren 2 und 4 in Abbildung 26 B zeigen, dass VP40 unter keiner der gewählten
Pufferbedingungen gemeinsam mit dem VP24-Flag kosedimentiert werden konnte.
Ebenso verhielt es sich bei der Präzipitation mit dem monoklonalen VP40-AK, die
ausschließlich zur Fällung des VP40, nicht aber des VP24-Flag führte (Spuren 3 und
5). Somit konnte eine potentielle Interaktion zwischen VP24 und VP40 nicht durch die
Koimmunpräzipitation aus radioaktiv-markiertem Retikulozytenlysat gezeigt werden.
4.4.3.2 Kolokalisation von VP24 und VP40 in der Immunfluoreszenzanalyse
Da eine Interaktion des VP24 mit VP40 durch Koimmunpräzipitation nicht
nachgewiesen werden konnte, wurde im Folgenden die Kolokalisation beider Proteine
mittels Immunfluoreszenzanalyse untersucht.
Zunächst wurde die intrazelluläre Verteilung des VP24 und des VP40 durch
Einzelexpression der Proteine betrachtet. VP40 zeigte dabei die Ausbildung von
größeren Clustern (Abbildung 27 B2) in der Zellperipherie, von denen bereits gezeigt
werden konnte, dass sie mit multivesikulären Strukturen des späten Endosoms, sog.
„multivesicular bodies“ (MVB), kolokalisieren. Außerdem zeigte VP40 eine Lokalisation
an der Plasmamenbran (Kolesnikova et al., 2002). VP24 wies die bereits
beschriebenen punktförmigen Aggregate im zellkernnahen Bereich auf (4.1.4).
Abbildung 26: Koimmunpräzipitationsanalyse des VP24-Flag mit dem VP40. VP24-Flag und VP40 wurden sowohl getrennt als auch zusammen in vitro translatiert undradioaktiv markiert. Anschließend wurde unter Verwendung des α Flag-AK und des α VP40-AK eine Immunpräzipitationsanalyse (A) und eine Koimmunpräzipitationsanalyse (B)durchgeführt. Die Präzipitate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mithilfe des Bio-Imagers ausgewertet.
A B
VP24-FlagαFlagivTl α40
VP40αFlagivTl α40
VP40
VP24-Flag30 kD
1 2 3 4 5 6
VP24-FlagαFlagivTl α40
VP40αFlagivTl α40
VP40
VP24-Flag30 kD
1 2 3 4 5 6
30 kD
VP24-FlagVP40
αFlagivTl α40pTM1αFlagivTl α40αFlag α40
VP40
VP24-Flag
1 2 3 4 5 6 7 8
30 kD
VP24-FlagVP40
αFlagivTl α40pTM1αFlagivTl α40αFlag α40
VP40
VP24-Flag
1 2 3 4 5 6 7 8
4 Ergebnisse 96
Bei der Koexpression von VP24 und VP40 (Abbildung 27 A) zeigte sich nur eine
schwache Kolokalisation beider Proteine. Diese konnte vor allem an der
Plasmamembran sowie in Zellausläufern beobachtet werden (Ausschnittsver-
größerungen I + II). VP24 kolokalisierte nicht mit VP40, das in den großen Clustern der
MVB lokalisiert vorlag (Ausschnitt III), während VP40 ebenfalls nicht mit den
punktförmigen VP24-Aggregaten im zellkernnahen Bereich kolokalisierte. Die
Kolokalisation von VP24 und VP40 scheint weit weniger stark ausgeprägt, als die
Interaktion des VP24 mit dem Nukleoprotein NP. Dies könnte darauf hindeuten, dass
das VP24 in der Morphogenese eher am Reifungsprozess der Nukleokapside beteiligt
ist als an der Bildung der Virushülle.
Abbildung 27: Immunfluoreszenzanalyse der Kolokalisation von VP24 und VP40. Subkonfluente Vero-Zellen wurden und mit 0,5 µg pCAGGS-VP24 und 1 µg pCAGGS-VP40einzeln oder kotransfiziert. 24 h p.t. wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit demaffinitätsgereinigten α VP24 AK bzw. dem monoklonalen α VP40-AK sowie einemRhodamin-gekoppelten α Kaninchen-AK und einem FITC-gekoppelten α Maus-AK gefärbt.A: Koexpression von VP24 und VP40, Ausschnittsvergrößerungen sind links (I), rechts (III)und unterhalb (II) einzeln gefärbt sowie in der Überlagerung gezeigt. B: Einzelexpressionvon VP24 und VP40, sowie Kofärbung der Mock-Zellen mit beiden Antikörpern in derÜberlagerung.
MockVP40VP24
A
B
I
II
III
4 Ergebnisse 97
4.5 Abschalten der MARV VP24-Expression durch RNAi
Die Rolle des VP24 im viralen Vermehrungszyklus ist bisher unbekannt. Zur
Untersuchung der Funktion in der Morphogenese von reifen Viruspartikeln sollte VP24
durch den Einsatz kurzer (21 bp), doppelsträngiger RNA-Fragmente, sog. siRNAs, in
der MARV-Infektion abgeschaltet werden. Dieser Mechanismus ist als RNA Interferenz
beschrieben (1.8). Er beruht auf der homologen Paarung der siRNA mit der Ziel-
mRNA-Sequenz und ist dabei absolut sequenzspezifisch. Es ist beschrieben, dass
bereits die Mutation einer Base in der siRNA-Sequenz ein posttranskriptionelles
Abschalten des gewünschten Proteins verhindern kann (Zeng et al., 2002; Doench et
al., 2003).
4.5.1 Auswahl geeigneter siRNA-Sequenzen aus der Ziel-mRNA-Sequenz
Die virale mRNA des VP24 stellte die Zielsequenz dar, aus welcher passende siRNA-
Sequenzen ausgesucht werden sollten. Das Design dieser dsRNA-Fragmente wurde
unter Berücksichtigung der Hinweise von Tuschl und Kollegen zur Generierung funktio-
neller siRNA-Sequenzen erstellt (http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html)
Folgende Vorgaben wurden berücksichtigt:
- die Sequenz sollte 50 bis 100 Nukleotide jenseits des Startkodons liegen, um
Interferenzen mit UTR-bindenden Proteinen oder den Translations-Initiations-
Komplexen und dem RISC-Komplex zu vermeiden
- die optimale Sequenz ist 23 Nukleotide lang und folgt dem Motiv AA(N19)TT, wobei
N jedes beliebige Nukleotid darstellt
- ebenfalls funktionell sind Sequenzen mit dem Motiv NA(N21), wobei die 3’-Enden
dieser siRNA-Sequenzen zu TT konvertriert werden sollten, um symmetrische 3’-
Überhänge zu erzeugen.
- der G/C-Gehalt der entsprechenden Sequenz sollte optimalerweise bei ca. 50 %,
aber auf jeden Fall zwischen 30 und 70 % liegen.
In der mRNA-Sequenz des VP24 befinden sich insgesamt 7 Sequenzabschnitte, die
dem Motiv AA(N17)TT entsprechen, jedoch nur eine dieser Sequenzen (EMBL
Nucleotide Sequence Database, accession number Z12132; Nukleotide 10465 -
10487) zeigt einen optimalen G/C-Gehalt von ca. 50 %. Diese Sequenz wurde zur
Synthese von siRNA VP24 Nr. 1 ausgewählt. Zur Synthese einer zweiten VP24-
spezifischen siRNA wurde auf das Sequenzmotiv NA(N21) ausgewichen und nach
Berücksichtigung der Tuschl-Regeln wurde die Sequenz der Nukleotide 10819 bis
10841 (EMBL Nucleotide Sequence Database, accession number Z12132) zur
Synthese der siRNA VP24 Nr. 2 ausgewählt (Abbildung 28). Bei der chemischen
Synthese der siRNA-Duplexe wurden für die 3’-Überhänge Thymidine (dT) statt Uridine
4 Ergebnisse 98
(U) verwendet, da Desoxynukleotide in den 3’-Überhängen die gleiche Effizienz zeigen
wie Ribonukleotide, jedoch preiswerter in der Synthese und wahrscheinlich
nukleaseresistenter sind. Als Kontroll-siRNA, die nicht in der Lage sein sollte die
mRNA-Sequenz des VP24 abzuschalten, wurde eine käufliche siRNA der Firma
Qiagen gewählt, die keinerlei Sequenzhomologien zu bisher beschriebenen
eukaryotischen Genen besitzt und daher keine bisher bekannte mRNA-Sequenz
erkennt.
4.5.2 Abschalten der transienten VP24-Expression durch siRNAs
Zunächst wurden die VP24-spezifischen siRNAs dahingehend überprüft, ob sie in der
Lage sind, spezifisch die transiente Expression von VP24 herunterzufahren. Dazu
wurden Vero-Zellen in 24 well-Platten ausgesät und bei einer Konfluenz von ca. 70 %
mit 250 ng pCAGGS-VP24 singulär oder in Kombination mit ansteigenden
Konzentrationen (100 bis 1000 ng) der spezifischen und unspezifischen Kontroll-siRNA
transfiziert (3.2.5). Als Transfektionsreagenz diente LipofectamineTM 2000. 24 Stunden
p.t. wurde ein Mediumwechsel durchgeführt und die Zellernte fand 48 Stunden p.t. wie
unter 3.2.7 beschrieben statt. Der Gesamtproteingehalt der Zelllysate wurde
vergleichend durch Auftrennung mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung (3.3.1.2)
dargestellt und nach Digitalisierung des Gelbildes mithilfe des Programms TINA2.0
Abbildung 28: Sequenzen der VP24-spezifischen siRNAs sowie der Kontroll-siRNA X.Die VP24-spezifischen Sequenzen wurden in Anlehnung an die Tuschl-Regeln entworfen(4.5.1). Die Kontroll-siRNA X der Firma Qiagen zeigt keine Sequenzspezifität für einbekanntes eukaryotisches Gen.
siRNA VP24 Nr. 1Zielsequenz (10465 - 10487): 5' AACCGTTTTTGGCCCTGAGGATT 3'
Sense siRNA: 5' CCGUUUUUGGCCCUGAGGAdTdT 3'
Antisense siRNA: 5' UCCUCAGGGCCAAAAACGGdTdT 3'
siRNA VP24 Nr. 2Zielsequenz (10819 – 10841): 5' AACCTTGCTGTGGTGAGACAGTC 3'
Sense siRNA: 5' CCUUGCUGUGGUGAGACAGdTdT 3'
Antisense siRNA: 5' CUGUCUCACCACAGCAAGGdTdT 3'
Kontroll-siRNA X:Zielsequenz: 5' AATTCTCCGAACGTGTCACGT 3'
Sense siRNA: 5' UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT 3'
Antisense siRNA: 5' ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT 3'
4 Ergebnisse 99
ausgewertet und angeglichen. Anschließend wurden entsprechende Mengen der
Zelllysate mittels SDS-PAGE aufgetrennt und die Proteinexpression von VP24 im
Western Blot gezeigt.
Abbildung 29 zeigt die Proteinexpression des VP24 unter Einfluss verschiedener
Mengen an spezifischer und unspezifischer siRNA.
Bereits der Einsatz von 100 ng beider VP24-spezifischen siRNAs zeigte einen
deutlichen, wenn auch nicht vollständigen Rückgang der VP24-Expression (Abbildung
AMock VP24
100 ng siRNAVP24
1VP24
2 X
1 2 3 4 5
VP24
Tubulin
BMock VP24
250 ng siRNAVP24
1VP24
2 X
1 2 3 4 5
VP24
Tubulin
CMock VP24
500 ng siRNAVP24
1VP24
2 X
1 2 3 4 5
VP24
Tubulin
DMock VP24
750 ng siRNAVP24
1VP24
2 X
1 2 3 4 5
VP24
Tubulin
Mock VP24
1000 ng siRNAVP24
1VP24
2 X
1 2 3 4 5
E
VP24
Tubulin
Abbildung 29: Abschalten der transienten VP24-Expression durch siRNA-Transfektion.250 ng pCAGGS-VP24 wurden entweder allein oder gemeinsam mit verschiedenen Mengen(100 bis 1000 ng) an VP24-spezifischen bzw. Kontroll-siRNA in Vero-Zellen transfiziert. Die Zellernte fand 48 h p.t. statt und die Proteine VP24 und α-Tubulin wurden mittels SDS-PAGE und anschließendem Western Blot dargestellt. VP24 wurde mit dem affinitätsgereinigten VP24-AK sowie einem POD-gekoppelten α Kaninchen-AK, α-Tubulin mit einem mono-klonalen α α-Tubulin-AK sowie einem POD-gekoppelten α Maus-AK gefärbt. A-E zeigen die VP24-Expression (Spur 2) sowie den Einfluss ansteigender siRNA-Konzentrationen an VP24-spezifischen (Spuren 3 + 4) und unspezifischer siRNA (Spur 5).
4 Ergebnisse 100
29 A, Spuren 3 + 4). Die unspezifische Kontroll-siRNA (Spur 5) wies im Vergleich zur
unbehandelten Einzelexpression von VP24 (Spur 2) keinen Effekt auf. Außerdem
wurde zur Kontrolle das konstitutiv exprimierte, zytoplasmatische Protein α-Tubulin
angefärbt, um festzustellen, ob die Transfektion und siRNA-Behandlung einen Einfluss
auf die zelluläre Proteinexpression hatte. Wie die Proteinbanden des Tubulins zeigten,
hatte der Einsatz von 100 ng siRNA keinen Einfluss auf dessen Expression. Diese
Ergebnisse sprechen für eine spezifische Abschaltung der VP24-Expression durch
RNA Interferenz mit den VP24-spezifischen siRNAs. Der Einsatz von 250 ng siRNA
(29 B) hatte bereits einen nahezu vollständigen Rückgang der VP24-Expression zu
Folge (Spuren 3 + 4), der beim Einsatz von 500 ng kaum mehr verstärkt werden
konnte (29 C). Auch hier zeigten die Kontrollen der unspezifischen siRNA (Spur 5)
sowie der Tubulin-Expression, dass es sich um einen spezifischen Effekt handelte. Der
Einsatz von höheren Mengen siRNAs hatte ebenfalls die spezifische Abschaltung des
VP24 (29 C-E) zur Folge. Es konnte jedoch mit diesem Versuch gezeigt werden, dass
bereits eine Menge zwischen 250 und 500 ng siRNA ausreichend ist, um die VP24-
Expression effizient abzuschalten.
Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung einer weiteren Zelllinie (HeLa CCL2-
Zellen) unter gleichen Versuchsbedingungen beobachtet (Daten nicht gezeigt)
Außerdem wurden VP24-spezifische siRNA-Sequenzen in den pSUPER-Vektor
kloniert. Dieser Vektor enthält einen Polymerase II H1-RNA Promotor, der die
Synthese kleiner RNA-Transkripte ohne Poly-A Schwanz mit klar definierten Enden
ermöglicht, die wie bei siRNAs aus zwei Uridinen bestehen. Die VP24-spezifischen
Sequenzen wurden so in den pSUPER-Vektor kloniert, dass es nach der Transfektion
in eukaryotische Zellen zur Ausbildung von „hairpin“ siRNAs kommt, welche ebenfalls
RNA Interferenz vermitteln können (Brummelkamp et al., 2002). Die VP24-spezifischen
pSUPER-Konstrukte wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit hin getestet, VP24 in der
transienten Expression abzuschalten (Daten nicht gezeigt). Es zeigte sich jedoch, dass
die Transfektionseffizienz der Vektoren in Vero-Zellen wesentlich geringer war, als die
der siRNAs und daher kein so deutlicher RNAi-Effekt gezeigt werden konnte, wie mit
chemisch synthetisierten siRNAs. Daher wurden ausschließlich die chemisch
synthetisierten siRNAs für die Abschaltung des VP24 in der Virusinfektion benutzt.
4.5.3 Abschalten der VP24-Expression in der Virusinfektion durch RNAi
Nachdem gezeigt werden konnte, dass die entworfenen siRNA-Sequenzen in der Lage
waren VP24 spezifisch abzuschalten, sollte der Versuchsansatz auf MARV-infizierte
Vero-Zellen übertragen werden.
4 Ergebnisse 101
Der Ansatz wurde in 6 well-Platten durchgeführt. Die Menge an siRNA wurde an diese
Versuchsbedingungen angepasst. Vorversuche ergaben, dass eine einmalige
Transfektion von 2570 ng siRNA (entsprach 500 ng auf einer 24 well-Platte) im
direkten Anschluss an die Virusinfektion sowie eine Zellernte 24 Stunden p.i. kaum
einen Effekt auf die VP24-Expression zeigte. Daher wurde das Transfektions- und
Infektionsschema in Anlehnung an die siRNA-Behandlung von RSV-infizierten Zellen
(Bitko and Barik, 2001) durchgeführt.
Vero-Zellen wurden einen Tag vor der ersten siRNA-Transfektion in 6 well-Platten
ausgesät und bei einer Konfluenz von ca. 70 % mit 1543 ng der entsprechenden
siRNA transfiziert (3.2.6). 8 Stunden nach dieser ersten Transfektion wurden die Zellen
im Sicherheitslabor mit MARV infiziert (m.o.i. = 1), im direkten Anschluss fand eine
zweite siRNA-Transfektion statt. Die Bedingungen und siRNA-Mengen entsprachen
denen der ersten Transfektion. 24 Stunden p.i. wurden die Zellen wie unter 3.2.7
beschrieben geerntet und anschließend aus dem Sicherheitslabor ausgeschleust.
Der Gesamtproteingehalt der Zelllysate wurde vergleichend durch Auftrennung mittels
SDS-PAGE und Coomassie-Färbung (3.3.1.2) dargestellt und nach Digitalisierung des
Gelbildes mithilfe des Programms TINA2.0 ausgewertet und angeglichen.
Anschließend wurden entsprechende Mengen der Zelllysate in der SDS-PAGE
aufgetrennt und die virale Proteinexpression mittels Western Blot analysiert.
In Abbildung 30 A ist zu sehen, dass die Anwendung der VP24 siRNAs (Spuren 3 und
4) zu einem spezifischen Rückgang der VP24-Expression in der Virusinfektion führte,
während dies bei Anwendung der Kontroll-siRNA X (Spur 5) nicht der Fall war. Zur
Kontrolle wurden die zellulären Proteine α-Tubulin und Lamin A/C im Western Blot
dargestellt, deren Expression durch die Anwesenheit der siRNAs nicht beeinträchtigt
wurde.
Nachdem die RNAi-Behandlung eine spezifische Abnahme der VP24 Expression
ermöglichte, stellte sich die Frage, ob die Abwesenheit von VP24 einen Einfluss auf die
Expression der anderen viralen Proteine hatte. In einem artifiziellen Minigenomsystem
konnte bereits gezeigt werden, dass für die Vorgänge der Transkription und Replikation
die Anwesenheit der Nukleokapsidproteine NP, VP35 und L notwendig und
ausreichend ist (Mühlberger et al., 1998) und dass VP24 an diesem Prozess nicht
beteiligt zu sein scheint. Daher wurde durch Western Blot Analysen die Expression der
anderen viralen Proteine NP, VP35, VP40, GP und VP30 untersucht (Abbildung 30 B).
Die RNA-abhängige RNA-Polymerase L konnte aufgrund von fehlenden Antikörpern
zur Detektion dieses Proteins im Western Blot nicht dargestellt werden.
4 Ergebnisse 102
Sowohl bei Einsatz der siRNA VP24 Nr. 1 als auch bei siRNA Nr. 2 (Spuren 3 + 4)
konnte kein Effekt auf die Proteinexpression der genannten viralen Proteine im
Vergleich zur unbehandelten MARV-Infektion (Spur 2) und der Transfektion mit der
unspezifischen Kontroll-siRNA (Spur 5) festgestellt werden. Dieses Ergebnis zeigte
zum einen, dass VP24 tatsächlich nicht an dem Prozess der Transkription und
Replikation während des viralen Vermehrungszyklus beteiligt zu sein scheint. Zum
anderen machten diese Ergebnisse auch deutlich, dass die virale genomische und
antigenomische RNA nicht für den siRNA-vermittelten Abbau von RNA empfänglich ist,
da der Abbau der genomischen RNA nicht nur eine Verminderung der VP24-
Expression, sondern auch eine Verminderung der Expression aller anderen viralen
Proteine zur Folge hätte. Es wird vermutet, dass die Enkapsidierung der viralen
Genome im direkten Anschluss an deren Synthese dafür verantwortlich ist, dass diese
RNA-Moleküle nicht für den siRNA-vermittelten Abbau empfänglich sind.
Abbildung 30: Abschalten der VP24-Expression in der MARV-Infektion durch RNAi. Subkonfluente Vero-Zellen wurden zunächst mit 1543 ng der VP24-spezifischen bzw.Kontroll-siRNAs transfiziert und 8 h p.t. mit MARV infiziert. Im direkten Anschluss fand einezweite siRNA-Transfektion statt. Die Ernte der Zellen erfolgte 24 h p.i. und die Zelllysatewurden mittels SDS-PAGE und Western Blot auf die virale Proteinexpression hin untersucht.A: Färbung des WB gegen VP24, Lamin A/C und α-Tubulin. B: Färbung der Zelllysategegen die viralen Proteine NP, VP35, VP40, GP und VP30.
XVP24 2
VP24 1
∅
siRNAMARV
Mock
1 2 3 4 5
ZelllysatB
NP
VP35
VP40
GP1
VP30
XVP24 2
VP24 1
∅
siRNAMARV
Mock
1 2 3 4 5
ZelllysatA
Lamin A/C
VP24
Tubulin
4 Ergebnisse 103
4.5.4 Freisetzung reifer Viruspartikel von siRNA-behandelten Zellen
Da VP24 als Strukturprotein mit den reifen Viruspartikeln freigesetzt wird, stellte sich
die Frage, ob seine Abwesenheit einen Einfluss auf die Freisetzung reifer Viruspartikel
hat. Um diese Fragestellung zu untersuchen, wurden die Zellkulturüberstände der
siRNA-transfizierten, MARV-infizierten Vero-Zellen auf die Anwesenheit von reifen
Partikeln hin untersucht. Dies geschah zum einen mittels Western Blot Analyse durch
Nachweis des Nukleoproteins NP, zum anderen mittels Real-time RT-PCR Analyse
zum Nachweis freigesetzter viraler Genome.
Zunächst wurde ein Aliquot des Zellkulturüberstandes mit 4x Proteinprobenpuffer
versetzt und mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen
(3.3.1.4). Um die Menge an freigesetzten Viruspartikeln sichtbar zu machen, wurde die
Membran gegen das Nukleoprotein NP gefärbt, neben VP40 eine der
Hauptkomponenten der viralen Partikel, das jedoch nicht in der Lage ist, seine eigene
Freisetzung selbstständig zu vermitteln (Abbildung 22).
Der Western Blot ist in Abbildung 31 A dargestellt. Vergleicht man die Menge an
freigesetztem NP im Überstand, so fällt auf, dass die Behandlung der MARV-infizierten
Zellen mit der unspezifischen Kontroll-siRNA (Spur 5) nicht zu einer Verminderung der
Virusfreisetzung im Vergleich zur unbehandelten MARV-Infektion (Spur 2) führt. Im
Gegensatz dazu beobachtet man jedoch einen deutlichen Rückgang an freigesetzten
Viruspartikeln nach der Behandlung mit beiden VP24-spezifischen siRNAs (Spuren 3 +
4).
Die Freisetzung reifer Viruspartikel kann ferner durch den Nachweis der viralen
genomischen RNA im Überstand überprüft werden. Zu diesem Zweck wurde mithilfe
des Viral RNA Mini Kit der Firma Qiagen die virale RNA aus dem Zellkulturüberstand
gereinigt (3.1.5.1). Durch Verwendung von NP-spezifischen Primern wurde die Anzahl
der vorhandenen Genomkopien im Überstand der unbehandelten und siRNA-
behandelten Zellen durch Real-time RT-PCR bestimmt und miteinander verglichen
(3.1.6). Abbildung 31 B zeigt das Ergebnis der quantitativen PCR.
Vergleicht man die Menge an viralen Genomen im Überstand der unbehandelten
Zellen (rote Linie) mit jenem der Zellen die zusätzlich mit der unspezifischen Kontroll-
siRNA X transfiziert wurden (schwarze Linie), so zeigte sich, das hier kein signifikanter
Unterschied in der Freisetzung viraler Genome vorlag. Im Gegensatz dazu zeigte
sowohl die Behandlung mit siRNA VP24 Nr.1 als auch mit siRNA VP24 Nr. 2 eine
deutliche Verminderung der Menge an viralen Genomen im Überstand.
4 Ergebnisse 104
Die Ergebnisse der Western Blot Analyse als auch der Real-time RT-PCR zeigen
deutlich, dass die Abwesenheit von VP24 in der Virusinfektion durch Transfektion von
VP24-spezifischen siRNAs zu einer verminderten Freisetzung viraler Partikel führt.
Diese Beobachtungen unterstreichen die Vermutung, dass das VP24 eine zentrale
Rolle bei der Morphogenese und Ausschleusung von Nachkommenviren spielt.
Abbildung 31: Freisetzung reifer MARV-Partikel nach siRNA-Behandlung. Die Zellkulturüberstände der unter 4.5.3 transfizierten und infizierten Vero-Zellen wurdenzum einen für die Western Blot Analyse mit Probenpuffer versetzt (A), zum anderen wurdefür die Real-time RT-PCR die virale RNA extrahiert (B). A: Western Blot derZellkulturüberstände gefärbt mit dem monoklonalen α NP-AK 2B10. B: Real-time RT-PCR-Analyse der viralen RNA im Zellkulturüberstand mit NP-spezifischen Primern.
XVP24 2
VP24 1
∅
siRNAMARV
Mock
Überstand
1 2 3 4 5
NP
A
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49
MockMock MARV
siVP24 1 siVP24 2 siX
Fluo
resz
enz
(530
nm
)
ZyklusM
ock
Moc
k
MAR
VM
ARV
siVP
24 1
siVP
24 1
siVP
24 2
siVP
24 2
siX
siX
B
1 2 3 4 5
5 Diskussion 105
5 Diskussion
Die Morphogenese umhüllter Viren ist bisher noch nicht sehr gut verstanden. Umhüllte
Viren müssen zur Bildung infektiöser Virionen das im Zytoplasma reifende
Nukleokapsid mit einer Hüllmembran umschließen, welche mit den viralen
Oberflächenproteinen assoziiert ist. Da diese subviralen Komponenten innerhalb der
Zelle getrennt voneinander synthetisiert und assembliert werden, muss der Transport
von Nukleokapsiden und Oberflächenproteinen zur Ausschleusungsstelle zeitlich und
räumlich präzise organisiert sein. Die viralen Matrixproteine gelten hierbei als
Mediatoren dieser Prozesse. Die Filoviren besitzen im Gegensatz zu anderen
Vertretern der Ordnung Mononegavirales zwei Proteine im Matrixraum der Virionen,
wobei VP40 das Analogon der Matrixproteine repräsentiert, während die Funktion des
VP24 unbekannt ist. VP24 gilt als zweites Matrixprotein.
Ziel dieser Arbeit war es, VP24 bezüglich seiner Interaktion mit zellulären Membranen,
der Fähigkeit VLPs zu bilden und seiner Interaktion mit anderen viralen Proteinen zu
untersuchen. Außerdem sollte die Rolle von VP24 in der viralen Morphogenese
während der Virusinfektion durch Einsatz von siRNAs näher betrachtet werden.
Interaktion mit zellulären Membranen
Die Analysen zeigten, dass VP24 in der Lage ist mit zellulären Membranen zu
interagieren, dass jedoch der Hauptanteil des Proteins nicht membranassoziiert
vorliegt. Hier unterscheidet sich das VP24 deutlich von VP40, welches bereits kurz
nach seiner Synthese eine hohe Tendenz zur Interaktion mit Membranen aufweist
(Kolesnikova et al., 2002). Eine nähere Charakterisierung der Membraninteraktion
ergab, dass VP24 zum Teil als lösliches, in Membranvesikeln eingeschlossenes
Protein vorzuliegen scheint, da die Behandlung mit Karbonatpuffer die
Membranassoziation verringerte (Fujiki et al., 1982). Die Behandlung mit hohen
Salzkonzentrationen oder dem Chelatbildner EDTA führte jedoch nicht zu einer
Ablösung des Proteins von den Membranen, was für hydrophobe und nicht
elektrostatische Wechselwirkungen mit den Membranlipiden spricht. Die Koexpression
von VP24 mit VP40 oder GP hatte keinen Einfluss auf die Rekrutierung des VP24 an
die zellulären Membranen. In der Immunfluoreszenzanalyse des singulär exprimierten
WT-VP24 lässt sich nur eine schwache Interaktion mit der Plasmamembran erkennen.
Im Gegensatz dazu ergab die Triton X-114 Phasenpartitionierung von zellulär
exprimiertem VP24 eine 50:50 Verteilung in der wässrigen Phase (enthält lösliche und
peripher membranassoziierte Proteine) und der Detergentienphase (enthält integrale
Membranproteine), was auf eine Tendenz zur Membranintegration hindeutet. Dieses
5 Diskussion 106
Verhalten des VP24 wurde nicht nur in der transienten Expression des Proteins
beobachtet, sondern auch in den reifen Viruspartikeln. Betrachtet man die AS-Sequenz
des VP24, so finden sich weder Signalsequenzen für eine Translokation ins ER, noch
ausreichend lange hydrophobe Regionen, die als Transmembrandomäne fungieren
könnten (von Heijne, 1985; Tusnady et al., 1998). Auch sind keine bekannten
Signalsequenzen für die Anheftung eines GPI-Ankers oder Konsensussequenzen für
eine Acylierung vorhanden (Chatterjee and Mayor, 2001; Resh, 1999). Daher scheint
es unwahrscheinlich, dass Lipid-Modifikationen die Erklärung für das Verhalten in der
Phasenpartitionierung sind. Hydrophobizitätsanalysen der AS-Sequenz von VP24
(Kyte-Doolittle, Hopp-Woods) zeigten jedoch, dass VP24 ein stark hydrophobes Profil
besitzt. Eine mögliche Erklärung für das Verhalten des VP24 in der Triton X-114
Partitionsanalyse wäre, dass VP24 durch Multimerisierung in der Lage ist, Strukturen
auszubilden, welche dann in die Membranen eintauchen und diese starke Assoziation
vermitteln könnten. Für das VP24 des Ebolavirus wurde ein ähnliches Verhalten in der
Phasenpartitionierung beschrieben, und mithilfe von Gelfiltrationsanalysen konnte
gezeigt werden, dass EBOV-VP24 in der Lage zu sein scheint, Tetramere auszubilden
(Han et al., 2003). Ein ähnliches Verhalten in der Gelfiltration konnte auch in dieser
Arbeit für das MARV-VP24 beobachtet werden, jedoch waren Crosslinking-Analysen
bezüglich der Multimerisierung des VP24 bisher nicht erfolgreich (Daten nicht gezeigt).
Neben dem VP24 des EBOV zeigt auch das M1-Protein von Influenza A das Verhalten
eines partiell membranassoziierten und –integrierten Proteins (Zhang and Lamb,
1996). Das Verhalten von M1 in der Phasenpartitionierung konnte bisher nicht erklärt
werden, da es, ebenso wie das VP24, keine membrandurchspannende Domäne
enthält. Allerdings besitzt die AS-Sequenz des M1 einige hydrophobe Bereiche und es
liegt in der Flotationsanalyse stark membranassoziiert vor (ca. zu 70 %). Man nimmt
an, dass es zu einem Zusammenschluss der hydrophoben Domänen mehrerer M1-
Moleküle kommt, die dann eine besonders enge Interaktion mit Membranen vermitteln
(Zhang and Lamb, 1996).
Bildung von virusähnlichen Partikeln
Die Matrixproteine vieler NNS-RNA-Viren sind bei transienter Einzelexpression in der
Lage, ihre eigene Freisetzung von den Zellen in Form von virusähnlichen Partikeln zu
vermitteln. Diese Eigenschaft ist auch für das VP40 der Filoviren gezeigt (Noda et al.,
2002; Swenson et al., 2004; Kolesnikova et al., 2004b). Bei diesem Prozess der
Abschnürung und Freisetzung viraler Partikel bzw. VLPs scheinen sogenannte Late-
Domain-Motive, kurze Peptidmotive, die die zelluläre Knospungsmaschinerie an den
Ort der Virusfreisetzung dirigieren, eine entscheidende Rolle zu spielen. Es stellte sich
5 Diskussion 107
die Frage, ob auch VP24, als zweites Matrixprotein der Filoviren, in der Lage ist, VLPs
zu bilden. Für das VP24 von EBOV konnte gezeigt werden, dass es in einer
membranumhüllten Form von transfizierten Zellen freigesetzt wird, jedoch in wesentlich
geringeren Mengen als das VP40 (Han et al., 2003). MARV-VP24 konnte jedoch bei
transienter Einzelexpression im Gegensatz zu EBOV-VP24 nicht in Form von VLPs im
Zellkulturüberstand nachgewiesen werden. Für EBOV-VP24 wurde postuliert, dass das
AS-Motiv YXXL, welches als Late-Domain-Motiv des Virus der infektiösen Anämie der
Pferde identifiziert wurde (Puffer et al., 1997; Li et al., 2002), die Freisetzung von VP24
vermitteln könnte. MARV-VP24 besitzt jedoch kein klassisches Late-Domain-Motiv,
was das unterschiedliche Verhalten in der Freisetzung erklären könnte. Die
Koexpression mit MARV-VP40 führt jedoch zur Freisetzung von VP24 in den von VP40
gebildeten VLPs, was darauf hindeutet, dass VP24 durch das VP40 in die viralen
Partikel rekrutiert wird. Dahingegen ist das Oberflächenprotein GP nicht in der Lage,
VP24 in die sphärischen, von GP gebildeten VLPs einzubauen, obwohl für MARV-
VP24 eine Tendenz zur Interaktion mit dem zytoplasmatischen Anteil des GP gezeigt
werden konnte (Bamberg, 2000).
Für die transiente Koexpression von VP40 und GP ist bekannt, dass beide Proteine
sich gegenseitig in ihrer Freisetzung verstärken und dass GP sehr effizient in die von
VP40 gebildeten VLPs eingebaut wird (Swenson et al., 2004; Kolesnikova et al.,
2004b). Daher wurde untersucht, ob auch VP24 in der Lage ist die Bildung der VP40-
VLPs zu beeinflussen. Die Koexpression von VP24 und VP40 führte zwar zum Einbau
des VP24 in die VLPs, jedoch blieb die Menge an freigesetztem VP40 im Vergleich zu
seiner Einzelexpression unverändert. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für die
Koexpression von EBOV-VP24 und EBOV-VP40 beschrieben (Licata et al., 2004). Die
Freisetzung von GP wurde ebenfalls kaum von der Anwesenheit des VP24 beeinflusst.
Wurden alle drei Proteine gemeinsam exprimiert, so konnte man eine erhöhte
Freisetzung von VP24, im Vergleich zur Koexpression mit VP40, beobachten. Hier
kann man jedoch davon ausgehen, dass die erhöhte Menge darauf zurückzuführen ist,
dass die Anwesenheit von GP die Freisetzung von VP40 verstärkt und die vermehrte
Freisetzung von VP40 somit auch vermehrt VP24 in den Überstand transportiert.
Allerdings war ein Effekt von VP24 auf den Einbau des GP in die VLPs zu beobachten.
Die Menge an eingebautem GP war im Vergleich zur Koexpression ohne VP24 leicht
verringert. Wie dieser Effekt zustande kommt ist bisher unklar, jedoch war diese
Beobachtung mehrfach reproduzierbar. Dr. Larissa Kolesnikova konnte zeigen, dass
der zytoplasmatische Anteil des GP kaum eine Rolle bei der Rekrutierung durch VP40
in die VLPs spielt. Dafür scheinen andere Bereiche im GP, wie die Transmembran-
oder die Ektodomäne verantwortlich zu sein (persönliche Mitteilung). Für das VP24
5 Diskussion 108
konnte hingegen eine sequenzspezifische Interaktion mit dem zytoplasmatischen Anteil
des GP gezeigt werden (Bamberg, 2000). In Abbildung 33 ist eine schematische
Vorstellung für die Bildung der filoviralen Hüllmembran gezeigt. Es ist bekannt, dass
Matrixproteine dazu neigen, in direkter Assoziation mit Membranen gitternetzartige
Strukturen auszubilden. GP wird durch Koexpression mit VP40 in einer bestimmten
Quantität in dieses Gitternetz eingebaut. Wird jedoch das zweite Matrixprotein VP24
koexprimiert, wäre eine Veränderung der von VP40 ausgebildeten Netzwerkstruktur
durch das VP24 denkbar. In die so gebildete virale Matrix würde GP anders eingebaut
als in jene, welche ausschließlich von VP40 gebildet wird. Außerdem wäre durch eine
direkte Interaktion mit dem zytoplasmatischen Anteil des GPs ein veränderter Einbau in
die VLPs zu erklären. Im Moment ist jedoch unklar, welche Bedeutung die verringerte
Einbaurate des GP in Gegenwart von VP24 hat.
Durch Koexpression sollte versucht werden, NP in die von VP40 gebildeten VLPs
einzubauen. Für das NP vom Marburgvirus ist gezeigt, dass die singuläre Expression
zur Ausbildung von nukleokapsidähnlichen Strukturen führt (Mavrakis et al., 2002), die
den Einschlusskörpern in der Virusinfektion ultrastrukturell stark ähneln (Kolesnikova et
al., 2000). Allerdings zeigen diese Strukturen keine so starke Kondensierung wie die
reifen RNP-Komplexe, was auf den Einfluss anderer viraler Proteine auf die strukturelle
Organisation der reifen Nukleokapside hindeutet. Der Einbau von singulär
exprimiertem NP in die virusähnlichen Partikel war nicht erfolgreich und es kam zu
einer nicht-membrangeschützten Freisetzung in den Überstand nach Koexpression von
VP40 bzw. VP40 und VP24. Wie NP hierbei freigesetzt wurde ist bisher unklar,
ultrastrukturelle Analysen zeigten eine Assoziation mit der Außenseite der VLPs (Daten
GP
VP40
GP
VP40VP24
GP
VP40
GP
VP40
GP
VP40VP24
GP
VP40VP24
Abbildung 32: Schematische Darstellung der filoviralen Hüllmembran. Dargestellt ist eine modellhafte Vorstellung der Bildung der filoviralen Hüllmembran in Ab-und Anwesenheit von VP24 sowie der Einbau des Oberflächenproteins GP in dieseOberflächenstrukturen.
5 Diskussion 109
nicht gezeigt). Es wird vermutet, dass es durch die Überexpression von VP40 und
VP24 und den späten Zeitpunkt der Zellernte (nach 48 Stunden) zu einer
unspezifischen Freisetzung von NP aus nicht mehr intakten Zellen kommt. Für den
Einbau in die VLPs scheinen somit die durch Einzelexpression entstehenden
Strukturen des NP nicht ausreichend zu sein. Für das Ebolavirus konnte gezeigt
werden, dass für die Ausbildung von Nukleokapsiden, die ultrastrukturell reifen RNP-
Komplexen ähneln, die Proteine NP, VP35 und VP24 notwendig und ausreichend sind
(Huang et al., 2002).
Während die Late-Domain-Motive des EBOV-VP40 sowie der Matrixproteine weiterer
Vertreter der Familien der Rhabdo- und Paramyxoviridae hinsichtlich ihrer Funktion bei
der Abschnürung viraler Partikel bzw. VLPs näher untersucht sind, ist über die Rolle
des PPPY-Motiv des MARV-VP40 sowie dessen Einfluss auf den Einbau von VP24 in
die VLPs bisher nichts bekannt. Für das M-Protein von VSV sowie für das Z-Protein
von Lassavirus (Jayakar et al., 2000; Strecker et al., 2003) konnte gezeigt werden,
dass bereits der Austausch des Tyrosin (Y) gegen Alanin (A) die Funktionalität des
PPPY-Motivs stark beeinträchtigt und nur noch eine schwache Knospungsaktivität zu
beobachten ist. Durch die Substitution des Tyrosin-Rests im PPPY-Motiv des MARV-
VP40 durch Alanin, sollte dieses Sequenzmotiv hinsichtlich seines Einflusses auf die
VP40-Freisetzung und VP24-Rekrutierung untersucht werden. Überaschenderweise
war die Effizienz in der Freisetzung von VP40 durch die Mutation des PPPY-Motivs
nicht beeinflusst. Diese AS-Sequenz scheint somit, im Vergleich zu anderen
Matrixproteinen, nicht entscheidend für die Virusfreisetzung zu sein. Auch spielte das
PPPY-Motiv keine Rolle bei der Rekrutierung von VP24 in die VLPs, da sich die Menge
an eingebautem VP24 auch bei Mutation dieses Motivs nicht änderte. Diese
Ergebnisse lassen vermuten, dass im Falle das MARV-VP40 andere AS-Sequenzen
innerhalb des Proteins für die Rekrutierung des VP24 in die VLPs sowie die Interaktion
mit zellulären Faktoren zur Vermittlung der Virusfreisetzung eine Rolle spielen, die
bisher jedoch noch nicht beschrieben sind. So besitzt z.B. das Influenza A M1-Protein
kein typisches Late-Domain-Motiv, ist jedoch auch bei singulärer, transienter
Expression in der Lage VLPs zu bilden und wird von den transfizierten Zellen
freigesetzt (Gómez-Puertas et al., 2000). Hier scheinen ebenfalls bisher nicht näher
beschriebene AS-Sequenzen für die Interaktion mit zellulären Proteinen und die
Virusfreisetzung verantwortlich zu sein.
5 Diskussion 110
Interaktion des MARV-VP24 mit NP und VP40
Betrachtet man die intrazelluläre Lokalisation des VP24 in der MARV-Infektion, so zeigt
sich in der Immunfluoreszenzanalyse sowie in der elektronenmikroskopischen
Untersuchung eine deutliche Kolokalisation mit den viralen Einschlusskörpern, den
Reifungszentren der Nukleokapside, deren Hauptkomponente das NP ist. Die
transiente Koexpression von VP24 und NP führte zu einer Relokalisation des VP24 in
die NP-Aggregate, was für ein direktes Wechselspiel beider Proteine spricht. Allerdings
wurde außerdem beobachtet, dass die Kolokalisation nur in den perinukleären
Aggregaten, nicht jedoch in der Zellperipherie stattfindet. Für EBOV ist eine Beteiligung
des VP24 an der Reifung viraler Nukloekapside gezeigt (Huang et al., 2002). Die hier
erhaltenen Ergebnisse für das Marburgvirus lassen eine ähnliche Funktion des MARV-
VP24 in der Reifung von Nukleokapsiden vermuten, jedoch ist es fraglich, ob und wie
VP24 in den Transport der reifen Nukleokapside involviert ist. Im Vergleich zu VP24
zeigt das Matrixprotein VP40 von MARV nur eine schwache Kolokalisation mit den
Einschlusskörpern der Virusinfektion sowie den NP-Aggregaten in der rekombinanten
Koexpression (Dr. Larissa Kolesnikova, persönliche Mitteilung). Dahingegen interagiert
VP40 stark mit zellulären Membranen und es wird sechs Mal mehr
membranassoziiertes VP40 transportiert als nukleokapsidassoziiertes (Kolesnikova et
al., 2002). Jedoch wurde VP40 in der Virusinfektion in Assoziation mit einzelnen, reifen
RNP-Komplexen, welche zur Plasmamembran transportiert wurden, detektiert und
könnte somit eine Rolle im Transport dieser Nukleokapside spielen. Die hier gezeigten
Daten sowie die publizierten Daten bezüglich des EBOV VP24 scheinen eher gegen
einen Kotransport von Nukleokapsiden und VP24 zu sprechen.
Betrachtet man VP24 und VP40 in der Immunfluoreszenzanalyse, so beobachtet man
eine schwache Kolokalisation der beiden Proteine, vor allem im Bereich der
Plasmamembran sowie in Plasmamembranausläufern. VP24 zeigt keinerlei
Kolokalisation mit den großen VP40-Clustern in den multivesikulären Strukturen des
späten Endosoms (MVBs) in der Zellperipherie oder in Kernnähe. Koimmun-
präzipitationsanalysen von MARV-VP24 und VP40 waren ebenfalls nicht erfolgreich,
jedoch ist VP40 in der Lage, VP24 spezifisch in VLPs zu rekrutieren. Es ist ungeklärt,
ob es sich bei dieser Rekrutierung um eine direkte Interaktion oder vielleicht um eine
indirekte Rekrutierung mittels bisher unbekannter, zellulärer Faktoren handelt. Auch für
das EBOV-VP24 konnte nur eine schwache Interaktion mit dem EBOV-VP40
nachgewiesen werden (Licata et al., 2004).
5 Diskussion 111
Abschalten der VP24-Expression durch RNA Interferenz
Durch Anwendung der siRNA Technologie ist es möglich, die Expression einzelner
Proteine gezielt durch den Abbau ihrer jeweiligen mRNA abzuschalten. Dieser Prozess
der RNA Interferenz ist unter anderem als Ansatz für eine antivirale Therapie
interessant. Bisher konnte eine Inhibition der Virusreplikation durch RNAi für eine
Reihe von Viren gezeigt werden, so z.B. für HIV-I (Novina et al., 2002), HCV (Kapadia
et al., 2003), Influenza A Virus (Ge et al., 2003), das Respiratorische Syncytialvirus
RSV (Bitko and Barik, 2001) oder auch das Hepatitis B Virus (Shlomai et al., 2003).
Jedoch ist es noch nicht möglich, siRNAs zur antiviralen Therapie einzusetzen.
Nichtsdestotrotz ist die RNA Interferenz ein interessantes Werkzeug für die virale
Grundlagenforschung.
Um die Rolle des VP24 in der Infektion näher zu untersuchen, wurden zwei
verschiedene VP24-spezifische siRNAs synthetisiert, welche beide in der Lage waren
VP24 spezifisch in der transienten Expression abzuschalten, während eine
unspezifische Kontroll-siRNA keinen Einfluss auf die VP24-Expression hatte. Der
Einsatz beider siRNA-Sequenzen war ebenfalls in der MARV-Infektion erfolgreich. Nun
war interessant, welche Folgen die Abwesenheit des VP24 auf die Virusreplikation und
Morphogenese hat. Für das Marburgvirus konnte bereits mithilfe eines artifiziellen
Minigenomsystems gezeigt werden, dass für die Transkription der viralen mRNA-
Spezies sowie die Replikation des viralen Genoms die Nukleokapsidproteine NP, VP35
und L notwendig und ausreichend sind (Mühlberger et al., 1998). In diesem System
konnte kein Einfluss von VP24 auf diese Prozesse gezeigt werden, genauso wenig wie
für das Nukleokapsidprotein VP30. Jedoch zeigte der Einsatz einer VP30-spezifischen
siRNA in der Infektion, dass das VP30 des MARV für die Vorgänge der Transkription
und Replikation durchaus eine Rolle spielt, diese jedoch mittels des artifiziellen
Minigenomsystems nicht gezeigt werden konnte (Fowler and Bamberg et al., in
submission).
Daher wurde durch Western Blot Analysen untersucht, ob die Abwesenheit des VP24
die Expression der anderen Virusproteine beeinflusst. Die Expression der viralen
Proteine NP, VP35, VP40, GP und VP30 in der unbehandelten Infektion wurde mit der
in den siRNA-behandelten Zellen verglichen. Dieser Vergleich ergab, dass das
Abschalten der VP24-Expression durch RNAi keinen Einfluss auf die Expression der
anderen viralen Proteine hat. Nur VP24 wurde spezifisch abgeschaltet. Dies wiederum
bedeutet zum einen, dass VP24, auch in der Virusinfektion, nicht an den Prozessen
der Transkription und Replikation beteiligt zu sein scheint, da ansonsten eine Abnahme
in der Expression der anderen Proteine erwartet werden würde. Zum anderen lässt
sich indirekt auf die Zugänglichkeit der viralen Genome und Antigenome durch den
5 Diskussion 112
RNAi-Mechanismus schließen. Während der Infektion entstehen in der Zelle sowohl
negativsträngige als auch positivsträngige virale RNA-Genome. Beide RNA-Moleküle
zeigen komplementäre Sequenzen zu den siRNAs. Daher könnte man erwarten, dass
auch diese genomischen RNA-Moleküle für den RNAi-Mechanismus zugänglich sind.
Die Expression der viralen Proteine macht jedoch deutlich, dass nur die VP24-
spezifische mRNA betroffen ist. Die genomischen RNAs wurden nicht als
Zielsequenzen von den siRNAs erkannt und nicht abgebaut. Gleiche Ergebnisse
bezüglich der viralen Genome wurden auch bei der siRNA-Behandlung von RSV-
infizierten Zellen (Bitko and Barik, 2001) sowie bei Influenza A-infizierten Zellen
beschrieben (Ge et al., 2003). Man nimmt an, dass die viralen Genome aufgrund der
kompletten Enkapsidierung durch die jeweiligen Nukleoproteine im direkten Anschluss
an deren Synthese nicht für den RNAi-Mechanismus zugänglich sind.
Betrachtet man im Weiteren die Freisetzung von reifen Virionen in den
Zellkulturüberstand, so fällt auf, dass die Behandlung mit den VP24-spezifischen
siRNAs im Vergleich zu den Kontrollen zu einer verminderten Freisetzung führte. Damit
konnte gezeigt werden, dass das VP24 des Marburgvirus eine wichtige Rolle in der
viralen Morphogenese spielt und dass dieses Protein für eine effiziente Freisetzung der
Tochtervirionen notwendig ist. Welche Mechanismen VP24 dabei genau vermittelt,
konnte jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht aufgeklärt werden. Aufgrund der hier
erhobenen Daten ist aber eine Funktion im Reifungsprozess sowie dem Einbau von
RNP-Komplexen denkbar. Allerdings konnte für EBOV gezeigt werden, dass VP24 für
die Produktion infektiöser VLPs, die ein GFP-exprimierendes EBOV-Minigenom tragen,
nicht benötigt wird (Watanabe et al., 2004). Jedoch handelt es sich hier um ein
artifizielles System, bei dem der Einfluss des VP24 auf die Partikelreifung eventuell
durch andere Faktoren beeinflusst oder überlagert sein könnte. Ein weiterer Hinweis,
dass VP24 essentiell ist für die Virusreifung ist, kommt aus Studien mit VP24-
defizienten Ebolaviren, die mithilfe von reverser Genetik erzeugt wurden (Volchkov et
al., 2001). Hier war es nach Deletion des VP24-Gens nicht möglich reife, infektiöse
Viruspartikel zu generieren (Viktor Volchkov, persönliche Mitteilung).
Die hier erhaltenen Ergebnisse lassen vermuten, dass das VP24 des Marburgvirus als
strukturelle Komponente der Virionen eine wichtige Rolle in der Morphogenese reifer
Partikel spielt. Aufgrund der hier gezeigten starken Assoziation mit dem Nukleoprotein
NP scheint dabei eine Beteiligung an der Reifung der RNP-Komplexe sowie deren
Transport wahrscheinlich.
6 Zusammenfassung 113
6 Zusammenfassung
Das Marburgvirus bildet zusammen mit dem Ebolavirus die Familie der Filoviridae.
Hierbei handelt es sich um hochpathogene Erreger, die sowohl bei menschlichen als
auch nichtmenschlichen Primaten schwere, oft tödliche Erkrankungen mit
hämorrhagischer Diathese verursachen. Eine Besonderheit dieser Viren ist das
Vorhandensein von zwei Matrixproteinen, VP40 und VP24. VP40 stellt das Analogon
zu den Matrixproteinen anderer Mononegavirales dar. Die Funktion des zweiten
Matrixproteins VP24 ist bislang ungeklärt. Aus früheren Untersuchungen war eine
Interaktion mit dem zytoplasmatischen Anteil des Oberflächenproteins GP sowie eine
schwache Bindung an negativ geladene Membranen bekannt.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass VP24 eine schwache Tendenz zur
Interaktion mit zellulären Membranen aufwies, welche durch Koexpression von GP
oder VP40 nicht verstärkt werden konnte. Allerdings war eine Tendenz zur
Membranintegration von transient exprimiertem sowie viralem VP24 vorhanden, deren
Zustandekommen und Bedeutung jedoch bisher nicht geklärt ist. VP24 ist des
Weiteren nicht in der Lage, seine eigene Freisetzung in Form von virusähnlichen
Partikeln (VLPs) zu vermitteln, wird jedoch in die von VP40 gebildeten, filamentösen
VLPs rekrutiert. Außerdem scheint VP24 einen Einfluss auf die Inkorporation des
Oberflächenproteins GP in die von VP40 gebildeten VLPs zu haben.
VP24 zeigte eine deutliche Kolokalisation mit den Einschlusskörpern der Virusinfektion,
welche die Reifungszentren viraler Nukleokapside darstellen. Eine direkte Interaktion
von VP24 und NP wurde durch Immunfluoreszenzanalysen nachgewiesen. Im
Gegensatz dazu scheint die Interaktion von VP24 und VP40 nur schwach ausgeprägt
zu sein, wie Koimmunfluoreszenzanalysen sowie Koimmunpräzipitationstudien zeigten.
Mithilfe von RNA Interferenz war es möglich, VP24 sowohl in der transienten
Expression als auch in der viralen Infektion abzuschalten. Hier konnte gezeigt werden,
dass VP24 in der Infektion keine Rolle bei der viralen Transkription und Replikation
spielt, jedoch beim Zusammenbau reifer Virionen nötig ist, um diese von den Zellen
freizusetzen. Auch konnte indirekt gezeigt werden, dass der Mechanismus der RNA
Interferenz nicht in der Lage ist, die viralen RNA-Genome zu erkennen und abzubauen.
Die hier erhaltenen Ergebnisse lassen vermuten, dass das VP24 des Marburgvirus als
strukturelle Komponente der Virionen eine wichtige Rolle in der Morphogenese reifer
Partikel spielt. Aufgrund seiner starken Assoziation mit dem Nukleoprotein scheint
dabei die Beteiligung an der Reifung der Nukleokapside sowie deren Transport
wahrscheinlich.
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8 Abbildung- und Tabellenverzeichnis 127
8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abbildungen:
Abbildung 1 Taxonomie der Filoviren. 7
Abbildung 2 Struktur des Marburgvirus. 12
Abbildung 3 Genomstruktur des Marburgvirus. 13
Abbildung 4 Der RNAi-Mechanismus. 20
Abbildung 5 Prinzip einer PCR. 44
Abbildung 6 Schematische Darstellung der Epitop-markierten MARV-
VP24-Mutanten.
68
Abbildung 7 Schema der Klonierung der Epitop-markierten MARV-VP24-
Mutanten.
69
Abbildung 8 Immunfluoreszenzanalyse der Epitop-markierten VP24-
Mutanten.
71
Abbildung 9 Vergleich des VP24-spezifischen Kaninchenserum und des
affinitätsgereinigten VP24-AK..
72
Abbildung 10 Immunfluoreszenzanalyse der Einzelexpression des WT-
VP24.
73
Abbildung 11 Flotationsanalyse des WT-VP24 und HA-VP24. 74
Abbildung 12 Charakterisierung der Membranassoziation von HA-VP24. 76
Abbildung 13 Membranassoziation von HA-VP24 bei Koexpression von
VP40 bzw. GP.
77
Abbildung 14 Triton X-114 Phasenpartitionierung von VP24 und VP40. 78
Abbildung 15 Triton X-114 Phasenpartitionierung von MARV-Partikeln. 79
Abbildung 16 Bildung von virusähnlichen Partikeln durch Einzelexpression
von VP40, GP und VP24.
81
Abbildung 17 Einfluss des VP24 auf die Expression von VP40 bzw. GP. 82
Abbildung 18 Vergleich der Proteinmengen in MARV-infizierten Vero-Zellen
und transfizierten HEK293-Zellen.
83
Abbildung 19 Rekrutierung von VP24 in virusähnliche Partikel. 85
8 Abbildung- und Tabellenverzeichnis 128
Abbildung 20 Einfluss des VP24 auf die Bildung virusähnlicher Partikel. 86
Abbildung 21
Mutation des Late-Domain-Motivs PPPY des VP40 und sein
Einfluss auf die Freisetzung der VLPs sowie die Rekrutierung
von VP24.
88
Abbildung 22 Einbau von NP in VLPs. 89
Abbildung 23 Lokalisation des VP24 in Marburgvirus-infizierten Vero-Zellen. 91
Abbildung 24 Lokalisation des VP24 in den Einschlusskörpern
Marburgvirus-infizierter Vero-Zellen.
92
Abbildung 25 Immunfluoreszenzanalyse der Einzel- und Koexpression von
VP24 und NP.
93
Abbildung 26 Koimmunpräzipitationsanalyse des VP24-Flag mit dem VP40. 95
Abbildung 27 Immunfluoreszenzanalyse der Kolokalisation von VP24 und
VP40.
96
Abbildung 28 Sequenzen der VP24-spezifischen siRNAs sowie der Kontroll-
siRNA X.
98
Abbildung 29 Abschalten der transienten VP24-Expression durch siRNA-
Transfektion.
99
Abbildung 30 Abschalten der VP24-Expression in der MARV-Infektion durch
RNAi.
102
Abbildung 31 Freisetzung reifer MARV-Partikel nach siRNA-Behandlung. 104
Abbildung 32 Schematische Darstellung der filoviralen Hüllmembran. 108
Tabellen:
Tabelle 1 Ausbrüche von Filovirus-Infektionen. 8
Tabelle 2 Für Klonierungen verwendete DNA-Matrizen und
Oligonukleotide.
36
9 Abkürzungsverzeichnis 129
9 Abkürzungsverzeichnis
Die Abkürzungen für SI-Einheiten, Aminosäuren und Nukleotide entsprechen den
international verbindlichen Normen. Die Abkürzungen der chemischen Substanzen
wurden im Materialteil aufgeführt.
α anti AK Antikörper AS Aminosäure bp Basenpaare CDC Centers for Disease Control (Atlanta/USA) C-Terminus Carboxyterminus d (bei dH2O) deionisiert ddNTP 2’3’ -Didesoxynukleosidtriphosphat def deficient DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP 2’ -Desoxynukleosidtriphosphat DRC Demokratische Republik Kongo (früher Zaire) EBOV Ebolavirus EM Elektronenmikroskop ER Endoplasmatisches Retikulum FCS fetales Kälberserum FITC Fluorescein-Isothiocyanat Isomer 1 GP Glykoprotein GST Glutathion-S-Transferase h Stunden HIV Humanes-Immundefizienzvirus ICTV International Committee on Taxonomy of VirusesIFN Interferon IgG Immunglobulin G IRES interne Ribosomeneintrittsstelle ISRE “interferon-stimulated response element“ kb Kilobasen kD Kilodalton KoIP Koimmunpräzipitation Lamp-1 “lysosome-associated membrane protein 1“ L-Protein Large-Protein (Polymerase) MARV Marburgvirus MEM Modified Eagle Medium min Minuten Mock Scheininfektion
9 Abkürzungsverzeichnis 130
m.o.i. multiplicity of infection mRNA messenger RNA MVA-T7 Modified Vaccinia-Virus Ankara-T7 MVB “multi vesicular bodies“ = multivesikuläre
Strukturen NNS nichtsegmentiert, negativsträngig NP Nukleoprotein N-Terminus Aminoterminus OD Optische Dichte ORF offener Leserahmen p.i. “post infection” = nach Infektion POD Peroxidase p.t. “post transfection” = nach Transfektion P/S Penicillin/Streptomycin PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PAS Protein-A-Sepharose PCR Polymerase-Kettenreaktion PNÜ postnukleärer Überstand PTGS “post trancriptional gene silencing“ Q L-Glutamin RNA Ribonukleinsäure RNAi RNA Interferenz RNP-Komplex Ribonukleoproteinkomplex RT Raumtemperatur sec Sekunden siRNA small interfering RNA TNF α Tumor Nekrose Faktor α U “unit“ = Einheit ÜKR Überkopfrotierer ÜN über Nacht ÜNK Übernachtkultur UpM Umdrehungen pro Minute UTR “untranslated region” = nichttranslatierte Region VLP “virus-like particles” = virusähnliche Partikel VP Virusprotein vRNA virale RNA VSV Vesikular-Stomatitis-Virus VT Volumenteil v/v Volume per volume w/v weight per volume WHO World Health Organisation WT Wildtyp
10 Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen 131
10 Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen
Veröffentlichungen
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit wurden folgende Publikationen erstellt:
“Molecular Characterisation and Silencing of VP24 in Marburgvirus Infection: Implications for Maturation of Filoviral Particles” Sandra Bamberg, Peggy Möller, Larissa Kolesnikova, Hans-Dieter Klenk, Stephan Becker (in Vorbereitung)
Weitere Publikationen während der Dissertation:
"The matrix protein of Marburg virus is transported to the plasma membrane along cellular membranes: exploiting the retrograde late endosomal pathway." Larissa Kolesnikova, Sandra Bamberg, Beate Berghöfer, Stephan Becker J Virol. 2004 Mar;78(5): 2382-93
"Multivesicular bodies as a platform for the formation of Marburgvirus envelope"
Larissa Kolesnikova, Beate Berghöfer, Sandra Bamberg, Stephan Becker; (J Virol.,
akzeptiert)
"Inhibition of Marburgvirus Protein Expression and Viral Release by RNAi" Trent Fowlerª, Sandra Bambergª, Peggy Möller, Thomas F. Meyer. Stephan Becker, Thomas Rudel ª both authors contributed equally to this work (übermittelt)
Vorträge:
"Inhibition of Marburgvirus protein expression and viral release by RNAi" Sandra Bamberg, Trent Fowler, Stephan Becker, Peggy Möller, Thomas F. Meyer, Thomas Rudel Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie 2004, Tübingen
“Molecular Characterization and Intracellular Distribution of the Marburgvirus VP24” Sandra Bamberg, Larissa Kolesnikova, Stephan Becker Progress Report SFB 535 2002, Gießen
10 Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen 132
“The Role of the Late Endosome in the Transport of a Viral Matrix Protein” Larissa Kolesnikova, Sandra Bamberg, Stephan Becker SFB 535: Symposium on “Visualisation of infectious agents and structures in living cells”
2002, Schloss Rauischholzhausen
“Interaction of the Marburgvirus VP24 and the Surface Protein GP” Sandra Bamberg, Christian Sänger, Stephan Becker Klausurtagung SFB 286 2001, Hirschegg, Österreich
Posterpräsentationen:
“Employment of RNAi to Reduce Marburgvirus Replication” Trent Fowler, Sandra Bamberg, Peggy Möller, Thomas F. Meyer, Stephan Becker, and
Thomas Rudel
ASM Biodefense Meeting, März 2004, Baltimore, USA
“Biochemical Analysis of the Marburgvirus VP24“ Sandra Bamberg, Larissa Kolesnikova, Stephan Becker Twelfth International Conference on Negative Strand Viruses 2003, Pisa, Italy
“Exploiting the Late Endosomal Pathway: Implications for Budding of Marburgvirus” Larissa Kolesnikova, Sandra Bamberg, Stephan Becker Twelfth International Conference on Negative Strand Viruses 2003, Pisa, Italy; 2003
“Biochemical Analysis of the Marburgvirus VP24“ Sandra Bamberg, Larissa Kolesnikova, Stephan Becker Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie 2003, Berlin “Interaction of the Marburgvirus VP24 with the Surface Protein GP and Anionic Membrane Structures“ Sandra Bamberg, Christian Sänger, Elke Mühlberger, Stephan Becker Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie 2001, Dresden
11 Curriculum Vitae 133
11 Curriculum Vitae
Persönliche Daten
Name: Sandra Bamberg
Anschrift: Hübingerweg 15d
56323 Waldesch
Geburtsdatum: 24.05.1976
Geburtsort: Koblenz
Schulausbildung
1982 – 1986 Grundschule in Buchholz
1986 – 1990 priv. Realschule Marienberg in Boppard/Rhein
1990 – 1995 Gymnasium auf der Karthause in Koblenz
Abschluss: Abitur (1,3)
Hochschulausbildung
10/1995 – 12/2000 Studium der Humanbiologie, Philipps-Universität Marburg
Hauptfach: Virologie
Nebenfächer: Zellbiologie, Immunologie
10/1997 Vordiplom (Note: gut)
01/2000 Diplom-Prüfung (Note: sehr gut)
02/2000 – 12/2000 Diplomarbeit am Institut für Virologie, Philipps-Universität Marburg
Thema: „Interaktion des Marburgvirus VP24 mit dem
Oberflächenprotein GP und anionischen Membranstrukturen“
(Note: sehr gut)
01/2001 – 07/2004 Promotion am Institut für Virologie, Philipps-Universität Marburg
Thema: „Untersuchungen zur Rolle des VP24 im
Vermehrungszyklus des Marburgvirus“
03/2003 – 05/2003 Trainee am EMBL (European Molecular Biology Laboratory) in
Grenoble, Frankreich
Marburg, den 13.08.04
(Sandra Bamberg)
12 Verzeichnis der akademischen Lehrer 134
12 Verzeichnis der akademischen Lehrer
Meine akademischen Lehrer an der Philipps-Universität Marburg waren die folgenden
Damen und Herren:
Arnold, Aumüller, Aurich, Barth, Becker, Brandis-Heep, Dobbelstein, Elsässer, Fischer,
Frenking, Fruhstorfer, Garten, Grzeschik, Gudermann, Habermehl, Hartmann, Jungclas,
Kern, Kirchner, Klenk, Knöller, Koch, Koolman, Lammel, Lang, Lill, Löffler, Lührmann,
Maisner, Mazummda, Melsheimer, Mühlberger, Müller, Radsak, Röhm, Schachtschabel,
Schäfer, Schulz, Schwee, Seifart, Seitz, Steinmetz, von Löw, Westermann.
13 Danksagung 135
13 Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk vom Institut für Virologie für die Bereitstellung
des interessanten und vielseitigen Themas.
Außerdem danke ich der Philipps-Universität Marburg, dem Hessischen Ministerium für
Wissenschaft und Kunst sowie der Frauenbeauftragten Dr. Silke Lorch-Göllner für die
Förderung meiner Arbeit durch ein Promotionsstipendium für Frauen in den Ingenieur- und
Naturwissenschaften.
Weiterhin bedanke ich mich bei Herrn PD Dr. Stephan Becker für die hervorragende
Betreuung meiner Dissertation in der Arbeitsgruppe am Institut für Virologie. Er stand mir
jederzeit mit Rat und Tat zur Seite und förderte den erfolgreichen Fortgang der Arbeit.
Auch möchte ich mich bei PD Dr. Winfried Weissenhorn für den interessanten und
erfolgreichen Aufenthalt am EMBL in Grenoble bedanken.
Mein besonderer Dank gilt den Kollegen aus dem Labor G23. Peggy Möller für ihren
permanenten Beistand und seelischen Zuspruch sowie natürlich für die vielen Stunden im
Sicherheitslabor, Dr. Larissa Kolesnikova für ihre ständige Diskussionsbereitschaft und
methodische Hilfestellung und Angelika Lander für ihre technische Unterstützung und den
netten Tratsch in den Kaffeepausen. Außerdem Andrea DiCarlo, Bettina Hartlieb, Thomas
Hoenen, Daniel Voss, Annika Kern, Beate Berghöfer, Dr. Jens Modrof, Dr. Christian
Sänger, Dr. Michael Weik sowie allen Praktikanten, die gemeinsam zu einer hervorragend
kollegialen und fruchtbaren Arbeitsatmosphäre beigetragen haben.
Ich danke ebenfalls allen anderen Mitarbeitern des Instituts für Virologie für die gute
Zusammenarbeit, v.a. der Arbeitsgruppe um PD Dr. Elke Mühlberger.
Ganz besonders möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mich während der
gesamten Zeit meines Studiums und der Promotion nicht nur materiell gefördert, sondern
mir in allen Situationen und Entscheidungen den Rücken gestärkt und mich unterstützt
haben.
Zuletzt gilt mein persönlicher Dank Meik Szelies, der mich stets in meinem Fortkommen
unterstützt und meine Launen und Eigenarten „ertragen“ hat.
14 Ehrenwörtliche Erklärung 136
14 Ehrenwörtliche Erklärung
Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die dem Fachbereich Medizin Marburg zur
Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel:
„Untersuchungen zur Rolle des VP24 im Vermehrungszyklus des Marburgvirus“ im Medizinischen Zentrum für Hygiene und Infektionsbiologie unter Leitung von Prof. Dr.
Hans-Dieter Klenk mit Unterstützung durch PD Dr. Stephan Becker ohne sonstige Hilfe
selbst durchgeführt und bei der Abfassung der Arbeit keine anderen als die in der
Dissertation angeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Ich habe bisher an keinem in- und ausländischen Medizinischen Fachbereich ein Gesuch
um Zulassung zur Promotion eingereicht noch die vorliegende oder eine andere Arbeit als
Dissertation vorgelegt.
Teile der vorliegenden Arbeit wurden veröffentlicht (Kapitel 10).
Marburg, den 13.08.04
(Sandra Bamberg)